ES2933435T3 - Métodos para reducir la expresión de C9ORF72 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para reducir la cantidad o actividad de ARN C90RF72 y, en ciertos casos, para reducir la cantidad de proteína C90RF72 en un animal. Dichos métodos son útiles para prevenir o mejorar al menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa. Dichos síntomas incluyen ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria. Dichas enfermedades neurodegenerativas incluyen esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniano atípico y degeneración olivopontocerelar (OPCD). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para reducir la expresión de C9ORF72

Campo

Se proporcionan métodos para reducir la cantidad o actividad de ARN de C9ORF72 y, en ciertos casos, para reducir la cantidad de proteína de C9ORF72 en un animal. Tales métodos son útiles para prevenir o mejorar por lo menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa. Tales síntomas incluyen ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria. Tales enfermedades neurodegenerativas incluyen esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniano atípico y degeneración olivopontocerelar (OPCD).

Antecedentes

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada clínicamente por una parálisis progresiva que lleva a la muerte por insuficiencia respiratoria, generalmente en el plazo de dos o tres años después del inicio de los síntomas (Rowland y Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688­ 1700). La ELA es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337), y actualmente no existen terapias eficaces. Aproximadamente el 10% de los casos son de naturaleza familiar, mientras que la mayoría de los pacientes diagnosticados con la enfermedad se clasifican como esporádicos, ya que parecen producirse aleatoriamente en la población (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533­ 537). Existe un reconocimiento creciente, basado en datos clínicos, genéticos y epidemiológicos, que la ELA y la demencia frontotemporal (FTD) representan un continuo de enfermedad que se superpone, caracterizado patológicamente por la presencia de inclusiones positivas para TDP-43 por todo el sistema nervioso central (Lillo y Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).

Hasta la fecha, se han descubierto varios genes como causantes de la ELA familiar clásica, por ejemplo, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN y VCP (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Recientemente, el análisis de vínculos de familias que implican múltiples casos de ELA, FTD y ELA-FTD ha sugerido que había un locus importante para la enfermedad en el brazo corto del cromosoma 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). El locus del cromosoma 9p21ALS-FTD en el último gen dominante autosómico principal cuya mutación es causante de la ELA. La mutación que causa ELA-FTD es una expansión repetida de hexanucleótido grande (GGGGCC) en el primer intrón del gen C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Un haplotipo fundador, que cubre el gen C9ORF72, está presente en la mayoría de los casos ligado a esta región (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268). Este locus en el cromosoma 9p21 representa casi la mitad de la ELA familiar y casi una cuarta parte de todos los casos de ELA en una cohorte de 405 pacientes finlandeses (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).

Actualmente hay una falta de opciones aceptables para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración corticobasal (CBD), el síndrome parkinsoniano atípico y la degeneración olivopontocerelar (OPCD). Por lo tanto, un objeto de la presente es proporcionar métodos para el tratamiento de tales enfermedades.

La WO 2015/054676, la US 2015/259679 y la US 2015/267197 describen compuestos que comprenden oligonucleótidos modificados para reducir la expresión de ARNm y/o proteína de C9ORF72 en un animal que son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades neurodegenerativas. Mahoney et al., 2012 proporciona un análisis clínico, neuroanatómico y neuropatológico de casos con degeneraciones lobares frontotemporales (FTLD), que confirman informes anteriores de que la expansión de la repetición del hexanucleótido C9ORF72 es una causa importante de la FTLD:

Sumario de la invención

La invención proporciona un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido modificado para su uso en la mejora o prevención de por lo menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa, en donde el oligonucleótido modificado consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que es por lo menos un 90% complementaria a un ácido nucleido de C9ORF72, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, o 18 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 6, y en donde el por lo menos un síntoma es cualquiera de ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria.

En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniano atípico o degeneración olivopontocerelar (OPCD). En ciertas realizaciones, la mejora de estos síntomas da como resultado una ansiedad reducida, un aprendizaje espacial mejorado o una memoria mejorada.

Descripción detallada de la invención

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los encabezados de las secciones usados en la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

Definiciones

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con la química analítica, la química orgánica sintética y la química farmacéutica y médica descritas en la presente y los procedimientos y técnicas de las mismas son bien conocidos y comúnmente usados en la técnica.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

DEFINICIONES

"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal. "Administrado antes de la detección del por lo menos un síntoma" es la administración profiláctica y significa proporcionar el agente farmacéutico a un animal antes de que un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa sea evidente a través del diagnóstico. Dicho diagnóstico puede lograrse, por ejemplo, mediante evaluación clínica y pruebas genéticas.

"Animal" significa un animal humano o no humano.

"Actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico objetivo o proteína codificada por dicho ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo en ausencia del compuesto antisentido.

"Mejorar" o "mejoría" en referencia a un tratamiento significa la mejora en por lo menos un síntoma con respecto al mismo síntoma en ausencia del tratamiento. En ciertas realizaciones, la mejoría es la reducción de la gravedad o la frecuencia de un síntoma o el retraso en el inicio o la ralentización de la progresión de la gravedad o la frecuencia de un síntoma. Los síntomas son ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria.

"Fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende dos anillos, en donde el segundo anillo se forma a través de un puente que conecta dos de los átomos en el primer anillo formando de este modo una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el primer anillo de la fracción de azúcar bicíclico es una fracción de furanosilo. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar bicíclico no comprende una fracción de furanosilo.

"Complementario" en referencia a un oligonucleótido significa que por lo menos el 70% de las nucleobases del oligonucleótido o una o más regiones del mismo y las nucleobases de otro ácido nucleico o una o más regiones del mismo son capaces de formar enlaces de hidrógeno entre sí cuando la secuencia de nucleobases del oligonucleótido y el otro ácido nucleico están alineadas en direcciones opuestas. Las nucleobases complementarias significan nucleobases que son capaces de formar enlaces de hidrógeno entre sí. Las parejas de nucleobases complementarios incluyen, pero a menos que se especifique lo contrario, no se limitan a, adenina (A) y timina (T), adenina (A) y uracilo (U), citosina (C) y guanina (G), 5-metil citosina (mC) y guanina (G). Los oligonucleótidos y/o ácidos nucleicos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobases en cada nucleósido. Más bien, se toleran algunos malapareamientos. Como se usa en la presente, "complementariedad completa" o "100% complementario" en referencia a oligonucleótidos significa que los oligonucleótidos son complementarios con otro oligonucleótido o ácido nucleico en cada nucleósido del oligonucleótido.

"Grupo conjugado" significa un grupo de átomos que está unido directa o indirectamente a un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen una fracción conjugada y un conector conjugado que une la fracción conjugada al oligonucleótido.

"Contiguo" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a nucleósidos, nucleobases, fracciones de azúcar o enlaces internucleosídicos que están inmediatamente adyacentes entre sí. Por ejemplo, "nucleobases contiguas" significa nucleobases que están inmediatamente adyacentes entre sí en una secuencia.

"Gapmer" significa un oligonucleótido modificado que comprende una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H posicionada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. A la región interna puede hacerse referencia como "hueco" y a las regiones externas puede hacerse referencia como "alas".

El "enlace internucleosídico" es el enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido. Como se usa en la presente, "enlace internucleosídico modificado" significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico de fosfodiéster. "Enlace de fosforotioato" significa un enlace internucleosídico modificado en el que uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes de un enlace internucleosídico fosfodiéster se reemplaza por un átomo de azufre.

"MOE" significa metoxietilo. "2'-MOE" significa un grupo -OCH²CH²OCH³ en la posición 2' de un anillo de furanosilo.

"Enfermedad neurodegenerativa" significa una afección marcada por la pérdida progresiva de la estructura o función de las neuronas, incluyendo la muerte de las neuronas. En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es cualquiera de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniano atípico y degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).

"Nucleobase" significa una nucleobase no modificada o una nucleobase modificada. Como se usa en la presente, "una nucleobase no modificada" es adenina (A), timina (T), citosina (C), uracilo (U) y guanina (G). Como se usa en la presente, una "nucleobase modificada" es un grupo de átomos distintos de A, T, C, U o G no modificados capaces de emparejarse con por lo menos una nucleobase no modificada. Una "5-metilcitosina" es una nucleobase modificada. Una base universal es una nucleobase modificada que puede emparejarse con cualquiera de las cinco nucleobases no modificadas. Como se usa en la presente, "secuencia de nucleobases" significa el orden de las nucleobases contiguas (es decir, no hay nucleobases adicionales presentes entre las que son contiguas) en un ácido nucleico u oligonucleótido independiente de cualquier modificación de azúcar o enlace internucleosídico.

"Nucleósido" significa un compuesto que comprende una nucleobase y una fracción de azúcar. La nucleobase y la fracción de azúcar están cada una, independientemente, sin modificar o modificado. Como se usa en la presente, "nucleósido modificado" significa un nucleósido que comprende una nucleobase modificada y/o una fracción de azúcar modificado. Los nucleósidos modificados incluyen nucleósidos abásicos, que carecen de una nucleobase. Los "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no hay nucleósidos adicionales presentes entre los que están enlazados).

"Compuesto oligomérico" significa un compuesto que comprende un oligonucleótido y, opcionalmente, una o más características adicionales, como un grupo conjugado o un grupo terminal.

"Compuesto oligomérico" significa un oligonucleótido y, opcionalmente, una o más características adicionales, como un grupo conjugado o un grupo terminal. Un compuesto oligomérico puede emparejarse con un segundo compuesto oligomérico o puede no estar emparejado. Un "compuesto oligomérico de cadena sencilla" es un compuesto oligomérico no emparejado. Un "compuesto oligomérico duplicado" es un compuesto oligomérico emparejado con un segundo compuesto oligomérico; este es un "dúplex oligomérico".

"Oligonucleótido" significa una cadena de nucleósidos enlazados conectados a través de enlaces internucleosídicos, donde cada enlace nucleosídico e internucleosídico puede estar modificado o no modificado. A menos que se indique lo contrario, los oligonucleótidos consisten en 8-50 nucleósidos enlazados. Como se usa en la presente, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido, en donde se modifica por lo menos un enlace nucleosídico o internucleosídico. Como se usa en la presente, "oligonucleótido no modificado" significa un oligonucleótido que no comprende ninguna modificación de nucleosídica o modificación de internucleosídica.

"Reducir o inhibir la expresión o la cantidad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o la cantidad con respecto a la expresión o la cantidad en una muestra de control o no tratada y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o la cantidad.

"Sales" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos oligoméricos, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto oligomérico original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.

"Ensayo celular estándar" significa el ensayo descrito en el Ejemplo 5 y variaciones razonables del mismo. "Experimento estándar in vivo" significa el procedimiento descrito en el Ejemplo 7 y variaciones razonables del mismo.

"Fracción de azúcar" significa una fracción de azúcar no modificada o una fracción de azúcar modificada. Como se usa en la presente, "fracción de azúcar no modificada" significa una fracción de furanosilo 2'-OH(H), como se encuentra en el ARN (una "fracción de azúcar de ARN no modificado"), o una fracción 2'-H(H), como se encuentra en el ADN (una "fracción de azúcar de ADN no modificado"). Las fracciones de azúcar no modificado tienen un hidrógeno en cada una de las posiciones 1', 3' y 4', un oxígeno en la posición 3' y dos hidrógenos en la posición 5'. Como se usa en la presente, "fracción de azúcar modificado" significa una fracción de azúcar de furanosilo modificado o un sustituto de azúcar. Como se usa en la presente, fracción de azúcar de furanosilo modificado significa un azúcar de furanosilo que comprende un sustituyente que no es hidrógeno en lugar de por lo menos un hidrógeno de una fracción de azúcar no modificado. Las fracciones de azúcar de furanosilo modificado incluyen azúcares bicíclicos y azúcares no bicíclicos. Como se usa en la presente, "sustituto de azúcar" significa una fracción de azúcar modificado que tiene una fracción diferente al furanosilo que puede enlazar una nucleobase con otro grupo, como un enlace internucleosídico, un grupo conjugado o un grupo terminal en un oligonucleótido. Los nucleósidos modificados que comprenden sustitutos de azúcar pueden incorporarse en una o más posiciones dentro de un oligonucleótido y tales oligonucleótidos son capaces de hibridar con compuestos oligoméricos o ácidos nucleicos complementarios.

"Ácido nucleico objetivo" significa un ácido nucleico con el que un compuesto oligomérico está diseñado para hibridar.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un animal. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz mejora un síntoma de una enfermedad.

"Proteína total de C9ORF72" significa todas las variantes de la proteína C9ORF72.

"ARN total de C9ORF72" significa todas las variantes de ARN de C9ORF72. "ARN patógeno de C9ORF72" significa variantes que contienen una repetición de hexanucleótido expandida.

I. Ciertos oligonucleótidos

En la presente se describen oligonucleótidos, que consisten en nucleósidos enlazados. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos no modificados (ARN o ADN) o pueden ser oligonucleótidos modificados. Los oligonucleótidos modificados comprenden por lo menos una modificación respecto al ARN o ADN no modificado. Es decir, los oligonucleótidos modificados comprenden por lo menos un nucleósido modificado (que comprende una fracción de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada) y/o por lo menos un enlace internucleosídico modificado.

A. Ciertos nucleósidos modificados

Los nucleósidos modificados comprenden una fracción de azúcar modificado o una nucleobase modificada o tanto una fracción de azúcar modificado como una nucleobase modificada.

1. Ciertas fracciones de azúcar

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado son fracciones de azúcar modificado no bicíclicas. En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado son fracciones de azúcar bicíclicas o tricíclicas. En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado son sustitutos del azúcar. Tales sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de otros tipos de fracciones de azúcar modificado.

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado son fracciones de azúcar modificado no bicíclicas que comprenden un anillo de furanosilo con uno o más sustituyentes acíclicos, incluyendo pero no limitados a, sustituyentes en las posiciones 2', 4' y/o 5'. En ciertas realizaciones, uno o más sustituyentes acíclicos de fracciones de azúcar modificado no bicíclicas están ramificados. Los ejemplos de grupos sustituyentes 2' adecuados para fracciones de azúcar modificado no bicíclicas incluyen, pero no se limitan a: 2'-F, 2'-OCH3 ("OMe" u "O-metilo") y 2'-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). En ciertas realizaciones, los grupos sustituyentes 2' se seleccionan de: halo, alilo, amino, azido, SH, CN, o Cn , CF³ , OCF³, O-alcoxi C¹-C¹⁰, O-alcoxi C¹ -C¹⁰ sustituido, O-alquilo C¹-C¹⁰, O-alquilo C¹-C¹⁰ sustituido, S-alquilo, N(Rm)-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N(Rm)-alquenilo, O-alquinilo, S-alquinilo, N(Rm)alquinilo, O-alquilenil-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH2)2SCH3, O(CH²)²ON(Rm)(Rn) u OCH²C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector de amino, o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, y los grupos sustituyentes 2' descritos en Cook et al., US 6.531.584; Cook et al, US 5.859.221; y Cook et al., US 6.005.087. Ciertas realizaciones de estos grupos sustituyentes 2' pueden sustituirse adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes independientemente seleccionados de: hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO²), tiol, tioalcoxi, tioalquilo, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo. Los ejemplos de grupos sustituyentes 4' adecuados para fracciones de azúcar modificado no bicíclicas incluyen, pero no se limitan a, alcoxi (por ejemplo, metoxi), alquilo y los descritos en Manoharan et al., WO 2015/106128. Los ejemplos de grupos sustituyentes 5' adecuados para fracciones de azúcar modificado no bicíclicas incluyen, pero no se limitan a: 5'-metilo (R o S), 5'-vinilo y 5'-metoxi. En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado no bicíclicas comprenden más de un sustituyente de azúcar que no forma puentes, por ejemplo, fracciones de azúcar 2'-F-5'-metilo y las fracciones de azúcar modificado y nucleósidos modificados descritos en Migawa et al., WO 2008/101157 y Rajeev et al., US2013/0203836).

En ciertas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido en o un nucleósido modificado no bicíclico 2' comprende una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado de: F, NH² , N³ , OCF3, OCH3, O(CH2)3NH2, CH2CH=CH2, OCH2CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn), O(CH²)²O(CH²)²N(CH³ )² , y acetamida N-sustituida (OCH²C(=O)-N(Rm)(Rn)), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector de amino, o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido.

En ciertas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido o un nucleósido 2'-modificado no bicíclico comprende una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado de: F, OCF³ , OCH³, OCH²CH²OCH³ , O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, y OCH2C(=O)-N(H)CH3 ("NMA").

En ciertas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido o un nucleósido 2'-modificado no bicíclico comprende una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado de: F, OCH3 y OCH2CH2OCH3.

Los nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado, como fracciones de azúcar modificado no bicíclicas, pueden denominarse por la posición o posiciones de la sustitución o sustituciones en la fracción de azúcar del nucleósido. Por ejemplo, los nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar 2'-sustituidas se denominan nucleósidos 2'-sustituidos.

Ciertas fracciones de azúcar modificado comprenden un sustituyente de azúcar puente que forma un segundo anillo que da como resultado una fracción de azúcar bicíclica. En ciertas de tales realizaciones, la fracción de azúcar bicíclica comprende un puente entre los átomos del anillo de furanosa 4' y 2'. Los ejemplos de tales sustituyentes de azúcar puente de 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a: 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2' (“LNA”), 4'-CH2-S-2', 4'-(CH2)2-O-2' (“ENA”), 4'-CH(CH3)-O-2' (referido como "etilo restringido" o "cEt" cuando está en la configuración S), 4'-CH2-O-CH2-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2 ("MOE restringido" o "cMOE") y análogos de los mismos (ver, por ejemplo, Seth et al., U.S. 7,399,845, Bhat et al., U.S. 7,569,686, Swayze et al., U.S. 7,741,457, y Swayze et al., U.S. 8,022,193), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' y análogos del mismo (ver, por ejemplo, Seth et al., US 8.278.283), 4'-CH2-N(OCH3)-2' y análogos del mismo (ver, por ejemplo, Prakash et al., U^s 8,278,425), 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver, por ejemplo, Allerson et al., US 7,696,345 y Allerson et al., US 8,124,745), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver, por ejemplo, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134), 4'-CH2-C(=CH2)-2' y análogos del mismo (ver, por ejemplo, Seth et al., US 8.278.426), 4'-C(RaRb)-N(R)-O-2', 4'-C(RaRb)-O-N(R)-2',4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde cada R, Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C¹-C¹² (ver, por ejemplo, Imanishi et al., U.S. 7.427.672).

En ciertas realizaciones, tales puentes de 4' a 2' comprenden independientemente de 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de: -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)²-, -S(=O)x-, and -N(Ra)-;

en donde:

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰, arilo C⁵-C²⁰ sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C⁵-C⁷ , radical alicíclico C⁵-C⁷ sustituido, halógeno, OJ¹, NJ¹J² , SJ¹, N³ , COOJ¹, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)²-J¹), o sulfoxilo (S(=O)-J¹); y

cada J¹ y J² es, independientemente, H, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰, arilo C⁵-C²⁰ sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C¹-C¹², aminoalquilo C¹-C¹² sustituido, o un grupo protector.

En la técnica se conocen fracciones de azúcar bicíclicas adicionales, ver, por ejemplo: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 20017, 129, 8362-8379;Wengel et a., U.S. 7,053,207; Imanishi et al., U.S. 6,268,490; Imanishi et al. U.S. 6,770,748; Imanishi et al., U.S. RE44,779; Wengel et al., U.S. 6,794,499; Wengel et al., U.S. 6,670,461; Wengel et al., U.S.

7,034,133; Wengel et al., U.S. 8,080,644; Wengel et al., U.S. 8,034,909; Wengel et al., U.S. 8,153,365; Wengel et al., U.S. 7,572,582; and Ramasamy et al., U.S. 6,525,191;; Torsten et al., WO 2004/106356;Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al., WO 2007/134181; Seth et al., U.S. 7,547,684; Seth et al., U.S. 7,666,854; Seth et al., U.S.

8,088,746; Seth et al., U.S. 7,750,131; Seth et al., U.S. 8,030,467; Seth et al., U.S. 8,268,980; Seth et al., U.S.

8,546,556; Seth et al., U.S. 8,530,640; Migawa et al., U.S. 9,012,421; Seth et al., U.S. 8,501,805; y Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° Allerson et al., US2008/0039618 y Migawa et al., US2015/0191727.

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclicas y los nucleósidos que incorporan tales fracciones de azúcar bicíclicas se definen además por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido de LNA (descrito en la presente) puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D.

se han incorporado nucleósidos bicíclicos a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') o a-L-LNA en oligonucleótidos que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372). En la presente, las descripciones generales de los nucleósidos bicíclicos incluyen ambas configuraciones isoméricas. Cuando las posiciones de nucleósidos bicíclicos específicos (por ejemplo, LNA o cEt) se identifican en las realizaciones ejemplificadas en la presente, están en la configuración p-D, a menos que se especifique lo contrario.

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado comprenden uno o más sustituyentes de azúcar que no forman puente y uno o más sustituyentes de azúcar que forman puente (por ejemplo, azúcares 5'-sustituidos y con puente 4'-2').

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar modificado son sustitutos del azúcar. En ciertas de tales realizaciones, el átomo de oxígeno de la fracción de azúcar se reemplaza, por ejemplo, con un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En ciertas de tales realizaciones, tales fracciones de azúcar modificado también comprenden sustituyentes que forman puente y/o que no forman puente como se describe en la presente. Por ejemplo, ciertos sustitutos de azúcar comprenden un átomo de azufre 4' y una sustitución en la posición 2' (ver, por ejemplo, Bhat et al., U.S. 7,875,733 y Bhat et al., U.S. 7,939,677) y/o la posición 5'.

En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropirano ("THP") de seis miembros. Dichos tetrahidropiranos pueden modificarse o sustituirse adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden tales tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico de hexitol ("HNA'), ácido nucleico de anitol ("ANA"), ácido nucleico de manitol ("MNA") (ver, por ejemplo, Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854), fluoro HNA:

("F-HNA", ver, por ejemplo, et al., U.S. 8,088,904; Swayze et al., U.S. 8,440,803; Swayze et al., U.S. 8,796,437; y Swayze et al., U.S. 9,005,906; a F-HNA también puede hacerse referencia como F-THP o 3'-fluorotetrahidropirano) y nucleósidos que comprenden compuestos de THP modificados adicionales que tienen la fórmula:

en donde, independientemente, para cada uno de dichos nucleósidos de THP modificados:

Bx es una fracción de nucleobase;

T³ y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el nucleósido de

THP modificado con el resto de un oligonucleótido o uno de T³ y T⁴ es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el nucleósido de THP modificado con el resto de un oligonucleótido y el otro de T³ y T⁴ es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3'-terminal;

q¹, q² , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ s C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido; y

cada uno de R¹ y R² se selecciona independientemente entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ¹J² , SJ¹, N³, OC(=X)J¹, OC(=X)NJJ², NJsC(=X)NJJ² , y CN, en donde X es O, S o NJ¹, y cada J¹, J² y J³ es, independientemente, H o alquilo C¹-C⁶.

En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados en los que q¹, q² , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q¹, q² , q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q¹, q² , q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados en los que uno de R¹ y R² es F. En ciertas realizaciones, R¹ es F y R² es H, en ciertas realizaciones, R¹ es metoxi y R² es H, y en ciertas realizaciones, R¹ es metoxietoxi y R² es H.

En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 y Summerton et al.,

U.S. 5,698,685; Summerton et al. U.S. 5,166,315; Summerton et al., U.S. 5,185,444; y Summerton et al., U.S.

5,034,506). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente estructura:

En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. A tales sustitutos de azúcar se hace referencia en la presente como "morfolinos modificados".

En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden fracciones acíclicas. Los ejemplos de nucleósidos y oligonucleótidos que comprenden tales sustitutos de azúcares acíclicos incluyen, pero no se limitan a:

ácido nucleico peptídico ("PNA"), ácido nucleico de butilo acíclico (ver, por ejemplo, Kumar et al., Org. Biomol.

Chem., 2013, 11, 5853-5865), y nucleósidos y oligonucleótidos descritos en Manoharan et al., WO2011/133876.

En la técnica se conocen muchos otros azúcares y sistemas de anillos sustitutos de azúcar bicíclicos y tricíclicos que pueden usarse en nucleósidos modificados.

2. Ciertas nucleobases modificadas

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase no modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que no comprenden una nucleobase, a los que se hace referencia en la presente como nucleósidos abásicos.

En ciertas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas, pirimidinas sustituidas con alquilo o alquinilo, purinas sustituidas con alquilo y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas. En ciertas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: 2-aminopropiladenina, 5 hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-N-metilguanina, 6-N-metiladenina, 2-propiladenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinilo (-CEC-CH³) uracilo, 5-propinilcitosina, 6-azouracilo, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-ribosiluracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo, 8-aza y otras purinas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo, 5-halouracilo y 5-halocitosina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina, 3-deazaadenina, 6-N-benzoiladenina, 2-N-isobutirilguanina, 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracilo, 5-metil 4-N-benzoilcitosina, 5-metil 4-N-benzoiluracilo, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas. Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas, como 1,3-diazafenoxazina-2-ona, 1,3-diazafenotiazina-2-ona y 9-(2-aminoetoxi)-1,3-diazafenoxazina-2-ona (abrazadera G). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen las divulgadas en Merigan et al., U.S. 3,687,808, las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y.S., Cápitulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T.y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; y las divulgadas en los Capítulos 6 y 15, Antisense Drug Technology, Crooke S.T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 y 442-443.

Las publicaciones que enseñan la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen sin limitación, Manohara et al., US2003/0158403; Manoharan et al., US2003/0175906; Dinh et al., U.S. 4,845,205; Spielvogel et al., U.S. 5,130,302; Rogers et al., U.S.

5,134,066; Bischofberger et al., U.S. 5,175,273; Urdea et al., U.S. 5,367,066; Benner et al., U.S. 5,432,272; Matteucci et al., U.S. 5,434,257; Gmeiner et al., U.S. 5,457,187; Cook et al., U.S. 5,459,255; Froehler et al., U.S.

5,484,908; Matteucci et al., U.S. 5,502,177; Hawkins et al., U.S. 5,525,711; Haralambidis et al., U.S. 5,552,540; Cook et al., U.S. 5,587,469; Froehler et al., U.S. 5,594,121; Switzer et al., U.S. 5,596,091; Cook et al., U.S. 5,614,617; Froehler et al., U.S. 5,645,985; Cook et al., U.S. 5,681,941; Cook et al., U.S. 5,811,534; Cook et al., U.S. 5,750,692; Cook et al., U.S. 5,948,903; Cook et al., U.S. 5,587,470; Cook et al., U.S. 5,457,191; Matteucci et al., U.S. 5,763,588; Froehler et al., U.S. 5,830,653; Cook et al., U.S. 5,808,027; Cook et al., 6,166,199; y Matteucci et al., U.S. 6,005,096.

3. Ciertos enlaces internucleosídicos modificados

En ciertas realizaciones, los nucleósidos de oligonucleótidos modificados pueden enlazarse entre sí usando cualquier enlace internucleosídico. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleosídico se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfatos, que contienen un enlace fosfodiéster ("P=O") (también denominados enlaces no modificados o de origen natural), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos ("P= S") y fosforoditioatos ("HS-P=S"). Los grupos de enlace internucleosídicos representativos que no contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, metilenmetilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster, tionocarbamato (-O-C(=O)(NH)-S-); siloxano (-O-SH²-O-); y N,N'-dimetilhidracina (-CH²-N(CH3)-N(CH3)-). Los enlaces internucleosídicos modificados, en comparación con los enlaces fosfato de origen natural, pueden usarse para alterar, típicamente aumentar, la resistencia a la nucleasa del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral pueden prepararse como una mezcla racémica o como enantiómeros separados. Los enlaces internucleosídicos quirales representativos incluyen, pero no se limitan a, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces internucleosídicos que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los enlaces internucleosídicos neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), metoxipropilo, y tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Otros enlaces internucleosídicos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (ver por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi yP.D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, 40-65). Otros enlaces internucleosídicos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH².

B. Ciertos Motivos

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En tales realizaciones, las fracciones de azúcar modificado, no modificado y modificado de manera diferente, las nucleobases y/o los enlaces internucleosídicos de un oligonucleótido modificado definen un patrón o motivo. En ciertas realizaciones, los patrones de fracciones de azúcar, nucleobases y enlaces internucleosídicos son independientes entre sí. Por tanto, un oligonucleótido modificado puede describirse por su motivo de azúcar, motivo de nucleobase y/o motivo de enlace internucleosídico (como se usa en la presente, motivo de nucleobase describe las modificaciones a las nucleobases independientemente de la secuencia de nucleobases).

1. Ciertos motivos de azúcar

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de azúcar modificado y/o fracción de azúcar no modificado dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de azúcar. En ciertos casos, dichos motivos de azúcar incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las modificaciones de azúcar analizadas en la presente.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo gapmer, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o "hueco". Las tres regiones de un motivo gapmer (el ala 5', el hueco y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en la que por lo menos algunas de las fracciones de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de por lo menos algunas de las fracciones de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, por lo menos las fracciones de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca del hueco (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren de la fracción de azúcar de los nucleósidos del hueco colindantes, definiendo por tanto el límite entre las alas y el hueco (es decir, la unión ala/hueco). En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar dentro del hueco son iguales entre sí. En ciertas realizaciones, el hueco incluye uno o más nucleósidos que tienen una fracción de azúcar que difiere de la fracción de azúcar de uno o más nucleósidos del hueco. En ciertas realizaciones, los motivos de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (gapmer simétrico). En ciertas realizaciones, el motivo de azúcar del ala 5' difiere del motivo de azúcar del ala 3' (gapmer asimétrico).

En ciertas realizaciones, las alas de un gapmer comprenden de 1 a 5 nucleósidos. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de cada ala de un gapmer es un nucleósido modificado.

En ciertas realizaciones, el hueco de un gapmer comprende de 7 a 12 nucleósidos. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gapmer es un 2'-desoxinucleósido no modificado.

En ciertas realizaciones, el gapmer es un gapmer desoxi. En realizaciones, los nucleósidos en el lado de cada unión ala/hueco son nucleósidos 2'-desoxi no modificados y los nucleósidos en los lados del ala de cada unión ala/hueco son nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco es un nucleósido 2'-desoxi no modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de cada ala de un gapmer es un nucleósido modificado.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar completamente modificado. En tales realizaciones, cada nucleósido de la región completamente modificada del oligonucleótido modificado comprende una fracción de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del oligonucleótido modificado completo comprende una fracción de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar completamente modificado, en donde cada nucleósido dentro de la región completamente modificada comprende la misma fracción de azúcar modificado, referido en la presente motivo de azúcar uniformemente modificado. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido completamente modificado es un oligonucleótido uniformemente modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de un uniformemente modificado comprende la misma modificación 2'. 2. Ciertos motivos de nucleobases

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden nucleobases modificadas y/o no modificadas dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo definido. En ciertas realizaciones, cada nucleobase está modificada. En ciertas realizaciones, ninguna de las nucleobases está modificada. En ciertas realizaciones, se modifica cada purina o cada pirimidina. En ciertas realizaciones, se modifica cada adenina. En ciertas realizaciones, se modifica cada guanina. En ciertas realizaciones, se modifica cada timina. En ciertas realizaciones, se modifica cada uracilo. En ciertas realizaciones, se modifica cada citosina. En ciertas realizaciones, algunas o todas las nucleobases de citosina en un oligonucleótido modificado son 5-metilcitosinas.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En ciertas de tales realizaciones, el bloque está en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está en el extremo 5' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleósidos del extremo 5' del oligonucleótido.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo gapmer comprenden un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En ciertas de tales realizaciones, un nucleósido que comprende una nucleobase modificada está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmer. En ciertas de tales realizaciones, la fracción de azúcar de dicho nucleósido es una fracción 2'-desoxirribosilo. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada se selecciona de: una 2-tiopirimidina y una 5-propinepirimidina.

3. Ciertos motivos de enlace internucleosídico

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados y/o no modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo definido. En ciertas realizaciones, cada grupo de enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosfodiéster (P=O). En ciertas realizaciones, cada grupo de enlace internucleosídico de un oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido modificado se selecciona independientemente de un enlace internucleosídico fosforotioato y un enlace internucleosídico fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el motivo de azúcar de un oligonucleótido modificado es un gapmer y todos los enlaces internucleosídicos dentro del hueco están modificados. En ciertas de tales realizaciones, algunos o todos los enlaces internucleosídicos en las alas son enlaces fosfato no modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos terminales están modificados.

C. Ciertas longitudes

Es posible aumentar o disminuir la longitud de un oligonucleótido sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de malapareamiento cerca de los extremos de los oligonucleótidos fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos que no contenían malapareamientos. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró usando oligonucleótidos de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.

Los oligonucleótidos (incluyendo los oligonucleótidos modificados) pueden tener cualquiera de una variedad de rangos de longitudes. Los oligonucleótidos pueden consistir en nucleósidos enlazados de X a Y, donde X representa el menor número de nucleósidos en el intervalo e Y representa el mayor número de nucleósidos en el intervalo. X e Y se seleccionan cada uno independientemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, y 50; siempre que X<Y. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden consistir en de 12 a 13, de 12 a 14, de 12 a 15, de 12 a 16, de 12 a 17, de 12 a 18, de 12 a 19, de 12 a 20, de 12 a 21, de 12 a 22, de 12 a 23, de 12 a 24, de 12 a 25, de 12 a 26, de 12 a 27, de 12 a 28, de 12 a 29, de 12 a 30, de 13 a 14, de 13 a 15, de 13 a 16, de 13 a 17, de 13 a 18, de 13 a 19, de 13 a 20, de 13 a 21, de 13 a 22, de 13 a 23, de 13 a 24, de 13 a 25, de 13 a 26, de 13 a 27, de 13 a 28, de 13 a 29, de 13 a 30, de 14 a 15, de 14 a 16, de 14 a 17, de 14 a 18, de 14 a 19, de 14 a 20, de 14 a 21, de 14 a 22, de 14 a 23, de 14 a 24, de 14 a 25, de 14 a 26, de 14 a 27, de 14 a 28, de 14 a 29, de 14 a 30, de 15 a 16, de 15 a 17, de 15 a 18, de 15 a 19, de 15 a 20, de 15 a 21, de 15 a 22, de 15 a 23, de 15 a 24, de 15 a 25, de 15 a 26, de 15 a 27, de 15 a 28, de 15 a 29, de 15 a 30, de 16 a 17, de 16 a 18, de 16 a 19, de 16 a 20, de 16 a 21, de 16 a 22, de 16 a 23, de 16 a 24, de 16 a 25, de 16 a 26, de 16 a 27, de 16 a 28, de 16 a 29, de 16 a 30, de 17 a 18, de 17 a 19, de 17 a 20, de 17 a 21, de 17 a 22, de 17 a 23, de 17 a 24, de 17 a 25, de 17 a 26, de 17 a 27, de 17 a 28, de 17 a 29, de 17 a 30, de 18 a 19, de 18 a 20, de 18 a 21, de 18 a 22, de 18 a 23, de 18 a 24, de 18 a 25, de 18 a 26, de 18 a 27, de 18 a 28, de 18 a 29, de 18 a 30, de 19 a 20, de 19 a 21, de 19 a 22, de 19 a 23, de 19 a 24, de 19 a 25, de 19 a 26, de 19 a 29, de 19 a 28, de 19 a 29, de 19 a 30, de 20 a 21, de 20 a 22, de 20 a 23, de 20 a 24, de 20 a 25, de 20 a 26, de 20 a 27, de 20 a 28, de 20 a 29, de 20 a 30, de 21 a 22, de 21 a 23, de 21 a 24, de 21 a 25, de 21 a 26, de 21 a 27, de 21 a 28, de 21 a 29, de 21 a 30, de 22 a 23, de 22 a 24, de 22 a 25, de 22 a 26, de 22 a 27, de 22 a 28, de 22 a 29, de 22 a 30, de 23 a 24, de 23 a 25, de 23 a 26, de 23 a 27, de 23 a 28, de 23 a 29, de 23 a 30, de 24 a 25, de 24 a 26, de 24 a 27, de 24 a 28, de 24 a 29, de 24 a 30, de 25 a 26, de 25 a 27, de 25 a 28, de 25 a 29, de 25 a 30, de 26 a 27, de 26 a 28, de 26 a 29, de 26 a 30, de 27 a 28, de 27 a 29, de 27 a 30, de 28 a 29, de 28 a 30, o de 29 a 30 nucleósidos enlazados.

D. Ciertos oligonucleótidos modificados

En ciertas realizaciones, las modificaciones anteriores (azúcar, nucleobase, enlace internucleosídico) se incorporan en un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados se caracterizan por sus motivos de modificación y longitudes totales. En ciertas realizaciones, tales parámetros son independientes entre sí. Por tanto, a menos que se indique lo contrario, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gapmer puede modificarse o no modificarse y puede seguir o no el patrón de modificación del gapmer de las modificaciones de azúcar. Por ejemplo, los enlaces internucleosídicos dentro de las regiones del ala de un gapmer de azúcar pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleosídicos de la región de hueco del motivo del azúcar. De igual manera, dichos oligonucleótidos gapmer de azúcar pueden comprender una o más nucleobases modificadas independientemente del patrón de gapmer de las modificaciones de azúcar. A menos que se indique lo contrario, todas las modificaciones son independientes de la secuencia de nucleobases.

E. Secuencia de nucleobases

Los oligonucleótidos (oligonucleótidos no modificados o modificados) se describen además por su secuencia de nucleobases. Los oligonucleótidos tienen una secuencia de nucleobases que es complementaria a un segundo oligonucleótido o un ácido nucleico de referencia identificado, como un ácido nucleico objetivo. Una región de un oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobases que es complementaria a un segundo oligonucleótido o un ácido nucleico de referencia identificado, como un ácido nucleico objetivo. La secuencia de nucleobases de una región o la longitud total de un oligonucleótido es por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, o un 100% complementaria al segundo oligonucleótido o ácido nucleico, como un ácido nucleico objetivo.

II. Ciertos compuestos oligoméricos

Los compuestos oligoméricos pueden consistir en un oligonucleótido (modificado o no modificado) y opcionalmente uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales. Los grupos conjugados consisten en uno o más fracciones conjugadas y un conector conjugado que enlaza la fracción conjugada al oligonucleótido. Los grupos conjugados pueden unirse a uno o ambos extremos de un oligonucleótido y/o en cualquier posición interna. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados se unen a la posición 2' de un nucleósido de un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados que están unidos a cualquiera o ambos extremos de un oligonucleótido son grupos terminales. En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados o los grupos terminales se unen en el extremo 3' y/o 5' de los oligonucleótidos. En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados (o grupos terminales) se unen en el extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados se unen cerca del extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados (o grupos terminales) se unen en el extremo 5' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados se unen cerca del extremo 5' de los oligonucleótidos.

Los ejemplos de grupos terminales incluyen, pero no se limitan a, grupos conjugados, grupos de caperuza, fracciones de fosfato, grupos protectores, nucleósidos modificados o no modificados y dos o más nucleósidos que están independientemente modificados o no modificados.

A. Ciertos grupos conjugados

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos se unen covalentemente a uno o más grupos conjugados. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, incluyendo pero no limitado a, la farmacodinámica, la farmacocinética, la estabilidad, la unión, la absorción, la distribución tisular, la distribución celular, la captación celular, la carga y la depuración. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados imparten una nueva propiedad al oligonucleótido unido, por ejemplo, fluoróforos o grupos informadores que permiten la detección del oligonucleótido. Con anterioridad se han descrito ciertos grupos conjugados y fracciones conjugadas, por ejemplo: fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg Med. Chem. Lett.,1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de do-decan-diol o undiceilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111­ 1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochem., 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético de adamantano, una fracción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937), un grupo tocoferol (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; y Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740), o un grupo GalNAc (por ejemplo, WO2014/179620).

1. Fracciones conjugadas

Las fracciones conjugadas incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, péptidos, carbohidratos, fracciones de vitaminas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesterol, fracciones de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas, fluoróforos y colorantes.

En ciertas realizaciones, una fracción conjugada comprende una sustancia farmacéutica activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fen-bufen, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, fingolimod, ácido flufenámico, ácido folínico, benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbitúrico, una cefalosporina, un fármaco de sulfonamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

2. Conectores conjugados

Las fracciones conjugadas se unen a los oligonucleótidos a través de conectores conjugados. En ciertos compuestos oligoméricos, el conector conjugado es un enlace químico simple (es decir, la fracción conjugada se une directamente a un oligonucleótido a través de un enlace simple). En ciertas realizaciones, el conector conjugado comprende una estructura de cadena, como una cadena de hidrocarbilo, o un oligómero de unidades repetitivas, como unidades de etilenglicol, nucleósidos o aminoácidos.

En ciertas realizaciones, un conector conjugado comprende uno o más grupos seleccionados de alquilo, amino, oxo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxilamino. En ciertas de tales realizaciones, el conector conjugado comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amino, oxo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el conector conjugado comprende grupos seleccionados de grupos alquilo y amida. En ciertas realizaciones, el conector conjugado comprende grupos seleccionados de grupos alquilo y éter. En ciertas realizaciones, el conector conjugado comprende por lo menos una fracción de fósforo. En ciertas realizaciones, el conector conjugado comprende por lo menos un grupo fosfato. En ciertas realizaciones, el conector conjugado incluye por lo menos un grupo de enlace neutro.

En ciertas realizaciones, los conectores conjugados, incluyendo los conectores conjugados descritos anteriormente, son fracciones de enlace bifuncionales, por ejemplo, aquellos conocidos en la técnica por ser útiles para unir grupos conjugados a compuestos originales, como los oligonucleótidos proporcionados en la presente. En general, una fracción de enlace bifuncional comprende por lo menos dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona para unirse a un sitio particular en un compuesto original y el otro se selecciona para unirse a un grupo conjugado. Los ejemplos de grupos funcionales usados en una fracción de enlace bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electrófilos para reaccionar con grupos nucleofílicos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrofílicos. En ciertas realizaciones, las fracciones de enlace bifuncionales comprenden uno o más grupos seleccionados de amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, alquilo, alquenilo,

Los ejemplos de conectores conjugados incluyen, pero no se limitan a, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros conectores conjugados incluyen, pero no se limitan a, alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido, alquenilo C^2-10 sustituido o no sustituido o alquinilo C²-C¹⁰ sustituido o no sustituido, en donde una lista no limitativa de grupos sustituyentes preferidos incluye hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.

En ciertas realizaciones, los conectores conjugados comprenden 1-10 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados comprenden 2-5 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados comprenden exactamente 3 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados comprenden el motivo TCA. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos conectores son nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos conectores comprenden una fracción de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los nucleósidos conectores no están modificados. En ciertas realizaciones, los nucleósidosconectores comprenden una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un nucleósido seleccionado de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. Típicamente, es deseable que los nucleósidos conectores se escindan del compuesto oligomérico después de que alcance un tejido objetivo. Por consiguiente, los nucleósidos conectores se enlazan típicamente entre sí y con el resto del compuesto oligomérico a través de enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, tales enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster.

En la presente, los nucleósidos conectores no se consideran parte del oligonucleótido. Por consiguiente, en las realizaciones en las que un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido que consiste en un número o intervalo especificado de nucleósidos enlazados y/o un porcentaje especificado de complementariedad con un ácido nucleico de referencia y el compuesto oligomérico también comprende un grupo conjugado que comprende un conector conjugado que comprende nucleósidos conectores, esos nucleósidos conectores no se cuentan en la longitud del oligonucleótido y no se usan para determinar el porcentaje de complementariedad del oligonucleótido para el ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, un compuesto oligomérico puede comprender (1) un oligonucleótido modificado que consiste en 8-30 nucleósidos y (2) un grupo conjugado que comprende 1-10 nucleósidos conectores que son contiguos a los nucleósidos del oligonucleótido modificado. El número total de nucleósidos enlazados contiguos en dicho compuesto oligomérico es de más de 30. Alternativamente, un compuesto oligomérico puede comprender un oligonucleótido modificado que consiste en 8-30 nucleósidos y ningún grupo conjugado. El número total de nucleósidos enlazados contiguos en un compuesto oligomérico de este tipo no es de más de 30. A menos que se indique lo contrario, los conectores conjugados no comprenden más de 10 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados no comprenden más de 5 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados no comprenden más de 3 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados no comprenden más de 2 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores conjugados no comprenden más de 1 nucleósido conector.

En ciertas realizaciones, es deseable que un grupo conjugado se escinda del oligonucleótido. Por ejemplo, en ciertas circunstancias, los compuestos oligoméricos que comprenden una fracción conjugada particular son absorbidos mejor por un tipo de célula particular, pero una vez que el compuesto oligomérico ha sido absorbido, es deseable que el grupo conjugado se escinda para liberar el oligonucleótido original o no conjugado. Por tanto, ciertos conectores conjugados pueden comprender una o más fracciones escindibles. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un enlace escindible. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un grupo de átomos que comprende por lo menos un enlace escindible. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, una fracción escindible se escinde selectivamente dentro de una célula o compartimento subcelular, como un lisosoma. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es escindida selectivamente por enzimas endógenas, como nucleasas.

En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona entre: una amida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato o un disulfuro. En ciertas realizaciones, un enlace escindible es uno o ambos ésteres de un fosfodiéster. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un enlace de fosfato entre un oligonucleótido y una fracción conjugada o grupo conjugado.

En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende o consiste en uno o más nucleósidos conectores. En ciertas de tales realizaciones, el uno o más nucleósidos conectores están enlazados entre sí y/o al resto del compuesto oligomérico a través de enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, tales enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster no modificados. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un nucleósido 2'-desoxi que se une al nucleósido 3' o 5'-terminal de un oligonucleótido mediante un enlace internucleosídico de fosfato y se une covalentemente al resto del conector conjugado o fracción conjugada mediante un enlace fosfato o fosforotioato. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible es 2'-desoxiadenosina.

III. Compuestos oligoméricos duplexados

Los compuestos oligoméricos descritos en la presente comprenden un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico se empareja con un segundo compuesto oligomérico para formar un dúplex oligomérico. Dichos dúplex oligoméricos comprenden un primer compuesto oligomérico que tiene una región complementaria a un ácido nucleico objetivo y un segundo compuesto oligomérico que tiene una región complementaria al primer compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el primer compuesto oligomérico de un dúplex oligomérico comprende o consiste en (1) un oligonucleótido modificado o no modificado y opcionalmente un grupo conjugado y (2) un segundo oligonucleótido modificado o no modificado y opcionalmente un grupo conjugado. Cualquiera o ambos compuestos oligoméricos de un dúplex oligomérico pueden comprender un grupo conjugado. Los oligonucleótidos de cada compuesto oligomérico de un dúplex oligomérico pueden incluir nucleósidos salientes no complementarios.

IV. Actividad antisentido

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos y los dúplex oligoméricos son capaces de hibridar con un ácido nucleico objetivo, dando como resultado por lo menos una actividad antisentido; tales compuestos oligoméricos y dúplex oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido afectan selectivamente a uno o más ácidos nucleicos objetivo. Tales compuestos antisentido comprenden una secuencia de nucleobases que hibrida con uno o más ácidos nucleicos objetivo, lo que da como resultado una o más actividades antisentido deseadas y no hibrida con uno o más ácidos nucleicos no objetivo o no hibrida con uno o más ácidos nucleicos no objetivo de tal manera que da como resultado una actividad antisentido significativa no deseada.

En ciertas actividades antisentido, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde el ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, ciertos compuestos antisentido dan como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo mediada por RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. El ADN en dicho dúplex ARN:ADN no necesita ser ADN no modificado. En ciertas realizaciones, se describen en la presente compuestos antisentido que son suficientemente "similares al ADN" para provocar la actividad de la ARNasa H. En ciertas realizaciones, se tolera uno o más nucleósidos no similares a ADN en el hueco de un gapmer.

En ciertas actividades antisentido, un compuesto antisentido o una porción de un compuesto antisentido se carga en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), lo que da como resultado en última instancia la escisión del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, ciertos compuestos antisentido dan como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo por Argonaute. Los compuestos antisentido que se cargan en RISC son compuestos de ARNi. Los compuestos de ARNi pueden ser de cadena doble (ARNdc) o de cadena sencilla (ARNmc).

En ciertas realizaciones, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo no da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde ese ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo da como resultado la alteración del corte y empalme del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado la inhibición de una interacción de unión entre el ácido nucleico objetivo y una proteína u otro ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado la alteración o traducción del ácido nucleico objetivo.

Las actividades antisentido pueden observarse directa o indirectamente. En ciertas realizaciones, la observación o detección de una actividad antisentido implica la observación o detección de un cambio en la cantidad de un ácido nucleico o proteína objetivo codificados por dicho ácido nucleico objetivo, un cambio en la proporción de variantes de corte y empalme de un ácido nucleico o proteína, y/o un cambio fenotípico en una célula o animal. V. Ciertos ácidos nucleicos objetivo

Los compuestos oligoméricos pueden comprender o consistir en un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a un ácido nucleico objetivo. El ácido nucleico objetivo puede ser una molécula de ARN endógeno. El ácido nucleico objetivo puede codificar una proteína. El ácido nucleico objetivo puede seleccionarse de: un ARNm maduro y un pre-ARNm, incluyendo regiones intrónicas, exónicas y no traducidas. El ARN objetivo puede ser ARNm maduro. El ácido nucleico objetivo puede ser un pre-ARNm. La región objetivo puede estar completamente dentro de un intrón. La región objetivo puede abarcar una unión de intrón/exón. La región objetivo puede estar por lo menos en un 50% dentro de un intrón.

El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN no codificante. El ARN no codificante objetivo puede seleccionarse de: un ARN no codificante largo, un ARN no codificante corto, una molécula de ARN intrónico, un ARNsno, un ARNsca, un microARN (incluyendo pre-microARN y microARN maduro), un ARN ribosómico y ARN dirigido por promotor. El ácido nucleico objetivo puede ser un ácido nucleico distinto de un ARNm maduro. El ácido nucleico objetivo puede ser un ácido nucleico distinto de un ARNm maduro o un microARN. El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN no codificante distinto de un microARN. El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN no codificante distinto de un microARN o una región intrónica de un pre-ARNm. El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN largo no codificante. El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN no codificante asociado con el corte y empalme de otros pre-ARNm. El ácido nucleico objetivo puede ser un ARN no codificante retenido en el núcleo.

Los compuestos oligoméricos descritos en la presente pueden ser complementarios a un ácido nucleico objetivo que comprende un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). El compuesto oligomérico puede ser capaz de modular la expresión de un alelo del ácido nucleico objetivo que contiene SNP en mayor o menor medida de lo que modula otro alelo. Un compuesto oligomérico hibrida con un ácido nucleico objetivo que contiene (SNP) en el sitio de polimorfismo de un solo nucleótido.

Los compuestos oligoméricos son por lo menos parcialmente complementarios a más de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, los compuestos oligoméricos descritos en la presente pueden imitar los microARN, que normalmente se unen a múltiples objetivos.

A. Complementariedad/malapareamientos con el ácido nucleico objetivo

Es posible introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst.

93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo. Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos de 14 nucleobases por sí solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos de 28 o 42 nucleobases.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden oligonucleótidos que son complementarios al ácido nucleico objetivo en toda la longitud del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos son un 99%, 95%, 90%, 85% u 80% complementarios al ácido nucleico objetivo. Los oligonucleótidos pueden ser por lo menos un 80% complementarios al ácido nucleico objetivo en toda la longitud del oligonucleótido y comprenden una región que es un 100% o completamente complementaria a un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la región de complementariedad total tiene una longitud de 6 a 20, de 10 a 18 o de 18 a 20 nucleobases.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más nucleobases malapareadas con respecto al ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido contra el objetivo se reduce por tal malapareamiento, pero la actividad contra un no objetivo se reduce en una cantidad mayor. Por tanto, en ciertas realizaciones se mejora la selectividad del compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el malpareamiento se posiciona específicamente dentro de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, el malapareamiento está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 desde el extremo 5' de la región de hueco. En ciertas realizaciones, el malapareamiento está en la posición 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 desde el extremo 3' de la región de hueco. En ciertas realizaciones, el malapareamiento está en la posición 1, 2, 3 o 4 desde el extremo 5' de la región de ala. En ciertas realizaciones, el malapareamiento está en la posición 4, 3, 2 o 1 desde el extremo 3' de la región de ala.

B. C9ORF72

Los compuestos oligoméricos descritos en la presente comprenden o consisten en cualquier oligonucleótido que comprenda una región que sea complementaria a un ácido nucleico objetivo, en donde el ácido nucleico objetivo es C9ORF72. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico C9ORF72 tiene la secuencia expuesta en el N° de registro de GENBANK NM_018325.4 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1) o el complemento del N° de registro de GENBANK NT_008413.18 truncado de la nucleobase 27535000 a 27565000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2).

En ciertas realizaciones, poner en contacto una célula con un oligonucleótido complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 reduce la cantidad de ARN de C9ORF72. En ciertas realizaciones, poner en contacto una célula con un oligonucleótido complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 reduce la cantidad de proteína C9ORF72 total. En ciertas realizaciones, poner en contacto una célula con un compuesto oligomérico complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 mejora uno o más síntomas de una enfermedad neurodegenerativa, como ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria.

C. Ciertos ácidos nucleicos objetivo en ciertos tejidos

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden o consisten en un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a un ácido nucleico objetivo, en donde el ácido nucleico objetivo se expresa en tejido del SNC, incluyendo la médula espinal y la corteza.

VI. Ciertas composiciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, en la presente se describen composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos oligoméricos o una sal de los mismos. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos oligoméricos. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos oligoméricos. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es una solución salina de calidad farmacéutica. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos oligoméricos y agua estéril. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en un compuesto oligomérico y agua estéril. En ciertas realizaciones, el agua estéril es agua de calidad farmacéutica. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos oligoméricos y solución salina tamponada con fosfato (PBS). En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos oligoméricos y PBS estéril. En ciertas realizaciones, el PBS estéril es PBS de calidad farmacéutica.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más compuestos oligoméricos y uno o más excipientes. En ciertas realizaciones, los excipientes se seleccionan de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos pueden mezclarse con sustancias activas y/o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto oligomérico abarcan cualquier sal farmacéuticamente aceptable del compuesto oligomérico, ésteres del compuesto oligomérico o sales de tales ésteres. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos oligoméricos que comprenden uno o más oligonucleótidos, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, son capaces de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o el residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos oligoméricos, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio. En ciertas realizaciones, los profármacos comprenden uno o más grupos conjugados unidos a un oligonucleótido, en donde el grupo conjugado es escindido por nucleasas endógenas dentro del cuerpo.

Las fracciones lipídicas se han usado en terapias con ácidos nucleicos en una variedad de métodos. En ciertos de tales métodos, el ácido nucleico, como un compuesto oligomérico, se introduce en liposomas o lipoplejos preformados hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En ciertos métodos, se forman los complejos de ADN con lípidos mono o policatiónicos sin la presencia de un lípido neutro. En ciertas realizaciones, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico a una célula o tejido particular. En ciertas realizaciones, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico al tejido adiposo. En ciertas realizaciones, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico al tejido muscular.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un sistema de administración. Los ejemplos de sistemas de administración incluyen, pero no se limitan a, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de administración son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas, incluyendo las que comprenden compuestos hidrofóbicos. En ciertas realizaciones, se usan ciertos solventes orgánicos como dimetilsulfóxido.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden una o más moléculas de administración específicas de tejido diseñadas para administrar uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención a tejidos o tipos de células específicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un sistema cosolvente. Ciertos de tales sistemas cosolventes comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, dichos sistemas de cosolventes se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitativo de dicho sistema cosolvente es el sistema cosolvente VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende el 3% p/v de alcohol bencílico, el 8% p/v del surfactante no polar Polysorbate 80™ y el 65% p/v polietilenglicol 300. Las proporciones de tales sistemas cosolventes pueden variar considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del cosolvente puede variar: por ejemplo, pueden usarse otros surfactantes en lugar de Polysorbate 80™; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variar; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración oral. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración bucal. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica se prepara para administración por inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal, intracerebroventricular, etc.). En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica comprende un portador y se formula en una solución acuosa, como agua o tampones fisiológicamente compatibles, como la solución de Hanks, la solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. En ciertas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan usando portadores líquidos, agentes de suspensión y similares apropiados. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Ciertos solventes adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a, solventes lipófilos y aceites grasos, como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener.

Divulgación no limitativa

Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretende que limiten la misma.

Aunque el listado de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como "ARN" o "ADN", según se requiera, en realidad, esas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que dicha designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende una fracción de azúcar 2'-OH y una base de timina podría describirse como un ADN que tiene un azúcar modificado (2'-OH en lugar de un 2'-H de ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) en lugar de un uracilo de ARN). Por consiguiente, se pretende que las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente, incluyendo pero no limitadas a, las que se encuentran en el listado de secuencias, abarquen ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de ARN y/o ADN natural o modificado, incluyendo pero no limitado a, dichos ácidos nucleicos que tienen nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobases "ATCGATCG" abarca cualquier compuesto oligomérico que tenga dicha secuencia de nucleobases, ya sea modificado o no modificado, incluyendo pero no limitados a, compuestos que comprenden bases de ARN, como los que tienen secuencia "AUCGAUCG" y aquellos que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN como "AUCGATCG" y compuestos oligoméricos que tienen otras nucleobases modificadas, como "ATmCGAUCG", en donde mC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en la posición 5.

Ciertos compuestos descritos en la presente (por ejemplo, oligonucleótidos modificados) tienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisoméricaas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), como a o p, como para los anómeros de azúcar, o como (D) o (L), como para los aminoácidos, etc. En los compuestos proporcionados en la presente se incluyen todos los posibles isómeros, incluyendo sus formas racémicas y ópticamente puras, a menos que se especifique lo contrario. De igual manera, también se incluyen todos los isómeros cis y trans y las formas tautoméricas a menos que se indique lo contrario. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los compuestos descritos en la presente incluyan las formas de sal correspondientes.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente divulgación y no son limitativos. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un apoyo razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o uno similar. Y, por ejemplo, cuando una modificación particular de alta afinidad aparece en una posición particular, se consideran adecuadas otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: Oligonucleótidos modificados dirigidos a C9ORF72 humano

El oligonucleótido modificado de la siguiente tabla es un gapmer MOE. El segmento de hueco central del gapmer contiene 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' que contienen nucleósidos que comprenden cada uno un grupo 2'-MOE. El motivo específico del gapmer se enumera en la siguiente tabla, representado por tres números separados por guiones. Los números representan el número de nucleósidos en el ala 5', el hueco y el ala 3', respectivamente. Todos los residuos de citosina a lo largo del oligonucleótido son 5-metilcitosinas. Los enlaces internucleosídicos para el gapmer son enlaces mixtos de fosforotioato y fosfodiéster. Los enlaces internucleosídicos para el gapmer se presentan en la columna Enlace, donde 'o' indica un enlace fosfodiéster y 's' indica un enlace fosforotioato.

El oligonucleótido modificado enumerado en la siguiente tabla está dirigido a la secuencia genómica de C9ORF72 humano, designada en la presente SEQ ID NO: 2 (el complemento del N° de registro de GENBANK NT_008413.18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 27565000). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia genómica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia genómica humana.

Tabla 1

Ejemplo 2: Inhibición de la respuesta a la dosis in vitro del ARN de C9ORF72 patógeno humano en células HepG2 con 672681

El Compuesto N° 672681 se probó a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,11 pM, 0,33 pM, 1,00 pM o 3,00 pM de oligonucleótido modificado. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de C9ORF72 mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando un conjunto de sonda con cebador humano RTS3905 (cebador directo: GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, designado en la presente como SEQ ID NO: 3; cebador inverso: GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, designado en la presente como SEQ ID NO: 4; sonda: TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, designada en la presente como SEQ ID NO: 5 - un conjunto de sonda con cebador TAQ-man). Se usó el conjunto de sonda con cebador RTS3905 para medir el ARN patógeno de C9ORF72, que es el producto de un pre-ARNm que contiene una repetición de hexanucleótidos. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustaron de acuerdo con el contenido de a Rn total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 2 a continuación como porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de C9ORF72 humano, con respecto a las células de control no tratadas.

Tabla 2

Ejemplo 3: Inhibición del ARN de C9ORF72 humano en ratones transgénicos

La inhibición del ARN de C9ORF72 se probó usando el Compuesto N° 672681 en una línea de ratones transgénicos BAC, designada en la presente como C9B183. La línea de ratón C9B183 expresa un gen C9ORF72 humano truncado que comprende los exones 1-5. El gen C9ORF72 humano truncado de la línea de ratón C9B183 contiene 450 repeticiones de hexanucleótidos.

Cada uno de los ratones C9B183 de 3 meses de edad recibió una única inyección estereotáctica intracerebroventricular (ICV) en el ventrículo derecho de 350 pg del Compuesto N° 672681 o un oligonucleótido de control que no se dirige a C9ORF72 humano en 10 pl de volumen total de PBS. Cada grupo de tratamiento consistía en seis ratones. Dos semanas después del tratamiento con oligonucleótidos, se sacrificaron los ratones y se recogieron tejidos de la médula espinal y la corteza de cada ratón. El ARN total de cada tejido se aisló con TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la primera cadena de ADNc se sintetizó usando el kit de síntesis de la primera cadena SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CAa). La RT-qPCR del ARN de C9ORF72 patógeno humano se realizó usando el conjunto de sonda con cebador RTS3905 (ver el Ejemplo 2) y se normalizó a GAPDH. Los resultados medios para cada grupo de tratamiento se presentan en la tabla a continuación como porcentaje de inhibición normalizado de ARN de C9ORF72 con respecto a los ratones tratados con control.

Tabla 3

Ejemplo 4: Efectos conductuales de la inhibición mediada por oligonucleótidos modificados del ARN de C9ORF72 humano

Cada uno de los ratones de tipo salvaje y C9B183 de nueve meses de edad recibió una única inyección estereotáctica ICV en el ventrículo derecho de 350 pg de Isis N° 672681 o un oligonucleótido de control que no se dirige a C9ORF72 humano en 10 pl de volumen total de PBS. Cada grupo de tratamiento consistía en de diez a trece ratones. A los 12 y 15 meses de edad se evaluaron las conductas relacionadas con la ansiedad y la cognición que se describen a continuación, excepto el laberinto del brazo radial, que se evaluó solo a los 12 meses.

Entierro de canicas

Los ratones se colocaron individualmente en una jaula estándar para ratones que contenía ropa de cama de 5 cm de profundidad, con 20 canicas pequeñas dispuestas en 4 filas espaciadas uniformemente de 5 encima del material de cama. Después de 20 minutos, se retiraron los ratones y se determinó el número de canicas enterradas (las canicas que estaban por lo menos 2/3 cubiertas por ropa de cama se contaron como enterradas). El aumento del enterramiento de canicas se asocia con un aumento del comportamiento relacionado con la ansiedad. Los resultados se presentan en la tabla siguiente como el porcentaje medio de canicas enterradas para cada grupo de tratamiento.

Laberinto superior elevado

El aparato de laberinto superior tenía cuatro brazos (5 x 30 cm) en ángulo recto entre sí y estaba elevado a 30 cm del suelo. Dos de los brazos tenían paredes de 16 cm de alto (brazos cerrados) y dos brazos tenían un borde de 0,5 cm, pero no tenían paredes (brazos abiertos). Los ratones se colocaron en el centro del laberinto y se les permitió el acceso libre a los cuatro brazos durante 5 minutos. El comportamiento se registró usando una cámara montada encima del aparato. Un mayor porcentaje de tiempo que se pasa en los brazos cerrados se asocia con un mayor comportamiento relacionado con la ansiedad. Los resultados se presentan en la tabla como el porcentaje medio de tiempo pasado en los brazos abiertos para cada grupo de tratamiento.

Laberinto de Barnes

Se usó un disco de plexiglás opaco de 75 cm de diámetro y elevado 58 cm sobre el suelo en un trípode como laberinto de Barnes. Se colocaron veinte orificios, de 5 cm de diámetro cada uno, a 5 cm del perímetro y debajo de uno de los orificios se colocó una caja de escape de plexiglás negro (19 x 8 x 7 cm). Se colocaron señales espaciales distintas alrededor del laberinto y se mantuvieron constantes durante todo el estudio. El primer día de las pruebas se realizó una sesión de entrenamiento en la que se colocó al ratón en la caja de escape durante cinco minutos. Un minuto después, se inició la primera sesión. Al comienzo de cada sesión, el ratón se colocó en el medio de la plataforma en una cámara de inicio cilíndrica negra de 10 cm de alto. Después de 10 segundos, se retiró la cámara de inicio, se encendió una luz (400 lux) y se permitió al ratón explorar libremente el laberinto. La sesión finalizaba cuando el ratón entraba en el túnel de escape o transcurridos 3 minutos. Cuando el ratón entró en el túnel de escape, la luz se apagó y el ratón permaneció en la oscuridad durante un minuto. Cuando el ratón no entraba por sí mismo en el túnel, se lo colocaba suavemente en la caja de escape durante un minuto. El túnel siempre estuvo localizado por debajo del mismo agujero (estable dentro del entorno espacial), que se determinó aleatoriamente para cada ratón. Los ratones se probaron una vez al día durante 9 días. Se tabuló el número de errores al encontrar la cámara de escape uno cada día de prueba para cada ratón. Los resultados se presentan en la tabla siguiente como el número medio de errores para cada grupo de tratamiento durante los días 7 a 9 de la prueba. El laberinto de Barnes es una medida del aprendizaje espacial y la memoria.

Laberinto de brazo radial

Antes del comienzo del estudio, todos los animales se sometieron a un período de restricción de alimentos de 5 días en el que sus pesos corporales se redujeron al 90% del peso original restringiendo el alimento disponible a 2 gramos de comida para animales por ratón. Una vez que cada animal alcanzó el peso objetivo del 90% del peso corporal original, las raciones de alimentos se ajustaron de acuerdo con este peso. El propósito de la privación de alimentos fue establecer la comida como un motivador. Luego, los ratones fueron entrenados diariamente en un laberinto elevado de 8 brazos radiales, con una taza de comida circular empotrada colocada al final de cada brazo. Los primeros 3 días sirvieron como período de familiarización para los ratones. El primer día, cada ratón se colocó en el laberinto durante 10 minutos sin comida presente. En los siguientes dos días, la comida se esparció en la plataforma central y en toda la longitud de cuatro de los brazos del laberinto. Los cuatro brazos que contenían comida se distribuyeron al azar por todo el laberinto (por ejemplo, los brazos 1, 4, 5 y 7 se cebaron con comida). Después de completar la fase de familiarización, los gránulos de comida se colocaron solo en las tazas de comida al final de los cuatro brazos designados. Cada ratón permaneció en el laberinto hasta que encontró las cuatro tazas de comida o hasta que transcurrieron 10 minutos. Durante cada prueba, se registró el número y el orden de los brazos en los que se introdujo cada ratón. Las entradas en los brazos que nunca habían contenido comida después de la fase de familiarización se consideraron errores en la memoria de referencia. Volver a introducirse en un brazo en el que ya se había introducido anteriormente se consideró un error en la memoria de trabajo. Los resultados se presentan en la tabla siguiente como el número total medio de errores para cada grupo de tratamiento en el día de prueba indicado.

Tabla 4

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido modificado para su uso en la mejora o prevención de por lo menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa, en donde el oligonucleótido modificado consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que es por lo menos un 90% complementaria a un ácido nucleido de C9ORF72, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, o 18 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 6, y en donde el por lo menos un síntoma es cualquiera de ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria

2. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad neurodegenerativa es cualquiera de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniano atípico y degeneración olivopontocerelar (OPCD).

3. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el oligonucleótido complementario tiene una secuencia de nucleobases que es por lo menos un 90% complementaria, por lo menos un 95% complementaria, o un 100% complementaria con la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 1 o 2, cuando se mide a través de la secuencia de nucelobases completa del oligonucleótido modificado.

4. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:

a. el compuesto oligomérico se administra antes de la detección del por lo menos un síntoma;

b. la mejora es la ralentización de la progresión de por lo menos un síntoma.

c. la mejora es el retraso del inicio de por lo menos un síntoma.

d. la mejora es la reducción de la gravedad de por lo menos un síntoma.

e. la mejora es la reducción de la frecuencia de por lo menos un síntoma.

5. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:

a. se reduce la cantidad de ARN de C9ORF72 total o se reduce la cantidad de ARN patógeno de C9ORF72; y/o b. se reduce la cantidad de proteína de C9ORF72 total.

6. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el compuesto oligomérico es de cadena sencilla.

7. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado.

8. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde:

a. el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende una fracción de azúcar modificado, opcionalmente en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende una fracción de azúcar bicíclica, preferiblemente en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende una fracción de azúcar bicíclica que tiene un puente 2'-4', en donde el puente 2-4' se selecciona de -O-CH²-; -O-CH²-CH² ; y -O-CH(CH3)-; y/o

b. el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende una fracción de azúcar no bicíclica modificada, opcionalmente en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende una fracción de azúcar no bicíclica que comprende un 2'-MOE o 2'-OMe.

9. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende un sustituto de azúcar, opcionalmente en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende un sustituto de azúcar seleccionado de un morfolino, un p Na , un F-HNA, un THP o un THP modificado.

10. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el oligonucleótido modificado tiene un motivo de azúcar que comprende:

una región 5' que consiste en 1-5 nucleósidos 5' enlazados;

una región central que consiste en 6-10 nucleósidos de la región central enlazados; y

una región 3' que consiste en 1-5 nucleósidos de la región 3' enlazados; en donde cada uno de los nucleósidos de la región 5' y cada uno de los nucleósidos de la región 3' comprende una fracción de azúcar modificado y cada uno de los nucleósidos de la región central comprende una fracción de azúcar de ADN no modificado.

11. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde: a. el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, opcionalmente en donde el por lo menos un enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato, preferiblemente en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico de fosfodiéster;

b. cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado, opcionalmente en donde por lo menos uno o cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato; o

c. cada enlace internucleosídico es o un enlace internucleosídico de fosfodiéster o un enlace internucleosídico de fosforotioato.

12. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos una nucleobase modificada, opcionalmente en donde la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina, y/o en donde cada nucleobase de cada nucleósido del oligonucleótido modificado es o una nucleobase no modificada o es una 5-metilcitosina.

13. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el compuesto oligomérico comprende un grupo conjugado; y/o el compuesto oligomérico está emparejado con un segundo compuesto oligomérico para formar un dúplex.

14. El compuesto oligomérico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el oligonucleótido modificado del compuesto es una sal de sodio.

15. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable para su uso en la mejora o prevención de por lo menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa, en donde el por lo menos un síntoma es cualquiera de ansiedad, aprendizaje espacial reducido y pérdida de memoria, opcionalmente en donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato.