ES2791995T3 - Composiciones para modular la expresión de C90RF72 - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula: **(Ver fórmula)** (SEQ ID NO: 33) o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para modular la expresión de C90RF72
Campo
Se proporcionan composiciones y métodos para modular la expresión de C9ORF72 ARNm y proteína en células y animales. Tales composiciones y métodos son útiles para tratar, prevenir, mejorar o retrasar la progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluidas la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración corticobasal (CBD), el síndrome de Parkinson atípico y la degeneración olivopontocerebelosa (OPCD)
Antecedentes
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal caracterizada clínicamente por parálisis progresiva que conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria, típicamente dentro de los dos o tres años posteriores al inicio de los síntomas (Rowland y Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). La ELA es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326­ 337), y actualmente no existen terapias efectivas. Aproximadamente el 10% de los casos son de naturaleza familiar, mientras que la mayoría de los pacientes diagnosticados con la enfermedad se clasifican como esporádicos, ya que parecen ocurrir al azar en toda la población (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537). Existe un reconocimiento creciente, basado en datos clínicos, genéticos y epidemiológicos, de que la ELA y la demencia frontotemporal (FTD) representan un continuo superpuesto de enfermedad, caracterizado patológicamente por la presencia de inclusiones positivas para TDP-43 en todo el sistema nervioso central (Lillo y Hodges)., J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).
Hasta la fecha, se han descubierto varios genes causantes de la ELA familiar clásica, por ejemplo, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN y VCP (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Recientemente, el análisis de ligamiento de las familias que involucran múltiples casos de ELA, FTD y ELA-FTD sugirió que había un lugar importante para la enfermedad en el brazo corto del cromosoma 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). La mutación en el gen C9ORF72 es la causa genética más común de ELA y FTD. La mutación causante de ELA-FTD es una expansión repetida de hexanucleótidos grandes (GGGGCC) en el primer intrón del gen C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Un haplotipo fundador, que cubre el gen C9ORF72 está presente en la mayoría de los casos vinculados a esta región (Renton et al., Neuron, 201 1,72, 257-268). Este locus en el cromosoma 9p21 representa casi la mitad de la ELA familiar y casi una cuarta parte de todos los casos de ELA en una cohorte de 405 pacientes finlandeses (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
Un haplotipo fundador, que cubre el gen C9ORF72, está presente en la mayoría de los casos vinculados a esta región.
Actualmente no hay terapias efectivas para tratar tales enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es un objeto proporcionar composiciones y métodos para el tratamiento de tales enfermedades neurodegenerativas.
Riboldi et al., 2014 es un artículo de revisión que discute la hipótesis de que la acumulación de ARN “tóxico” que contiene la repetición de GGGGCC contribuye a la muerte de neurones motores en esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Donnelly et al. 2013 también investiga el mecanismo por el que la expansión de repetición en C9ORF72 podría causar la enfermedad.
WO 2014/062736 describe biomarcadores y métodos para monitorear la expresión de C9ORF72 ARNm y proteína en un animal con inhibidores específicos de C9ORF72.
Sumario
La invención proporciona un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000003_0001
(SEQ ID NO: 33) o una sal del mismo.
La invención también proporciona un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000004_0001
(SEQ ID NO: 33).
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido modificado de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, en el que el oligonucleótido modificado es un gápmero que consiste en un segmento de ala 5’, un segmento de separación central y un segmento de ala 3', en donde:
el segmento del ala 5’ consiste en cuatro nucleósidos de 2'-O-metoxietilo,
el segmento de separación central consta de ocho p-D-desoxirribonucleósidos, y
el segmento del ala 3’ consiste en seis nucleósidos de 2'-O-metoxietilo; en donde el oligonucleótido modificado tiene la secuencia de nucleobase 5'-GCCCCTAGCGCGCGACTC-3' (SEQ ID NO: 33), en donde cada citosina es una 5-metilcitosina; y en donde los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido modificado son, de 5' a 3', soosssssssssoooss, en donde cada s es un enlace fosforotioato y cada o es un enlace fosfodiéster.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un oligonucleótido modificado, un compuesto o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad neurodegenerativa Ciertas realizaciones proporcionan métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de C9ORF72 ARNm y proteína en células, tejidos y animales. Ciertas realizaciones proporcionan métodos, compuestos y composiciones para reducir los niveles de C9ORF72 ARNm y proteína en células, tejidos y animales. Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son oligonucleótidos modificados. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados son monocatenarios.
En ciertas realizaciones, se reducen los productos de traducción no ATG asociada repetida de C9ORF72 asociada (traducción RAN). En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados a C9ORF72 son poli(glicinaprolina), poli-(glicina-alanina) y poli-(glicina-arginina). En ciertas realizaciones, ciertas variantes de ARNm de C9ORF72 se reducen preferentemente. En ciertas realizaciones, las variantes de ARNm de C9ORF72 preferentemente reducidas son variantes procesadas a partir de un intrón 1 que contiene ARNm previo. En determinadas realizaciones, el intrón 1 contiene una expansión repetida de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, la variante de ARNm de C9ORF72 reducida preferentemente es una variante de ARNm patógeno asociada a C9ORF72. En ciertas realizaciones, la variante de ARNm patogénico asociado C9ORF72 es n M_001256054,1 (SEQ ID NO: 1). En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos está asociada con una enfermedad asociada a C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos está asociada con una enfermedad asociada a la expansión repetida de hexanucleótidos C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos comprende al menos 30 repeticiones GGGGCC, más de 30 repeticiones GGGGCC, más de 100 repeticiones GGGGCC, más de 500 repeticiones GGGGCC o más de 1000 repeticiones GGGGCC. En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos está asociada con focos nucleares. En ciertas realizaciones, los productos de traducción RAN asociados a C9ORF72 están asociados con focos nucleares. En ciertas realizaciones, los productos de traducción RAN asociados a C9ORF72 son poli(glicina-prolina), poli-(glicinaalanina) y poli-(glicina-arginina). En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para reducir los niveles de ARNm de C9ORF72, los niveles de proteína C9ORF72, los productos de traducción RAN de C9ORF72 y los focos nucleares. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para reducir selectivamente variantes de ARNm patogénico asociado a C9ORF72. Tal reducción puede ocurrir de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.
También se proporcionan métodos útiles para prevenir, tratar, mejorar y ralentizar la progresión de enfermedades asociadas con C9ORF72. En ciertas realizaciones, tales enfermedades asociadas a C9ORF72 son enfermedades neurodegenerativas. En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración corticobasal (CBD), el síndrome de Parkinson atípico y la degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
Dichas enfermedades pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad neurodegenerativa, y, en particular, ELA y FTD, incluyen la predisposición genética y la edad avanzada.
En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido C9ORF72 a un individuo que lo necesite. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado monocatenario. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado monocatenario es complementario a un ácido nucleico C9ORF72.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, como se usa en este documento, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluido", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarca elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los compuestos de la invención incluyen variaciones en las que uno o más átomos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre se reemplazan con un isótopo estable del mismo elemento.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2’-O-metoxietilo" (también de 2'-MOE y 2'-OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2’-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2’-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado por MOE.
"Nucleósido 2’-sustituido” significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2’-sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclicas.
"5-metilo citosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5’. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en donde los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes farmacéuticos no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse por un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, entre otros, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Mejoría" se refiere a una disminución, desaceleración, detención o reversión de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
“Anticuerpo” se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, siARNs, shARNs, ssARNs y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o en ausencia del compuesto antisentido.
"Mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en donde el resultado o efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobase que permite la hibridación a un segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases precisas de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediado por Watson-Crick, Hoogsteen o la unión de hidrógeno de Hoogsteen invertida entre las nucleobases correspondientes.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
Nucleósido bicíclico (también BNA) significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4’ y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Transcripción antisentido C9ORF72" significa transcripciones producidas a partir de la cadena no codificante (también cadena antisentido y cadena de plantilla) del gen C9ORF72. La transcripción antisentido C9ORF72 difiere de la "transcripción sensorial C9ORF72" transcrita canónicamente, que se produce a partir de la cadena de codificación (también cadena sensorial) del gen C9ORF72. En ciertas realizaciones, una transcripción antisentido C9ORF72 es SEQ ID NO: 18.
"Inhibidor específico de transcripción antisentido C9ORF72" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de la transcripción antisentido C9ORF72 y/o sus productos de expresión a nivel molecular. Como se usa en el presente documento, "específico" significa reducir o inhibir la expresión de la transcripción antisentido C9ORF72 sin reducir la transcripción no diana a un grado apreciable (por ejemplo, un inhibidor específico de la transcripción antisentido C9ORF72 reduce la expresión de la transcripción antisentido C9ORF72, pero no reduce la expresión de la transcripción de sentido C9ORF72 en un grado apreciable). Los inhibidores de transcripción antisentido específicos de C9ORF72 incluyen compuestos antisentido, siARN, aptámeros, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de la transcripción antisentido C9ORF72 y/o sus productos de expresión, tales como productos de traducción RAN asociados a la transcripción antisentido C9ORF72.
"Enfermedad asociada a C9ORF72" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico C9ORF72 o producto de expresión del mismo. Dichas enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Dichas enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ELA y FTD. En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a C9ORF72 es causada por (o está asociada con) una expansión repetida de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos puede comprender GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG repetido al menos 30 veces, más de 30 veces, más de 100 veces, más de 500 veces o más de 1000 veces.
"Productos de traducción de RAN asociados a C9ORF72" significa polímeros de péptidos o dipéptidos aberrantes traducidos a través de traducción de RAN (es decir, traducción asociada a repetición y no dependiente de ATG). En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados a C9ORF72 son cualquiera de poli-(glicinaprolina), poli-(glicina-alanina) y poli-(glicina-arginina).
"Ácido nucleico C9ORF72" significa cualquier ácido nucleico que codifica C9ORF72. Un ácido nucleico C9ORF72 puede incluir una secuencia de ADN que codifica C9ORF72, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica C9ORF72 que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones (es decir, pre-ARNm), y una secuencia de ARNm que codifica C9ORF72. "ARNm de C9ORF72" significa un ARNm que codifica una proteína C9ORF72.
"Variante de ARNm patogénico asociada a C9ORF72" significa la variante de ARNm de C9ORF72 procesada a partir de una variante de ARNm previo a C9ORF72 que contiene la repetición del hexanucleótido. Un pre-ARNm de C9ORF72 contiene la repetición del hexanucleótido cuando comienza la transcripción del pre-ARNm en la región desde el sitio de inicio del exón 1A al sitio de inicio del exón 1B, por ejemplo, los nucleótidos 1107 a 1520 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 2, el complemento de GENBANK N° de acceso NT_008413,18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 27565000). En ciertas realizaciones, se mide el nivel de una variante de ARNm patogénico asociado C9ORF72 para determinar el nivel de un pre-ARNm C9ORF72 que contiene la repetición del hexanucleótido en una muestra.
"Inhibidor específico de C9ORF72" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de ARNm de C9ORF72 y/o proteína C9ORF72 a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de C9ORF72 incluyen ácidos nucleicos (incluidos compuestos antisentido), siARN, aptámeros, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARNm de C9ORF72 y/o proteína C9ORF72. De manera similar, en ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de C9ORF72 pueden afectar otros procesos moleculares en un animal.
"Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4’ y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2’.
"Nucleósido de etilo constreñido" (también nucleósido de cEt) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4’-CH(CH3)-O-2’.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos de 2’-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones de 2’-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas, cada posición con una pluralidad de subunidades.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración abarca la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprender", "comprende" y "que comprende" implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diseño" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los medicamentos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no fácilmente acomodado por una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad efectiva" en el contexto de la modulación de una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto que necesite dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es efectiva para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o la profilaxis o la mejora de esa afección. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a ser tratado, el grupo taxonómico de los individuos a ser tratados, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones por las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que operan en una célula. Dichas estructuras incluyen, entre otras, los productos de transcripción y traducción.
"Foco" o "focos" significa un cuerpo nuclear o citoplasmático que comprende una transcripción C9ORF72. En ciertas realizaciones, un foco comprende al menos un transcrito C9ORF72. En ciertas realizaciones, los focos C9ORF72 comprenden transcripciones que comprenden cualquiera de las siguientes repeticiones de hexanucleótidos: GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC y/o GGGGCG.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en donde una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Expansión repetida de hexanucleótidos" significa una serie de seis bases (por ejemplo, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC) repetidas al menos dos veces. En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos puede localizarse en el intrón 1 de un ácido nucleico C9ORF72. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótidos patógenos incluye al menos 30, más de 30, más de 100, más de 500 o más de 1000 repeticiones de GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC en un ácido nucleico C9ORF72 y está asociado con la enfermedad. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones son interrumpidas por 1 o más nucleobases. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótido de tipo salvaje incluye 23 repeticiones o menos de GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o g Gg GGC en un ácido nucleico C9ORF72. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones son interrumpidas por 1 o más nucleobases.
"Hibridación" significa el recocido de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero sin limitación, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero sin limitación, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a C9ORF72" significa identificar a un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad asociada a C9ORF72 o predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72 incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72, que incluyen antecedentes personales o familiares o predisposición genética de una o más enfermedades asociadas a C9ORF72. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir C9ORF72" significa reducir el nivel o la expresión de un ARNm y/o proteína C9ORF72. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm y/o proteína de C9ORF72 se inhiben en presencia de un compuesto antisentido dirigido a C9ORF72, que incluye un oligonucleótido antisentido dirigido a C9ORF72, en comparación con la expresión de ARNm de C9ORF72 y/o niveles de proteína en ausencia de un compuesto antisentido C9ORF72, como un oligonucleótido antisentido.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
“Nucleósidos enlazados” significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleosídico.
"Ácido nucleico bloqueado" o "ANB" o "nucleósidos de ANB" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4’ y 2' de la unidad de azúcar nucleósido, formando así un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no se limitan a A) a-L-Metileneoxi (4'-CH2-O-2’) ANB, (B) p-D-Metileneoxi (4'-CHz-O-2’) ANB, (C) Etileneoxi (4’-(CHz)z-O-2’) ANB, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2’) ANB y (E) Oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) An B, como se muestra a continuación.
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Como se usa en el presente documento, los compuestos de ANB incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4’ y 2' del azúcar en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(Ri )(R2)]n-, -C(Ri )=C(R2)-, -C(Ri )=N-, -C(=NRi)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- y -N(R1)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1,2, 3 o 4; cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, un radical de heterociclo, un radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical de C5-C7 alicíclico, radical de C5-C7 alicíclico sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4’-2’ incluidos en la definición de ANB incluyen, entre otros, una de las fórmulas: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-o-, -C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1 R2)-O-N(R1)-. Además, otros grupos puente abarcados con la definición de An B son puentes 4'-CH2-2’, 4'-(CH2)2-2’, 4'-(CH2)3-2’, 4'-CH2-O-2’, 4'-(CH2)2-O-2’, 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4'CH2-N(Ri )-O-2’-, en donde cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
También se incluyen dentro de la definición de ANB según la invención los ANB en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar, formando así un puente de metileneoxi (4'-CH2-O-2’) para formar el resto de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4', para lo cual se usa el término ANB metileneoxi (4'-CH2-O-2’). Además; en el caso del resto de azúcar bicíclico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término etilo eneoxi (4’-CH2CH2-O-2’) ANB. a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2’), un isómero de metileneoxi (4’-CH2-O-2’) ANB también está incluido en la definición de ANB, como se usa en el presente documento.
"No coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
“Nucleósido modificado” significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
“Nucleótido modificado” significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado y/o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, azúcar modificado y/o nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, entre otros, nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.
"Motivo” significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
"Resto de azúcar natural" significa un resto de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3’ a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o que de otro modo soportan la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, entre otros, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (siARN) y microARN (miARN).
“Nucleobase” significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de la nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de unirse por hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que la posición de la unión de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementaria en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, enlace y/o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, miméticos de nucleósido que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o miméticos de azúcar triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N (H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término mimósico nucleósido del término un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en el presente documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar de la combinación de azúcar o enlace de azúcar-internucleosido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a una diana seleccionada.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Efecto fuera de diana" se refiere a un efecto biológico no deseado o nocivo asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen que no sea el ácido nucleico diana deseado.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monomélicas unidas que es capaz de hibridarse con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos unidos, cada uno de los cuales puede modificarse o no modificarse, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa administración por inyección (p. ej., inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada uniendo al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Sin limitación, como se usa en el presente documento, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a C9ORF72 es un agente farmacéutico.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica al reemplazar uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace internucleósido modificado.
“Porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevención" o "prevenir" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a días, semanas a meses o indefinidamente.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas o afecciones.
"Cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2’ de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Sales" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Segmentos" se definen como porciones pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana. Las versiones "acortadas" o "truncadas" de oligonucleótidos antisentido enseñadas en el presente documento tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anormalidades en el sistema nervioso central y miopatías.
“Oligonucleótido monocatenario” significa un oligonucleótido que no se hibrida con una cadena complementaria. Un "oligonucleótido modificado monocatenario" significa un oligonucleótido modificado que no se hibrida a una cadena complementaria.
Los "sitios", como se usan en el presente documento, se definen como posiciones únicas de nucleobase dentro de un ácido nucleico diana.
"Disminuye la progresión" significa disminución en el desarrollo de la enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. Las "condiciones de hibridación rigurosas" o las "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones bajo las cuales un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. "Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcripción de ARN diana" y "ácido nucleico diana" significan un ácido nucleico capaz de ser diana de compuestos antisentido.
"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana al que se dirige uno o más compuestos antisentido. "Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5’” se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3’ " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" o "tratado" o "tratamiento" significa administrar una composición para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad o afección.
"Nucleobases no modificadas" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos que se producen naturalmente. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido). "Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertas realizaciones
Ciertas realizaciones proporcionan composiciones y métodos para reducir la expresión total de ARNm y proteína de C9ORF72.
Ciertas realizaciones proporcionan composiciones y métodos para reducir variantes de ARNm patogénico asociado a C9ORF72.
Ciertas realizaciones proporcionan métodos para el tratamiento, prevención, mejora o disminución de la progresión de enfermedades asociadas con C9ORF72 en un individuo que lo necesita. También se contemplan métodos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad asociada con C9ORF72. Las enfermedades asociadas a C9ORF72 incluyen enfermedades neurodegenerativas. En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa puede ser ELA o FTD. En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa puede ser familiar o esporádica.
La presente divulgación proporcionó las siguientes realizaciones numeradas no limitantes:
Realización 1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula o una sal del mismo.
Figure imgf000013_0001
Realización 2. Una composición que consiste de la sal de sodio de un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula.
Figure imgf000014_0001
Realización 3. El compuesto o composición de las realizaciones 1 y 2, en donde el compuesto o compsición es capaz de reducir la expresión humana ARNm o proteína C9ORF72 en un mamífero.
Realización 4. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de mejorar al menos un síntoma de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome de Parkinson atípico o degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
Realización 5. El compuesto o composición de la realización 4, en donde el síntoma de ALS es cualquiera de déficit motor, ansiedad y denervación.
Realización 6. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de retrasar la progresión de la enfermedad.
Realización 7. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de extender la supervivencia.
Realización 8. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de reducir los productos de traducción RAN asociados a C9ORF72.
Realización 9. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de reducir selectivamente las variantes de ARNm patógeno C9ORF72 asociado.
Realización 10. El compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones 1-2, en donde el compuesto o composición es capaz de reducir focos nucleares.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y siARNs. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
Un compuesto antisentido puede tener una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige. Un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades vinculadas de longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades unidas son nucleósidos.
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5’ (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3’ (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5’, o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5’ y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5’ o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades agregadas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5’ (adición de 5'), o alternativamente al extremo 3’ (adición de 3’), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5’ y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), se probó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, se logró la escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desajustes.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341 -3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido en tándem de 14 nucleobases, y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobase compuesto por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora aumentada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir una mayor resistencia a la degradación de la nucleasa, una mayor captación celular, una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo de gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento gap generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un Gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un Gápmero pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2’-modificados (tales nucleósidos 2’-modificados pueden incluir 2'-MOE, y 2’-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4’-(CH2)n-O-2’, donde n = l o n = 2 y 4’ CH2-0-CH2-2'). Preferiblemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo ala-espacio-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región del ala 5’, "Y" representa la longitud de la región del espacio, y "Z" representa la longitud de la región del ala 3’. Como se usa en el presente documento, un gápmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de separación se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos del ala 5’ y el segmento de ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5’ y el segmento de separación, o el segmento de separación y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en este documento puede tener un motivo de gápmero. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gápmeros descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10-5, 5-10-4, 4-10­ 4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, o 4-7-4.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo "wingmer", que tiene una configuración de alaseparación o separación-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describió anteriormente para la configuración de separación. Por lo tanto, las configuraciones de wingmer descritas en este documento incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2- 10, 1 -10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 poseen un motivo de gápmero 5-10-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 poseen un motivo de gápmero 5-8-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 poseen modificaciones de azúcar en cualquiera de los siguientes patrones: eeekkdddddddkkeee, eekkddddddddkkeee, ekddddddddekekeee, kekeddddddddekeke y ekekddddddddkekee; en donde,
e = un nucleósido modificado con 2’-O-metoxietilo
d = un 2'-desoxinucleósido, y
k = un nucleósido cEt.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene un motivo estrecho de separación. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido estrecho de separación dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene un segmento de separación de 9, 8, 7 o 62'-desoxinucleótidos colocados inmediatamente adyacentes y entre segmentos de ala de 5, 4, 3, 2, o 1 nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente de 4’ a 2' seleccionado entre: puente 4’-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2; y 4’ CH2-O-CH2-2'. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende el puente 4’-CH(CH3)-O-2’. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende un resto de azúcar no bicíclico 2’-modificado. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar 2’-modificado no bicíclico comprende un grupo 2’-O-metiletilo o un grupo 2’-O-metilo.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican C9ORF72 incluyen, sin limitación, lo siguiente: el complemento de N° de acceso GENBANK NM_001256054,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), el complemento de N° de acceso GENBANK NT_008413,18 truncado de la nucleobase 27535000 a 27565000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), GENBANK N° de acceso BQ068108,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3), N° de acceso GENBANK NM_018325,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), N° de acceso GENBANK DN993522,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), N° de acceso GENBANK NM_145005,5 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), N° de acceso GENBANK d B079375,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7), N° de acceso GENBANK BU194591,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8), Identificador de secuencia 4141_014_A (incorporado aquí como SEQ ID NO: 9), e Identificador de secuencia 4008_73_A (incorporado aquí como SEQ ID NO: 10), y GENBANK N° de acceso NW_001101662,1 truncado de los nucleósidos 8522000 a 8552000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 11).
Se entiende que la secuencia establecida en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación a un resto de azúcar, un enlace intemucleósido o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace intemucleósido o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
Una región diana puede ser una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3’, una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para C9ORF72 se pueden obtener mediante el número de acceso a partir de bases de datos de secuencias tales como NCBI y dicha información se incorpora aquí como referencia. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5’ de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
La orientación incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, de modo que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por una cantidad de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5’ o sitios diana 3' enumerados aquí.
Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de un 5’ UTR, una región de codificación, un 3' UTR, un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de detención.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridarse de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o no diana).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por reducción porcentual de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de C9ORF72 son indicativas de inhibición de la expresión de C9ORF72. Las reducciones en los niveles de una proteína C9ORF72 también son indicativas de inhibición de la expresión de ARNm diana. La reducción en presencia de focos de ARN C9ORF72 expandidos es indicativa de inhibición de la expresión de C9ORF72. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de inhibición de la expresión de C9ORF72. Por ejemplo, la función motora y la respiración mejoradas pueden ser indicativas de inhibición de la expresión de C9ORF72.
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un ácido nucleico C9ORF72. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno de Hoogsteen invertido) entre las nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede ocurrir en diferentes condiciones. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico C9ORF72.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico C9ORF72).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico C9ORF72 pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico C9ORF72 de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados aquí, o una porción especificada de los mismos, son, o son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico C9ORF72, una región diana, segmento diana o una porción específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en donde 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias de una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría 77,8% de complementariedad general con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, caería dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y Programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). Porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wisconsin), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482 489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico C9ORF72, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en este documento, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobase del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobase puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobase del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobase en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobase del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5’ o extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se encuentra en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido de gápmero.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud no comprenden más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico C9ORF72, o una porción especificada del mismo.
En ciertas realizaciones, compuestos antisentido que son, o son hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico C9ORF72, o una porción especificada del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados aquí también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones de nucleobase de un segmento diana, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como los compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos aquí.
En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar base. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto hidroxilo 2’, 3' o 5’ del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotídica, los grupos fosfato se denominan comúnmente formando los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por la diana de ácido nucleico, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibitoria.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3’ a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforos representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y no fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 comprenden uno o más enlaces internucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan en todo el compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 comprenden al menos un enlace fosfodiéster y al menos un enlace fosforotioato.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 poseen enlaces internucleosídicos en cualquiera de los siguientes patrones: soooossssssssssooss, sooosssssssssooss, soosssssssssooss y sosssssssssoooss; en donde,
s = un enlace de fosforotioato, y
o = un enlace fosfodiéster.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir mayor estabilidad de la nucleasa, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos grupos sustituyentes 5’ y 2', puente de átomos de anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(Ri )(R2) (R, Ri y R2 son cada uno independientemente H, C1-C12 alquilo o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido 2’-sustituido-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5’,2'-bis descritos) o la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2’ (ver Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente 5'-sustitución de un BNA (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 11/22/07 en donde ANB está sustituido con, por ejemplo, un grupo de 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH 3, 2'-OCH2CH 3, Grupos sustituyentes 2'- OCH2CH 2 F y 2'-0 (CH 2) 2 OCH 3. El sustituyente en la posición 2’ también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF 3, OCH 2 F, 0 (CH 2) 2 SCH 3, 0 (CH2)2-O-N(R m) (R n), 0-CH2-C(=O)-N(R m) (R n) y 0-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(R m) (R n), donde cada R1, R m y R n es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4’ y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en este documento incluyen uno o más nucleósidos BNA en donde el puente comprende una de las fórmulas: 4’-(CH2)-O-2’ (ANB); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2’ (y sus análogos, véase la Patente de los Estados Unidos 7,399,845, emitida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3) (CH3)-O-2’ (y sus análogos, ver PCT/US2008/068922 publicado como WO/2009/006478, publicado el 8 de enero de 2009); 4’-CH2-N (OCH3)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/064591 publicada como WO/2008/150729, publicada en diciembre 11, 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2’ (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2’, en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase la patente de EE.UU. 7,427,672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4’-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/066154 publicada como WO 2008/154401, publicado el 8 de diciembre, 2008).
Se han informado de nucleósidos bicíclicos adicionales en la literatura publicada (véase, por ejemplo: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (26) 8362-8379; Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001,2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001,8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol Ther., 2001,3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Medicina. Chem Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Patentes de los EE.UU. Nos: 7,399,845; 7,053,207; 7,034,133; 6,794,499; 6,770,748; 6,670,461; 6,525,191; 6,268,490; Publicaciones de patentes de EE.UU. Nos: US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; Solicitudes de Patente de los Estados Unidos, Números de Serie: 12/129,154; 61/099,844; 61/097,787; 61/086,231; 61/056,564; 61/026,998; 61/026,995; 60/989,574; Solicitudes internacionales WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; y Solicitudes Internacionales PCT Nos: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; y PCT/US2008/064591). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos monocíticos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar, o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico 4’-2’" o "nucleósido bicíclico 4' a 2’” se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar.
En ciertas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre los átomos de carbono 4’ y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo, que incluyen, sin limitación, puentes que comprenden 1 o de 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=Ra)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x -, y -N(Ra)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1,2, 3 o 4; cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, radical de heterociclo, radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical de C5-C7 alicíclico, radical de C5-C7 alicíclico sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O-o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2’, 4'-(c H2)2-2’, 4'-(Ch 2)3-2’, 4'-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4'-CH2-O-N(R)-2’ y 4'-CH2-N(R)-O-2’- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4’-(CH2)-O-2’, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los BNA de a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2’) se habían incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen aquellos que tienen un puente de 4’ a 2' en donde dichos puentes incluyen, sin limitación, a-L-4’-(CH2)-O-2’, p-D-4'-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4 ’-CH2-O-N(R)-2’, 4'-CH2-N(R)-O-2’, 4’-CH(CH)-O-2’, 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2’, 4'-CH2-CH(CH3)-2' y 4’-(CH2)3-2', en donde R es H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000022_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, alquilo sustituido C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquilo, o C1-C6 alquilo sustituido y X es o o NJc.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000022_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000022_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, sustituido C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido, C1-C6 alcoxilo, C1-C6 alcoxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000023_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=H)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
Se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos de adenina, citosina, guanina, 5-metilo-citosina, timina y uracilo que tienen un puente 4'-CH2-O-2’, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácido nucleico (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). La síntesis de nucleósidos bicíclicos también se ha descrito en los documentos Wo 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de varios nucleósidos bicíclicos que tienen grupos puente de 4’ a 2' como 4'-CH2-O-2’ y 4'-CH2-S-2' (Kumar et al, Bioorg. Med Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos que comprenden nucleósidos bicíclicos para su uso como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un novedoso análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras complementarias de ARN y ADN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000023_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte; cada q i, qj, qk y q l es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=H)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4’-(CH2)3-2' y el puente análogo alquenílico 4'-CH=CH-CH2-2’ (Frier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2’) BNA, (B) p-D-metileneoxi (4'-CH2-O-2’) BNA, (C)etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2’) BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) b Na (4'-CH2-N(R)-O-2’) BNA, (F) metilo (metileneoxi) (4'-c H(CH3)-O-2’) Bn A (también referido como acetato restringido o CET), (G) metileno-tio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilen-amino (4’-CH2-N(R)-2') BNA, (I) BNA de metilo carbocíclico (4'-c H2-CH(CH3)-2’), (j ) propiloeno carbocíclico (4'-(CH2)3-2’) BNA y (K) vinilo BNA como se ha representado a continuación.
Figure imgf000024_0001
en donde Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector, C1-C6 alquilo o C1-C6 alcoxi.
Como se usa en este documento, el término "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales y puede denominarse un sustituto de azúcar. Los nucleósidos de THP modificados incluyen, entre otros, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropiranilo como se ilustra a continuación.
Figure imgf000024_0002
En cierta realización, los sustitutos de azúcar se seleccionan con la fórmula:
Figure imgf000024_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto oligomérico o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto u oligonucleótido oligomérico y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5’ o 3';
q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y
uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro se selecciona de halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJJ2, y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquilo.
En ciertas realizaciones, q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP en donde uno de R1 y R2 es F. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se han informado nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41,4503-4510; y las patentes de los Estados Unidos 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; y 5,034,506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000025_0001
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. Dichos sustitutos del azúcar se denominan en el presente documento "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos sustituidos 5’,2'-bis descritos)) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2’ (véase la solicitud de patente de EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase Solicitud internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11/07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2- 0-2’ se sustituye adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo) La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito {véase, por ejemplo, Srivastava et al, J. Am. Chem Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos naturales. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, entre otros, los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud PCT publicada de propiedad común WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al, J. Am. Chem. Soc, 2008, 130 (6), 1979-1984; Horvath et al, Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621­ 3623; Nauwelaerts et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001,66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20 (4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y la solicitud PCT publicada WO 01/049687; el texto de cada uno se incorpora aquí como referencia, en su totalidad). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo
de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3’; y
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alqui alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, C2-C6 alquinilo sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Muchos otros sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos son conocidos en la técnica y son adecuados
como sustitutos del azúcar que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos oligoméricos como se proporciona en este documento (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Christian J.
Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillo pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar aún más su actividad.
Como se usa en el presente documento, "azúcar 2’-modificado” significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que
incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido
y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En
ciertas realizaciones, las modificaciones 2’ se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a:
O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 ; y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también se pueden seleccionar de: C1-C12 alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo,
SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol.
Chem., 1997, 272, 11944-12000). Dicha sustitución de 2'-MOE se ha descrito que tiene una afinidad de unión mejorada
en comparación con nucleósidos no modificados y a otros nucleósidos modificados, tales como 2'-0-metilo, O-propilo
y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim.
Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24,
630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en el presente documento, "2’-modificado” o "2’-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un
azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ diferente de H u OH. Los nucleósidos 2’-modificados incluyen, entre otros, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con 2’ sustituyentes no de puente, tales como
alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o
O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
Los nucleósidos 2’-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones
del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende
un grupo flúor en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en este documento, "2’-OMe" o "2’-OCH3 ", "2’-O-metilo" o "2’-metoxi" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en el presente documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2'-OCH2CH2OCH3 " o "2’-O-metoxietilo" se refieren
cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes representativas de EE.UU. que enseñan la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, entre otras,
US: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811;
5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 y 6,600,032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como w O 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005, y cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad
de nucleósidos unidos. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (natural, modificado o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2’-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo de gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo de puente (4’-CH(CH3)-O-2’). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2’) están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, entre otros, la vía de administración, el alcance de la enfermedad o la dosis a administrar.
Se puede utilizar un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente adecuado o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones para ser administradas por vía parenteral. En consecuencia, en una realización, empleada en los métodos descritos en el presente documento es una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales, ésteres o sales farmacéuticamente aceptables de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden estar unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la absorción celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos.
Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Se incluyen en los grupos estabilizadores las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el terminal 5’ (tapa 5’), o en el terminal 3’ (tapa 3'), o puede estar presente en ambas terminales. Las estructuras de tapones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas abásicas desoxi invertidas. Otros grupos estabilizadores 3’ y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad a la nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos C9ORF72 se pueden probar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En este documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración LIPOFECTIN que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con la LIPOFECTAMINE en OPTI-MEM 1 redujo el medio sérico (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se cosechan típicamente 16­ 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden por métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles o expresión diana
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico C9ORF72 se puede analizar de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es una rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se utiliza como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT en tiempo real de PCR se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia.
Las cantidades diana del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de RIBOGREEN RNA (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, LJ et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridarse con un ácido nucleico C9ORF72. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de niveles de proteínas
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos C9ORF72 se puede evaluar midiendo los niveles de proteína C9ORF72. Los niveles de proteína de C9ORF72 pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad proteica (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de ratones, ratas, monos y humanos C9ORF72 están disponibles comercialmente.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido.
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad de inhibir la expresión de C9ORF72 y producir cambios fenotípicos, tales como la función motora mejorada y la respiración. En ciertas realizaciones, la función motora se mide mediante rotarod, fuerza de agarre, ascenso de poste, rendimiento de campo abierto, haz de equilibrio, prueba de huella de pata trasera en el animal. En ciertas realizaciones, la respiración se mide mediante pletismógrafo de cuerpo entero, resistencia invasiva y medidas de cumplimiento en el animal. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). La administración incluye vías de administración parenteral, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea, así como vías centrales de administración, como intracerebroventricular o intratecal. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y depende de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido del SNC o el LCR y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico C9ORF72.
Orientación a C9ORF72
Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridarse con un ácido nucleico C9ORF72 en cualquier etapa del procesamiento de ARN. Por ejemplo, aquí se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un pre-ARNm o un ARNm maduro. Además, los oligonucleótidos antisentido descritos en este documento pueden hibridarse con cualquier elemento de un ácido nucleico C9ORF72. Por ejemplo, aquí se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un exón, un intrón, el 5’ UTR, el 3' UTR, una región repetida, una expansión de repetición hexanucleotídica, una unión de empalme, una unión de empalme de exon:exon, un silenciador de empalme exónico (ESS), un potenciador de empalme exónico (ESE), exón 1a, exón 1b, exón 1c, exón 1d, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10 de un ácido nucleico C9ORF72.
Los oligonucleótidos antisentido descritos en este documento hibridan con todas las variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento hibridan selectivamente con ciertas variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento hibridan selectivamente con variantes de C9ORF72 que contienen una expansión repetida de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento hibridan selectivamente con variantes pre-ARNm que contienen la repetición del hexanucleótido. En ciertas realizaciones, las variantes de pre-ARNm de C9ORF72 que contienen una expansión repetida de hexanucleótidos incluyen SEQ ID NO: 1-3 y 6-10. En ciertas realizaciones, dicha expansión de repetición de hexanucleótidos comprende al menos 24 repeticiones de cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG.
Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben la expresión de todas las variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben la expresión de todas las variantes de C9ORF72 por igual. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben preferentemente la expresión de una o más variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben preferentemente la expresión de variantes de C9ORF72 que contienen una expansión repetida de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben selectivamente la expresión de variantes de pre-ARNm que contienen la repetición del hexanucleótido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento inhiben selectivamente la expresión de variantes de ARNm patogénico C9ORF72 asociado. En ciertas realizaciones, las variantes de pre-ARNm de C9ORF72 que contienen una expansión repetida de hexanucleótidos incluyen SEQ ID NO: 1 -3 y 6-10. En ciertas realizaciones, dicha expansión de repetición de hexanucleótidos comprende al menos 24 repeticiones de cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG. En ciertas realizaciones, la expansión repetida de hexanucleótidos forma focos nucleares. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento son útiles para reducir focos nucleares. Los focos nucleares pueden reducirse en términos de porcentaje de células con focos, así como en número de focos por célula.
Inhibición selectiva de ciertas variantes patógenas asociadas
En ciertos ejemplos en el presente documento, el conjunto de sonda de cebador RTS3905 detecta una variante de ARNm (por ejemplo, NM_001256054,1) procesada a partir de una variante pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido. La variante de ARNm procesada a partir de una variante de pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido (es decir, la "variante de ARNm patógena C9ORF72 asociada"). Un pre-ARNm contiene la repetición del hexanucleótido cuando la transcripción del pre-ARNm comienza en la región desde el sitio de inicio del exón 1A al sitio de inicio del exón 1B, por ejemplo, los nucleótidos 1107 a 1520 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 2, el complemento de N° de acceso GENBANK NT_008413,18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 27565000). Los oligonucleótidos se diseñaron en esta región para dirigirse selectivamente a la variante pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido. RTS3905 mide un producto de ARNm (es decir, la variante de ARNm patógena asociada C9ORF72) de la variante de pre-ARNm que contiene la repetición de hexanucleótido y, por lo tanto, mide la reducción de la variante de pre-ARNm que contiene la repetición de hexanucleótido.
Características C9ORF72
Los oligonucleótidos antisentido descritos en este documento pueden hibridarse con cualquier variante C9ORF72 en cualquier estado de procesamiento dentro de cualquier elemento del gen C9ORF72. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridarse con un exón, un intrón, el 5’ UTR, el 3' UTR, una región repetida, una expansión de repetición hexanucleotídica, una unión de empalme, una unión de empalme de exón:exón, un silenciador de empalme exónico (ESS), un exónico potenciador de empalme (ESE), exón 1a, exón 1b, exón 1c, exón 1d, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden atacar a cualquiera de los exones que se caracterizan a continuación en las Tablas 1-5 para las diversas variantes de C9ORF72 que se describen a continuación. Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento también pueden dirigirse a variantes no caracterizadas a continuación y tales variantes se caracterizan en GENBANK. Además, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento también pueden dirigirse a elementos distintos de los exones y dichos elementos se caracterizan en GENBANK.
Tabla 1
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Tabla 2
Segmentos funcionales para NM_018325,3 (SEQ ID NO: 4)
Figure imgf000031_0003
Tabla 3
Figure imgf000031_0004
Tabla 4
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Tabla 5
Figure imgf000031_0002
Ciertas indicaciones
En el presente documento se proporcionan métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En ciertas realizaciones, el individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, que incluye, pero no se limita a, ELA o FTD. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a C9ORF72. En ciertas realizaciones, en este documento se proporcionan métodos para reducir profilácticamente la expresión de C9ORF72 en un individuo. Ciertas realizaciones incluyen el tratamiento de un individuo que lo necesita mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72.
En una realización, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 se acompaña de la monitorización de los niveles de C9ORF72 en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido puede ser utilizada por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 da como resultado la reducción de la expresión de C9ORF72 en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 da como resultado una función motora y respiración mejoradas en un animal. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido C9ORF72 mejora la función motora y la respiración al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a C9ORF72 se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad neurodegenerativa que incluye ELA y FTD.
Ciertas terapias combinadas
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En ciertas realizaciones, tales uno o más agentes farmacéuticos adicionales están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que la una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente a la una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, tal uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas descritas aquí. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinacional. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en este documento y uno o más agentes farmacéuticos adicionales se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en este documento y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran en diferentes momentos. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en este documento y uno o más otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una sola formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en este documento y uno o más otros agentes farmacéuticos se preparan por separado.
En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que pueden coadministrarse con una composición farmacéutica descrita en el presente documento incluyen Riluzol (Rilutek), Lioresal (Lioresal) y Dexpramipexol.
En ciertas realizaciones, agentes farmacéuticos que pueden administrarse conjuntamente con un inhibidor específico de C9ORF72 descrito en el presente documento incluye, pero no se limita a, un inhibidor adicional de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, agentes farmacéuticos que pueden administrarse conjuntamente con un inhibidor específico de C9ORF72 descrito en el presente documento incluye, pero no se limita a, un inhibidor específico de transcripción antisentido C9ORF72. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de transcripción antisentido C9ORF72 es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es monocatenario.
En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra antes de la administración de una composición farmacéutica descrita aquí. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra después de la administración de una composición farmacéutica descrita aquí. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra al mismo tiempo que una composición farmacéutica descrita aquí. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo.
En ciertas realizaciones, la administración conjunta de un segundo compuesto aumenta el efecto de un primer compuesto, de modo que la administración conjunta de los compuestos da como resultado un efecto que es mayor que el efecto de administrar el primer compuesto solo. En otras realizaciones, la coadministración produce efectos que son aditivos a los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, la administración conjunta da como resultado efectos que son supraaditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
Ciertas com posiciones com parativas
Los compuestos descritos en el presente documento son más tolerables que ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 y/o ISIS 577083. ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 e ISIS 577083 se seleccionaron como compuestos de comparación porque exhibieron altos niveles de reducción dependiente de la dosis de ARNm de C9ORF72 en varios estudios descritos en el documento WO2014/062691. Por lo tanto, ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 e ISIS 577083 se consideraron compuestos altamente eficaces y potentes. Además, ISIS 577065, ISIS 577056 e ISIS 576816 descritos en WO2014/062691 son estructuralmente similares a los compuestos descritos en este documento. Por ejemplo, ISIS 577065 tiene una superposición de 16 nucleobases con ISIS 801287; ISIS 577056 tiene una superposición de 16 nucleobases con ISIS 806679; ISIS 576816 tiene una superposición de 18 nucleobases con ISIS 802473 (18-mer); e ISIS 576816 tiene una superposición de 18 nucleobases con ISIS 802459.
ISIS 576816, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (incorporada aquí como SEQ ID NO: 21), en donde cada enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto de comparación. ISIS 576816 logró una puntuación FOB promedio de 7,00 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el comparador compuesto ISIS 576816.
ISIS 576974, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GGGACACTACAAGGTAGTAT (incorporada aquí como SEQ ID NO: 56), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto comparador. ISIS 576974 logró una puntuación FOB promedio de 5,67 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el compuesto comparador ISIS 576974.
ISIS 577061, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') TACAGGCTGCGGTTGTTTCC (incorporada aquí como SEQ ID NO: 57), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto comparador. ISIS 577061 logró un puntaje FOB promedio de 7,00 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el comparador compuesto ISIS 577061.
En ciertas realizaciones, ISIS 577065, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') CCCGGCCCCTAGCGCGCGAC (incorporada aquí como SEQ ID NO: 58), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto comparador. ISIS 577065 logró un puntaje FOB promedio de 6,00 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el comparador compuesto ISIS 577065.
En ciertas realizaciones, ISIS 577083, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GGTAACTTCAAACTCTTGGG (incorporada aquí como SEQ ID NO: 59), en donde cada enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto de comparación. ISIS 577083 logró un puntaje FOB promedio de 7,00 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el comparador compuesto ISIS 577083.
ISIS 577056, un 5-10-5 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') AATCTTTATCAGGTCTTTTC (incorporada aquí como SEQ ID NO: 60), en donde cada enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un grupo 2’-O-metoxietilo, que se describió previamente en el documento WO2014/062691, incorporado aquí como referencia, es un compuesto de comparación. ISIS 577056 logró un puntaje FOB promedio de 6,5 en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 3 a continuación). Ciertos compuestos descritos en este documento lograron una puntuación FOB más baja en un estudio similar de tolerabilidad aguda en ratones (véase el Ejemplo 2 a continuación), incluidos ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 e ISIS 802459. Por lo tanto, ciertos compuestos descritos en este documento son más tolerables que el comparador compuesto ISIS 577056.
Ciertas terapias humanas
Los oligonucleótidos antisentido humanos C9ORF72 descritos en el presente documento son terapéuticos humanos. Se están examinando varios parámetros de potencia, eficacia y/o tolerabilidad. Dichos parámetros incluyen la inhibición in vitro de la expresión total de ARN de C9ORF72, la inhibición in vitro de la expresión de variante de ARN asociada a C9ORF72 patógena, la respuesta a la dosis in vitro (CI50), la inhibición in vivo de ARN y/o proteína total o patógena en un animal transgénico que contiene un humano Transgén C9ORF72 en tejidos relevantes (p. ej., cerebro y/o médula espinal), tolerabilidad en ratones, tolerabilidad en ratas y/o tolerabilidad en primates. Los marcadores de tolerabilidad que pueden medirse incluyen parámetros químicos de sangre y suero, parámetros químicos de LCR, pesos corporales y de órganos, observaciones generales y/o pruebas de comportamiento, y/o marcadores bioquímicos como GFAP y/o AIF1. Se puede medir la tolerabilidad aguda o a largo plazo.
Ciertas composiciones
1. ISIS 801287
ISIS 801287 se caracteriza como un 4-8-6 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GCCCCTAGCGCGCGACTC (incorporada aquí como SEQ ID NO: 33), en donde cada uno de los nucleósidos 1-4 y 13-18 son nucleósidos modificados con 2’-O-metoxietilribosa, y cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxinucleósidos, en donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14, 14 a 15 y 15 a 16 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces de fosforotioato, y en donde cada citosina es una 5'-metilcitosina.
ISIS 801287 se describe mediante la siguiente notación química: Ges mCeo mCeo mCes mCds Tds Ads Gds mCds Gds mCds Gds mCeo Geo Aeo mCes Tes mCe; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5’-metilo citosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado 2’-O-metoxietilribosa
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato, y
o = un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
ISIS 801287, el oligonucleótido de la invención, se describe mediante la siguiente estructura química o una sal de la misma:
Figure imgf000035_0001
Estructura 1. ISIS 801287
La sal de sodio de ISIS 801287, el oligonucleótido modificado de la invención, se describe mediante la siguiente estructura química:
Figure imgf000036_0001
Estructura 2. La sal de sodio de ISIS 801287
2. ISIS 806679
En ciertas realizaciones, ISIS 806679 se caracteriza como un 6-10-4 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GGTTAATCTTTATCAGGTCT (incorporada aquí como SEQ ID NO: 49), en donde cada uno de los nucleósidos 1-6 y 17-20 son nucleósidos modificados con 2’-O-metoxietilribosa, y cada uno de los nucleósidos 7-16 son 2'-desoxinucleósidos, en donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, y 17 a 18 son enlaces fosfodiéster y enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 16 a 17, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces de fosforotioato, y en donde cada citosina es una 5’-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, ISIS 806679 se describe mediante la siguiente notación química: Ges Geo Teo Teo Aeo Aeo Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ads Gds Geo Tes mCes Te; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado 2’-O-metoxietilribosa
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato, y
o = un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, ISIS 806679 se describe mediante la siguiente estructura química, o una sal de la misma:
Figure imgf000037_0001
Estructura 3. ISIS 806679
En ciertas realizaciones, la sal de sodio de ISIS 806679 se describe mediante la siguiente estructura química:
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Estructura 4. La sal de sodio de ISIS 806679
3. ISIS 802473
En ciertas realizaciones, ISIS 802473 se caracteriza como un 4-8-6 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GCCTTACTCTAGGACCAA (incorporada aquí como SEQ ID NO: 47), en donde cada uno de los nucleósidos 1­ 4 y 13-18 son nucleósidos modificados con 2’-O-metoxietilribosa, y cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxinucleósidos, en donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14, 14 a 15 y 15 a 16 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre nucleósidos son 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces de fosforotioato, y en donde cada citosina es una 5'-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, ISIS 802473 se describe mediante la siguiente notación química: Ges mCeo mCeo Tes Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Geo Aeo mCeo mCes Aes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5’-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado 2’-O-metoxietilribosa
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato, y
o = un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, ISIS 802473 se describe mediante la siguiente estructura química, o una sal del misma:
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Estructura 5. ISIS 802473
En ciertas realizaciones, la sal de sodio de ISIS 802473 se describe mediante la siguiente estructura química:
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Estructura 6. La sal de sodio de ISIS 802473
4. ISIS 802459
En ciertas realizaciones, ISIS 802459 se caracteriza como un 3-10-7 gápmero MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (incorporada aquí como SEQ ID NO: 21), en donde cada uno de los nucleósidos 1-3 y 14-20 son nucleósidos modificados con 2’-O-metoxietilribosa, y cada uno de los nucleósidos 4-13 son 2'-desoxinucleósidos, en donde los enlaces intemucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 14 a 15, 15 a 16, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces fosfodiéster y los enlaces intemucleósidos entre nucleósidos son 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces de fosforotioato, y en donde cada citosina es una 5’-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, ISIS 802459 se describe mediante la siguiente notación química: Ges mCeo mCeo Tds Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Gds Aeo mCeo mCeo Aeo Aes Ges Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado 2’-O-metoxietilribosa
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato, y
o = un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, ISIS 802459 se describe mediante la siguiente estructura química, o una sal del misma:
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Estructura 7. ISIS 802459
En ciertas realizaciones, la sal de sodio de ISIS 802459 se describe mediante la siguiente estructura química:
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Estructura 8. La sal de sodio de ISIS 802459
EJEMPLOS
Divulgación no lim itativa
Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: O ligonucleótidos antisentido dirigidos a C9ORF72 humano
Los oligonucleótidos antisentido en la tabla a continuación se diseñaron como gápmeros de MOE. El segmento de separación central de cada separador contiene 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en el extremo 5’ como en el extremo 3' que contiene nucleósidos que comprenden cada uno un grupo 2'-MOE. El motivo específico de cada gápmero se enumera en la tabla a continuación, representada por tres números separados por guiones. Los números representan el número de nucleósidos en el ala 5’, el separador y el ala 3', respectivamente. Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. Los enlaces internucleosídicos para los gápmeros son enlaces mixtos de fosforotioato y fosfodiéster. Los enlaces internucleosídicos para cada gápmero se presentan en la columna de enlace, donde “o" indica un enlace fosfodiéster y “s" indica un enlace de fosforotioato. Cada oligonucleótido antisentido que se enumera en la tabla a continuación está dirigido a la secuencia genómica C9ORF72 humana, designada aquí como SEQ ID NO: 2 (el complemento de GENBANK N° de acceso NT_008413,18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 27565000). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia genómica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3’ al que el gápmero es la secuencia genómica humana dirigida.
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v "0o3 = O
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Ejemplo 2: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido d irigidos a C9ORF72 humano en ratones
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se probaron en ratones para evaluar la tolerabilidad de los oligonucleótidos. Cada uno de los ratones tipo C57/B16 recibió una dosis única de ICV de 700 pg de un oligonucleótido antisentido que figura en la tabla a continuación. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 ratones. A las 3 horas después de la inyección, cada ratón se evaluó de acuerdo con 7 criterios diferentes. Los 7 criterios son (1) el ratón era brillante, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba parado o encorvado sin estímulos; (3) el ratón mostró cualquier movimiento sin estímulos; (4) el ratón demostró movimiento hacia adelante después de levantarlo; (5) el ratón demostró cualquier movimiento después de levantarlo; (6) el ratón respondió a un pellizco de la cola; (7) respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios diferentes, a cada ratón se le asignó un puntaje secundario de 0 si cumplía con los criterios o 1 si no lo hacía. Después de que se evaluaron los 7 criterios, se sumaron las puntuaciones secundarias para cada ratón y luego se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si un mouse era brillante, alerta y respondía 3 horas después de la dosis de 700 pg de ICV, y cumplía con todos los demás criterios, obtendría un puntaje sumado de 0. Si otro ratón no era brillante, alerta y respondía 3 horas después de la dosis de 700 pg de ICV pero cumplió con todos los demás criterios, recibiría una puntuación de 1. Los resultados se presentan como la puntuación promedio para cada grupo de tratamiento.
Tabla 7
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(Continuación)
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Ejemplo 3: Tolerabilidad de oligonucleótidos del documento WO 2014/062691
Los oligonucleótidos descritos en el documento WO 2014/062691 se probaron en un estudio de tolerabilidad aguda en ratones. Los grupos de 3 ratones C57/B16 de tipo salvaje se trataron y analizaron como se describe en el Ejemplo 2. Los oligonucleótidos probados incluyen los enumerados en la tabla a continuación, que son 5-10-5 gápmeros MOE con un esqueleto de fosforotioato completo y cada citosina es un 5-metilcitosina. Se muestran los sitios de inicio y finalización en la SEQ ID NO: 2 a los que se dirige cada oligonucleótido. Los resultados se presentan como el puntaje promedio para cada grupo de tratamiento en la tabla a continuación. Estos resultados demuestran que ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, ISIS 577083 e ISIS 577056 fueron mal tolerados.
Tabla 8
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Tabla 9
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 4: Inhibición antisentido de una variante de ARNm de C9ORF72 humano en células HepG2
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se prueban para determinar sus efectos sobre el ARNm de C9ORF72 in vitro. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se electroporan con un oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aísla el ARN de las células y se miden los niveles de ARNm de C9ORF72 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Conjunto de sonda de cebador humano RTS3905 (secuencia de cebador directo GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, designada aquí como SEQ ID NO: 12; secuencia de cebador inverso GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, designada aquí como SEQ ID NO: 13; secuencia de sonda TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, designada aquí como SEQ ID n O: 14 - a TAQ se utiliza el conjunto de sonda de cebador man). RTS3905 detecta una variante de ARNm (por ejemplo, NM_001256054,1) procesada a partir de una variante pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido. La variante de ARNm procesada a partir de una variante pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido es en este documento la "variante de ARNm patogénico asociado C9ORF72". Un pre-ARNm contiene la repetición del hexanucleótido cuando comienza la transcripción del pre-ARNm en la región desde el sitio de inicio del exón 1A al sitio de inicio del exón IB (generalmente los nucleótidos 1107 a 1520 de la secuencia genómica: SEQ ID NO: 2, el complemento de N° de acceso GENBANK NT_008413,18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 2756500. Por lo tanto, los oligonucleótidos diseñados en esta región se dirigen selectivamente a la variante pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido de la variante de pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido y, por lo tanto, mide la reducción de la variante de pre-ARNm que contiene la repetición del hexanucleótido Los niveles de la variante de ARNm patogénico asociado C9ORF72 se normalizan al contenido total de ARN de la célula, tal como se mide por RIBOGREEN®, los niveles de variante de ARNm normalizados se comparan con los de las células que no fueron tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Ejemplo 5: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de una variante de ARNm de C9ORF72 humano
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se prueban a varias dosis en células HepG2. Las células se colocan en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se electroporan con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas o 24 horas, se aísla el ARN de las células y se miden los niveles de ARNm de C9ORF72 por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador C9ORF72 humano RTS3905 se usa para medir la variante de ARNm patogénico asociado C9ORF72. Los niveles de la variante de ARNm C9ORF72 patógena asociada se ajustan de acuerdo al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. La concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se calcula basándose en la inhibición de los niveles variantes de ARNm observadas en cada dosis individual de oligonucleótido antisentido.
Ejemplo 6: Inhibición antisentido de C9ORF72 por oligonucleótidos antisentido de reacción cruzada humanorhesus en células LLC-MK2
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente que son completamente reactivos con un ácido nucleico rhesus C9ORF72 se prueban para determinar sus efectos sobre el ARNm rhesus C9ORF72 in vitro. Las células rhesus LLC-MK2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se electroporan con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aísla el ARN de las células y se miden los niveles de ARNm de C9ORF72 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Conjunto de sonda de cebador RTS3750 (secuencia directa TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, designada aquí como SEQ ID NO: 15; secuencia inversa GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, designada aquí como SEQ ID NO: 16; secuencia de sonda TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, designada aquí como SEQ ID NO: 17 - un conjunto de sonda de cebador TAQ-man) se usa para medir los niveles totales de ARNm de C9ORF72. RTS3750 se dirige al exón 2 de las transcripciones de ARNm y, por lo tanto, mide las transcripciones de ARNm totales. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustan de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®, luego los niveles de variante de ARNm normalizados se comparan con los de las células que no fueron tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Ejemplo 7: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del ARNm de C9ORF72 humano en LLC-MK2
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se prueban a varias dosis en células LLC-MK2. Las células se colocan en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se electroporan con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas o 24 horas, se aísla el ARN de las células y se miden los niveles de ARNm de C9ORF72 por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador RTS3750 se usa para medir los niveles totales de ARNm de C9ORF72. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustan de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®, luego los niveles de variante de ARNm normalizados se comparan con los de las células que no fueron tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Ejemplo 8: Inhibición antisentido del ARNm de C9ORF72 humano en un modelo de ratón transgénico
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se prueban en dos líneas de ratones transgénicos BAC, designadas aquí como C9B41 y C9B183, que expresan cada uno un gen C9ORF72 humano truncado que comprende los exones 1 -5. Los genes C9ORF72 humanos truncados de las líneas de ratón C9B41 y C9B183 comprenden 110 y 450 repeticiones de hexanucleótidos, respectivamente. Cada ratón en cada grupo de tratamiento recibe 350 jg de un oligonucleótido antisentido, luego los niveles de expresión del ARN C9ORF72 humano se analizan por RT-PCR. También se realizan respuestas a la dosis.
Ejemplo 9: Inhibición antisentido del ARNm de C9ORF72 en fibroblastos de pacientes
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se probaron para determinar sus efectos sobre el ARNm de C9ORF72 in vitro. Los oligonucleótidos antisentido enumerados en la tabla a continuación se agregaron a una placa antes de agregar fibroblastos F09-152 a una densidad de 20.000 células por pocillo. Las concentraciones finales de los oligonucleótidos antisentido después de la adición de las células se enumeran en la tabla a continuación. Después de 30 segundos de agitación, las células se electroporaron y luego se transfirieron a una placa de cultivo recubierta con Primaria. Después de 16 horas, se aisló el ARN de las células, y los niveles de ARNm de C9ORF72 total (es decir, ARNm a partir del exón 1A y ARNm a partir del exón IB) y los niveles del ARNm patógeno asociado (véase el Ejemplo 4) se midieron por RT-qPCR. Se usaron los conjuntos de sondas de cebador humano RTS 3750 (véase el Ejemplo 6) y RTS3905 (véase el Ejemplo 4) para detectar el ARNm C9ORF72 total y el ARNm patogénico C9ORF72 asociado, respectivamente. Los niveles del ARNm total C9ORF72 y el ARNm asociado patogénico C9ORF72 se normalizaron con el contenido total de ARN de la célula, medido por RIBOGREEN®, luego se compararon los niveles normalizados de ARNm con los de las células que no se trataron con oligonucleótido antisentido. Los resultados se muestran en la tabla de abajo. Una entrada de "nd" significa no determinado. Los valores de CI50 enumerados como "nd" no se determinaron, porque la diana no se inhibió lo suficiente como para determinar un CI50. Los resultados muestran que todos los oligonucleótidos enumerados a continuación inhibieron la variante de ARNm de C9ORF72 patógena asociada. Los oligonucleótidos que no se dirigen específicamente a la variante repetida pre-ARNm inhibieron tanto el ARNm C9ORF72 patogénico asociado como el ARNm C9ORF72 total. Los oligonucleótidos que se dirigen específicamente a la variante repetida pre-ARNm inhibieron selectivamente el ARNm C9ORF72 patogénico asociado.
Tabla 10
Figure imgf000049_0001
(Continuación)
Figure imgf000050_0001
(Continuación)
Figure imgf000051_0001
Ejemplo 10: inhibición antisentido del ARNm de C9ORF72 humano en un modelo de ratón transgénico
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se probaron en una línea de ratón transgénico BAC, C9B41 (véase el Ejemplo 8), que expresa un gen C9ORF72 humano que comprende la región promotora a través del exón 5 y 110 repeticiones de hexanucleótidos. Cada grupo de tratamiento consistió en 2-3 ratones. Cada ratón recibió un solo ICVB de 350 gg de un oligonucleótido antisentido que se enumera en las tablas a continuación o PBS. Dos semanas después, los ratones fueron sacrificados, y los niveles de expresión de la variante de ARNm de C9ORF72 asociada a patógenos humanos y/o el ARNm de C9ORF72 humano total se analizaron por RT-qPCR como se describe en el Ejemplo 9. El análisis de los niveles de ARNm de variante de C9ORF72 asociados a patógenos no fue completado para los oligonucleótidos que no se dirigen específicamente a la variante repetida C9ORF72 pre-ARNm. Los resultados en las tablas a continuación muestran el porcentaje promedio de niveles de ARNm de C9ORF72 humano normalizado en relación con el promedio normalizado para el grupo tratado con PBS.
Tabla 11
Figure imgf000052_0001
Tabla 12
Figure imgf000053_0002
Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de C9ORF72 humano en un modelo de ratón transgénico
Los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente se probaron en dos líneas de ratones transgénicos BAC, C9B41 y C9B183, que expresan cada uno el gen C9ORF72 humano atruncado que comprende los exones 1-5. Los genes C9ORF72 humanos truncados de las líneas de ratón C9B41 y C9B183 comprenden 110 y 450 repeticiones de hexanucleótidos, respectivamente (véase el Ejemplo 8). Cada grupo de tratamiento consistió en 2-4 ratones. Cada ratón recibió un solo ICVB de 30 gg, 100 gg, 300 gg o 700 gg de un oligonucleótido antisentido como se enumera en las tablas a continuación o PBS. Dos semanas después, los ratones se sacrificaron y los niveles de expresión de la variante de ARNm de C9ORF72 asociada a patógenos humanos y/o ARNm de C9ORF72 humano total se analizaron por RT-qPCR como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados en las tablas a continuación muestran el porcentaje promedio normalizado niveles de ARNm de C9ORF72 humano en relación con el promedio normalizado para el grupo tratado con PBS. Un valor de 100 o mayor significa que el oligonucleótido antisentido no redujo el ARNm ni aumentó la cantidad de ARNm.
Tabla 13
Figure imgf000053_0001
Tabla 14
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 12: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido d irigidos a ratones C9ORF72in humanos
Cada uno de los ratones tipo C57/B16 recibió una dosis única de ICV de 700 pg de un oligonucleótido antisentido que figura en la tabla a continuación, como se describe en el Ejemplo 2. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 ratones. A las 8 semanas después de la inyección, los ratones fueron evaluados de acuerdo con 7 criterios diferentes. Los criterios son (1) el ratón era brillante, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba parado o encorvado sin estímulos; (3) el ratón mostró cualquier movimiento sin estímulos; (4) el ratón demostró movimiento hacia adelante después de levantarlo; (5) el ratón demostró cualquier movimiento después de levantarlo; (6) el ratón respondió al pellizco de la cola; (7) respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios, a un ratón se le asignó una puntuación inferior de 0 si cumplía con los criterios y 1 si no lo hacía. Después de evaluar los 7 criterios, las puntuaciones se sumaron para cada ratón y se promediaron dentro de cada grupo de tratamiento. Los resultados se presentan en la tabla a continuación.
Los animales fueron sacrificados a las 8 semanas. Se recogieron la corteza y la médula espinal de cada animal, y se realizó RT-PCR. Los niveles de expresión del factor inflamatorio de aloinjerto (AIF1) se determinaron como una medida de inflamación. Los niveles de expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) también se determinaron como una medida de la activación de las células gliales. Los resultados se normalizaron a Gpadh y se presentan en relación con el control PBS (1,0) en la tabla a continuación. "ND" indica que no hubo datos porque el experimento no se realizó. Un asterisco indica que el resultado correspondiente es el promedio de 1-3 ratones.
Tabla 15:
Figure imgf000054_0002
(Continuación)
Figure imgf000055_0001
(Continuación)
Figure imgf000056_0001
Ejemplo 13: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ratas C9ORF72in humanas
Las ratas Sprague Dawley se separaron en grupos de 4 o 6 ratas. A cada rata en cada grupo de ratas se le administró una dosis intratecal (IT) única de 3 mg del oligonucleótido indicado en la tabla a continuación. A las 3 horas y a las 8 semanas después de la dosis de IT, se evaluó el movimiento de 7 partes diferentes del cuerpo para cada rata. Las 7 partes del cuerpo son (1) la cola de la rata; (2) la postura posterior de la rata; (3) las extremidades posteriores de la rata; (4) las patas traseras de la rata; (5) las patas delanteras de la rata; (6) la postura anterior de la rata; (7) la cabeza de la rata. Para cada una de las 7 partes del cuerpo diferentes, a cada rata se le asignó un puntaje secundario de 0 si la parte del cuerpo se movía o 1 si la parte del cuerpo estaba paralizada. Después de evaluar cada una de las 7 partes del cuerpo, se sumaron los puntajes secundarios para cada rata y luego se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si la cola, la cabeza y todas las demás partes del cuerpo evaluadas de una rata se movieran 3 horas después de la dosis de 3 mg de IT, obtendría un puntaje sumado de 0. Si otra rata no moviera su cola 3 horas después de la dosis de dosis 3 mg de IT pero todas las demás partes del cuerpo evaluadas se movían, recibiría una puntuación de 1. Las ratas tratadas con solución salina generalmente reciben una puntuación de 0. Una puntuación en el extremo superior del rango sugeriría toxicidad aguda. Los resultados se presentan en la tabla a continuación como el puntaje promedio para cada grupo de tratamiento.
Los animales fueron sacrificados a las 8 semanas. Se recogieron la corteza y la médula espinal de cada animal, y se

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula:
    Figure imgf000109_0001
    (SEQ ID NO: 33) o una sal del mismo.
    2. Un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula:
    Figure imgf000110_0001
    (SEQ ID NO: 33).
    3. El oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que es una sal de sodio de la fórmula.
    4. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido modificado de cualquier reivindicación precedente y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
    5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que la composición farmacéutica consiste esencialmente en el oligonucleótido modificado y solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    7. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, en el que el oligonucleótido modificado es un gápmero que consiste en un segmento de ala de 5', un segmento de espacio central y un segmento de ala de 3', en el que: el segmento del ala 5’ consiste en cuatro nucleósidos de 2'-O-metoxietilo,
    el segmento de separación central consta de ocho p-D-desoxirribonucleósidos, y
    el segmento del ala 3’ consiste en seis nucleósidos de 2'-O-metoxietilo;
    en donde el oligonucleótido modificado tiene la secuencia de nucleobase 5'-GCCCCTAGCGCGCGACTC-3 '(SEQ ID NO: 33), en donde cada citosina es una 5-metilcitosina; y en donde los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido modificado son, de 5 'a 3', soosssssssssoooss, en donde cada s es un enlace de fosforotioato y cada o es un enlace fosfodiéster.
    8. El compuesto de la reivindicación 7, que comprende el oligonucleótido modificado unido covalentemente a un grupo conjugado.
    9. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
    10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la composición farmacéutica consiste esencialmente en el compuesto y solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    12. Un oligonucleótido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, un compuesto de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 4-6 y 9-11, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad neurodegenerativa.
    13. El oligonucleótido, compuesto o composición farmacéutica modificada para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad neurodegenerativa es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome de Parkinson atípico o degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
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