RU2736574C2 - Композиции для модулирования экспрессии c9orf72 - Google Patents

Композиции для модулирования экспрессии c9orf72 Download PDF

Info

Publication number
RU2736574C2
RU2736574C2 RU2017139121A RU2017139121A RU2736574C2 RU 2736574 C2 RU2736574 C2 RU 2736574C2 RU 2017139121 A RU2017139121 A RU 2017139121A RU 2017139121 A RU2017139121 A RU 2017139121A RU 2736574 C2 RU2736574 C2 RU 2736574C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
c9orf72
antisense
modified oligonucleotide
nucleic acid
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
RU2017139121A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017139121A (ru
RU2017139121A3 (ru
Inventor
Франк РИГО
Original Assignee
Ионис Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ионис Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Ионис Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2017139121A publication Critical patent/RU2017139121A/ru
Publication of RU2017139121A3 publication Critical patent/RU2017139121A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2736574C2 publication Critical patent/RU2736574C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлена группа изобретений, включающая модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 33, или его соль, натриевую соль вышеуказанного олигонуклеотида, фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество вышеуказанного модифицированного олигонуклеотида для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72 (варианты), фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество натриевой соли модифицированного олигонуклеотида для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72. В одном из вариантов реализации модифицированный олигонуклеотид характеризуется последовательностью нуклеиновых оснований 5'-GCCCCTAGCGCGCGACTC-3' (SEQ ID NO: 33), где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и где межнуклеозидные связи модифицированного олигонуклеотида, в направлении 5'-3', представляют собой soosssssssssoooss, где каждая s представляет собой тиофосфатную связь, и каждая о представляет собой фосфодиэфирную связь. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения заболеваний, ассоциированных с C9ORF72. 8 н. и 12 з.п. ф-лы, 17 табл., 14 пр.

Description

Перечень последовательностей
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0269WOSEQ_ST25.txt, созданного 15 апреля 2016 года, размером 104 Кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
Область изобретения
Предложены композиции и способы модулирования экспрессии мРНК и белка C9ORF72 в клетках и у животных. Указанные композиции и способы подходят для лечения, предупреждения, облегчения или замедления прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, включая боковой амиотрофический склероз (ALS - amyotrophic lateral sclerosis), лобно-височную деменцию (FTD - frontotemporal dementia), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD - corticobasal degeneration syndrome), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD - olivopontocerebellar degeneration).
Уровень техники
Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой неизлечимое нейродегенеративное заболевание, клинически характеризующееся прогрессирующим параличом, приводящим к смерти вследствие дыхательной недостаточности, обычно в течение двух-трех лет после возникновения симптома (Rowland and Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). ALS является третьим по распространенности нейродегенеративным заболеванием в западном мире (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337), и в настоящее время не существует эффективных терапевтических способов лечения. Около 10% случаев являются наследственными по своей природе, при этом основная масса пациентов, у которых диагностировано указанное заболевание, классифицируется как спорадическая, поскольку болезнь возникает в популяции случайным образом (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537). На основании клинических, генетических и эпидемиологических данных растет понимание того, что ALS и лобно-височная деменция (FTD) представляют собой перекрывающийся, сплошной спектр заболевания, патологически характеризующийся наличием TDP-43-положительных включений в центральной нервной системе (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).
В настоящее время открыто множество генов, являющихся причиной классического наследственного ALS, например, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN и VCP (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Проведенный недавно анализ генетических связей между родственниками с многочисленными случаями ALS, FTD и ALS-FTD позволил предположить, что существует важный локус указанного заболевания на коротком плече хромосомы 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). Мутация в гене C9ORF72 является наиболее распространенной генетической причиной ALS и FTD. Мутация, вызывающая ALS-FTD, представляет собой экспансию крупного гексануклетоидного (GGGGCC) повтора в первом интроне гена C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Гаплотип-основатель, охватывающий ген C9ORF72, в большинстве случаев присутствует в связанной форме с указанной областью (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268). Указанный локус на хромосоме 9р21 обусловливает около половины случаев наследственного ALS и около четверти всех случаев ALS в группе из 405 финских пациентов (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
Гаплотип-основатель, охватывающий ген C9ORF72, в большинстве случаев присутствует в связанной форме с указанной областью.
В настоящее время не существует эффективных способов терапевтического лечения указанных нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиций и способов лечения указанных нейродегенеративных заболеваний.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии мРНК и белка C9ORF72 в клетках, тканях и у животных. В некоторых вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для снижения уровней мРНК и белка C9ORF72 в клетках, тканях и у животных. В некоторых вариантах реализации предложены антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой модифицированные олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации модифицированные олигонуклеотиды являются одноцепочечными.
В некоторых вариантах реализации обеспечено снижение продуктов ассоциированной с повтором C9ORF72, не связанной с ATG трансляции (RAN-зависимой трансляции). В некоторых вариантах реализации изобретения продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой поли(глицин-пролин), поли(глицин-аланин) и поли(глицин-аргинин). В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращены некоторые варианты мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращенные варианты мРНК C9ORF72 представляют собой варианты, процессированные из пре-мРНК, содержащей интрон 1. В некоторых вариантах реализации интрон 1 содержит экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращенный вариант мРНК C9ORF72 представляет собой патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации патоген-асоциированный вариант мРНК C9ORF72 представляет собой NM_001256054.1 (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора связана с C9ORF72-ассоциированным заболеванием. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора связана с заболеванием, ассоциированным с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 30 повторов GGGGCC, более 30 повторов GGGGCC, более 100 повторов GGGGCC, более 500 повторов GGGGCC или более 1000 повторов GGGGCC. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора ассоциирована с ядерными очагами. В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции ассоциированы с ядерными очагами. В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой поли(глицин-пролин), поли(глицин-аланин) и поли(глицин-аргинин). В некоторых вариантах реализации композиции и способы, описанные в настоящем документе, пригодны для снижения уровней мРНК C9ORF72, уровней белка C9ORF72, продуктов RAN-зависимой трансляции C9ORF72 и ядерных очагов. В некоторых вариантах реализации композиции и способы, описанные в настоящем документе, пригодны для селективного сокращения патоген-ассоциированных вариантов мРНК C9ORF72. Подобные сокращения могут возникать в зависимости от времени или в зависимости от дозы.
Предложены также способы, пригодные для предупреждения, лечения, облегчения и замедления прогрессирования заболеваний, связанных с C9ORF72. В некоторых вариантах реализации указанные заболевания, связанные с C9ORF72, представляют собой нейродегенеративные заболевания. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS), лобно-височную деменцию (FTD), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD).
Такие заболевания могут в совокупности иметь один или несколько факторов риска, причин или последствий. Некоторые факторы риска и причины развития нейродегенеративного заболевания и, в частности, ALS и FTD, включают генетическую предрасположенность и пожилой возраст.
В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения включают введение антисмыслового соединения против C9ORF72 индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид комплементарен нуклеиновой кислоте C9ORF72.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что изложенное выше общее описание и следующее подробное описание являются лишь примерными и пояснительными, и не являются ограничивающими заявленное изобретение. В данном документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. В данном контексте термин «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, в данном контексте применение термина «и» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Также, такие термины как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.
Соединения согласно настоящему изобретению включают разновидности описанных соединений, в которых один или более атомов водорода, углерода, азота, кислорода или серы заменен на стабильный изотоп того же элемента.
Названия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей, и их не следует толковать как ограничение описанного объекта изобретения. Все документы или фрагменты документов, цитируемые в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки, статьи, книги, монографии и учетные номера GENBANK, а также информацию об ассоциированной последовательности, получаемую посредством баз данных, таких как Национальный центр информации по биотехнологии (NCBI), и другие данные, указанные в в тексте настоящего описания, явным образом включены в настоящий документ посредством ссылки в отношении тех фрагментов документов, которые рассмотрены в настоящем документе, а также в полном объеме.
Определения
При отсутствии конкретных определений, номенклатура, используемая в связи с ними, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в настоящем документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методы.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
«2'-O-метоксиэтил» (также 2'-МОЕ и 2'-ОСН2СН2-ОСН3 и МОЕ) относится к О-метоксиэтильной модификации в 2' положении фуранозного кольца. 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.
«2'-МОЕ нуклеозид» (также 2'-O-метоксиэтил-нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий модифицированный МОЕ фрагмент сахара.
«2'-замещенный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий отличный от Н или ОН заместитель в 2'-положении фуранозного кольца. В некоторых вариантах реализации 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями.
«5-Метилцитозин» обозначает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5' положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.
«Вводят совместно» относится к совместному введению двух фармацевтических агентов любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих проявляются у пациента одновременно. Совместное применение не требует, чтобы оба фармацевтических агента вводились в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним способом введения. Эффекты обоих фармацевтических агентов не обязательно должны проявляться одновременно. Эффекты должны только перекрываться в промежутке времени и не обязательно должны иметь одинаковую продолжительность.
«Введение» означает обеспечение фармацевтическим агентом животного и включает, но не ограничивается этим, введение медицинским работником и самостоятельное введение.
«Улучшение» относится к уменьшению, замедлению, остановке или инвертированному течению по меньшей мере одного показателя тяжести состояния или заболевания. Степень тяжести показателей может быть определена субъективными или объективными показателями, которые известны специалистам в данной области техники.
«Животное» относится к человеку или животному, которое не является человеком, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.
«Антитело» относится к молекуле, характеризующейся специфическим взаимодействием с антигеном каким-либо образом, при этом антитело и антиген определены относительно друг друга. Антитело может относиться к целой молекуле антитела, или какому-либо ее фрагменту или области, такой как тяжелая цепь, легкая цепь, область Fab и область Fc.
«Антисмысловая активность» означает любую обнаруживаемую или поддающуюся измерению активность, обусловленную гибридизацией антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В неких вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.
«Антисмысловое соединение» означает олигомерное соединение, которые способно гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой посредством водородной связи. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, мшРНК, оцРНК и соединения на их основе.
«Антисмысловое ингибирование» означает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты в присутствии антисмыслового соединения комплементарного целевой нуклеиновой кислоте по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты или в отсутствие антисмыслового соединения.
«Антисмысловые механизмы» представляют собой все те механизмы гибридизации соединения с целевой нуклеиновой кислотой, отличающиеся тем, что результат или эффект гибридизации или целевой деградации, или целевой занятости с сопутствующей остановкой клеточных механизмов, при участии, например, транскрипции или сплайсинга.
«Антисмысловой олигонуклеотид» означает одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий последовательности, обеспечивающие гибридизацию соответствующему сегменту целевой нуклеиновой кислоты.
«Комплементарность основания» относится к способности спаривания конкретной пары нуклеиновых оснований антисмыслового олигонуклеотида с соответствующими нуклеиновыми основаниями в нуклеиновой кислоте-мишени (т.е. гибридизации), опосредованной уотсон-криковским, хугстиновским или обратным хугстиновским водородным связыванием между соответствующими нуклеиновыми основаниями.
«Бициклический сахар» означает фуранозное кольцо, модифицированное образованием мостика между двумя атомами. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.
«Бициклический нуклеозид» (также БНК) означает нуклеозид, содержащий фрагмент сахара, содержащий мостик, соединяющий два атома углерода сахарного кольца, в результате чего образуется бициклическая кольцевая система. В некоторых вариантах реализации, мостик соединяет 4'-углерод и 2'-углерод сахарного кольца.
«Антисмысловой транскрипт C9ORF72» означает транскрипты, полученные из некодирующей цепи (также антисмысловой цепи и матричной цепи) гена C9ORF72. Антисмысловой транскрипт C9ORF72 отличается от канонически транскрибированного «смыслового транскрипта C9ORF72», который образуется из кодирующей цепи (также смысловой цепи) гена C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловой транскрипт C9ORF72 представляет собой SEQ ID NO: 18.
«Специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72» относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72 и/или продукты его экспрессии на молекулярном уровне. В данном контексте «специфический» означает снижение или ингибирование экспрессии антисмыслового транскрипта C9ORF72 без существенного снижения нецелевого транскрипта (например, специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 снижает экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72, но существенно не снижает экспрессию смыслового транскрипта C9ORF72). Специфические ингибиторы антисмыслового транскрипта C9ORF72 включают антисмысловые соединения, миРНК, аптамеры, антитела, пептиды, низкомолекулярные соединения и другие агенты, способные ингибировать экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72 и/или продукты его экспрессии, такие как продукты RAN-зависимой трансляции, ассоциированной с антисмысловым транскриптом C9ORF72.
«Связанное с C9ORF72 заболевание» обозначает любое заболевание, связанное с любой нуклеиновой кислотой C9ORF72 или продуктом ее экспрессии. Такие заболевания могут включать нейродегенеративное заболевание. Такие нейродегенеративные заболевания могут включать ALS и FTD. В некоторых вариантах реализации заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано (или ассоциировано с) экспансией гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора может содержать GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG, повторяющиеся по меньшей мере 30 раз, более 30 раз, более 100 раз, более 500 раз или более 1000 раз.
«Продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции» означают аберрантные пептидные или дипептидные полимеры, транслированные посредством RAN-трансляции (т.е. ассоциированной с повтором и не зависимой от ATG трансляции). В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72- ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
«Нуклеиновая кислота C9ORF72» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую C9ORF72. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 включает последовательность ДНК, кодирующую C9ORF72, последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей C9ORF72, в том числе, геномной ДНК, содержащей интроны и экзоны (т.е. пре-мРНК), и последовательность мРНК, кодирующую C9ORF72. «мРНК C9ORF72» обозначает мРНК, кодирующую белок C9ORF72.
«Патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72» означает вариант мРНК C9ORF72, процессированный из варианта пре-мРНК C9ORF72, содержащего гексануклеотидный повтор. Пре-мРНК C9ORF72 содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1В, например, с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности (SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). В некоторых вариантах реализации измеряют уровень патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 для определения уровня пре-мРНК C9ORF72, содержащей гексануклеотидный повтор, в образце.
«Специфический ингибитор C9ORF72 «относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72 на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы C9ORF72 включают нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), миРНК, аптамеры, антитела, пептиды, низкомолекулярные соединения и другие агенты, способные ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72. Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 могут влиять на другие молекулярные процессы у животного.
«Кэп-структура» или «кэп-терминальный фрагмент» означает химические модификации, которые были сделаны на любом конце антисмыслового соединения.
«cEt» или «стерически затрудненный этил» означает бициклический нуклеозид, содержащий фрагмент сахара, содержащий мостик, соединяющий 4'-углерод и 2'-углерод, причем мостик имеет формулу: 4'-СН(СН3)-O-2'.
«Нуклеозид со стерически затрудненным этилом» (также cEt нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий бициклический фрагмент сахара, содержащий 4'-СН(СН3)-O-2' мостик.
«Химически отличная область» означает область антисмыслового соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, содержащая 2'-O-метоксиэтил-нуклеозиды, химически отличается от области, содержащей нуклеозиды без 2'-O-метоксиэтильных модификаций.
«Химерное антисмысловое соединение» означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически различные области, каждая позиция имеет множество субъединиц.
«Совместное введение» означает введение индивидууму двух или более фармацевтических агентов. Два или более фармацевтических агентов могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более фармацевтических агентов может быть введен таким же или другим способом введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.
«Комплементарность» означает способность к спариванию нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
«Включать», «включает» и «включающий» следует понимать как включение указанной стадии или элемента, или группы элементов или стадий, но не исключение любого другого элемента или стадии, или группы стадий или элементов.
«Смежные нуклеиновые основания» означают нуклеиновые основания, непосредственно примыкающие друг к другу.
«Конструирование» или «сконструированный для» относиться к процессу конструирования олигомерного соединения, которое специфически гибридизуется с выбранной молекулой нуклеиновой кислоты.
«Разбавитель» означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но необходим или желателен с фармацевтической точки зрения. Например, в препаратах, которые вводят парентерально, разбавитель может быть жидкостью, например, солевым раствором.
«Доза» означает количество указанного фармацевтического агента, обеспечиваемое за одно введение или за определенный период времени. В некоторых вариантах реализации доза может быть введена в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в определенных вариантах реализации, где необходимо подкожное введение, нужная доза требует объема, который не помещается в одной инъекции, поэтому для достижения желаемой дозы могут быть использованы две или более инъекций. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтический агент вводят путем инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического агента в час, день, неделю, или месяц.
«Эффективное количество» в контексте модулирования активности или лечения или предупреждения состояния, означает введение данного количества фармацевтического агента субъекту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или профилактике, или в однократной дозе или как часть серии, которое является эффективным для модуляции данного эффекта, или для лечения или профилактики или улучшения данного состояния. Эффективное количество может варьировать среди индивидуумов в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуумов, подлежащих лечению, рецептуры композиции, оценки индивидуального состояния здоровья и других релевантных факторов.
«Эффективность» означает способность производить желаемый эффект.
«Экспрессия» включает в себя все функции, благодаря которым информация, закодированная в гене, преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке. Такие структуры включают, но не ограничиваются ими, продукты транскрипции и трансляции.
«Очаг» или «очаги» означает ядерное или цитоплазматическое тело, содержащее транскрипт C9ORF72. В некоторых вариантах реализации очаг содержит по меньшей мере один транскрипт C9ORF72. В некоторых вариантах реализации очаги C9ORF72 содержат транскрипты, содержащие любой из следующих гексануклеотидных повторов: GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC и/или GGGGCG.
«Полностью комплементарный» или «100% комплементарный» означает, что каждое нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеиновое основание во второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
«Гэпмер» означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, располагается между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, причем нуклеозиды, составляющие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может быть описана как «гэп», а внешние области могут быть описаны как «крылья».
«Экспансия гексануклеотидного повтора» означает серию из шести оснований (например, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC), повторяющуюся по меньшей мере дважды. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора может быть расположена в интроне 1 нуклеиновой кислоты C9ORF72. В некоторых вариантах реализации патогенная экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 30, более 30, более 100, более 500 или более 1000 повторов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72 и ассоциирована с заболеванием. В некоторых вариантах реализации указанные повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации указанные повторы прерваны 1 или более нуклеиновыми основаниями. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора дикого типа содержит 23 или менее повторов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72. В некоторых вариантах реализации указанные повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации указанные повторы прерваны 1 или более нуклеиновыми основаниями.
«Гибридизация» означает соединение комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, антисмысловой олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.
«Идентификация животного, имеющего C9ORF72-ассоциированное заболевание» означает определение животного, которому поставлен диагноз C9ORF72-ассоциированного заболевания, или которое предрасположено к развитию C9ORF72-ассоциированного заболевания. Индивидуумы, предрасположенные к развитию C9ORF72-ассоциированного заболевания, включают тех, у кого присутствуют один или более факторов риска развития C9ORF72-ассоциированного заболевания, включая личный или семейный анамнез или генетическую предрасположенность к одному или более C9ORF72-ассоциированным заболеваниям. Такая идентификация может быть выполнена любым способом, включая оценку истории болезни человека и стандартными клиническими испытаниями или оценками, такими как генетическое тестирование.
«Непосредственно примыкающий» означает, что нет никаких промежуточных элементов между непосредственно примыкающими элементами.
«Индивидуум» означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.
«Ингибирование C9ORF72» обозначает снижение уровня или экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни мРНК и/или белка C9ORF72 ингибируются в присутствии антисмыслового соединения, нацеленного на C9ORF72, включая антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на C9ORF72, по сравнению с экспрессией мРНК и/или уровнями белка C9ORF72 в отсутствие антисмыслового соединения против C9ORF72, такого как антисмысловой олигонуклеотид.
«Ингибирование экспрессии или активности» означает снижение или блокаду экспрессии или активности и не обязательно говорит о полном прекращении экспрессии или активности.
«Межнуклеозидная связь» означает химическую связь между нуклеозидами.
«Связанные нуклеозиды» означают соседние нуклеозиды, связанные между собой межнуклеозидной связью.
«Заблокированная нуклеиновая кислота» или «ЗНК» или «ЗНК нуклеозид» означает, что мономеры нуклеиновой кислоты имеют мостик, соединяющий два атома углерода между 4' и 2' положениями сахарной части нуклеозида, тем самым образуя бициклический сахар. Примеры такого бициклического сахара включают, но не ограничиваются ими, А) α-L-метиленокси (4'-СН2-O-2') ЗНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН2-O-2') ЗНК, (С) этиленокси (4'-(СН2)2-O-2') ЗНК, (D) аминоокси (4'-СН2-O-N(R)-2') ЗНК и (Е) оксиамино (4'-СН2-N(R)-O-2') ЗНК, как показано ниже.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
В данном контексте соединения ЗНК включают, но не ограничиваются ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4' и 2' положениями сахара, причем каждый из мостиков независимо содержит 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- и -N(R1)-; где: x равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R1 и R2 независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксилный радикал, С1-С12 алкильный радикал, замещенный С1-С12 алкильный радикал, С2-С12 алкенильный радикал, замещенный С2-С12 алкенильный радикал, C2-C12 алкинильный радикал, замещенный С2-С12 алкинильный радикал, С5-С20 арильный радикал, замещенный С5-С20 арильный радикал, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарильный радикал, замещенный гетероарильный радикал, С5-С7 алициклический радикал, замещенный С5-С7 алициклический радикал, галоген, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, ацильный радикал (С(=O)-Н), замещенный ацильный радикал, CN, сульфонильный радикал (S(=O)2-J1) или сульфоксильный радикал (S(=O)-J1); и каждый J1 and J2 независимо представляет собой Н, С1-C12 алкильный радикал, замещенный С1-С12 алкильный радикал, С2-С12 алкенильный радикал, замещенный С2-С12 алкенильный радикал, С2-С12 алкинильный радикал, замещенный С2-С12 алкинильный радикал, С5-С20 арильный радикал, замещенный С5-С20 арильный радикал, ацильный радикал (С(=O)-Н), замещенный ацильный радикал, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С1-С12 аминоалкильный радикал, замещенный С1-С12 аминоалкильный радикал или защитную группу.
Примеры 4'-2' мостиковых групп, входящих в определение ЗНК, включают, но не ограничиваются ими, одну из формул: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-О- или -C(R1R2)-O-N(R1)-. Кроме того, другие мостиковые группы, входящие в определение ЗНК, представляют собой мостики 4'-СН2-2', 4'-(СН2)2-2', 4'-(СН2)3-2', 4'-СН2-O-2', 4'-(СН2)2-O-2', 4'-СН2-O-N(R1)-2' и 4'-СН2-N(R1)-O-2'-, где каждый R1 и R2 независимо представляет собой Н, защитную группу или C1-С12 алкильный радикал.
Также в определение ЗНК согласно настоящему изобретению включены ЗНК, в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного сахарного кольца соединена с 4' атомом углерода сахарного кольца, с образованием таким образом метиленоксильного мостика (4'-СН2-O-2'), формируя бициклический фрагмент сахара. Мостик также может быть метиленовой группой (-СН2-), соединяющей атом кислорода 2' и атом углерода 4', для которой используется термин метиленокси (4'-СН2-O-2') ЗНК. Кроме того, в случае бициклического фрагмента сахара, содержащего группу этиленового мостика в данном положении, применяется термин этиленокси (4'-СН2СН2-O-2') ЗНК. α-L-метиленокси (4'-СН2-O-2'), изомер метиленокси (4'-СН2-O-2') ЗНК, также попадает под определение ЗНК в данном контексте.
«Несоответствие» или «некомплементарное нуклеиновое основание» относится к случаю, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не способно связываться с соответствующим нуклеиновым основанием второй или нуклеиновой кислоты-мишени.
«Модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замене или любому изменению природной межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).
«Модифицированное нуклеиновое основание» означает любое нуклеиновое основание, отличное от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. «Немодифицированное нуклеиновое основание» означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Модифицированный нуклеозид» обозначает нуклеозид, содержащий независимо модифицированный фрагмент сахара и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, содержащий независимо модифицированный фрагмент сахара, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный олигонуклеотид» обозначает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный сахар» означает замещение и/или изменение любого из природных фрагментов сахаров.
«Мономер» означает одно звено олигомера. Мономеры включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды и нуклеотиды, природные или модифицированные.
«Мотив» означает конфигурацию из немодифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении.
«Природный фрагмент сахара» означает фрагмент сахара, находящийся в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
«Природная межнуклеозидная связь» означает 3'-5' фосфодиэфирную связь.
«Некомплементарное нуклеиновое основание» относится к паре нуклеиновых оснований нуклеиновых кислот, которые не образуют водородных связей друг с другом или иным образом не поддерживают гибридизацию.
«Нуклеиновая кислота» означает молекулы, состоящие из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает, но не ограничивается ими, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двуцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК.
«Нуклеиновое основание» означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
«Комплементарность нуклеиновых оснований» означает нуклеиновое основание, способное спариваться с другим нуклеиновым основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарное нуклеиновое основание означает нуклеиновое основание антисмыслового соединения, способное спариваться с нуклеиновым основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с нуклеиновым основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным по этой паре нуклеиновых оснований.
«Последовательность нуклеиновых оснований» означает порядок смежных нуклеиновых оснований, независимый от любой модификации сахара, связи или нуклеинового основания.
«Нуклеозид» означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром.
«Миметик нуклеозида» включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания и необязательно связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, например, такие как миметики нуклеозидов, содержащие морфолиновые, циклогексениловые, циклогексиловые, тетрагидропираниловые, бициклические или трициклические сахарные миметики, например, нефуранозные сахарные звенья. Миметик нуклеотида включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолины (морфолины, связанные -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связью). Заменитель сахара пересекается с более широким термином нуклеозид-миметик, но предназначен для обозначения замены только сахарной части (фуранозного кольца). Тетрагидропираниловые кольца, представленные в настоящем документе, иллюстрируют пример заменителя сахара, в котором фуранозная группа сахара заменена тетрагидропираниловой кольцевой системой. «Миметик» относится к группам, которые заменяют сахар, нуклеиновое основание и/или межнуклеозидную связь. Как правило, миметик используют вместо сахара или комбинации сахара с межнуклеозидной связью, а нуклеиновое основание сохраняется для гибридизации с выбранной мишенью.
«Нуклеотид» означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
«Нецелевой эффект» означает нежелательный или вредный биологический эффект, связанный с модуляцией экспрессии РНК или белка гена, отличного от нуклеиновой кислоты-мишени.
«Олигомерное соединение» или «олигомер» означает полимер из связанных мономерных субъединиц, которые способны к гибридизации с по меньшей мере областью молекулы нуклеиновой кислоты.
«Олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.
«Парентеральное введение» означает введение путем инъекций (например, болюсная инъекция) или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
«Пептид» означает, что молекула образуется путем связывания по меньшей мере двух аминокислот посредством амидных связей. Без ограничений, в данном контексте пептид относится к полипептидам и белкам.
«Фармацевтический агент» означает вещество, которое обеспечивает терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на C9ORF72, представляет собой фармацевтический агент.
«Фармацевтически приемлемое производное» включает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных в настоящем документе.
«Фармацевтически приемлемые соли» обозначает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют желательную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не вызывают нежелательных токсикологических эффектов.
«Тиофосфатная связь» означает связь между нуклеозидами, в которой фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из не образующих мостик атомов кислорода на атом серы. Тиофосфатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
«Часть» означает определенное количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.
«Предупреждать» или «предупреждение» относится к задержке или предотвращению появления или развития заболевания, расстройства или патологического состояния в течение периода времени от нескольких минут до дней, недель или месяцев, или на неопределенный срок.
«Пролекарство» означает терапевтический агент, который получен в неактивной форме, которая преобразуется в активную форму в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.
«Профилактически эффективное количество» означает такое количество фармацевтического агента, которое обеспечивает профилактический или превентивный эффект для животного.
«Область» определяют как фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, имеющий по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
«Рибонуклеотид» означает нуклеотид, имеющий гидрокси-группу в 2' положении сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы с помощью любого из множества заместителей.
«Соли» означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не вызывают нежелательных токсикологических эффектов.
«Сегменты» определяют как меньшие или субфрагменты областей в составе нуклеиновой кислоты-мишени.
«Укороченные» или «усеченные» версии антисмысловых олигонуклеотидов представленные в настоящем документе имеющие один, два или более удаленных нуклеозида.
«Побочные эффекты» означают отличающиеся от желаемых физиологические ответы, приписываемые лечению. В некоторых вариантах реализации побочные эффекты включают, без ограничения, реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, отклонения в функциях почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы и миопатии.
«Одноцепочечный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью. «Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид» означает модифицированный олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.
«Сайты» в данном контексте определяют как уникальные положения нуклеиновых оснований в нуклеиновой кислоте-мишени.
«Замедляет прогрессирование» означает ослабление развития указанного заболевания.
«Специфично гибридизуется» обозначает антисмысловое соединение, обладающее достаточной степенью комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью, чтобы вызывать желаемый эффект, минимально или никак не влияния на нецелевые нуклеиновые кислоты в условиях, в которых специфическое связывание является желательным, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo и терапевтического лечения.
«Строгие условия гибридизации» или «жесткие условия» означают условия, при которых олигомерное соединение гибридизуется со своей целевой последовательностью, но с минимальным количеством других последовательностей.
«Субъект» означает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.
«Целевой» относится к белку, модуляция которого является желательной.
«Ген-мишень» означает ген, кодирующий белок-мишень.
«Нацеливание» или «нацеленный» означает процесс конструирования и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать требуемый эффект.
«Целевая нуклеиновая кислота», «целевая РНК» и «целевой РНК транскрипт» и «нуклеиновые кислоты-мишени» означает нуклеиновую кислоту, способную стать мишенью для антисмысловых соединений.
«Область-мишень» означает фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, на который нацелено одно или более антисмысловых соединений.
«Сегмент-мишень» означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено антисмысловое соединение. «5' сайт-мишень» относится к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. «3' сайт-мишень» относится к крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени.
«Терапевтически эффективное количество» означает количество фармацевтического агента, которое обеспечивает терапевтический эффект для индивидуума.
«Лечить» или «лечение», или «терапия» обозначает введение композиции с целью достижения изменения или облегчения заболевания или патологического состояния.
«Немодифицированные нуклеиновые основания» означает пуриновые основания: аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания: тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из природных нуклеиновых оснований, фрагментов сахаров и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой РНК нуклеотид (т.е. β-D-рибонуклеозид) или ДНК нуклеотид (т.е., β-D-дезоксирибонуклеозид).
«Сегмент крыла» означает множество нуклеозидов, модифицированных для придания олигонуклеотиду свойств, таких как усиленная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.
Некоторые варианты реализации изобретения
В некоторых вариантах реализации предложены композиции и способы снижения общей экспрессии мРНК и белка C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации предложены композиции и способы для снижения патоген-ассоциированных вариантом мРНК C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации предложены способы лечения, предупреждения, облегчения или замедления прогрессирования заболеваний, связанных с C9ORF72, у индивидуума, нуждающегося в этом. Предусмотрены также способы получения лекарственного средства для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, связанного с C9ORF72. C9ORF72-ассоциированные заболевания включают нейродегенеративные заболевания. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание может представлять собой ALS или FTD. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание может быть наследственным или спорадическим.
В настоящем описании предложены следующие неограничивающие нумерованные варианты реализации:
Вариант реализации 1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 последовательных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 22-55.
Вариант реализации 2. Соединение по варианту реализации 1, отличающееся тем, что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% комплементарна SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Вариант реализации 3. Соединение по вариантам реализации 1 и 2, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид.
Вариант реализации 4. Соединение по любому из вариантов реализации 1-3, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 5. Соединение по варианту реализации 4, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 6. Соединение по любому из вариантов реализации 4 и 5, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
Вариант реализации 7. Соединение по варианту реализации 5, отличающееся тем, что каждая модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 8. Соединение по любому из вариантов реализации 1-7, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание.
Вариант реализации 9. Соединение по варианту реализации 8, отличающееся тем, что модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.
Вариант реализации 10. Соединение по любому из вариантов реализации 1-9, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.
Вариант реализации 11. Соединение по варианту реализации 10, отличающееся тем, что каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.
Вариант реализации 12. Соединение по вариантам реализации 10 или 11, отличающееся тем, что по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар.
Вариант реализации 13. Соединение по варианту реализации 12, отличающееся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, при этом указанный химический мостик выбран из: 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН2)2-O-2', где R независимо представляет собой Н, C1-С6 алкильный радикал и C1-С6 алкоксильный радикал.
Вариант реализации 14. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой метальный радикал.
Вариант реализации 15. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой Н.
Вариант реализации 16. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой -CH2-О-СН3.
Вариант реализации 17. Соединение по вариантам реализации 10 или 11, отличающееся тем, что по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.
Вариант реализации 18. Соединение по любому из вариантов реализации 1-10 или 12-16, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.
Вариант реализации 19. Соединение по варианту реализации 18, отличающееся тем, что гэпмер представляет собой любой из 3-8-7 МОЕ гэпмера, 3-10-7 МОЕ гэпмера, 4-8-6 МОЕ гэпмера, 4-10-6 МОЕ гэпмера, 6-10-4 МОЕ гэпмера, 6-8-4 МОЕ гэпмера, 7-8-3 МОЕ гэпмера или 7-10-3 МОЕ гэпмера.
Вариант реализации 20. Соединение по п. 5, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит межнуклеозидные связи в любом из следующих паттернов: soossssssssssooooss, sooossssssssssoooss, sooooossssssssssoss, soooooossssssssssss, soooosssssssssooss, sooosssssssssoooss, sooooosssssssssoss, soosssssssssoooss, soooosssssssssoss, sosssssssssooooss или sooooosssssssssss, где,
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
Вариант реализации 19. Композиция, содержащая соединение по любому из предыдущих вариантов реализации или его соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Вариант реализации 20. Композиция по варианту реализации 19, дополнительно содержащая специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72.
Вариант реализации 21. Композиция по варианту реализации 20, отличающаяся тем, что специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 представляет собой антисмысловое соединение.
Вариант реализации 22. Композиция по варианту реализации 21, отличающаяся тем, что антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
Вариант реализации 23. Композиция по варианту реализации 22, отличающаяся тем, что модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
Вариант реализации 24. Композиция по вариантам реализации 22 или 23, отличающаяся тем, что модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% комплементарна антисмысловому транскрипту C9ORF72.
Вариант реализации 25. Композиция по варианту реализации 24, отличающаяся тем, что антисмысловой транскрипт C9ORF72 имеет последовательность нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 18.
Вариант реализации 26. Способ, включающий введение животному соединения или композиции по любому из предыдущих вариантов.
Вариант реализации 27. Способ по варианту реализации 26, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 28. Способ по вариантам реализации 26 и 27, отличающийся тем, что введение соединения обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 29. Способ по варианту реализации 28, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 30. Способ по варианту реализации 28, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS), лобно-височную деменцию (FTD), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD).
Вариант реализации 31. Способ по вариантам реализации 26-30, отличающийся тем, что введение обеспечивает уменьшение ядерных очагов.
Вариант реализации 32. Способ по вариантам реализации 26-31, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 33. Способ по варианту реализации 32, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Вариант реализации 34. Применение соединения или композиции по любому из вариантов реализации 1-33 для производства лекарственного средства для лечения нейродегенеративного расстройства.
Вариант реализации 35. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Figure 00000006
Вариант реализации 36. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Figure 00000007
Вариант реализации 37. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Figure 00000008
Вариант реализации 38. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Figure 00000009
Вариант реализации 39. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Figure 00000010
Вариант реализации 40. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Figure 00000011
Вариант реализации 41. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Figure 00000012
Вариант реализации 42. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Figure 00000013
Вариант реализации 43. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что указанное соединение или композиция может снижать экспрессию мРНК или белка человеческого C9ORF72 у млекопитающего.
Вариант реализации 44. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может облегчать по меньшей мере один симптом бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 45. Соединение или композиция по варианту реализации 44, отличающиеся тем, что симптом ALS представляет собой любой из двигательного дефекта, тревожного расстройства и денервации.
Вариант реализации 46. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может вызывать отсрочку прогрессирования заболевания.
Вариант реализации 47. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может увеличивать продолжительность жизни.
Вариант реализации 48. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может уменьшать продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 49. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может селективно снижать патоген-ассоциированные варианты мРНК C9ORF72.
Вариант реализации 50. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может сокращать ядерные очаги.
Вариант реализации 51. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Figure 00000014
Вариант реализации 52. Способ, включающий введение животному соединения по варианту реализации 51.
Вариант реализации 53. Способ по варианту реализации 52, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 54. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает ингибирование C9ORF72.
Вариант реализации 55. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 56. Способ по варианту реализации 55, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 57. Способ по варианту реализации 55, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой любое из бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 58. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает сокращение ядерных очагов.
Вариант реализации 59. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 60. Способ по варианту реализации 59, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Вариант реализации 61. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Figure 00000015
Вариант реализации 62. Способ, включающий введение животному композиции по варианту реализации 60.
Вариант реализации 63. Способ по варианту реализации 62, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 64. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает ингибирование C9ORF72.
Вариант реализации 65. Способ по варианту реализации 62, отличающийся тем, что введение обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 66. Способ по варианту реализации 65, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 67. Способ по варианту реализации 65, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой любое из бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 68. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает сокращение ядерных очагов.
Вариант реализации 69. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 70. Способ по варианту реализации 69, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть «антисмысловым» к нуклеиновой кислоте-мишени, что означает, что оно способно подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородного связывания.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую она нацелена. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая при написании в 5'-3' направлении, содержит обратный комплемент целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую она нацелена.
В некоторых вариантах реализации изобретения длина антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, составляет 12-30 субъединиц. Другими словами, длина таких антисмысловых соединений составляет 12-30 связанных субъединиц. В других вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит 8-80,12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных субъединиц. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения имеют 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц в длину или количество в диапазоне, определенном любыми двумя из указанных выше значений. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, и связанными субъединицами являются нуклеозиды.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, могут быть укороченными или усеченными. Например, одна субъединица может быть удалена с 5' конца (5' усечение), или же с 3' конца (3' усечение). В укороченном или усеченном антисмысловом соединении, нацеленном на нуклеиновую кислоту C9ORF72, две субъединицы могут быть удалены на 5' конце или, в качестве альтернативы, две субъединицы могут быть удалены на 3' конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте удаленные нуклеозиды могут быть рассеяны по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении с одним нуклеозидом, удаленным с 5' конца, и одним нуклеозидом, удаленным с 3' конца.
Если в удлиненном антисмысловом соединении присутствует одна дополнительная субъединица, то дополнительная субъединица может быть расположена на 5' или 3' конце антисмыслового соединения. При наличии двух или более дополнительных субъединиц, добавленные субъединицы могут быть расположены рядом друг с другом, например, в антисмысловом соединении, имеющем две субъединицы, добавленные на 5' конце (5' присоединение) или, в альтернативном варианте, на 3' конце (3' присоединение). В альтернативном варианте присоединенные субъединицы могут быть рассеяны по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, имеющем одну субъединицу, присоединенную к 5' концу, и одну субъединицу, присоединенную к 3' концу.
Длина антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, может быть увеличена или уменьшена, и/или могут быть введены некомплементарные основания без потери активности. Например, в Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) ряд антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований был испытан на предмет способности индуцировать расщепление целевой РНК в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеиновых оснований с 8 или 11 некомплементарными основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфическое расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержали никаких несоответствий. Аналогичным образом целевое специфическое расщепление было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13 нуклеиновых оснований, включая те, которые имели 1 или 3 несоответствия.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, обладающего 100% комплементарностью мРНК bcl-2 и содержащего 3 рассогласованных основания по отношению к мРНК bcl-xL, уменьшать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, данный олигонуклеотид продемонстрировал высокую противоопухолевую активность in vivo.
Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) провели испытания серии тандемов антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеиновых оснований и антисмысловых олигонуклеотидов из 28 и 42 нуклеиновых оснований, состоящих из последовательности двух или трех тандемов антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность к блокированию трансляции ДГФР человека в анализе на ретикулоцитах кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований по отдельности мог воспрепятствовать трансляции, хотя на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеиновых основания.
Мотивы антисмысловых соединений
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для обеспечения таких свойств антисмысловых соединений, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к расщеплению нуклеазами in vivo.
Как правило, химерные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к разложению под действием нуклеаз, усиленное клеточное поглощение, повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой, и/или повышенную ингибирующую активность. Второй химерный участок антисмыслового соединения может дополнительно служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая отщепляет нить РНК в дуплексе РНК:ДНК.
Антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, представляют собой химерные антисмысловые соединения. В гэпмере внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, химически отличающихся от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, сегмент гэпа, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегменты крыльев содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения области гэпмера различаются по типам фрагментов сахаров в составе каждой отдельной области. Типы фрагментов сахаров, которые используют для дифференциации областей гэпмера, в некоторых вариантах реализации могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать, среди прочего, 2'-МОЕ и 2'-O-СН3) и модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды (такие модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды могут включать те, которые имеют мостик 4'-(СН2)n-O-2', где n=1 или n=2, и 4'-СН2-O-СН2-2'). Предпочтительно, каждая отдельная область содержит одинаковые фрагменты сахаров. Мотив крыло-гэп-крыло часто описывают как «Х-Y-Z», в котором «X» представляет длину области 5' крыла, «Y» представляет длину гэпа, и «Z» представляет длину области У крыла. В данном контексте гэпмер, описанный как «Х-Y-Z», имеет такую конфигурацию, что сегмент гэп расположен непосредственно примыкающим к каждому из сегмента 5' крыла и сегмента 3' крыла. Таким образом, отсутствуют промежуточные нуклеотиды между сегментом 5' крыла и сегментом гэп или сегментом гэп и сегментом У крыла. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения X и Z являются одинаковыми; в других вариантах реализации изобретения они являются различными. В предпочтительном варианте реализации изобретения длина Y составляет от 8 до 15 нуклеотидов. X, Y или Z могут составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, гэпмеры, описанные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, например, 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4 или 4-7-4.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит мотив «вингмера», который имеет конфигурацию крыло-гэп или гэп-крыло, т.е. конфигурацию X-Y или Y-Z, как описано выше для конфигурации гэпмера. Таким образом, конфигурации вингмера, описанные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 или 6-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат гэпмерный мотив 5-10-5.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат гэпмерный мотив 5-8-5.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат сахарные модификации в любом из следующих паттернов: eeekkdddddddkkeee, eekkddddddddkkeee, ekddddddddekekeee, kekeddddddddekeke и ekekddddddddkekee; где
e=2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,
d=2'-дезоксинуклеозид, и
k=cEt нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержит суженный гэп-мотив. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид с суженным гэп, нацеленный на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержит сегмент гэп из 9, 8, 7 или 6 2'-дезоксинуклеотидов, расположенных непосредственно рядом и между сегментами крыльев из 5, 4, 3, 2 или 1 химически модифицированного нуклеозида. В некоторых вариантах реализации химическая модификация включает бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации бициклический сахар содержит мостик от 4' к 2', выбранный из: мостика 4'-(СН2)n-O-2', где n равен 1 или 2; и 4'-СН2-O-СН2-2'. В некоторых вариантах реализации бициклический сахар содержит мостик 4'-СН(СН3)-O-2'. В некоторых вариантах реализации химическая модификация включает не бициклический 2'-модифицированный фрагмент сахара. В некоторых вариантах реализации не бициклический 2'-модифицированный фрагмент сахара содержит 2'-O-метоксиэтильную группу или 2'-O-метильную группу.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности
Нуклеотидные последовательности, которые кодируют C9ORF72 включают, без ограничения, следующие: комплемент номера доступа GENBANKNM_001256054.1 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO: 1), комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеиновым основаниям с 27535000 по 27565000 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO: 2), номер доступа GENBANKBQ068108.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 3), номер доступа GENBANKNM_018325.3 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 4), номер доступа GENBANKDN993522.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 5), номер доступа GENBANKNM_145005.5 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 6), номер доступа GENBANKDB079375.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 7), номер доступа GENBANKBU194591.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 8), идентификатор последовательности 4141_014_А (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 9) и 4008_73_А (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 10) и номер доступа GENBANKNW_001101662.1, усеченная по нуклеозидам с 8522000 по 8552000 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 11).
Следует понимать, что последовательность, изложенная в каждой SEQ ID NO в примерах, содержащихся в данном документе, является независимой от любой модификации фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Следовательно, антисмысловое соединение, определяемое по SEQ ID NO, может независимо содержать одну или более модификаций фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описанные по номеру Isis (Isis №), указывают сочетание последовательности нуклеиновых оснований и мотива.
В некоторых вариантах реализации изобретения целевая область представляет собой структурно определенную область нуклеиновой кислоты-мишени. Например, целевая область может содержать 3' нетранслируемую область, 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, экзон-интронное сочленение, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для C9ORF72 могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена в данное описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации целевая область может охватывать последовательность от 5' сайта-мишени одного целевого сегмента в пределах области-мишени до 3' сайта-мишени другого целевого сегмента в пределах той же области-мишени.
Нацеливание включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизуется антисмысловое соединение, например, для достижения желаемого эффекта. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипическое изменение, связанное с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Область-мишень может содержать один или более сегментов-мишеней. Множество сегментов-мишеней в области-мишени могут быть перекрывающимися. В альтернативном варианте они могут быть не перекрывающимися. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах реализации целевые сегменты в пределах области-мишени разделены числом нуклеотидов, равным, равным около, не более чем, не более чем около 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидами в нуклеиновой кислоте-мишени, или находится в пределах, определяемых любыми двумя из предшествующих значений. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем или не более чем около 5 нуклеотидами в нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени являются смежными. Предусмотрены области-мишени, определенные диапазоном, имеющим стартовую нуклеиновую кислоту, которая представляет собой любую из 5' сайта-мишени или 3' сайта-мишени, перечисленных в настоящем документе.
Подходящие сегменты-мишени могут быть расположены в пределах 5' UTR, кодирующей области, 3' UTR, интрона, экзона или соединения экзон/интрон. Сегменты-мишени, содержащие старт-кодон или стоп-кодон, также представляют собой подходящие сегменты-мишени. Подходящий целевой сегмент может специфически исключать некоторые структурно определенные области, такие как старт-кодон или стоп-кодон.
Определение пригодных сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в геноме. Например, для идентификации областей сходства среди различных нуклеиновых кислот может быть использован алгоритм BLAST. Такое сравнение может предотвратить отбор последовательностей антисмыслового соединения, которые способны гибридизоваться неспецифическим образом с последовательностями, отличными от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. нецелевыми или побочными последовательностями).
Могут быть вариации в активности (например, определенной по процентному снижению уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений внутри целевой области. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней мРНК C9ORF72 является индикатором ингибирования экспрессии C9ORF72. Снижение уровней белка C9ORF72 также указывает на подавление экспрессии мРНК-мишени. Уменьшение наличия очагов РНК с расширенным C9ORF72 является показателем ингибирования экспрессии C9ORF72. Кроме того, на ингибирование экспрессии C9ORF72 указывают фенотипические изменения. Например, улучшение двигательной функции и дыхания может быть показателем ингибирования экспрессии C9ORF72.
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в настоящем документе, и нуклеиновой кислотой C9ORF72. Наиболее общий механизм гибридизации включает участие водородной связи (например, уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское образование водородной связи) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и определяются природой и составом гибридизуемых молекул нуклеиновых кислот.
Способы определения того, является ли последовательность специфически гибридизуемой с целевой нуклеиновой кислотой, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, являются специфически гибридизуемыми с нуклеиновой кислотой C9ORF72.
Комплементарность
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу, если достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом, что будет достигаться желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72).
Некомплементарные нуклеиновые основания между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой C9ORF72 могут быть допустимыми при условии, что антисмысловое соединение сохраняет способность специфично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизоваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты C9ORF72 таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлевая структура, рассогласование или структура шпильки).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, представленные в настоящем изобретении, или определенные их части, являются или по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% комплементарны к нуклеиновой кислоте C9ORF72, области-мишени, сегменту-мишени или определенной ее части. Процент комплементарности антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен с применением стандартных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения являются комплементарными к области-мишени, и поэтому будут специфически гибридизоваться, будут имеет 90 процентов комплементарности. В данном примере оставшиеся некомплементарные нуклеиновые основания могут быть расположены кластерно или вперемешку с комплементарными нуклеиновыми основаниями и не обязаны быть смежными друг с другом или комплементарными нуклеиновыми основаниям. Таким образом, антисмысловое соединение, длина которого составляет 18 нуклеиновых оснований, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеиновых основания, фланкированных двумя областями полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, обладает общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью 77,8%, и таким образом, входит в границы объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен с помощью программ BLAST (поисковые инструменты для основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность или комплементарность последовательностей, могут быть определены, например, программой Gap (висконсинский пакет анализа последовательностей, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, Висконсинский Университет, Мэдисон штат Висконсин), используя настройки по умолчанию, которые используют алгоритм Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем документе, или их определенные части полностью комплементарны (т.е. на 100% комплементарны) нуклеиновой кислоте-мишени или определенной ее части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарно нуклеиновой кислоте C9ORF72 или ее области-мишени, или ее сегменту-мишени, или ее последовательности-мишени. В данном контексте «полностью комплементарный» означает, что каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения способно точно спариваться с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение длиной 20 нуклеиновых оснований является полностью комплементарным к последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеиновых оснований при условии, что в нуклеиновой кислоте-мишени присутствует соответствующая часть длиной 20 нуклеиновых оснований, которая является полностью комплементарной к антисмысловому соединению. Полностью комплементарный может также использоваться в отношении определенной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть длиной 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеиновых оснований может быть «полностью комплементарной» к последовательности-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Часть длиной 20 нуклеиновых оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарна к последовательности-мишени, если последовательность-мишень содержит соответствующую часть длиной 20 нуклеиновых оснований, причем каждое нуклеиновое основание комплементарно к части антисмыслового соединения длиной 20 нуклеиновых оснований. В то же время, полноразмерное антисмысловое соединение длиной 30 нуклеиновых оснований может быть или не быть полностью комплементарным к последовательности-мишени, в зависимости от того, будут ли остальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения также комплементарными к последовательности-мишени.
Некомплементарное нуклеиновое основание может располагаться на 5' конце или 3' конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте некомплементарное нуклеиновое основание или нуклеиновые основания могут быть внутри антисмыслового соединения. При наличии двух или более некомплементарных нуклеиновых оснований, они могут быть смежными (т.е. связанными) или не смежными. В одном варианте реализации изобретения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла гэпмера антисмыслового олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(-ий) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной части.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(-ий) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной части.
Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, включают также те, которые являются комплементарными части нуклеиновой кислоты-мишени. В данном контексте «часть» относится к некоторому количеству смежных (т.е., связанных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. «Часть» также может относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 8 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 9 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 10 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 11 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 13 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 14 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 15 нуклеиновых оснований. Также предусмотрены антисмысловые соединения, которые комплементарны части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или с длиной в интервале, определенном любыми двумя из этих значений.
Идентичность
Антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, также могут иметь определенный процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO, или соединению, представленному конкретным номером Isis, или его части. В данном контексте антисмысловое соединение идентично последовательности, описанной в данном документе, если оно обладает такой же способностью к спариванию с нуклеиновыми основаниями. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, считалась бы идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанных в данном документе, а также соединения, содержащие неидентичные основания относительно антисмысловых соединений, представленных в данном документе. Неидентичные основания могут быть смежными по отношению друг к другу или рассеянными по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения вычисляют согласно количеству оснований с идентичным спариванием оснований относительно последовательности, с которой его сравнивают.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или их части являются по меньшей на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными одному или более антисмысловым соединениям или SEQ ID NO, или их частей, описанных в данном документе.
В некоторых вариантах реализации фрагмент антисмыслового соединения сравнивают с равной по длине части нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых вариантах реализации часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Нуклеиновое основание (также известное как основание) - часть нуклеозида, обычно представляющая собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильной группой сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах структуры олигонуклеотида, фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замены или модификации межнуклеозидных связей, фрагментов сахаров или нуклеиновых оснований. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую предпочтительны по сравнению с нативными формами за счет желаемых свойств, таких как, например, улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для повышения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с помощью более коротких антисмысловых соединений, которые имеют такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3'-5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, т.е., неприродных межнуклеозидных связей, часто предпочтительны по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими природные межнуклеозидные связи, благодаря желательным свойствам, например, таких как улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная устойчивость в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и тиофосфаты. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей являются хорошо известными.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации модифицированные межнуклеозидные связи рассеяны по всему антисмысловому соединению. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой тиофосфатные связи. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь и по меньшей мере одну тиофосфатную связь.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат межнуклеозидные связи в любом из следующих паттернов: soooossssssssssooss, sooosssssssssooss, soosssssssssooss и sosssssssssoooss; где
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
Модифицированные фрагменты сахаров
Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению необязательно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениями повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, не ограничиваясь ими, добавление групп заместителей (включая 5' и 2' группы заместителей, соединение мостиком негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БНК), замену атома кислорода в рибозильном кольце на S, N(R) или C(R1)(R2) (R, R1 и R2, каждый независимо, представляют собой Н, С1-С1 алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где представлены другие описанные 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды) или замену атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года), или в альтернативном варианте с 5'-замещением БНК (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где ЗНК замещена, например, 5'-метальной или 5'-винильной группой).
Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные фрагменты сахаров, включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие 5'-винильные, 5'-метильные (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН3, 2'-ОСН2СН3, 2'-OCH2CH2F и 2'-О(СН2)2ОСН3 группы заместителей. Заместитель в 2' положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, О-аллила, O-C1-С10 алкила, OCF3, OCH2F, O(СН2)2SCH3, О(СН2)2-O-N(Rm)(Rn), О-СН2-C(=О)-N(Rm)(Rn) и O-СН2-C(=O)-N(R1)-(СН2)2-N(Rm)(Rn), где каждый R1, Rm и Rn независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C1-C10 алкил.
В данном контексте «бициклические нуклеозиды» относятся к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический фрагмент сахара. Примеры бициклических нуклеиновых кислот (БНК) включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие мостик между 4' и 2' атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, содержат один или более БНК нуклеозидов, при этом мостик содержит одну из формул: 4'-(СН2)-O-2' (ЗНК); 4'-(СН2)-S-2'; 4'-(СН2)2-O-2' (ЭНК); 4'-СН(СН3)-O-2' и 4'-СН(СН2ОСН3)-O-2' (и их аналоги, см. патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН3)(СН3)-O-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/068922, опубликованную как WO 2009/006478 8 января 2009 года); 4'-СН2-N(OCH3)-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/064591, опубликованную как WO/2008/150729 11 декабря 2008 года); 4'-СН2-O-N(CH3)-2' (см. опубликованную заявку на патент США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-СН2-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, С1-С1 алкил или защитную группу (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-СН2-С(Н)(СН3)-2' (см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН2-C(=СН2)-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/066154, опубликованную как WO 2008/154401 8 декабря 2008 года).
Дополнительные бициклические нуклеозиды описаны в опубликованной литературе (см., например: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; патенты США №: 7399845; 7053207; 7034133; 6794499; 6770748; 6670461; 6525191; 6268490; публикации патентов США №: US2008-0039618; US 2007-0287831; US 2004-0171570; заявки на патент США, серийные номера: 12/129154; 61/099844; 61/097787; 61/086231; 61/056564; 61/026998; 61/026995; 60/989574; международные заявки WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; и международные заявки РСТ №: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; и PCT/US2008/064591). Каждый из указанных бициклических нуклеозидов может быть получен с одной или более стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку РСТ PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).
В данном контексте «моноциклические нуклеозиды» относятся к нуклеозидам, содержащим модифицированные фрагменты сахаров, которые не являются бициклическими фрагментами сахаров. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент сахара или аналог фрагмента сахара нуклеозида может быть модифицирован или замещен в любом положении.
В данном контексте «4'-2' бициклический нуклеозид» или «4' к 2' бициклический нуклеозид» относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода фуранозного кольца, соединяющий 2' атом углерода и 4' атом углерода сахарного кольца.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические фрагменты сахаров нуклеозидов БНК включают, но не ограничиваются ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4' и 2' атомами углерода пентофуранозильного фрагмента сахара, включая, без ограничения, мостики, содержащие 1 или от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из-[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=О)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=О)x- и -N(Ra)-; где: x равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый Ra и Rb независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C1-C12 алкил, замещенный С1-С1 алкил, С2-С12 алкенил, замещенный С2-С12 алкенил, С2-С12 алкинил, замещенный С2-С12 алкинил, С5-С20 арил, замещенный С5-С20 арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7 алициклический радикал, замещенный С5-С7 алициклический радикал, галоген, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=О)2-J1) или сульфоксил (S(=О)-J1); и
каждый J1 и J2 независимо представляет собой Н, С1-С12 алкил, замещенный С1-С12 алкил, С2-С12 алкенил, замещенный С2-С12 алкенил, С2-С12 алкинил, замещенный С2-С12 алкинил, С5-С20 арил, замещенный С5-С20 арил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С1-С12 аминоалкил, замещенный С1-С12 аминоалкил или защитную группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения мостик бициклического фрагмента сахара представляет собой -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- или -C(RaRb)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации изобретения мостик представляет собой 4'-СН2-2', 4'-(СН2)2-2', 4'-(СН2)3-2', 4'-СН2-O-2', 4'-(СН2)2-O-2', 4'-СН2-O-N(R)-2' и 4'-СН2-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или С1-С12 алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-(СН2)-O-2', может быть в α-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее α-L-метиленокси β'-СН2-O-2') БНК были внедрены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают нуклеозиды, имеющие 4'-2' мостик, где такие мостики включают, без ограничения, α-L-4'-(СН2)-O-2', β-D-4'-СН2-O-2', 4'-(СН2)2-O-2', 4'-СН2-O-N(R)-2', 4'-СН2-N(R)-O-2', 4'-СН(СН3)-O-2', 4'-СН2-S-2', 4'-СН2-N(R)-2', 4'-СН2-СН(СН3)-2' и 4'-(СН2)3-2', где R представляет собой Н, защитную группу или С1-С12 алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000016
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
-Qa-Qb-Qc- представляет собой -СН2-N(Rc)-СН2-, -C(=O)-N(Rc)-СН2-, -СН2-O-N(Rc)-, -СН2-N(Rc)-O- или -N(Rc)-O-СН2;
Rc представляет собой C1-C12 алкил или аминозащитную группу; и
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000017
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
Za представляет собой C1-С6 алкил, С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил, замещенный C1-С6 алкил, замещенный С2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тиол.
В одном варианте реализации изобретения каждая из замещенных групп независимо является моно или полизамещенной группами заместителей, выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc и NJeC(=X)NJcJd, где каждый Jc, Jd и Je независимо представляет собой Н, C1-С6 алкил или замещенный C1-С6 алкил, и X представляет собой О или NJc.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000018
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
Zb представляет собой C1-С6 алкил, С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил, замещенный C1-С6 алкил, замещенный С2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000019
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
Rd представляет собой C1-С6 алкил, замещенный C1-С6 алкил, С2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил или замещенный С2-С6 алкинил;
каждый qa, qb, qc и qd независимо представляет собой Н, галоген, C1-С6 алкил, замещенный C1-С6 алкил, С2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил или замещенный С2-С6 алкинил, C1-С6 алкоксил, замещенный C1-С6 алкоксил, ацил, замещенный ацил, C1-С6 аминоалкил или замещенный C1-С6 аминоалкил;
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000020
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
qa, qb, qe и qf, каждый независимо, представляют собой водород, галоген, С1-C12 алкил, замещенный С1-С12 алкил, С2-С12 алкенил, замещенный С2-С12 алкенил, С2-С12 алкинил, замещенный С2-С12 алкинил, С1-С12 алкокси, замещенный С1-С12 алкокси, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk или N(H)C(=S)NJjJk;
или qe и qf вместе представляют собой =C(qg)(qh);
qg и qh, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С1-С12 алкил или замещенный С1-С12 алкил.
Описаны синтез и получение бициклических нуклеозидов аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила, имеющих мостик 4'-СН2-O-2', а также их олигомеризация и свойства распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Описан также синтез бициклических нуклеозидов в WO 98/39352 и WO 99/14226.
Были также получены аналоги различных бициклических нуклеозидов, которые имеют 4'-2' мостиковые группы, такие как 4'-СН2-O-2' и 4'-СН2-S-2' (Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Описано также получение
олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов, содержащих бициклические нуклеозиды, для применения в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники описан синтез 2'-амино-БНК, нового конформационно ограниченного высокоаффинного аналога олигонуклеотида (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были получены 2'-амино- и 2'-метиленамино БНК, и была описана термостабильность их дуплексов с комплементарными нитями РНК и ДНК.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
Figure 00000021
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Та и Tb, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
каждый qi, qj, qk и ql независимо представляет собой Н, галоген, С1-С12 алкил, замещенный С1-С12 алкил, С2-С12 алкенил, замещенный С2-С12 алкенил, С2-С12 алкинил, замещенный С2-С12 алкинил, С1-С12 алкоксил, замещенный С1-С12 алкоксил, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk или N(H)C(=S)NJjJk; и
qi и qj или ql и qk вместе представляют собой =C(qg)(qh), где qg и qh, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С1-С12 алкил или замещенный С1-С12 алкил.
Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий мостик 4'-(СН2)3-2', и мостик из аналога алкенила 4'-СН=СН-СН2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-СН2-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН2-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(СН2)2-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-СН2-O-N(R)-2') БНК, (Е) оксиамино (4'-СН2-N(R)-O-2') БНК, (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН3)-O-2') БНК (также называемый стерически затрудненным этилом или cEt), (G) метилентио (4'-СН2-S-2') БНК, (Н) метиленамино (4'-СН2-N(R)-2') БНК, (I) метилкарбоциклическую (4'-СН2-СН(СН3)-2') БНК, (J) пропиленкарбоциклическую (4'-(СН2)3-2') БНК и (K) винил-БНК, как показано ниже.
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
где Вх представляет собой фрагмент основания, а R независимо представляет собой Н, защитную группу, C1-С6 алкил или C1-С6 алкокси.
В данном контексте термин «модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид» или «модифицированный ТГП нуклеозид» означает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый «сахар», заменивший пентофуранозильный остаток в обычных нуклеозидах, и он может быть упомянут как заменитель сахара. ТГП-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, те, которые в данной области техники называют гекситоловой нуклеиновой кислотой (ГНК), анитоловой нуклеиновой кислотой (АНК), манитоловой нуклеиновой кислотой (МНК) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) или фтор-ГНК (F-ГНК), имеющие тетрагидропирановую кольцевую систему, как показано ниже.
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
В некоторых вариантах реализации выбраны заменители сахара, имеющие формулу:
Figure 00000028
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Т3 и Т4, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением, или один из Т3 и Т4 представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением или олигонуклеотидом, а другой из Т3 и Т4 представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5' или 3'-концевую группу;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7, каждый независимо, представляют собой Н, C1-С6 алкил, замещенный C1-С6 алкил, С2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил или замещенный С2-С6 алкинил; и
один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой выбран из галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=Х)NJ1J2 и CN, где X представляет собой О, S или NJ1, и каждый J1, J2 и J3 независимо представляет собой Н или C1-С6 алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждый q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 отличен от H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены ТГП нуклеозиды, в которых один из R1 и R2 представляет собой F. В некоторых вариантах реализации изобретения R1 представляет собой фтор, a R2 представляет собой Н; R1 представляет собой метокси, a R2 представляет собой Н, и R1 представляет собой метоксиэтокси, a R2 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения заменители сахара содержат кольца, имеющие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, описаны нуклеозиды, содержащие морфолинофрагменты сахаров, и их применение в олигомерных соединениях (см., например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444; и 5034506). В данном контексте термин «морфолино» означает заменитель сахара, имеющий следующую формулу:
Figure 00000029
В некоторых вариантах реализации изобретения морфолиновые фрагменты могут быть модифицированными, например, введением или модификацией различных заместителей, по сравнению с упомянутой выше структурой морфолино. Такие заменители сахара в данном контексте называют «модифицированными морфолино».
Предложены также комбинации модификаций, без ограничения, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны другие 5', 2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замену рибозильного кольцевого атома кислорода на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или в альтернативном варианте с 5'-замещением бициклической нуклеиновой кислоты (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где 4'-СН2-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5' положении 5'-метальной или 5'-винильной группой). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозиды, имеющие шестичленный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка в природных нуклеозидах. Модифицированные циклогексенильные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды, описанные в данной области техники (см., например, параллельную опубликованную заявку РСТ WO 2010/036696, опубликованную 10 апреля, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008,130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al, Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; опубликованную заявку РСТ WO 06/047842; и опубликованную заявку РСТ WO 01/049687; полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют формулу X.
Figure 00000030
где независимо для каждого указанного по меньшей мере одного циклогексенильного нуклеозидного аналога формулы X:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
Т3 и Т4, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает циклогексенильный нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т3 и Т4 представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т3 и Т4 представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5'-или 3'-концевую группу; и
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 и q9, каждый независимо, представляют собой Н, C1-С6 алкил, замещенный C1-С6 алкил, C2-С6 алкенил, замещенный С2-С6 алкенил, С2-С6 алкинил, замещенный С2-С6 алкинил или другие группы-заместители сахара.
В данной области техники известны также многие другие моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы, и они подходят в качестве заменителей сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в олигомерные соединения, предложенные в данном документе (см., например, обзорную статью: Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002,10, 841-854). Такие кольцевые системы могут быть подвергнуты различным дополнительным замещениям для дополнительного повышения их активности.
В данном контексте «2'-модифицированный сахар» означает фуранозильный сахар, модифицированный в 2' положении. В некоторых вариантах реализации изобретения такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенидов, включая, но не ограничиваясь ими, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах реализации изобретения 2' модификации выбраны из заместителей, включающих, но не ограничиваясь ими: O[(СН2)nO]mCH3, O(СН2)nNH2, O(СН2)nCH3, O(СН2)nF, 0(СН2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 и О(СН2)nON(СН2)nCH3]2, где n и m равны от 1 до около 10. Другие 2' группы заместителей также могут быть выбраны из: С1-С12 алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила или О-аралкила, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, РНК расщепляющей группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и других заместителей с подобными свойствами. В некоторых вариантах реализации модифицированные нуклеозиды содержат 2'-МОЕ боковую цепь (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такие 2'-MOE замещения описаны как улучшающие аффинность связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'- O-метил, О-пропил и О-аминопропил. Было показано, что олигонуклеотиды, имеющие 2'-МОЕ заместитель, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными возможностями для применения in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
В данном контексте «2'-модифицированный» или «2'-замещенный» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий заместитель в 2' положении, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два атом углерода сахарного кольца, соединяет 2' атом углерода и другой атом углерода сахарного кольца; и
нуклеозиды с немостиковыми 2' заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-C1-C10 алкил, -OCF3, О-(СН2)2-O-СН3, 2'-О(СН2)2SCH3, О-(СН2)2-O-N(Rm)(Rn), or О-СН2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C1-С10 алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут также содержать другие модификации, например в других позициях сахара и/или нуклеинового основания.
В данном контексте «2'-F» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу фтора в 2' положении сахарного кольца.
В данном контексте «2'-ОМе» или «2'-ОСН3», «2'-O-метил» или «2'-метокси» относятся к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСН3 в 2' положении сахарного кольца.
В данном контексте «МОЕ» или «2'-МОЕ», или «2'-OCH2CH2OCH3», или «2'-O-метоксиэтил» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСН2СН2ОСН3 в 2' положении сахарного кольца.
Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области техники. Некоторые иллюстративные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, без ограничения, патенты США: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5670633; 5700920; 5792847 и 6600032 и международную заявку PCT/US 2005/019219, поданную 2 июня 2005 года и опубликованную как WO 2005/121371 22 декабря 2005 года, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.
В данном контексте «олигонуклеотид» относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
В нуклеотидах, имеющих модифицированные фрагменты сахаров, фрагменты нуклеиновых оснований (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняются для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, имеющих модифицированные фрагменты сахаров. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный фрагмент сахара представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации 2'-МОЕ модифицированные нуклеозиды расположены в гэпмерном мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный фрагмент сахара представляет собой бициклический нуклеозид, имеющий мостиковую группу (4'-СН(СН3)-O-2'). В некоторых вариантах реализации изобретения (4'-СН(СН3)-O-2') модифицированные нуклеозиды расположены в крыльях гэпмерного мотива.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от множества критериев, включая, но не ограничиваясь ими, способ введения, тяжесть заболевания или дозу, подлежащую введению.
Антисмысловое соединение, к нуклеиновой кислоте C9ORF72, могут быть использованы в фармацевтических композициях путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). PBS представляет собой разбавитель, подходящий для применения в композициях, доставляемых парентерально. Соответственно, в одном из вариантов реализации в способах, описанных в настоящем документе, используют фармацевтическую композицию, содержащую антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, который, при введении животному, включая человека, способен обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и к другим биоэквивалентам. Пригодные фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.
Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов с одного или обоих концов антисмыслового соединения, которые расщепляются в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового соединения.
Сопряженные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или более фрагментом или конъюгатом, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные сопряженные группы включают фрагменты холестерина и липидные фрагменты. Дополнительные сопряженные группы включают сахара, фосфолипиды, биотин, феназин, соль фолиевой кислоты, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины, и красители.
Антисмысловые соединения могут также быть модифицированными, чтобы иметь одну или более стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или обоим концам антисмысловых соединений для улучшения свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэпирующие структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение с концевой нуклеиновой кислотой от разрушения под действием экзонуклеаз и могут способствовать доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может быть расположен на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может находиться на обоих концах. Кэпирующие структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, инвертированные дезокси кэпы с удаленными нуклеиновыми основаниями. Дополнительные 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения для придания устойчивости к нуклеазам, включают группы, описанные в WO 03/004602 опубликованном 16 января 2003 года.
Клеточная культура и лечение антисмысловыми соединениями
Влияние антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот C9ORF72 может быть испытано in vitro на различных типах клеток. Различные типы клеток, используемые для таких анализов, имеются в продаже у коммерческих поставщиков (например, Американская коллекция типов культур (АТСС), Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, штат Северная Каролина; Clonetics Corporation, Уолкерсвиль, штат Мэриленд) и культивируются согласно инструкциям производителей с применением коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния). Иллюстративные клеточные типы включают, но не ограничиваются ими, клетки HepG2, клетки Нер3В, и первичные гепатоциты.
Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro
В данном документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
В целом, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают приблизительно 60-80% конфлуентности в культуре.
Реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает катионный липидный трансфекционный реагент Липофектин (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN в OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния), чтобы достичь желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает Липофектамин (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE в среде OPTI-MEM 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другая технология, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами стандартными способами. Клетки обычно собирают через 16-24 часов после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, после чего уровни РНК или белков нуклеиновых кислот-мишеней измеряют методами, известными в данной области техники и описанными в настоящем документе. Как правило, если обработку проводят в нескольких повторениях, данные представляют как среднее значение для многократных обработок.
Концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьирует от одной линии клеток к другой. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной клеточной линии хорошо известны в данной области техники. Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ, при трансфекции с использованием LIPOFECTAMINE. Антисмысловые олигонуклеотиды используют в более высоких концентрациях в диапазоне от 625 до 20000 нМ при трансфекции с использованием электропорации.
Выделение РНК
Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. РНК получают с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) по рекомендуемым протоколам производителя.
Анализ ингибирования целевых уровней или экспрессии
Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72 может быть проанализировано различными способами, известными в данной области техники. Например, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть количественно определены, например, нозерн-блоттингом, конкурентной полимеразной цепной реакцией (ПНР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. Нозерн-блоттинг также является общепринятым в данной области техники. Количественная ПЦР в реальном времени может быть удобно выполнена с помощью имеющихся в продаже систем обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700, или 7900 производства компании PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, и используемых в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ уровней РНК мишени методом количественной ПЦР в реальном времени
Количественное определение уровней целевой РНК может быть проведено путем количественной ПЦР в реальном времени с использованием систем обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Способы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.
Перед проведением ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), которая производит комплементарную ДНК (кДНК), в дальнейшем используемую в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени выполняются последовательно в одной и той же ячейке с образцом. Реагенты для ОТ и ПЦР в реальном времени приобретали у компании Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени проводят способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Количества гена-мишени (или РНК), полученные путем ПЦР в реальном времени, нормализуют с использованием либо уровня экспрессии гена, экспрессия которого постоянна, такого как циклофилин А, или на основе количественной оценки суммарной РНК с использованием реагента RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Карлсбад, штат Калифорния). Экспрессию циклофилина А определяют количественно с помощью ПЦР в реальном времени, проводя ее одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Общую РНК количественно определяют с помощью реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Юджин, штат Орегон). Способы количественного определения РНК с использованием RIBOGREEN изложены в in Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN используют прибор CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).
Зонды и праймеры конструируют для гибридизации с нуклеиновой кислотой C9ORF72. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники, и могут включать использование программного обеспечения, такого как PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния).
Анализ уровней белка
Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот C9ORF72 может быть оценено путем измерения уровней белка C9ORF72. Уровни белка C9ORF72 могут быть оценены или количественно измерены различными способами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг), иммуноферментный анализ (ELISA), количественный анализ белка, анализ активности белка (например, анализ активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Антитела, нацеленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Бирмингем, штат Мичиган) или могут быть получены традиционными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области техники. Антитела, пригодные для обнаружения C9ORF72 мышей, крыс, обезьян и человека, являются коммерчески доступными.
Тестирование антисмысловых соединений in vivo
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, испытывали на животных с целью оценки их способности ингибировать экспрессию C9ORF72 и производить фенотипические изменения, такие как улучшение двигательной функции и дыхания. В некоторых вариантах реализации двигательную функцию измеряли посредством оценки способности удерживания на вращающемся барабане, прочности сжатия, залезания на шест, теста «открытое поле», балансировки на бревне, анализа отпечатков задних лап у животного. В некоторых вариантах реализации дыхание измеряли с помощью общего плетизмографа, измерений сопротивления инвазии и податливости у животного. Тестирование быть проведено на здоровых животных или в экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным антисмысловые олигонуклеотиды составляли в композицию с фармацевтически приемлемым разбавителем, таким как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или искусственная спинномозговая жидкость (aCSF). Введение включает парентеральные способы введения, такие как интраперитонеальный, внутривенный и подкожный, а также центральные способы введения, такие как интрацеребровентрикулярный или интратекальный. Расчет дозы и частоты введения антисмыслового олигонуклеотида известен специалистам в данной области техники и зависит от таких факторов, как способ введения и масса тела животного. После периода лечения с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, РНК выделяют из ткани ЦНС или СМЖ и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72.
Направленное воздействие на C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой C9ORF72 на любой стадии процессинга РНК. Например, в настоящем документе описаны антисмысловые олигонуклеотиды, которые комплементарны пре-мРНК или зрелой мРНК. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с любым элементом нуклеиновой кислоты C9ORF72. Например, в настоящем документе описаны антисмысловые олигонуклеотиды, которые комплементарны экзону, интрону, 5' UTR, 3' UTR, области повтора, экспансии гексануклеотидного повтора, границе сплайсинга, экзон: экзонной границе сплайсинга, экзонному сайленсеру сплайсинга (ESS), экзонному энхансеру сплайсинга (ESE), экзону 1а, экзону 1b, экзону 1с, экзону 1d, экзону 1е, экзону 2, экзону 3, экзону 4, экзону 5, экзону 6, экзону 7, экзону 8, экзону 9, экзону 10, экзону 11, интрону 1, интрону 2, интрону 3, интрону 4, интрону 5, интрону 6, интрону 7, интрону 8, интрону 9 или интрону 10 нуклеиновой кислоты C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, гибридизуются со всеми вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с некоторыми вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с вариантами C9ORF72, содержащими экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с вариантами пре-мРНК, содержащими гексануклеотидный повтор. В некоторых вариантах реализации варианты пре-мРНК C9ORF72, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора, включают SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации такая экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 24 повтора любого из GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72 в равной степени. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, предпочтительно ингибируют экспрессию одного или более вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, предпочтительно ингибируют экспрессию вариантов C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно ингибируют экспрессию вариантов пре-мРНК, содержащих гексануклеотидный повтор. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно ингибируют экспрессию патоген-ассоциированных вариантов мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации варианты пре-мРНК C9ORF72, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора, включают SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации такая экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 24 повтора любого из GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора образует ядерные очаги. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, пригодны для сокращения ядерных очагов. Ядерные очаги могут быть сокращены в отношении процента клеток с такими очагами, а также в отношении количества очагов на одну клетку.
Селективное ингибирование некоторых патогенных ассоциированных вариантов.
В некоторых примерах, представленных в настоящем документе, набор праймеров и зондов RTS3905 обнаруживает вариант мРНК (например, NM_001256054.1), процессированный из варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Вариант мРНК, процессированный из варианта пре-мРНК, содержит гексануклеотидный повтор (т.е. «патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72»). Пре-мРНК содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1 В, например, с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности (SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). В указанной области были сконструированы олигонуклеотиды для селективного воздействия на вариант пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор. RTS3905 обеспечивает возможность измерения продукта мРНК (т.е. патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72) варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор, и, следовательно, обеспечивает возможность измерения снижения варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор.
Особенности C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с любым вариантом C9ORF72 в любом состоянии процессинга в любом элементе гена C9ORF72. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с экзоном, интроном 5' UTR, 3' UTR, областью повтора, экспансией гексануклеотидного повтора, границей сплайсинга, экзон: экзонной границей сплайсинга, экзонным сайленсером сплайсинга (ESS), экзонным энхансером сплайсинга (ESE), экзоном 1а, экзоном 1b, экзоном 1с, экзоном 1d, экзоном 1е, экзоном 2, экзоном 3, экзоном 4, экзоном 5, экзоном 6, экзоном 7, экзоном 8, экзоном 9, экзоном 10, экзоном 11, интроном 1, интроном 2, интроном 3, интроном 4, интроном 5, интроном 6, интроном 7, интроном 8, интроном 9 или интроном 10. Например, антисмысловые олигонуклеотиды могут быть направлены на любой из экзонов, описанных ниже в таблицах 1-5 для различных вариантов C9ORF72, описанных ниже. Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, также могут быть направлены на варианты, не описанные ниже, и такие варианты описаны в GENBANK. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, также могут быть направлены на элементы, отличные от экзонов, и такие элементы описаны в GENBANK.
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Некоторые показания
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации индивидуум страдает нейродегенеративным заболеванием. В некоторых вариантах реализации индивидуум имеет риск развития нейродегенеративного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, ALS или FTD. В некоторых вариантах реализации у индивидуума идентифицировано C9ORF72-ассоциированное заболевание. В некоторых вариантах реализации в настоящем документе предложены способы профилактического снижения экспрессии C9ORF72 у индивидуума. Некоторые варианты реализации включают лечение индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения индивидууму терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, сопровождается мониторингом уровней C9ORF72 у индивидуума для определения реакции индивидуума на введение антисмыслового соединения. Реакцию индивидуума на введение антисмыслового соединения врач может использовать для определения объема и продолжительности терапевтического вмешательства.
В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к снижению экспрессии C9ORF72 на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к улучшению двигательной функции и дыхания у животного. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения к C9ORF72 обеспечивает улучшение двигательной функции и дыхания на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, направленное на C9ORF72, используют для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего или предрасположенного к нейродегенеративному заболеванию, включая ALS и FTD.
Некоторые комбинированные терапии
В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с одним или более другими фармацевтическими агентами. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения того же заболевания, расстройства или патологического состояния, что и одна или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения другого заболевания, расстройства или патологического состояния, чем одна или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для лечения нежелательного побочного эффекта указанного другого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для обеспечения комбинированного эффекта. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для обеспечения синергетического эффекта.
В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов вводят в разное время. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов получают вместе в составе одной лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов получают по отдельности.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть совместно введены с фармацевтической композицией, описанной в настоящем документе, включают рилузол (рилутек), лиорезал (лиорезал) и декспрамипексол.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно со специфическим ингибитором C9ORF72, описанным в настоящем документе, включают, но не ограничиваются им, дополнительный ингибитор C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно со специфическим ингибитором C9ORF72, описанным в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят до введения фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят после введения фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят одновременно с фармацевтической композицией, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента является такой же, как доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента ниже, чем доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента выше, чем доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента.
В некоторых вариантах реализации совместное введение второго соединения усиливает эффект первого соединения, так что указанное совместное введение соединений приводит к получению более высокого эффекта, чем эффект от введения только первого соединения. В других вариантах реализации совместное введение приводит к получению эффектов, которые являются аддитивными для эффектов указанных соединений при введении по отдельности. В некоторых вариантах реализации совместное введение приводит к получению эффектов, которые являются сверхаддитивными для эффектов указанных соединений при введении по отдельности. В некоторых вариантах реализации первое соединение представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации второе соединение представляет собой антисмысловое соединение.
Некоторые композиции сравнения
В некоторых вариантах реализации соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и/или ISIS 577083. ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и ISIS 577083 были выбраны в качестве соединений сравнения, поскольку они демонстрируют высокие уровни дозозависимого снижения мРНК C9ORF72 в различных исследованиях, описанных в WO2014/062691. Таким образом, ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и ISIS 577083 предположительно являются высокоэффективными и сильнодействующими соединениями. Кроме того, ISIS 577065, ISIS 577056 и ISIS 576816, описанные в WO 2014/062691, являются структурно родственными соединениям, описанным в настоящем документе. Например, ISIS 577065 имеет 16 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 801287; ISIS 577056 имеет 16 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 806679; ISIS 576816 имеет 18 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 802473 (18-мер); и ISIS 576816 имеет 18 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 802459.
В некоторых вариантах реализации ISIS 576816, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 21), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 576816 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 576816.
В некоторых вариантах реализации ISIS 576974, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGGACACTACAAGGTAGTAT (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 56), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 576974 обеспечивает среднюю оценку FOB 5,67 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 576974.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577061, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') TACAGGCTGCGGTTGTTTCC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 57), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577061 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577061.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577065, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') CCCGGCCCCTAGCGCGCGAC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 58), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577065 обеспечивает среднюю оценку FOB 6,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577065.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577083, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGTAACTTCAAACTCTTGGG (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 59), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577083 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577083.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577056, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') AATCTTTATCAGGTCTTTTC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 60), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577056 обеспечивает среднюю оценку FOB 6,5 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577056.
Некоторые терапевтические средства для лечения людей
Антисмысловые олигонуклеотиды к человеческому C9ORF72, описанные в настоящем документе, представляют собой терапевтические средства для лечения людей. Были изучены различные параметры активности, эффективности и/или переносимости. Такие параметры включают in vitro ингибирование экспрессии общей РНК C9ORF72, in vitro ингибирование экспрессии патоген-ассоциированного варианта РНК C9ORF72, in vitro эффект дозы (IC50), in vivo ингибирование общей или патогенной РНК и/или белка у трансгенных животных, несущих трансген человеческого C9ORF72 в релевантных тканях (например, головном мозге и/или спинном мозге), переносимость у мышей, переносимость у крыс и/или переносимость у приматов. Маркеры переносимости, которые могут быть измерены, включают химические параметры крови и плазмы, химические параметры СМЖ, массу тела и органов, общие наблюдения и/или поведенческие тесты, и/или биохимические маркеры, такие как GFAP и/или AIF1. Может быть измерена острая или долговременная переносимость.
Некоторые композиции
1. ISIS 801287
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 характеризуется как 4-8-6 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCCCTAGCGCGCGACTC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 33), где каждый из нуклеозидов 1-4 и 13-18 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 5-12 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 13 и 14, 14 и 15, и 15 и 16 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo mCes mCds Tds Ads Gds mCds Gds mCds Gds mCeo Geo Aeo mCes Tes mCe; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 описан следующей химической структурой, или его соль:
Figure 00000036
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 801287 описана следующей химической структурой:
Figure 00000037
2. ISIS 806679
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 характеризуется как 6-10-4 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGTTAATCTTTATCAGGTCT (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 49), где каждый из нуклеозидов 1-6 и 17-20 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 7-16 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, и 17 и 18 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 13 и 14, 14 и 15, 15 и 16, 16 и 17, 18 и 19, и 19 и 20 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 описан следующей химической записью: Ges Geo Тео Тео Aeo Aeo Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ads Gds Geo Tes mCes Те; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
е = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 описан следующей химической структурой, или его соль:
Figure 00000038
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 806679 описана следующей химической структурой:
Figure 00000039
3. ISIS 802473
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 характеризуется как 4-8-6 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 47), где каждый из нуклеозидов 1-4 и 13-18 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 5-12 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 13 и 14, 14 и 15, и 15 и 16 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo Tes Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Geo Aeo mCeo mCes Aes Ae; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозньш сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 описан следующей химической структурой, или его соль:
Figure 00000040
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 802473 описана следующей химической структурой:
Figure 00000041
4. ISIS 802459
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 характеризуется как 3-10-7 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 21), где каждый из нуклеозидов 1-3 и 14-20 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 4-13 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 14 и 15, 15 и 16, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 13 и 14, 18 и 19, и 19 и 20 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo Tds Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Gds Aeo mCeo mCeo Aeo Aes Ges Ae; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 описан следующей химической структурой, или его соль:
Figure 00000042
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 802459 описана следующей химической структурой:
Figure 00000043
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее описание и включение посредством ссылки
Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, были описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и не подразумевают его ограничения. Каждая ссылка, упоминаемая в настоящей заявке, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Пример 1: Антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на человеческий C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды в представленной ниже таблице были сконструированы как МОЕ гэпмеры. Центральный сегмент гэп каждого гэпмера содержит 2'-дезоксинуклеозиды и окружен сегментами крыльев с 5' конца и 3' конца, содержащими нуклеозиды, каждый из которых содержит группу 2'-МОЕ. Конкретный мотив каждого гэпмера указан в представленной ниже таблице, обозначенный тремя числами, разделенными дефисами. Числа означают количество нуклеозидов в 5'-крыле, гэп и 3'-крыле, соответственно. Все остатки цитозина в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины. Межнуклеозидные связи в гэпмерах представляют собой смешанные тиофосфатные и фосфодиэфирные связи. Межнуклеозидные связи для каждого гэпмера представлены в колонке «Связь», где «о» означает фосфодиэфирную связь, и «s» означает тиофосфатную связь.
Каждый антисмысловой олигонуклеотид, перечисленный в следующей таблице, нацелен на человеческую геномную последовательность C9ORF72, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 2 (комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). «Сайт инициации» обозначает самый крайний 5' нуклеозид, на который направлен гэпмер в геномной последовательности человека. «Сайт терминации» обозначает самый крайний 3' нуклеозид, на который направлен гэпмер в геномной последовательности человека.
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Пример 2: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9ORF72, у мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на мышах для оценки переносимости олигонуклеотидов. Мышам С57/В16 дикого типа вводили однократную ICV дозу 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Через 3 часа после инъекции каждую мышь оценивали по 7 различным критериям. 7 критериев представляют собой: (1) мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой; (2) мышь стояла или сгибалась без раздражителя; (3) мышь выполняла любое движение без раздражителя; (4) мышь демонстрировала движение вперед после того, как ее подняли; (5) мышь демонстрировала любое движение после того, как ее подняли; (6) мышь реагировала на щипок за хвост; (7) ровное дыхание. Для каждого из 7 различных критериев, каждой мыши начисляли балл 0, если она отвечала критерию, или 1 если она не отвечала ему. После оценки всех 7 критериев суммировали промежуточные оценки для каждой мыши, а затем усредняли для каждой группы. Например, если мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой через 3 часа после ICV введения дозы 700 мкг, и соответствовала всем остальным критериям, она получала суммарный балл 0. Если другая мышь не была бодрой, бдительной и отзывчивой через 3 часа после ICV введения дозы 700 мкг, но соответствовала всем остальным критериям, она получала суммарный балл 1. Результаты представлены в виде среднего балла по каждой экспериментальной группе.
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Пример 3: Переносимость олигонуклеотидов из WO 2014/062691
Олигонуклеотиды, описанные в WO 2014/062691, испытывали в исследовании острой переносимости на мышах. Группы по 3 мыши С57/В16 дикого типа лечили и анализировали так, как описано в примере 2. Испытанные олигонуклеотиды включали те, которые перечислены в следующей таблице, которые представляют собой 5-10-5 МОЕ гэпмеры с полностью тиофосфатным скелетом, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. Представлены сайты инициации и терминации SEQ ID NO: 2, на которую направлен каждый олигонуклеотид. В следующей таблице результаты представлены в виде среднего балла по каждой экспериментальной группе. Полученные результаты демонстрируют, что ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, ISIS 577083 и ISIS 577056 переносятся неудовлетворительно.
Figure 00000050
Figure 00000051
Пример 4: Антисмысловое ингибирование варианта мРНК человеческого C9ORF72 в клетках HepG2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 in vitro. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов человека RTS3905 (прямая последовательность GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 12; обратная последовательность GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 13; последовательность зонда TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 14 - набор праймеров и зондов TAQ-man). RTS3905 обеспечивает обнаружение варианта мРНК (например, NH_001256054.1), процессированный из варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Вариант мРНК, процессированный из варианта пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор, в настоящем документе представляет собой «патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72». Пре-мРНК содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1 В (обычно с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности: SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 2756500. Следовательно, олигонуклеотиды, сконструированные в данной области, селективно направлены на вариант пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор. RTS3905 обеспечивает возможность измерения продукта мРНК (т.е. патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72) варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор, и, следовательно, обеспечивает возможность измерения снижения варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Уровни патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 нормализовали к общему содержанию РНК в клетке по результатам измерения с помощью RIBOGREEN®, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 5: Дозозависимое антисмысловое ингибирование варианта мРНК человеческого C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в различных дозах на клетках HepG2. Клетки помещали на планшет с плотностью 20000 клеток на лунку и обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 16 часов или 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 использовали набор праймеров и зондов RTS3905 человеческого C9ORF72. Уровни патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC50) каждого олигонуклеотида рассчитывали на основании ингибирования уровней мРНК варианта, наблюдаемого для каждой отдельной дозы антисмыслового олигонуклеотида.
Пример 6: Антисмысловое ингибирование C9ORF72 кросс-реактивными в отношении человека и резуса антисмысловыми олигонуклеотидами в клетках LLC-МK2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, которые являются полностью кросс-реактивными с нуклеиновой кислотой C9ORF72 резуса, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 резуса in vitro. Культивированные клетки LLC-MK2 резуса с плотностью 20000 клеток на лунку обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов RTS3750 (прямая последовательность TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 15; обратная последовательность GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 16; последовательность зонда TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 17 - набор праймеров и зондов TAQ-man) для измерения уровней общей мРНК C9ORF72. RTS3750 нацелен на экзон 2 транскриптов мРНК и, следовательно, обеспечивает возможность измерения всех транскриптов мРНК. Уровни мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 7: Дозозависимое антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в LLC-MK2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в различных дозах на клетках LLC-MK2. Клетки помещали на планшет с плотностью 20000 клеток на лунку и обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 16 часов или 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов RTS3750 для измерения уровней общей мРНК C9ORF72. Уровни мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 8: Антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в двух трансгенных линиях мышей ВАС, обозначенных в настоящем документе как С9В41 и С9В183, каждая из которых экспрессирует усеченный человеческий ген C9ORF72, содержащий экзоны 1-5. Усеченные гены C9ORF72 в мышиных линиях С9В41 и С9В183 содержат 110 и 450 гексануклеотидных повторов, соответственно. Каждой мыши в каждой экспериментальной группе вводили 350 мкг антисмыслового олигонуклеотида, затем анализировали уровни экспрессии РНК человеческого C9ORF72 с помощью ОТ-ПЦР. Определяли также реакцию на дозу.
Пример 9: Антисмысловое ингибирование мРНК C9ORF72 в фибробластах пациента
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды, перечисленные в представленной ниже таблице, добавляли на планшет с последующим добавлением фибробластов пациента F09-152 с плотностью 20000 клеток на лунку. Конечные концентрации антисмысловых олигонуклеотидов после добавления клеток указаны в следующей таблице. Через 30 секунд встряхивания клетки обрабатывали электропорацией, затем переносили в культуральный планшет с покрытием Primaria. Через 16 часов выделяли РНК из клеток и измеряли уровни общей мРНК C9ORF72 (т.е. мРНК, начинающейся с экзона 1А, и мРНК, начинающейся с экзона 1В) и уровни патогенной ассоциированной мРНК (см. пример 4), с помощью ОТ-кПЦР. Использовали набор праймеров и зондов человека RTS 3750 (см. пример 6) и RTS3905 (см. пример 4) для определения общей мРНК C9ORF72 и патоген-ассоциированной мРНК C9ORF72, соответственно. Уровни общей мРНК C9ORF72 и патоген-ассоциированной мРНК C9ORF72 нормализовали к общему содержанию РНК в клетке, измеренному с помощью RIBOGREEN®, затем нормализованные уровни мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом. Результаты представлены в следующей таблице. Запись «н.о.« означает, что показатель не определяли. Значения IC50, указанные как «н. о.», не определяли, поскольку мишень не была в достаточной степени ингибирована для определения IC50. Результаты демонстрируют, что все олигонуклеотиды, перечисленные ниже, ингибируют патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72. Олигонуклеотиды, которые специфически не нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК, ингибировали патоген-ассоциированную мРНК C9ORF72 и общую мРНК C9ORF72. Олигонуклеотиды, которые специфически нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК, селективно ингибировали патоген-ассоциированную мРНК C9ORF72.
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Пример 10: Антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в трансгенной линии мышей ВАС С9В41 (см. пример 8), которая экспрессирует человеческий ген C9ORF72, содержащий область промотора в экзоне 5 и 110 гексануклеотидных повторов. Каждая экспериментальная группа состояла из 2-3 мышей. Каждой мыши вводили однократную ICVB дозу 350 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, или PBS. Через две недели мышей усыпляли и анализировали уровни экспрессии человеческого патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 и/или общей мРНК C9ORF72 человека с помощью ОТК-кПЦР, как описано в примере 9. Анализ уровней патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 не проводили для олигонуклеотидов, которые специфически не нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК C9ORF72. Результаты в представленных ниже таблицах демонстрируют средние процентные нормализованные уровни мРНК C9ORF72 человека относительно нормализованного среднего значения для группы, обработанной PBS.
Figure 00000056
Figure 00000057
Figure 00000058
Пример 11: Дозозависимое антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в двух трансгенных линиях мышей ВАС, С9В41 и С9В183, каждая из которых экспрессирует усеченный человеческий ген C9ORF72, содержащий экзоны 1-5. Усеченные гены C9ORF72 в мышиных линиях С9В41 и С9В183 содержат 110 и 450 гексануклеотидных повторов, соответственно (см. пример 8). Каждая экспериментальная группа состояла из 2-4 мышей. Каждой мыши вводили однократную ICVB дозу 30 мкг, 100 мкг, 300 мкг или 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, или PBS. Через две недели мышей усыпляли и анализировали уровни экспрессии человеческого патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 и/или общей мРНК C9ORF72 человека с помощью ОТК-кПЦР, как описано в примере 9. Результаты в представленных ниже таблицах демонстрируют средние процентные нормализованные уровни мРНК C9ORF72 человека относительно нормализованного среднего значения для группы, обработанной PBS. Значение 100 или более означает, что антисмысловой олигонуклеотид не снижает мРНК или увеличивает количество мРНК.
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Пример 12: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9Orf72, у мышей
Мышам С57/В16 дикого типа вводили однократную ICV дозу 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, как описано в примере 2. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Через 8 недель после инъекции мышей оценивали по 7 различным критериям. Критерии представляют собой: (1) мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой; (2) мышь стояла или сгибалась без раздражителя; (3) мышь выполняла любое движение без раздражителя; (4) мышь демонстрировала движение вперед после того, как ее подняли; (5) мышь демонстрировала любое движение после того, как ее подняли; (6) мышь реагировала на щипок за хвост; (7) ровное дыхание. Для каждого из 7 критериев, каждой мыши начисляли балл 0, если она отвечала критерию, и 1 если она не отвечала ему. После оценки всех 7 критериев суммировали промежуточные оценки для каждой мыши, а затем усредняли для каждой экспериментальной группы. Результаты представлены в следующей таблице.
Животных усыпляли спустя 8 недель. У каждого животного извлекали кору головного мозга и спинной мозг и проводили ОТ-ПЦР. Определяли уровни экспрессии аллогенного воспалительного фактора (AIF1) как меру воспаления. Определяли также уровни экспрессии глиофибриллярного кислого белка (GFAP) как меру активации глиальных клеток. Результаты, нормализованные Gpadh, представлены относительно контроля с PBS (1,0) в следующей таблице. «Н.о.» означает, что данные отсутствуют, поскольку эксперимент не проводили. Звездочка означает, что соответствующий результат является средним для 1-3 мышей.
Figure 00000062
Figure 00000063
Figure 00000064
Пример 13: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9Orf72, у крыс
Крысы Спрага-Доули разделяли на группы по 4 или 6 крыс. Каждой крысе в каждой группе крыс вводили однократную интратекальную (IT) дозу 3 мг олигонуклеотида, указанного в следующей таблице. Через 3 часа и через 8 недель после IT дозы у каждой крысы оценивали движение 7 различных частей тела. 7 частей тела представляют собой (1) хвост крысы; (2) положение задней части тела крысы; (3) задние конечности крысы; (4) задние лапы крысы; (5) передние лапы крысы; (6) положение передней части тела крысы; (7) голова крысы. Для каждой из 7 различных частей тела крысы, каждой крысе начислялся балл 0, если часть тела двигалась, или 1, если она была парализована. После оценки всех 7 частей тела суммировали промежуточные оценки для каждой крысы, а затем усредняли для каждой группы. Например, если у крысы хвост, голова и все остальные оцениваемые части тела двигались через 3 часа после IT дозы 3 мг, она получала суммарный балл 0. Например, если у другой крысы хвост не двигался через 3 часа после IT дозы 3 мг, но все остальные оцениваемые части тела двигались, она получала суммарный балл 1. Крысы, которым вводили физраствор, как правило, получали 0 баллов. Баллы в верхней части диапазона свидетельствуют об острой токсичности. Результаты представлены в следующей таблице как средний балл для каждой экспериментальной группы.
Животных усыпляли спустя 8 недель. У каждого животного извлекали кору головного мозга и спинной мозг и проводили ОТ-ПЦР. Определяли уровни экспрессии AIF1 как меру воспаления. Определяли также уровни экспрессии GFAP как меру активации глиальных клеток. Звездочка означает, что соответствующий результат является средним для 2-3 мышей. Результаты, нормализованные по Gapdh, представлены относительно контроля с PBS (1,0) в следующей таблице.
Figure 00000065
Figure 00000066
Пример 14: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9ORF72, у приматов, не являющихся человеком
Самкам яванских макак (2-6 кг) вводили 3 дозы по 35 мг антисмыслового олигонуклеотида на 1, 14 и 28 день посредством интратекальной болюсной инъекции (1 мл медленного болюса, затем 0,25 мл с усилием). Каждая экспериментальная группа содержала четыре обезьяны. Через две недели после последней дозы животных усыпляли и проводили ОТ-ПЦР на различных тканях ЦНС. Определяли уровни экспрессии AIF1 как меру воспаления и уровни экспрессии GFAP как меру активации глиальных клеток. В следующей таблице представлены результаты, нормализованные по GADPH, относительно контроля с PBS (1,0) для ISIS №801287, 802459 и 806679.
Figure 00000067
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИОНИС ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ C9ORF72
<130> BIOL0269WO
<150> 62/148,691
<151> 2015-04-16
<150> 62/232,941
<151> 2015-09-25
<150> 62/239,400
<151> 2015-10-09
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3339
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120
ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 240
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 300
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 360
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 420
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 480
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 540
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 600
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggaaa gacaagaaaa 660
tgtccagaag attatcttag aaggcacaga gagaatggaa gatcagggtc agagtattat 720
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 780
cagtgttcct gaagaaatag atatagctga tacagtactc aatgatgatg atattggtga 840
cagctgtcat gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacttgcaaa cctgtggctg 900
ttccgttgta gtaggtagca gtgcagagaa agtaaataag atagtcagaa cattatgcct 960
ttttctgact ccagcagaga gaaaatgctc caggttatgt gaagcagaat catcatttaa 1020
atatgagtca gggctctttg tacaaggcct gctaaaggat tcaactggaa gctttgtgct 1080
gcctttccgg caagtcatgt atgctccata tcccaccaca cacatagatg tggatgtcaa 1140
tactgtgaag cagatgccac cctgtcatga acatatttat aatcagcgta gatacatgag 1200
atccgagctg acagccttct ggagagccac ttcagaagaa gacatggctc aggatacgat 1260
catctacact gacgaaagct ttactcctga tttgaatatt tttcaagatg tcttacacag 1320
agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtctttcag ctgaaacctg gcttatctct 1380
cagaagtact ttccttgcac agtttctact tgtccttcac agaaaagcct tgacactaat 1440
aaaatatata gaagacgata cgcagaaggg aaaaaagccc tttaaatctc ttcggaacct 1500
gaagatagac cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg ctctggctga 1560
gaaaattaaa ccaggcctac actcttttat ctttggaaga cctttctaca ctagtgtgca 1620
agaacgagat gttctaatga ctttttaaat gtgtaactta ataagcctat tccatcacaa 1680
tcatgatcgc tggtaaagta gctcagtggt gtggggaaac gttcccctgg atcatactcc 1740
agaattctgc tctcagcaat tgcagttaag taagttacac tacagttctc acaagagcct 1800
gtgaggggat gtcaggtgca tcattacatt gggtgtctct tttcctagat ttatgctttt 1860
gggatacaga cctatgttta caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat 1920
aataggatgt aaacttgacc acaactactg tttttttgaa atacatgatt catggtttac 1980
atgtgtcaag gtgaaatctg agttggcttt tacagatagt tgactttcta tcttttggca 2040
ttctttggtg tgtagaatta ctgtaatact tctgcaatca actgaaaact agagccttta 2100
aatgatttca attccacaga aagaaagtga gcttgaacat aggatgagct ttagaaagaa 2160
aattgatcaa gcagatgttt aattggaatt gattattaga tcctactttg tggatttagt 2220
ccctgggatt cagtctgtag aaatgtctaa tagttctcta tagtccttgt tcctggtgaa 2280
ccacagttag ggtgttttgt ttattttatt gttcttgcta ttgttgatat tctatgtagt 2340
tgagctctgt aaaaggaaat tgtattttat gttttagtaa ttgttgccaa ctttttaaat 2400
taattttcat tatttttgag ccaaattgaa atgtgcacct cctgtgcctt ttttctcctt 2460
agaaaatcta attacttgga acaagttcag atttcactgg tcagtcattt tcatcttgtt 2520
ttcttcttgc taagtcttac catgtacctg ctttggcaat cattgcaact ctgagattat 2580
aaaatgcctt agagaatata ctaactaata agatcttttt ttcagaaaca gaaaatagtt 2640
ccttgagtac ttccttcttg catttctgcc tatgtttttg aagttgttgc tgtttgcctg 2700
caataggcta taaggaatag caggagaaat tttactgaag tgctgttttc ctaggtgcta 2760
ctttggcaga gctaagttat cttttgtttt cttaatgcgt ttggaccatt ttgctggcta 2820
taaaataact gattaatata attctaacac aatgttgaca ttgtagttac acaaacacaa 2880
ataaatattt tatttaaaat tctggaagta atataaaagg gaaaatatat ttataagaaa 2940
gggataaagg taatagagcc cttctgcccc ccacccacca aatttacaca acaaaatgac 3000
atgttcgaat gtgaaaggtc ataatagctt tcccatcatg aatcagaaag atgtggacag 3060
cttgatgttt tagacaacca ctgaactaga tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa 3120
aaaatatata aatactacct tgtagtgtcc catactgtgt tttttacatg gtagattctt 3180
atttaagtgc taactggtta ttttctttgg ctggtttatt gtactgttat acagaatgta 3240
agttgtacag tgaaataagt tattaaagca tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc 3300
taaatggaga attttgaata aaatatattt gaaattttg 3339
<210> 2
<211> 30001
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa 60
attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg 120
gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca 180
ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt 240
catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga 300
atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt 360
tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc 420
ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca 480
ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg 540
tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca 600
cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga 660
atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa 720
atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt 780
gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc 840
agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc 900
atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa 960
ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac 1020
gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc 1080
ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt 1140
aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg 1200
taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg 1260
cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 1320
ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 1380
agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 1440
caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg 1500
gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc 1560
ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct 1620
gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt 1680
tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga 1740
attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga 1800
caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc 1860
ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta 1920
ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca 1980
agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga 2040
gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac 2100
ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg 2160
ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg 2220
gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt 2280
gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag 2340
ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc 2400
tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat 2460
gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca 2520
aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact 2580
tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc 2640
tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct 2700
gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag 2760
tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat 2820
ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg 2880
ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg 2940
tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta 3000
ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat 3060
gaacttcacc ttccagtctt ccctgatgtt gaagattgag aaagtgttgt gaactttctg 3120
gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg 3180
gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt 3240
attgagagcc aggttggaga aggtggctta cacctgtaat gccagagctt tgggaggcgg 3300
aggcaagagg atcacttgaa gccaggagtt caagctcaac ctgggcaacg tagaccctgt 3360
ctctacaaaa aattaaaaac ttagccgggc gtggtgatgt gcacctgtag tcctagctac 3420
ttgggaggct gaggcaggag ggtcatttga gcccaagagt ttgaagttac cgagagctat 3480
gatcctgcca gtgcattcca gcctggatga caaaacgaga ccctgtctct aaaaaacaag 3540
aagtgagggc tttatgattg tagaattttc actacaatag cagtggacca accacctttc 3600
taaataccaa tcagggaaga gatggttgat tttttaacag acgtttaaag aaaaagcaaa 3660
acctcaaact tagcactcta ctaacagttt tagcagatgt taattaatgt aatcatgtct 3720
gcatgtatgg gattatttcc agaaagtgta ttgggaaacc tctcatgaac cctgtgagca 3780
agccaccgtc tcactcaatt tgaatcttgg cttccctcaa aagactggct aatgtttggt 3840
aactctctgg agtagacagc actacatgta cgtaagatag gtacataaac aactattggt 3900
tttgagctga tttttttcag ctgcatttgc atgtatggat ttttctcacc aaagacgatg 3960
acttcaagta ttagtaaaat aattgtacag ctctcctgat tatacttctc tgtgacattt 4020
catttcccag gctatttctt ttggtaggat ttaaaactaa gcaattcagt atgatctttg 4080
tccttcattt tctttcttat tctttttgtt tgtttgtttg tttgtttttt tcttgaggca 4140
gagtctctct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcgcc atctcagctc attgcaacct 4200
ctgccacctc cgggttcaag agattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca 4260
ggtgtccacc accacacccg gctaattttt tgtattttta gtagaggtgg ggtttcacca 4320
tgttggccag gctggtcttg agctcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cggcctacca 4380
aagagctggg ataacaggtg tgacccacca tgcccggccc attttttttt tcttattctg 4440
ttaggagtga gagtgtaact agcagtataa tagttcaatt ttcacaacgt ggtaaaagtt 4500
tccctataat tcaatcagat tttgctccag ggttcagttc tgttttagga aatactttta 4560
ttttcagttt aatgatgaaa tattagagtt gtaatattgc ctttatgatt atccaccttt 4620
ttaacctaaa agaatgaaag aaaaatatgt ttgcaatata attttatggt tgtatgttaa 4680
cttaattcat tatgttggcc tccagtttgc tgttgttagt tatgacagca gtagtgtcat 4740
taccatttca attcagatta cattcctata tttgatcatt gtaaactgac tgcttacatt 4800
gtattaaaaa cagtggatat tttaaagaag ctgtacggct tatatctagt gctgtctctt 4860
aagactatta aattgataca acatatttaa aagtaaatat tacctaaatg aatttttgaa 4920
attacaaata cacgtgttaa aactgtcgtt gtgttcaacc atttctgtac atacttagag 4980
ttaactgttt tgccaggctc tgtatgccta ctcataatat gataaaagca ctcatctaat 5040
gctctgtaaa tagaagtcag tgctttccat cagactgaac tctcttgaca agatgtggat 5100
gaaattcttt aagtaaaatt gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc 5160
caaagcaatc atatggcaaa gataggtata tcatagtttg cctattagct gctttgtatt 5220
gctattatta taaatagact tcacagtttt agacttgctt aggtgaaatt gcaattcttt 5280
ttactttcag tcttagataa caagtcttca attatagtac aatcacacat tgcttaggaa 5340
tgcatcatta ggcgattttg tcattatgca aacatcatag agtgtactta cacaaaccta 5400
gatagtatag cctttatgta cctaggccgt atggtatagt ctgttgctcc taggccacaa 5460
acctgtacaa ctgttactgt actgaatact atagacagtt gtaacacagt ggtaaatatt 5520
tatctaaata tatgcaaaca gagaaaaggt acagtaaaag tatggtataa aagataatgg 5580
tatacctgtg taggccactt accacgaatg gagcttgcag gactagaagt tgctctgggt 5640
gagtcagtga gtgagtggtg aattaatgtg aaggcctaga acactgtaca ccactgtaga 5700
ctataaacac agtacgctga agctacacca aatttatctt aacagttttt cttcaataaa 5760
aaattataac tttttaactt tgtaaacttt ttaatttttt aacttttaaa atacttagct 5820
tgaaacacaa atacattgta tagctataca aaaatatttt ttctttgtat ccttattcta 5880
gaagcttttt tctattttct attttaaatt ttttttttta cttgttagtc gtttttgtta 5940
aaaactaaaa cacacacact ttcacctagg catagacagg attaggatca tcagtatcac 6000
tcccttccac ctcactgcct tccacctcca catcttgtcc cactggaagg tttttagggg 6060
caataacaca catgtagctg tcacctatga taacagtgct ttctgttgaa tacctcctga 6120
aggacttgcc tgaggctgtt ttacatttaa cttaaaaaaa aaaaaagtag aaggagtgca 6180
ctctaaaata acaataaaag gcatagtata gtgaatacat aaaccagcaa tgtagtagtt 6240
tattatcaag tgttgtacac tgtaataatt gtatgtgcta tactttaaat aacttgcaaa 6300
atagtactaa gaccttatga tggttacagt gtcactaagg caatagcata ttttcaggtc 6360
cattgtaatc taatgggact accatcatat atgcagtcta ccattgactg aaacgttaca 6420
tggcacataa ctgtatttgc aagaatgatt tgttttacat taatatcaca taggatgtac 6480
ctttttagag tggtatgttt atgtggatta agatgtacaa gttgagcaag gggaccaaga 6540
gccctgggtt ctgtcttgga tgtgagcgtt tatgttcttc tcctcatgtc tgttttctca 6600
ttaaattcaa aggcttgaac gggccctatt tagcccttct gttttctacg tgttctaaat 6660
aactaaagct tttaaattct agccatttag tgtagaactc tctttgcagt gatgaaatgc 6720
tgtattggtt tcttggctag catattaaat atttttatct ttgtcttgat acttcaatgt 6780
cgttttaaac atcaggatcg ggcttcagta ttctcataac cagagagttc actgaggata 6840
caggactgtt tgcccatttt ttgttatggc tccagacttg tggtatttcc atgtcttttt 6900
tttttttttt ttttttgacc ttttagcggc tttaaagtat ttctgttgtt aggtgttgta 6960
ttacttttct aagattactt aacaaagcac cacaaactga gtggctttaa acaacagcaa 7020
tttattctct cacaattcta gaagctagaa gtccgaaatc aaagtgttga caggggcatg 7080
atcttcaaga gagaagactc tttccttgcc tcttcctggc ttctggtggt taccagcaat 7140
cctgagtgtt cctttcttgc cttgtagttt caacaatcca gtatctgcct tttgtcttca 7200
catggctgtc taccatttgt ctctgtgtct ccaaatctct ctccttataa acacagcagt 7260
tattggatta ggccccactc taatccagta tgaccccatt ttaacatgat tacacttatt 7320
tctagataag gtcacattca cgtacaccaa gggttaggaa ttgaacatat ctttttgggg 7380
gacacaattc aacccacaag tgtcagtctc tagctgagcc tttcccttcc tgtttttctc 7440
ctttttagtt gctatgggtt aggggccaaa tctccagtca tactagaatt gcacatggac 7500
tggatatttg ggaatactgc gggtctattc tatgagcttt agtatgtaac atttaatatc 7560
agtgtaaaga agcccttttt taagttattt ctttgaattt ctaaatgtat gccctgaata 7620
taagtaacaa gttaccatgt cttgtaaaat gatcatatca acaaacattt aatgtgcacc 7680
tactgtgcta gttgaatgtc tttatcctga taggagataa caggattcca catctttgac 7740
ttaagaggac aaaccaaata tgtctaaatc atttggggtt ttgatggata tctttaaatt 7800
gctgaaccta atcattggtt tcatatgtca ttgtttagat atctccggag catttggata 7860
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 7920
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 7980
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 8040
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 8100
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 8160
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 8220
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 8280
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggtaa gtgatttttc 8340
agcttattaa tcatgttaac ctatctgttg aaagcttatt ttctggtaca tataaatctt 8400
atttttttaa ttatatgcag tgaacatcaa acaataaatg ttatttattt tgcatttacc 8460
ctattagata caaatacatc tggtctgata cctgtcatct tcatattaac tgtggaaggt 8520
acgaaatggt agctccacat tatagatgaa aagctaaagc ttagacaaat aaagaaactt 8580
ttagaccctg gattcttctt gggagccttt gactctaata ccttttgttt ccctttcatt 8640
gcacaattct gtcttttgct tactactatg tgtaagtata acagttcaaa gtaatagttt 8700
cataagctgt tggtcatgta gcctttggtc tctttaacct ctttgccaag ttcccaggtt 8760
cataaaatga ggaggttgaa tggaatggtt cccaagagaa ttccttttaa tcttacagaa 8820
attattgttt tcctaaatcc tgtagttgaa tatataatgc tatttacatt tcagtatagt 8880
tttgatgtat ctaaagaaca cattgaattc tccttcctgt gttccagttt gatactaacc 8940
tgaaagtcca ttaagcatta ccagttttaa aaggcttttg cccaatagta aggaaaaata 9000
atatctttta aaagaataat tttttactat gtttgcaggc ttacttcctt ttttctcaca 9060
ttatgaaact cttaaaatca ggagaatctt ttaaacaaca tcataatgtt taatttgaaa 9120
agtgcaagtc attcttttcc tttttgaaac tatgcagatg ttacattgac tgttttctgt 9180
gaagttatct ttttttcact gcagaataaa ggttgttttg attttatttt gtattgttta 9240
tgagaacatg catttgttgg gttaatttcc tacccctgcc cccatttttt ccctaaagta 9300
gaaagtattt ttcttgtgaa ctaaattact acacaagaac atgtctattg aaaaataagc 9360
aagtatcaaa atgttgtggg ttgttttttt aaataaattt tctcttgctc aggaaagaca 9420
agaaaatgtc cagaagatta tcttagaagg cacagagaga atggaagatc aggtatatgc 9480
aaattgcata ctgtcaaatg tttttctcac agcatgtatc tgtataaggt tgatggctac 9540
atttgtcaag gccttggaga catacgaata agcctttaat ggagctttta tggaggtgta 9600
cagaataaac tggaggaaga tttccatatc ttaaacccaa agagttaaat cagtaaacaa 9660
aggaaaatag taattgcatc tacaaattaa tatttgctcc cttttttttt ctgtttgccc 9720
agaataaatt ttggataact tgttcatagt aaaaataaaa aaaattgtct ctgatatgtt 9780
ctttaaggta ctacttctcg aacctttccc tagaagtagc tgtaacagaa ggagagcata 9840
tgtacccctg aggtatctgt ctggggtgta ggcccaggtc cacacaatat ttcttctaag 9900
tcttatgttg tatcgttaag actcatgcaa tttacatttt attccataac tattttagta 9960
ttaaaatttg tcagtgatat ttcttaccct ctcctctagg aaaatgtgcc atgtttatcc 10020
cttggctttg aatgcccctc aggaacagac actaagagtt tgagaagcat ggttacaagg 10080
gtgtggcttc ccctgcggaa actaagtaca gactatttca ctgtaaagca gagaagttct 10140
tttgaaggag aatctccagt gaagaaagag ttcttcactt ttacttccat ttcctcttgt 10200
gggtgaccct caatgctcct tgtaaaactc caatatttta aacatggctg ttttgccttt 10260
ctttgcttct ttttagcatg aatgagacag atgatacttt aaaaaagtaa ttaaaaaaaa 10320
aaacttgtga aaatacatgg ccataataca gaacccaata caatgatctc ctttaccaaa 10380
ttgttatgtt tgtacttttg tagatagctt tccaattcag agacagttat tctgtgtaaa 10440
ggtctgactt aacaagaaaa gatttccctt tacccaaaga atcccagtcc ttatttgctg 10500
gtcaataagc agggtcccca ggaatggggt aactttcagc accctctaac ccactagtta 10560
ttagtagact aattaagtaa acttatcgca agttgaggaa acttagaacc aactaaaatt 10620
ctgcttttac tgggattttg ttttttcaaa ccagaaacct ttacttaagt tgactactat 10680
taatgaattt tggtctctct tttaagtgct cttcttaaaa atgttatctt actgctgaga 10740
agttcaagtt tgggaagtac aaggaggaat agaaacttaa gagattttct tttagagcct 10800
cttctgtatt tagccctgta ggattttttt tttttttttt ttttttggtg ttgttgagct 10860
tcagtgaggc tattcattca cttatactga taatgtctga gatactgtga atgaaatact 10920
atgtatgctt aaacctaaga ggaaatattt tcccaaaatt attcttcccg aaaaggagga 10980
gttgcctttt gattgagttc ttgcaaatct cacaacgact ttattttgaa caatactgtt 11040
tggggatgat gcattagttt gaaacaactt cagttgtagc tgtcatctga taaaattgct 11100
tcacagggaa ggaaatttaa cacggatcta gtcattattc ttgttagatt gaatgtgtga 11160
attgtaattg taaacaggca tgataattat tactttaaaa actaaaaaca gtgaatagtt 11220
agttgtggag gttactaaag gatggttttt ttttaaataa aactttcagc attatgcaaa 11280
tgggcatatg gcttaggata aaacttccag aagtagcatc acatttaaat tctcaagcaa 11340
cttaataata tggggctctg aaaaactggt taaggttact ccaaaaatgg ccctgggtct 11400
gacaaagatt ctaacttaaa gatgcttatg aagactttga gtaaaatcat ttcataaaat 11460
aagtgaggaa aaacaactag tattaaattc atcttaaata atgtatgatt taaaaaatat 11520
gtttagctaa aaatgcatag tcatttgaca atttcattta tatctcaaaa aatttactta 11580
accaagttgg tcacaaaact gatgagactg gtggtggtag tgaataaatg agggaccatc 11640
catatttgag acactttaca tttgtgatgt gttatactga attttcagtt tgattctata 11700
gactacaaat ttcaaaatta caatttcaag atgtaataag tagtaatatc ttgaaatagc 11760
tctaaaggga atttttctgt tttattgatt cttaaaatat atgtgctgat tttgatttgc 11820
atttgggtag attatacttt tatgagtatg gaggttaggt attgattcaa gttttcctta 11880
cctatttggt aaggatttca aagtcttttt gtgcttggtt ttcctcattt ttaaatatga 11940
aatatattga tgacctttaa caaatttttt ttatctcaaa ttttaaagga gatcttttct 12000
aaaagaggca tgatgactta atcattgcat gtaacagtaa acgataaacc aatgattcca 12060
tactctctaa agaataaaag tgagctttag ggccgggcat ggtcagaaat ttgacaccaa 12120
cctggccaac atggcgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaatcagc cgggcatggt 12180
ggcggcacct atagtcccag ctacttggga ggatgagaca ggagagtcac ttgaacctgg 12240
gaggagaggt tgcagtgagc tgagatcacg ccattgcact ccagcctgag caatgaaagc 12300
aaaactccat ctcaaaaaaa aaaaaagaaa agaaagaata aaagtgagct ttggattgca 12360
tataaatcct ttagacatgt agtagacttg tttgatactg tgtttgaaca aattacgaag 12420
tattttcatc aaagaatgtt attgtttgat gttattttta ttttttattg cccagcttct 12480
ctcatattac gtgattttct tcacttcatg tcactttatt gtgcagggtc agagtattat 12540
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 12600
cagtgttcct gaagaaatag atgtaagttt aaatgagagc aattatacac tttatgagtt 12660
ttttggggtt atagtattat tatgtatatt attaatattc taattttaat agtaaggact 12720
ttgtcataca tactattcac atacagtatt agccacttta gcaaataagc acacacaaaa 12780
tcctggattt tatggcaaaa cagaggcatt tttgatcagt gatgacaaaa ttaaattcat 12840
tttgtttatt tcattacttt tataattcct aaaagtggga ggatcccagc tcttatagga 12900
gcaattaata tttaatgtag tgtcttttga aacaaaactg tgtgccaaag tagtaaccat 12960
taatggaagt ttacttgtag tcacaaattt agtttcctta atcatttgtt gaggacgttt 13020
tgaatcacac actatgagtg ttaagagata cctttaggaa actattcttg ttgttttctg 13080
attttgtcat ttaggttagt ctcctgattc tgacagctca gaagaggaag ttgttcttgt 13140
aaaaattgtt taacctgctt gaccagcttt cacatttgtt cttctgaagt ttatggtagt 13200
gcacagagat tgttttttgg ggagtcttga ttctcggaaa tgaaggcagt gtgttatatt 13260
gaatccagac ttccgaaaac ttgtatatta aaagtgttat ttcaacacta tgttacagcc 13320
agactaattt ttttattttt tgatgcattt tagatagctg atacagtact caatgatgat 13380
gatattggtg acagctgtca tgaaggcttt cttctcaagt aagaattttt cttttcataa 13440
aagctggatg aagcagatac catcttatgc tcacctatga caagatttgg aagaaagaaa 13500
ataacagact gtctacttag attgttctag ggacattacg tatttgaact gttgcttaaa 13560
tttgtgttat ttttcactca ttatatttct atatatattt ggtgttattc catttgctat 13620
ttaaagaaac cgagtttcca tcccagacaa gaaatcatgg ccccttgctt gattctggtt 13680
tcttgtttta cttctcatta aagctaacag aatcctttca tattaagttg tactgtagat 13740
gaacttaagt tatttaggcg tagaacaaaa ttattcatat ttatactgat ctttttccat 13800
ccagcagtgg agtttagtac ttaagagttt gtgcccttaa accagactcc ctggattaat 13860
gctgtgtacc cgtgggcaag gtgcctgaat tctctataca cctatttcct catctgtaaa 13920
atggcaataa tagtaatagt acctaatgtg tagggttgtt ataagcattg agtaagataa 13980
ataatataaa gcacttagaa cagtgcctgg aacataaaaa cacttaataa tagctcatag 14040
ctaacatttc ctatttacat ttcttctaga aatagccagt atttgttgag tgcctacatg 14100
ttagttcctt tactagttgc tttacatgta ttatcttata ttctgtttta aagtttcttc 14160
acagttacag attttcatga aattttactt ttaataaaag agaagtaaaa gtataaagta 14220
ttcactttta tgttcacagt cttttccttt aggctcatga tggagtatca gaggcatgag 14280
tgtgtttaac ctaagagcct taatggcttg aatcagaagc actttagtcc tgtatctgtt 14340
cagtgtcagc ctttcataca tcattttaaa tcccatttga ctttaagtaa gtcacttaat 14400
ctctctacat gtcaatttct tcagctataa aatgatggta tttcaataaa taaatacatt 14460
aattaaatga tattatactg actaattggg ctgttttaag gctcaataag aaaatttctg 14520
tgaaaggtct ctagaaaatg taggttccta tacaaataaa agataacatt gtgcttatag 14580
cttcggtgtt tatcatataa agctattctg agttatttga agagctcacc tacttttttt 14640
tgtttttagt ttgttaaatt gttttatagg caatgttttt aatctgtttt ctttaactta 14700
cagtgccatc agctcacact tgcaaacctg tggctgttcc gttgtagtag gtagcagtgc 14760
agagaaagta aataaggtag tttattttat aatctagcaa atgatttgac tctttaagac 14820
tgatgatata tcatggattg tcatttaaat ggtaggttgc aattaaaatg atctagtagt 14880
ataaggaggc aatgtaatct catcaaattg ctaagacacc ttgtggcaac agtgagtttg 14940
aaataaactg agtaagaatc atttatcagt ttattttgat agctcggaaa taccagtgtc 15000
agtagtgtat aaatggtttt gagaatatat taaaatcaga tatataaaaa aaattactct 15060
tctatttccc aatgttatct ttaacaaatc tgaagatagt catgtacttt tggtagtagt 15120
tccaaagaaa tgttatttgt ttattcatct tgatttcatt gtcttcgctt tccttctaaa 15180
tctgtccctt ctagggagct attgggatta agtggtcatt gattattata ctttattcag 15240
taatgtttct gaccctttcc ttcagtgcta cttgagttaa ttaaggatta atgaacagtt 15300
acatttccaa gcattagcta ataaactaaa ggattttgca cttttcttca ctgaccatta 15360
gttagaaaga gttcagagat aagtatgtgt atctttcaat ttcagcaaac ctaatttttt 15420
aaaaaaagtt ttacatagga aatatgttgg aaatgatact ttacaaagat attcataatt 15480
tttttttgta atcagctact ttgtatattt acatgagcct taatttatat ttctcatata 15540
accatttatg agagcttagt atacctgtgt cattatattg catctacgaa ctagtgacct 15600
tattccttct gttacctcaa acaggtggct ttccatctgt gatctccaaa gccttaggtt 15660
gcacagagtg actgccgagc tgctttatga agggagaaag gctccatagt tggagtgttt 15720
tttttttttt ttttaaacat ttttcccatc ctccatcctc ttgagggaga atagcttacc 15780
ttttatcttg ttttaatttg agaaagaagt tgccaccact ctaggttgaa aaccactcct 15840
ttaacataat aactgtggat atggtttgaa tttcaagata gttacatgcc tttttatttt 15900
tcctaataga gctgtaggtc aaatattatt agaatcagat ttctaaatcc cacccaatga 15960
cctgcttatt ttaaatcaaa ttcaataatt aattctcttc tttttggagg atctggacat 16020
tctttgatat ttcttacaac gaatttcatg tgtagaccca ctaaacagaa gctataaaag 16080
ttgcatggtc aaataagtct gagaaagtct gcagatgata taattcacct gaagagtcac 16140
agtatgtagc caaatgttaa aggttttgag atgccataca gtaaatttac caagcatttt 16200
ctaaatttat ttgaccacag aatccctatt ttaagcaaca actgttacat cccatggatt 16260
ccaggtgact aaagaatact tatttcttag gatatgtttt attgataata acaattaaaa 16320
tttcagatat ctttcataag caaatcagtg gtctttttac ttcatgtttt aatgctaaaa 16380
tattttcttt tatagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa 16440
tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa 16500
ggcctgctaa aggtatagtt tctagttatc acaagtgaaa ccacttttct aaaatcattt 16560
ttgagactct ttatagacaa atcttaaata ttagcattta atgtatctca tattgacatg 16620
cccagagact gacttccttt acacagttct gcacatagac tatatgtctt atggatttat 16680
agttagtatc atcagtgaaa caccatagaa taccctttgt gttccaggtg ggtccctgtt 16740
cctacatgtc tagcctcagg actttttttt ttttaacaca tgcttaaatc aggttgcaca 16800
tcaaaaataa gatcatttct ttttaactaa atagatttga attttattga aaaaaaattt 16860
taaacatctt taagaagctt ataggattta agcaattcct atgtatgtgt actaaaatat 16920
atatatttct atatataata tatattagaa aaaaattgta tttttctttt atttgagtct 16980
actgtcaagg agcaaaacag agaaatgtaa attagcaatt atttataata cttaaaggga 17040
agaaagttgt tcaccttgtt gaatctatta ttgttatttc aattatagtc ccaagacgtg 17100
aagaaatagc tttcctaatg gttatgtgat tgtctcatag tgactacttt cttgaggatg 17160
tagccacggc aaaatgaaat aaaaaaattt aaaaattgtt gcaaatacaa gttatattag 17220
gcttttgtgc attttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata 17280
gaaactagtt aaaggaaacg tagtttctat ttgagttata catatctgta aattagaact 17340
tctcctgtta aaggcataat aaagtgctta atacttttgt ttcctcagca ccctctcatt 17400
taattatata attttagttc tgaaagggac ctataccaga tgcctagagg aaatttcaaa 17460
actatgatct aatgaaaaaa tatttaatag ttctccatgc aaatacaaat catatagttt 17520
tccagaaaat acctttgaca ttatacaaag atgattatca cagcattata atagtaaaaa 17580
aatggaaata gcctctttct tctgttctgt tcatagcaca gtgcctcata cgcagtaggt 17640
tattattaca tggtaactgg ctaccccaac tgattaggaa agaagtaaat ttgttttata 17700
aaaatacata ctcattgagg tgcatagaat aattaagaaa ttaaaagaca cttgtaattt 17760
tgaatccagt gaatacccac tgttaatatt tggtatatct ctttctagtc tttttttccc 17820
ttttgcatgt attttcttta agactcccac ccccactgga tcatctctgc atgttctaat 17880
ctgctttttt cacagcagat tctaagcctc tttgaatatc aacacaaact tcaacaactt 17940
catctataga tgccaaataa taaattcatt tttatttact taaccacttc ctttggatgc 18000
ttaggtcatt ctgatgtttt gctattgaaa ccaatgctat actgaacact tctgtcacta 18060
aaactttgca cacactcatg aatagcttct taggataaat ttttagagat ggatttgcta 18120
aatcagagac cattttttaa aattaaaaaa caattattca tatcgtttgg catgtaagac 18180
agtaaatttt ccttttattt tgacaggatt caactggaag ctttgtgctg cctttccggc 18240
aagtcatgta tgctccatat cccaccacac acatagatgt ggatgtcaat actgtgaagc 18300
agatgccacc ctgtcatgaa catatttata atcagcgtag atacatgaga tccgagctga 18360
cagccttctg gagagccact tcagaagaag acatggctca ggatacgatc atctacactg 18420
acgaaagctt tactcctgat ttgtacgtaa tgctctgcct gctggtactg tagtcaagca 18480
atatgaaatt gtgtctttta cgaataaaaa caaaacagaa gttgcattta aaaagaaaga 18540
aatattacca gcagaattat gcttgaagaa acatttaatc aagcattttt ttcttaaatg 18600
ttcttctttt tccatacaat tgtgtttacc ctaaaatagg taagattaac ccttaaagta 18660
aatatttaac tatttgttta ataaatatat attgagctcc taggcactgt tctaggtacc 18720
gggcttaata gtggccaacc agacagcccc agccccagcc cctacattgt gtatagtcta 18780
ttatgtaaca gttattgaat ggacttatta acaaaaccaa agaagtaatt ctaagtcttt 18840
tttttcttga catatgaata taaaatacag caaaactgtt aaaatatatt aatggaacat 18900
ttttttactt tgcattttat attgttattc acttcttatt tttttttaaa aaaaaaagcc 18960
tgaacagtaa attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gttgagcatg gacccaactt 19020
gaaaaaaaaa atgatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaaag 19080
atgttctgaa atcaggaaaa gaattatagt atacttttgt gtttctcttt tatcagttga 19140
aaaaaggcac agtagctcat gcctgtaaga acagagcttt gggagtgcaa ggcaggcgga 19200
tcacttgagg ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca 19260
aaaaataaaa aagaattatt ggaatgtgtt tctgtgtgcc tgtaatccta gctattccga 19320
aagctgaggc aggaggatct tttgagccca ggagtttgag gttacaggga gttatgatgt 19380
gccagtgtac tccagcctgg ggaacaccga gactctgtct tatttaaaaa aaaaaaaaaa 19440
aaaatgcttg caataatgcc tggcacatag aaggtaacag taagtgttaa ctgtaataac 19500
ccaggtctaa gtgtgtaagg caatagaaaa attggggcaa ataagcctga cctatgtatc 19560
tacagaatca gtttgagctt aggtaacaga cctgtggagc accagtaatt acacagtaag 19620
tgttaaccaa aagcatagaa taggaatatc ttgttcaagg gacccccagc cttatacatc 19680
tcaaggtgca gaaagatgac ttaatatagg acccattttt tcctagttct ccagagtttt 19740
tattggttct tgagaaagta gtaggggaat gttttagaaa atgaattggt ccaactgaaa 19800
ttacatgtca gtaagttttt atatattggt aaattttagt agacatgtag aagttttcta 19860
attaatctgt gccttgaaac attttctttt ttcctaaagt gcttagtatt ttttccgttt 19920
tttgattggt tacttgggag cttttttgag gaaatttagt gaactgcaga atgggtttgc 19980
aaccatttgg tatttttgtt ttgtttttta gaggatgtat gtgtatttta acatttctta 20040
atcattttta gccagctatg tttgttttgc tgatttgaca aactacagtt agacagctat 20100
tctcattttg ctgatcatga caaaataata tcctgaattt ttaaattttg catccagctc 20160
taaattttct aaacataaaa ttgtccaaaa aatagtattt tcagccacta gattgtgtgt 20220
taagtctatt gtcacagagt cattttactt ttaagtatat gtttttacat gttaattatg 20280
tttgttattt ttaattttaa ctttttaaaa taattccagt cactgccaat acatgaaaaa 20340
ttggtcactg gaattttttt tttgactttt attttaggtt catgtgtaca tgtgcaggtg 20400
tgttatacag gtaaattgcg tgtcatgagg gtttggtgta caggtgattt cattacccag 20460
gtaataagca tagtacccaa taggtagttt tttgatcctc acccttctcc caccctcaag 20520
taggccctgg tgttgctgtt tccttctttg tgtccatgta tactcagtgt ttagctccca 20580
cttagaagtg agaacatgcg gtagttggtt ttctgttcct ggattagttc acttaggata 20640
atgacctcta gctccatctg gtttttatgg ctgcatagta ttccatggtg tatatgtatc 20700
acattttctt tatccagtct accattgata ggcatttagg ttgattccct gtctttgtta 20760
tcatgaatag tgctgtgatg aacatacaca tgcatgtgtc tttatggtag aaaaatttgt 20820
attcctttag gtacatatag aataatgggg ttgctagggt gaatggtagt tctattttca 20880
gttatttgag aaatcttcaa actgcttttc ataatagcta aactaattta cagtcccgcc 20940
agcagtgtat aagtgttccc ttttctccac aaccttgcca acatctgtga ttttttgact 21000
ttttaataat agccattcct agagaattga tttgcaattc tctattagtg atattaagca 21060
ttttttcata tgctttttag ctgtctgtat atattcttct gaaaaatttt catgtccttt 21120
gcccagtttg tagtggggtg ggttgttttt tgcttgttaa ttagttttaa gttccttcca 21180
gattctgcat atccctttgt tggatacatg gtttgcagat atttttctcc cattgtgtag 21240
gttgtctttt actctgttga tagtttcttt tgccatgcag gagctcgtta ggtcccattt 21300
gtgtttgttt ttgttgcagt tgcttttggc gtcttcatca taaaatctgt gccagggcct 21360
atgtccagaa tggtatttcc taggttgtct tccagggttt ttacaatttt agattttacg 21420
tttatgtctt taatccatct tgagttgatt tttgtatatg gcacaaggaa ggggtccagt 21480
ttcactccaa ttcctatggc tagcaattat cccagcacca tttattgaat acggagtcct 21540
ttccccattg cttgtttttt gtcaactttg ttgaagatca gatggttgta agtgtgtggc 21600
tttatttctt ggctctctat tctccattgg tctatgtgtc tgtttttata acagtaccct 21660
gctgttcagg ttcctatagc cttttagtat aaaatcggct aatgtgatgc ctccagcttt 21720
gttctttttg cttaggattg ctttggctat ttgggctcct ttttgggtcc atattaattt 21780
taaaacagtt ttttctggtt ttgtgaagga tatcattggt agtttatagg aatagcattg 21840
aatctgtaga ttgctttggg cagtatggcc attttaacaa tattaattct tcctatctat 21900
gaatatggaa tgtttttcca tgtgtttgtg tcatctcttt atacctgatg tataaagaaa 21960
agctggtatt attcctactc aatctgttcc aaaaaattga ggaggaggaa ctcttcccta 22020
atgaggccag catcattctg ataccaaaac ctggcagaga cacaacagaa aaaagaaaac 22080
ttcaggccaa tatccttgat gaatatagat gcaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac 22140
caaatccagc agcacatcaa aaagctgatc tactttgatc aagtaggctt tatccctggg 22200
atgcaaggtt ggttcaacat acacaaatca ataagtgtga ttcatcacat aaacagagct 22260
aaaaacaaaa accacaagat tatctcaata ggtagagaaa aggttgtcaa taaaatttaa 22320
catcctccat gttaaaaacc ttcagtaggt caggtgtagt gactcacacc tgtaatccca 22380
gcactttggg aggccaaggc gggcatatct cttaagccca ggagttcaag acgagcctag 22440
gcagcatggt gaaaccccat ctctacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatta gcttggtatg 22500
gtgacatgca cctatagtcc cagctattca ggaggttgag gtgggaggat tgtttgagcc 22560
cgggaggcag aggttggcag cgagctgaga tcatgccacc gcactccagc ctgggcaacg 22620
gagtgagacc ctgtctcaaa aaagaaaaat cacaaacaat cctaaacaaa ctaggcattg 22680
aaggaacatg cctcaaaaaa ataagaacca tctatgacag acccatagcc aatatcttac 22740
caaatgggca aaagctggaa gtattctcct tgagaaccgt aacaagacaa ggatgtccac 22800
tctcaccact ccttttcagc atagttctgg aagtcctagc cagagcaatc aggaaagaga 22860
aagaaagaaa gacattcaga taggaagaga agaagtcaaa ctatttctgt ttgcaggcag 22920
tataattctg tacctagaaa atctcatagt ctctgcccag aaactcctaa atctgttaaa 22980
aatttcagca aagttttggc attctctata ctccaacacc ttccaaagtg agagcaaaat 23040
caagaacaca gtcccattca caatagccgc aaaacgaata aaatacctag gaatccagct 23100
aaccagggag gtgaaagatc tctatgagaa ttacaaaaca ctgctgaaag aaatcagaga 23160
tgacacaaac aaatggaaat gttctttttt aacaccttgc tttatctaat tcacttatga 23220
tgaagatact cattcagtgg aacaggtata ataagtccac tcgattaaat ataagcctta 23280
ttctctttcc agagcccaag aaggggcact atcagtgccc agtcaataat gacgaaatgc 23340
taatattttt cccctttacg gtttctttct tctgtagtgt ggtacactcg tttcttaaga 23400
taaggaaact tgaactacct tcctgtttgc ttctacacat acccattctc tttttttgcc 23460
actctggtca ggtataggat gatccctacc actttcagtt aaaaactcct cctcttacta 23520
aatgttctct taccctctgg cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaaagatga 23580
aagggaggtg gggcctggga agggaataag tagtcctgtt tgtttgtgtg tttgctttag 23640
cacctgctat atcctaggtg ctgtgttagg cacacattat tttaagtggc cattatatta 23700
ctactactca ctctggtcgt tgccaaggta ggtagtactt tcttggatag ttggttcatg 23760
ttacttacag atggtgggct tgttgaggca aacccagtgg ataatcatcg gagtgtgttc 23820
tctaatctca ctcaaatttt tcttcacatt ttttggtttg ttttggtttt tgatggtagt 23880
ggcttatttt tgttgctggt ttgttttttg tttttttttg agatggcaag aattggtagt 23940
tttatttatt aattgcctaa gggtctctac tttttttaaa agatgagagt agtaaaatag 24000
attgatagat acatacatac ccttactggg gactgcttat attctttaga gaaaaaatta 24060
catattagcc tgacaaacac cagtaaaatg taaatatatc cttgagtaaa taaatgaatg 24120
tatattttgt gtctccaaat atatatatct atattcttac aaatgtgttt atatgtaata 24180
tcaatttata agaacttaaa atgttggctc aagtgaggga ttgtggaagg tagcattata 24240
tggccatttc aacatttgaa cttttttctt ttcttcattt tcttcttttc ttcaggaata 24300
tttttcaaga tgtcttacac agagacactc tagtgaaagc cttcctggat caggtaaatg 24360
ttgaacttga gattgtcaga gtgaatgata tgacatgttt tcttttttaa tatatcctac 24420
aatgcctgtt ctatatattt atattcccct ggatcatgcc ccagagttct gctcagcaat 24480
tgcagttaag ttagttacac tacagttctc agaagagtct gtgagggcat gtcaagtgca 24540
tcattacatt ggttgcctct tgtcctagat ttatgcttcg ggaattcaga cctttgttta 24600
caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat aataagatat aaagttgacc 24660
acaactactg ttttttgaaa catagaattc ctggtttaca tgtatcaaag tgaaatctga 24720
cttagctttt acagatataa tatatacata tatatatcct gcaatgcttg tactatatat 24780
gtagtacaag tatatatata tgtttgtgtg tgtatatata tatagtacga gcatatatac 24840
atattaccag cattgtagga tatatatatg tttatatatt aaaaaaaagt tataaactta 24900
aaaccctatt atgttatgta gagtatatgt tatatatgat atgtaaaata tataacatat 24960
actctatgat agagtgtaat atatttttta tatatatttt aacatttata aaatgataga 25020
attaagaatt gagtcctaat ctgttttatt aggtgctttt tgtagtgtct ggtctttcta 25080
aagtgtctaa atgatttttc cttttgactt attaatgggg aagagcctgt atattaacaa 25140
ttaagagtgc agcattccat acgtcaaaca acaaacattt taattcaagc attaacctat 25200
aacaagtaag tttttttttt ttttttgaga aagggaggtt gtttatttgc ctgaaatgac 25260
tcaaaaatat ttttgaaaca tagtgtactt atttaaataa catctttatt gtttcattct 25320
tttaaaaaat atctacttaa ttacacagtt gaaggaaatc gtagattata tggaacttat 25380
ttcttaatat attacagttt gttataataa cattctgggg atcaggccag gaaactgtgt 25440
catagataaa gctttgaaat aatgagatcc ttatgtttac tagaaatttt ggattgagat 25500
ctatgaggtc tgtgacatat tgcgaagttc aaggaaaatt cgtaggcctg gaatttcatg 25560
cttctcaagc tgacataaaa tccctcccac tctccacctc atcatatgca cacattctac 25620
tcctacccac ccactccacc ccctgcaaaa gtacaggtat atgaatgtct caaaaccata 25680
ggctcatctt ctaggagctt caatgttatt tgaagatttg ggcagaaaaa attaagtaat 25740
acgaaataac ttatgtatga gttttaaaag tgaagtaaac atggatgtat tctgaagtag 25800
aatgcaaaat ttgaatgcat ttttaaagat aaattagaaa acttctaaaa actgtcagat 25860
tgtctgggcc tggtggctta tgcctgtaat cccagcactt tgggagtccg aggtgggtgg 25920
atcacaaggt caggagatcg agaccatcct gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa 25980
gtatacaaaa attagctggg cgtggcagcg tgtgcctgta atcccagcta cctgggaggc 26040
tgaggcagga gaatcgcttg aacccaggag gtgtaggttg cagtgagtca agatcgcgcc 26100
actgcacttt agcctggtga cagagctaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aaaatatcag 26160
attgttccta cacctagtgc ttctatacca cactcctgtt agggggcatc agtggaaatg 26220
gttaaggaga tgtttagtgt gtattgtctg ccaagcactg tcaacactgt catagaaact 26280
tctgtacgag tagaatgtga gcaaattatg tgttgaaatg gttcctctcc ctgcaggtct 26340
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 26400
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgtga gtaaaactcc 26460
tacacggaag aaaaaccttt gtacattgtt tttttgtttt gtttcctttg tacattttct 26520
atatcataat ttttgcgctt cttttttttt tttttttttt tttttttcca ttatttttag 26580
gcagaaggga aaaaagccct ttaaatctct tcggaacctg aagatagacc ttgatttaac 26640
agcagagggc gatcttaaca taataatggc tctggctgag aaaattaaac caggcctaca 26700
ctcttttatc tttggaagac ctttctacac tagtgtgcaa gaacgagatg ttctaatgac 26760
tttttaaatg tgtaacttaa taagcctatt ccatcacaat catgatcgct ggtaaagtag 26820
ctcagtggtg tggggaaacg ttcccctgga tcatactcca gaattctgct ctcagcaatt 26880
gcagttaagt aagttacact acagttctca caagagcctg tgaggggatg tcaggtgcat 26940
cattacattg ggtgtctctt ttcctagatt tatgcttttg ggatacagac ctatgtttac 27000
aatataataa atattattgc tatcttttaa agatataata ataggatgta aacttgacca 27060
caactactgt ttttttgaaa tacatgattc atggtttaca tgtgtcaagg tgaaatctga 27120
gttggctttt acagatagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtagaattac 27180
tgtaatactt ctgcaatcaa ctgaaaacta gagcctttaa atgatttcaa ttccacagaa 27240
agaaagtgag cttgaacata ggatgagctt tagaaagaaa attgatcaag cagatgttta 27300
attggaattg attattagat cctactttgt ggatttagtc cctgggattc agtctgtaga 27360
aatgtctaat agttctctat agtccttgtt cctggtgaac cacagttagg gtgttttgtt 27420
tattttattg ttcttgctat tgttgatatt ctatgtagtt gagctctgta aaaggaaatt 27480
gtattttatg ttttagtaat tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc 27540
caaattgaaa tgtgcacctc ctgtgccttt tttctcctta gaaaatctaa ttacttggaa 27600
caagttcaga tttcactggt cagtcatttt catcttgttt tcttcttgct aagtcttacc 27660
atgtacctgc tttggcaatc attgcaactc tgagattata aaatgcctta gagaatatac 27720
taactaataa gatctttttt tcagaaacag aaaatagttc cttgagtact tccttcttgc 27780
atttctgcct atgtttttga agttgttgct gtttgcctgc aataggctat aaggaatagc 27840
aggagaaatt ttactgaagt gctgttttcc taggtgctac tttggcagag ctaagttatc 27900
ttttgttttc ttaatgcgtt tggaccattt tgctggctat aaaataactg attaatataa 27960
ttctaacaca atgttgacat tgtagttaca caaacacaaa taaatatttt atttaaaatt 28020
ctggaagtaa tataaaaggg aaaatatatt tataagaaag ggataaaggt aatagagccc 28080
ttctgccccc cacccaccaa atttacacaa caaaatgaca tgttcgaatg tgaaaggtca 28140
taatagcttt cccatcatga atcagaaaga tgtggacagc ttgatgtttt agacaaccac 28200
tgaactagat gactgttgta ctgtagctca gtcatttaaa aaatatataa atactacctt 28260
gtagtgtccc atactgtgtt ttttacatgg tagattctta tttaagtgct aactggttat 28320
tttctttggc tggtttattg tactgttata cagaatgtaa gttgtacagt gaaataagtt 28380
attaaagcat gtgtaaacat tgttatatat cttttctcct aaatggagaa ttttgaataa 28440
aatatatttg aaattttgcc tctttcagtt gttcattcag aaaaaaatac tatgatattt 28500
gaagactgat cagcttctgt tcagctgaca gtcatgctgg atctaaactt tttttaaaat 28560
taattttgtc ttttcaaaga aaaaatattt aaagaagctt tataatataa tcttatgtta 28620
aaaaaacttt ctgcttaact ctctggattt cattttgatt tttcaaatta tatattaata 28680
tttcaaatgt aaaatactat ttagataaat tgtttttaaa cattcttatt attataatat 28740
taatataacc taaactgaag ttattcatcc caggtatcta atacatgtat ccaaagtaaa 28800
aatccaagga atctgaacac tttcatctgc aaagctagga ataggtttga cattttcact 28860
ccaagaaaaa gttttttttt gaaaatagaa tagttgggat gagaggtttc tttaaaagaa 28920
gactaactga tcacattact atgattctca aagaagaaac caaaacttca tataatacta 28980
taaagtaaat ataaaatagt tccttctata gtatatttct ataatgctac agtttaaaca 29040
gatcactctt atataatact attttgattt tgatgtagaa ttgcacaaat tgatatttct 29100
cctatgatct gcagggtata gcttaaagta acaaaaacag tcaaccacct ccatttaaca 29160
cacagtaaca ctatgggact agttttatta cttccatttt acaaatgagg aaactaaagc 29220
ttaaagatgt gtaatacacc gcccaaggtc acacagctgg taaaggtgga tttcatccca 29280
gacagttaca gtcattgcca tgggcacagc tcctaactta gtaactccat gtaactggta 29340
ctcagtgtag ctgaattgaa aggagagtaa ggaagcaggt tttacaggtc tacttgcact 29400
attcagagcc cgagtgtgaa tccctgctgt gctgcttgga gaagttactt aacctatgca 29460
aggttcattt tgtaaatatt ggaaatggag tgataatacg tacttcacca gaggatttaa 29520
tgagacctta tacgatcctt agttcagtac ctgactagtg cttcataaat gctttttcat 29580
ccaatctgac aatctccagc ttgtaattgg ggcatttaga acatttaata tgattattgg 29640
catggtaggt taaagctgtc atcttgctgt tttctatttg ttctttttgt tttctcctta 29700
cttttggatt tttttattct actatgtctt ttctattgtc ttattaacta tactctttga 29760
tttattttag tggttgtttt agggttatac ctctttctaa tttaccagtt tataaccagt 29820
ttatatacta cttgacatat agcttaagaa acttactgtt gttgtctttt tgctgttatg 29880
gtcttaacgt ttttatttct acaaacatta taaactccac actttattgt tttttaattt 29940
tacttataca gtcaattatc ttttaaagat atttaaatat aaacattcaa aacaccccaa 30000
t 30001
<210> 3
<211> 1031
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
attcccggga tacgtaacct acggtgtccc gctaggaaag agaggtgcgt caaacagcga 60
caagttccgc ccacgtaaaa gatgacgctt ggtgtgtcag ccgtccctgc tgcccggttg 120
cttctctttt gggggcgggg tctagcaaga gcaggtgtgg gtttaggaga tatctccgga 180
gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc accgccatct 240
ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt agcagctact 300
tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc tccaaagaca 360
gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac tctaaatgga 420
gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt cttgtctgaa 480
aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga tcgcagcaca 540
tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc acttcataga 600
gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat gcataaggaa 660
agacaagaaa aatgtccaga agattatctt agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg 720
tcagagtatt attccaatgc ttactggaga agtgattcct gtaatggaaa ctgctttcct 780
ctatgaaatt cccccgggtt cctggaggaa atagatatag gctgatacag ttacccaatg 840
atggatgaat attgggggac cgcctggtca ttgaaaggct ttcttttctc caggaaagaa 900
atttttttcc ttttccataa aaagcttggg aatggaagac aacaattccc attctttttt 960
tgcgttccac ccctatgtga caacagaaat ttttggggaa acaacaacga aaaaatttta 1020
tcccgcgcgc a 1031
<210> 4
<211> 3244
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag 60
tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtgatg tcgactcttt 120
gcccaccgcc atctccagct gttgccaaga cagagattgc tttaagtggc aaatcacctt 180
tattagcagc tacttttgct tactgggaca atattcttgg tcctagagta aggcacattt 240
gggctccaaa gacagaacag gtacttctca gtgatggaga aataactttt cttgccaacc 300
acactctaaa tggagaaatc cttcgaaatg cagagagtgg tgctatagat gtaaagtttt 360
ttgtcttgtc tgaaaaggga gtgattattg tttcattaat ctttgatgga aactggaatg 420
gggatcgcag cacatatgga ctatcaatta tacttccaca gacagaactt agtttctacc 480
tcccacttca tagagtgtgt gttgatagat taacacatat aatccggaaa ggaagaatat 540
ggatgcataa ggaaagacaa gaaaatgtcc agaagattat cttagaaggc acagagagaa 600
tggaagatca gggtcagagt attattccaa tgcttactgg agaagtgatt cctgtaatgg 660
aactgctttc atctatgaaa tcacacagtg ttcctgaaga aatagatata gctgatacag 720
tactcaatga tgatgatatt ggtgacagct gtcatgaagg ctttcttctc aatgccatca 780
gctcacactt gcaaacctgt ggctgttccg ttgtagtagg tagcagtgca gagaaagtaa 840
ataagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa tgctccaggt 900
tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa ggcctgctaa 960
aggattcaac tggaagcttt gtgctgcctt tccggcaagt catgtatgct ccatatccca 1020
ccacacacat agatgtggat gtcaatactg tgaagcagat gccaccctgt catgaacata 1080
tttataatca gcgtagatac atgagatccg agctgacagc cttctggaga gccacttcag 1140
aagaagacat ggctcaggat acgatcatct acactgacga aagctttact cctgatttga 1200
atatttttca agatgtctta cacagagaca ctctagtgaa agccttcctg gatcaggtct 1260
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 1320
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgcag aagggaaaaa 1380
agccctttaa atctcttcgg aacctgaaga tagaccttga tttaacagca gagggcgatc 1440
ttaacataat aatggctctg gctgagaaaa ttaaaccagg cctacactct tttatctttg 1500
gaagaccttt ctacactagt gtgcaagaac gagatgttct aatgactttt taaatgtgta 1560
acttaataag cctattccat cacaatcatg atcgctggta aagtagctca gtggtgtggg 1620
gaaacgttcc cctggatcat actccagaat tctgctctca gcaattgcag ttaagtaagt 1680
tacactacag ttctcacaag agcctgtgag gggatgtcag gtgcatcatt acattgggtg 1740
tctcttttcc tagatttatg cttttgggat acagacctat gtttacaata taataaatat 1800
tattgctatc ttttaaagat ataataatag gatgtaaact tgaccacaac tactgttttt 1860
ttgaaataca tgattcatgg tttacatgtg tcaaggtgaa atctgagttg gcttttacag 1920
atagttgact ttctatcttt tggcattctt tggtgtgtag aattactgta atacttctgc 1980
aatcaactga aaactagagc ctttaaatga tttcaattcc acagaaagaa agtgagcttg 2040
aacataggat gagctttaga aagaaaattg atcaagcaga tgtttaattg gaattgatta 2100
ttagatccta ctttgtggat ttagtccctg ggattcagtc tgtagaaatg tctaatagtt 2160
ctctatagtc cttgttcctg gtgaaccaca gttagggtgt tttgtttatt ttattgttct 2220
tgctattgtt gatattctat gtagttgagc tctgtaaaag gaaattgtat tttatgtttt 2280
agtaattgtt gccaactttt taaattaatt ttcattattt ttgagccaaa ttgaaatgtg 2340
cacctcctgt gccttttttc tccttagaaa atctaattac ttggaacaag ttcagatttc 2400
actggtcagt cattttcatc ttgttttctt cttgctaagt cttaccatgt acctgctttg 2460
gcaatcattg caactctgag attataaaat gccttagaga atatactaac taataagatc 2520
tttttttcag aaacagaaaa tagttccttg agtacttcct tcttgcattt ctgcctatgt 2580
ttttgaagtt gttgctgttt gcctgcaata ggctataagg aatagcagga gaaattttac 2640
tgaagtgctg ttttcctagg tgctactttg gcagagctaa gttatctttt gttttcttaa 2700
tgcgtttgga ccattttgct ggctataaaa taactgatta atataattct aacacaatgt 2760
tgacattgta gttacacaaa cacaaataaa tattttattt aaaattctgg aagtaatata 2820
aaagggaaaa tatatttata agaaagggat aaaggtaata gagcccttct gccccccacc 2880
caccaaattt acacaacaaa atgacatgtt cgaatgtgaa aggtcataat agctttccca 2940
tcatgaatca gaaagatgtg gacagcttga tgttttagac aaccactgaa ctagatgact 3000
gttgtactgt agctcagtca tttaaaaaat atataaatac taccttgtag tgtcccatac 3060
tgtgtttttt acatggtaga ttcttattta agtgctaact ggttattttc tttggctggt 3120
ttattgtact gttatacaga atgtaagttg tacagtgaaa taagttatta aagcatgtgt 3180
aaacattgtt atatatcttt tctcctaaat ggagaatttt gaataaaata tatttgaaat 3240
tttg 3244
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (693)..(693)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (722)..(722)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60
taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag 120
agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag 180
cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca 240
tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300
ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg 360
ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag 420
agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt 480
gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg 540
tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca 600
ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc 660
tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc 720
tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g 761
<210> 6
<211> 1901
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120
agtgatgtcg actctttgcc caccgccatc tccagctgtt gccaagacag agattgcttt 180
aagtggcaaa tcacctttat tagcagctac ttttgcttac tgggacaata ttcttggtcc 240
tagagtaagg cacatttggg ctccaaagac agaacaggta cttctcagtg atggagaaat 300
aacttttctt gccaaccaca ctctaaatgg agaaatcctt cgaaatgcag agagtggtgc 360
tatagatgta aagttttttg tcttgtctga aaagggagtg attattgttt cattaatctt 420
tgatggaaac tggaatgggg atcgcagcac atatggacta tcaattatac ttccacagac 480
agaacttagt ttctacctcc cacttcatag agtgtgtgtt gatagattaa cacatataat 540
ccggaaagga agaatatgga tgcataagga aagacaagaa aatgtccaga agattatctt 600
agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg tcagagtatt attccaatgc ttactggaga 660
agtgattcct gtaatggaac tgctttcatc tatgaaatca cacagtgttc ctgaagaaat 720
agatatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagctgtc atgaaggctt 780
tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaagctggat gaagcagata ccatcttatg 840
ctcacctatg acaagatttg gaagaaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta 900
gggacattac gtatttgaac tgttgcttaa atttgtgtta tttttcactc attatatttc 960
tatatatatt tggtgttatt ccatttgcta tttaaagaaa ccgagtttcc atcccagaca 1020
agaaatcatg gccccttgct tgattctggt ttcttgtttt acttctcatt aaagctaaca 1080
gaatcctttc atattaagtt gtactgtaga tgaacttaag ttatttaggc gtagaacaaa 1140
attattcata tttatactga tctttttcca tccagcagtg gagtttagta cttaagagtt 1200
tgtgccctta aaccagactc cctggattaa tgctgtgtac ccgtgggcaa ggtgcctgaa 1260
ttctctatac acctatttcc tcatctgtaa aatggcaata atagtaatag tacctaatgt 1320
gtagggttgt tataagcatt gagtaagata aataatataa agcacttaga acagtgcctg 1380
gaacataaaa acacttaata atagctcata gctaacattt cctatttaca tttcttctag 1440
aaatagccag tatttgttga gtgcctacat gttagttcct ttactagttg ctttacatgt 1500
attatcttat attctgtttt aaagtttctt cacagttaca gattttcatg aaattttact 1560
tttaataaaa gagaagtaaa agtataaagt attcactttt atgttcacag tcttttcctt 1620
taggctcatg atggagtatc agaggcatga gtgtgtttaa cctaagagcc ttaatggctt 1680
gaatcagaag cactttagtc ctgtatctgt tcagtgtcag cctttcatac atcattttaa 1740
atcccatttg actttaagta agtcacttaa tctctctaca tgtcaatttc ttcagctata 1800
aaatgatggt atttcaataa ataaatacat taattaaatg atattatact gactaattgg 1860
gctgttttaa ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1901
<210> 7
<211> 562
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(166)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagagatatc tccggagcat ttggataatg 60
tgacagttgg aatgcagtga tgtcgactct ttgcccaccg ccatctccag ctgttgccaa 120
gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa gg 562
<210> 8
<211> 798
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
gggctctctt ttgggggcgg ggtctagcaa gagcagatat ctccggagca tttggataat 60
gtgacagttg gaatgcagtg atgtcgactc tttgcccacc gccatctcca gctgttgcca 120
agacagagat tgctttaagt ggcaaatcac ctttattagc agctactttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa ggcacagaga gaatggaaga tcagggtcag agtattattc 600
caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg aaatcacaca 660
gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat atttggtgac 720
agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa aagctgggat 780
gaagccagat tcccatct 798
<210> 9
<211> 169
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct 60
gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt 120
ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc 169
<210> 10
<211> 176
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga 60
gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120
agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176
<210> 11
<211> 30001
<212> DNA
<213> macaca mulatta
<220>
<221> misc_feature
<222> (26113)..(26155)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (28797)..(29186)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
aatctctaag caattttttg gggaagaaag aattgcaatt agggcatacg tgtagatcag 60
atggtcttcg gtatatccaa cgacaaagaa aaggtgggag gtttcgttaa aaaagagaaa 120
tgttacatag tacttttaga gaaaattcac tggcactatt aagggtctga ggagctggta 180
agtttcaatt ggtgagtgat ggtggtagat aaaattagag ctgcagcagg tcatttcagc 240
aactatcaga taaaactggt ctcaggtcac aacgggcagt ttcagcagct agacttgaaa 300
gaattacact gcgggagcaa tgtcatttgt cctgcatgct tttctacccc ctacccccac 360
ttttttagtt gggtataaca agaacgaccc aaattgtatg atcaactttc acaaagcata 420
gaacagtagg aaaagggtct gtttctgcag aagatgtaga cgttgagagc cattttatgt 480
atttatttct ccctttcttc atcggtgaat gattaaaatg ttctgtatga tttttagtga 540
tgagaaaggt taaacgccac tcatctgtag taagtgtaat ctacacactt gcagaccaaa 600
aggcataagg tttaaaaaac ctttgttttt ttacacatca aacagagtgg tataaatgct 660
actcatctgt agtaagtgaa atctatacac ctgcagacca acgacgcaag gtttcaaaaa 720
tctttgtgtt ttttacacat caaacagaat ggtacatttt tcaaaagttt aaaaaaaaaa 780
aaaatccaca tatcacaact agcaaaaatg acattcccca gtgtgaaaat catgcttgag 840
agaattctta catgtaaagg caaaattgca gtgactttac aagggacctg gggattcccg 900
cccacagtgt ggagctgtcc cctaccaggg tttgcggcgg agttttgaat gtacttaaca 960
gtgtctcacg gtaaaaacaa aacttcatcc accaaatatt tgttgagcgc ccactgcctg 1020
ccaagcacaa acaaaaccat tcaaaaccac gaaatcgtct gcactttctc cggatccagc 1080
agcctctgcg attaaggttt gcacacgcta ttgcgccaac gctcctccag agcgcgtctt 1140
aagataaaag aatgggacaa gttgcccctc cccctttcac gggcctcgtg cgtcaacgtc 1200
atcgcatata gaaaacacac agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagaggcgcg 1260
tcaaacagcg acaagttccg cccacgtaaa agatgacgct tggtgcgtca gccgtccctg 1320
ctgcccggtt ccttctctct gggggcgggg cctggctaga gcaggtgtgg gtttaggagg 1380
tgtgtgtttt tgtttttcct accctctccc ctctacttgc tctcacagta ctcgctgagg 1440
gtgaacaaga aaagacctga taaagattaa ccagaagaaa acaaagaggg aaacaactgc 1500
agcctgtagc gggctctgga gcttaagaga ggcgcgctag gcgccgggcc gtgggcgtgg 1560
tcggggcggg gtcgggccag gggcggggct gcggttgcgg tccctgcgcc cgcggcggcg 1620
gcggcggcgg cagcggaggc gcaggcggtg gcgagtgggt gagtgaagag gcggcgtcct 1680
ggcgggtgtc tgtttggcgt ccggttgccg ggaagagacg cgggtagcag ccggggctct 1740
cctcagagct cgacacattt ttactttccc tctcgtttct ctgaccgaag tcgggtgtcc 1800
ggctttcgcc tctagcgact ggtggaattg cctgcatctg ggccccgggc ttcgcggcgg 1860
cgcagggacg agggatggga atctggcctc ttcctcgctt tcccgcccgc agtgcgctgc 1920
cccagctgtc tccttcccgg ggacctgctg ggagcgctgc cgctacagac tcgagagaaa 1980
ggagcctcgg gcactgagag gcctcgcccg ggggaaggcc ggagggcggg cggcgggcgg 2040
cgagcggctc ctgcggacca agtctgggtt ctctgggaac ccgagacggt ccctgatggc 2100
gaggagatca tgcggggtgc tatgggggtg tggagacgtc tgcagaattt tagcccaagc 2160
ttctaaggag tgctgatgac ttgcatatga gggcagcaat gccagtcggt gtactcccta 2220
ttctgtggga catgatgtgg ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg 2280
aagtgaccat tgtgacttgg gcatcacttg actgatggta atcagttgca gacagaagtg 2340
cacagattac atgtctgtgt ccacactgga tcagtctggc cacgaggaac accacaggct 2400
ttgtattgag aaacaggagg gaggtcctgc actttcccag gaggggtggc cctttcagat 2460
gcaatcgaga ttgttaggct ctggtagagt ggttgcctgg ttgtggcagt tggcaaattc 2520
ctattcaaac tgttgccgtg cgtcaccagt taacaacaag ggtacacgat ctgtctggca 2580
ttacttctac tttgtacaaa ggatcaaaaa tactgttaga tatgattttt ctcagacttt 2640
gggaaacttt taacgtaatc tgtgaatatc acagaagcaa gactgtcata tagaggatat 2700
taataacctg gagtcagaat acttgaaata tggtgtcatt tgacacgggc tctgttatca 2760
ccacctttgc caagcccttt cacttgagga aaaccctcaa tcagttggaa actgcctcat 2820
gctgacagta catctgaaac aaaaacgaga gtagttacca cattccagat tgttcactaa 2880
ggcagcattt atctgctcca ggaaaacatt acaagcaact tatgaagttg ataaaatatt 2940
ttgtttggct atgttggtac tccaaaagtt gctttcagag aaacaaagta aaccaaggag 3000
gacttctgtt gttcacgtct gcccttgggc tctattctac gttaattagg tagttcccag 3060
gaggactaga ttagcctacc tattgtctga gaaacttgga tctgtgagaa atggccagat 3120
agtgatacga acttcacctc ccagtctttc ctgatgttta agattgagaa agtgttgtga 3180
actttctggt gctgtaagca gttcactgtc cttaaagtgg tcctgggcag ctcctgttgt 3240
ggaaagtgga ccgatttagg attctgcttg gctttggact gggagaaaat aaactgcatg 3300
gttacaagta ttgagagcca agttggagaa ggtggcttac acctataatg ccagagcctt 3360
aggaggcagg ggcaagagga tcactggaag tcaggagttc aagcccaacc tgggcagcct 3420
agaccctgtc tctacaaaaa attaaaaact tagccgggcg cggtggtgtg cacctgtagt 3480
cctagctact tgggaggctg aggcaggagg gtcttttgag cccaggagtt tgaagttaca 3540
gggagctatg atcctgccag tgcactccag cctggatggc aaaacgagac cctgtctcta 3600
aaaaacaaga agtgagggct ttatgatcgt agaaattttg cttacaatag cagtggacca 3660
accacctttc taaataccaa tcagggaaga catagttgat ttttaacaaa catttaaaga 3720
aaaagcaaaa cctcaaactt agcactctac taacagtttt agccgatgct aattaaggta 3780
atcatgtctg catatatggg attactttca gaaagtgtat tgggaaacct ctcatgaacc 3840
ctgtgcaacc ctgagcaagc caccgtctca ctcagtttga atcttggctt ccctcaaaag 3900
actctgtggc taatgtttgg taactctctg gagtagccag cactgcatgt acataggata 3960
ggtacataaa acaattattg gttttgagct gatttttttc agctgcattt gcgtgtatgg 4020
atttttctca ccaaagacaa tgacttcaag tgttaataaa ataattgtac agctctccta 4080
attatacttc tctgtaacat ttcatttctc agactatttc ttttggtagg atttaaaact 4140
aaacaattca gtatgatctt tgttcttcat tttctttctt attctttttt ttttcgagac 4200
agagtctccc tctgttgtgc catctcagcc cattgcaacc tccgccacct gggttcaagt 4260
gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gtgcccgcca ccacacctac 4320
ctaatttttt gtatttttag tagaggcggg gtttcaccat gttggctagg ctggtcttaa 4380
actcctgacc tcagatgatc cacctgcctc ggcctcccaa agagctggga tgataggcgt 4440
gacccaccat gcccgcccca ttttttttct tattctgtta ggagtgagag tgtaactagc 4500
agtctataat agttcaattt tcacaacgtg gtaaaaattt tccctgtaat tcaacgagat 4560
tttgcttcag ggctcagttc tgttttagga aatactttta ttttcagttt gatgatgaaa 4620
tattagagtt gtgatattgc ctttatgatt acctaccttt ttaacctaaa agaatgaaag 4680
aaaaatatgt ttacagtata attgtatggt tgcgtgttaa cttaattcat tatgttggcc 4740
tccagtttgc tgttgttcgt tatgacagca gtagtgtcat taccatttca attcagatta 4800
cattcctgta tttgatcatt gtaaactgat tgcttaaatt gtattaaaaa cagtggatat 4860
tttaaacaag ctgtactgct tatatccagt gctgtctcct aagactatta aattgatata 4920
acatatttaa aagtaaatat ttcctaaatg aatttttgaa attaaaaata cacgtgttaa 4980
aactgtcttt gtgttcaacc atttctgtac gtacttagag ttaactgttt tgccaggctc 5040
tgtatgccta ctcataatgt gataaaagca ctcatctaat gctctataaa tagaagtcag 5100
tgctttccat cagactgaac actcttggca agatgtggat aaaattattt aagtaaaatt 5160
gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc caaagcaatc atatggcaaa 5220
gataggcata tcataatttg cctattagct gctttgtatt gctattatga tagatttcac 5280
agttttagat ctgcttagat gaaaatgtaa ttctttttac tgtcagtctt agatataagt 5340
cttcaattat agtacagtca cacattgctt aggaatgcat cattaggcga ttttgtcatt 5400
atgcaaacat catagagtat acttacataa acctatatag tacagccttt acgtacgtag 5460
gccatatggt atagtctatt gctcctaggc tacaaatctg tacagctgtt actgtactga 5520
atactataga cagttgtaac acagtggtat ttatttatct aaatatatcc aaacatagaa 5580
aaggtacagt taaagtatgg tataaaaaat aatgatatac ctatataggc cacttaccgt 5640
gaatggagct tgcaggacta gaagttgctc tgggtgagtc agtaagtaag tggtgaatga 5700
atgtgaaggc ctagaacatt actgtacaca ctgtagactt tataaacaca gtatgcttaa 5760
gctacaccaa atttatcttt acagtttttc ttcaataaaa aattaatgtg aacctactat 5820
aactttttaa ctttgtaaac tttttaattt tttaactttt aaaatactta gcttgaaaca 5880
caaacacgca tagctataca aaaatatttt ttctttatat ccttattcta gaagcttttt 5940
cctattttta actttttttt ttttacttgt tagtcgtttt tgttaaaaac taaaacacac 6000
acactttcac ctaagcatag acaggattag gatcatcagt ttcactccct tccacctcac 6060
tgccttccac ctccacatct tgtcccactg gaacgttttt agggggaata acacacatgt 6120
agctgtcacc tgctatgata acagtgcttt ctgttgaata cctcctgaag gacctgcctg 6180
aggctgtttt acatttaact taaaaaaaaa aataagtaga aggagtacac tctaaaataa 6240
caataaaagg tatagtctag tgaatacata aaccagcaac atagtagttt attatcaagt 6300
gttgtatact gtaataattg tatgtgctat actttaaatg acttgaaaaa ttgtactaag 6360
accttatgat ggttacagtg tcactaaggc gatagcatat tttcaggtcc attgtaatct 6420
aatgggacca ccatcatata tgcagtccac cattgactga aatgttacat ggtacgtaac 6480
tgtatttgca agaatgattt gttttacatt aatatcacat aggatgtacc tttttagagt 6540
gatatgttta tgtggattaa gatgtacaag tggagcaagg ggacaagagc ccttggttct 6600
gtcttggatg tgagctttta tgctcttctc atcatgtctg ttttcttatt aaattcaaag 6660
gcttggacag gccctattta gcccttgttt tctatgtgtt ctaaataact aaagctttta 6720
aattctagcc atttagtgga gaactctctt tgcaatggta aaatgctgta ttggtttctt 6780
gactagcata ttaaatatat ttatctttgt cttgatattt caatgtcatt ttaaacatca 6840
ggattgggct ttagtattct catacccaga gagttcactg aggatacagg actgtttgcc 6900
cattttttgt tatggctcca gacttgtggt atttcgatgt cttttttttt tttttttttt 6960
tttaaccttt tagcagcttt aaagtatttc tgttgttagg tgttgtatta cttttctaag 7020
attactgtaa caaagcacca caaactgagt ggctttaaac aacagcaatt tattctctca 7080
caattctaga agctagaagt ccgaaatgga agtgttgatg gggcatgatc ctcaaaagag 7140
agaagactct ttccttgcct cttcctggct tctggtggtt accagcaatc ctgagcgttc 7200
ctttcttgct tcgtagtttc agcagtccag tatctgcctt ttgtcttcac atggatgtct 7260
accccttgtc tctgtgtctc cagatctctc tccttataaa cacagaagtt actggattag 7320
gccccactct aatccagtat gaccccattt taacacgatt acacctattt ctaaataagg 7380
tcacattcac atataccaag ggttaggaat tgagcatatc ttttgcaggg acacaattca 7440
acccacaagt gtcagtctct agctgagcct ttcccttcct ggttttctcc tttttagttg 7500
ctgtgggtta ggggccaaat ctccagtcat actagacttg cacatggact ggagatttgg 7560
gaatactgcg ggtctattct atgagcttta gtatgtaaca tttaatatca gtgtaaagaa 7620
gccatttttt cagttcacta tttctttgaa tttcttaatg tatgccctga atataagtaa 7680
caagttacta tgtctcataa aatgatcata tcaacaaaca tttaatgtgc acctactgtg 7740
ctagttgaat gtctttatcc tgataggaga taacaggctt ccgcatcttt gacttaagag 7800
gacaaaccaa gtatgtctga atcatttggg gttttgatgg atatctttaa attgctgaac 7860
ctaatcattg gttttatatg tcattgttta gatatctcag gagcatttgg ataatgtgac 7920
agttggaatg cagtgatgtc gactctttgc ccaccgccat ctccagctgt tgccaagaca 7980
gagattgctt taagtggtga atcaccttta ttagcagcta cttttgctta ctgggacaat 8040
attcttggtc ctagagtaag gcacatttgg gctccaaaga cagaacaggt acttctcagt 8100
gatggagaaa taacttttct tgccaaccac actctaaatg gagaaatcct tcgaaatgca 8160
gagagtggtg ctatagatgt aaagtttttt gtcttgtctg aaaagggagt gattattgtt 8220
tcattaatct ttgatggaaa ctggaatggg gatcgcagca catacggact atcaattata 8280
cttccacaga cagaacttag tttctacctc ccacttcata gagtgtgtgt tgatagatta 8340
acacatataa tccggaaagg aagaatatgg atgcataagg taagtgattt ttcagcttat 8400
taatcatgtt aacctatctt ttgaaagctt attttctgat acatataaat cttattttta 8460
aattatatgc agtgaacatc aaacaataga tattatttat tttgcattta tcctgttaga 8520
tacaaataca tctggtctga tgcctgtcat cttcatatta actgtggaag gtaggaaatg 8580
gtagctccac attacagatg aaaagctaaa gcttaaacaa atgcagaaac ttttagatcc 8640
tggattcttc ttgggagcct ttgactctaa taccttttgt ttccctttca ttgcacaatc 8700
ctgtctttcg cttactacta tgtgtaagta taacagttca aaaaaatagt ttcataagct 8760
gttggttatg tagcctttgg tctctttaac ctctttgcca agttcccagg ttcataaaat 8820
gaggaggttg aaccgcatgg ttcccaagag aattcctttt aattttacag aaattattgt 8880
tttccccgaa gtcctatagt tcaatatata atgatattta catttcagta tagttttggc 8940
atatctaaag aacacattaa gttctccttc ctgtgttcca gtttgatact aacctggaag 9000
tccattaagc attaccaatt ttaaaaggct tttgcccaat agtaaggaaa aataatatct 9060
tttaaaagaa taatttttta ctatgtttgc aggcttactt ccttttttct cacattatga 9120
aactcttaaa atcaggagaa tcttttaaac atcataatgt ttaatttgaa aagtgcaagt 9180
cattcttttc ctttttgaaa ctatgcagat gttacattga ctattttctg tgaagttatc 9240
ttttttttcc ctgcagaata aagggtgttt tgattttatt ttgtgttgtt tataagaaca 9300
tacattcgtt gggttaattt cctgcccctg cccccgtttt ttccctaaag tagaaagtat 9360
ttttcttgtg aactaaatta ctacacaaga acatgtctat tgaaaaataa gtatcaaaat 9420
gttgtgggtt gtttttttaa ataaattctt tcttgctcag gaaagacaag aaaatgtcca 9480
gaagattatc ttagaaggca cagagagaat ggaagatcag gtatatgcag attgcatact 9540
gtcaaatatt attctcatgg catgtatctg tgtaaagttg atggctacat ttgtgaaggc 9600
cttggggaca tacagagtaa gccttaatgg agcttttatg gaggtgtaca gaataaacta 9660
gaggaagatt tccatatctt agacctgaag agttaaatca gtaaacaaag gaaaatagta 9720
attgcatcta caaattaata tttgctccct ttttttttct gtttgaacag aataaatttt 9780
ggataacttg ttactagtaa aaaatttaaa aattgtctgt gatatgttct ttaaggtact 9840
acttctcgaa ctttttccta gaagtagctg taacaggagg agagcatatg tacccctaag 9900
gtatctgggg tataggccca tgtccaaaca atatttcttt taagtcttgt gttgtatctt 9960
taagactcat gcaatttaca ttttattcca tgatataact attttaatat taaaatttgt 10020
cagtgatatt tcttaccctc tcctctagga aaatgtgcca tgtttatact ttggctttga 10080
gtgcccctga ggaacagaca ctagagtttg agaagcatgg ttacacaggc gtggcttccc 10140
ctgcagaaat taagtacaga ctatttcagt gtaaagcaga gaagttcttt tgaaggggaa 10200
tctccagtga agaaagggtt cttcactttt acttccattt cctcttgagg gtgaccctca 10260
ttgctccttg taaaactccg atattttaaa catggctgtt ttgctttcct ctggttcttt 10320
ttaacatgag tgagacagat gatactttaa aaagtaattt taaaaaaaag tgttaaaata 10380
tatggccata atgcagaacc ctatgctgtg atctccttta ccaaattgtt gtgtttgtac 10440
ttttgtagat agctttccag tccagagaca gttattctgt gtaaaggtct gactcaacaa 10500
gaaaagattt ccctttaccc aaagaatgcc agtctttatt tgctggtcaa taagcagggt 10560
ccccaggaaa ggggtaactt tcaccaccct ctaacccact ggttattagt aaactaatta 10620
agtagactta tctcaagatg aggaaactta aaaccaagta aaattctgct tttactggga 10680
ttttattttt tgaaaccaga aacgtttact taagttgact actattaatg aattttggtc 10740
tctcttttaa gtactcttct taaaaatgtt atcctactgc tgagaagttc aagtttgaga 10800
agtacaagga ggaatagaaa cttgagagat tttctttttc ttttagagcc tcttctgtat 10860
ttagccctgt aggaattttt tttttccccc aagattcttc ttcgtgaaaa ggaggagttg 10920
ccttttgatt gagttcttgc aaatctcaca acgactttat tttgaacaat actgtttggg 10980
gatgatgcat gagtctgaaa caacttcagt tgtagctgtc atctgataaa attgcttcac 11040
agggaaggaa atttagcacg gatctagtca ttattcttgt tagattgaat gtgttaatca 11100
taattgtaaa caggcatgat aattattact ttaaaaactg aaaacagtga atagttagtt 11160
gtggaggtta ctaaagcatg atttttttaa aataaaactt tcagcatttt gcaaatatgc 11220
atatggttta ggatagaact tccagaggta gcatcacatt taaattctca agcaacttag 11280
taatacgagg ctctgaaaaa ctggttaaag ttactccaga aatggccctg ggtctgacag 11340
acattctaac ttaaagatgc atatgaagac tttgaataaa atcatttcat atgaagacat 11400
tgaataaaat catttcataa aataagtgag gaaaaacaac tactattgaa ttcatcttaa 11460
tgtatgattt taaaaatatg tttagctaaa aattcataga catttgacaa tttcgtttat 11520
atctcaaaaa gttgacttac ccaagttgat cacaaaactg atgagactgg tggtggtagt 11580
gaataaatga gggaccaccc atatttgaga cactttacat ttgtgatgtg ttatactgaa 11640
ttttcagttt gattctataa actaccaatt tcaaaattac aatttcaagg tgtaataagt 11700
agtggtatta tcttgaaata ggtctaaagg gaacttttct gttttaaaat attcttaaac 11760
tatatgtgct gattttgatt tgcatttggg tagattatac tcttatgaat cggggggctg 11820
ggtattgatt caggttttcc ttacctattt ggtaaggatt tcaaagtctt tttgtgcttg 11880
attttcctcg tttttaaata tgaaacatat tgatgacttt taattaacaa atgtttttat 11940
ctcgaataaa ttttaaagga gatcttttct aaaagaggta tgatgactta attattgcat 12000
ataacaataa atgagaaacc agtgattcca tactctctaa agaataaaag tgagctttag 12060
gcccaggcat ggtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt ggaaggccga ggcaggcgga 12120
tcacctgagg tcaggaattc gacaccagcc tggccaaatg gcaaaaccct gtctctacta 12180
caaatacaaa aattagctgg gcatggtggc agcccctata gtcccagcta cttggaagac 12240
tgagacagga gagtcactcg aacccgagag gcagaggttg cagtaagctg aaatcacacc 12300
attgcactcc agcctgggca acaagagcaa aactccgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 12360
aaaaagaata aaagtgagct ttggattgcg tataaatcct ttagacaagt agtagacttg 12420
tttgatactg tgtttgaaca aattacaaag tattttcatc aaagaatgtt attgtttgct 12480
gttattttta ttttttattg cccagcttct ctcatattca ttatgtgatt ttcttcactt 12540
catgttactt tattgtgcag ggtcagagta ttattccaat gcttactgga gaagtgattc 12600
ctgtaatgga actgctttca tctatgaaat cacacagtgt tcctgaagaa atagatgtaa 12660
gtttttatat ttttaaatga gagcaattat accctttatc agttttttgg ggttatatta 12720
ttattatgta tattattaat attctaattt taatactaag cacttcgtcg tacgtactat 12780
ccacatgcag tattagccac ttgaacagat aagcacacac aaaatcctgg attttatggc 12840
ataacagagg catttttgat cagtgatgac aaaactaaat ttattttgtt tatttcacta 12900
cttttataat tcctaaaagt gggaggatcc cagctcttat aggagcaatt aatatttaat 12960
gcagtacctt ttgaaacaaa actgtgtgcc aaagcagtaa ccattaatgg aagttgactt 13020
atagtcacaa atttagtttc cttaatcatt tgttgaggat gttttgaatc acacactatg 13080
agtgttaaga gatatcttta ggacactatt cttgttgttt tattgtcatt taggttagtc 13140
tcctgtctga cagctcagaa gaggaagttg ttcttgtaaa aattgtttac acaacctgat 13200
tgaccagctt tcacatttgt tcttctgaaa gctgatggta gtgcacagat tgttttatgg 13260
ggagtcttga ttctcagaaa tgaaggcagt gtgttatatt gaatccagac ttcagaaaac 13320
ttgtatatta aaagtgtttt ttcaacacta tgttatagcc agactaattt ttttattttt 13380
ttgatgcatt ttagatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagttgtc 13440
atgaaggctt tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaacctggat gaagcatatg 13500
ttcacctatg acaagatttg gaaggaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta 13560
gggacaacat tgcatatttg aattgttgct taaatttgtg ttatttttca ttcgttatat 13620
ttctataata tatttgatgt tattccattt gctatttaaa gaaactgagt ttccatattt 13680
cccagacaag aaatcatggc cccttgcttg attctggttt cttgttttac ttctcattaa 13740
agctaaaaga accctttcaa attaagttgt actgtagatg aacttaagtt atttaggcct 13800
agaaaaaaaa aattcatatt tatactgatc tttttccatc cagcagtgga gtttagtact 13860
taagagtttg tgcccttaaa ccagactccc tgggttaatg ctgtgtacct gtgggcaagg 13920
tccctgaatt ctctatacac ctatttcctc atctgtaaaa tggcaataat aataatagta 13980
cctaatgtat agagttgtta taagcattga gtaagataaa taatataaag cacttagaac 14040
agtgcctgga acataagaac acttaataat agctaacatt ttctatttac atttcttcta 14100
aggaaaaggt taacagaaat agccaatatt tgttcagtgc ctacatgtta gttcctatac 14160
taagtgcttt acatgtatta tcttatattc tattttaatg tttcttcaca gttgcagatt 14220
atcatgaaat tttatttttt aaaaaagaga agtaaaagga taaagtattc acttttatgt 14280
ccacagtctt ttcctttagg ctcatgatgg agtatcagag gcatgaatgt gtttaaccta 14340
agagccttaa tggcttgaat cagaagcact ttagtcctgt atctgttcag tgtcagcctt 14400
tcaaacatca ttttaaatcc catttgactt taagtaaatc acttaatctc tctacatgtc 14460
aatttcttca gctataaaat gatggtattt caataaataa atacattaat taaatgatat 14520
tttacaaact aattgggctg ttttaaggct caataagaaa atttctgtga aaggtctcta 14580
gcaaatgtag ggttctatac aaataaaaga taacattatg cttatatctt cggtgtttat 14640
catgcaaagc tcttctgagt tttttgaaga gctcacctac tattttttgt ttttagtttg 14700
ttaaattgtt ttataggcaa tgtttttaat ctgttttctt taacttacag tgccatcagc 14760
tcacacttgc aaacctgtgg ctgttccgtt gtagtaggta gcagtgcaga gaaagtaaat 14820
aaggtagttt attttataat ctagcaaatg atttgactct ttaagactga tgatatatca 14880
tggattgtca tttaaatggt aggttgcaat taaaatgatc taatagtata aggaggcaat 14940
gtaatctcat cgaattgctg agacaacttg tggcaacagt gagtttgaaa taaagtgaat 15000
aggagtcatt tatcagttta ttttgataac ttgtaaatac cagtgtcaga tgtgtataaa 15060
tggttttgag aatatattaa aatcaggtat ttaaaaaaac actattcttc tatttcccaa 15120
tgtaatcttt aacaaatctg aaggtagtca tgtactttcg gtactagttc tgaagaaatg 15180
ttatttgttt attcatcttg atttcattgt cttggctttc cttctaaatc tatcccttct 15240
tgggagctat tgggattaag tggtcattga tgattatact ttattcagta atgtttctga 15300
ccctttcctt cagtgctact tgagttaata aaggattaat gaacagttac atttccaagc 15360
attagctaat aaactaaagg attttgcact tttcttcact gaccattagt taaaaacagt 15420
tcagagataa gtacatgtat ctttcaattc tagcaaacct aattttttaa aagaagtttt 15480
acataggaaa tatgttggaa atgattattt actttacaaa gatattcata atttattttt 15540
tctgtaacta gctactttgt atatttacat gagccttaat ttatcaaaat tatatttctc 15600
atataaccat ttatgagagc ttagtattcc tctgtcatta tattgcgtct acggactagt 15660
gatcttacta cttctgttac ctcgaacaag tggcttcccg tctgtgacct ccaaagccgt 15720
aggttccaca gagtgactgc tgagctgctt tatgaaggga gaaaggctcc atagttgggt 15780
ttttggtttt gcttttgttt ttgtttttaa catttttcct atcctccatc ctcttgaggc 15840
agagtagctt accttttatc ttgttttaat ttgagaaaga agttgccact gctctagatt 15900
gaaaaccact gctttaacat aataactctg aatatggttt gaatttcaag atagtgacat 15960
gcctttttat ttttactaat agagctgtag gtcgaatatt attagatttc taaaccccac 16020
ccaatgacct ccttatttta aatcaaattt aataattaat tatcttctta ttggaggatc 16080
tggacattct ttgatgtttc ttacaatgaa tttcacatgt agacccacta aacagaagtt 16140
ataaaggttc catggtcaaa taagtctgag aaagtctgca tattatataa ttcacctaaa 16200
gagtcacagt atgtacccaa atgttaaagg ttttgagatg ccatacagta aatttaccaa 16260
gcattttcta aatttatttg accacagaat ccctatttta agcaacaact gttatatccc 16320
ataggttcca ggtgactaaa gaatacttat tgcttaggat atgttttatt gataataaca 16380
attaaaatgt cagatatctt tcataagcag atcagtggtc tttttaaaac tttgtatttt 16440
aatgctaaaa tcttttcttt tgtagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactgcagc 16500
agagagaaaa tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct 16560
ctttgtacag ggcctgctaa aggtatagtt tctacttatc acaagggaaa ccaattttct 16620
aaaatcattt ttgagactct ttgtagacaa atattaaata ttagcattta atgtatctca 16680
tattgacatg cccagtgact gacttccttt gcacagttct gcgcatagac tatatgtctt 16740
atggatttat agttagtatc atcagtgtaa caccatagaa taccctttgt tttccaggtg 16800
ggtccctgta cctacatgtc tagcatcagg tgttgttttt tttttttttt tttaaaacat 16860
atgcttaaat caggttgcac atctaaaata agatcatttc tttttaacta aatagatttg 16920
aattttattg aaaaaaattt taaaacatct ttaagaagca tataggattt aagcagttac 16980
tatgtatgtg tactaaaata tatatatatt cctaaatata tattcctata tataatatat 17040
gtatttctat atataatata tattagaaaa aacttagagt tttctttcat ttgagtctac 17100
tgttcaagga gcaaaacaga gaaatgtaaa ttagcaatta tttacaataa ttaaagggaa 17160
gaaagttgtt caccttgttg gatctattat tgttgtttta attatagtcc caagacgtga 17220
agaaatagct ttcctaatgg ttatgtgatt gtctcatagt gactactttc ttgaggatgt 17280
agccacagca aaatgaaatt taaaaaattt aaaaattgtt gcaaataaaa gttatattag 17340
gcttttgtgc aatttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata 17400
gaaactagtt aaaggaaaca cagtttctat ttgagttata caaatctgta aattagaact 17460
tctcctgtta aggcattata aagtgcttaa tacttttgtt tcctcagcac cctctcattt 17520
aattatataa ttttagctct gaaagggacc tataccagat gtgtagagga aatttcaaaa 17580
ctatgatcta atgaaaaaat atttaatagt tctccatgca aatacaaatt atatagtttt 17640
ctggaaaata cctttgacat tatacaaaga tgattatcac agcattataa tagtgaaaaa 17700
atggaaatag cctctttctt ctgttctgtt cacagcatat ggcacagtac ctcatatgca 17760
gtaggttatt atgacctggt aactggctcc cccaactgat taggaaagaa gtaaatttgt 17820
tatttataaa aatacgtgtt cattgagatg catagaataa ttaagaaatt aaaagacact 17880
tgtaatttca aatccagtga atacccactg ttaatatttg gcatatctct ttctagtctt 17940
tttttccctt ttgcatgtat tttctttaag actcccaccc ccactggatc atctctgcat 18000
attctaatct gcttttttca cagcagattc taagcctttt tgcatatcaa cacaaacttc 18060
aacaacttca tctttagatg ctaaataatg aattcatttt tatttactta accactttct 18120
ttggatgctc aggttattct gatgttttgc cattaaaacc aatgctatac tgaacacttc 18180
tgtcactaaa acttgaacac actcatgaat aatttcttag gataaatttt tagagatgga 18240
tttgctaaat caaagaccat tttttaaaaa ttgaaaaaca attatatcgt ttggcatgta 18300
agacagtaca ttttcctttt attttgacag gattcaactg gaagctttgt gctgcctttc 18360
cggcaagtca tgtatgctcc atatcccacc acacacatag atgtggatgt caatactgtg 18420
aagcagatgc caccctgtca tgaacatatt tataatcagc gtagatacat gagatccgag 18480
ctgacagcct tctggagagc cacttcagaa gaagacatgg ctcaggatac gatcatctac 18540
actgacgaaa gctttactcc tgatttgtac gtaatgctct gcgtgctggt actgtagtca 18600
agcaatatga aactgtgtct tttatgaata aaaacaaaac agaagttgca ttcaaaaaga 18660
aagaaatatt actagcagaa ttatgcttga agaaacattt aatcaagcat ttttttctta 18720
aatgttcttc tttttccata cgattgtgtt taccctaaaa taagtaagat taacccttaa 18780
agtgaatatt taactatttg tttaataaat atatattgag ctcctaagca ctgttctagg 18840
tactgggctt aatagtggct aaccacacag ctccagcccc tacattgcat atagtctatt 18900
gtataagtta ctgaatggac ttactaacaa aaccagagaa gtaattctaa gtcttttttt 18960
tcttgacata tgaatataaa atacaacaaa actggtaaaa tatattaata gagcattctt 19020
ttactttgca ttttatattg ttactcactt cgtatttaag aaaaacagtc tgatcaggaa 19080
attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gagcatagac ccaacttgaa aagaaaaaaa 19140
aggatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaatg atgttctgaa 19200
atcaggaaaa gaattatagt atatttttgt ggttctcttt tattagttga aaaaaggcac 19260
agtagctcat gcctataaga acagagcttt gggattccaa ggcaggcaga tcacttgagg 19320
ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca aaaataaaaa 19380
agaattagtt gaatgtgttt ctgtgtgcct ataatcctag ctattcagaa agctgaggca 19440
ggaggatctc ttgagcccag gagtttgagg ttacatggag ttatgatgtg ccagtgtact 19500
ccagcctgcg ggacaatgag actctgtctt gttaaaaaaa aaagtgcttg gaataatgtt 19560
tggcatatag aaggtaacaa cagtaaatgt taactgtaat aacccaggta taagtgtgta 19620
aggtgataga aaaattgggg caaacaaccc tgacctgtgt ctctacagaa taagtttgag 19680
ttgaggcaac agacatgtgg agcaccagta attacacact aaatgttaac caaaagcgtt 19740
gaatagtaac atcttattca agggaccccc agccttatat atctcaaggt gcagaaagat 19800
gacttaatat aggacccatt ttttccgagt tctccagagt ttttattggt tcttgagaaa 19860
gtagtggggg aattgtttta gaaaatgaat tggtcaaact gaaattccat gtcagtaagt 19920
ttttacatat tggtaaattt tgatagacat gtagaagttt tctaattaat ctgcgccttg 19980
aaacattttc ctttttccta aagtgcttag tattttttcc cttttttgat tggttgcttg 20040
ggagcttttt tgaggaaatt tagtgaactg cagaatgagt ttgcaaccat ttagtatttt 20100
tgttttgtgt tttagaggag gtatgtgtat tttaacattt cttaatcatt tttagccagc 20160
tatgtttgtt ttgctgattg acaaactata attaaacagc tattctcatt ttgctgatca 20220
tgacaaagta atatcctgaa tttttaaatt ttgcatccag ctctaaattt tctaaatttt 20280
ctaaacataa aattgttcaa aaaatagtat ttttagccac tagattgtgt gttgttaagt 20340
ctgttgtcac agactcattt tacttttcag tgtgtgtttt tacatgttaa ttatgtttgt 20400
catttttaat tttaactttt taaaataatt ccagtcactg ccaaaacatg aaaaattggt 20460
cactggaaat ttttttttta acttttattt taggttcatg tgtacatgtg caggtttgtt 20520
atacaggtaa attgcgtgtc gtgagggttt ggtgtaccca ggtaataagg gtagtaccca 20580
ataggtagtt ttttgatcct tacccttctc ccacccttct ttcaccctcg agtaggcctt 20640
ggtgttgctg tttccttctt tgtgtccatg tgtactcaat ggttagctcc tacttagaag 20700
tgagaacatg cggtatttgg ttttctgttc ctggattagt tcactcagga taatggcctc 20760
tagctccatc tgttttttat ggctgcatag tattccatgg tgtatatgta tcatgttttc 20820
tttatccagt ctaccattga tagacattta ggttgattct ctgtctttac tatcatgaat 20880
agcgctgtga tgaacatata cacatgcatg tgtccttatg gtggaacaat ttgtattcct 20940
ttaagtatat acagaataat ggggttgcta gggtgaatgg tagttctatt gtaagttatt 21000
tgtgaaatct tcaaactgct tttcacaata gctaaactaa tttacagtcc caccagcagt 21060
gtataagtgt tcccttttct ccacaacctt gccaacatgt tattttttta cttttcaata 21120
ataggcattc ctagagaatt gatttgcaat tctctaatga ttagtgatat tgagcatttt 21180
ttcgtatgct ttttagctgt gtgtatatat tcttttgaaa aatgttaatg tcctttgccc 21240
agtttgtaat ggggttgttt gtttttgctt gttaattaaa gttccttcca gattctggat 21300
atccctttgt cagatgcgtg gtttgcagat atttttctcc ccttgtgtag gttgtctttt 21360
tactctgttg atagtttctt ttgccgggca ggagctcatt aggtctcatt tgtgtttgtt 21420
tttgttgcag ttgcttttgg cgtcttcatc ataaaatctg tgccagggcc tatgtccaga 21480
atggtatttc ctagtttgtc ttccagggtt tttacaattt tagattttac gtttatgtct 21540
ttaatccgtc ttgagttgat taaggaaggg gtccagtttc actctaattc ctatggctaa 21600
caattatccc agcaccattt attgaatacg gagtcctttc cccattgctt gtttttgtca 21660
attttgttga agatctgatg gttgtaggtg ctatgtggct ttatttcttg gctctctatt 21720
ctccactggt ctgtctgttt ttataccagt accctgctgt taaggttcct atagcctttt 21780
agtataaggt cggctaatgt gatgcctcca gctttgttct ttttgcttag gattgctttg 21840
gctatttggg ctcctttttg gttccatatt aattttaaaa tagttttttc tagttttgtg 21900
aagaatgtca ttgatagttt agaggaatag cgttgaatct gtagattgct ttgggcaaat 21960
ggccatttta acaatattga ttcttcctat ctatgaacat ggaatgtttt tccatgtgtt 22020
tgtgtcatct ctttatacct gatgtataaa gaaaaaccag tattattgct actcaatctg 22080
ttccaaaaaa ttgaggagga ggaactcttc cctaatgaga ccggcttcct tctgatacca 22140
aaacctggca gagatacaac agaaaaaaga aaacttcagg ccaatatcct tgatgaatat 22200
agatgcaaaa atcctcaaca aaatactagc aaccaaatcc agcagtacgt caaaaagcta 22260
atctacttta agtaggcttt atccctggga tgcaaggttg gttcaacata cacaaatcaa 22320
taagtgtgat tcatcacata aacagagcta aaaacaaaaa ccacaagatt atctcaatag 22380
gtgcagaaaa ggctttcaat acaatttaac atccttcatg ttaaaaacct tcagtaggtc 22440
aggtgcagtg actcacacct gtaatcccag cactttggga ggccaaggcg gacgtatatc 22500
ttaagcccag gagttcaaga ccagcctagg cagcatggtg aaaccccatc tctacaggaa 22560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcttaatat ggcggcatgc acctatagtc 22620
ccagctactc aggaggttga ggtgggagga ttgcttgagc ccaggaggca gaggttgcag 22680
cgagctgaga tcgtgccact gcactccaac ctgggcaata aagtgagacc ctgtctcaaa 22740
aagaaaaaca aaaataatcc taaaccaact aggcattgaa ggaatatgcc tcaaaaaaat 22800
aagaaccatc tatgacagac ccacagccaa tatcttacca aatgggcaaa agctggaagt 22860
attctccttg agaaccgtaa caagacaagg atacacactc tcatccctcc ttttcagcat 22920
agttctggaa gtcctcgcca gagcagtcag gaaagagaaa gaaagaaaag gcattcagat 22980
aggaagagaa gaagtcaaac tatttctgtt tgcaggcagt ataattctat acctagaaaa 23040
tgccatagtt tctgcccaga agctcctaca tctgttaaaa atttcagcaa agttttagca 23100
ttgtctgtat tccaacagct tccagggtga gagtgaaatc aggaacacag tcccgttcac 23160
aatagccgca aaaagaataa aataccttgg aatccagcta accagggagg tgaaacatct 23220
ctacgagaat tacaaaacgc tgctgaaaga aatcagagat gacacaaaca aatggaaatg 23280
ttgtttttaa caccttgctt tatctaattc acttataact aagatattca ttcagtggaa 23340
caggtataat aagaccactc gacttaaata taagccttat tctctttcca gagcccaaga 23400
aggggcacta tcagtgccca gtcaataatg ataaaatgct gatatttttc ccctttactg 23460
tttctttctt ctgtagtgtg gtacactcat ttcttaagat tagaaaactt gacctacctt 23520
cctgtttgct tctacacacc cccattctct ttttttgcca ctccggtcag gtataggatg 23580
atccctacca cttttagtta aaacctcctt cccttattaa atgttctctt accactctgg 23640
cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaagatgaa agggaggtgg gggctgggaa 23700
gggaatagtc ttgtttgtgt gtttgcttta gcacctacta tatcctaggt gctgtgttag 23760
gcacacatta ttttaagtgg ccattatatt gctacatctc actctggtca ttgccaaggt 23820
aggtagtact ttcttggata gttggttcat gttacttata ggtggtggac ttgttgaggc 23880
aaccccaatg gataatcatc tgagtgtgtt ctctaatctc agatttttct tcatattttt 23940
tggtttgttt tggtttttga tggtggtggt tgtgtgctta tttttgttgc tggcttgttt 24000
ttttgttttg tttttgatat ggcaagaatt ggtagtttta tttattaatt gcctaagggt 24060
ctctactttt tttaaaagat gagagtacta aaatagattg ataggtacat acataccttt 24120
atgggggact gcttatattc cttagagaaa aaaattactt attagcctga caaacaccag 24180
taaaatgtaa atatatccgt gagtaaataa atgaatgtat gctttgtatc tccaaatata 24240
tacatctata ttcttacaaa tatgttttta tgtaatacca atttataaga acttaaaatg 24300
ttggctcaag tgagggatgg tggaaagtag cattatatag ccatttcaac atttgaactt 24360
ttttcttcat tttcttcttt tcttcaggaa tatttttcaa gatgtcttac acagagacac 24420
tctagtgaaa gccttcctgg atcaggtaaa tgttgaactt gagattgtca gagtgaatga 24480
tatgacatgt tttctttttt aatatatctt acaatgcctg ttctctctct ctatatatat 24540
atatttatat atttccctgg atcatgcccc agagttctgc tgagcaattg cagttaagtt 24600
agttacacta cagttctcac aagagtctgt gaggggatgt caggtgcatc attacattgg 24660
atgcctcttg tcctagattt atgtttcggg aattcagacc tatgtttaca atataataaa 24720
tattgttgct gccttttaca gataaaataa taagatataa acttgaccac aactactgtt 24780
ttttgaaaca tagagttcat ggtttacatg tatcaaagtg aaatctgagt tagcttttac 24840
agatataata tatacatata tatatcctac aatgcttgta ctatatatgt agtacaagta 24900
tatatatgtg tgtgtgtgtg tgtatatata ttatggcact gtagtatata tatgtttata 24960
tgttaaaaaa tatataaata tatgttacat atttaacata aacatatata catatatgtt 25020
aaatatataa catatactct atatatgaca aatagagtat aatatatatt tttatttttt 25080
atatatatat aaaacatgat agaattaaga attaagtcct aatctgtttt attaggtgct 25140
ttttgtagtg ttcagtcttt ctaaagtgtc taaatgattt ttccttttga cttattaatg 25200
gggaagagcc tctatattaa caattaaggc tgcagcattg attacttcaa acaacaaaca 25260
ttttaattca agcattaacc tataactcaa gtaagttttt tttttttttt ttttgagaaa 25320
gggaggttgt ttatttgcct gaattgagtc aaaaatattt ttgaaacatc atgtactcat 25380
ttaaatgata acatctttat tgtttcattc ttttaaaaaa tatctactta attacacagt 25440
tgaaggaaat tgtagattat atggaactta tttcttaata tattacagtt ttgttataat 25500
aacattctgg ggatcaggcc aggaaactgt gtcatagata aagctttgaa ataatgagat 25560
ccttatgttt actagaaatt ttggattgag atctatgtgg tctgtgacat attgcaaagt 25620
tcaaggaaaa ttcgtaggca tggaatttct caaactgaaa atccctccca ctgtccacct 25680
catcacatgc acacattcta ctcttaccca cccactccac cccttgcaaa agtacagata 25740
tatgaatgtc tcaaaaccat gggctcatct tctagaagct tcaatgttat ttgaagattt 25800
gggcagagga agttaagaaa tatgaaatag cttacatatg agttttaata gtgaaacaaa 25860
catggatgta ttctgaagta gaatgcaaaa tttgagtgca tttttttttt tttgagactg 25920
agtctggctc tgtcgcccag gctggagtgc agtggccgga tctcagctca ctgcaagctc 25980
cacctcccgg gtttacgcca ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gaccacaggc 26040
gcccgccact tcgcccggct agtttgtttg tattttttag tagagatggg gtttcaccgt 26100
gttagccagg gannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccatt 26160
gagtgcattt ttaaagataa atcagaaaac ttcgaaaaac tatcagattg gccggacatg 26220
gtggcttatg cctgtaatcc tagcactttg ggaggctgag gtgggtggat cacgaggtca 26280
ggagatcgag accatcctgc caacatggtg aaaccccatc tctactaagt atacaaaaat 26340
tagctgggcg tgacagcacg tgcctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga 26400
atcgcttgaa cccgggaggt ggaggttgca gtgagtcaag atcacaccac tgcacttcag 26460
cttggtgaca gagctagact ccatatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa gtcagattgt 26520
tcctacaccc agtgcttcta taccacactc ctactagggg gcatcagtgg aaatggttaa 26580
ggagatgttt agtgtgtatt gtctgccaag cactgttaac actgtcctag aaacattgct 26640
gtacaagtag aatgtgagca aattatgtat tgaaatggtt cctctccctg caggtctttc 26700
agctgaaacc tggcttatct ctcaggagta ctttccttgc acagttttta cttgtccttc 26760
acagaaaagc cttgacacta ataaaatata tagaagatga tacgtgagta caactcctac 26820
atggaggaaa aaccttttgt acgttgtttt ttgttttatt tcctttgtac attttctgta 26880
tcataatttt tgcttttttt tttttttttt ttttctccat tactttcagg cagaagggaa 26940
aaaagccctt taaatctctt cggaacctga agatagacct tgatttaaca gcagagggcg 27000
atcttaacat aataatggct ctggctgaga aaattaaacc aggcctacac tcttttatct 27060
ttggaagacc tttctacact agtgtacaag aacgagatgt tctaatgact ttttaaatgt 27120
gtaacttaat aagcctattc catcacaatc gtgatcgctg ctaaagtagc tcggtggtgt 27180
ggggaaacat tcccctggat catactccag agctctgctc ggcagttgca gttaagttag 27240
ttacactaca gttctcacaa gagtctgtga ggggatgtca ggtgcatcat tacattggat 27300
gtctcttttc ctagatttat gcttttggga tacagaccta tgtttacaat ataataggta 27360
ttattgctgt cttttaaata tataataata ggatataaac ttgaccacaa ctgctgtttt 27420
tttgaaatat atgattcatg gtttacatgt attaaggtga aatccgagtt cgcttttaca 27480
gatattagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtggaattac tgtaatactt 27540
ctgcaatcaa ctgaaaatta gagcctttaa atgatttcag ttccacagaa agaaagtgag 27600
cttcaacata ggataagctt tagaaagaga attgatcaag cagatgttta attggaattg 27660
attattagat cctgctttgt ggatttagcc ctcgggattc agtctgtaga aatgtctgat 27720
agttctctat agtccctgct catggtgaac cacagttagg atgttttgtt tgttttattg 27780
ttgttgctat tgttgatgtt ctatatagtt gagctctata aaaggaaatt gtattttatg 27840
ttttagtagt tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc caaattgaaa 27900
tgtgcacctc ctgtgccttt tttttccttg gaaaatcgaa ttacttggaa gaagttcaga 27960
tttcactggt cagtcgtttt catcttgttt tcttcttgca gagtcttacc atgtacctgc 28020
tttggcaatc attgtaactc tgagattata aaatgcatta gagaatatat taactaataa 28080
gatctttttt ttcaggaaca gaaaatagtt ccttgagtac ttccttctta catttctgcc 28140
catgtttttg aagttgttgc catttgcctg caataggcta taaggaatag caggagaaat 28200
tttactgaag tgctattttt ctaggtgcta ctttggcaga gctaagtggt ctgtttcttt 28260
tgtttcctta atgcgtttgg accattttgc tggctgtaaa ataactgatt aatataattc 28320
taacacaata ttgacattgt agtgtacaca aacacaaata ttttatttaa aactggaagt 28380
aacataaaag ggaaaatata tttataagaa aggaataaag gtaatagagc tcttctgtcc 28440
cccagccacc aaatttacac aacaaaatca tatgttctaa tgtgaaaggt cataatagct 28500
ttcccatcat taatcagaaa gatgtggcag cttgattttt tagacaaccc ctgaactaga 28560
tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa aaaatatata aatactatct cgtagtgtcc 28620
catactatgt tttttacatg atagattctt atttaagtgc taactggtta ttttctttgg 28680
ctggtttatt gtactgttat atagaatgta agttgtacag tgaaataagt tattaaagca 28740
tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc tagatggaga attttgaata aaatatnnnn 28800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28980
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29040
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29100
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29160
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa gactaattga tcatatcact atgattctca 29220
aagaagaacc aaaacttcat ataatactac aaatatgaga tagttacttc tgtagtatat 29280
ttctgtaatg ctacaggtta aacaggtcac tcttatataa cactattttg attttgatgt 29340
agaattgcac aaattgatat ttcttctatg atctgtaggg tatagcttaa agtagcaaaa 29400
acagtccacc acctccagtt aacacacagt aacactatgg gactagtatt attatttcca 29460
ttttacaaag gaggaaacta aagcttaaag atgtgtaata tacagcccaa ggtcacacag 29520
ctggtaaagg tagatttcat cccagacagt tacagtcatt gccgtgggca cagctcctaa 29580
cttattaact ccatgtaact ggtactcagt ttagttgaat tgaaaggaga gtagggaagc 29640
aggtctgttt gcactattca gagcccaagt gtgaatccct gctgtgctgc ttggagaagt 29700
tacttaacct atgcaaggtt cattttttaa atatttgaaa cggaatgata atacatactt 29760
caccagtggg tttaatgaga ccttataaga tcgttagttc agtacctgac cagtgcttca 29820
taaatgcttt ttcatccaat ctgacaatct ctagcttgta attggggcat ttagaacatt 29880
taatatgatt attggcatgg taggttaaag ttgtcatctt gctgttttct ctttgttctt 29940
ttttctcctt tcttttggat ttttttttaa ttttactgtg tcttctctgt tgtcttatta 30000
a 30001
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
gggtctagca agagcaggtg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
gtcttggcaa cagctggaga t 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 14
tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 17
tcgactcttt gcccaccgcc a 21
<210> 18
<211> 783
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gcctctcagt acccgaggct cccttttctc gagcccgcag cggcagcgct cccagcgggt 60
ccccgggaag gagacagctc gggtactgag ggcgggaaag caaggaagag gccagatccc 120
catcccttgt ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gggaagcccg gggcccggat 180
gcaggcaatt ccaccagtcg ctagaggcga aagcccgaca cccagcttcg gtcagagaaa 240
tgagagggaa agtaaaaatg cgtcgagctc tgaggagagc ccccgcttct acccgcgcct 300
cttcccggca gccgaacccc aaacagccac ccgccaggat gccgcctcct cactcaccca 360
ctcgccaccg cctgcgcctc cgccgccgcg ggcgcaggca ccgcaaccgc agccccgccc 420
cgggcccgcc cccgggcccg ccccgaccac gccccggccc cggccccggc cccggccccg 480
gcccctagcg cgcgactcct gagttccaga gcttgctaca ggctgcggtt gtttccctcc 540
ttgttttctt ctggttaatc tttatcaggt cttttcttgt tcaccctcag cgagtactgt 600
gagagcaagt agtggggaga gagggtggga aaaacaaaaa cacacacctc ctaaacccac 660
acctgctctt gctagacccc gcccccaaaa gagaagcaac cgggcagcag ggacggctga 720
cacaccaagc gtcatctttt acgtgggcgg aacttgtcgc tgtttgacgc acctctcttt 780
cct 783
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 21
gccttactct aggaccaaga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 22
ccggccccta gcgcgcgact 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23
cggcccctag cgcgcgact 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 24
ccggccccta gcgcgcgac 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 25
ccctagcgcg cgactcctga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 26
cccctagcgc gcgactcctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 27
gcccctagcg cgcgactcct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 28
ggcccctagc gcgcgactcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 29
cggcccctag cgcgcgactc 20
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 30
cctagcgcgc gactcctg 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 31
ccctagcgcg cgactcct 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 32
cccctagcgc gcgactcc 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 33
gcccctagcg cgcgactc 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 34
ggcccctagc gcgcgact 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35
cggcccctag cgcgcgac 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 36
aggctgcggt tgtttccctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 37
caggctgcgg ttgtttccct 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 38
ggctgcggtt gtttccctc 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 39
aggctgcggt tgtttccct 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 40
caggctgcgg ttgtttccc 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41
gctgcggttg tttccctc 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42
ggctgcggtt gtttccct 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 43
aggctgcggt tgtttccc 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44
caggctgcgg ttgtttcc 18
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45
tctgtctttg gagcccaaat 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46
ctgcgatccc cattccagtt 20
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 47
gccttactct aggaccaa 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
tctgtctttg gagcccaa 18
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
ggttaatctt tatcaggtct 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
tggttaatct ttatcaggtc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
ctggttaatc tttatcaggt 20
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
gttaatcttt atcaggtc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
ggttaatctt tatcaggt 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
tggttaatct ttatcagg 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
ctagcgcgcg actcctga 18
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
gggacactac aaggtagtat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
tacaggctgc ggttgtttcc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
cccggcccct agcgcgcgac 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
ggtaacttca aactcttggg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
aatctttatc aggtcttttc 20
<---

Claims (28)

1. Модифицированный олигонуклеотид согласно следующей химической структуре:
Figure 00000068
(SEQ ID NO: 33) или его соль.
2. Натриевая соль модифицированного олигонуклеотида согласно следующей химической структуре:
Figure 00000069
(SEQ ID NO: 33).
3. Модифицированный олигонуклеотид по п. 1, который представляет собой натриевую соль или калиевую соль.
4. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного олигонуклеотида по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
6. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция состоит по существу из модифицированного олигонуклеотида и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
7. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного олигонуклеотида по п. 3 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72.
8. Фармацевтическая композиция по п. 7, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
9. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция состоит по существу из модифицированного олигонуклеотида и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
10. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество натриевой соли модифицированного олигонуклеотида по п. 2 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72.
11. Фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
12. Фармацевтическая композиция по п. 10, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция состоит по существу из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
13. Модифицированный олигонуклеотид, отличающийся тем, что модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 5' сегмента крыла, центрального сегмента гэп и 3' сегмента крыла, где
5' сегмент крыла состоит из четырех 2'-O-метоксиэтил-нуклеозидов;
центральный сегмент гэп состоит из восьми β-D-дезоксирибонуклеозидов, и
3' сегмент крыла состоит из шести 2'-O-метоксиэтил-нуклеозидов;
причем модифицированный олигонуклеотид характеризуется последовательностью нуклеиновых оснований 5'-GCCCCTAGCGCGCGACTC-3' (SEQ ID NO: 33), где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и где межнуклеозидные связи модифицированного олигонуклеотида, в направлении 5'-3', представляют собой soosssssssssoooss, где каждая s представляет собой тиофосфатную связь и каждая о представляет собой фосфодиэфирную связь.
14. Модифицированный олигонуклеотид по п. 13, где модифицированный олигонуклеотид ковалентно связан с группой конъюгата.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного олигонуклеотида по п. 13 и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
17. Фармацевтическая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция состоит по существу из модифицированного олигонуклеотида и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
18. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного олигонуклеотида по п. 14 и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель для лечения заболевания, ассоциированного с C9ORF72.
19. Фармацевтическая композиция по п. 18, содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
20. Фармацевтическая композиция по п. 18, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция состоит по существу из модифицированного олигонуклеотида и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
RU2017139121A 2015-04-16 2016-04-15 Композиции для модулирования экспрессии c9orf72 RU2736574C2 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562148691P 2015-04-16 2015-04-16
US62/148,691 2015-04-16
US201562232941P 2015-09-25 2015-09-25
US62/232,941 2015-09-25
US201562239400P 2015-10-09 2015-10-09
US62/239,400 2015-10-09
PCT/US2016/027747 WO2016168592A2 (en) 2015-04-16 2016-04-15 Compositions for modulating c9orf72 expression

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017139121A RU2017139121A (ru) 2019-05-16
RU2017139121A3 RU2017139121A3 (ru) 2019-06-10
RU2736574C2 true RU2736574C2 (ru) 2020-11-18

Family

ID=57126261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017139121A RU2736574C2 (ru) 2015-04-16 2016-04-15 Композиции для модулирования экспрессии c9orf72

Country Status (30)

Country Link
US (4) US9605263B2 (ru)
EP (2) EP3283080B1 (ru)
JP (3) JP6606557B2 (ru)
KR (2) KR102104163B1 (ru)
CN (2) CN107427532B (ru)
AU (2) AU2016249002B2 (ru)
BR (1) BR112017016068A2 (ru)
CA (1) CA2978103A1 (ru)
CL (4) CL2017002567A1 (ru)
CO (1) CO2017007671A2 (ru)
CY (1) CY1122981T1 (ru)
DK (1) DK3283080T3 (ru)
ES (1) ES2791995T3 (ru)
HK (1) HK1250255A1 (ru)
HR (1) HRP20200843T1 (ru)
HU (1) HUE049233T2 (ru)
IL (2) IL253557B (ru)
LT (1) LT3283080T (ru)
MX (2) MX366128B (ru)
MY (1) MY181815A (ru)
NZ (1) NZ733882A (ru)
PH (2) PH12017501875B1 (ru)
PL (1) PL3283080T3 (ru)
PT (1) PT3283080T (ru)
RS (1) RS60230B1 (ru)
RU (1) RU2736574C2 (ru)
SA (3) SA520412450B1 (ru)
SG (2) SG10202001856WA (ru)
SI (1) SI3283080T1 (ru)
WO (1) WO2016168592A2 (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2015151857A (ru) 2008-12-02 2019-01-15 Уэйв Лайф Сайенсес Джапан, Инк. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
CN107365339A (zh) 2011-07-19 2017-11-21 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
CA2879023C (en) 2012-07-13 2017-03-28 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
US10577604B2 (en) 2012-10-15 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring C9ORF72 expression
US9963699B2 (en) 2012-10-15 2018-05-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating C9ORF72 expression
JP6570447B2 (ja) 2012-10-15 2019-09-04 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｃ９ｏｒｆ７２発現を調節するための組成物
SG11201602597YA (en) 2013-10-11 2016-05-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions for modulating c9orf72 expression
KR20230152178A (ko) 2014-01-16 2023-11-02 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
WO2017079291A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating c90rf72
EP3443094B1 (en) * 2016-04-13 2022-10-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing c9orf72 expression
WO2018081728A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Emendobio Inc. Compositions for genome editing
KR20200035301A (ko) * 2017-08-08 2020-04-02 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
WO2019094694A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 University Of Massachusetts Compositions and methods for the treatment of expanded repeat-associated disorders
CA3088112A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
WO2020023418A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Enclear Therapies, Inc. Methods of treating neurological disorders
WO2020027311A1 (ja) 2018-08-03 2020-02-06 国立大学法人東京医科歯科大学 Ｔｄｐ－４３凝集阻害剤
BR112021010660A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-24 Biogen Ma Inc. Proteína de neurofilamento para guiar intervenção terapêutica sobre esclerose lateral amiotrófica
CA3133784A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 University Of Massachusetts Oligonucleotide-based modulation of c9orf72
WO2020227395A2 (en) * 2019-05-06 2020-11-12 University Of Massachusetts Anti-c9orf72 oligonucleotides and related methods
EP4037695A4 (en) * 2019-10-06 2024-03-27 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2024036186A2 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 The University Of Massachusetts Identification of allele-specific target sequences for c9orf72

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2145964C1 (ru) * 1994-11-02 2000-02-27 Ай-Си-Эн ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ Нуклеозиды с модифицированными сахарами и олигонуклеотиды
WO2013030588A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 The University Of Manchester Method for diagnosing a neurodegenerative disease
WO2014062736A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring c9orf72 expression
RU2015117680A (ru) * 2012-10-15 2016-12-10 Айсис Фармасьютикалс, Инк. Композиции для модуляции экспрессии гена c9orf72

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
DK0497875T3 (da) 1989-10-24 2000-07-03 Gilead Sciences Inc 2'-modificerede oligonukleotider
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
ATE515510T1 (de) 1991-12-24 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
EP0691968B1 (en) 1993-03-30 1997-07-16 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
EP2253639A1 (en) 1997-09-12 2010-11-24 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US5998148A (en) 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
EP1244667B1 (en) 1999-12-30 2006-04-05 K.U. Leuven Research & Development Cyclohexene nucleic acids
USH2191H1 (en) 2000-10-24 2007-06-05 Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
WO2003004602A2 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
ATE517992T1 (de) 2002-11-14 2011-08-15 Dharmacon Inc Funktionelle und hyperfunktionelle sirna
US7790867B2 (en) 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
US7427672B2 (en) 2003-08-28 2008-09-23 Takeshi Imanishi Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
AU2004274021B2 (en) 2003-09-18 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
US20050261233A1 (en) 2004-04-21 2005-11-24 Sanjay Bhanot Modulation of glucose-6-phosphatase translocase expression
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
JP2008501693A (ja) 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
EP1766052A4 (en) 2004-06-03 2009-12-16 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOSITIONS WITH CAP
US20080261905A1 (en) 2004-11-08 2008-10-23 K.U. Leuven Research And Development Modified Nucleosides for Rna Interference
US20070299027A1 (en) 2006-01-26 2007-12-27 Gene Hung Compositions and their uses directed to huntingtin
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2386578T3 (es) 2006-05-05 2012-08-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de PCSK9
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
EP2444494B1 (en) 2006-10-09 2016-09-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
CN102604951A (zh) 2006-12-14 2012-07-25 诺瓦提斯公司 治疗肌肉和心血管病症的组合物和方法
US20100190837A1 (en) 2007-02-15 2010-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
ATE462787T1 (de) 2007-06-18 2010-04-15 Commissariat Energie Atomique Reversibles sirna-silencing eines mutierten und endogenen huntington-wildtypgens und dessen anwendung zur behandlung von morbus huntington
DK2176280T4 (en) 2007-07-05 2015-07-20 Isis Pharmaceuticals Inc 6-Disubstituerede bicykliske nukleinsyreanaloge
US20090123928A1 (en) 2007-10-11 2009-05-14 The Johns Hopkins University Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers
EP2217705A2 (en) * 2007-11-05 2010-08-18 Baltic Technology Development, Ltd. Use of oligonucleotides with modified bases in hybridization of nucleic acids
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
EP2265627A2 (en) 2008-02-07 2010-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
WO2010036696A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cyclohexenyl nucleic acid analogs
US20120149757A1 (en) 2009-04-13 2012-06-14 Krainer Adrian R Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
MX2011013421A (es) 2009-06-15 2012-03-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Arnds formulado con lipido de direccionamiento del gen pcsk9.
CA2767231A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cell-based bioprocessing
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2563921B1 (en) 2010-04-30 2016-11-23 Cellectis Method for modulating double-strand break-induced homologous recombination
WO2012005898A2 (en) 2010-06-15 2012-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chinese hamster ovary (cho) cell transcriptome, corresponding sirnas and uses thereof
CN106434648A (zh) * 2010-07-19 2017-02-22 F·C·贝内特 肌强直性营养障碍蛋白激酶(dmpk)表达的调节
CA3077910A1 (en) * 2010-11-17 2012-05-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
DK2655621T3 (en) 2010-12-20 2018-08-13 Massachusetts Gen Hospital Polycomb-associated non-coding RNAS
US20140050778A1 (en) 2010-12-28 2014-02-20 University Of Rochester Nucleic acid binding compounds, methods of making, and use thereof
CN103562215B (zh) * 2011-04-01 2017-04-26 埃西斯药品公司 信号转导及转录激活蛋白3(stat3)表达的调节
LT3505528T (lt) * 2011-04-21 2021-04-26 Glaxo Group Limited Hepatito b viruso (hbv) raiškos moduliacija
WO2013036833A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis
CN103906838A (zh) * 2011-10-25 2014-07-02 Isis制药公司 Gccr表达的反义调节
WO2013075079A1 (en) * 2011-11-17 2013-05-23 Rheonix, Inc. System and methods for selective molecular analysis
EP2785729B1 (en) * 2011-11-30 2020-11-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases
EP2788087A4 (en) 2011-12-06 2015-08-26 Ohio State Innovation Foundation NON-IONIC LOW OSMOLARITY CONTRAST AGENTS FOR THE ADMINISTRATION OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND THE TREATMENT OF DISEASE
RS56319B1 (sr) 2012-04-23 2017-12-29 Biomarin Tech Bv Oligonukleotidi koji moduliraju rnk sa poboljšanim karakteristikama za lečenje neuromišićnih poremećaja
DK2855500T3 (da) * 2012-05-24 2020-09-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til modulering af apolipoprotein (A)-ekspression
US9963699B2 (en) 2012-10-15 2018-05-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating C9ORF72 expression
HUE046434T2 (hu) * 2013-01-22 2020-03-30 Deutsches Zentrum Fuer Neurodegenerative Erkrankungen E V Dipeptid-ismétlõdõ fehérjék terápiás célpontként neurodegeneratív betegségekben, hexanukleotid ismétlõdõ expanzióval
SG11201602597YA (en) * 2013-10-11 2016-05-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions for modulating c9orf72 expression
WO2016024205A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Pfizer Inc. Oligomers targeting hexanucleotide repeat expansion in human c9orf72 gene
WO2016060919A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Allele selective inhibition of mutant c9orf72 foci expression by duplex rnas targeting the expanded hexanucleotide repeat
WO2017079291A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating c90rf72
EP3443094B1 (en) 2016-04-13 2022-10-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing c9orf72 expression
US10399845B2 (en) 2017-09-22 2019-09-03 Emco Wheaton Retail Corporation Testable overfill prevention valve for a liquid storage container

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2145964C1 (ru) * 1994-11-02 2000-02-27 Ай-Си-Эн ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ Нуклеозиды с модифицированными сахарами и олигонуклеотиды
WO2013030588A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 The University Of Manchester Method for diagnosing a neurodegenerative disease
WO2014062736A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring c9orf72 expression
RU2015117680A (ru) * 2012-10-15 2016-12-10 Айсис Фармасьютикалс, Инк. Композиции для модуляции экспрессии гена c9orf72

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019007834A (es) 2019-09-06
CL2020002019A1 (es) 2020-12-11
EP3283080B1 (en) 2020-03-18
AU2016249002B2 (en) 2019-07-18
CO2017007671A2 (es) 2018-01-31
US10815483B2 (en) 2020-10-27
EP3722424A1 (en) 2020-10-14
IL277624A (en) 2020-11-30
AU2016249002A1 (en) 2017-08-10
SI3283080T1 (sl) 2020-06-30
PH12019502724A1 (en) 2021-03-15
SA520412451B1 (ar) 2021-02-22
IL253557B (en) 2020-11-30
PL3283080T3 (pl) 2020-07-27
HUE049233T2 (hu) 2020-09-28
US20190264204A1 (en) 2019-08-29
EP3283080A4 (en) 2018-12-19
JP2018512127A (ja) 2018-05-17
KR102104163B1 (ko) 2020-04-23
KR20170136597A (ko) 2017-12-11
PH12017501875A1 (en) 2018-02-26
KR20200043513A (ko) 2020-04-27
SA520412450B1 (ar) 2022-01-24
US10138482B2 (en) 2018-11-27
HK1250255A1 (zh) 2018-12-07
ES2791995T3 (es) 2020-11-06
PH12017501875B1 (en) 2018-02-26
SG11201708468YA (en) 2017-11-29
RS60230B1 (sr) 2020-06-30
JP6606557B2 (ja) 2019-11-13
US9605263B2 (en) 2017-03-28
AU2019250156B2 (en) 2021-11-25
EP3283080A2 (en) 2018-02-21
MX2017013199A (es) 2018-02-09
CL2020002018A1 (es) 2020-12-11
JP2021184720A (ja) 2021-12-09
BR112017016068A2 (pt) 2018-04-03
US20160304871A1 (en) 2016-10-20
JP2020022483A (ja) 2020-02-13
WO2016168592A3 (en) 2016-11-24
US20210230589A1 (en) 2021-07-29
DK3283080T3 (da) 2020-04-06
KR102258516B1 (ko) 2021-05-31
PT3283080T (pt) 2020-06-08
SA517390168B1 (ar) 2020-08-26
AU2019250156A1 (en) 2019-10-31
LT3283080T (lt) 2020-05-25
CL2017002567A1 (es) 2018-06-01
IL253557A0 (en) 2017-09-28
CN113265404A (zh) 2021-08-17
SG10202001856WA (en) 2020-04-29
NZ733882A (en) 2020-04-24
RU2017139121A (ru) 2019-05-16
RU2017139121A3 (ru) 2019-06-10
US20170349897A1 (en) 2017-12-07
CY1122981T1 (el) 2021-10-29
JP6924242B2 (ja) 2021-08-25
CA2978103A1 (en) 2016-10-20
CL2018003582A1 (es) 2019-04-05
CN107427532B (zh) 2021-06-04
MX366128B (es) 2019-06-28
CN107427532A (zh) 2017-12-01
HRP20200843T1 (hr) 2020-08-21
WO2016168592A2 (en) 2016-10-20
MY181815A (en) 2021-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019250156B2 (en) Compositions for modulating c9orf72 expression
RU2748426C2 (ru) Композиции для модуляции экспрессии c90rf72
RU2730677C2 (ru) Соединение для модуляции экспрессии гена c9orf72 и его применение
KR102285629B1 (ko) Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물
AU2016225852B2 (en) Modulation of alpha synuclein expression
AU2018236699C1 (en) Methods and compositions for modulating apolipoprotein(a) expression
KR102482890B1 (ko) 아포지질단백질 (a) 발현을 조절하는 조성물 및 방법
DK2753694T3 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of Leber Congenital Amaurosis
KR101839177B1 (ko) Ｐｔｐｉｂ 발현의 안티센스 조절
AU2012275096B2 (en) Methods for modulating kallikrein (KLKB1) expression
TW202216996A (zh) 調節ｐｌｐ１之化合物及方法
KR20240111010A (ko) Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물
KR20140014365A (ko) 인자 ｘｉ에 의한 염증 반응의 조정