KR102258516B1 - C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 - Google Patents
C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102258516B1 KR102258516B1 KR1020207010994A KR20207010994A KR102258516B1 KR 102258516 B1 KR102258516 B1 KR 102258516B1 KR 1020207010994 A KR1020207010994 A KR 1020207010994A KR 20207010994 A KR20207010994 A KR 20207010994A KR 102258516 B1 KR102258516 B1 KR 102258516B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- c9orf72
- certain embodiments
- antisense
- compound
- pharmaceutically acceptable
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Psychology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 출원은 동물에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 조성물들 및 방법들을 개시한다. 이러한 방법들은 이를 필요로하는 개체에서 신경퇴행성 질환들을 치료, 예방, 개선 또는 진행을 감속시키는데 유용하다.
Description
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2016년 4월 15일에 생성된, 104 Kb 크기의 파일명 BIOL0269WOSEQ_ST25.txt로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에 있는 정보는 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
기술분야
세포들 및 동물들에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법들이 제공된다. 이러한 조성물들 및 방법들은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)을 비롯한 신경퇴행성 질환들의 치료, 예방, 개선 또는 진행을 감속시킴에 유용하다.
배경
근위축 측삭 경화증 (ALS)은 임상적으로 진행성 마비로 특징되는 치명적인 신경퇴행성 질환으로, 전형적으로 증상 발현 2 내지 3년 내 호흡 부전으로 인한 사망을 초래한다 (Rowland and Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). ALS는 서양에서 세번째로 가장 통상적인 신경퇴행성 질환이며 (Hirtz 등, Neurology, 2007, 68, 326-337), 현재 효과적인 치료법은 없다. 사례들 중 대략 10%가 사실상 가족력인 반면, 이 질환으로 진단받은 환자들의 대부분은 인구 전반에 걸쳐 무작위로 발생하는 것으로 보이므로 산발성으로 분류된다 (Chio 등, Neurology, 2008, 70, 533-537). 임상적, 유전적, 그리고 역학적 데이터에 기초하여, ALS 및 전두측두엽 치매 (FTD)는 병리학적으로 중추 신경계 전반에 걸친 TDP-43 양성 봉입체들의 존재로 특징지어지는, 중첩되는 연속선상의 질환을 나타냄에 대한 인식이 높아져가고 있다 (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann 등, Science, 2006, 314, 130-133).
지금까지, 고전적 가족성 ALS에 대한 원인으로 수많은 유전자들, 예를 들면, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN, 및 VCP (Johnson 등, Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski 등, Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama 등, Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen 등, Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan 등, Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance 등, Brain, 2009, 129, 868-876)가 발견되었다. 최근, ALS, FTD, 및 ALS-FTD에 관한 다수의 사례들과 관련된 가계도 계통 분석은 염색체 9의 짧은 암(arm)상에 상기 질환에 중요한 좌위(locus)가 존재하였음을 제시하였다 (Boxer 등, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita 등, Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson 등 J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance 등, Brain, 2006, 129, 868-876). C9ORF72 유전자에서의 돌연변이는 ALS 및 FTD의 가장 통상적인 유전적 원인이다. ALS-FTD 유발 돌연변이는 C9ORF72 유전자의 첫번째 인트론에서의 대형 헥사뉴클레오티드 (GGGGCC) 반복 확장부이다 (Renton 등, Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez 등, Neuron, 2011, 72, 245-256). 이 영역에 연관된 대부분의 사례들에서 C9ORF72 유전자를 덮고 있는 파운더 하플로타입(founder haplotype)이 나타난다 (Renton 등, Neuron, 2011, 72, 257-268). 염색체 9p21 상의 이 좌위는 405명의 핀란드 환자들의 코호트에서 모든 ALS 사례들 중 대략 4분의 1 그리고 가족성 ALS의 대략 절반에 대한 원인이된다 (Laaksovirta 등, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
C9ORF72 유전자를 덮고 있는 파운더 하플로타입(founder haplotype)은 이 영역에 연관된 대부분의 사례들에서 나타난다.
이러한 신경퇴행성 질환들을 치료하기 위한 효과적인 치료법들은 현재 존재하지 않는다. 그러므로 이러한 신경퇴행성 질환들의 치료를 위한 조성물 및 방법들을 제공하는 것이 목적이다.
요약
특정 구체예들은 세포, 조직 및 동물들에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질의 발현을 억제하기 위한 방법들, 화합물들 및 조성물들을 제공한다. 특정 구체예들은 세포, 조직 및 동물들에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질 수준을 감소시키기 위한 방법들, 화합물들 및 조성물들을 제공한다. 특정 구체예들은 C9ORF72 핵산에 표적되는 안티센스 화합물들을 제공한다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물들은 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구체예들에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 연관된 반복 연관 비-ATG 번역 (Repeat Associated Non-ATG 번역, RAN 번역) 산물들은 감소된다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)이다. 특정 구체예들에서, 특정 C9ORF72 mRNA 변이체들은 우선적으로 감소된다. 특정 구체예들에서, 우선적으로 감소된 C9ORF72 mRNA 변이체들은 인트론 1을 내포하는 예비-mRNA로부터 가공된 변이체들이다. 특정 구체예들에서, 인트론 1은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 내포한다. 특정 구체예들에서, 우선적으로 감소된 C9ORF72 mRNA 변이체는 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체이다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체는 NM_001256054.1 (서열 번호: 1)이다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 연관 질환과 연관된다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 연관 질환과 연관된다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 30회 GGGGCC 반복, 30회 초과의 GGGGCC 반복, 100회 초과의 GGGGCC 반복, 500회 초과의 GGGGCC 반복, 또는 1000회 초과의 GGGGCC 반복을 포함한다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 핵 집합체(nuclear foci)와 연관된다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 핵 집합체와 연관된다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)이다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 조성물 및 방법들은 C9ORF72 mRNA 수준, C9ORF72 단백질 수준, C9ORF72 RAN 번역 산물들, 및 핵 집합체를 감소시키는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 조성물 및 방법들은 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체들을 선택적으로 감소시키는데 유용하다. 이러한 감소는 시간-의존 방식 또는 투여량-의존 방식으로 발생할 수 있다.
또한 C9ORF72와 연관된 질환들의 예방, 치료, 개선 및 진행을 감속시킴에 유용한 방법들도 제공된다. 특정 구체예들에서, 이러한 C9ORF72 연관 질환들은 신경퇴행성 질환들이다. 특정 구체예들에서, 신경퇴행성 질환은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)이다.
이러한 질환들은 공통적으로 하나 또는 그 이상의 위험 인자들, 원인들, 또는 결과들을 가질 수 있다. 신경퇴행성 질환, 그리고, 특히, ALS 및 FTD의 발달에 관한 특정 위험 인자들 및 원인들에는 유전적 소인 및 노령(older age)이 포함된다.
특정 구체예들에서, 치료 방법들은 필요로 하는 개체에게 C9ORF72 안티센스 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 단일-가닥 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구체예들에서, 단일-가닥 변형된 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산에 상보적이다.
상세한 설명
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 모두 오직 예시적이고 설명적인 것이며 본 발명을 청구범위와 같이 제한하지 않음을 이해하여야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 달리 특별한 언급이 없는 한 복수형을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "또는"은 달리 언급이 없는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 본 출원에서 사용되는 "및"은 달리 언급이 없는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 그 외 형태들, 가령, "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, 용어, 가령, "요소" 또는 "성분"은 달리 특별한 언급이 없는 한, 하나의 단위를 포함하는 요소들 및 성분들 그리고 하나 이상의 아단위를 포함하는 요소들 및 성분들 모두를 포함한다.
본 발명의 화합물들은 하나 또는 그 이상의 수소, 탄소, 질소, 산소, 또는 황 원자들이 동일한 원소의 안정한 동위원소로 대체되어 있는, 상기 개시된 화합물들의 변이체들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구조화를 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 공개 특허 출원, 논문, 서적, 조약 및 미국 국립생물공학 정보센터 (NCBI)와 같은 데이터베이스를 통해 얻을 수 있는 GENBANK 등록 번호 및 관련 서열 정보 그리고 본 출원에 기재된 내용 전반에 걸쳐 언급되는 그 외 데이터를 비롯하여 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 본 출원에서 인용된 모든 문헌들 또는 이러한 문헌들의 일부는 본 출원에서 논의되는 문헌의 해당 부분 뿐만 아니라 전체로도 본 출원에 참고문헌으로 명백히 포함된다.
정의
특정한 정의가 제공되지 않는 한, 본 출원에 기재된 내용과 관련하여 사용되는 명명법, 본 출원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 약물 및 제약학적 화학의 절차 및 기술들은 해당 기술 분야에서 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성 및 화학 분석을 위한 표준 기술들이 사용될 수 있다.
달리 언급이 없는 한, 다음 용어들은 다음 의미를 가진다:
"2'-O-메톡시에틸" (또한 2'-MOE 및 2'-OCH2CH2-OCH3 및 MOE)은 퓨라노스 고리의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 의미한다. 2'-O-메톡시에틸 변형 당은 변형된 당이다.
"2'-MOE 뉴클레오시드" (또한 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드)는 MOE 변형 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"2'-치환된 뉴클레오시드"는 퓨라노스 고리의 2'-위치에 H 또는 OH 이외의 치환체를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구체예들에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 바이시클릭 당 변형을 가진 뉴클레오시드를 포함한다.
"5-메틸시토신"은 5' 위치에 부착된 메틸 그룹으로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 핵염기이다.
"동시에 투여되는"은 두개의 제약학적 제제 모두의 약리학적 효과들이 환자에서 동시에 나타나는 임의의 방식으로 이들 제제들을 병용-투여하는 것을 의미한다. 동시 투여는 두개 제약학적 제제들 모두가 단일 제약학적 조성물로, 동일한 투여 형태로, 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여됨을 필요로 하지 않는다. 제약학적 제제들 모두의 효과가 동시에 분명하게 나타날 필요는 없다. 효과는 일정 시기 동안 중첩되기만 하면 되고 동일한 시간에 걸쳐 존재할 필요는 없다.
"투여(Administering)"는 동물에게 제약학적 제제를 제공하는 것을 의미하며, 의학 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
"개선(Amelioration)"은 병태 또는 질환의 중증도에 관한 최소한 하나의 지표의 약화, 감속, 정지, 또는 역전을 의미한다. 지표들의 중증도는 해당 기술분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 주관적 또는 객관적 측정치들에 의해 결정될 수 있다.
"동물"은 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 비-인간 영장류를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 인간 또는 비-인간 동물을 의미하며, 비-인간 영장류에는 원숭이 및 침팬지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"항체"는 항원과 일부 방식으로 특이적으로 반응하는 것으로 특징지어지는 분자를 의미하며, 여기서 항체 및 항원은 다른 하나에 대하여 각각 정의된다. 항체는 완전 항체 분자 또는 이의 임의의 절편 또는 영역, 가령, 중쇄, 경쇄, Fab 부위, 및 Fc 부위를 의미할 수 있다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물의 해당 표적 핵산에 대한 혼성화에 기인한 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 구체예들에서, 안티센스 활성은 이러한 표적 핵산에 의하여 인코딩되는 표적 핵산 또는 단백질의 양 또는 발현의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화가 이루어질 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다. 안티센스 화합물의 예들에는 단일-가닥 및 이중-가닥 화합물, 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, ssRNA 및 점유-기반 화합물이 포함된다.
"안티센스 억제"는 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물 부재시의 표적 핵산 수준에 비해 이러한 안티센스 화합물 존재시의 표적 핵산 수준이 감소함을 의미한다.
"안티센스 기전"은 표적 핵산과 화합물의 혼성화에 관여하는 모든 기전들인데, 여기서 혼성화의 결과 또는 효과는, 예를 들면, 전사 또는 스플라이싱(splicing)에 관여하는 세포 기전(세포 machinery)의 지연이 수반되는 표적 분해 또는 표적 점유이다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 해당 분절에 대한 혼성화를 가능하게 하는 핵염기 서열을 가지는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"염기 상보성"은 표적 핵산에서 상응하는 핵염기들과 안티센스 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 정확한 염기 페어링 (즉, 혼성화) 능력을 의미하며, 상응하는 핵염기들 간의 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴 또는 역 후그스틴 (Hoogsteen or reversed Hoogsteen) 수소 결합에 의해 매개된다.
"바이시클릭 당"은 두 개의 원자들의 가교화에 의해 변형된 퓨라노스 고리를 의미한다. 바이시클릭 당은 변형 당이다.
"바이시클릭 뉴클레오시드" (또한 BNA)는 상기 당 고리의 2개의 탄소 원자들을 연결함으로써 바이시클릭 고리계를 형성하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 가진 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구체예들에서, 가교는 당 고리의 4'-탄소와 2'-탄소를 연결한다.
"C9ORF72 안티센스 전사체"은 C9ORF72 유전자의 비-코딩 가닥 (또한 안티센스 가닥 및 주형 가닥)으로부터 생성된 전사체를 의미한다. C9ORF72 안티센스 전사체는 C9ORF72 유전자의 코딩 가닥 (또한 센스 가닥)으로부터 생성된, 표준적으로 전사된 "C9ORF72 센스 전사체"과 상이하다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 안티센스 전사체는 서열 번호: 18이다.
"C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제"는 C9ORF72 안티센스 전사체의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 임의의 제제 및/또는 이의 분자 수준의 발현 산물을 의미한다. 본 출원에서 사용되는, "특이적"은 비-표적 전사체를 주목할만한 정도로 감소시키지 않으면서 C9ORF72 안티센스 전사체의 발현을 감소 또는 억제하는 것을 의미한다 (예컨대, C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제는 C9ORF72 안티센스 전사체의 발현을 감소시키지만, C9ORF72 센스 전사체의 발현을 주목할 만한 정도로 감소시키지는 않는다). C9ORF72 특이적 안티센스 전사체 억제제들에는, C9ORF72 안티센스 전사체 및/또는 이의 발현 산물, 가령, C9ORF72 안티센스 전사체 연관 RAN 번역 산물들의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 화합물들, siRNA, 압타머, 항체, 펩티드, 소분자, 및 그 외 제제들이 포함된다.
"C9ORF72 연관 질환"은 임의의 C9ORF72 핵산 또는 이의 발현 산물과 연관된 임의의 질환을 의미한다. 이러한 질환들은 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 이러한 신경퇴행성 질환들은 ALS 및 FTD를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 연관 질환은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부에 의해 유발된다 (또는 이와 연관된다). 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 30회, 30회 초과, 100회 초과, 500회 초과, 또는 1000회 초과로 반복되는 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG를 포함할 수 있다.
"C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들"은 RAN 번역 (즉, 반복-연관된, 그리고 비-ATG-의존성 번역)을 통해 번역된 이상(aberrant) 펩티드 또는 디-펩티드 폴리머를 의미한다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 임의의 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)이다.
"C9ORF72 핵산"은 C9ORF72를 인코딩하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산은 C9ORF72을 인코딩하는 DNA 서열, 인트론 및 엑손을 포함하는 유전체 DNA를 포함하는, C9ORF72을 인코딩하는 DNA로부터 전사된 RNA 서열(즉, 예비-mRNA), 및 C9ORF72을 인코딩하는 mRNA 서열을 포함한다. "C9ORF72 mRNA"는 C9ORF72 단백질을 인코딩하는 mRNA를 의미한다.
"C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체"는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 C9ORF72 예비-mRNA 변이체로부터 가공된 C9ORF72 mRNA 변이체를 의미한다. C9ORF72 예비-mRNA는 예비-mRNA의 전사가, 엑손 1A의 개시 부위로부터 엑손 1B의 개시 부위까지의 영역, 예컨대, 상기 유전체 서열(서열 번호: 2, 뉴클레오시드 27535000로부터 27565000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NT_008413.18의 보체)의 뉴클레오티드 1107 내지 1520에서 시작할 때 헥사 뉴클레오티드 반복을 내포한다. 특정 구체예들에서, 샘플 내 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 C9ORF72 예비-mRNA의 수준을 결정하기 위해 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체의 수준이 측정된다.
"C9ORF72 특이적 억제제"는 분자 수준에서 C9ORF72 mRNA, 및/또는 C9ORF72 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 예를 들면, C9ORF72 특이적 억제제에는, C9ORF72 mRNA 및/또는 C9ORF72 단백질의 발현을 억제할 수 있는 핵산 (안티센스 화합물들 포함), siRNA, 압타머, 항체, 펩티드, 소분자, 및 그 외 제제가 포함된다. 유사하게, 특정 구체예들에서, C9ORF72 특이적 억제제는 동물에서 그 외 다른 분자적 과정에 영향을 줄 수 있다.
"캡 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 어느 한 쪽 말단부에 포함되어 있는 화학적 변형부를 의미한다.
"cEt" 또는 "속박된 에틸"은 4'-탄소와 2'-탄소를 연결하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 가지는 바이시클릭 뉴클레오시드를 의미하며, 이 때 가교는 화학식: 4'-CH(CH3)-O-2'을 가진다.
"속박된 에틸 뉴클레오시드" (또는 cEt 뉴클레오시드)는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 바이시클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"화학적으로 구별되는 영역(Chemically distinct region)"은 동일한 안티센스 화합물의 또다른 부위와 일부 방식에서 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 의미한다. 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드를 가지는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형이 없는 뉴클레오시드를 가지는 영역과 화학적으로 구별된다.
"키메릭(chimeric) 안티센스 화합물"은 최소한 두개의 화학적으로 구별되는 영역들을 가지는 안티센스 화합물을 의미하며, 각 위치는 복수의 아단위들을 가진다.
"병용-투여(Co-administration)"는 개체에 둘 또는 그 이상의 제약학적 제제들을 투여하는 것을 의미한다. 둘 또는 그 이상의 제약학적 제제들은 단일 제약학적 조성물로 투여될 수 있거나, 별도의 제약학적 조성물들로 투여될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 제약학적 제제들 각각은 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 병용-투여는 병행 또는 순차 투여를 포함한다.
"상보성"은 제 1 핵산 및 제 2 핵산의 핵염기들 간의 페어링(pairing) 능력을 의미한다.
"포함하다", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은, 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함함을 의미하지만 임의의 그 외 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 제외시키지 않음이 이해될 것이다.
"인접 핵염기"는 서로에 바로 인접한 핵염기를 의미한다.
"설계하는 것" 또는"~하도록 설계된"은 선택된 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 올리고머 화합물을 설계하는 과정을 의미한다.
"희석제"는 약리학적 활성은 없으나, 제약상 필요하거나 바람직한, 조성물 내 성분을 의미한다. 예를 들면, 주사되는 약물에서, 희석제는 액체, 예컨대, 식염수 용액일 수 있다.
"투여량(dose)"은 단회 투여로, 또는 특정 시기에 제공되는 제약학적 제제의 특정량을 의미한다. 특정 구체예들에서, 투여량은 1회, 2회 또는 그 이상의 볼러스, 정제, 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들면, 피하 투여가 바람직한 특정 구체예들에서, 바람직한 투여량이 단회 주사로 용이하게 수용될 수 없는 용적을 요구하는 경우, 바람직한 투여량에 도달하기 위해 2회 또는 그 이상의 주사가 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 제약학적 제제는 연장된 시기에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 투여량은 1시간, 1일, 1주 또는 1개월 당 제약학적 제제의 양으로서 나타낼 수 있다.
활성을 조절 또는 한 병태를 치료 또는 예방함에 관한 내용에서 "유효량"은 이러한 조절, 치료 또는 예방을 필요로하는 개체에게 단회 투여 또는 일련의 투여 중 일부로 투여하는, 해당 효과의 조절, 또는 해당 병태의 치료 또는 예방 또는 개선에 효과적인 제약학적 제제의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체적 상태, 치료될 개체의 분류군, 조성물의 제형, 개체의 의학적 병태에 관한 평가, 및 그 외 관련 인자들에 따라 개체들에 있어 달라질 수 있다.
"효능(Efficacy)"은 바람직한 효과를 생성하는 능력을 의미한다.
"발현(Expression)"은 해당 기능에 의해 유전자의 코딩된 정보가 세포내에 존재하는 구조로 전환되어 작동하는 모든 기능들을 포함한다. 이러한 구조들은 전사 및 번역의 산물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
"집합체(focus 또는 foci)"는 C9ORF72 전사체를 포함하는 핵 또는 세포질 소체를 의미한다. 특정 구체예들에서, 집합체는 최소한 하나의 C9ORF72 전사체를 포함한다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 집합체는 다음과 같은 임의의 헥사뉴클레오티드 반복을 포함하는 전사체를 포함한다: GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 및/또는 GGGGCG.
"완전히 상보적인" 또는 "100% 상보적인"은 제 1 핵산의 각각의 핵염기가 제 2 핵산에서 상보적인 핵염기를 가짐을 의미한다. 특정 구체예들에서, 제 1 핵산은 안티센스 화합물이고 표적 핵산은 제 2 핵산이다.
"갭머(Gapmer)"는 RNase H 절단을 보조하는 복수의 뉴클레오시드를 가지는 내부 영역이 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 가지는 외부 영역들 사이에 위치되어 있는 키메릭 안티센스 화합물을 의미하며, 여기서 내부 영역을 포함하는 뉴클레오시드들은 외부 영역들을 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드들과 화학적으로 구별된다. 내부 영역은 "갭"으로 언급될 수 있으며 외부 영역들은 "윙 들"로 언급될 있다.
"헥사뉴클레오티드 반복 확장부"는 최소한 2회 반복되는, 일련의 6개 염기들 (예를 들면, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC)을 의미한다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산의 인트론 1에 위치될 수 있다. 특정 구체예들에서, 병원성 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산에서 최소한 30회, 30회 초과, 100회 초과, 500회 초과, 또는 1000회 초과의 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC 반복을 포함하며 질환과 연관된다. 특정 구체예들에서, 상기 반복은 연속적이다. 특정 구체예들에서, 상기 반복은 1 또는 그 이상의 핵염기들에 의해 불연속된다. 특정 구체예들에서, 야생형 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산에서 23회 또는 그 미만의 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC 반복을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 반복은 연속적이다. 특정 구체예들에서, 상기 반복은 1 또는 그 이상의 핵염기들에 의해 불연속된다.
"혼성화"는 상보적인 핵산 분자들의 어닐링을 의미한다. 특정 구체예들에서, 상보적인 핵산 분자들은 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, 상보적인 핵산 분자들은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 핵산 표적을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
"C9ORF72 연관 질환을 가지는 동물을 식별하는 것"은 C9ORF72 연관 질환을 가진 것으로 진단받은 적 있는 또는 C9ORF72 연관 질환을 발달시킬 성향이 있는 동물을 식별하는 것을 의미한다. C9ORF72 연관 질환을 발달시킬 성향이 있는 개체들은 C9ORF72 연관 질환을 발달시킬 하나 또는 그 이상의 위험 인자들을 가진 개체들을 포함하며, 이러한 개체에는 하나 또는 그 이상의 C9ORF72 연관 질환들의 개인 또는 가족 병력 또는 유전적 소인을 가지는 개체들이 포함된다. 이러한 식별은 개체의 병력을 평가하는 것 및 표준 임상 테스트 또는 평가, 가령, 유전자 테스트를 비롯한 임의의 방법에 의해 구현될 수 있다.
"바로 인접한"은 바로 인접한 요소들 사이에 간섭 요소들이 없음을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 치료법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"C9ORF72를 억제하는 것"은 C9ORF72 mRNA 및/또는 단백질의 수준 또는 발현을 감소시키는 것을 의미한다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 mRNA 및/또는 단백질 수준은, C9ORF72 안티센스 화합물, 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부재시 C9ORF72 mRNA 및/또는 단백질 수준의 발현에 비해, C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 비롯한 C9ORF72를 표적하는 안티센스 화합물의 존재시 억제된다.
"발현 또는 활성을 억제하는 것"은 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 의미하며 반드시 발현 또는 활성의 총 제거를 의미하는 것은 아니다.
"뉴클레오시드간 연결(Internucleoside linkage)"는 뉴클레오시드들 사이의 화학적 결합을 의미한다.
"연결된 뉴클레오시드(Linked nucleosides)"는 뉴클레오시드간 연결에 의해 함께 연결된 인접한 뉴클레오시드들을 의미한다.
"잠금 핵산" 또는 " LNA" 또는 "LNA 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드 당 단위의 4' 및 2' 위치 사이의 2개의 탄소 원자들을 연결함으로써 바이시클릭 당을 형성하는 가교를 가지는 핵산 모노머를 의미한다. 바이시클릭 당의 예들에는 아래 도시된 바와 같은 A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA , (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA , (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') LNA , (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA 및 (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는, LNA 화합물들에는, 당의 4' 및 2' 위치 사이에 최소한 하나의 가교를 가지는 화합물들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 가교들 각각은 독립적으로 -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- 및 -N(R1)-에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2 내지 4개의 연결 그룹들을 포함하며; 여기서: x는 0, 1, 또는 2이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 보호 그룹, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로시클 라디칼, 치환된 헤테로시클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 알리시클릭 라디칼, 치환된 C5-C7 알리시클릭 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; 그리고 각각의 J1 및 J2는, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로시클 라디칼, 치환된 헤테로시클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호 그룹이다.
LNA의 정의에 포함되는 4'- 2' 가교 그룹들의 예들에는 다음 화학식 중 하나가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)-. 더욱이, LNA의 정의에 포함되는 그 외 가교 그룹들은 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' 및 4'-CH2-N(R1)-O-2'- 가교들이며, 여기서 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 보호 그룹 또는 C1-C12 알킬이다.
본 발명에 따른 LNA의 정의에는 리보실 당 고리의 2'-하이드록실 그룹이 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결됨으로써, 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 가교를 형성하여 바이시클릭 당 모이어티를 형성하는 LNA들 또한 포함된다. 이러한 가교는 또한 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 (-CH2-) 그룹일 수 있으며, 이에 관해 용어 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA가 사용된다. 더욱이; 이 위치에 에틸렌 가교 그룹을 가지는 바이시클릭 당 모이어티의 경우, 용어 에틸렌옥시 (4'-CH2CH2-O-2') LNA가 사용된다. 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA의 이성질체인 α -L- 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 또한 본 출원에서 사용되는 LNA의 정의에 포함된다.
"미스매치(Mismatch)" 또는 "비-상보적인 핵염기"는 제 1 핵산의 핵염기가 제 2 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 페어링 할 수 없는 경우를 의미한다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 자연 발생 뉴클레오시드간 결합 (즉, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합)으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 의미한다.
"변형된 핵염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실 이외의 임의의 핵염기를 의미한다. "비변형된 핵염기"는 퓨린 염기, 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기, 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오시드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 및/또는 변형된 핵염기를 가지는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결 및/또는 변형된 핵염기를 가지는 뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 변형 당, 및/또는 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"변형 당"은 자연 당 모이어티로부터의 치환 및/또는 임의의 변화를 의미한다.
"모노머"는 한 올리고머의 단일 단위를 의미한다. 모노머들에는, 자연발생이든 변형된 것이든 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내 비변형된 및 변형된 뉴클레오시드의 패턴을 의미한다.
"자연 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH)에서 발견되는 당 모이어티를 의미한다.
"자연 발생 뉴클레오시드간 연결"은 3' 에서 5'로의 포스포디에스테르 연결을 의미한다.
"비-상보적인 핵염기"는 서로 수소 결합을 형성하지 않거나 그 외 방식으로 혼성화를 보조하지 않는 한 쌍의 핵염기들을 의미한다.
"핵산"은 모노머 뉴클레오티드로 이루어진 분자들을 의미한다. 핵산에는, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"핵염기"는 또다른 핵산의 염기와 페어링 할 수 있는 헤테로시클릭 모이어티를 의미한다.
"핵염기 상보성"은 또다른 핵염기와 염기 페어링 할 수 있는 핵염기를 의미한다. 예를 들면, DNA에서, 아데닌 (A)은 티민 (T)에 상보적이다. 예를 들면, RNA에서, 아데닌 (A)은 우라실 (U)에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 상보적인 핵염기는 해당 표적 핵산의 핵염기와 염기 페어링 할 수 있는 안티센스 화합물의 핵염기를 의미한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 있는 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치에 있는 핵염기와 수소 결합할 수 있는 경우, 이 때 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 그 핵염기 쌍에서 상보적인 것으로 고려된다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 연결, 및/또는 핵염기 변형에 무관한 인접 핵염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오시드 모방체(Nucleoside mimetic)"에는 올리고머 화합물의 하나 또는 그 이상의 위치들에 있는 당 또는 당과 염기를 대체하기 위해 사용되는 구조들이 포함되는데 반드시 연결이어야 하는 것은 아니며; 가령, 예를 들면, 뉴클레오시드 모방체는 모르폴리노, 시클로헥세닐, 시클로헥실, 테트라하이드로피라닐, 바이시클로 또는 트리시클로 당 모방체들, 예컨대, 비 퓨라노스 당 단위들을 가진다. "뉴클레오티드 유사체"에는 올리고머 화합물의 하나 또는 그 이상의 위치들에서 뉴클레오시드 및 연결을 대체하기 위해 사용되는 구조들, 가령, 예를 들면, 펩티드 핵산 또는 모르폴리노 (-N(H)-C(=O)-O- 또는 그 외 비-포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 모르폴리노)가 포함된다. 당 대용체는 약간 더 넓은 범위의 용어 뉴클레오시드 모방체와 중첩되나 당 단위들 (퓨라노스 고리) 만의 대체를 나타내기 위한 것이다. 본 출원에서 제공되는 테트라하이드로피라닐 고리는 퓨라노스 당 그룹이 테트라하이드로피라닐 고리계로 대체되어 있는 당 대용체의 한 예를 나타낸다. "모방체"는 당, 핵염기, 및/또는 뉴클레오시드간 연결에 대해 치환되는 그룹들을 의미한다. 일반적으로, 모방체는 당 또는 당-뉴클레오시드간 연결 조합을 대신하여 사용되며, 핵염기는 선택된 표적에 대한 혼성화를 위해 유지된다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 그룹을 가지는 뉴클레오시드를 의미한다.
"오프-타겟 효과(off-target effect)"는 의도한 표적 핵산 이외의 유전자의 RNA 또는 단백질 발현의 조절과 연관된 원치않은 또는 유해한 생물학적 효과를 의미한다.
"올리고머 화합물" 또는 "올리고머"는 핵산 분자의 최소한 한 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 모노머 아단위들의 폴리머를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 연결된 뉴클레오시드들의 폴리머를 의미하며, 뉴클레오시드 각각은 변형되거나 비변형될 수 있고 서로 독립적이다.
"비경구 투여"는 주사 (예컨대, 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여, 예컨대, 경막내 또는 뇌혈관내실 투여가 포함된다.
"펩티드"는 최소한 두개의 아미노산이 아미드 결합에 의하여 결합됨으로써 형성된 분자를 의미한다. 본 출원에서 사용되는 펩티드는, 제한없이, 폴리펩티드 및 단백질을 의미한다.
"제약상 제제"는 개체에 투여될 때 치료적 이점을 제공하는 물질을 의미한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, C9ORF72에 대해 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 제약학적 제제이다.
"제약상 허용가능한 유도체"는 본 출원에 기재된 화합물들의 제약상 허용가능한 염, 공액체, 전구약물 또는 이성질체들을 포함한다.
"제약상 허용가능한 염"은 안티센스 화합물의 생리학상 및 제약상 허용가능한 염, 즉, 모 올리고뉴클레오티드의 바람직한 생물학적 활성을 보유하며 바람직하지 않은 독물학적 효과들을 그에 제공하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 연결"은 비-가교 산소 원자들 중 하나가 황 원자로 대체됨으로써 포스포디에스테르 결합이 변형된, 뉴클레오시드들 간 연결을 의미한다. 포스포로티오에이트 연결은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
"부분(Portion)"은 하나의 핵산 중 정의된 수의 인접 (즉, 연결된) 핵염기를 의미한다. 특정 구체예들에서, 부분은 하나의 표적 핵산 중 정의된 수의 인접 핵염기이다. 특정 구체예들에서, 부분은 하나의 안티센스 화합물 중 정의된 수의 인접 핵염기이다.
"예방하다" 또는 "예방하는 것"은 질환, 장애, 또는 병태의 발병 또는 발생을 수분 내지 수일, 수주 내지 수개월, 또는 무기한으로 일정 시기동안 지연시키는 것 또는 미연에 방지하는 것을 의미한다.
"전구약물"은 내인성 효소들 또는 그 외 화학물질들 또는 조건들의 작용에 의해 신체 또는 신체의 세포들 내부에서 활성 형태로 전환되는, 비활성 형태로 제조되는 치료 제제를 의미한다.
"예방적 유효량"은 동물에게 예방적 또는 방지적 이점을 제공하는 제약학적 제제의 양을 의미한다.
"영역(region)"은 최소한 하나의 식별가능한 구조, 기능 또는 특성을 가지는 표적 핵산의 한 부분으로 정의된다.
"리보뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 당 부분의 2' 위치에 하이드록시를 가지는 뉴클레오티드를 의미한다. 리보뉴클레오티드는 여러가지의 임의의 치환체들로 변형될 수 있다.
"염"은 안티센스 화합물의 생리학상 및 제약상 허용가능한 염, 즉, 모 올리고뉴클레오티드의 바람직한 생물학적 활성을 보유하며 바람직하지 않은 독물학적 효과들을 그에 제공하지 않는 염을 의미한다.
"분절들(Segments)"은 하나의 표적 핵산 내 영역들의 보다 작은 하위-부분들로 정의된다.
본 출원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 "단축형(Shortened)" 또는 "절단형(truncated)" 형태는 하나, 둘 또는 그 이상의 뉴클레오시드들이 결실되어 있다.
"부작용"은 치료로 인한, 바람직한 효과들 이외의 생리학적 반응들을 의미한다. 특정 구체예들에서, 부작용에는, 제한없이, 주사 부위 반응들, 간기능 검사 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상 및 근질환이 포함된다.
"단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적인 가닥에 혼성화되지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. "단일-가닥 변형된 올리고뉴클레오티드"는 상보적인 가닥에 혼성화되지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "부위들"은 표적 핵산 내 특유한 핵염기 위치들로 정의된다.
"진행을 감속시키다"는 질환의 발달에 있어서의 감소를 의미한다.
"특이적으로 혼성화가능한"은 특이적 결합이 바람직한 조건하에서, 즉, 생체내 분석 및 치료적 처리를 하는 경우 생리학적 조건하에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 바람직한 효과를 유도하기에 충분한 정도의 상보성을 가지는 반면 비-표적 핵산들에 대해 최소의 효과를 보이거나 효과를 전혀 보이지 않는 안티센스 화합물을 의미한다.
"엄격한 혼성화 조건들" 또는 "엄격한 조건들"은 올리고머 화합물이, 이의 표적 서열에 혼성화하지만 그 외 서열들에는 최소한의 수로 혼성화하게 되는 조건을 의미한다.
"피험체"는 치료 또는 치료법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"표적"은 단백질, 조절이 필요한 단백질을 의미한다.
"표적 유전자"는 표적을 인코딩하는 유전자를 의미한다.
"표적하는" 또는 "표적된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 바람직한 효과를 유도하게 되는 안티센스 화합물의 설계 및 선택 과정을 의미한다.
"표적 핵산," "표적 RNA," 및 "표적 RNA 전사체" 및 "핵산 표적"은 모두 안티센스 화합물들에 의해 표적될 수 있는 핵산을 의미한다.
"표적 영역(target region)"은 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물들이 표적되는 표적 핵산의 일 부분을 의미한다.
"표적 분절"은 하나의 안티센스 화합물이 표적되는 표적 핵산의 뉴클레오티드들의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 분절의 5'에 가장 가까운(5'-most) 뉴클레오티드를 의미한다. "3' 표적 부위"는 표적 분절의 3'에 가장 가까운(3'-most) 뉴클레오티드를 의미한다.
"치료적 유효량"은 개체에게 치료적 이점을 제공하는 제약학적 제제의 양을 의미한다.
"치료하다" 또는 "치료하는 것" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 변화 또는 향상을 가져오기 위해 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
"비변형된 핵염기"는 퓨린 염기, 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기, (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"비변형된 뉴클레오티드"는 자연 발생 핵염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오시드간 연결들로 이루어진 뉴클레오티드를 의미한다. 특정 구체예들에서, 비변형된 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-리보뉴클레오시드) 또는 DNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-데옥시리보뉴클레오시드)이다.
"윙 분절(wing segment)"은 올리고뉴클레오티드 성질들, 가령, 개선된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도, 또는 생체내 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 제공하기 위해 변형된 복수의 뉴클레오시드를 의미한다.
특정 구체예들
특정 구체예들은 전체 C9ORF72 mRNA 및 단백질 발현을 감소시키기 위한 조성물 및 방법들을 제공한다.
특정 구체예들은 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체들을 감소시키기 위한 조성물 및 방법들을 제공한다.
특정 구체예들은 필요로 하는 개체에서 C9ORF72와 연관된 질환들의 치료, 예방, 개선 또는 진행의 감속을 위한 방법들을 제공한다. C9ORF72와 연관된 질환의 치료, 예방, 또는 개선용 약제의 제조를 위한 방법들 또한 고려된다. C9ORF72 연관 질환들에는 신경퇴행성 질환들이 포함된다. 특정 구체예들에서, 신경퇴행성 질환은 ALS 또는 FTD일 수 있다. 특정 구체예들에서, 신경퇴행성 질환은 가족성 또는 산발성 일 수 있다.
본 출원은 다음과 같은 비-제한적 수의 구체예들을 제공하였다:
구체예 1. 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 번호: 22-55의 임의의 핵염기 서열들의 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 연속 핵염기들을 포함하는 핵염기 서열을 가지는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물.
구체예 2. 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2에 최소한 80%, 최소한 81%, 최소한 82%, 최소한 83%, 최소한 84%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 상보적인, 구체예 1의 화합물.
구체예 3. 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 변형된 올리고뉴클레오티드인, 구체예 1 및 2의 화합물.
구체예 4. 변형된 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 구체예 1-3 중 어느 하나의 화합물.
구체예 5. 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 구체예 4의 화합물.
구체예 6. 변형된 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 포스포디에스테르 연결을 포함하는, 구체예 4 및 5의 화합물.
구체예 7. 각각의 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 구체예 5의 화합물.
구체예 8. 최소한 하나의 뉴클레오시드는 변형된 핵염기를 포함하는, 구체예 1-7 중 어느 하나의 화합물.
구체예 9. 변형된 핵염기는 5-메틸시토신인, 구체예 8의 화합물.
구체예 10. 변형된 올리고뉴클레오티드의 최소한 하나의 뉴클레오시드는 변형 당을 포함하는, 구체예 1-9 중 어느 하나의 화합물.
구체예 11. 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 변형 당을 포함하는, 구체예 10의 화합물.
구체예 12. 최소한 하나의 변형 당은 바이시클릭 당인, 구체예 10 또는 11의 화합물.
구체예 13. 바이시클릭 당은 당의 4'과 2' 위치들 사이에 화학적 가교를 포함하며 이러한 화학적 가교는 다음에서 선택되는, 구체예 12의 화합물: 4'-CH(R)-O-2' 및 4'-(CH2)2-O-2', 여기서 R은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 및 C1-C6 알콕시임.
구체예 14. 화학적 가교는 4'-CH(R)-O-2'이고 여기서 R은 메틸인, 구체예 13의 화합물.
구체예 15. 화학적 가교는 4'-CH(R)-O-2'이고 여기서 R은 H인, 구체예 13의 화합물.
구체예 16. 화학적 가교는 4'-CH(R)-O-2'이고 여기서 R은 -CH2-O-CH3인, 구체예 13의 화합물.
구체예 17. 최소한 하나의 변형 당은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하는, 구체예 10 또는 11의 화합물.
구체예 18. 변형된 올리고뉴클레오티드는 갭머인, 구체예 1-10 또는 12-16 중 어느 하나의 화합물.
구체예 19. 갭머는 임의의 3-8-7 MOE 갭머, 3-10-7 MOE 갭머, 4-8-6 MOE 갭머, 4-10-6 MOE 갭머, 6-10-4 MOE 갭머, 6-8-4 MOE 갭머, 7-8-3 MOE 갭머, 또는 7-10-3 MOE 갭머인, 구체예 18의 화합물.
구체예 20. 변형된 올리고뉴클레오티드는 임의의 다음 패턴들의 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 청구항 5의 화합물: soossssssssssooooss, sooossssssssssoooss, sooooossssssssssoss, soooooossssssssssss, soooosssssssssooss, sooosssssssssoooss, sooooosssssssssoss, soosssssssssoooss, soooosssssssssoss, sosssssssssooooss, 또는 sooooosssssssssss, 여기서,
s = 포스포로티오에이트 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 연결임.
구체예 19. 임의의 전술한 구체예의 화합물 또는 이의 염 및 최소한 하나의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
구체예 20. C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제를 추가로 포함하는, 구체예 19의 조성물.
구체예 21. C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제는 안티센스 화합물인, 구체예 20의 조성물.
구체예 22. 안티센스 화합물은 변형된 올리고뉴클레오티드인 구체예 21의 조성물.
구체예 23. 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥인, 구체예 22의 조성물.
구체예 24. 변형된 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 안티센스 전사체에 대해 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 상보적인 핵염기 서열을 가지는, 구체예 22 또는 23의 조성물.
구체예 25. C9ORF72 안티센스 전사체는 서열 번호: 18의 핵염기 서열을 가지는, 구체예 24의 조성물.
구체예 26. 임의의 전술한 구체예의 화합물 또는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
구체예 27. 동물은 인간인, 구체예 26의 방법.
구체예 28. 화합물을 투여하는 것은 C9ORF72 연관 질환을 예방, 치료, 개선 또는 진행을 감속시키는, 구체예 26 및 27의 방법.
구체예 29. C9ORF72 연관 질환은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부에 의해 유발되는 구체예 28의 방법.
구체예 30. C9ORF72 연관 질환은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)인, 구체예 28의 방법.
구체예 31. 투여는 핵 집합체를 감소시키는, 구체예 26-30의 방법.
구체예 32. 투여는 C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들의 발현을 감소시키는, 구체예 26-31의 방법.
구체예 33. C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 임의의 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)인, 구체예 32의 방법.
구체예 34. 신경퇴행성 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 구체예 1-33 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물의 용도.
구체예 35. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물 또는 이의 염:
구체예 36. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드의 소듐 염으로 구성된 조성물:
구체예 37. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물, 또는 이의 염:
구체예 38. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드의 소듐 염으로 구성된 조성물:
구체예 39. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물, 또는 이의 염:
구체예 40. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드의 소듐 염으로 구성된 조성물:
구체예 41. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물, 또는 이의 염:
구체예 42. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드의 소듐 염으로 구성된 조성물:
구체예 43. 화합물 또는 조성물은 포유동물에서 인간 C9ORF72 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 44. 화합물 또는 조성물은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 또는 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD) 중 최소한 하나의 증상을 개선시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 45. ALS의 증상은 운동 부족(motor deficit), 불안, 및 신경차단 중 하나인, 구체예 44의 화합물 또는 조성물.
구체예 46. 화합물 또는 조성물은 질환의 진행을 지연시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 47. 화합물 또는 조성물은 생존을 연장시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 48. 화합물 또는 조성물은 C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들을 감소시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 49. 화합물 또는 조성물은 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체들을 선택적으로 감소시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 50. 화합물 또는 조성물은 핵 집합체를 감소시킬 수 있는, 구체예 1-25 또는 35-42 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물.
구체예 51. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물 또는 이의 염:
구체예 52. 구체예 51의 화합물을 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
구체예 53. 동물은 인간인, 구체예 52의 방법.
구체예 54. 투여는 C9ORF72를 억제하는, 구체예 53의 방법.
구체예 55. 투여는 C9ORF72 연관 질환을 예방, 치료, 개선 또는 진행을 감속시키는, 구체예 53의 방법.
구체예 56. C9ORF72 연관 질환은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부에 의해 유발되는 구체예 55의 방법.
구체예 57. C9ORF72 연관 질환은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 또는 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD) 중 어느 하나인, 구체예 55의 방법.
구체예 58. 투여는 핵 집합체를 감소시키는, 구체예 53의 방법.
구체예 59. 투여는 C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들의 발현을 감소시키는, 구체예 53의 방법.
구체예 60. C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 임의의 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)인, 구체예 59의 방법.
구체예 61. 다음 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드의 소듐 염으로 구성된 조성물:
구체예 62. 구체예 60의 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
구체예 63. 동물은 인간인, 구체예 62의 방법.
구체예 64. 투여는 C9ORF72를 억제하는, 구체예 63의 방법.
구체예 65. 투여는 C9ORF72 연관 질환을 예방, 치료, 개선 또는 진행을 감속시키는, 구체예 62의 방법.
구체예 66. C9ORF72 연관 질환은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부에 의해 유발되는 구체예 65의 방법.
구체예 67. C9ORF72 연관 질환은 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군, 또는 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD) 중 어느 하나인, 구체예 65의 방법.
구체예 68. 투여는 핵 집합체를 감소시키는, 구체예 63의 방법.
구체예 69. 투여는 C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들의 발현을 감소시키는, 구체예 63의 방법.
구체예 70. C9ORF72 연관 RAN 번역 산물들은 임의의 폴리-(글리신-프롤린), 폴리-(글리신-알라닌), 및 폴리-(글리신-아르기닌)인, 구체예 69의 방법.
안티센스 화합물들
올리고머 화합물에는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대한 "안티센스" 일 수 있으며, 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화가 이루어질 수 있음을 의미한다.
특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 5' 에서 3' 방향으로 기재될 때, 표적되는 표적 핵산의 표적 분절의 역보체를 포함하는 핵염기 서열을 가진다. 이러한 특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 에서 3' 방향으로 기재될 때 표적되는 표적 핵산의 표적 분절의 역보체를 포함하는 핵염기 서열을 가진다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물은 12 내지 30개 길이의 아단위들이다. 달리 말하면, 안티센스 화합물은 12 내지 30개 연결된 아단위들이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 8 내지 80, 12 내지 50, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 연결된 아단위들이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물들은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 길이 또는 상기 수치들 중 임의의 두 개로 정의된 범위 길이의 연결된 아단위들이다. 일부 구체예들에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 그리고 연결된 아단위들은 뉴클레오시드들이다.
특정 구체예들에서 C9ORF72 핵산에 대해 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단축형 또는 절단형일 수 있다. 예를 들면, 하나의 아단위들은 5' 단부로부터 결실되거나 (5' 절단), 또는 대안적으로 3' 단부로부터 결실 (3' 절단) 될 수 있다. C9ORF72 핵산에 대해 표적되는 단축형 또는 절단형 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 5' 단부로부터 결실된 2개의 아단위들을 가질 수 있거나, 또는 대안적으로 안티센스 화합물의 3' 단부로부터 결실된 2개의 아단위들을 가질 수 있다. 대안적으로, 대안적으로, 결실된 뉴클레오시드들은 예를 들면, 5' 단부로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드 및 3' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드를 가지는 안티센스 화합물에서 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산될 수 있다.
단일의 추가 아단위들이 연장된 안티센스 화합물 내 존재하는 경우, 이러한 추가 아단위들은 안티센스 화합물의 5' 또는 3' 단부에 배치될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 추가 아단위들이 존재하는 경우, 추가되는 아단위들은, 예를 들면, 안티센스 화합물의 5' 단부에 추가되는 (5' 부가), 또는 대안적으로 3' 단부에 추가되는 (3' 부가) 2개의 아단위들을 가지는 안티센스 화합물에서 서로 인접할 수 있다. 대안적으로, 상기 추가된 아단위들은, 5' 단부에 부가된 하나의 아단위 및 3' 단부에 부가된 하나의 아단위를 가지는 안티센스 화합물에서 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산될수 있다.
안티센스 화합물, 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이를 증가 또는 감소시키는 것, 및/또는 활성을 제거하지 않고 미스매치된 염기들을 도입시키는 것이 가능하다. 예를 들면, Woolf 등은 문헌 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)에서, 13-25개 핵염기 길이의 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 난자 주입 모델에서 표적 RNA의 절단을 유도하는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 단부들 근처에 8 또는 11개 미스매치된 염기들을 가지는 25개 핵염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드들은, 미스매치를 전혀 내포하지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들 보다 적은 정도 일지라도, 표적 mRNA의 특이적 절단을 지시할 수 있었다. 유사하게, 1 또는 3개 미스매치를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 비롯한, 13개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 표적 특이적 절단이 이루어졌다.
Gautschi 등은 문헌 (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)에서 bcl-2 mRNA에 100% 상보성을 가지며 bcl-xL mRNA에 대해 3개 미스매치를 가지는 올리고뉴클레오티드가 시험관내 및 생체내에서 bcl-2 및 bcl-xL 모두의 발현을 감소시키는 능력을 입증하였다. 더욱이, 이러한 올리고뉴클레오티드는 효능있는 생체내 항-종양 활성을 나타내었다.
Maher 및 Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988)는 일련의 연쇄(tandem) 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 및 상기 연쇄 안티센스 올리고뉴클레오티드의 둘 또는 세개의 서열을 각각 포함하는 28 및 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드들을, 토끼 망상적혈구 분석에서 인간 DHFR의 번역을 정지시키는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. 각 세가지에 있어, 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드만이 28 또는 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드들보다 더 적절한 수준으로(a more modest level) 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물은 안티센스 화합물에 대해 성질, 가령, 증강된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도, 또는 생체내 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 부여하는 패턴 또는 모티프로 배열된, 화학적으로 변형된 아단위들을 가진다.
키메릭 안티센스 화합물은 일반적으로 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하기 위해 변형된 최소한 하나의 영역을 내포한다. 키메릭 안티센스 화합물의 제 2 영역은 RNA: DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단시키는 세포 엔도뉴클레아제 RNase H에 대한 기질로서 선택적으로 기능할 수 있다.
갭머 모티프를 가지는 안티센스 화합물은 키메릭 안티센스 화합물로 고려된다. 갭머에서 RNaseH 절단을 보조하는 복수의 뉴클레오티드들을 가지는 내부 영역은 내부 부위의 뉴클레오시드들과 화학적으로 구별되는 복수의 뉴클레오티드들을 가지는 외부 영역들 사이에 위치된다. 갭머 모티프를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에서, 갭 분절은 일반적으로 엔도뉴클레아제 절단을 위한 기질로서 기능하는 반면, 윙 분절은 변형된 뉴클레오시드들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 갭머 영역들은 각 구별되는 영역을 포함하는 당 모이어티 유형들에 의해 분화된다. 상기 갭머 영역들을 분화시키기 위해 사용되는 당 모이어티의 유형들은, 일부 구체예들에서, β-D-리보뉴클레오시드, β-D-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (이러한 2'-변형된 뉴클레오시드는 그중에서도 2'-MOE, 및 2'-O-CH3를 포함할 수 있다), 및 바이시클릭 당 변형된 뉴클레오시드 (이러한 바이시클릭 당 변형된 뉴클레오시드는 n=1 또는 n=2인 4'-(CH2)n-O-2' 가교 및 4'-CH2-O-CH2-2'을 가지는 것들을 포함할 수 있다)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 구별되는 영역은 균일한(uniform) 당 모이어티를 포함한다. 윙-갭-윙 모티프는 흔히 "X-Y-Z"로 기재되는데, 여기서 "X"는 5' 윙 영역의 길이를 나타내고, "Y"는 갭 영역의 길이를 나타내며, "Z"는 3' 윙 영역의 길이를 나타낸다. 본 출원에서 사용되는, "X-Y-Z"로 기재되는 갭머는 갭 분절이 5' 윙 분절 및 3' 윙 분절의 각각에 바로 인접하여 위치되도록 하는 배열을 가진다. 그러므로 5' 윙 분절과 갭 분절 사이, 또는 갭 분절과 3' 윙 분절 사이에 개입 뉴클레오티드(intervening nucleotide)들은 전혀 존재하지 않는다. 본 출원에 기재된 임의의 안티센스 화합물은 갭머 모티프를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, X 및 Z는 동일하고; 다른 구체예들에서 이들은 상이하다. 한 바람직한 구체예에서, Y는 8 내지 15개 뉴클레오티드이다. X, Y, 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개 또는 그 이상의 임의의 뉴클레오티드들 일 수 있다. 그러므로 본 출원에 기재된 갭머들은, 예를 들면 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, 또는 4-7-4를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예들에서, "윙머(wingmer)" 모티프로서 안티센스 화합물은 윙-갭 또는 갭-윙 구조, 즉, 갭머 구조로 상기 기재된 바와 같은 X-Y 또는 Y-Z 구조를 가진다. 그러므로 본 출원에 기재된 윙머 배열은, 예를 들면 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8, 또는 6-8을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물들은 5-10-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물들은 5-8-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물들은 임의의 다음 패턴의 당 변형들을 보유한다: eeekkdddddddkkeee, eekkddddddddkkeee, ekddddddddekekeee, kekeddddddddekeke, 및 ekekddddddddkekee; 여기서,
e = 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드
d = 2'-데옥시뉴클레오시드, 그리고
k = cEt 뉴클레오시드이다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물은 갭-협소(gap-narrowed) 모티프를 가진다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적되는 갭-협소 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드들의 윙 분절들 사이에 바로 인접하여 위치된 9, 8, 7, 또는 6개 2'-데옥시뉴클레오티드의 갭 분절을 가진다. 특정 구체예들에서, 화학적 변형은 바이시클릭 당을 포함한다. 특정 구체예들에서, 바이시클릭 당은 다음에서 선택된 4'에서 2' 으로의 가교를 포함한다: 4'-(CH2)n-O-2' 가교, 여기서 n은 1 또는 2이고; 그리고 4'-CH2-O-CH2-2'. 특정 구체예들에서, 바이시클릭 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함한다. 특정 구체예들에서, 화학적 변형은 비-바이시클릭 2'-변형 당 모이어티를 포함한다. 특정 구체예들에서, 비-바이시클릭 2'-변형 당 모이어티는 2'-O-메틸에틸 그룹 또는 2'-O-메틸 그룹을 포함한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오티드 서열
C9ORF72를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들에는, 제한없이, 다음이 포함된다: GENBANK 등록 번호 NM_001256054.1의 보체 (본 출원에서 서열 번호: 1로 포함됨), 핵염기 27535000로부터 27565000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NT_008413.18의 보체 (본 출원에서 서열 번호: 2로 포함됨), GENBANK 등록 번호 BQ068108.1 (본 출원에서 서열 번호: 3으로 포함됨), GENBANK 등록 번호 NM_018325.3 (본 출원에서 서열 번호: 4로 포함됨), GENBANK 등록 번호 DN993522.1 (본 출원에서 서열 번호: 5로 포함됨), GENBANK 등록 번호 NM_145005.5 (본 출원에서 서열 번호: 6으로 포함됨), GENBANK 등록 번호 DB_079375.1 (본 출원에서 서열 번호: 7로 포함됨), GENBANK 등록 번호 BU194591.1 (본 출원에서 서열 번호: 8로 포함됨), 서열 식별자 4141_014_A (본 출원에서 서열 번호: 9로 포함됨), 및 서열 식별자 4008_73_A (본 출원에서 서열 번호: 10으로 포함됨), 그리고 뉴클레오시드 8522000로부터 8552000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NW_001101662.1 (본 출원에서 서열 번호: 11로 포함됨).
본 출원에 포함된 실시예들에서 각 서열 번호에 제시된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 임의의 변형과 무관함을 이해하여야 한다. 이렇게, 하나의 서열 번호에 의해 정의된 안티센스 화합물은 독립적으로, 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 하나 또는 그 이상의 변형들을 포함할 수 있다. Isis 번호 (Isis No)로 기재된 안티센스 화합물은 핵염기 서열 및 모티프의 조합을 표시한다.
특정 구체예들에서, 표적 영역은 표적 핵산 중 구조적으로 정의된 영역이다. 예를 들면, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합부, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종결 영역, 또는 그 외 정의된 핵산 영역을 포함할 수 있다. C9ORF72에 관해 구조적으로 정의된 영역들은 서열 데이터베이스, 가령, NCBI의 등록 번호에 의해 얻을 수 있으며 이러한 정보는 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 특정 구체예들에서, 표적 영역은 동일한 표적 영역 내 하나의 표적 분절의 5' 표적 부위로부터 그 표적 영역 내 또다른 표적 분절의 3' 표적 부위까지의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 안티센스 화합물이 혼성화하여 바람직한 효과가 발생하는 최소한 하나의 표적 분절의 결정을 포함한다. 특정 구체예들에서, 바람직한 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소이다. 특정 구체예들에서, 바람직한 효과는 표적 핵산에 의해 인코딩되는 단백질 수준의 감소 또는 표적 핵산과 관련된 표현형 변화이다.
표적 영역은 하나 또는 그 이상의 표적 분절들을 내포할 수 있다. 표적 영역 내 복수의 표적 분절들은 중첩될 수 있다. 대안적으로, 이들은 비-중첩될 수 있다. 특정 구체예들에서, 표적 영역 내 표적 분절들은 약 300 개 이하의 뉴클레오티드들에 의해 분리될 수 있다. 특정 구체예들에서, 표적 영역 내 표적 분절들은 수많은 뉴클레오티드들에 의해 분리되는데, 이들 뉴클레오티드들은 표적 핵산 상의 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개 뉴클레오티드들이거나, 대략 이러한 수치이거나, 그 이하이거나, 대략 그 이하이거나, 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이다. 특정 구체예들에서, 표적 영역 내 표적 분절들들은 표적 핵산 상의 5개 이하, 또는 대략 5개 이하의 뉴클레오티드들에 의해 분리된다. 특정 구체예들에서, 표적 분절들은 인접해있다. 본 출원에서 열거된 5' 표적 부위들 또는 3' 표적 부위들 중 어느 하나인 개시 핵산을 가지는 범위에 의해 정의된 표적 영역들이 고려된다.
적합한 표적 분절들은 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손, 또는 엑손/인트론 접합부 내에서 찾을 수 있다. 개시 코돈 또는 종결 코돈을 내포하는 표적 분절들 또한 적합한 표적 분절들이다. 적합한 표적 분절은 구조적으로 정의된 특정 영역, 가령, 개시 코돈 또는 종결 코돈을 특이적으로 배제시킬 수 있다.
적합한 표적 분절들의 결정은 유전체 전반에 걸친 다른 서열들에 대한 표적 핵산 서열의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들면, BLAST 알고리즘은 상이한 핵산들간의 유사성 영역들을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산 이외의 서열 (즉, 비-표적 또는 오프-타겟 서열들)에 비-특이적 방식으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물 서열들의 선택을 방지할 수 있다.
표적 영역 내에서 안티센스 화합물의 활성 (예컨대, 표적 핵산 수준의 감소 백분율로 정의되는 바와 같은)의 변화가 존재할 수 있다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 mRNA 수준의 감소는 C9ORF72 발현의 억제에 대한 지표이다. C9ORF72 단백질 수준의 감소는 표적 mRNA 발현의 억제에 대한 지표이다. 확장된 C9ORF72 RNA 집합체의 존재시 감소는 C9ORF72 발현의 억제에 관한 지표이다. 더욱이, 표현형 변화는 C9ORF7 발현의 억제에 관한 지표이다. 예를 들면, 향상된 운동 기능 및 호흡은 C9ORF72 발현의 억제에 관한 지표가 될 수 있다.
혼성화
일부 구체예들에서, 혼성화는 본 출원에 개시된 안티센스 화합물과 C9ORF72 핵산간에 발생한다. 가장 통상적인 혼성화 기전은 핵산 분자들의 상보적 핵염기 간의 수소 결합 (예컨대, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴(reversed Hoogsteen) 수소 결합)과 관련된다.
혼성화는 다양한 조건들하에 발생할 수 있다. 엄격한 조건들은 서열-의존적이며 혼성화되는 핵산 분자들의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 특이적으로 혼성화가능한지 여부의 결정 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 특정 구체예들에서, 본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물은 C9ORF72 핵산과 특이적으로 혼성화가능하다.
상보성
안티센스 화합물 및 표적 핵산은 충분한 수의 안티센스 화합물 핵염기들이 상응하는 표적 핵산의 핵염기와 수소 결합하여, 바람직한 효과(예컨대, 표적 핵산, 가령, C9ORF72 핵산의 안티센스 억제)가 발생하게 될 경우 서로 상보적이다.
안티센스 화합물과 C9ORF72 핵산 간 비-상보적인 핵염기들은 안티센스 화합물이 표적 핵산에 대해 특이적으로 혼성화할 수 있게 유지됨을 조건으로 내약성을 띨 수 있다. 더욱이, 안티센스 화합물은 개입 또는 인접 분절들이 혼성화가 일어날 때 관여되지 않도록 C9ORF72 핵산의 하나 또는 그 이상의 분절들에 걸쳐 혼성화될 수 있다 (예컨대, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조).
특정 구체예들에서, 본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물 또는 이의 특정 부분은, C9ORF72 핵산, 표적 영역, 표적 분절, 또는 이의 특정 부분에 대해 최소한 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적이거나, 또는 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적이다. 안티센스 화합물의 표적 핵산과의 상보성 백분율은 통상의 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.
예를 들면, 안티센스 화합물의 20개 핵염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이고 그에 따라 특이적으로 혼성화하게 되는 안티센스 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낸다. 이 예에서, 비상보적인 잔여 핵염기는 상보적인 핵염기와 집락을 형성하거나 상보적인 핵염기들 사이에 배치될 수 있으며 서로에 또는 상보적인 핵염기에 인접할 필요가 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전히 상보성인 두 개 영역들에 의해 플랭크된 4 개(네개)의 비-상보적인 핵염기를 가지는 18개 핵염기 길이의 안티센스 화합물은 표적 핵산과 총 77.8% 상보성을 가질 것이므로, 본 발명의 범위에 속하게 된다. 표적 핵산의 한 영역과 안티센스 화합물의 상보성 백분율은 해당 분야에 공지된 BLAST 프로그램 (기본적인 국소 정렬 조사 도구) 및 PowerBLAST 프로그램 (Altschul 등, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656)을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 백분율 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은, 예를 들면, 디폴트 세팅을 이용하는 Gap 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용하여 결정될 수 있는데, 이 프로그램은 Smith와 Waterman 알고리즘을 사용한다 (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
특정 구체예들에서, 본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물 또는 이의 특정 부분들은 표적 핵산 또는 이의 특정 부분에 대해 완전히 상보적이다 (즉, 100% 상보적이다). 예를 들면, 안티센스 화합물은 C9ORF72 핵산, 또는 이의 표적 영역, 또는 표적 분절 또는 표적 서열에 대해 완전히 상보적 일 수 있다. 본 출원에서 사용되는, "완전히 상보적"은 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확히 염기 페어링 할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 20개 핵염기 안티센스 화합물은, 표적 핵산 중 이러한 안티센스 화합물에 완전히 상보적인 상응하는 20개 핵염기 부분이 존재하는 한 400개 핵염기 길이의 표적 서열에 대해 완전히 상보적이다. 완전히 상보적은 또한 제 1 및/또는 제 2 핵산의 특정 부분과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 30개 핵염기 안티센스 화합물 중 20개 핵염기 부분은 400개 핵염기 길이인 표적 서열에 "완전히 상보적"일 수 있다. 표적 서열이 상응하는 20개 핵염기 부분을 가지고 이 때 각각의 핵염기가 상기 안티센스 화합물의 20개 핵염기 부분에 상보적인 경우, 30개 핵염기 올리고뉴클레오티드 중 20개 핵염기 부분은 표적 서열에 완전히 상보적이다. 동시에, 이러한 전체 30개 핵염기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물 중 나머지 10개 핵염기 또한 표적 서열에 상보적인지 여부에 따라 표적 서열에 완전히 상보적이거나 완전히 상보적이지는 않을 수도 있다.
비-상보적인 핵염기의 배치는 안티센스 화합물의 5' 단부 또는 3' 단부에 있을 수 있다. 대안적으로, 비-상보적인 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 있을 수 있다. 둘 또는 그 이상의 비-상보적인 핵염기가 존재할 경우, 이들은 인접 (즉, 연결)하거나 인접하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 비-상보적인 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드의 윙 분절에 배치된다.
특정 구체예들에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이인 또는 최대 이러한 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 가령, C9ORF72 핵산, 또는 이의 특정 부분과 비교하여 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적인 핵염기(들)을 포함한다.
특정 구체예들에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 핵염기 길이인 또는 최대 이러한 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 가령, C9ORF72 핵산, 또는 이의 특정 부분과 비교하여 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적인 핵염기(들)을 포함한다.
본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물은 또한 표적 핵산의 한 부분에 상보적인 화합물들을 포함한다. 본 출원에서 사용되는, "부분(portion)"은 표적 핵산의 한 영역 또는 분절 내에서 인접 (즉, 연결)된 핵염기의 정의된 수를 의미한다. "부분"은 또한 안티센스 화합물의 인접 핵염기의 정의된 수를 의미할 수도 있다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 8개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 9개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 10개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 11개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 12개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 13개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 14개 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 최소한 15개 핵염기 부분에 상보적이다. 표적 분절의 최소한 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개로 정의되는 범위의 핵염기 부분에 상보적인 안티센스 화합물 또한 고려된다.
동일성
본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물은 명시된 Isis 번호로 나타내어지는 특정 뉴클레오티드 서열, 서열 번호, 또는 화합물 또는 이의 부분에 대해 정의된 동일성 백분율을 가질 수도 있다. 본 출원에서 사용될 때, 안티센스 화합물은 이것이 동일한 핵염기 페어링 능력을 가지는 경우 본 출원에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들면, 개시된 DNA 서열에서 티미딘 대신 우라실을 내포하는 RNA는 우라실과 티미딘 모두가 아데닌과 페어링하기 때문에 DNA 서열과 동일한 것으로 고려될 것이다. 본 출원에 기재된 안티센스 화합물 뿐만 아니라 본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물과 비교하여 비-동일성인 염기들을 가지는 화합물의 단축형 및 연장형 형태들 또한 고려된다. 비-동일성 염기들은 서로 인접하거나 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산될 수 있다. 안티센스 화합물의 동일성 백분율은 비교되는 서열과 비교하여 동일한 염기 페어링을 가지는 염기들의 수에 따라 계산된다.
특정 구체예들에서, 안티센스 화합물, 또는 이의 부분들은, 본 출원에 개시된 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물 또는 서열 번호, 또는 이의 부분과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
특정 구체예들에서, 안티센스 화합물의 한 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다. 특정 구체예들에서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 핵염기 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다.
특정 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 한 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다. 특정 구체예들에서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 핵염기 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다.
변형들
뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 핵염기 (염기로도 공지됨) 부분은 보통 헤테로시클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 그룹을 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토퓨라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드들에 있어서, 포스페이트 그룹은 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 인접 뉴클레오시드들의 서로에 대한 공유 연결을 통해 올리고뉴클레오티드가 형성되어, 선형 폴리머 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 그룹들은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결들을 형성하는 것으로 언급된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오시드간 연결, 당 모이어티, 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포함한다. 변형된 안티센스 화합물은 흔히 바람직한 성질들, 가령, 예를 들면, 증강된 세포 흡수, 증강된 핵산 표적에 대한 친화도, 뉴클레아제 존재시 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성으로 인해 고유 형태들 보다 바람직하다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드들은 또한 표적 핵산에 대한 단축형 또는 절단형 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 결과적으로, 이러한 화학적으로 변형된 뉴클레오시드들을 가지는 보다 짧은 안티센스 화합물을 이용하여 비슷한 결과들을 얻을 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
RNA와 DNA의 자연 발생 뉴클레오시드간 연결은 3' 에서 5' 으로의 포스포디에스테르 연결이다. 하나 또는 그 이상의 변형된, 즉, 비-자연 발생의, 뉴클레오시드간 연결들을 가지는 안티센스 화합물은 바람직한 성질, 가령, 예를 들면, 증강된 세포 흡수, 표적 핵산들에 대한 증강된 친화도, 및 뉴클레아제의 존재시 증가된 안정성으로 인해 자연 발생 뉴클레오시드간 연결들을 가지는 안티센스 화합물보다 더 흔히 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결들을 가지는 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 연결들 뿐만 아니라 인 원자를 가지지 않는 뉴클레오시드간 연결들을 포함한다. 대표적인 인 내포 뉴클레오시드간 연결들에는, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 인-내포 및 비-인-내포 연결들의 제조방법들은 널리 공지되어 있다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물은 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결들은 안티센스 화합물 전반에 걸쳐 사이사이 배치된다. 특정 구체예들에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결들이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적되는 안티센스 화합물들은 최소한 하나의 포스포디에스테르 연결 및 최소한 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적되는 안티센스 화합물들은 임의의 다음 패턴들의 뉴클레오시드간 연결들을 보유한다: soooossssssssssooss, sooosssssssssooss, soosssssssssooss, 및 sosssssssssoooss; 여기서,
s = 포스포로티오에이트 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 연결이다.
변형 당 모이어티
본 발명의 안티센스 화합물은 당 그룹이 변형되어 있는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드들을 선택적으로 내포할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드들은 증강된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화도, 또는 일부 그 외 유익한 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 특정 구체예들에서, 뉴클레오시드들은 화학적으로 변형된 리보퓨라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보퓨라노스 고리들의 예들에는, 치환체 그룹들 (5' 및 2' 치환체 그룹들 포함)의 부가, 바이시클릭 핵산 (BNA)을 형성하기 위한 비-제미날 고리 원자들의 가교, 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R2) (R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호 그룹)로의 대체 및 이의 조합이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 변형된 당들의 예들에는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (그 외 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오시드들에 관하여 8/21/08에 공개된 PCT 국제출원 WO 2008/101157 참고) 또는 2'-위치에서 S로 추가 치환된 리보실 고리 산소 원자의 대체 (2005년 6월 15일에 공개된 미국 공개 특허 출원 US2005-0130923 참고) 또는 대안적으로 BNA의 5'-치환 (11/22/07에 공개된 PCT 국제출원 WO 2007/134181 참고, 여기서 LNA는 예를 들면, 5'-메틸 또는 5'-비닐기로 치환됨)이 포함된다.
변형된 당 모이어티를 가지는 뉴클레오시드들의 예에는 제한없이, 5'-비닐, 5'-메틸 (R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환체 그룹들을 포함하는 뉴클레오시드들이 포함된다. 2' 위치에서의 치환체는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)에서 선택될 수 있으며, 여기서 각각의 Rl, Rm 및 Rn는, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다.
본 출원에서 사용되는, "바이시클릭 뉴클레오시드"는 바이시클릭 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오시드들을 의미한다. 바이시클릭 핵산 (BNAs)의 예에는 4'과 2' 리보실 고리 원자들간의 가교를 포함하는 뉴클레오시드들이 제한없이 포함된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에서 제공되는 안티센스 화합물은 가교가 다음 화학식 중 하나를 포함하는 하나 또는 그 이상의 BNA 뉴클레오시드들을 포함한다: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (및 이의 유사체들, 2008년 7월 15일 등록된 미국 특허 7,399,845 참고); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체들, 2009년 1월 8일, WO/2009/006478로 공개된 PCT/US2008/068922 참고); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 이의 유사체들, 2008년 12월 11일 WO/2008/150729로 공개된 PCT/US2008/064591 참고); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (2004년 9월 2일 공개된 미국 공개 특허출원 US2004-0171570 참고); 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹임 (2008년 9월 23일 등록된 미국 특허 7,427,672 참고); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (Chattopadhyaya 등의 문헌, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참고); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2' (및 이의 유사체들, 2008년 12월 8일 WO 2008/154401로 공개된 PCT/US2008/066154 참고).
또다른 바이시클릭 뉴클레오시드들이 공개된 문헌들에 기록되어 있다 (예를 들면: Srivastava 등, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden 등, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi 등, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch 등, Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum 등, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Singh 등, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh 등, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; 미국 특허 제: 7,399,845; 7,053,207; 7,034,133; 6,794,499; 6,770,748; 6,670,461; 6,525,191; 6,268,490; 미국 공개 특허 제: US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; 미국 특허 출원 번호: 12/129,154; 61/099,844; 61/097,787; 61/086,231; 61/056,564; 61/026,998; 61/026,995; 60/989,574; 국제 출원 WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; 및 PCT 국제 출원 제: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; 및 PCT/US2008/064591 참고). 전술한 바이시클릭 뉴클레오시드들 각각은, 예를 들면, α-L-리보퓨라노스 및 β-D-리보퓨라노스를 비롯한 하나 또는 그 이상의 입체화학적 당 구조를 가지도록 제조될 수 있다 (1999년 3월 25일 WO 99/14226로 공개된 PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393 참고).
본 출원에서 사용되는, "모노시클릭 뉴클레오시드"는 바이시클릭 당 모이어티가 아닌 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드들을 의미한다. 특정 구체예들에서, 뉴클레오시드의 당 모이어티, 또는 당 모이어티 유사체는 임의의 위치에서 변형 또는 치환될 수 있다.
본 출원에서 사용되는, "4'-2' 바이시클릭 뉴클레오시드" 또는 "4' 에서 2' 바이시클릭 뉴클레오시드"는 당 고리의 2' 탄소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 퓨라노스 고리의 2개의 탄소 원자들을 연결하는 가교를 포함한, 퓨라노스 고리를 포함하는 바이시클릭 뉴클레오시드를 의미한다.
특정 구체예들에서, BNA 뉴클레오시드들의 바이시클릭 당 모이어티에는, -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, 및 -N(Ra)-에서 독립적으로 선택된 1 또는 1 내지 4개 연결기를 포함하는 가교를 포함하는 (이에 제한되지 않음), 펜토퓨라노실 당 모이어티의 4' 및 2' 탄소 원자들 간에 최소한 하나의 가교를 가지는 화합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니며; 여기서: x는 0, 1, 또는 2이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이고; Ra 및 Rb 각각은 독립적으로, H, 보호 그룹, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로시클 라디칼, 치환된 헤테로시클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 알리시클릭 라디칼, 치환된 C5-C7 알리시클릭 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; 그리고
각각의 J1 및 J2는, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로시클 라디칼, 치환된 헤테로시클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호 그룹이다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 당 모이어티의 가교는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는 -C(RaRb)-O-N(R)-이다. 특정 구체예들에서, 가교는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2'-이고, 여기서 각각의 R은, 독립적으로, H, 보호 그룹 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 이성질체 배열에 의해 추가로 정의된다. 예를 들면, 4'-(CH2)-O-2' 가교를 포함하는 뉴클레오시드는 α-L 배열 또는 β-D 배열로 존재할 수 있다. 종래에, α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA는 안티센스 활성을 보였던 안티센스 올리고뉴클레오티드들에 포함되었다 (Frieden 등, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 4' 에서 2' 가교를 가지는 것들을 포함하며, 여기서 이러한 가교들은, α-L-4'-(CH2)-O-2', β-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2-CH(CH3)-2', 및 4'-(CH2)3-2'를 제한없이 포함하고, R은 H, 보호 그룹 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
-Qa-Qb-Qc-는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH2이고;
Rc는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호 그룹이고; 그리고
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이고;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티올이다.
한 구체예에서, 각각의 치환체 그룹들은, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, 및 NJeC(=X)NJcJd에서 독립적으로 선택된 치환체 그룹들로 단일 또는 다중치환되며, 여기서 각각의 Jc, Jd 및 Je는, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고 X는 O 또는 NJc이다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이고;
Zb는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 치환된 아실 (C(=O)-)이다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이고;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
각각의 qa, qb, qc 및 qd는, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다;
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이고;
qa, qb, qe 및 qf는 각각, 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
또는 qe 및 qf는 함께 =C(qg)(qh)이고;
qg 및 qh는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-CH2-O-2' 가교를 가지는 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실 바이시클릭 뉴클레오시드들의 합성 및 제조 및 올리고머화, 및 핵산 인식 성질은 이미 기재된 바 있다 (Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). 바이시클릭 뉴클레오시드들의 합성은 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226에서 설명된 바 있다.
4' 에서 2' 가교 그룹, 가령, 4'-CH2-O-2' 및 4'-CH2-S-2'을 가지는 다양한 바이시클릭 뉴클레오시드들의 유사체들 또한 이미 제조된 바 있다 (Kumar 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 폴리머라제들에 대한 기질로서 사용하기 위한 바이시클릭 뉴클레오시드들을 포함하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 듀플렉스들의 제조 또한 설명된 바 있다 (Wengel 등, WO 99/14226). 더욱이, 입체적으로 제한된 높은-친화도의 신규한 올리고뉴클레오티드 유사체인 2'-아미노-BNA의 합성은 해당 분야에서 이미 기재된 바 있다 (Singh 등, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA가 제조된 바 있으며, 상보적인 RNA 및 DNA 가닥들을 가지는 이들의 듀플렉스의 열 안정성이 이미 보고된 바 있다.
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들은 다음 화학식을 가진다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각, 독립적으로 H, 하이드록실 보호 그룹, 공액체 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티 또는 지지 매질(support medium)에 대한 공유 부착이고;
각각의 qi, qj, qk 및 ql은, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고; 그리고
qi와 qj 또는 ql과 qk는 함께 =C(qg)(qh)이고, 여기서 qg 및 qh 각각은 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 가교 및 알케닐 유사체 가교 4'-CH=CH-CH2-2'를 가지는 하나의 카르보시클릭 바이시클릭 뉴클레오시드가 기재된 바 있다 (Frier 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek 등, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). 카르보시클릭 바이시클릭 뉴클레오시드들의 합성 및 제조 및 이들의 올리고머화 및 생화학적 연구가 기재된 바 있다 (Srivastava 등, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
특정 구체예들에서, 바이시클릭 뉴클레오시드들에는, 하기 도시된 바와 같은 (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA , (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA , (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA (속박된 에틸 또는 cEt로도 언급됨), (G) 메틸렌-티오 (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카르보시클릭 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) 프로필렌 카르보시클릭 (4'-(CH2)3-2') BNA, 및 (K) 비닐 BNA가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서 Bx는 염기 모이어티이고 R은, 독립적으로, H, 보호 그룹, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "변형된 테트라히드로피란 뉴클레오시드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오시드"는 정상 뉴클레오시드에서 펜토퓨라노실 잔기에 대해 치환된 6원의 테트라히드로피란 "당"을 가지는 뉴클레오시드를 의미하며 당 대용체로 언급될 수 있다. 변형된 THP 뉴클레오시드들에는, 헥시톨 핵산 (HNA), 아니톨 핵산 (ANA), 마니톨 핵산 (manitol nucleic acid, MNA) (Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 참고) 또는 하기 도시된 테트라하이드로피라닐 고리계를 가지는 플루오로 HNA (F-HNA)로 해당 분야에서 언급되는 것이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 다음 화학식을 가지는 당 대용체들이 선택된다:
여기서:
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각, 독립적으로, 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 올리고머 화합물에 연결하는 뉴클레오시드간 연결기이거나 T3 및 T4 중 하나는 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 올리고머 화합물 또는 올리고뉴클레오티드에 연결하는 뉴클레오시드간 연결기이고 T3 및 T4 중 다른 하나는 H, a 하이드록실 보호 그룹, 연결된 공액체 그룹 또는 5' 또는 3'-말단 그룹이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; 그리고
R1 및 R2 중 하나는 수소이고 다른 하나는 할로겐, 치환된 또는 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN에서 선택되며, 여기서 X는 O, S 또는 NJ1이고 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구체예들에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 H이다. 특정 구체예들에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 최소한 하나는 H가 아니다. 특정 구체예들에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 최소한 하나는 메틸이다. 특정 구체예들에서, R1 및 R2 중 하나가 F인 THP 뉴클레오시드들이 제공된다. 특정 구체예들에서, R1은 플루오로이고 R2는 H이며; R1은 메톡시이고 R2는 H이며, 그리고 R1은 메톡시에톡시이고 R2는 H이다.
특정 구체예들에서, 당 대용체들은 5개 초과의 원자들과 1개 초과의 헤테로원자를 가지는 고리를 포함한다. 예를 들면, 모르폴리노 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드들 및 이들의 올리고머 화합물에서의 용도가 보고된 바 있다 (예를 들면: Braasch 등, Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; 및 미국 특허 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; 및 5,034,506 참고). 본 출원에서 사용되는 용어 "모르폴리노"는 다음 화학식을 가지는 당 대용체를 의미한다:
특정 구체예들에서, 모르폴리노는, 예를 들면, 상기 모르폴리노 구조에서 다양한 치환체 그룹들을 부가 또는 변화시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 당 대용체들은 본 출원에서 "변형된 모르폴리노"로 언급된다.
또한 변형들의 조합, 가령, 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (그 외 5', 2'-비스 치환된 뉴클레오시드들도 개시에 관하여, 8/21/08에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157 참고) 및 리보실 고리 산소 원자의 S로의 대체와 2'-위치에서의 추가 치환 (2005년 6월 16일 공개된 미국 공개 특허 출원 US2005-0130923 참고) 또는 대안적으로 바이시클릭 핵산의 5'-치환 (11/22/07 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181 참고, 여기서 4'-CH2-O-2' 바이시클릭 뉴클레오시드는 5' 위치에서 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹으로 추가 치환됨)도 제한없이 제공된다. 카르보시클릭 바이시클릭 뉴클레오시드들의 합성 및 제조 및 이들의 올리고머화 및 생화학적 연구가 기재된 바 있다 (예컨대, Srivastava 등, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379 참고).
특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 하나 또는 그 이상의 변형된 시클로헥세닐 뉴클레오시드들을 포함하는데, 이는 자연 발생 뉴클레오시드에서 펜토퓨라노실 잔기 대신 6원의 시클로헥세닐을 가지는 뉴클레오시드이다. 변형된 시클로헥세닐 뉴클레오시드들에는, 해당 분야에서 기재된 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다 (예를 들면, 통상적으로, 2010년 4월 10일 공개된 PCT 공개 출원 WO 2010/036696, Robeyns 등, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horvath 등, Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts 등, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu 등,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts 등, Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns 등, Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu 등, Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu 등, Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang 등, J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure 등, Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang 등, J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang 등, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang 등, J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; PCT 공개 출원, WO 06/047842; 및 PCT 공개 출원 WO 01/049687 참고; 각 내용은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다). 특정한 변형된 시클로헥세닐 뉴클레오시드들은 다음 화학식 X를 가진다.
Bx는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각, 독립적으로, 시클로헥세닐 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 연결시키는 뉴클레오시드간 연결기이거나 T3 및 T4 중 하나는 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 연결시키는 뉴클레오시드간 연결기이고 T3 및 T4 중 다른 하나는 H, 하이드록실 보호 그룹, 연결된 공액체 그룹, 또는 5'- 또는 3'-말단 그룹이고; 그리고
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 및 q9는 각각, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 그 외 당 치환체 그룹이다.
본 출원에서 제공되는 올리고머 화합물로의 혼입을 위해 뉴클레오시드들을 변형시키는데 사용될 수 있는 그 외 많은 모노시클릭, 바이시클릭 및 트리시클릭 고리계는 해당 분야에 공지이며 당 대용체로 적합하다 (예를 들면, 논문: Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854 참고). 이러한 고리계는 이들의 활성을 더욱 증강시키기 위해 다양한 추가 치환을 거칠 수 있다.
본 출원에서 사용되는, "2'-변형된 당"은 2' 위치에서 변형된 퓨라노실 당을 의미한다. 특정 구체예들에서, 이러한 변형들은 다음에서 선택된 치환체들을 포함한다: 치환된 및 비치환된 알콕시, 치환된 및 비치환된 티오알킬, 치환된 및 비치환된 아미노 알킬, 치환된 및 비치환된 알킬, 치환된 및 비치환된 알릴, 그리고 치환된 및 비치환된 알키닐을 포함한 할라이드 (그러나 이에 제한되는 것은 아님). 특정 구체예들에서, 2' 변형들은 다음을 포함하는 치환체들에서 선택되나 이에 제한되는 것은 아니다: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 그 외 2'- 치환체 그룹들은 또한 다음에서 선택될 수 있다: C1-C12 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 리포터기(reporter group), 인터컬레이터, 약동학적 성질을 향상시키는 작용기, 또는 안티센스 화합물의 약력학적 성질을 향상시키는 작용기, 및 유사한 성질을 가지는 그 외 치환체들. 특정 구체예들에서, 변형된 뉴클레오시드들은 2'-MOE 측쇄를 포함한다 (Baker 등, J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). 이러한 2'-MOE 치환은 비변형된 뉴클레오시드 및 그 외 변형된 뉴클레오시드들, 가령, 2'- O-메틸, O-프로필, 및 O-아미노프로필에 비해 향상된 결합 친화도를 가지는 것으로 기재된 바 있다. 2'-MOE 치환체를 가지는 올리고뉴클레오티드들은 또한 생체내 사용을 위한 유망한 특징들을 가지는 유전자 발현의 안티센스 억제제임이 밝혀진 바 있다 (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann 등, Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann 등, Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; 및 Altmann 등, Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
본 출원에서 사용되는, "2'-변형된" 또는 "2'-치환된"은 2' 위치에 H 또는 OH 이외의 치환체를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 2'-변형된 뉴클레오시드들에는, 당 고리의 2개의 탄소 원자들을 연결하는 가교가 당 고리의 2' 탄소와 또다른 탄소를 연결하는 바이시클릭 뉴클레오시드들; 및 비-가교 2'치환체들, 가령, 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)을 가지며, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬인 뉴클레오시드들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 2'-변형된 뉴클레오시드들은 당의 다른 위치들에서 및/또는 핵염기에서 다른 변형들을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는, "2'-F"는 당 고리의 2' 위치에 플루오로 그룹을 포함하는 당을 포함한 뉴클레오시드를 의미한다.
본 출원에서 사용되는, "2'-OMe" 또는 "2'-OCH3", "2'-O-메틸" 또는 "2'-메톡시" 각각은 당 고리의 2' 위치에 -OCH3기를 포함하는 당을 포함한 뉴클레오시드를 의미한다.
본 출원에서 사용되는, "MOE" 또는 "2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3" 또는 "2'-O-메톡시에틸" 각각은 당 고리의 2' 위치에 -OCH2CH2OCH3기를 포함하는 당을 포함한 뉴클레오시드를 의미한다.
변형된 당들의 제조 방법들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 널리 공지되어 있다. 이러한 변형된 당의 제조를 개시하는 몇몇 대표적인 미국 특허들에는 U.S.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 및 6,600,032, 그리고 2005년 12월 22일 WO 2005/121371로 공개된, 2005년 6월 2일 출원된 국제 출원 PCT/US2005/019219이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
본 출원에서 사용되는, "올리고뉴클레오티드"는 복수의 연결된 뉴클레오시드들을 포함하는 화합물을 의미한다. 특정 구체예들에서, 복수의 뉴클레오시드들 중 하나 또는 그 이상은 변형된다. 특정 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 리보뉴클레오시드 (RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오시드 (DNA)를 포함한다.
변형된 당 모이어티를 가지는 뉴클레오티드들에서, 핵염기 모이어티 (자연, 변형된 또는 이의 조합)는 적절한 핵산 표적과의 혼성화를 위해 유지된다.
특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 변형된 당 모이어티를 가지는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 구체예들에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드들은 갭머 모티프에 배열된다. 특정 구체예들에서, 변형된 당 모이어티는 (4'-CH(CH3)-O-2') 가교 그룹(bridging group)을 가지는 바이시클릭 뉴클레오시드이다. 특정 구체예들에서, (4'-CH(CH3)-O-2') 변형된 뉴클레오시드들은 갭머 모티프의 윙 전반에 걸쳐 배열된다.
제약학적 조성물을 제제화하기 위한 조성물 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오티드는 제약학적 조성물 또는 제제들의 제조를 위해 제약상 허용가능한 활성 또는 불활성 물질들과 혼합될 수 있다. 제약학적 조성물들의 제제화를 위한 조성물 및 방법들은 투여 경로, 질환 정도, 또는 투여될 투여량을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 수많은 기준에 따라 달라진다.
C9ORF72 핵산에 대하여 표적된 안티센스 화합물은 제약학적 조성물에서 안티센스 화합물을 적합한 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체와 조합함으로써 이용될 수 있다. 제약상 허용가능한 희석제에는 포스페이트-완충 식염수 (PBS)가 포함된다. PBS는 비경구적으로 전달되는 조성물에 사용하기에 적합한 희석제이다. 따라서, 한 구체예에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물 및 제약상 허용가능한 희석제를 포함하는 제약학적 조성물이 본 출원에 기재된 방법들에서 사용된다. 특정 구체예들에서, 제약상 허용가능한 희석제는 PBS이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 제약학적 조성물들은 인간을 비롯한 동물에 투여시 생물학적 활성 대사산물 또는 이의 잔기를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 제약상 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 그 외 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 본 출원은 또한 안티센스 화합물의 제약상 허용가능한 염, 전구약물, 이러한 전구약물의 제약상 허용가능한 염, 및 그 외 생물학적 균등물에 관한 것이다. 적합한 제약상 허용가능한 염에는, 소듐 및 포타슘 염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
전구약물은 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 단부에 추가 뉴클레오시드들의 혼입을 포함할 수 있는데, 이러한 뉴클레오시드들은 신체 내에서 내인성 뉴클레아제에 의해 절단되어 활성 안티센스 화합물을 형성한다.
공액된 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 생성된 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증강시키는 하나 또는 그 이상의 모이어티 또는 공액체에 공유적으로 연결될 수 있다. 전형적인 공액체 그룹에는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티가 포함된다. 추가 공액체 그룹들에는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 엽산염, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 형광물질, 로다민, 쿠마린, 및 염료가 포함된다.
안티센스 화합물은 또한 성질, 가령, 예를 들면, 뉴클레아제 안정성을 증강시키기 위하여 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 일반적으로 부착되는 하나 또는 그 이상의 안정화 그룹를 가지도록 변형될 수 있다. 안정화 그룹에는 캡 구조들이 포함된다. 이들 말단 변형들은 엑소뉴클레아제 분해로부터 생긴 말단 핵산들을 가지는 안티센스 화합물을 보호하며, 세포 내에서의 전달 및/또는 위치선정(localization)을 도울 수 있다. 상기 캡은 5'-말단 (5'-캡)에, 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 양쪽 말단 모두에 존재할 수 있다. 캡 구조들은 해당 분야에 널리 공지이며, 예를 들면, 역 데옥시 비염기 캡(inverted deoxy abasic caps)을 포함한다. 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 단부를 캡핑하여 뉴클레아제 안정성을 부여하기 위해 사용될 수 있는 또다른 3' 및 5'-안정화기들에는 2003년 1월 16일 공개된 WO 03/004602에 개시된 것들이 포함된다.
세포 배양 및 안티센스 화합물 처리
C9ORF72 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과들은 여러가지의 세포 유형들에서 시험관내 테스트 될 수 있다. 이러한 분석에 사용되는 세포 유형들은 상업적 공급업체들 (예컨대 American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)로부터 구입가능하며 공급업체들의 지시에 따라 상업적으로 구입가능한 시약들 (예컨대 Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 배양된다. 예시적인 세포 유형들에는, HepG2 세포, Hep3B 세포, 및 일차 간세포가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
안티센스 올리고뉴클레오티드들의 시험관내 테스트
본 출원에 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 이용한 세포 처리 방법들이 기재되는데, 이는 다른 안티센스 화합물로 처리하기에 적절하게 변형될 수 있다.
일반적으로, 세포들은 세포가 배양시 대략 60-80% 밀집도에 도달할 때 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리된다.
배양된 세포들에 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 하나의 시약에는 양이온성 지질 형질주입 시약 리포펙틴(LIPOFECTIN) (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최종 농도 및 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ug/mL 범위인 리포펙틴 농도를 구현하기 위해 OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 리포펙틴과 혼합된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드들을 배양된 세포들에 도입하기 위하여 사용되는 또다른 시약에는 리포펙타민(LIPOFECTAMINE) (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도 및 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ug/mL 범위의 리포펙타민 농도를 구현하기 위하여 OPTI-MEM 1 환원 혈청 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 리포펙타민과 혼합된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드들을 배양된 세포들에 도입하기 위하여 사용되는 또다른 기법에는 전기천공법이 포함된다.
세포들은 관례적인 방법들에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리된다. 세포들은 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 16-24시간 후에 수집되며, 이 시점에서 표적 핵산들의 RNA 또는 단백질 수준은 해당 분야에 공지되고 본 출원에 기재된 방법들에 의해 측정된다. 일반적으로, 처리가 여러번 반복하여 실시될 경우, 데이터는 반복 처리들의 평균으로 나타낸다.
사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주에 따라 달라진다. 특정 세포주에 대한 최적의 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법들은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 리포펙타민, 리포펙틴 또는 사이토펙틴(Cytofectin)으로 형질감염시 전형적으로 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 전기천공을 이용한 형질감염시 625 내지 20,000 nM 범위의 높은 농도로 사용된다.
RNA 단리
RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 실시될 수 있다. RNA 단리 방법들은 해당 분야에 널리 공지이다. RNA는 제조업체의 권고 프로토콜에 따라 해당 분야에 널리 공지된 방법들, 예를 들면, 트리졸(TRIZOL) 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조된다.
표적 수준 또는 발현의 억제 분석
C9ORF72 핵산의 수준 또는 발현 억제는 해당 분야에 공지된 여러가지 방법들로 분석될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산 수준은, 예컨대, 노던 블롯 분석 (Northern blot analysis), 경쟁적 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 또는 정량적 실시간 PCR에 의해 정량화될 수 있다. RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 실시될 수 있다. RNA 단리 방법들은 해당 분야에 널리 공지이다. 노던 블롯 분석은 또한 해당 분야에서 관례적이다. 정량적 실시간 PCR은 제조업체의 지시에 따라 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA로부터 구입가능하고 상업적으로 구입가능한 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템을 사용하여 편리하게 이루어질 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량화는 제조업체의 지시에 따라 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용한 정량적 실시간 PCR에 의해 이루어질 수 있다. 정량적 실시간 PCR 방법들은 해당 분야에 널리 공지이다.
실시간 PCR에 앞서, 단리된 RNA는 역전사효소 (RT) 반응을 거치게 되고, 이러한 반응은 상보적인 DNA (cDNA)를 생성하며 이는 그 후 실시간 PCR 증폭을 위한 기질로서 사용된다. RT 및 실시간 PCR 반응들은 동일한 샘플 웰에서 순차적으로 실시된다. RT 및 실시간 PCR 시약들은 Invitrogen사 (Carlsbad, CA)로부터 수득된다. RT, 실시간-PCR 반응들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 널리 공지된 방법들에 의해 실시된다.
실시간 PCR에 의해 수득된 유전자 (또는 RNA) 표적량은 그 발현이 일정한 발현 수준의 유전자, 가령, 시클로필린 A를 사용하거나, 리보그린(RIBOGREEN) (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)을 사용하여 총 RNA를 정량화함으로써 정규화된다. 시클로필린 A 발현은 표적과 동시에, 다중적으로, 또는 별도로 실시간 PCR을 가동함으로써 정량화된다. 총 RNA는 리보그린 RNA 정량화 시약 (Invetrogen, Inc. Eugene, OR)을 사용하여 정량화된다. 리보그린에 의한 RNA 정량화 방법들은 Jones, L.J., 등의, 문헌 (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)에 개시되어 있다. 사이토플루오르(CYTOFLUOR) 4000 기기 (PE Applied Biosystems)는 리보그린 형광을 측정하기 위하여 사용된다.
프로브 및 프라이머들은 C9ORF72 핵산에 혼성화하도록 설계된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하는 방법들은 해당 분야에 널리 공지이며, 소프트웨어, 가령, 프라이머 EXPRESS 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 사용을 포함할 수 있다.
단백질 수준 분석
C9ORF72 핵산의 안티센스 억제는 C9ORF72 단백질 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. C9ORF72의 단백질 수준은 해당 분야에 널리 공지된 여러가지 방법들, 가령, 면역침강법, 웨스턴 블롯 분석 (면역탁본법), 효소-결합 면역흡착 측정법 (ELISA), 정량적 단백질 분석법, 단백질 활성 분석법 (예를 들면, 카스파제 활성 분석), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화 세포 분류법 (FACS)으로 평가 또는 정량화될 수 있다. 표적을 겨냥하는 항체들은 식별되어 여러 공급원들, 가령, MSRS 항체 카탈로그 (Aerie Corporation, Birmingham, MI)로부터 수득될 수 있으며, 또는 해당 분야에 널리 공지된 종래의 단클론 또는 다클론 항체 생성 방법들을 통해 제조될 수 있다. 마우스, 래트, 원숭이 및 인간 C9ORF72의 검출에 유용한 항체들은 상업적으로 구입가능하다.
안티센스 화합물의 생체내 테스트
안티센스 화합물, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 C9ORF72의 발현을 억제하고 표현형 변화, 가령, 향상된 운동 기능 및 호흡을 생성하는 이들의 능력을 평가하기 위해 동물에서 테스트된다. 특정 구체예들에서, 운동 기능은 동물에서 로타로드(rotarod), 그립 강도(grip strength), 폴 클라임(pole climb), 개방 필드 수행(open field performance), 빔 균형(balance beam), 뒷발 족적 테스트 (hindpaw footprint testing)에 의해 측정된다. 특정 구체예들에서, 호흡은 전신 체적변동기록기(whole body plethysmograph), 침습성 내성(invasive resistance), 및 순응도(compliance) 측정에 의해 측정된다. 테스트는 정상 동물들에서, 또는 실험 질환 모델에서 실시될 수 있다. 동물에 투여하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 제약상 허용가능한 희석제, 가령, 포스페이트-완충 식염수(PBS) 또는 인공 뇌척수액 (aCSF)에서 제제화된다. 투여에는 비경구 투여 경로, 가령, 복강내, 정맥내, 및 피하, 뿐만 아니라 중추 투여 경로, 가령, 뇌혈관내실 또는 경막내가 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여량 및 투여 빈도의 계산은 해당 분야의 숙련된 기술자의 능력 범위에 속하며, 인자들, 가령, 투여 경로 및 동물의 체중에 따라 달라진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리 기간 후, RNA가 CNS 조직 또는 CSF로부터 단리되고 C9ORF72 핵산 발현의 변화가 측정된다.
C9ORF72의 표적화
본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 RNA 가공 단계에서 C9ORF72 핵산에 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 예비-mRNA 또는 성숙 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 출원에 기재된다. 또한, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산의 임의의 요소에 혼성화할 수 있다. 예를 들면, C9ORF72 핵산의 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부, 스플라이스 접합부(splice junction), 엑손:엑손 스플라이스 접합부, 엑손 스플라이싱 사일렌서 (ESS), 엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 출원에 기재된다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 모든 변이체들에 혼성화한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 특정 변이체들에 선택적으로 혼성화한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 내포하는 C9ORF72의 변이체들에 선택적으로 혼성화한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체들에 선택적으로 혼성화한다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 내포하는 C9ORF72의 예비-mRNA 변이체들은 서열 번호: 1-3 및 6-10을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이러한 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 24회의 임의의 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG 반복을 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 모든 변이체들의 발현을 억제한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 모든 변이체들의 발현을 균등하게 억제한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 하나 또는 그 이상의 변이체들의 발현을 우선적으로 억제한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 내포하는 C9ORF72의 변이체들의 발현을 우선적으로 억제한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체들의 발현을 선택적으로 억제한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체들의 발현을 선택적으로 억제한다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 내포하는 C9ORF72의 예비-mRNA 변이체들은 서열 번호: 1-3 및 6-10을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이러한 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 24회의 임의의 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG 반복을 포함한다. 특정 구체예들에서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 핵 집합체를 형성한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 핵 집합체를 감소시킴에 유용하다. 핵 집합체는 집합체를 보유한 세포들의 백분율 뿐만 아니라 세포 당 집합체의 수에 있어서 감소될 수 있다.
특정 병원성 연관 변이체들의 선택적 억제
본 출원의 특정 실시예들에서, 프라이머 프로브 세트 RTS3905는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체로부터 가공된 mRNA 변이체 (예컨대 NM_001256054.1)를 검출한다. 이 mRNA 변이체는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체로부터 가공하였다 (즉, "C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체"). 예비-mRNA는 예비-mRNA의 전사가 엑손 1A의 개시 부위로부터 엑손 1B의 개시 부위까지의 영역, 예컨대, 상기 유전체 서열(서열 번호: 2, 뉴클레오시드 27535000로부터 27565000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NT_008413.18의 보체)의 뉴클레오티드 1107 내지 1520에서 시작할 때 헥사 뉴클레오티드 반복을 내포한다. 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체를 선택적으로 표적하기 위하여 이 영역에서 설계되었다. RTS3905는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체의 mRNA 산물 (즉 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체)을 측정하므로, 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체의 감소를 측정한다.
C9ORF72 특징
본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 유전자의 임의의 요소 내에서의 임의의 가공 상태에서 임의의 C9ORF72 변이체에 혼성화 할 수 있다. 예를 들면, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부, 스플라이스 접합부(splice junction), 엑손:엑손 스플라이스 접합부, 엑손 스플라이싱 사일렌서 (ESS), 엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10에 혼성화 할 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아래 기재된 다양한 C9ORF72 변이체들에 관해 아래 표 1-5에 특성화된 임의의 엑손들을 표적할 수 있다. 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 아래 특성화되지 않은 변이체들을 표적할 수도 있으며 이러한 변이체들은 GENBANK에 특성화되어 있다. 더욱이, 본 출원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 엑손 이외의 요소들을 표적할 수도 있으며 이러한 요소들은 GENBANK에 특성화되어 있다.
표 1
NM_001256054.1 (서열 번호: 1)에 관한 기능성 분절들
표 2
NM_018325.3 (서열 번호: 4)에 관한 기능성 분절들
표 3
NM_145005.5 (서열 번호: 6)에 관한 기능성 분절들
표 4
DB079375.1 (서열 번호: 7)에 관한 기능성 분절들
표 5
BU194591.1 (서열 번호: 8)에 관한 기능성 분절들
특정 징후들
본 출원의 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들을 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치료 방법이 제공된다. 특정 구체예들에서, 개체는 신경퇴행성 질환을 가진다. 특정 구체예들에서, 개체는 ALS 또는 FTD를 비롯한 (그러나 이에 제한되지는 않음) 신경퇴행성 질환을 발달시킬 위험이 있다. 특정 구체예들에서, 개체는 C9ORF72 연관 질환을 가지는 것으로 식별된 바 있다. 본 출원의 특정 구체예들에서, 개체에서 C9ORF72 발현을 예방적으로 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구체예들은 C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물의 치료적 유효량을 개체에 투여함으로써 이를 필요로하는 개체를 치료하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물의 치료적 유효량의 투여는 개체에서의 C9ORF72 수준을 모니터링하여 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응을 결정하는 것을 수반한다. 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응은 의사가 치료적 개입의 양 및 기간을 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물의 투여는 C9ORF72 발현을 최소한 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%만큼, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 만큼 감소시킨다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 핵산에 대해 표적된 안티센스 화합물의 투여는 동물에서의 운동 기능 및 호흡을 향상시킨다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 안티센스 화합물의 투여는 운동 기능 및 호흡을 최소한 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%만큼, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 만큼 향상시킨다.
특정 구체예들에서, C9ORF72에 대해 표적된 안티센스 화합물을 포함하는 제약학적 조성물은 ALS 및 FTD를 비롯한 신경퇴행성 질환을 앓고 있거나 이에 취약한 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다.
특정 병용 요법들
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들은 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들과 병용-투여된다. 특정 구체예들에서, 이러한 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들과 동일한 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위하여 설계된다. 특정 구체예들에서, 이러한 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들과 상이한 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위하여 설계된다. 특정 구체예들에서, 이러한 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들의 바람직하지 않은 부작용을 치료하기 위하여 설계된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들은 이러한 그 외 제약학적 제제의 바람직하지 않은 효과를 치료하기 위한 또다른 제약학적 제제와 병용-투여된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들은 또다른 제약학적 제제와 병용-투여되어 병용 효과를 생성한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들은 또다른 제약학적 제제와 병용-투여되어 상승작용 효과를 생성한다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들 및 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 동시에 투여된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들 및 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 상이한 시기에 투여된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들 그리고 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 함께 단일 제제로 제조된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 하나 또는 그 이상의 제약학적 조성물들 그리고 하나 또는 그 이상의 그 외 제약학적 제제들은 별도로 제조된다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 제약학적 조성물과 병용-투여될 수 있는 제약학적 제제들에는 릴루졸(Riluzole) (Rilutek사), 리오레살 (Lioresal) (Lioresal사), 및 덱스프라미펙솔(Dexpramipexole)이 포함된다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 C9ORF72 특이적 억제제와 병용-투여될 수 있는 제약학적 제제들에는 또다른 C9ORF72 억제제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 C9ORF72 특이적 억제제와 병용-투여될 수 있는 제약학적 제제들에는 C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, C9ORF72 안티센스 전사체 특이적 억제제는 안티센스 화합물이다. 특정 구체예들에서, 안티센스 화합물은 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구체예들에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다.
특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제는 본 출원에 기재된 제약학적 조성물의 투여 이전에 투여된다. 특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제는 본 출원에 기재된 제약학적 조성물의 투여 이후에 투여된다. 특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제는 본 출원에 기재된 제약학적 조성물과 동시에 투여된다. 특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제의 투여량은 그 병용-투여되는 제약학적 제제가 단독으로 투여되었을 경우 투여되게 될 투여량과 동일하다. 특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제의 투여량은 그 병용-투여되는 제약학적 제제가 단독으로 투여되었을 경우 투여되게 될 투여량보다 적다. 특정 구체예들에서, 병용-투여되는 제약학적 제제의 투여량은 그 병용-투여되는 제약학적 제제가 단독으로 투여되었을 경우 투여되게 될 투여량보다 많다.
특정 구체예들에서, 제 2 화합물의 병용-투여는 제 1 화합물의 효과를 증강시키므로, 이들 화합물들의 병용-투여는 제 1 화합물을 단독으로 투여하는 것의 효과보다 더 큰 효과를 가져온다. 다른 구체예들에서, 이러한 병용-투여는 단독 투여시의 화합물들의 효과에 부가적(additive)인 효과를 가져온다. 특정 구체예들에서, 이러한 병용-투여는 단독 투여시의 화합물들의 효과에 초-부가적(supra-additive)인 효과를 가져온다. 특정 구체예들에서, 제 1 화합물은 안티센스 화합물이다. 특정 구체예들에서, 제 2 화합물은 안티센스 화합물이다.
특정 비교기(Comparator ) 조성물
특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 화합물들은 ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, 및/또는 ISIS 577083 보다 더 내약성을 띤다. ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, 및 ISIS 577083은WO2014/062691에 기재된 다양한 연구들에서 C9ORF72 mRNA에 관한 높은 수준의 투여량-의존적 감소를 보였기 때문에 비교기 화합물들로서 선택되었다. 그러므로, ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, 및 ISIS 577083은 매우 효험있고 효능있는 화합물들로 간주되었다. 또한, WO2014/062691에 기재된 ISIS 577065, ISIS 577056, 및 ISIS 576816은 본 출원에 기재된 화합물들과 구조적으로 유사하다. 예를 들면, ISIS 577065는 ISIS 801287과 중첩되는 16개의 핵염기를 가지고; ISIS 577056은 ISIS 806679와 중첩되는 16개의 핵염기를 가지며; ISIS 576816은 ISIS 802473와 중첩되는 18개 핵염기를 가지고 (18-머); 그리고 ISIS 576816은 ISIS 802459와 중첩되는 18개 핵염기를 가진다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) GCCTTACTCTAGGACCAAGA의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 576816 (본 출원에 서열 번호: 21로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 576816은 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 7.00의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 576816보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) GGGACACTACAAGGTAGTAT의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 576974 (본 출원에 서열 번호: 56으로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 576974는 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 5.67의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 576974보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) TACAGGCTGCGGTTGTTTCC의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 577061 (본 출원에 서열 번호: 57으로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 577061은 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 7.00의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 577061보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) CCCGGCCCCTAGCGCGCGAC의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 577065 (본 출원에 서열 번호: 58으로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 577065는 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 6.00의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 577065보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) GGTAACTTCAAACTCTTGGG의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 577083 (본 출원에 서열 번호: 59으로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 577083은 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 7.00의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 577083보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 구체예들에서, (5'에서 3'으로) AATCTTTATCAGGTCTTTTC의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머인 ISIS 577056 (본 출원에 서열 번호: 60으로 포함됨)이 비교기 화합물인데, 여기서 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2'-O-메톡시에틸 그룹을 포함하며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO2014/062691에 이미 기재되어 있다. ISIS 577056은 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 평균 6.5의 FOB 점수를 받았다(아래 실시예 3 참고). ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473, 및 ISIS 802459를 비롯한, 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 마우스에서의 급성 내약성 유사 연구에서 보다 낮은 FOB 점수를 받았다 (아래 실시예 2 참고). 그러므로 본 출원에 기재된 특정 화합물들은 비교기 화합물 ISIS 577056보다 더욱 내약성을 띤다.
특정 인간 치료제
본 출원에 기재된 인간 C9ORF72 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 치료제이다. 역가(potency), 효능, 및/또는 내약성에 관한 다양한 매개변수들이 조사된다. 이러한 매개변수들에는 총 C9ORF72 RNA 발현의 시험관내 억제, C9ORF72 병원성 연관 RNA 변이체 발현의 시험관내 억제, 시험관내 투여량 반응 (IC50), 관련 조직들 (예컨대, 뇌 및/또는 척수)에 인간 C9ORF72 이식유전자를 내포하는 유전자삽입 동물에서 총 또는 병원성 RNA 및/또는 단백질의 생체내 억제 , 마우스에서의 내약성, 래트에서의 내약성, 및/또는 영장류동물에서의 내약성이 포함된다. 측정될 수 있는 내약성 표지자들에는 혈액 및 혈청 화학 매개변수들, CSF 화학 매개변수들, 체중 및 장기 중량, 일반적인 관찰내용 및/또는 행동 테스트, 및/또는 생화학적 표지자들, 가령, GFAP 및/또는 AIF1이 포함된다. 급성 또는 장기간 내약성이 측정될 수 있다.
특정 조성물
1. ISIS 801287
특정 구체예들에서, ISIS 801287은 (5'에서 3'으로) GCCCCTAGCGCGCGACTC의 서열 (본 출원에 서열 번호: 33으로 포함됨)을 가지는 4-8-6 MOE 갭머로서 특징되는데, 여기서 각각의 뉴클레오시드 1-4 및 13-18은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 뉴클레오시드이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 5-12는 2'-데옥시뉴클레오시드이며, 뉴클레오시드 2 내지 3, 3 내지 4, 13 내지 14, 14 내지 15, 그리고 15 내지 16 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포디에스테르 연결이고 뉴클레오시드 1 내지 2, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 16 내지 17, 그리고 17 내지 18 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결이며, 그리고 각각의 시토신은 5'-메틸시토신이다.
특정 구체예들에서, ISIS 801287은 다음과 같은 화학적 표기법으로 기재된다: Ges mCeo mCeo mCes mCds Tds Ads Gds mCds Gds mCds Gds mCeo Geo Aeo mCes Tes mCe; 여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸시토신
G = 구아닌,
T = 티민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 당
d = 2'-데옥시리보스 당,
s = 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구체예들에서, ISIS 801287은 다음 화학 구조, 또는 이의 염으로 기재된다:
구조식 1. ISIS 801287
특정 구체예들에서, ISIS 801287의 소듐염은 다음과 같은 화학적 구조로 기재된다:
구조식 2.
ISIS 801287의 소듐염
2. ISIS 806679
특정 구체예들에서, ISIS 806679는 (5'에서 3'으로) GGTTAATCTTTATCAGGTCT의 서열 (본 출원에 서열 번호: 49로 포함됨)을 가지는 6-10-4 MOE 갭머로서 특징되는데, 여기서 각각의 뉴클레오시드 1-6 및 17-20은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 뉴클레오시드이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 7-16은 2'-데옥시뉴클레오시드이며, 뉴클레오시드 2 내지 3, 3 내지 4, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 그리고 17 내지 18 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포디에스테르 연결이고 그리고 뉴클레오시드 1 내지 2, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 18 내지 19, 그리고 19 내지 20 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결이고, 그리고 각각의 시토신은 5'-메틸시토신이다.
특정 구체예들에서, ISIS 806679는 다음과 같은 화학적 표기법으로 기재된다: Ges Geo Teo Teo Aeo Aeo Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ads Gds Geo Tes mCes Te; 여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸시토신
G = 구아닌,
T = 티민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 당
d = 2'-데옥시리보스 당,
s = 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구체예들에서, ISIS 806679는 다음 화학 구조, 또는 이의 염으로 기재된다:
특정 구체예들에서, ISIS 806679의 소듐염은 다음과 같은 화학적 구조로 기재된다:
구조식 4. ISIS 806679의 소듐염
3. ISIS 802473
특정 구체예들에서, ISIS 802473은 (5'에서 3'으로) GCCTTACTCTAGGACCAA의 서열 (본 출원에 서열 번호: 47로 포함됨)을 가지는 4-8-6 MOE 갭머로서 특징되는데, 여기서 각각의 뉴클레오시드 1-4 및 13-18은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 뉴클레오시드이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 5-12는 2'-데옥시뉴클레오시드이며, 뉴클레오시드 2 내지 3, 3 내지 4, 13 내지 14, 14 내지 15, 그리고 15 내지 16 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포디에스테르 연결이고 뉴클레오시드 1 내지 2, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 16 내지 17, 그리고 17 내지 18 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결이며, 그리고 각각의 시토신은 5'-메틸시토신이다.
특정 구체예들에서, ISIS 802473은 다음과 같은 화학적 표기법으로 기재된다: Ges mCeo mCeo Tes Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Geo Aeo mCeo mCes Aes Ae; 여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸시토신
G = 구아닌,
T = 티민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 당
d = 2'-데옥시리보스 당,
s = 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구체예들에서, ISIS 802473은 다음 화학 구조, 또는 이의 염으로 기재된다:
구조식 5. ISIS 802473
특정 구체예들에서, ISIS 802473의 소듐염은 다음과 같은 화학적 구조로 기재된다:
구조식 6.
ISIS 802473의 소듐염
4. ISIS 802459
특정 구체예들에서, ISIS 802459는 (5'에서 3'으로) GCCTTACTCTAGGACCAAGA의 서열 (본 출원에 서열 번호: 21로 포함됨)을 가지는 3-10-7 MOE 갭머로 특징되는데, 여기서 각각의 뉴클레오시드 1-3 및 14-20은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 뉴클레오시드이고, 그리고 각각의 뉴클레오시드 4-13은 2'-데옥시뉴클레오시드이며, 뉴클레오시드 2 내지 3, 3 내지 4, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 그리고 17 내지 18 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포디에스테르 연결이고 그리고 뉴클레오시드 1 내지 2, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 18 내지 19, 그리고 19 내지 20 사이의 뉴클레오시드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결이고, 그리고 각각의 시토신은 5'-메틸시토신이다.
특정 구체예들에서, ISIS 802459는 다음과 같은 화학적 표기법으로 기재된다: Ges mCeo mCeo Tds Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Gds Aeo mCeo mCeo Aeo Aes Ges Ae; 여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸시토신
G = 구아닌,
T = 티민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 당
d = 2'-데옥시리보스 당,
s = 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 그리고
o = 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구체예들에서, ISIS 802459는 다음 화학 구조, 또는 이의 염으로 기재된다:
구조식 7. ISIS 802459
특정 구체예들에서, ISIS 802459의 소듐염은 다음과 같은 화학적 구조로 기재된다:
구조식 8. ISIS 802459의 소듐염
실시예
비-제한적 개시 및 참고문헌으로 포함
본 출원에 기재된 특정 화합물, 조성물 및 방법들을 특정 구체예들에 따라 특이적으로 기재하였으나, 다음 실시예들은 본 출원에 기재된 화합물을 설명하기 위한 것일 뿐이며 이를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 출원에서 인용된 문헌들 각각은 온전히 참고문헌으로 본 출원에 포함된다.
실시예 1: 인간 C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드
아래 표의 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 MOE 갭머로서 설계되었다. 각각의 갭머의 중심 갭 분절은 2'-데옥시뉴클레오시드들을 내포하며, 양쪽 5' 단부 및 3' 단부 모두에서, 2'-MOE 그룹을 각각 포함하는 뉴클레오시드들을 내포하는 윙 분절들에 의해 플랭크된다. 각각의 갭머에 관한 구체적인 모티프가 아래 표에 열거되어 있으며, 하이픈으로 분리된 세 개의 숫자들로 나타내어진다. 숫자들은 각각 5'-윙, 갭, 그리고 3'-윙의 뉴클레오시드들의 수를 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오티드 전반에 걸친 모든 시토신 잔기들은 5-메틸시토신이다. 갭머들에 있어 뉴클레오시드간 연결들은 혼합된 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 연결들이다. 각각의 갭머에 있어 뉴클레오시드간 연결들은 연결(linkage) 열에 나타내는데, 여기서 'o'는 포스포디에스테르 연결을 표시하고 's'는 포스포로티오에이트 연결을 표시한다.
아래 표에 열거된 각각의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 2로 본 출원에 지정된 인간 C9ORF72 유전체 서열 (뉴클레오시드 27535000로부터 27565000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NT_008413.18의 보체)에 표적된다. "개시 부위"는 인간 유전체 서열에서 갭머를 표적시키는 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드를 나타낸다. "종결 부위"는 인간 유전체 서열에서 갭머를 표적시키는 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드를 나타낸다.
표 6
인간 C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드
실시예 2: 마우스에서 인간 C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드의 내약성을 평가하기 위해 마우스에서 테스트하였다. 야생형 C57/Bl6 마우스 각각에 아래 표에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 700 μg의 단회 투여량으로 ICV 제공하였다. 각 처리 그룹은 4마리의 마우스들로 구성되었다. 주사 3시간 후, 각 마우스를 7개의 상이한 기준에 따라 평가하였다. 7개 기준은 (1) 마우스가 명석하고 경계적이고 반응적이었는가; (2) 마우스가 자극없이 서거나 웅크렸는가; (3) 마우스가 자극없이 임의의 거동을 보였는가; (4) 마우스가 들어올려진 후 앞쪽으로의 거동을 나타냈는가; (5) 마우스가 들어올려진 후 임의의 거동을 나타냈는가; (6) 마우스가 꼬리 꼬집기(tail pinch)에 반응했는가; (7) 규칙적인 호흡 이다. 이러한 7개의 상이한 기준 각각에 대해, 각 마우스에게 마우스가 기준을 충족시키는 경우 0의 하위-점수를 또는 기준을 총족시키지 못한 경우 1의 하위-점수를 주었다. 7개 기준들 모두를 평가한 후, 각 마우스에 대한 하위-점수들을 합산한 다음 각 그룹에 대해 평균하였다. 예를 들면, 마우스가 700 μg ICV 투여량 투여 3시간 후 명석하고 경계적이고 반응적이었으며 모든 다른 기준을 충족시킨 경우, 이 마우스는 총점 0을 받을 것이다. 또다른 마우스가 700 μg ICV 투여량 투여 3시간 후 명석하지 않고 경계적이지 않고 반응적이지 않았으나 모든 다른 기준을 충족시킨 경우, 이 마우스는 1점을 받을 것이다. 결과는 각 처리 그룹에 대한 평균 점수로 나타낸다.
표 7
급성 내약성 점수
실시예 3: WO 2014/062691의 올리고뉴클레오티드의 내약성
WO 2014/062691에 기재된 올리고뉴클레오티드들을 마우스에서의 급성 내약성 연구에서 테스트하였다. 3개의 야생형 C57/Bl6 마우스 그룹들을 실시예 2에 기재된 바와 같이 처리하고 분석하였다. 테스트된 올리고뉴클레오티드들은 아래 표에 나열된 올리고뉴클레오티드들을 포함하는데, 이들은 전체 포스포로티오에이트 골격을 가진 5-10-5 MOE 갭머들이고 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다. 각각의 올리고뉴클레오티드가 표적되는, 서열 번호: 2 상의 개시 및 종결 부위들이 나타나 있다. 결과는 아래 표에 각 처리 그룹에 대한 평균 점수로 나타낸다. 이들 결과들은 ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, ISIS 577083, 및 ISIS 577056이 불량한 내약성을 띠었음을 나타낸다.
표 8
WO 2014/062691의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리 3시간 후 급성 내약성 점수
표 9
WO 2014/062691의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리 3시간 후 급성 내약성 점수
실시예 4: HepG2 세포들에서 인간 C9ORF72 mRNA 변이체의 안티센스 억제
상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 C9ORF72 mRNA에 대한 이들의 효과에 관해 시험관내 테스트한다. 각 웰 당 20,000개 세포 밀도로 배양된 HepG2 세포들을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공시킨다. 대략 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포들로부터 단리시키고 C9ORF72 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정한다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3905 (정방향 프라이머 서열 GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, 본 출원에서 서열 번호: 12로 명시됨; 역방향 프라이머 서열 GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, 본 출원에서 서열 번호: 13으로 명시됨; 프로브 서열 TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, 본 출원에서 서열 번호: 14로 명시됨 - TAQ-man 프라이머 프로브 세트)가 사용된다. RTS3905는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체로부터 가공된 mRNA 변이체 (예컨대 NM_001256054.1)를 검출한다. 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체로부터 가공된 이 mRNA 변이체는 본 출원에서 "C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체"이다. 예비-mRNA는 예비-mRNA의 전사가 엑손 1A의 개시 부위로부터 엑손 1B의 개시 부위까지의 영역 (일반적으로 상기 유전체 서열: 서열 번호: 2, 뉴클레오시드 27535000로부터 27565000까지 절단된 GENBANK 등록 번호 NT_008413.18의 보체의 뉴클레오티드 1107 내지 1520에서 시작할 때 헥사 뉴클레오티드 반복을 내포한다. 그러므로 이 영역에 설계된 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체를 선택적으로 표적한다. RTS3905는 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체의 mRNA 산물 (즉 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체)을 측정하므로, 헥사뉴클레오티드 반복을 내포하는 예비-mRNA 변이체의 감소를 측정한다. C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체의 수준을 리보그린®에 의해 측정된, 세포의 총 RNA 함량으로 정규화시킨 다음, 정규화된 mRNA 변이체 수준을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않았던 세포들의 수준들과 비교한다.
실시예 5: 인간 C9ORF72 mRNA 변이체의 투여량-의존성 안티센스 억제
상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 HepG2 세포들에서 다양한 투여량으로 테스트한다. 각 웰 당 20,000개 세포 밀도로 세포들을 플레이팅하고 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공시킨다. 대략 16시간 또는 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포들로부터 단리시키고 C9ORF72 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정한다. 인간 C9ORF72 프라이머 프로브 세트 RTS3905가 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체를 측정하기 위해 사용된다. C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체의 수준은 리보그린®으로 측정된 총 RNA 함량에 따라 조정된다. 각 올리고뉴클레오티드의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 각 개개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여량에서 관찰된 mRNA 변이체 수준의 억제에 기초하여 계산한다.
실시예 6: LLC-MK2 세포들에서 인간-레서스 교차-반응성 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 C9ORF72의 안티센스 억제
레서스 C9ORF72 핵산과 완전히 교차-반응성인 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 레서스 C9ORF72 mRNA에 대한 이들의 효과에 관하여 시험관내 테스트한다. 각 웰 당 20,000개 세포 밀도로 배양된 레서스 LLC-MK2 세포들을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공시킨다. 대략 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포들로부터 단리시키고 C9ORF72 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정한다. 총 C9ORF72 mRNA 수준을 측정하기 위하여 프라이머 프로브 세트 RTS3750 (정방향 서열 TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, 본 출원에서 서열 번호: 15로 명시됨; 역방향 서열 GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, 본 출원에서 서열 번호: 16으로 명시됨; 프로브 서열 TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, 본 출원에서 서열 번호: 17로 명시됨 -TAQ-man 프라이머 프로브 세트)가 사용된다. RTS3750이 mRNA 전사체들의 엑손 2를 표적하므로, 총 mRNA 전사체를 측정한다. C9ORF72 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된, 총 RNA 함량에 따라 조정한 다음, 정규화된 mRNA 변이체 수준을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않았던 세포들의 수준과 비교한다.
실시예 7: LLC-MK2에서 인간 C9ORF72 mRNA의 투여량-의존성 안티센스 억제
상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 LLC-MK2 세포들에서 다양한 투여량으로 테스트한다. 각 웰 당 20,000개 세포 밀도로 세포들을 플레이팅하고 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공시킨다. 대략 16시간 또는 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포들로부터 단리시키고 C9ORF72 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정한다. 총 C9ORF72 mRNA 수준을 측정하기 위하여 프라이머 프로브 세트 RTS3750이 사용된다. C9ORF72 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된, 총 RNA 함량에 따라 조정한 다음, 정규화된 mRNA 변이체 수준을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않았던 세포들의 수준과 비교한다.
실시예 8: 유전자삽입 마우스 모델에서 인간 C9ORF72 mRNA의 안티센스 억제
본 출원에서 C9B41 및 C9B183으로 명시되며 각각 엑손 1-5를 포함하는 절단형 인간 C9ORF72 유전자를 표현하는, 2개의 BAC 유전자삽입 마우스 라인에서 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 테스트한다. C9B41 및 C9B183 마우스 라인의 절단형 인간 C9ORF72 유전자들은 각각110회 및 450회 헥사뉴클레오티드 반복을 포함한다. 각 처리 그룹의 각 마우스에게 350 μg의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한 다음, 인간 C9ORF72 RNA의 발현 수준을 RT-PCR로 분석한다. 투여량 반응 또한 실시된다.
실시예 9: 환자 섬유모세포들에서 C9ORF72 mRNA의 안티센스 억제
상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 C9ORF72 mRNA에 대한 이들의 효과에 관해 시험관내 테스트하였다. 아래 표에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 플레이트에 추가한 후,환자 섬유모세포 F09-152를 각 웰 당 20,000개 세포 밀도로 추가하였다. 세포 추가 후 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최종 농도가 아래 표에 열거되어 있다. 30초 진탕 후, 세포들을 전기천공시킨 다음 Primaria 코팅된 배양 플레이트로 옮겼다. 16시간 후, RNA를 세포들로부터 단리시키고, 총 C9ORF72 mRNA (즉, 엑손 1A로부터 개시하는 mRNA 및 엑손 1B로부터 개시하는 mRNA)의 수준 및 병원성 연관 mRNA의 수준 (실시예 4 참고)을 RT-qPCR로 측정하였다. 총 C9ORF72 mRNA 및 C9ORF72 병원성 연관 mRNA를 각각 검출하기 위하여 인간 프라이머 프로브 세트 RTS 3750 (실시예 6 참고) 및 RTS3905 (실시예 4 참고)가 사용되었다. C9ORF72 총 mRNA 및 C9ORF72 병원성 연관 mRNA 변이체의 수준을 리보그린®에 의해 측정된, 세포의 총 RNA 함량으로 정규화시킨 다음, 정규화된 mRNA 수준을 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않았던 세포들의 수준들과 비교하였다. 결과가 아래 표에 나타나있다. "nd"의 삽입은 결정되지 않음을 의미한다. "nd"로 열거된 IC50 수치들은 이 표적이 IC50을 결정하기에 충분히 억제되지 않았기 때문에 결정되지 않았다. 결과들은 아래 열거된 모든 올리고뉴클레오티드가 병원성 연관 C9ORF72 mRNA 변이체를 억제하였음을 보여준다. 반복 변이체 예비-mRNA를 특이적으로 표적하지 않는 올리고뉴클레오티드는 병원성 연관 C9ORF72 mRNA 및 총 C9ORF72 mRNA 모두를 억제하였다. 반복 변이체 예비-mRNA를 특이적으로 표적하는 올리고뉴클레오티드는 병원성 연관 C9ORF72 mRNA를 선택적으로 억제하였다.
표 10
안티센스 억제 후 환자 섬유모세포에서 C9ORF72 mRNA 수준
실시예 10: 유전자삽입 마우스 모델에서 인간 C9ORF72 mRNA의 안티센스 억제
엑손 5를 통한 프로모터 영역 및 110회 헥사뉴클레오티드 반복을 포함하는 인간 C9ORF72 유전자를 발현시키는 BAC 유전자삽입 마우스 라인, C9B41 (실시예 8 참고)에서 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 테스트하였다. 각 처리 그룹은 2-3마리의 마우스들로 구성되었다. 각 마우스에게 아래 표에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 350 μg의 단회 ICVB로 제공하였다. 2주 후, 마우스들을 안락사시키고, 인간 병원성 연관 C9ORF72 mRNA 변이체 및/또는 총 인간 C9ORF72 mRNA의 발현 수준을 실시예 9에 기재된 바와 같이 RT-qPCR로 분석하였다. 병원성 연관 C9ORF72 변이체 mRNA 수준의 분석은 C9ORF72 반복 변이체 예비-mRNA를 특이적으로 표적하지 않는 올리고뉴클레오티드에 대해서는 완료되지 않았다. 아래 표의 결과들은 PBS 처리 그룹에서의 정규화 평균과 비교하여, 정규화된 인간 C9ORF72 mRNA 수준의 평균 백분율을 보여준다.
표 11
안티센스 억제 후 유전자삽입 마우스에서 인간 C9ORF72 mRNA 수준
표 12
안티센스 억제 후 유전자삽입 마우스에서 인간 C9ORF72 mRNA 수준
실시예 11: 유전자삽입 마우스 모델에서 인간 C9ORF72 mRNA의 투여량 의존성 안티센스 억제
각각 엑손 1-5를 포함하는 절단형 인간 C9ORF72 유전자를 표현하는, 2개의 BAC 유전자삽입 마우스 라인, C9B41 및 C9B183에서 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 테스트하였다. C9B41 및 C9B183 마우스 라인들의 절단형 인간 C9ORF72 유전자들은 각각 110회 및 450회 헥사뉴클레오티드 반복을 포함한다 (실시예 8 참고). 각 처리 그룹은 2-4마리의 마우스들로 구성되었다. 각 마우스에게 아래 표에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 30 μg, 100 μg, 300 μg, 또는 700 μg의 단회 ICVB로 제공하였다. 2주 후, 마우스들을 안락사시키고, 인간 병원성 연관 C9ORF72 mRNA 변이체 및/또는 총 인간 C9ORF72 mRNA의 발현 수준을 실시예 9에 기재된 바와 같이 RT-qPCR로 분석하였다. 아래 표의 결과들은 PBS 처리 그룹에서의 정규화 평균과 비교하여, 정규화된 인간 C9ORF72 mRNA 수준의 평균 백분율을 보여준다. 100 또는 이보다 큰 수치은 해당 안티센스 올리고뉴클레오티드가 mRNA를 감소시키지 않았거나 mRNA의 양을 증가시켰음을 의미한다.
표 13
C9B41 유전자삽입 마우스에서 투여량 의존성 안티센스 억제 후 인간 C9ORF72 mRNA 수준
표 14
C9B183 유전자삽입 마우스에서 투여량 의존성 안티센스 억제 후 인간 C9ORF72 mRNA 수준
실시예 12: 마우스에서 인간 C9Orf72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
실시예 2에 기재한 바와 같이, 야생형 C57/Bl6 마우스 각각에게 아래 표에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 700μg의 단회 ICV 투여량으로 제공하였다. 각 처리 그룹은 4마리의 마우스들로 구성되었다. 주사 8주 후, 마우스들을 7개의 상이한 기준에 따라 평가하였다. 7개 기준은 (1) 마우스가 명석하고 경계적이고 반응적이었는가; (2) 마우스가 자극없이 서거나 웅크렸는가; (3) 마우스가 자극없이 임의의 거동을 보였는가; (4) 마우스가 들어올려진 후 앞쪽으로의 거동을 나타냈는가; (5) 마우스가 들어올려진 후 임의의 거동을 나타냈는가; (6) 마우스가 꼬리 꼬집기(tail pinch)에 반응했는가; (7) 규칙적인 호흡 이다. 이러한 7개의 기준 각각에 대해, 마우스에게 마우스가 기준을 충족시키는 경우 0의 하위점수 그리고 기준을 총족시키지 못한 경우 1의 하위점수를 주었다. 7개 기준들 모두를 평가한 후, 각 마우스에 대한 점수들을 합산한 다음 각 처리 그룹에서 평균하였다. 결과가 아래 표에 제공된다.
동물들을 8주시에 희생시켰다. 각 동물로부터 피질과 척수를 수집하고, RT-PCR을 실시하였다. 염증의 측정치로서 동종이식 염증 인자 (AIF1)의 발현 수준을 결정하였다. 아교 세포 활성화의 측정치로서 아교세포 섬유 산성 단백질 (GFAP)의 발현 수준을 또한 결정하였다. 결과들을 Gpadh에 대해 정규화시키고 아래 표에 PBS 대조군 (1.0)과 비교하여 제공한다. "N.D."는 실험이 실시되지 않았으므로 데이터가 없음을 표시한다. 별표는 해당 결과가 1-3마리 마우스들의 평균임을 표시한다.
표 15: 마우스에서 C9Orf72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
실시예 13: 래트에서 인간 C9Orf72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
스프라그 돌리 래트(Sprague Dawley rat)들을 4 또는 6마리 래트들의 그룹들로 나누었다. 각 래트 그룹내 각각의 래트에 아래 표에 표시된 올리고뉴클레오티드를 3 mg의 단회 투여량으로 경막내(IT) 투여하였다. IT 투여 3시간 및 8주 후, 각 래트에 대해 7개의 상이한 신체 부분들의 거동을 평가하였다. 7개의 신체 부분들은 (1) 래트의 꼬리; (2) 래트의 후방 자세; (3) 래트의 뒷다리; (4) 래트의 뒷발; (5) 래트의 앞발; (6) 래트의 전방 자세; (7) 래트의 머리이다. 이러한 상이한 신체 부분들 각각에 대해, 각 래트에게 해당 신체 부분이 움직이고 있었던 경우 0의 하위-점수를 또는 해당 신체 부분이 마비되었던 경우 1의 하위-점수를 주었다. 7개 신체 부위들 각각을 평가한 후, 각 래트에 대한 하위-점수들을 합산한 다음 각 그룹에 대해 평균하였다. 예를 들면, 래트의 꼬리, 머리 그리고 그 외 모든 평가된 신체 부분들이 3 mg IT 투여 3시간 후에 움직이고 있었던 경우, 이 래트는 총점 0을 받을 것이다. 또다른 래트가 3 mg IT 투여 3시간 후 꼬리를 움직이고 있지 않았으나 그 외 모든 평가된 신체 부분들이 움직이고 있었던 경우, 이 래트는 총점 1을 받을 것이다. 식염수 처리된 래트들은 일반적으로 0점을 받는다. 해당 범위 상단에 있는 점수는 급성 독성을 암시하는 것이다. 결과들을 아래 표에 각 처리 그룹에 대한 평균 점수로 나타낸다.
동물들을 8주시에 희생시켰다. 각 동물로부터 피질과 척수를 수집하고, RT-PCR을 실시하였다. AIF1의 발현 수준을 염증 측정치로서 결정하였다. (GFAP)의 발현 수준을 아교 세포 활성화 측정치로서 결정하였다. 별표는 해당 결과가 2-3마리 마우스들의 평균임을 표시한다. 결과들을 Gapdh에 대해 정규화시키고 아래 표에 PBS 대조군 (1.0)과 비교하여 제공한다.
표 16: 래트에서 C9Orf72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
실시예 14: 비-인간 영장류동물에서 인간 C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
암컷 시노몰구스 원숭이들 (2-6kg)에게 안티센스 올리고뉴클레오티드 35mg을 1일, 14일, 및 28일에 경막내 볼러스 주사로 3회 투여하였다 (1mL 저속 볼러스 후 0.25mL 플러쉬). 각 처리 그룹은 4마리의 원숭이들을 내포하였다. 최종 투여 2주 후, 동물들을 희생시키고 다양한 CNS 조직들에 대해 RT-PCR을 실시하였다. AIF1의 발현 수준을 염증 측정치로서 결정하였으며 GFAP의 발현 수준을 아교 세포 활성화 측정치로서 결정하였다. 결과들을 GAPDH에 대해 정규화시키고 ISIS 번호 801287, 802459, 및 806679에 관한 아래 표에 PBS 대조군 (1.0)과 비교하여 제공한다.
표 17: 시노몰구스 원숭이들에서 C9ORF72를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 내약성
SEQUENCE LISTING
<110> Ionis Pharamceuticals, Inc.
<120> COMPOSITIONS FOR MODULATING C9ORF72 EXPRESSION
<130> BIOL0269WO
<150> 62/148,691
<151> 2015-04-16
<150> 62/232,941
<151> 2015-09-25
<150> 62/239,400
<151> 2015-10-09
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3339
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120
ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 240
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 300
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 360
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 420
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 480
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 540
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 600
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggaaa gacaagaaaa 660
tgtccagaag attatcttag aaggcacaga gagaatggaa gatcagggtc agagtattat 720
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 780
cagtgttcct gaagaaatag atatagctga tacagtactc aatgatgatg atattggtga 840
cagctgtcat gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacttgcaaa cctgtggctg 900
ttccgttgta gtaggtagca gtgcagagaa agtaaataag atagtcagaa cattatgcct 960
ttttctgact ccagcagaga gaaaatgctc caggttatgt gaagcagaat catcatttaa 1020
atatgagtca gggctctttg tacaaggcct gctaaaggat tcaactggaa gctttgtgct 1080
gcctttccgg caagtcatgt atgctccata tcccaccaca cacatagatg tggatgtcaa 1140
tactgtgaag cagatgccac cctgtcatga acatatttat aatcagcgta gatacatgag 1200
atccgagctg acagccttct ggagagccac ttcagaagaa gacatggctc aggatacgat 1260
catctacact gacgaaagct ttactcctga tttgaatatt tttcaagatg tcttacacag 1320
agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtctttcag ctgaaacctg gcttatctct 1380
cagaagtact ttccttgcac agtttctact tgtccttcac agaaaagcct tgacactaat 1440
aaaatatata gaagacgata cgcagaaggg aaaaaagccc tttaaatctc ttcggaacct 1500
gaagatagac cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg ctctggctga 1560
gaaaattaaa ccaggcctac actcttttat ctttggaaga cctttctaca ctagtgtgca 1620
agaacgagat gttctaatga ctttttaaat gtgtaactta ataagcctat tccatcacaa 1680
tcatgatcgc tggtaaagta gctcagtggt gtggggaaac gttcccctgg atcatactcc 1740
agaattctgc tctcagcaat tgcagttaag taagttacac tacagttctc acaagagcct 1800
gtgaggggat gtcaggtgca tcattacatt gggtgtctct tttcctagat ttatgctttt 1860
gggatacaga cctatgttta caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat 1920
aataggatgt aaacttgacc acaactactg tttttttgaa atacatgatt catggtttac 1980
atgtgtcaag gtgaaatctg agttggcttt tacagatagt tgactttcta tcttttggca 2040
ttctttggtg tgtagaatta ctgtaatact tctgcaatca actgaaaact agagccttta 2100
aatgatttca attccacaga aagaaagtga gcttgaacat aggatgagct ttagaaagaa 2160
aattgatcaa gcagatgttt aattggaatt gattattaga tcctactttg tggatttagt 2220
ccctgggatt cagtctgtag aaatgtctaa tagttctcta tagtccttgt tcctggtgaa 2280
ccacagttag ggtgttttgt ttattttatt gttcttgcta ttgttgatat tctatgtagt 2340
tgagctctgt aaaaggaaat tgtattttat gttttagtaa ttgttgccaa ctttttaaat 2400
taattttcat tatttttgag ccaaattgaa atgtgcacct cctgtgcctt ttttctcctt 2460
agaaaatcta attacttgga acaagttcag atttcactgg tcagtcattt tcatcttgtt 2520
ttcttcttgc taagtcttac catgtacctg ctttggcaat cattgcaact ctgagattat 2580
aaaatgcctt agagaatata ctaactaata agatcttttt ttcagaaaca gaaaatagtt 2640
ccttgagtac ttccttcttg catttctgcc tatgtttttg aagttgttgc tgtttgcctg 2700
caataggcta taaggaatag caggagaaat tttactgaag tgctgttttc ctaggtgcta 2760
ctttggcaga gctaagttat cttttgtttt cttaatgcgt ttggaccatt ttgctggcta 2820
taaaataact gattaatata attctaacac aatgttgaca ttgtagttac acaaacacaa 2880
ataaatattt tatttaaaat tctggaagta atataaaagg gaaaatatat ttataagaaa 2940
gggataaagg taatagagcc cttctgcccc ccacccacca aatttacaca acaaaatgac 3000
atgttcgaat gtgaaaggtc ataatagctt tcccatcatg aatcagaaag atgtggacag 3060
cttgatgttt tagacaacca ctgaactaga tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa 3120
aaaatatata aatactacct tgtagtgtcc catactgtgt tttttacatg gtagattctt 3180
atttaagtgc taactggtta ttttctttgg ctggtttatt gtactgttat acagaatgta 3240
agttgtacag tgaaataagt tattaaagca tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc 3300
taaatggaga attttgaata aaatatattt gaaattttg 3339
<210> 2
<211> 30001
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa 60
attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg 120
gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca 180
ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt 240
catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga 300
atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt 360
tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc 420
ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca 480
ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg 540
tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca 600
cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga 660
atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa 720
atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt 780
gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc 840
agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc 900
atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa 960
ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac 1020
gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc 1080
ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt 1140
aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg 1200
taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg 1260
cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 1320
ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 1380
agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 1440
caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg 1500
gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc 1560
ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct 1620
gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt 1680
tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga 1740
attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga 1800
caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc 1860
ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta 1920
ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca 1980
agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga 2040
gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac 2100
ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg 2160
ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg 2220
gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt 2280
gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag 2340
ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc 2400
tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat 2460
gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca 2520
aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact 2580
tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc 2640
tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct 2700
gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag 2760
tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat 2820
ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg 2880
ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg 2940
tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta 3000
ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat 3060
gaacttcacc ttccagtctt ccctgatgtt gaagattgag aaagtgttgt gaactttctg 3120
gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg 3180
gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt 3240
attgagagcc aggttggaga aggtggctta cacctgtaat gccagagctt tgggaggcgg 3300
aggcaagagg atcacttgaa gccaggagtt caagctcaac ctgggcaacg tagaccctgt 3360
ctctacaaaa aattaaaaac ttagccgggc gtggtgatgt gcacctgtag tcctagctac 3420
ttgggaggct gaggcaggag ggtcatttga gcccaagagt ttgaagttac cgagagctat 3480
gatcctgcca gtgcattcca gcctggatga caaaacgaga ccctgtctct aaaaaacaag 3540
aagtgagggc tttatgattg tagaattttc actacaatag cagtggacca accacctttc 3600
taaataccaa tcagggaaga gatggttgat tttttaacag acgtttaaag aaaaagcaaa 3660
acctcaaact tagcactcta ctaacagttt tagcagatgt taattaatgt aatcatgtct 3720
gcatgtatgg gattatttcc agaaagtgta ttgggaaacc tctcatgaac cctgtgagca 3780
agccaccgtc tcactcaatt tgaatcttgg cttccctcaa aagactggct aatgtttggt 3840
aactctctgg agtagacagc actacatgta cgtaagatag gtacataaac aactattggt 3900
tttgagctga tttttttcag ctgcatttgc atgtatggat ttttctcacc aaagacgatg 3960
acttcaagta ttagtaaaat aattgtacag ctctcctgat tatacttctc tgtgacattt 4020
catttcccag gctatttctt ttggtaggat ttaaaactaa gcaattcagt atgatctttg 4080
tccttcattt tctttcttat tctttttgtt tgtttgtttg tttgtttttt tcttgaggca 4140
gagtctctct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcgcc atctcagctc attgcaacct 4200
ctgccacctc cgggttcaag agattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca 4260
ggtgtccacc accacacccg gctaattttt tgtattttta gtagaggtgg ggtttcacca 4320
tgttggccag gctggtcttg agctcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cggcctacca 4380
aagagctggg ataacaggtg tgacccacca tgcccggccc attttttttt tcttattctg 4440
ttaggagtga gagtgtaact agcagtataa tagttcaatt ttcacaacgt ggtaaaagtt 4500
tccctataat tcaatcagat tttgctccag ggttcagttc tgttttagga aatactttta 4560
ttttcagttt aatgatgaaa tattagagtt gtaatattgc ctttatgatt atccaccttt 4620
ttaacctaaa agaatgaaag aaaaatatgt ttgcaatata attttatggt tgtatgttaa 4680
cttaattcat tatgttggcc tccagtttgc tgttgttagt tatgacagca gtagtgtcat 4740
taccatttca attcagatta cattcctata tttgatcatt gtaaactgac tgcttacatt 4800
gtattaaaaa cagtggatat tttaaagaag ctgtacggct tatatctagt gctgtctctt 4860
aagactatta aattgataca acatatttaa aagtaaatat tacctaaatg aatttttgaa 4920
attacaaata cacgtgttaa aactgtcgtt gtgttcaacc atttctgtac atacttagag 4980
ttaactgttt tgccaggctc tgtatgccta ctcataatat gataaaagca ctcatctaat 5040
gctctgtaaa tagaagtcag tgctttccat cagactgaac tctcttgaca agatgtggat 5100
gaaattcttt aagtaaaatt gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc 5160
caaagcaatc atatggcaaa gataggtata tcatagtttg cctattagct gctttgtatt 5220
gctattatta taaatagact tcacagtttt agacttgctt aggtgaaatt gcaattcttt 5280
ttactttcag tcttagataa caagtcttca attatagtac aatcacacat tgcttaggaa 5340
tgcatcatta ggcgattttg tcattatgca aacatcatag agtgtactta cacaaaccta 5400
gatagtatag cctttatgta cctaggccgt atggtatagt ctgttgctcc taggccacaa 5460
acctgtacaa ctgttactgt actgaatact atagacagtt gtaacacagt ggtaaatatt 5520
tatctaaata tatgcaaaca gagaaaaggt acagtaaaag tatggtataa aagataatgg 5580
tatacctgtg taggccactt accacgaatg gagcttgcag gactagaagt tgctctgggt 5640
gagtcagtga gtgagtggtg aattaatgtg aaggcctaga acactgtaca ccactgtaga 5700
ctataaacac agtacgctga agctacacca aatttatctt aacagttttt cttcaataaa 5760
aaattataac tttttaactt tgtaaacttt ttaatttttt aacttttaaa atacttagct 5820
tgaaacacaa atacattgta tagctataca aaaatatttt ttctttgtat ccttattcta 5880
gaagcttttt tctattttct attttaaatt ttttttttta cttgttagtc gtttttgtta 5940
aaaactaaaa cacacacact ttcacctagg catagacagg attaggatca tcagtatcac 6000
tcccttccac ctcactgcct tccacctcca catcttgtcc cactggaagg tttttagggg 6060
caataacaca catgtagctg tcacctatga taacagtgct ttctgttgaa tacctcctga 6120
aggacttgcc tgaggctgtt ttacatttaa cttaaaaaaa aaaaaagtag aaggagtgca 6180
ctctaaaata acaataaaag gcatagtata gtgaatacat aaaccagcaa tgtagtagtt 6240
tattatcaag tgttgtacac tgtaataatt gtatgtgcta tactttaaat aacttgcaaa 6300
atagtactaa gaccttatga tggttacagt gtcactaagg caatagcata ttttcaggtc 6360
cattgtaatc taatgggact accatcatat atgcagtcta ccattgactg aaacgttaca 6420
tggcacataa ctgtatttgc aagaatgatt tgttttacat taatatcaca taggatgtac 6480
ctttttagag tggtatgttt atgtggatta agatgtacaa gttgagcaag gggaccaaga 6540
gccctgggtt ctgtcttgga tgtgagcgtt tatgttcttc tcctcatgtc tgttttctca 6600
ttaaattcaa aggcttgaac gggccctatt tagcccttct gttttctacg tgttctaaat 6660
aactaaagct tttaaattct agccatttag tgtagaactc tctttgcagt gatgaaatgc 6720
tgtattggtt tcttggctag catattaaat atttttatct ttgtcttgat acttcaatgt 6780
cgttttaaac atcaggatcg ggcttcagta ttctcataac cagagagttc actgaggata 6840
caggactgtt tgcccatttt ttgttatggc tccagacttg tggtatttcc atgtcttttt 6900
tttttttttt ttttttgacc ttttagcggc tttaaagtat ttctgttgtt aggtgttgta 6960
ttacttttct aagattactt aacaaagcac cacaaactga gtggctttaa acaacagcaa 7020
tttattctct cacaattcta gaagctagaa gtccgaaatc aaagtgttga caggggcatg 7080
atcttcaaga gagaagactc tttccttgcc tcttcctggc ttctggtggt taccagcaat 7140
cctgagtgtt cctttcttgc cttgtagttt caacaatcca gtatctgcct tttgtcttca 7200
catggctgtc taccatttgt ctctgtgtct ccaaatctct ctccttataa acacagcagt 7260
tattggatta ggccccactc taatccagta tgaccccatt ttaacatgat tacacttatt 7320
tctagataag gtcacattca cgtacaccaa gggttaggaa ttgaacatat ctttttgggg 7380
gacacaattc aacccacaag tgtcagtctc tagctgagcc tttcccttcc tgtttttctc 7440
ctttttagtt gctatgggtt aggggccaaa tctccagtca tactagaatt gcacatggac 7500
tggatatttg ggaatactgc gggtctattc tatgagcttt agtatgtaac atttaatatc 7560
agtgtaaaga agcccttttt taagttattt ctttgaattt ctaaatgtat gccctgaata 7620
taagtaacaa gttaccatgt cttgtaaaat gatcatatca acaaacattt aatgtgcacc 7680
tactgtgcta gttgaatgtc tttatcctga taggagataa caggattcca catctttgac 7740
ttaagaggac aaaccaaata tgtctaaatc atttggggtt ttgatggata tctttaaatt 7800
gctgaaccta atcattggtt tcatatgtca ttgtttagat atctccggag catttggata 7860
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 7920
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 7980
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 8040
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 8100
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 8160
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 8220
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 8280
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggtaa gtgatttttc 8340
agcttattaa tcatgttaac ctatctgttg aaagcttatt ttctggtaca tataaatctt 8400
atttttttaa ttatatgcag tgaacatcaa acaataaatg ttatttattt tgcatttacc 8460
ctattagata caaatacatc tggtctgata cctgtcatct tcatattaac tgtggaaggt 8520
acgaaatggt agctccacat tatagatgaa aagctaaagc ttagacaaat aaagaaactt 8580
ttagaccctg gattcttctt gggagccttt gactctaata ccttttgttt ccctttcatt 8640
gcacaattct gtcttttgct tactactatg tgtaagtata acagttcaaa gtaatagttt 8700
cataagctgt tggtcatgta gcctttggtc tctttaacct ctttgccaag ttcccaggtt 8760
cataaaatga ggaggttgaa tggaatggtt cccaagagaa ttccttttaa tcttacagaa 8820
attattgttt tcctaaatcc tgtagttgaa tatataatgc tatttacatt tcagtatagt 8880
tttgatgtat ctaaagaaca cattgaattc tccttcctgt gttccagttt gatactaacc 8940
tgaaagtcca ttaagcatta ccagttttaa aaggcttttg cccaatagta aggaaaaata 9000
atatctttta aaagaataat tttttactat gtttgcaggc ttacttcctt ttttctcaca 9060
ttatgaaact cttaaaatca ggagaatctt ttaaacaaca tcataatgtt taatttgaaa 9120
agtgcaagtc attcttttcc tttttgaaac tatgcagatg ttacattgac tgttttctgt 9180
gaagttatct ttttttcact gcagaataaa ggttgttttg attttatttt gtattgttta 9240
tgagaacatg catttgttgg gttaatttcc tacccctgcc cccatttttt ccctaaagta 9300
gaaagtattt ttcttgtgaa ctaaattact acacaagaac atgtctattg aaaaataagc 9360
aagtatcaaa atgttgtggg ttgttttttt aaataaattt tctcttgctc aggaaagaca 9420
agaaaatgtc cagaagatta tcttagaagg cacagagaga atggaagatc aggtatatgc 9480
aaattgcata ctgtcaaatg tttttctcac agcatgtatc tgtataaggt tgatggctac 9540
atttgtcaag gccttggaga catacgaata agcctttaat ggagctttta tggaggtgta 9600
cagaataaac tggaggaaga tttccatatc ttaaacccaa agagttaaat cagtaaacaa 9660
aggaaaatag taattgcatc tacaaattaa tatttgctcc cttttttttt ctgtttgccc 9720
agaataaatt ttggataact tgttcatagt aaaaataaaa aaaattgtct ctgatatgtt 9780
ctttaaggta ctacttctcg aacctttccc tagaagtagc tgtaacagaa ggagagcata 9840
tgtacccctg aggtatctgt ctggggtgta ggcccaggtc cacacaatat ttcttctaag 9900
tcttatgttg tatcgttaag actcatgcaa tttacatttt attccataac tattttagta 9960
ttaaaatttg tcagtgatat ttcttaccct ctcctctagg aaaatgtgcc atgtttatcc 10020
cttggctttg aatgcccctc aggaacagac actaagagtt tgagaagcat ggttacaagg 10080
gtgtggcttc ccctgcggaa actaagtaca gactatttca ctgtaaagca gagaagttct 10140
tttgaaggag aatctccagt gaagaaagag ttcttcactt ttacttccat ttcctcttgt 10200
gggtgaccct caatgctcct tgtaaaactc caatatttta aacatggctg ttttgccttt 10260
ctttgcttct ttttagcatg aatgagacag atgatacttt aaaaaagtaa ttaaaaaaaa 10320
aaacttgtga aaatacatgg ccataataca gaacccaata caatgatctc ctttaccaaa 10380
ttgttatgtt tgtacttttg tagatagctt tccaattcag agacagttat tctgtgtaaa 10440
ggtctgactt aacaagaaaa gatttccctt tacccaaaga atcccagtcc ttatttgctg 10500
gtcaataagc agggtcccca ggaatggggt aactttcagc accctctaac ccactagtta 10560
ttagtagact aattaagtaa acttatcgca agttgaggaa acttagaacc aactaaaatt 10620
ctgcttttac tgggattttg ttttttcaaa ccagaaacct ttacttaagt tgactactat 10680
taatgaattt tggtctctct tttaagtgct cttcttaaaa atgttatctt actgctgaga 10740
agttcaagtt tgggaagtac aaggaggaat agaaacttaa gagattttct tttagagcct 10800
cttctgtatt tagccctgta ggattttttt tttttttttt ttttttggtg ttgttgagct 10860
tcagtgaggc tattcattca cttatactga taatgtctga gatactgtga atgaaatact 10920
atgtatgctt aaacctaaga ggaaatattt tcccaaaatt attcttcccg aaaaggagga 10980
gttgcctttt gattgagttc ttgcaaatct cacaacgact ttattttgaa caatactgtt 11040
tggggatgat gcattagttt gaaacaactt cagttgtagc tgtcatctga taaaattgct 11100
tcacagggaa ggaaatttaa cacggatcta gtcattattc ttgttagatt gaatgtgtga 11160
attgtaattg taaacaggca tgataattat tactttaaaa actaaaaaca gtgaatagtt 11220
agttgtggag gttactaaag gatggttttt ttttaaataa aactttcagc attatgcaaa 11280
tgggcatatg gcttaggata aaacttccag aagtagcatc acatttaaat tctcaagcaa 11340
cttaataata tggggctctg aaaaactggt taaggttact ccaaaaatgg ccctgggtct 11400
gacaaagatt ctaacttaaa gatgcttatg aagactttga gtaaaatcat ttcataaaat 11460
aagtgaggaa aaacaactag tattaaattc atcttaaata atgtatgatt taaaaaatat 11520
gtttagctaa aaatgcatag tcatttgaca atttcattta tatctcaaaa aatttactta 11580
accaagttgg tcacaaaact gatgagactg gtggtggtag tgaataaatg agggaccatc 11640
catatttgag acactttaca tttgtgatgt gttatactga attttcagtt tgattctata 11700
gactacaaat ttcaaaatta caatttcaag atgtaataag tagtaatatc ttgaaatagc 11760
tctaaaggga atttttctgt tttattgatt cttaaaatat atgtgctgat tttgatttgc 11820
atttgggtag attatacttt tatgagtatg gaggttaggt attgattcaa gttttcctta 11880
cctatttggt aaggatttca aagtcttttt gtgcttggtt ttcctcattt ttaaatatga 11940
aatatattga tgacctttaa caaatttttt ttatctcaaa ttttaaagga gatcttttct 12000
aaaagaggca tgatgactta atcattgcat gtaacagtaa acgataaacc aatgattcca 12060
tactctctaa agaataaaag tgagctttag ggccgggcat ggtcagaaat ttgacaccaa 12120
cctggccaac atggcgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaatcagc cgggcatggt 12180
ggcggcacct atagtcccag ctacttggga ggatgagaca ggagagtcac ttgaacctgg 12240
gaggagaggt tgcagtgagc tgagatcacg ccattgcact ccagcctgag caatgaaagc 12300
aaaactccat ctcaaaaaaa aaaaaagaaa agaaagaata aaagtgagct ttggattgca 12360
tataaatcct ttagacatgt agtagacttg tttgatactg tgtttgaaca aattacgaag 12420
tattttcatc aaagaatgtt attgtttgat gttattttta ttttttattg cccagcttct 12480
ctcatattac gtgattttct tcacttcatg tcactttatt gtgcagggtc agagtattat 12540
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 12600
cagtgttcct gaagaaatag atgtaagttt aaatgagagc aattatacac tttatgagtt 12660
ttttggggtt atagtattat tatgtatatt attaatattc taattttaat agtaaggact 12720
ttgtcataca tactattcac atacagtatt agccacttta gcaaataagc acacacaaaa 12780
tcctggattt tatggcaaaa cagaggcatt tttgatcagt gatgacaaaa ttaaattcat 12840
tttgtttatt tcattacttt tataattcct aaaagtggga ggatcccagc tcttatagga 12900
gcaattaata tttaatgtag tgtcttttga aacaaaactg tgtgccaaag tagtaaccat 12960
taatggaagt ttacttgtag tcacaaattt agtttcctta atcatttgtt gaggacgttt 13020
tgaatcacac actatgagtg ttaagagata cctttaggaa actattcttg ttgttttctg 13080
attttgtcat ttaggttagt ctcctgattc tgacagctca gaagaggaag ttgttcttgt 13140
aaaaattgtt taacctgctt gaccagcttt cacatttgtt cttctgaagt ttatggtagt 13200
gcacagagat tgttttttgg ggagtcttga ttctcggaaa tgaaggcagt gtgttatatt 13260
gaatccagac ttccgaaaac ttgtatatta aaagtgttat ttcaacacta tgttacagcc 13320
agactaattt ttttattttt tgatgcattt tagatagctg atacagtact caatgatgat 13380
gatattggtg acagctgtca tgaaggcttt cttctcaagt aagaattttt cttttcataa 13440
aagctggatg aagcagatac catcttatgc tcacctatga caagatttgg aagaaagaaa 13500
ataacagact gtctacttag attgttctag ggacattacg tatttgaact gttgcttaaa 13560
tttgtgttat ttttcactca ttatatttct atatatattt ggtgttattc catttgctat 13620
ttaaagaaac cgagtttcca tcccagacaa gaaatcatgg ccccttgctt gattctggtt 13680
tcttgtttta cttctcatta aagctaacag aatcctttca tattaagttg tactgtagat 13740
gaacttaagt tatttaggcg tagaacaaaa ttattcatat ttatactgat ctttttccat 13800
ccagcagtgg agtttagtac ttaagagttt gtgcccttaa accagactcc ctggattaat 13860
gctgtgtacc cgtgggcaag gtgcctgaat tctctataca cctatttcct catctgtaaa 13920
atggcaataa tagtaatagt acctaatgtg tagggttgtt ataagcattg agtaagataa 13980
ataatataaa gcacttagaa cagtgcctgg aacataaaaa cacttaataa tagctcatag 14040
ctaacatttc ctatttacat ttcttctaga aatagccagt atttgttgag tgcctacatg 14100
ttagttcctt tactagttgc tttacatgta ttatcttata ttctgtttta aagtttcttc 14160
acagttacag attttcatga aattttactt ttaataaaag agaagtaaaa gtataaagta 14220
ttcactttta tgttcacagt cttttccttt aggctcatga tggagtatca gaggcatgag 14280
tgtgtttaac ctaagagcct taatggcttg aatcagaagc actttagtcc tgtatctgtt 14340
cagtgtcagc ctttcataca tcattttaaa tcccatttga ctttaagtaa gtcacttaat 14400
ctctctacat gtcaatttct tcagctataa aatgatggta tttcaataaa taaatacatt 14460
aattaaatga tattatactg actaattggg ctgttttaag gctcaataag aaaatttctg 14520
tgaaaggtct ctagaaaatg taggttccta tacaaataaa agataacatt gtgcttatag 14580
cttcggtgtt tatcatataa agctattctg agttatttga agagctcacc tacttttttt 14640
tgtttttagt ttgttaaatt gttttatagg caatgttttt aatctgtttt ctttaactta 14700
cagtgccatc agctcacact tgcaaacctg tggctgttcc gttgtagtag gtagcagtgc 14760
agagaaagta aataaggtag tttattttat aatctagcaa atgatttgac tctttaagac 14820
tgatgatata tcatggattg tcatttaaat ggtaggttgc aattaaaatg atctagtagt 14880
ataaggaggc aatgtaatct catcaaattg ctaagacacc ttgtggcaac agtgagtttg 14940
aaataaactg agtaagaatc atttatcagt ttattttgat agctcggaaa taccagtgtc 15000
agtagtgtat aaatggtttt gagaatatat taaaatcaga tatataaaaa aaattactct 15060
tctatttccc aatgttatct ttaacaaatc tgaagatagt catgtacttt tggtagtagt 15120
tccaaagaaa tgttatttgt ttattcatct tgatttcatt gtcttcgctt tccttctaaa 15180
tctgtccctt ctagggagct attgggatta agtggtcatt gattattata ctttattcag 15240
taatgtttct gaccctttcc ttcagtgcta cttgagttaa ttaaggatta atgaacagtt 15300
acatttccaa gcattagcta ataaactaaa ggattttgca cttttcttca ctgaccatta 15360
gttagaaaga gttcagagat aagtatgtgt atctttcaat ttcagcaaac ctaatttttt 15420
aaaaaaagtt ttacatagga aatatgttgg aaatgatact ttacaaagat attcataatt 15480
tttttttgta atcagctact ttgtatattt acatgagcct taatttatat ttctcatata 15540
accatttatg agagcttagt atacctgtgt cattatattg catctacgaa ctagtgacct 15600
tattccttct gttacctcaa acaggtggct ttccatctgt gatctccaaa gccttaggtt 15660
gcacagagtg actgccgagc tgctttatga agggagaaag gctccatagt tggagtgttt 15720
tttttttttt ttttaaacat ttttcccatc ctccatcctc ttgagggaga atagcttacc 15780
ttttatcttg ttttaatttg agaaagaagt tgccaccact ctaggttgaa aaccactcct 15840
ttaacataat aactgtggat atggtttgaa tttcaagata gttacatgcc tttttatttt 15900
tcctaataga gctgtaggtc aaatattatt agaatcagat ttctaaatcc cacccaatga 15960
cctgcttatt ttaaatcaaa ttcaataatt aattctcttc tttttggagg atctggacat 16020
tctttgatat ttcttacaac gaatttcatg tgtagaccca ctaaacagaa gctataaaag 16080
ttgcatggtc aaataagtct gagaaagtct gcagatgata taattcacct gaagagtcac 16140
agtatgtagc caaatgttaa aggttttgag atgccataca gtaaatttac caagcatttt 16200
ctaaatttat ttgaccacag aatccctatt ttaagcaaca actgttacat cccatggatt 16260
ccaggtgact aaagaatact tatttcttag gatatgtttt attgataata acaattaaaa 16320
tttcagatat ctttcataag caaatcagtg gtctttttac ttcatgtttt aatgctaaaa 16380
tattttcttt tatagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa 16440
tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa 16500
ggcctgctaa aggtatagtt tctagttatc acaagtgaaa ccacttttct aaaatcattt 16560
ttgagactct ttatagacaa atcttaaata ttagcattta atgtatctca tattgacatg 16620
cccagagact gacttccttt acacagttct gcacatagac tatatgtctt atggatttat 16680
agttagtatc atcagtgaaa caccatagaa taccctttgt gttccaggtg ggtccctgtt 16740
cctacatgtc tagcctcagg actttttttt ttttaacaca tgcttaaatc aggttgcaca 16800
tcaaaaataa gatcatttct ttttaactaa atagatttga attttattga aaaaaaattt 16860
taaacatctt taagaagctt ataggattta agcaattcct atgtatgtgt actaaaatat 16920
atatatttct atatataata tatattagaa aaaaattgta tttttctttt atttgagtct 16980
actgtcaagg agcaaaacag agaaatgtaa attagcaatt atttataata cttaaaggga 17040
agaaagttgt tcaccttgtt gaatctatta ttgttatttc aattatagtc ccaagacgtg 17100
aagaaatagc tttcctaatg gttatgtgat tgtctcatag tgactacttt cttgaggatg 17160
tagccacggc aaaatgaaat aaaaaaattt aaaaattgtt gcaaatacaa gttatattag 17220
gcttttgtgc attttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata 17280
gaaactagtt aaaggaaacg tagtttctat ttgagttata catatctgta aattagaact 17340
tctcctgtta aaggcataat aaagtgctta atacttttgt ttcctcagca ccctctcatt 17400
taattatata attttagttc tgaaagggac ctataccaga tgcctagagg aaatttcaaa 17460
actatgatct aatgaaaaaa tatttaatag ttctccatgc aaatacaaat catatagttt 17520
tccagaaaat acctttgaca ttatacaaag atgattatca cagcattata atagtaaaaa 17580
aatggaaata gcctctttct tctgttctgt tcatagcaca gtgcctcata cgcagtaggt 17640
tattattaca tggtaactgg ctaccccaac tgattaggaa agaagtaaat ttgttttata 17700
aaaatacata ctcattgagg tgcatagaat aattaagaaa ttaaaagaca cttgtaattt 17760
tgaatccagt gaatacccac tgttaatatt tggtatatct ctttctagtc tttttttccc 17820
ttttgcatgt attttcttta agactcccac ccccactgga tcatctctgc atgttctaat 17880
ctgctttttt cacagcagat tctaagcctc tttgaatatc aacacaaact tcaacaactt 17940
catctataga tgccaaataa taaattcatt tttatttact taaccacttc ctttggatgc 18000
ttaggtcatt ctgatgtttt gctattgaaa ccaatgctat actgaacact tctgtcacta 18060
aaactttgca cacactcatg aatagcttct taggataaat ttttagagat ggatttgcta 18120
aatcagagac cattttttaa aattaaaaaa caattattca tatcgtttgg catgtaagac 18180
agtaaatttt ccttttattt tgacaggatt caactggaag ctttgtgctg cctttccggc 18240
aagtcatgta tgctccatat cccaccacac acatagatgt ggatgtcaat actgtgaagc 18300
agatgccacc ctgtcatgaa catatttata atcagcgtag atacatgaga tccgagctga 18360
cagccttctg gagagccact tcagaagaag acatggctca ggatacgatc atctacactg 18420
acgaaagctt tactcctgat ttgtacgtaa tgctctgcct gctggtactg tagtcaagca 18480
atatgaaatt gtgtctttta cgaataaaaa caaaacagaa gttgcattta aaaagaaaga 18540
aatattacca gcagaattat gcttgaagaa acatttaatc aagcattttt ttcttaaatg 18600
ttcttctttt tccatacaat tgtgtttacc ctaaaatagg taagattaac ccttaaagta 18660
aatatttaac tatttgttta ataaatatat attgagctcc taggcactgt tctaggtacc 18720
gggcttaata gtggccaacc agacagcccc agccccagcc cctacattgt gtatagtcta 18780
ttatgtaaca gttattgaat ggacttatta acaaaaccaa agaagtaatt ctaagtcttt 18840
tttttcttga catatgaata taaaatacag caaaactgtt aaaatatatt aatggaacat 18900
ttttttactt tgcattttat attgttattc acttcttatt tttttttaaa aaaaaaagcc 18960
tgaacagtaa attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gttgagcatg gacccaactt 19020
gaaaaaaaaa atgatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaaag 19080
atgttctgaa atcaggaaaa gaattatagt atacttttgt gtttctcttt tatcagttga 19140
aaaaaggcac agtagctcat gcctgtaaga acagagcttt gggagtgcaa ggcaggcgga 19200
tcacttgagg ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca 19260
aaaaataaaa aagaattatt ggaatgtgtt tctgtgtgcc tgtaatccta gctattccga 19320
aagctgaggc aggaggatct tttgagccca ggagtttgag gttacaggga gttatgatgt 19380
gccagtgtac tccagcctgg ggaacaccga gactctgtct tatttaaaaa aaaaaaaaaa 19440
aaaatgcttg caataatgcc tggcacatag aaggtaacag taagtgttaa ctgtaataac 19500
ccaggtctaa gtgtgtaagg caatagaaaa attggggcaa ataagcctga cctatgtatc 19560
tacagaatca gtttgagctt aggtaacaga cctgtggagc accagtaatt acacagtaag 19620
tgttaaccaa aagcatagaa taggaatatc ttgttcaagg gacccccagc cttatacatc 19680
tcaaggtgca gaaagatgac ttaatatagg acccattttt tcctagttct ccagagtttt 19740
tattggttct tgagaaagta gtaggggaat gttttagaaa atgaattggt ccaactgaaa 19800
ttacatgtca gtaagttttt atatattggt aaattttagt agacatgtag aagttttcta 19860
attaatctgt gccttgaaac attttctttt ttcctaaagt gcttagtatt ttttccgttt 19920
tttgattggt tacttgggag cttttttgag gaaatttagt gaactgcaga atgggtttgc 19980
aaccatttgg tatttttgtt ttgtttttta gaggatgtat gtgtatttta acatttctta 20040
atcattttta gccagctatg tttgttttgc tgatttgaca aactacagtt agacagctat 20100
tctcattttg ctgatcatga caaaataata tcctgaattt ttaaattttg catccagctc 20160
taaattttct aaacataaaa ttgtccaaaa aatagtattt tcagccacta gattgtgtgt 20220
taagtctatt gtcacagagt cattttactt ttaagtatat gtttttacat gttaattatg 20280
tttgttattt ttaattttaa ctttttaaaa taattccagt cactgccaat acatgaaaaa 20340
ttggtcactg gaattttttt tttgactttt attttaggtt catgtgtaca tgtgcaggtg 20400
tgttatacag gtaaattgcg tgtcatgagg gtttggtgta caggtgattt cattacccag 20460
gtaataagca tagtacccaa taggtagttt tttgatcctc acccttctcc caccctcaag 20520
taggccctgg tgttgctgtt tccttctttg tgtccatgta tactcagtgt ttagctccca 20580
cttagaagtg agaacatgcg gtagttggtt ttctgttcct ggattagttc acttaggata 20640
atgacctcta gctccatctg gtttttatgg ctgcatagta ttccatggtg tatatgtatc 20700
acattttctt tatccagtct accattgata ggcatttagg ttgattccct gtctttgtta 20760
tcatgaatag tgctgtgatg aacatacaca tgcatgtgtc tttatggtag aaaaatttgt 20820
attcctttag gtacatatag aataatgggg ttgctagggt gaatggtagt tctattttca 20880
gttatttgag aaatcttcaa actgcttttc ataatagcta aactaattta cagtcccgcc 20940
agcagtgtat aagtgttccc ttttctccac aaccttgcca acatctgtga ttttttgact 21000
ttttaataat agccattcct agagaattga tttgcaattc tctattagtg atattaagca 21060
ttttttcata tgctttttag ctgtctgtat atattcttct gaaaaatttt catgtccttt 21120
gcccagtttg tagtggggtg ggttgttttt tgcttgttaa ttagttttaa gttccttcca 21180
gattctgcat atccctttgt tggatacatg gtttgcagat atttttctcc cattgtgtag 21240
gttgtctttt actctgttga tagtttcttt tgccatgcag gagctcgtta ggtcccattt 21300
gtgtttgttt ttgttgcagt tgcttttggc gtcttcatca taaaatctgt gccagggcct 21360
atgtccagaa tggtatttcc taggttgtct tccagggttt ttacaatttt agattttacg 21420
tttatgtctt taatccatct tgagttgatt tttgtatatg gcacaaggaa ggggtccagt 21480
ttcactccaa ttcctatggc tagcaattat cccagcacca tttattgaat acggagtcct 21540
ttccccattg cttgtttttt gtcaactttg ttgaagatca gatggttgta agtgtgtggc 21600
tttatttctt ggctctctat tctccattgg tctatgtgtc tgtttttata acagtaccct 21660
gctgttcagg ttcctatagc cttttagtat aaaatcggct aatgtgatgc ctccagcttt 21720
gttctttttg cttaggattg ctttggctat ttgggctcct ttttgggtcc atattaattt 21780
taaaacagtt ttttctggtt ttgtgaagga tatcattggt agtttatagg aatagcattg 21840
aatctgtaga ttgctttggg cagtatggcc attttaacaa tattaattct tcctatctat 21900
gaatatggaa tgtttttcca tgtgtttgtg tcatctcttt atacctgatg tataaagaaa 21960
agctggtatt attcctactc aatctgttcc aaaaaattga ggaggaggaa ctcttcccta 22020
atgaggccag catcattctg ataccaaaac ctggcagaga cacaacagaa aaaagaaaac 22080
ttcaggccaa tatccttgat gaatatagat gcaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac 22140
caaatccagc agcacatcaa aaagctgatc tactttgatc aagtaggctt tatccctggg 22200
atgcaaggtt ggttcaacat acacaaatca ataagtgtga ttcatcacat aaacagagct 22260
aaaaacaaaa accacaagat tatctcaata ggtagagaaa aggttgtcaa taaaatttaa 22320
catcctccat gttaaaaacc ttcagtaggt caggtgtagt gactcacacc tgtaatccca 22380
gcactttggg aggccaaggc gggcatatct cttaagccca ggagttcaag acgagcctag 22440
gcagcatggt gaaaccccat ctctacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatta gcttggtatg 22500
gtgacatgca cctatagtcc cagctattca ggaggttgag gtgggaggat tgtttgagcc 22560
cgggaggcag aggttggcag cgagctgaga tcatgccacc gcactccagc ctgggcaacg 22620
gagtgagacc ctgtctcaaa aaagaaaaat cacaaacaat cctaaacaaa ctaggcattg 22680
aaggaacatg cctcaaaaaa ataagaacca tctatgacag acccatagcc aatatcttac 22740
caaatgggca aaagctggaa gtattctcct tgagaaccgt aacaagacaa ggatgtccac 22800
tctcaccact ccttttcagc atagttctgg aagtcctagc cagagcaatc aggaaagaga 22860
aagaaagaaa gacattcaga taggaagaga agaagtcaaa ctatttctgt ttgcaggcag 22920
tataattctg tacctagaaa atctcatagt ctctgcccag aaactcctaa atctgttaaa 22980
aatttcagca aagttttggc attctctata ctccaacacc ttccaaagtg agagcaaaat 23040
caagaacaca gtcccattca caatagccgc aaaacgaata aaatacctag gaatccagct 23100
aaccagggag gtgaaagatc tctatgagaa ttacaaaaca ctgctgaaag aaatcagaga 23160
tgacacaaac aaatggaaat gttctttttt aacaccttgc tttatctaat tcacttatga 23220
tgaagatact cattcagtgg aacaggtata ataagtccac tcgattaaat ataagcctta 23280
ttctctttcc agagcccaag aaggggcact atcagtgccc agtcaataat gacgaaatgc 23340
taatattttt cccctttacg gtttctttct tctgtagtgt ggtacactcg tttcttaaga 23400
taaggaaact tgaactacct tcctgtttgc ttctacacat acccattctc tttttttgcc 23460
actctggtca ggtataggat gatccctacc actttcagtt aaaaactcct cctcttacta 23520
aatgttctct taccctctgg cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaaagatga 23580
aagggaggtg gggcctggga agggaataag tagtcctgtt tgtttgtgtg tttgctttag 23640
cacctgctat atcctaggtg ctgtgttagg cacacattat tttaagtggc cattatatta 23700
ctactactca ctctggtcgt tgccaaggta ggtagtactt tcttggatag ttggttcatg 23760
ttacttacag atggtgggct tgttgaggca aacccagtgg ataatcatcg gagtgtgttc 23820
tctaatctca ctcaaatttt tcttcacatt ttttggtttg ttttggtttt tgatggtagt 23880
ggcttatttt tgttgctggt ttgttttttg tttttttttg agatggcaag aattggtagt 23940
tttatttatt aattgcctaa gggtctctac tttttttaaa agatgagagt agtaaaatag 24000
attgatagat acatacatac ccttactggg gactgcttat attctttaga gaaaaaatta 24060
catattagcc tgacaaacac cagtaaaatg taaatatatc cttgagtaaa taaatgaatg 24120
tatattttgt gtctccaaat atatatatct atattcttac aaatgtgttt atatgtaata 24180
tcaatttata agaacttaaa atgttggctc aagtgaggga ttgtggaagg tagcattata 24240
tggccatttc aacatttgaa cttttttctt ttcttcattt tcttcttttc ttcaggaata 24300
tttttcaaga tgtcttacac agagacactc tagtgaaagc cttcctggat caggtaaatg 24360
ttgaacttga gattgtcaga gtgaatgata tgacatgttt tcttttttaa tatatcctac 24420
aatgcctgtt ctatatattt atattcccct ggatcatgcc ccagagttct gctcagcaat 24480
tgcagttaag ttagttacac tacagttctc agaagagtct gtgagggcat gtcaagtgca 24540
tcattacatt ggttgcctct tgtcctagat ttatgcttcg ggaattcaga cctttgttta 24600
caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat aataagatat aaagttgacc 24660
acaactactg ttttttgaaa catagaattc ctggtttaca tgtatcaaag tgaaatctga 24720
cttagctttt acagatataa tatatacata tatatatcct gcaatgcttg tactatatat 24780
gtagtacaag tatatatata tgtttgtgtg tgtatatata tatagtacga gcatatatac 24840
atattaccag cattgtagga tatatatatg tttatatatt aaaaaaaagt tataaactta 24900
aaaccctatt atgttatgta gagtatatgt tatatatgat atgtaaaata tataacatat 24960
actctatgat agagtgtaat atatttttta tatatatttt aacatttata aaatgataga 25020
attaagaatt gagtcctaat ctgttttatt aggtgctttt tgtagtgtct ggtctttcta 25080
aagtgtctaa atgatttttc cttttgactt attaatgggg aagagcctgt atattaacaa 25140
ttaagagtgc agcattccat acgtcaaaca acaaacattt taattcaagc attaacctat 25200
aacaagtaag tttttttttt ttttttgaga aagggaggtt gtttatttgc ctgaaatgac 25260
tcaaaaatat ttttgaaaca tagtgtactt atttaaataa catctttatt gtttcattct 25320
tttaaaaaat atctacttaa ttacacagtt gaaggaaatc gtagattata tggaacttat 25380
ttcttaatat attacagttt gttataataa cattctgggg atcaggccag gaaactgtgt 25440
catagataaa gctttgaaat aatgagatcc ttatgtttac tagaaatttt ggattgagat 25500
ctatgaggtc tgtgacatat tgcgaagttc aaggaaaatt cgtaggcctg gaatttcatg 25560
cttctcaagc tgacataaaa tccctcccac tctccacctc atcatatgca cacattctac 25620
tcctacccac ccactccacc ccctgcaaaa gtacaggtat atgaatgtct caaaaccata 25680
ggctcatctt ctaggagctt caatgttatt tgaagatttg ggcagaaaaa attaagtaat 25740
acgaaataac ttatgtatga gttttaaaag tgaagtaaac atggatgtat tctgaagtag 25800
aatgcaaaat ttgaatgcat ttttaaagat aaattagaaa acttctaaaa actgtcagat 25860
tgtctgggcc tggtggctta tgcctgtaat cccagcactt tgggagtccg aggtgggtgg 25920
atcacaaggt caggagatcg agaccatcct gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa 25980
gtatacaaaa attagctggg cgtggcagcg tgtgcctgta atcccagcta cctgggaggc 26040
tgaggcagga gaatcgcttg aacccaggag gtgtaggttg cagtgagtca agatcgcgcc 26100
actgcacttt agcctggtga cagagctaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aaaatatcag 26160
attgttccta cacctagtgc ttctatacca cactcctgtt agggggcatc agtggaaatg 26220
gttaaggaga tgtttagtgt gtattgtctg ccaagcactg tcaacactgt catagaaact 26280
tctgtacgag tagaatgtga gcaaattatg tgttgaaatg gttcctctcc ctgcaggtct 26340
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 26400
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgtga gtaaaactcc 26460
tacacggaag aaaaaccttt gtacattgtt tttttgtttt gtttcctttg tacattttct 26520
atatcataat ttttgcgctt cttttttttt tttttttttt tttttttcca ttatttttag 26580
gcagaaggga aaaaagccct ttaaatctct tcggaacctg aagatagacc ttgatttaac 26640
agcagagggc gatcttaaca taataatggc tctggctgag aaaattaaac caggcctaca 26700
ctcttttatc tttggaagac ctttctacac tagtgtgcaa gaacgagatg ttctaatgac 26760
tttttaaatg tgtaacttaa taagcctatt ccatcacaat catgatcgct ggtaaagtag 26820
ctcagtggtg tggggaaacg ttcccctgga tcatactcca gaattctgct ctcagcaatt 26880
gcagttaagt aagttacact acagttctca caagagcctg tgaggggatg tcaggtgcat 26940
cattacattg ggtgtctctt ttcctagatt tatgcttttg ggatacagac ctatgtttac 27000
aatataataa atattattgc tatcttttaa agatataata ataggatgta aacttgacca 27060
caactactgt ttttttgaaa tacatgattc atggtttaca tgtgtcaagg tgaaatctga 27120
gttggctttt acagatagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtagaattac 27180
tgtaatactt ctgcaatcaa ctgaaaacta gagcctttaa atgatttcaa ttccacagaa 27240
agaaagtgag cttgaacata ggatgagctt tagaaagaaa attgatcaag cagatgttta 27300
attggaattg attattagat cctactttgt ggatttagtc cctgggattc agtctgtaga 27360
aatgtctaat agttctctat agtccttgtt cctggtgaac cacagttagg gtgttttgtt 27420
tattttattg ttcttgctat tgttgatatt ctatgtagtt gagctctgta aaaggaaatt 27480
gtattttatg ttttagtaat tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc 27540
caaattgaaa tgtgcacctc ctgtgccttt tttctcctta gaaaatctaa ttacttggaa 27600
caagttcaga tttcactggt cagtcatttt catcttgttt tcttcttgct aagtcttacc 27660
atgtacctgc tttggcaatc attgcaactc tgagattata aaatgcctta gagaatatac 27720
taactaataa gatctttttt tcagaaacag aaaatagttc cttgagtact tccttcttgc 27780
atttctgcct atgtttttga agttgttgct gtttgcctgc aataggctat aaggaatagc 27840
aggagaaatt ttactgaagt gctgttttcc taggtgctac tttggcagag ctaagttatc 27900
ttttgttttc ttaatgcgtt tggaccattt tgctggctat aaaataactg attaatataa 27960
ttctaacaca atgttgacat tgtagttaca caaacacaaa taaatatttt atttaaaatt 28020
ctggaagtaa tataaaaggg aaaatatatt tataagaaag ggataaaggt aatagagccc 28080
ttctgccccc cacccaccaa atttacacaa caaaatgaca tgttcgaatg tgaaaggtca 28140
taatagcttt cccatcatga atcagaaaga tgtggacagc ttgatgtttt agacaaccac 28200
tgaactagat gactgttgta ctgtagctca gtcatttaaa aaatatataa atactacctt 28260
gtagtgtccc atactgtgtt ttttacatgg tagattctta tttaagtgct aactggttat 28320
tttctttggc tggtttattg tactgttata cagaatgtaa gttgtacagt gaaataagtt 28380
attaaagcat gtgtaaacat tgttatatat cttttctcct aaatggagaa ttttgaataa 28440
aatatatttg aaattttgcc tctttcagtt gttcattcag aaaaaaatac tatgatattt 28500
gaagactgat cagcttctgt tcagctgaca gtcatgctgg atctaaactt tttttaaaat 28560
taattttgtc ttttcaaaga aaaaatattt aaagaagctt tataatataa tcttatgtta 28620
aaaaaacttt ctgcttaact ctctggattt cattttgatt tttcaaatta tatattaata 28680
tttcaaatgt aaaatactat ttagataaat tgtttttaaa cattcttatt attataatat 28740
taatataacc taaactgaag ttattcatcc caggtatcta atacatgtat ccaaagtaaa 28800
aatccaagga atctgaacac tttcatctgc aaagctagga ataggtttga cattttcact 28860
ccaagaaaaa gttttttttt gaaaatagaa tagttgggat gagaggtttc tttaaaagaa 28920
gactaactga tcacattact atgattctca aagaagaaac caaaacttca tataatacta 28980
taaagtaaat ataaaatagt tccttctata gtatatttct ataatgctac agtttaaaca 29040
gatcactctt atataatact attttgattt tgatgtagaa ttgcacaaat tgatatttct 29100
cctatgatct gcagggtata gcttaaagta acaaaaacag tcaaccacct ccatttaaca 29160
cacagtaaca ctatgggact agttttatta cttccatttt acaaatgagg aaactaaagc 29220
ttaaagatgt gtaatacacc gcccaaggtc acacagctgg taaaggtgga tttcatccca 29280
gacagttaca gtcattgcca tgggcacagc tcctaactta gtaactccat gtaactggta 29340
ctcagtgtag ctgaattgaa aggagagtaa ggaagcaggt tttacaggtc tacttgcact 29400
attcagagcc cgagtgtgaa tccctgctgt gctgcttgga gaagttactt aacctatgca 29460
aggttcattt tgtaaatatt ggaaatggag tgataatacg tacttcacca gaggatttaa 29520
tgagacctta tacgatcctt agttcagtac ctgactagtg cttcataaat gctttttcat 29580
ccaatctgac aatctccagc ttgtaattgg ggcatttaga acatttaata tgattattgg 29640
catggtaggt taaagctgtc atcttgctgt tttctatttg ttctttttgt tttctcctta 29700
cttttggatt tttttattct actatgtctt ttctattgtc ttattaacta tactctttga 29760
tttattttag tggttgtttt agggttatac ctctttctaa tttaccagtt tataaccagt 29820
ttatatacta cttgacatat agcttaagaa acttactgtt gttgtctttt tgctgttatg 29880
gtcttaacgt ttttatttct acaaacatta taaactccac actttattgt tttttaattt 29940
tacttataca gtcaattatc ttttaaagat atttaaatat aaacattcaa aacaccccaa 30000
t 30001
<210> 3
<211> 1031
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
attcccggga tacgtaacct acggtgtccc gctaggaaag agaggtgcgt caaacagcga 60
caagttccgc ccacgtaaaa gatgacgctt ggtgtgtcag ccgtccctgc tgcccggttg 120
cttctctttt gggggcgggg tctagcaaga gcaggtgtgg gtttaggaga tatctccgga 180
gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc accgccatct 240
ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt agcagctact 300
tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc tccaaagaca 360
gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac tctaaatgga 420
gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt cttgtctgaa 480
aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga tcgcagcaca 540
tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc acttcataga 600
gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat gcataaggaa 660
agacaagaaa aatgtccaga agattatctt agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg 720
tcagagtatt attccaatgc ttactggaga agtgattcct gtaatggaaa ctgctttcct 780
ctatgaaatt cccccgggtt cctggaggaa atagatatag gctgatacag ttacccaatg 840
atggatgaat attgggggac cgcctggtca ttgaaaggct ttcttttctc caggaaagaa 900
atttttttcc ttttccataa aaagcttggg aatggaagac aacaattccc attctttttt 960
tgcgttccac ccctatgtga caacagaaat ttttggggaa acaacaacga aaaaatttta 1020
tcccgcgcgc a 1031
<210> 4
<211> 3244
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag 60
tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtgatg tcgactcttt 120
gcccaccgcc atctccagct gttgccaaga cagagattgc tttaagtggc aaatcacctt 180
tattagcagc tacttttgct tactgggaca atattcttgg tcctagagta aggcacattt 240
gggctccaaa gacagaacag gtacttctca gtgatggaga aataactttt cttgccaacc 300
acactctaaa tggagaaatc cttcgaaatg cagagagtgg tgctatagat gtaaagtttt 360
ttgtcttgtc tgaaaaggga gtgattattg tttcattaat ctttgatgga aactggaatg 420
gggatcgcag cacatatgga ctatcaatta tacttccaca gacagaactt agtttctacc 480
tcccacttca tagagtgtgt gttgatagat taacacatat aatccggaaa ggaagaatat 540
ggatgcataa ggaaagacaa gaaaatgtcc agaagattat cttagaaggc acagagagaa 600
tggaagatca gggtcagagt attattccaa tgcttactgg agaagtgatt cctgtaatgg 660
aactgctttc atctatgaaa tcacacagtg ttcctgaaga aatagatata gctgatacag 720
tactcaatga tgatgatatt ggtgacagct gtcatgaagg ctttcttctc aatgccatca 780
gctcacactt gcaaacctgt ggctgttccg ttgtagtagg tagcagtgca gagaaagtaa 840
ataagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa tgctccaggt 900
tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa ggcctgctaa 960
aggattcaac tggaagcttt gtgctgcctt tccggcaagt catgtatgct ccatatccca 1020
ccacacacat agatgtggat gtcaatactg tgaagcagat gccaccctgt catgaacata 1080
tttataatca gcgtagatac atgagatccg agctgacagc cttctggaga gccacttcag 1140
aagaagacat ggctcaggat acgatcatct acactgacga aagctttact cctgatttga 1200
atatttttca agatgtctta cacagagaca ctctagtgaa agccttcctg gatcaggtct 1260
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 1320
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgcag aagggaaaaa 1380
agccctttaa atctcttcgg aacctgaaga tagaccttga tttaacagca gagggcgatc 1440
ttaacataat aatggctctg gctgagaaaa ttaaaccagg cctacactct tttatctttg 1500
gaagaccttt ctacactagt gtgcaagaac gagatgttct aatgactttt taaatgtgta 1560
acttaataag cctattccat cacaatcatg atcgctggta aagtagctca gtggtgtggg 1620
gaaacgttcc cctggatcat actccagaat tctgctctca gcaattgcag ttaagtaagt 1680
tacactacag ttctcacaag agcctgtgag gggatgtcag gtgcatcatt acattgggtg 1740
tctcttttcc tagatttatg cttttgggat acagacctat gtttacaata taataaatat 1800
tattgctatc ttttaaagat ataataatag gatgtaaact tgaccacaac tactgttttt 1860
ttgaaataca tgattcatgg tttacatgtg tcaaggtgaa atctgagttg gcttttacag 1920
atagttgact ttctatcttt tggcattctt tggtgtgtag aattactgta atacttctgc 1980
aatcaactga aaactagagc ctttaaatga tttcaattcc acagaaagaa agtgagcttg 2040
aacataggat gagctttaga aagaaaattg atcaagcaga tgtttaattg gaattgatta 2100
ttagatccta ctttgtggat ttagtccctg ggattcagtc tgtagaaatg tctaatagtt 2160
ctctatagtc cttgttcctg gtgaaccaca gttagggtgt tttgtttatt ttattgttct 2220
tgctattgtt gatattctat gtagttgagc tctgtaaaag gaaattgtat tttatgtttt 2280
agtaattgtt gccaactttt taaattaatt ttcattattt ttgagccaaa ttgaaatgtg 2340
cacctcctgt gccttttttc tccttagaaa atctaattac ttggaacaag ttcagatttc 2400
actggtcagt cattttcatc ttgttttctt cttgctaagt cttaccatgt acctgctttg 2460
gcaatcattg caactctgag attataaaat gccttagaga atatactaac taataagatc 2520
tttttttcag aaacagaaaa tagttccttg agtacttcct tcttgcattt ctgcctatgt 2580
ttttgaagtt gttgctgttt gcctgcaata ggctataagg aatagcagga gaaattttac 2640
tgaagtgctg ttttcctagg tgctactttg gcagagctaa gttatctttt gttttcttaa 2700
tgcgtttgga ccattttgct ggctataaaa taactgatta atataattct aacacaatgt 2760
tgacattgta gttacacaaa cacaaataaa tattttattt aaaattctgg aagtaatata 2820
aaagggaaaa tatatttata agaaagggat aaaggtaata gagcccttct gccccccacc 2880
caccaaattt acacaacaaa atgacatgtt cgaatgtgaa aggtcataat agctttccca 2940
tcatgaatca gaaagatgtg gacagcttga tgttttagac aaccactgaa ctagatgact 3000
gttgtactgt agctcagtca tttaaaaaat atataaatac taccttgtag tgtcccatac 3060
tgtgtttttt acatggtaga ttcttattta agtgctaact ggttattttc tttggctggt 3120
ttattgtact gttatacaga atgtaagttg tacagtgaaa taagttatta aagcatgtgt 3180
aaacattgtt atatatcttt tctcctaaat ggagaatttt gaataaaata tatttgaaat 3240
tttg 3244
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (693)..(693)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (722)..(722)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60
taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag 120
agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag 180
cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca 240
tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300
ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg 360
ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag 420
agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt 480
gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg 540
tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca 600
ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc 660
tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc 720
tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g 761
<210> 6
<211> 1901
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120
agtgatgtcg actctttgcc caccgccatc tccagctgtt gccaagacag agattgcttt 180
aagtggcaaa tcacctttat tagcagctac ttttgcttac tgggacaata ttcttggtcc 240
tagagtaagg cacatttggg ctccaaagac agaacaggta cttctcagtg atggagaaat 300
aacttttctt gccaaccaca ctctaaatgg agaaatcctt cgaaatgcag agagtggtgc 360
tatagatgta aagttttttg tcttgtctga aaagggagtg attattgttt cattaatctt 420
tgatggaaac tggaatgggg atcgcagcac atatggacta tcaattatac ttccacagac 480
agaacttagt ttctacctcc cacttcatag agtgtgtgtt gatagattaa cacatataat 540
ccggaaagga agaatatgga tgcataagga aagacaagaa aatgtccaga agattatctt 600
agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg tcagagtatt attccaatgc ttactggaga 660
agtgattcct gtaatggaac tgctttcatc tatgaaatca cacagtgttc ctgaagaaat 720
agatatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagctgtc atgaaggctt 780
tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaagctggat gaagcagata ccatcttatg 840
ctcacctatg acaagatttg gaagaaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta 900
gggacattac gtatttgaac tgttgcttaa atttgtgtta tttttcactc attatatttc 960
tatatatatt tggtgttatt ccatttgcta tttaaagaaa ccgagtttcc atcccagaca 1020
agaaatcatg gccccttgct tgattctggt ttcttgtttt acttctcatt aaagctaaca 1080
gaatcctttc atattaagtt gtactgtaga tgaacttaag ttatttaggc gtagaacaaa 1140
attattcata tttatactga tctttttcca tccagcagtg gagtttagta cttaagagtt 1200
tgtgccctta aaccagactc cctggattaa tgctgtgtac ccgtgggcaa ggtgcctgaa 1260
ttctctatac acctatttcc tcatctgtaa aatggcaata atagtaatag tacctaatgt 1320
gtagggttgt tataagcatt gagtaagata aataatataa agcacttaga acagtgcctg 1380
gaacataaaa acacttaata atagctcata gctaacattt cctatttaca tttcttctag 1440
aaatagccag tatttgttga gtgcctacat gttagttcct ttactagttg ctttacatgt 1500
attatcttat attctgtttt aaagtttctt cacagttaca gattttcatg aaattttact 1560
tttaataaaa gagaagtaaa agtataaagt attcactttt atgttcacag tcttttcctt 1620
taggctcatg atggagtatc agaggcatga gtgtgtttaa cctaagagcc ttaatggctt 1680
gaatcagaag cactttagtc ctgtatctgt tcagtgtcag cctttcatac atcattttaa 1740
atcccatttg actttaagta agtcacttaa tctctctaca tgtcaatttc ttcagctata 1800
aaatgatggt atttcaataa ataaatacat taattaaatg atattatact gactaattgg 1860
gctgttttaa ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1901
<210> 7
<211> 562
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(166)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagagatatc tccggagcat ttggataatg 60
tgacagttgg aatgcagtga tgtcgactct ttgcccaccg ccatctccag ctgttgccaa 120
gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa gg 562
<210> 8
<211> 798
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
gggctctctt ttgggggcgg ggtctagcaa gagcagatat ctccggagca tttggataat 60
gtgacagttg gaatgcagtg atgtcgactc tttgcccacc gccatctcca gctgttgcca 120
agacagagat tgctttaagt ggcaaatcac ctttattagc agctactttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa ggcacagaga gaatggaaga tcagggtcag agtattattc 600
caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg aaatcacaca 660
gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat atttggtgac 720
agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa aagctgggat 780
gaagccagat tcccatct 798
<210> 9
<211> 169
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct 60
gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt 120
ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc 169
<210> 10
<211> 176
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga 60
gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120
agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176
<210> 11
<211> 30001
<212> DNA
<213> macaca mulatta
<220>
<221> misc_feature
<222> (26113)..(26155)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (28797)..(29186)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
aatctctaag caattttttg gggaagaaag aattgcaatt agggcatacg tgtagatcag 60
atggtcttcg gtatatccaa cgacaaagaa aaggtgggag gtttcgttaa aaaagagaaa 120
tgttacatag tacttttaga gaaaattcac tggcactatt aagggtctga ggagctggta 180
agtttcaatt ggtgagtgat ggtggtagat aaaattagag ctgcagcagg tcatttcagc 240
aactatcaga taaaactggt ctcaggtcac aacgggcagt ttcagcagct agacttgaaa 300
gaattacact gcgggagcaa tgtcatttgt cctgcatgct tttctacccc ctacccccac 360
ttttttagtt gggtataaca agaacgaccc aaattgtatg atcaactttc acaaagcata 420
gaacagtagg aaaagggtct gtttctgcag aagatgtaga cgttgagagc cattttatgt 480
atttatttct ccctttcttc atcggtgaat gattaaaatg ttctgtatga tttttagtga 540
tgagaaaggt taaacgccac tcatctgtag taagtgtaat ctacacactt gcagaccaaa 600
aggcataagg tttaaaaaac ctttgttttt ttacacatca aacagagtgg tataaatgct 660
actcatctgt agtaagtgaa atctatacac ctgcagacca acgacgcaag gtttcaaaaa 720
tctttgtgtt ttttacacat caaacagaat ggtacatttt tcaaaagttt aaaaaaaaaa 780
aaaatccaca tatcacaact agcaaaaatg acattcccca gtgtgaaaat catgcttgag 840
agaattctta catgtaaagg caaaattgca gtgactttac aagggacctg gggattcccg 900
cccacagtgt ggagctgtcc cctaccaggg tttgcggcgg agttttgaat gtacttaaca 960
gtgtctcacg gtaaaaacaa aacttcatcc accaaatatt tgttgagcgc ccactgcctg 1020
ccaagcacaa acaaaaccat tcaaaaccac gaaatcgtct gcactttctc cggatccagc 1080
agcctctgcg attaaggttt gcacacgcta ttgcgccaac gctcctccag agcgcgtctt 1140
aagataaaag aatgggacaa gttgcccctc cccctttcac gggcctcgtg cgtcaacgtc 1200
atcgcatata gaaaacacac agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagaggcgcg 1260
tcaaacagcg acaagttccg cccacgtaaa agatgacgct tggtgcgtca gccgtccctg 1320
ctgcccggtt ccttctctct gggggcgggg cctggctaga gcaggtgtgg gtttaggagg 1380
tgtgtgtttt tgtttttcct accctctccc ctctacttgc tctcacagta ctcgctgagg 1440
gtgaacaaga aaagacctga taaagattaa ccagaagaaa acaaagaggg aaacaactgc 1500
agcctgtagc gggctctgga gcttaagaga ggcgcgctag gcgccgggcc gtgggcgtgg 1560
tcggggcggg gtcgggccag gggcggggct gcggttgcgg tccctgcgcc cgcggcggcg 1620
gcggcggcgg cagcggaggc gcaggcggtg gcgagtgggt gagtgaagag gcggcgtcct 1680
ggcgggtgtc tgtttggcgt ccggttgccg ggaagagacg cgggtagcag ccggggctct 1740
cctcagagct cgacacattt ttactttccc tctcgtttct ctgaccgaag tcgggtgtcc 1800
ggctttcgcc tctagcgact ggtggaattg cctgcatctg ggccccgggc ttcgcggcgg 1860
cgcagggacg agggatggga atctggcctc ttcctcgctt tcccgcccgc agtgcgctgc 1920
cccagctgtc tccttcccgg ggacctgctg ggagcgctgc cgctacagac tcgagagaaa 1980
ggagcctcgg gcactgagag gcctcgcccg ggggaaggcc ggagggcggg cggcgggcgg 2040
cgagcggctc ctgcggacca agtctgggtt ctctgggaac ccgagacggt ccctgatggc 2100
gaggagatca tgcggggtgc tatgggggtg tggagacgtc tgcagaattt tagcccaagc 2160
ttctaaggag tgctgatgac ttgcatatga gggcagcaat gccagtcggt gtactcccta 2220
ttctgtggga catgatgtgg ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg 2280
aagtgaccat tgtgacttgg gcatcacttg actgatggta atcagttgca gacagaagtg 2340
cacagattac atgtctgtgt ccacactgga tcagtctggc cacgaggaac accacaggct 2400
ttgtattgag aaacaggagg gaggtcctgc actttcccag gaggggtggc cctttcagat 2460
gcaatcgaga ttgttaggct ctggtagagt ggttgcctgg ttgtggcagt tggcaaattc 2520
ctattcaaac tgttgccgtg cgtcaccagt taacaacaag ggtacacgat ctgtctggca 2580
ttacttctac tttgtacaaa ggatcaaaaa tactgttaga tatgattttt ctcagacttt 2640
gggaaacttt taacgtaatc tgtgaatatc acagaagcaa gactgtcata tagaggatat 2700
taataacctg gagtcagaat acttgaaata tggtgtcatt tgacacgggc tctgttatca 2760
ccacctttgc caagcccttt cacttgagga aaaccctcaa tcagttggaa actgcctcat 2820
gctgacagta catctgaaac aaaaacgaga gtagttacca cattccagat tgttcactaa 2880
ggcagcattt atctgctcca ggaaaacatt acaagcaact tatgaagttg ataaaatatt 2940
ttgtttggct atgttggtac tccaaaagtt gctttcagag aaacaaagta aaccaaggag 3000
gacttctgtt gttcacgtct gcccttgggc tctattctac gttaattagg tagttcccag 3060
gaggactaga ttagcctacc tattgtctga gaaacttgga tctgtgagaa atggccagat 3120
agtgatacga acttcacctc ccagtctttc ctgatgttta agattgagaa agtgttgtga 3180
actttctggt gctgtaagca gttcactgtc cttaaagtgg tcctgggcag ctcctgttgt 3240
ggaaagtgga ccgatttagg attctgcttg gctttggact gggagaaaat aaactgcatg 3300
gttacaagta ttgagagcca agttggagaa ggtggcttac acctataatg ccagagcctt 3360
aggaggcagg ggcaagagga tcactggaag tcaggagttc aagcccaacc tgggcagcct 3420
agaccctgtc tctacaaaaa attaaaaact tagccgggcg cggtggtgtg cacctgtagt 3480
cctagctact tgggaggctg aggcaggagg gtcttttgag cccaggagtt tgaagttaca 3540
gggagctatg atcctgccag tgcactccag cctggatggc aaaacgagac cctgtctcta 3600
aaaaacaaga agtgagggct ttatgatcgt agaaattttg cttacaatag cagtggacca 3660
accacctttc taaataccaa tcagggaaga catagttgat ttttaacaaa catttaaaga 3720
aaaagcaaaa cctcaaactt agcactctac taacagtttt agccgatgct aattaaggta 3780
atcatgtctg catatatggg attactttca gaaagtgtat tgggaaacct ctcatgaacc 3840
ctgtgcaacc ctgagcaagc caccgtctca ctcagtttga atcttggctt ccctcaaaag 3900
actctgtggc taatgtttgg taactctctg gagtagccag cactgcatgt acataggata 3960
ggtacataaa acaattattg gttttgagct gatttttttc agctgcattt gcgtgtatgg 4020
atttttctca ccaaagacaa tgacttcaag tgttaataaa ataattgtac agctctccta 4080
attatacttc tctgtaacat ttcatttctc agactatttc ttttggtagg atttaaaact 4140
aaacaattca gtatgatctt tgttcttcat tttctttctt attctttttt ttttcgagac 4200
agagtctccc tctgttgtgc catctcagcc cattgcaacc tccgccacct gggttcaagt 4260
gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gtgcccgcca ccacacctac 4320
ctaatttttt gtatttttag tagaggcggg gtttcaccat gttggctagg ctggtcttaa 4380
actcctgacc tcagatgatc cacctgcctc ggcctcccaa agagctggga tgataggcgt 4440
gacccaccat gcccgcccca ttttttttct tattctgtta ggagtgagag tgtaactagc 4500
agtctataat agttcaattt tcacaacgtg gtaaaaattt tccctgtaat tcaacgagat 4560
tttgcttcag ggctcagttc tgttttagga aatactttta ttttcagttt gatgatgaaa 4620
tattagagtt gtgatattgc ctttatgatt acctaccttt ttaacctaaa agaatgaaag 4680
aaaaatatgt ttacagtata attgtatggt tgcgtgttaa cttaattcat tatgttggcc 4740
tccagtttgc tgttgttcgt tatgacagca gtagtgtcat taccatttca attcagatta 4800
cattcctgta tttgatcatt gtaaactgat tgcttaaatt gtattaaaaa cagtggatat 4860
tttaaacaag ctgtactgct tatatccagt gctgtctcct aagactatta aattgatata 4920
acatatttaa aagtaaatat ttcctaaatg aatttttgaa attaaaaata cacgtgttaa 4980
aactgtcttt gtgttcaacc atttctgtac gtacttagag ttaactgttt tgccaggctc 5040
tgtatgccta ctcataatgt gataaaagca ctcatctaat gctctataaa tagaagtcag 5100
tgctttccat cagactgaac actcttggca agatgtggat aaaattattt aagtaaaatt 5160
gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc caaagcaatc atatggcaaa 5220
gataggcata tcataatttg cctattagct gctttgtatt gctattatga tagatttcac 5280
agttttagat ctgcttagat gaaaatgtaa ttctttttac tgtcagtctt agatataagt 5340
cttcaattat agtacagtca cacattgctt aggaatgcat cattaggcga ttttgtcatt 5400
atgcaaacat catagagtat acttacataa acctatatag tacagccttt acgtacgtag 5460
gccatatggt atagtctatt gctcctaggc tacaaatctg tacagctgtt actgtactga 5520
atactataga cagttgtaac acagtggtat ttatttatct aaatatatcc aaacatagaa 5580
aaggtacagt taaagtatgg tataaaaaat aatgatatac ctatataggc cacttaccgt 5640
gaatggagct tgcaggacta gaagttgctc tgggtgagtc agtaagtaag tggtgaatga 5700
atgtgaaggc ctagaacatt actgtacaca ctgtagactt tataaacaca gtatgcttaa 5760
gctacaccaa atttatcttt acagtttttc ttcaataaaa aattaatgtg aacctactat 5820
aactttttaa ctttgtaaac tttttaattt tttaactttt aaaatactta gcttgaaaca 5880
caaacacgca tagctataca aaaatatttt ttctttatat ccttattcta gaagcttttt 5940
cctattttta actttttttt ttttacttgt tagtcgtttt tgttaaaaac taaaacacac 6000
acactttcac ctaagcatag acaggattag gatcatcagt ttcactccct tccacctcac 6060
tgccttccac ctccacatct tgtcccactg gaacgttttt agggggaata acacacatgt 6120
agctgtcacc tgctatgata acagtgcttt ctgttgaata cctcctgaag gacctgcctg 6180
aggctgtttt acatttaact taaaaaaaaa aataagtaga aggagtacac tctaaaataa 6240
caataaaagg tatagtctag tgaatacata aaccagcaac atagtagttt attatcaagt 6300
gttgtatact gtaataattg tatgtgctat actttaaatg acttgaaaaa ttgtactaag 6360
accttatgat ggttacagtg tcactaaggc gatagcatat tttcaggtcc attgtaatct 6420
aatgggacca ccatcatata tgcagtccac cattgactga aatgttacat ggtacgtaac 6480
tgtatttgca agaatgattt gttttacatt aatatcacat aggatgtacc tttttagagt 6540
gatatgttta tgtggattaa gatgtacaag tggagcaagg ggacaagagc ccttggttct 6600
gtcttggatg tgagctttta tgctcttctc atcatgtctg ttttcttatt aaattcaaag 6660
gcttggacag gccctattta gcccttgttt tctatgtgtt ctaaataact aaagctttta 6720
aattctagcc atttagtgga gaactctctt tgcaatggta aaatgctgta ttggtttctt 6780
gactagcata ttaaatatat ttatctttgt cttgatattt caatgtcatt ttaaacatca 6840
ggattgggct ttagtattct catacccaga gagttcactg aggatacagg actgtttgcc 6900
cattttttgt tatggctcca gacttgtggt atttcgatgt cttttttttt tttttttttt 6960
tttaaccttt tagcagcttt aaagtatttc tgttgttagg tgttgtatta cttttctaag 7020
attactgtaa caaagcacca caaactgagt ggctttaaac aacagcaatt tattctctca 7080
caattctaga agctagaagt ccgaaatgga agtgttgatg gggcatgatc ctcaaaagag 7140
agaagactct ttccttgcct cttcctggct tctggtggtt accagcaatc ctgagcgttc 7200
ctttcttgct tcgtagtttc agcagtccag tatctgcctt ttgtcttcac atggatgtct 7260
accccttgtc tctgtgtctc cagatctctc tccttataaa cacagaagtt actggattag 7320
gccccactct aatccagtat gaccccattt taacacgatt acacctattt ctaaataagg 7380
tcacattcac atataccaag ggttaggaat tgagcatatc ttttgcaggg acacaattca 7440
acccacaagt gtcagtctct agctgagcct ttcccttcct ggttttctcc tttttagttg 7500
ctgtgggtta ggggccaaat ctccagtcat actagacttg cacatggact ggagatttgg 7560
gaatactgcg ggtctattct atgagcttta gtatgtaaca tttaatatca gtgtaaagaa 7620
gccatttttt cagttcacta tttctttgaa tttcttaatg tatgccctga atataagtaa 7680
caagttacta tgtctcataa aatgatcata tcaacaaaca tttaatgtgc acctactgtg 7740
ctagttgaat gtctttatcc tgataggaga taacaggctt ccgcatcttt gacttaagag 7800
gacaaaccaa gtatgtctga atcatttggg gttttgatgg atatctttaa attgctgaac 7860
ctaatcattg gttttatatg tcattgttta gatatctcag gagcatttgg ataatgtgac 7920
agttggaatg cagtgatgtc gactctttgc ccaccgccat ctccagctgt tgccaagaca 7980
gagattgctt taagtggtga atcaccttta ttagcagcta cttttgctta ctgggacaat 8040
attcttggtc ctagagtaag gcacatttgg gctccaaaga cagaacaggt acttctcagt 8100
gatggagaaa taacttttct tgccaaccac actctaaatg gagaaatcct tcgaaatgca 8160
gagagtggtg ctatagatgt aaagtttttt gtcttgtctg aaaagggagt gattattgtt 8220
tcattaatct ttgatggaaa ctggaatggg gatcgcagca catacggact atcaattata 8280
cttccacaga cagaacttag tttctacctc ccacttcata gagtgtgtgt tgatagatta 8340
acacatataa tccggaaagg aagaatatgg atgcataagg taagtgattt ttcagcttat 8400
taatcatgtt aacctatctt ttgaaagctt attttctgat acatataaat cttattttta 8460
aattatatgc agtgaacatc aaacaataga tattatttat tttgcattta tcctgttaga 8520
tacaaataca tctggtctga tgcctgtcat cttcatatta actgtggaag gtaggaaatg 8580
gtagctccac attacagatg aaaagctaaa gcttaaacaa atgcagaaac ttttagatcc 8640
tggattcttc ttgggagcct ttgactctaa taccttttgt ttccctttca ttgcacaatc 8700
ctgtctttcg cttactacta tgtgtaagta taacagttca aaaaaatagt ttcataagct 8760
gttggttatg tagcctttgg tctctttaac ctctttgcca agttcccagg ttcataaaat 8820
gaggaggttg aaccgcatgg ttcccaagag aattcctttt aattttacag aaattattgt 8880
tttccccgaa gtcctatagt tcaatatata atgatattta catttcagta tagttttggc 8940
atatctaaag aacacattaa gttctccttc ctgtgttcca gtttgatact aacctggaag 9000
tccattaagc attaccaatt ttaaaaggct tttgcccaat agtaaggaaa aataatatct 9060
tttaaaagaa taatttttta ctatgtttgc aggcttactt ccttttttct cacattatga 9120
aactcttaaa atcaggagaa tcttttaaac atcataatgt ttaatttgaa aagtgcaagt 9180
cattcttttc ctttttgaaa ctatgcagat gttacattga ctattttctg tgaagttatc 9240
ttttttttcc ctgcagaata aagggtgttt tgattttatt ttgtgttgtt tataagaaca 9300
tacattcgtt gggttaattt cctgcccctg cccccgtttt ttccctaaag tagaaagtat 9360
ttttcttgtg aactaaatta ctacacaaga acatgtctat tgaaaaataa gtatcaaaat 9420
gttgtgggtt gtttttttaa ataaattctt tcttgctcag gaaagacaag aaaatgtcca 9480
gaagattatc ttagaaggca cagagagaat ggaagatcag gtatatgcag attgcatact 9540
gtcaaatatt attctcatgg catgtatctg tgtaaagttg atggctacat ttgtgaaggc 9600
cttggggaca tacagagtaa gccttaatgg agcttttatg gaggtgtaca gaataaacta 9660
gaggaagatt tccatatctt agacctgaag agttaaatca gtaaacaaag gaaaatagta 9720
attgcatcta caaattaata tttgctccct ttttttttct gtttgaacag aataaatttt 9780
ggataacttg ttactagtaa aaaatttaaa aattgtctgt gatatgttct ttaaggtact 9840
acttctcgaa ctttttccta gaagtagctg taacaggagg agagcatatg tacccctaag 9900
gtatctgggg tataggccca tgtccaaaca atatttcttt taagtcttgt gttgtatctt 9960
taagactcat gcaatttaca ttttattcca tgatataact attttaatat taaaatttgt 10020
cagtgatatt tcttaccctc tcctctagga aaatgtgcca tgtttatact ttggctttga 10080
gtgcccctga ggaacagaca ctagagtttg agaagcatgg ttacacaggc gtggcttccc 10140
ctgcagaaat taagtacaga ctatttcagt gtaaagcaga gaagttcttt tgaaggggaa 10200
tctccagtga agaaagggtt cttcactttt acttccattt cctcttgagg gtgaccctca 10260
ttgctccttg taaaactccg atattttaaa catggctgtt ttgctttcct ctggttcttt 10320
ttaacatgag tgagacagat gatactttaa aaagtaattt taaaaaaaag tgttaaaata 10380
tatggccata atgcagaacc ctatgctgtg atctccttta ccaaattgtt gtgtttgtac 10440
ttttgtagat agctttccag tccagagaca gttattctgt gtaaaggtct gactcaacaa 10500
gaaaagattt ccctttaccc aaagaatgcc agtctttatt tgctggtcaa taagcagggt 10560
ccccaggaaa ggggtaactt tcaccaccct ctaacccact ggttattagt aaactaatta 10620
agtagactta tctcaagatg aggaaactta aaaccaagta aaattctgct tttactggga 10680
ttttattttt tgaaaccaga aacgtttact taagttgact actattaatg aattttggtc 10740
tctcttttaa gtactcttct taaaaatgtt atcctactgc tgagaagttc aagtttgaga 10800
agtacaagga ggaatagaaa cttgagagat tttctttttc ttttagagcc tcttctgtat 10860
ttagccctgt aggaattttt tttttccccc aagattcttc ttcgtgaaaa ggaggagttg 10920
ccttttgatt gagttcttgc aaatctcaca acgactttat tttgaacaat actgtttggg 10980
gatgatgcat gagtctgaaa caacttcagt tgtagctgtc atctgataaa attgcttcac 11040
agggaaggaa atttagcacg gatctagtca ttattcttgt tagattgaat gtgttaatca 11100
taattgtaaa caggcatgat aattattact ttaaaaactg aaaacagtga atagttagtt 11160
gtggaggtta ctaaagcatg atttttttaa aataaaactt tcagcatttt gcaaatatgc 11220
atatggttta ggatagaact tccagaggta gcatcacatt taaattctca agcaacttag 11280
taatacgagg ctctgaaaaa ctggttaaag ttactccaga aatggccctg ggtctgacag 11340
acattctaac ttaaagatgc atatgaagac tttgaataaa atcatttcat atgaagacat 11400
tgaataaaat catttcataa aataagtgag gaaaaacaac tactattgaa ttcatcttaa 11460
tgtatgattt taaaaatatg tttagctaaa aattcataga catttgacaa tttcgtttat 11520
atctcaaaaa gttgacttac ccaagttgat cacaaaactg atgagactgg tggtggtagt 11580
gaataaatga gggaccaccc atatttgaga cactttacat ttgtgatgtg ttatactgaa 11640
ttttcagttt gattctataa actaccaatt tcaaaattac aatttcaagg tgtaataagt 11700
agtggtatta tcttgaaata ggtctaaagg gaacttttct gttttaaaat attcttaaac 11760
tatatgtgct gattttgatt tgcatttggg tagattatac tcttatgaat cggggggctg 11820
ggtattgatt caggttttcc ttacctattt ggtaaggatt tcaaagtctt tttgtgcttg 11880
attttcctcg tttttaaata tgaaacatat tgatgacttt taattaacaa atgtttttat 11940
ctcgaataaa ttttaaagga gatcttttct aaaagaggta tgatgactta attattgcat 12000
ataacaataa atgagaaacc agtgattcca tactctctaa agaataaaag tgagctttag 12060
gcccaggcat ggtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt ggaaggccga ggcaggcgga 12120
tcacctgagg tcaggaattc gacaccagcc tggccaaatg gcaaaaccct gtctctacta 12180
caaatacaaa aattagctgg gcatggtggc agcccctata gtcccagcta cttggaagac 12240
tgagacagga gagtcactcg aacccgagag gcagaggttg cagtaagctg aaatcacacc 12300
attgcactcc agcctgggca acaagagcaa aactccgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 12360
aaaaagaata aaagtgagct ttggattgcg tataaatcct ttagacaagt agtagacttg 12420
tttgatactg tgtttgaaca aattacaaag tattttcatc aaagaatgtt attgtttgct 12480
gttattttta ttttttattg cccagcttct ctcatattca ttatgtgatt ttcttcactt 12540
catgttactt tattgtgcag ggtcagagta ttattccaat gcttactgga gaagtgattc 12600
ctgtaatgga actgctttca tctatgaaat cacacagtgt tcctgaagaa atagatgtaa 12660
gtttttatat ttttaaatga gagcaattat accctttatc agttttttgg ggttatatta 12720
ttattatgta tattattaat attctaattt taatactaag cacttcgtcg tacgtactat 12780
ccacatgcag tattagccac ttgaacagat aagcacacac aaaatcctgg attttatggc 12840
ataacagagg catttttgat cagtgatgac aaaactaaat ttattttgtt tatttcacta 12900
cttttataat tcctaaaagt gggaggatcc cagctcttat aggagcaatt aatatttaat 12960
gcagtacctt ttgaaacaaa actgtgtgcc aaagcagtaa ccattaatgg aagttgactt 13020
atagtcacaa atttagtttc cttaatcatt tgttgaggat gttttgaatc acacactatg 13080
agtgttaaga gatatcttta ggacactatt cttgttgttt tattgtcatt taggttagtc 13140
tcctgtctga cagctcagaa gaggaagttg ttcttgtaaa aattgtttac acaacctgat 13200
tgaccagctt tcacatttgt tcttctgaaa gctgatggta gtgcacagat tgttttatgg 13260
ggagtcttga ttctcagaaa tgaaggcagt gtgttatatt gaatccagac ttcagaaaac 13320
ttgtatatta aaagtgtttt ttcaacacta tgttatagcc agactaattt ttttattttt 13380
ttgatgcatt ttagatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagttgtc 13440
atgaaggctt tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaacctggat gaagcatatg 13500
ttcacctatg acaagatttg gaaggaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta 13560
gggacaacat tgcatatttg aattgttgct taaatttgtg ttatttttca ttcgttatat 13620
ttctataata tatttgatgt tattccattt gctatttaaa gaaactgagt ttccatattt 13680
cccagacaag aaatcatggc cccttgcttg attctggttt cttgttttac ttctcattaa 13740
agctaaaaga accctttcaa attaagttgt actgtagatg aacttaagtt atttaggcct 13800
agaaaaaaaa aattcatatt tatactgatc tttttccatc cagcagtgga gtttagtact 13860
taagagtttg tgcccttaaa ccagactccc tgggttaatg ctgtgtacct gtgggcaagg 13920
tccctgaatt ctctatacac ctatttcctc atctgtaaaa tggcaataat aataatagta 13980
cctaatgtat agagttgtta taagcattga gtaagataaa taatataaag cacttagaac 14040
agtgcctgga acataagaac acttaataat agctaacatt ttctatttac atttcttcta 14100
aggaaaaggt taacagaaat agccaatatt tgttcagtgc ctacatgtta gttcctatac 14160
taagtgcttt acatgtatta tcttatattc tattttaatg tttcttcaca gttgcagatt 14220
atcatgaaat tttatttttt aaaaaagaga agtaaaagga taaagtattc acttttatgt 14280
ccacagtctt ttcctttagg ctcatgatgg agtatcagag gcatgaatgt gtttaaccta 14340
agagccttaa tggcttgaat cagaagcact ttagtcctgt atctgttcag tgtcagcctt 14400
tcaaacatca ttttaaatcc catttgactt taagtaaatc acttaatctc tctacatgtc 14460
aatttcttca gctataaaat gatggtattt caataaataa atacattaat taaatgatat 14520
tttacaaact aattgggctg ttttaaggct caataagaaa atttctgtga aaggtctcta 14580
gcaaatgtag ggttctatac aaataaaaga taacattatg cttatatctt cggtgtttat 14640
catgcaaagc tcttctgagt tttttgaaga gctcacctac tattttttgt ttttagtttg 14700
ttaaattgtt ttataggcaa tgtttttaat ctgttttctt taacttacag tgccatcagc 14760
tcacacttgc aaacctgtgg ctgttccgtt gtagtaggta gcagtgcaga gaaagtaaat 14820
aaggtagttt attttataat ctagcaaatg atttgactct ttaagactga tgatatatca 14880
tggattgtca tttaaatggt aggttgcaat taaaatgatc taatagtata aggaggcaat 14940
gtaatctcat cgaattgctg agacaacttg tggcaacagt gagtttgaaa taaagtgaat 15000
aggagtcatt tatcagttta ttttgataac ttgtaaatac cagtgtcaga tgtgtataaa 15060
tggttttgag aatatattaa aatcaggtat ttaaaaaaac actattcttc tatttcccaa 15120
tgtaatcttt aacaaatctg aaggtagtca tgtactttcg gtactagttc tgaagaaatg 15180
ttatttgttt attcatcttg atttcattgt cttggctttc cttctaaatc tatcccttct 15240
tgggagctat tgggattaag tggtcattga tgattatact ttattcagta atgtttctga 15300
ccctttcctt cagtgctact tgagttaata aaggattaat gaacagttac atttccaagc 15360
attagctaat aaactaaagg attttgcact tttcttcact gaccattagt taaaaacagt 15420
tcagagataa gtacatgtat ctttcaattc tagcaaacct aattttttaa aagaagtttt 15480
acataggaaa tatgttggaa atgattattt actttacaaa gatattcata atttattttt 15540
tctgtaacta gctactttgt atatttacat gagccttaat ttatcaaaat tatatttctc 15600
atataaccat ttatgagagc ttagtattcc tctgtcatta tattgcgtct acggactagt 15660
gatcttacta cttctgttac ctcgaacaag tggcttcccg tctgtgacct ccaaagccgt 15720
aggttccaca gagtgactgc tgagctgctt tatgaaggga gaaaggctcc atagttgggt 15780
ttttggtttt gcttttgttt ttgtttttaa catttttcct atcctccatc ctcttgaggc 15840
agagtagctt accttttatc ttgttttaat ttgagaaaga agttgccact gctctagatt 15900
gaaaaccact gctttaacat aataactctg aatatggttt gaatttcaag atagtgacat 15960
gcctttttat ttttactaat agagctgtag gtcgaatatt attagatttc taaaccccac 16020
ccaatgacct ccttatttta aatcaaattt aataattaat tatcttctta ttggaggatc 16080
tggacattct ttgatgtttc ttacaatgaa tttcacatgt agacccacta aacagaagtt 16140
ataaaggttc catggtcaaa taagtctgag aaagtctgca tattatataa ttcacctaaa 16200
gagtcacagt atgtacccaa atgttaaagg ttttgagatg ccatacagta aatttaccaa 16260
gcattttcta aatttatttg accacagaat ccctatttta agcaacaact gttatatccc 16320
ataggttcca ggtgactaaa gaatacttat tgcttaggat atgttttatt gataataaca 16380
attaaaatgt cagatatctt tcataagcag atcagtggtc tttttaaaac tttgtatttt 16440
aatgctaaaa tcttttcttt tgtagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactgcagc 16500
agagagaaaa tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct 16560
ctttgtacag ggcctgctaa aggtatagtt tctacttatc acaagggaaa ccaattttct 16620
aaaatcattt ttgagactct ttgtagacaa atattaaata ttagcattta atgtatctca 16680
tattgacatg cccagtgact gacttccttt gcacagttct gcgcatagac tatatgtctt 16740
atggatttat agttagtatc atcagtgtaa caccatagaa taccctttgt tttccaggtg 16800
ggtccctgta cctacatgtc tagcatcagg tgttgttttt tttttttttt tttaaaacat 16860
atgcttaaat caggttgcac atctaaaata agatcatttc tttttaacta aatagatttg 16920
aattttattg aaaaaaattt taaaacatct ttaagaagca tataggattt aagcagttac 16980
tatgtatgtg tactaaaata tatatatatt cctaaatata tattcctata tataatatat 17040
gtatttctat atataatata tattagaaaa aacttagagt tttctttcat ttgagtctac 17100
tgttcaagga gcaaaacaga gaaatgtaaa ttagcaatta tttacaataa ttaaagggaa 17160
gaaagttgtt caccttgttg gatctattat tgttgtttta attatagtcc caagacgtga 17220
agaaatagct ttcctaatgg ttatgtgatt gtctcatagt gactactttc ttgaggatgt 17280
agccacagca aaatgaaatt taaaaaattt aaaaattgtt gcaaataaaa gttatattag 17340
gcttttgtgc aatttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata 17400
gaaactagtt aaaggaaaca cagtttctat ttgagttata caaatctgta aattagaact 17460
tctcctgtta aggcattata aagtgcttaa tacttttgtt tcctcagcac cctctcattt 17520
aattatataa ttttagctct gaaagggacc tataccagat gtgtagagga aatttcaaaa 17580
ctatgatcta atgaaaaaat atttaatagt tctccatgca aatacaaatt atatagtttt 17640
ctggaaaata cctttgacat tatacaaaga tgattatcac agcattataa tagtgaaaaa 17700
atggaaatag cctctttctt ctgttctgtt cacagcatat ggcacagtac ctcatatgca 17760
gtaggttatt atgacctggt aactggctcc cccaactgat taggaaagaa gtaaatttgt 17820
tatttataaa aatacgtgtt cattgagatg catagaataa ttaagaaatt aaaagacact 17880
tgtaatttca aatccagtga atacccactg ttaatatttg gcatatctct ttctagtctt 17940
tttttccctt ttgcatgtat tttctttaag actcccaccc ccactggatc atctctgcat 18000
attctaatct gcttttttca cagcagattc taagcctttt tgcatatcaa cacaaacttc 18060
aacaacttca tctttagatg ctaaataatg aattcatttt tatttactta accactttct 18120
ttggatgctc aggttattct gatgttttgc cattaaaacc aatgctatac tgaacacttc 18180
tgtcactaaa acttgaacac actcatgaat aatttcttag gataaatttt tagagatgga 18240
tttgctaaat caaagaccat tttttaaaaa ttgaaaaaca attatatcgt ttggcatgta 18300
agacagtaca ttttcctttt attttgacag gattcaactg gaagctttgt gctgcctttc 18360
cggcaagtca tgtatgctcc atatcccacc acacacatag atgtggatgt caatactgtg 18420
aagcagatgc caccctgtca tgaacatatt tataatcagc gtagatacat gagatccgag 18480
ctgacagcct tctggagagc cacttcagaa gaagacatgg ctcaggatac gatcatctac 18540
actgacgaaa gctttactcc tgatttgtac gtaatgctct gcgtgctggt actgtagtca 18600
agcaatatga aactgtgtct tttatgaata aaaacaaaac agaagttgca ttcaaaaaga 18660
aagaaatatt actagcagaa ttatgcttga agaaacattt aatcaagcat ttttttctta 18720
aatgttcttc tttttccata cgattgtgtt taccctaaaa taagtaagat taacccttaa 18780
agtgaatatt taactatttg tttaataaat atatattgag ctcctaagca ctgttctagg 18840
tactgggctt aatagtggct aaccacacag ctccagcccc tacattgcat atagtctatt 18900
gtataagtta ctgaatggac ttactaacaa aaccagagaa gtaattctaa gtcttttttt 18960
tcttgacata tgaatataaa atacaacaaa actggtaaaa tatattaata gagcattctt 19020
ttactttgca ttttatattg ttactcactt cgtatttaag aaaaacagtc tgatcaggaa 19080
attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gagcatagac ccaacttgaa aagaaaaaaa 19140
aggatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaatg atgttctgaa 19200
atcaggaaaa gaattatagt atatttttgt ggttctcttt tattagttga aaaaaggcac 19260
agtagctcat gcctataaga acagagcttt gggattccaa ggcaggcaga tcacttgagg 19320
ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca aaaataaaaa 19380
agaattagtt gaatgtgttt ctgtgtgcct ataatcctag ctattcagaa agctgaggca 19440
ggaggatctc ttgagcccag gagtttgagg ttacatggag ttatgatgtg ccagtgtact 19500
ccagcctgcg ggacaatgag actctgtctt gttaaaaaaa aaagtgcttg gaataatgtt 19560
tggcatatag aaggtaacaa cagtaaatgt taactgtaat aacccaggta taagtgtgta 19620
aggtgataga aaaattgggg caaacaaccc tgacctgtgt ctctacagaa taagtttgag 19680
ttgaggcaac agacatgtgg agcaccagta attacacact aaatgttaac caaaagcgtt 19740
gaatagtaac atcttattca agggaccccc agccttatat atctcaaggt gcagaaagat 19800
gacttaatat aggacccatt ttttccgagt tctccagagt ttttattggt tcttgagaaa 19860
gtagtggggg aattgtttta gaaaatgaat tggtcaaact gaaattccat gtcagtaagt 19920
ttttacatat tggtaaattt tgatagacat gtagaagttt tctaattaat ctgcgccttg 19980
aaacattttc ctttttccta aagtgcttag tattttttcc cttttttgat tggttgcttg 20040
ggagcttttt tgaggaaatt tagtgaactg cagaatgagt ttgcaaccat ttagtatttt 20100
tgttttgtgt tttagaggag gtatgtgtat tttaacattt cttaatcatt tttagccagc 20160
tatgtttgtt ttgctgattg acaaactata attaaacagc tattctcatt ttgctgatca 20220
tgacaaagta atatcctgaa tttttaaatt ttgcatccag ctctaaattt tctaaatttt 20280
ctaaacataa aattgttcaa aaaatagtat ttttagccac tagattgtgt gttgttaagt 20340
ctgttgtcac agactcattt tacttttcag tgtgtgtttt tacatgttaa ttatgtttgt 20400
catttttaat tttaactttt taaaataatt ccagtcactg ccaaaacatg aaaaattggt 20460
cactggaaat ttttttttta acttttattt taggttcatg tgtacatgtg caggtttgtt 20520
atacaggtaa attgcgtgtc gtgagggttt ggtgtaccca ggtaataagg gtagtaccca 20580
ataggtagtt ttttgatcct tacccttctc ccacccttct ttcaccctcg agtaggcctt 20640
ggtgttgctg tttccttctt tgtgtccatg tgtactcaat ggttagctcc tacttagaag 20700
tgagaacatg cggtatttgg ttttctgttc ctggattagt tcactcagga taatggcctc 20760
tagctccatc tgttttttat ggctgcatag tattccatgg tgtatatgta tcatgttttc 20820
tttatccagt ctaccattga tagacattta ggttgattct ctgtctttac tatcatgaat 20880
agcgctgtga tgaacatata cacatgcatg tgtccttatg gtggaacaat ttgtattcct 20940
ttaagtatat acagaataat ggggttgcta gggtgaatgg tagttctatt gtaagttatt 21000
tgtgaaatct tcaaactgct tttcacaata gctaaactaa tttacagtcc caccagcagt 21060
gtataagtgt tcccttttct ccacaacctt gccaacatgt tattttttta cttttcaata 21120
ataggcattc ctagagaatt gatttgcaat tctctaatga ttagtgatat tgagcatttt 21180
ttcgtatgct ttttagctgt gtgtatatat tcttttgaaa aatgttaatg tcctttgccc 21240
agtttgtaat ggggttgttt gtttttgctt gttaattaaa gttccttcca gattctggat 21300
atccctttgt cagatgcgtg gtttgcagat atttttctcc ccttgtgtag gttgtctttt 21360
tactctgttg atagtttctt ttgccgggca ggagctcatt aggtctcatt tgtgtttgtt 21420
tttgttgcag ttgcttttgg cgtcttcatc ataaaatctg tgccagggcc tatgtccaga 21480
atggtatttc ctagtttgtc ttccagggtt tttacaattt tagattttac gtttatgtct 21540
ttaatccgtc ttgagttgat taaggaaggg gtccagtttc actctaattc ctatggctaa 21600
caattatccc agcaccattt attgaatacg gagtcctttc cccattgctt gtttttgtca 21660
attttgttga agatctgatg gttgtaggtg ctatgtggct ttatttcttg gctctctatt 21720
ctccactggt ctgtctgttt ttataccagt accctgctgt taaggttcct atagcctttt 21780
agtataaggt cggctaatgt gatgcctcca gctttgttct ttttgcttag gattgctttg 21840
gctatttggg ctcctttttg gttccatatt aattttaaaa tagttttttc tagttttgtg 21900
aagaatgtca ttgatagttt agaggaatag cgttgaatct gtagattgct ttgggcaaat 21960
ggccatttta acaatattga ttcttcctat ctatgaacat ggaatgtttt tccatgtgtt 22020
tgtgtcatct ctttatacct gatgtataaa gaaaaaccag tattattgct actcaatctg 22080
ttccaaaaaa ttgaggagga ggaactcttc cctaatgaga ccggcttcct tctgatacca 22140
aaacctggca gagatacaac agaaaaaaga aaacttcagg ccaatatcct tgatgaatat 22200
agatgcaaaa atcctcaaca aaatactagc aaccaaatcc agcagtacgt caaaaagcta 22260
atctacttta agtaggcttt atccctggga tgcaaggttg gttcaacata cacaaatcaa 22320
taagtgtgat tcatcacata aacagagcta aaaacaaaaa ccacaagatt atctcaatag 22380
gtgcagaaaa ggctttcaat acaatttaac atccttcatg ttaaaaacct tcagtaggtc 22440
aggtgcagtg actcacacct gtaatcccag cactttggga ggccaaggcg gacgtatatc 22500
ttaagcccag gagttcaaga ccagcctagg cagcatggtg aaaccccatc tctacaggaa 22560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcttaatat ggcggcatgc acctatagtc 22620
ccagctactc aggaggttga ggtgggagga ttgcttgagc ccaggaggca gaggttgcag 22680
cgagctgaga tcgtgccact gcactccaac ctgggcaata aagtgagacc ctgtctcaaa 22740
aagaaaaaca aaaataatcc taaaccaact aggcattgaa ggaatatgcc tcaaaaaaat 22800
aagaaccatc tatgacagac ccacagccaa tatcttacca aatgggcaaa agctggaagt 22860
attctccttg agaaccgtaa caagacaagg atacacactc tcatccctcc ttttcagcat 22920
agttctggaa gtcctcgcca gagcagtcag gaaagagaaa gaaagaaaag gcattcagat 22980
aggaagagaa gaagtcaaac tatttctgtt tgcaggcagt ataattctat acctagaaaa 23040
tgccatagtt tctgcccaga agctcctaca tctgttaaaa atttcagcaa agttttagca 23100
ttgtctgtat tccaacagct tccagggtga gagtgaaatc aggaacacag tcccgttcac 23160
aatagccgca aaaagaataa aataccttgg aatccagcta accagggagg tgaaacatct 23220
ctacgagaat tacaaaacgc tgctgaaaga aatcagagat gacacaaaca aatggaaatg 23280
ttgtttttaa caccttgctt tatctaattc acttataact aagatattca ttcagtggaa 23340
caggtataat aagaccactc gacttaaata taagccttat tctctttcca gagcccaaga 23400
aggggcacta tcagtgccca gtcaataatg ataaaatgct gatatttttc ccctttactg 23460
tttctttctt ctgtagtgtg gtacactcat ttcttaagat tagaaaactt gacctacctt 23520
cctgtttgct tctacacacc cccattctct ttttttgcca ctccggtcag gtataggatg 23580
atccctacca cttttagtta aaacctcctt cccttattaa atgttctctt accactctgg 23640
cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaagatgaa agggaggtgg gggctgggaa 23700
gggaatagtc ttgtttgtgt gtttgcttta gcacctacta tatcctaggt gctgtgttag 23760
gcacacatta ttttaagtgg ccattatatt gctacatctc actctggtca ttgccaaggt 23820
aggtagtact ttcttggata gttggttcat gttacttata ggtggtggac ttgttgaggc 23880
aaccccaatg gataatcatc tgagtgtgtt ctctaatctc agatttttct tcatattttt 23940
tggtttgttt tggtttttga tggtggtggt tgtgtgctta tttttgttgc tggcttgttt 24000
ttttgttttg tttttgatat ggcaagaatt ggtagtttta tttattaatt gcctaagggt 24060
ctctactttt tttaaaagat gagagtacta aaatagattg ataggtacat acataccttt 24120
atgggggact gcttatattc cttagagaaa aaaattactt attagcctga caaacaccag 24180
taaaatgtaa atatatccgt gagtaaataa atgaatgtat gctttgtatc tccaaatata 24240
tacatctata ttcttacaaa tatgttttta tgtaatacca atttataaga acttaaaatg 24300
ttggctcaag tgagggatgg tggaaagtag cattatatag ccatttcaac atttgaactt 24360
ttttcttcat tttcttcttt tcttcaggaa tatttttcaa gatgtcttac acagagacac 24420
tctagtgaaa gccttcctgg atcaggtaaa tgttgaactt gagattgtca gagtgaatga 24480
tatgacatgt tttctttttt aatatatctt acaatgcctg ttctctctct ctatatatat 24540
atatttatat atttccctgg atcatgcccc agagttctgc tgagcaattg cagttaagtt 24600
agttacacta cagttctcac aagagtctgt gaggggatgt caggtgcatc attacattgg 24660
atgcctcttg tcctagattt atgtttcggg aattcagacc tatgtttaca atataataaa 24720
tattgttgct gccttttaca gataaaataa taagatataa acttgaccac aactactgtt 24780
ttttgaaaca tagagttcat ggtttacatg tatcaaagtg aaatctgagt tagcttttac 24840
agatataata tatacatata tatatcctac aatgcttgta ctatatatgt agtacaagta 24900
tatatatgtg tgtgtgtgtg tgtatatata ttatggcact gtagtatata tatgtttata 24960
tgttaaaaaa tatataaata tatgttacat atttaacata aacatatata catatatgtt 25020
aaatatataa catatactct atatatgaca aatagagtat aatatatatt tttatttttt 25080
atatatatat aaaacatgat agaattaaga attaagtcct aatctgtttt attaggtgct 25140
ttttgtagtg ttcagtcttt ctaaagtgtc taaatgattt ttccttttga cttattaatg 25200
gggaagagcc tctatattaa caattaaggc tgcagcattg attacttcaa acaacaaaca 25260
ttttaattca agcattaacc tataactcaa gtaagttttt tttttttttt ttttgagaaa 25320
gggaggttgt ttatttgcct gaattgagtc aaaaatattt ttgaaacatc atgtactcat 25380
ttaaatgata acatctttat tgtttcattc ttttaaaaaa tatctactta attacacagt 25440
tgaaggaaat tgtagattat atggaactta tttcttaata tattacagtt ttgttataat 25500
aacattctgg ggatcaggcc aggaaactgt gtcatagata aagctttgaa ataatgagat 25560
ccttatgttt actagaaatt ttggattgag atctatgtgg tctgtgacat attgcaaagt 25620
tcaaggaaaa ttcgtaggca tggaatttct caaactgaaa atccctccca ctgtccacct 25680
catcacatgc acacattcta ctcttaccca cccactccac cccttgcaaa agtacagata 25740
tatgaatgtc tcaaaaccat gggctcatct tctagaagct tcaatgttat ttgaagattt 25800
gggcagagga agttaagaaa tatgaaatag cttacatatg agttttaata gtgaaacaaa 25860
catggatgta ttctgaagta gaatgcaaaa tttgagtgca tttttttttt tttgagactg 25920
agtctggctc tgtcgcccag gctggagtgc agtggccgga tctcagctca ctgcaagctc 25980
cacctcccgg gtttacgcca ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gaccacaggc 26040
gcccgccact tcgcccggct agtttgtttg tattttttag tagagatggg gtttcaccgt 26100
gttagccagg gannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccatt 26160
gagtgcattt ttaaagataa atcagaaaac ttcgaaaaac tatcagattg gccggacatg 26220
gtggcttatg cctgtaatcc tagcactttg ggaggctgag gtgggtggat cacgaggtca 26280
ggagatcgag accatcctgc caacatggtg aaaccccatc tctactaagt atacaaaaat 26340
tagctgggcg tgacagcacg tgcctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga 26400
atcgcttgaa cccgggaggt ggaggttgca gtgagtcaag atcacaccac tgcacttcag 26460
cttggtgaca gagctagact ccatatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa gtcagattgt 26520
tcctacaccc agtgcttcta taccacactc ctactagggg gcatcagtgg aaatggttaa 26580
ggagatgttt agtgtgtatt gtctgccaag cactgttaac actgtcctag aaacattgct 26640
gtacaagtag aatgtgagca aattatgtat tgaaatggtt cctctccctg caggtctttc 26700
agctgaaacc tggcttatct ctcaggagta ctttccttgc acagttttta cttgtccttc 26760
acagaaaagc cttgacacta ataaaatata tagaagatga tacgtgagta caactcctac 26820
atggaggaaa aaccttttgt acgttgtttt ttgttttatt tcctttgtac attttctgta 26880
tcataatttt tgcttttttt tttttttttt ttttctccat tactttcagg cagaagggaa 26940
aaaagccctt taaatctctt cggaacctga agatagacct tgatttaaca gcagagggcg 27000
atcttaacat aataatggct ctggctgaga aaattaaacc aggcctacac tcttttatct 27060
ttggaagacc tttctacact agtgtacaag aacgagatgt tctaatgact ttttaaatgt 27120
gtaacttaat aagcctattc catcacaatc gtgatcgctg ctaaagtagc tcggtggtgt 27180
ggggaaacat tcccctggat catactccag agctctgctc ggcagttgca gttaagttag 27240
ttacactaca gttctcacaa gagtctgtga ggggatgtca ggtgcatcat tacattggat 27300
gtctcttttc ctagatttat gcttttggga tacagaccta tgtttacaat ataataggta 27360
ttattgctgt cttttaaata tataataata ggatataaac ttgaccacaa ctgctgtttt 27420
tttgaaatat atgattcatg gtttacatgt attaaggtga aatccgagtt cgcttttaca 27480
gatattagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtggaattac tgtaatactt 27540
ctgcaatcaa ctgaaaatta gagcctttaa atgatttcag ttccacagaa agaaagtgag 27600
cttcaacata ggataagctt tagaaagaga attgatcaag cagatgttta attggaattg 27660
attattagat cctgctttgt ggatttagcc ctcgggattc agtctgtaga aatgtctgat 27720
agttctctat agtccctgct catggtgaac cacagttagg atgttttgtt tgttttattg 27780
ttgttgctat tgttgatgtt ctatatagtt gagctctata aaaggaaatt gtattttatg 27840
ttttagtagt tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc caaattgaaa 27900
tgtgcacctc ctgtgccttt tttttccttg gaaaatcgaa ttacttggaa gaagttcaga 27960
tttcactggt cagtcgtttt catcttgttt tcttcttgca gagtcttacc atgtacctgc 28020
tttggcaatc attgtaactc tgagattata aaatgcatta gagaatatat taactaataa 28080
gatctttttt ttcaggaaca gaaaatagtt ccttgagtac ttccttctta catttctgcc 28140
catgtttttg aagttgttgc catttgcctg caataggcta taaggaatag caggagaaat 28200
tttactgaag tgctattttt ctaggtgcta ctttggcaga gctaagtggt ctgtttcttt 28260
tgtttcctta atgcgtttgg accattttgc tggctgtaaa ataactgatt aatataattc 28320
taacacaata ttgacattgt agtgtacaca aacacaaata ttttatttaa aactggaagt 28380
aacataaaag ggaaaatata tttataagaa aggaataaag gtaatagagc tcttctgtcc 28440
cccagccacc aaatttacac aacaaaatca tatgttctaa tgtgaaaggt cataatagct 28500
ttcccatcat taatcagaaa gatgtggcag cttgattttt tagacaaccc ctgaactaga 28560
tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa aaaatatata aatactatct cgtagtgtcc 28620
catactatgt tttttacatg atagattctt atttaagtgc taactggtta ttttctttgg 28680
ctggtttatt gtactgttat atagaatgta agttgtacag tgaaataagt tattaaagca 28740
tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc tagatggaga attttgaata aaatatnnnn 28800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28980
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29040
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29100
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29160
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa gactaattga tcatatcact atgattctca 29220
aagaagaacc aaaacttcat ataatactac aaatatgaga tagttacttc tgtagtatat 29280
ttctgtaatg ctacaggtta aacaggtcac tcttatataa cactattttg attttgatgt 29340
agaattgcac aaattgatat ttcttctatg atctgtaggg tatagcttaa agtagcaaaa 29400
acagtccacc acctccagtt aacacacagt aacactatgg gactagtatt attatttcca 29460
ttttacaaag gaggaaacta aagcttaaag atgtgtaata tacagcccaa ggtcacacag 29520
ctggtaaagg tagatttcat cccagacagt tacagtcatt gccgtgggca cagctcctaa 29580
cttattaact ccatgtaact ggtactcagt ttagttgaat tgaaaggaga gtagggaagc 29640
aggtctgttt gcactattca gagcccaagt gtgaatccct gctgtgctgc ttggagaagt 29700
tacttaacct atgcaaggtt cattttttaa atatttgaaa cggaatgata atacatactt 29760
caccagtggg tttaatgaga ccttataaga tcgttagttc agtacctgac cagtgcttca 29820
taaatgcttt ttcatccaat ctgacaatct ctagcttgta attggggcat ttagaacatt 29880
taatatgatt attggcatgg taggttaaag ttgtcatctt gctgttttct ctttgttctt 29940
ttttctcctt tcttttggat ttttttttaa ttttactgtg tcttctctgt tgtcttatta 30000
a 30001
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
gggtctagca agagcaggtg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
gtcttggcaa cagctggaga t 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 14
tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 17
tcgactcttt gcccaccgcc a 21
<210> 18
<211> 783
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gcctctcagt acccgaggct cccttttctc gagcccgcag cggcagcgct cccagcgggt 60
ccccgggaag gagacagctc gggtactgag ggcgggaaag caaggaagag gccagatccc 120
catcccttgt ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gggaagcccg gggcccggat 180
gcaggcaatt ccaccagtcg ctagaggcga aagcccgaca cccagcttcg gtcagagaaa 240
tgagagggaa agtaaaaatg cgtcgagctc tgaggagagc ccccgcttct acccgcgcct 300
cttcccggca gccgaacccc aaacagccac ccgccaggat gccgcctcct cactcaccca 360
ctcgccaccg cctgcgcctc cgccgccgcg ggcgcaggca ccgcaaccgc agccccgccc 420
cgggcccgcc cccgggcccg ccccgaccac gccccggccc cggccccggc cccggccccg 480
gcccctagcg cgcgactcct gagttccaga gcttgctaca ggctgcggtt gtttccctcc 540
ttgttttctt ctggttaatc tttatcaggt cttttcttgt tcaccctcag cgagtactgt 600
gagagcaagt agtggggaga gagggtggga aaaacaaaaa cacacacctc ctaaacccac 660
acctgctctt gctagacccc gcccccaaaa gagaagcaac cgggcagcag ggacggctga 720
cacaccaagc gtcatctttt acgtgggcgg aacttgtcgc tgtttgacgc acctctcttt 780
cct 783
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 21
gccttactct aggaccaaga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 22
ccggccccta gcgcgcgact 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23
cggcccctag cgcgcgact 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 24
ccggccccta gcgcgcgac 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 25
ccctagcgcg cgactcctga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 26
cccctagcgc gcgactcctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 27
gcccctagcg cgcgactcct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 28
ggcccctagc gcgcgactcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 29
cggcccctag cgcgcgactc 20
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 30
cctagcgcgc gactcctg 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 31
ccctagcgcg cgactcct 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 32
cccctagcgc gcgactcc 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 33
gcccctagcg cgcgactc 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 34
ggcccctagc gcgcgact 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35
cggcccctag cgcgcgac 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 36
aggctgcggt tgtttccctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 37
caggctgcgg ttgtttccct 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 38
ggctgcggtt gtttccctc 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 39
aggctgcggt tgtttccct 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 40
caggctgcgg ttgtttccc 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41
gctgcggttg tttccctc 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42
ggctgcggtt gtttccct 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 43
aggctgcggt tgtttccc 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44
caggctgcgg ttgtttcc 18
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45
tctgtctttg gagcccaaat 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46
ctgcgatccc cattccagtt 20
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 47
gccttactct aggaccaa 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
tctgtctttg gagcccaa 18
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
ggttaatctt tatcaggtct 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
tggttaatct ttatcaggtc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
ctggttaatc tttatcaggt 20
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
gttaatcttt atcaggtc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
ggttaatctt tatcaggt 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
tggttaatct ttatcagg 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
ctagcgcgcg actcctga 18
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
gggacactac aaggtagtat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
tacaggctgc ggttgtttcc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
cccggcccct agcgcgcgac 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
ggtaacttca aactcttggg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
aatctttatc aggtcttttc 20
Claims (20)
- 제1항에 있어서, 소듐 염 또는 포타슘 염인 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 제1항의 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제4항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제를 포함하고, 여기서 상기 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 식염수 (PBS)인 제약 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 제약 조성물.
- 제3항의 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제7항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제를 포함하고, 여기서 상기 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 식염수 (PBS)인 제약 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 제약 조성물.
- 제2항의 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제10항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제를 포함하고, 여기서 상기 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 식염수 (PBS)인 제약 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 제약 조성물.
- 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물이며, 여기서 변형된 올리고뉴클레오티드는 5' 윙 분절, 중심 갭 분절, 및 3' 윙 분절로 이루어진 갭머이고, 여기서:
5' 윙 분절은 6개의 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드로 이루어지고,
중심 갭 분절은 10개의 β-D-데옥시리보뉴클레오시드로 이루어지고,
3' 윙 분절은 4개의 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드로 이루어지고;
여기서 변형된 올리고뉴클레오티드는 핵염기 서열 5'-GGTTAATCTTTATCAGGTCT-3' (서열 번호: 49)을 가지며, 여기서 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고; 여기서 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결은 5'에서 3'으로 sooooossssssssssoss이며, 여기서 각각의 s는 포스포로티오에이트 연결이고 각각의 o는 포스포디에스테르 연결인 화합물. - 제13항에 있어서, 공액체 그룹에 공유적으로 연결된 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물.
- 제13항의 화합물, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제15항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제를 포함하고, 여기서 상기 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 식염수 (PBS)인 제약 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 화합물 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 제약 조성물.
- 제14항의 화합물, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비정형 파킨슨 증후군 및 올리보교소뇌 퇴행증 (OPCD)으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제18항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제를 포함하고, 여기서 상기 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 식염수 (PBS)인 제약 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 화합물 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 제약 조성물.
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562148691P | 2015-04-16 | 2015-04-16 | |
US62/148,691 | 2015-04-16 | ||
US201562232941P | 2015-09-25 | 2015-09-25 | |
US62/232,941 | 2015-09-25 | ||
US201562239400P | 2015-10-09 | 2015-10-09 | |
US62/239,400 | 2015-10-09 | ||
KR1020177032588A KR102104163B1 (ko) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 |
PCT/US2016/027747 WO2016168592A2 (en) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | Compositions for modulating c9orf72 expression |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177032588A Division KR102104163B1 (ko) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20200043513A KR20200043513A (ko) | 2020-04-27 |
KR102258516B1 true KR102258516B1 (ko) | 2021-05-31 |
Family
ID=57126261
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177032588A KR102104163B1 (ko) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 |
KR1020207010994A KR102258516B1 (ko) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177032588A KR102104163B1 (ko) | 2015-04-16 | 2016-04-15 | C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물 |
Country Status (30)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9605263B2 (ko) |
EP (2) | EP3283080B1 (ko) |
JP (3) | JP6606557B2 (ko) |
KR (2) | KR102104163B1 (ko) |
CN (2) | CN107427532B (ko) |
AU (2) | AU2016249002B2 (ko) |
BR (1) | BR112017016068A2 (ko) |
CA (1) | CA2978103A1 (ko) |
CL (4) | CL2017002567A1 (ko) |
CO (1) | CO2017007671A2 (ko) |
CY (1) | CY1122981T1 (ko) |
DK (1) | DK3283080T3 (ko) |
ES (1) | ES2791995T3 (ko) |
HK (1) | HK1250255A1 (ko) |
HR (1) | HRP20200843T1 (ko) |
HU (1) | HUE049233T2 (ko) |
IL (2) | IL253557B (ko) |
LT (1) | LT3283080T (ko) |
MX (2) | MX366128B (ko) |
MY (1) | MY181815A (ko) |
NZ (1) | NZ733882A (ko) |
PH (2) | PH12017501875B1 (ko) |
PL (1) | PL3283080T3 (ko) |
PT (1) | PT3283080T (ko) |
RS (1) | RS60230B1 (ko) |
RU (1) | RU2736574C2 (ko) |
SA (3) | SA520412450B1 (ko) |
SG (2) | SG10202001856WA (ko) |
SI (1) | SI3283080T1 (ko) |
WO (1) | WO2016168592A2 (ko) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2015151857A (ru) | 2008-12-02 | 2019-01-15 | Уэйв Лайф Сайенсес Джапан, Инк. | Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот |
AU2010270714B2 (en) | 2009-07-06 | 2015-08-13 | Wave Life Sciences Ltd. | Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof |
DK2620428T3 (da) | 2010-09-24 | 2019-07-01 | Wave Life Sciences Ltd | Asymmetrisk hjælpegruppe |
CN107365339A (zh) | 2011-07-19 | 2017-11-21 | 波涛生命科学有限公司 | 合成官能化核酸的方法 |
CA2879023C (en) | 2012-07-13 | 2017-03-28 | Wave Life Sciences Japan | Asymmetric auxiliary group |
US10577604B2 (en) | 2012-10-15 | 2020-03-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for monitoring C9ORF72 expression |
US9963699B2 (en) | 2012-10-15 | 2018-05-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating C9ORF72 expression |
JP6570447B2 (ja) | 2012-10-15 | 2019-09-04 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | C9orf72発現を調節するための組成物 |
SG11201602597YA (en) | 2013-10-11 | 2016-05-30 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compositions for modulating c9orf72 expression |
KR20230152178A (ko) | 2014-01-16 | 2023-11-02 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 디자인 |
WO2017079291A1 (en) | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating c90rf72 |
EP3443094B1 (en) * | 2016-04-13 | 2022-10-19 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing c9orf72 expression |
WO2018081728A1 (en) * | 2016-10-31 | 2018-05-03 | Emendobio Inc. | Compositions for genome editing |
KR20200035301A (ko) * | 2017-08-08 | 2020-04-02 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법 |
WO2019094694A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for the treatment of expanded repeat-associated disorders |
CA3088112A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof |
WO2020023418A1 (en) * | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of treating neurological disorders |
WO2020027311A1 (ja) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | Tdp-43凝集阻害剤 |
BR112021010660A2 (pt) | 2018-12-06 | 2021-08-24 | Biogen Ma Inc. | Proteína de neurofilamento para guiar intervenção terapêutica sobre esclerose lateral amiotrófica |
CA3133784A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | University Of Massachusetts | Oligonucleotide-based modulation of c9orf72 |
WO2020227395A2 (en) * | 2019-05-06 | 2020-11-12 | University Of Massachusetts | Anti-c9orf72 oligonucleotides and related methods |
EP4037695A4 (en) * | 2019-10-06 | 2024-03-27 | Wave Life Sciences Ltd. | OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF |
WO2024036186A2 (en) * | 2022-08-09 | 2024-02-15 | The University Of Massachusetts | Identification of allele-specific target sequences for c9orf72 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013030588A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | The University Of Manchester | Method for diagnosing a neurodegenerative disease |
WO2014062736A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for monitoring c9orf72 expression |
WO2014114660A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
WO2015054676A2 (en) | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating c9orf72 expression |
Family Cites Families (95)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
DK0497875T3 (da) | 1989-10-24 | 2000-07-03 | Gilead Sciences Inc | 2'-modificerede oligonukleotider |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
DE69032425T2 (de) | 1990-05-11 | 1998-11-26 | Microprobe Corp., Bothell, Wash. | Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden |
US6582908B2 (en) | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
EP0538194B1 (de) | 1991-10-17 | 1997-06-04 | Novartis AG | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
ATE515510T1 (de) | 1991-12-24 | 2011-07-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
EP0691968B1 (en) | 1993-03-30 | 1997-07-16 | Sanofi | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
US5801154A (en) | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5681940A (en) * | 1994-11-02 | 1997-10-28 | Icn Pharmaceuticals | Sugar modified nucleosides and oligonucleotides |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
US6770748B2 (en) | 1997-03-07 | 2004-08-03 | Takeshi Imanishi | Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue |
EP2253639A1 (en) | 1997-09-12 | 2010-11-24 | Exiqon A/S | Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US20030228597A1 (en) | 1998-04-13 | 2003-12-11 | Cowsert Lex M. | Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation |
US6043352A (en) | 1998-08-07 | 2000-03-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides |
US5998148A (en) | 1999-04-08 | 1999-12-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression |
EP1178999B1 (en) | 1999-05-04 | 2007-03-14 | Santaris Pharma A/S | L-ribo-lna analogues |
US6525191B1 (en) | 1999-05-11 | 2003-02-25 | Kanda S. Ramasamy | Conformationally constrained L-nucleosides |
EP1244667B1 (en) | 1999-12-30 | 2006-04-05 | K.U. Leuven Research & Development | Cyclohexene nucleic acids |
USH2191H1 (en) | 2000-10-24 | 2007-06-05 | Snp Consortium | Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome |
US20050019915A1 (en) | 2001-06-21 | 2005-01-27 | Bennett C. Frank | Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression |
WO2003004602A2 (en) | 2001-07-03 | 2003-01-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant chimeric oligonucleotides |
AU2003291755A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use |
AU2003291753B2 (en) | 2002-11-05 | 2010-07-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation |
US7250496B2 (en) | 2002-11-14 | 2007-07-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof |
ATE517992T1 (de) | 2002-11-14 | 2011-08-15 | Dharmacon Inc | Funktionelle und hyperfunktionelle sirna |
US7790867B2 (en) | 2002-12-05 | 2010-09-07 | Rosetta Genomics Inc. | Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA |
WO2004106356A1 (en) | 2003-05-27 | 2004-12-09 | Syddansk Universitet | Functionalized nucleotide derivatives |
US7427672B2 (en) | 2003-08-28 | 2008-09-23 | Takeshi Imanishi | Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type |
AU2004274021B2 (en) | 2003-09-18 | 2009-08-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-thionucleosides and oligomeric compounds |
US20050261233A1 (en) | 2004-04-21 | 2005-11-24 | Sanjay Bhanot | Modulation of glucose-6-phosphatase translocase expression |
EP1752536A4 (en) | 2004-05-11 | 2008-04-16 | Alphagen Co Ltd | POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME |
JP2008501693A (ja) | 2004-06-03 | 2008-01-24 | アイシス ファーマシューティカルズ、インク. | 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物 |
EP1766052A4 (en) | 2004-06-03 | 2009-12-16 | Isis Pharmaceuticals Inc | CHIMERIC OLIGOMER COMPOSITIONS WITH CAP |
US20080261905A1 (en) | 2004-11-08 | 2008-10-23 | K.U. Leuven Research And Development | Modified Nucleosides for Rna Interference |
US20070299027A1 (en) | 2006-01-26 | 2007-12-27 | Gene Hung | Compositions and their uses directed to huntingtin |
AU2007211080B9 (en) | 2006-01-27 | 2012-05-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 6-modified bicyclic nucleic acid analogs |
ES2386578T3 (es) | 2006-05-05 | 2012-08-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compuestos y procedimientos para modular la expresión de PCSK9 |
ES2389737T3 (es) | 2006-05-11 | 2012-10-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5' |
EP2444494B1 (en) | 2006-10-09 | 2016-09-28 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9 |
CN102604951A (zh) | 2006-12-14 | 2012-07-25 | 诺瓦提斯公司 | 治疗肌肉和心血管病症的组合物和方法 |
US20100190837A1 (en) | 2007-02-15 | 2010-07-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom |
EP2170917B1 (en) | 2007-05-30 | 2012-06-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs |
EP2173760B2 (en) | 2007-06-08 | 2015-11-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs |
ATE462787T1 (de) | 2007-06-18 | 2010-04-15 | Commissariat Energie Atomique | Reversibles sirna-silencing eines mutierten und endogenen huntington-wildtypgens und dessen anwendung zur behandlung von morbus huntington |
DK2176280T4 (en) | 2007-07-05 | 2015-07-20 | Isis Pharmaceuticals Inc | 6-Disubstituerede bicykliske nukleinsyreanaloge |
US20090123928A1 (en) | 2007-10-11 | 2009-05-14 | The Johns Hopkins University | Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers |
EP2217705A2 (en) * | 2007-11-05 | 2010-08-18 | Baltic Technology Development, Ltd. | Use of oligonucleotides with modified bases in hybridization of nucleic acids |
WO2009067647A1 (en) | 2007-11-21 | 2009-05-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs |
EP2265627A2 (en) | 2008-02-07 | 2010-12-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs |
WO2010036698A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides |
WO2010036696A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cyclohexenyl nucleic acid analogs |
US20120149757A1 (en) | 2009-04-13 | 2012-06-14 | Krainer Adrian R | Compositions and methods for modulation of smn2 splicing |
MX2011013421A (es) | 2009-06-15 | 2012-03-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Arnds formulado con lipido de direccionamiento del gen pcsk9. |
CA2767231A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cell-based bioprocessing |
WO2011005860A2 (en) | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 5' phosphate mimics |
WO2011017521A2 (en) | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs |
EP2563921B1 (en) | 2010-04-30 | 2016-11-23 | Cellectis | Method for modulating double-strand break-induced homologous recombination |
WO2012005898A2 (en) | 2010-06-15 | 2012-01-12 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chinese hamster ovary (cho) cell transcriptome, corresponding sirnas and uses thereof |
CN106434648A (zh) * | 2010-07-19 | 2017-02-22 | F·C·贝内特 | 肌强直性营养障碍蛋白激酶(dmpk)表达的调节 |
CA3077910A1 (en) * | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of alpha synuclein expression |
DK2655621T3 (en) | 2010-12-20 | 2018-08-13 | Massachusetts Gen Hospital | Polycomb-associated non-coding RNAS |
US20140050778A1 (en) | 2010-12-28 | 2014-02-20 | University Of Rochester | Nucleic acid binding compounds, methods of making, and use thereof |
CN103562215B (zh) * | 2011-04-01 | 2017-04-26 | 埃西斯药品公司 | 信号转导及转录激活蛋白3(stat3)表达的调节 |
LT3505528T (lt) * | 2011-04-21 | 2021-04-26 | Glaxo Group Limited | Hepatito b viruso (hbv) raiškos moduliacija |
WO2013036833A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis |
CN103906838A (zh) * | 2011-10-25 | 2014-07-02 | Isis制药公司 | Gccr表达的反义调节 |
WO2013075079A1 (en) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Rheonix, Inc. | System and methods for selective molecular analysis |
EP2785729B1 (en) * | 2011-11-30 | 2020-11-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases |
EP2788087A4 (en) | 2011-12-06 | 2015-08-26 | Ohio State Innovation Foundation | NON-IONIC LOW OSMOLARITY CONTRAST AGENTS FOR THE ADMINISTRATION OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND THE TREATMENT OF DISEASE |
RS56319B1 (sr) | 2012-04-23 | 2017-12-29 | Biomarin Tech Bv | Oligonukleotidi koji moduliraju rnk sa poboljšanim karakteristikama za lečenje neuromišićnih poremećaja |
DK2855500T3 (da) * | 2012-05-24 | 2020-09-14 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til modulering af apolipoprotein (A)-ekspression |
US9963699B2 (en) | 2012-10-15 | 2018-05-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating C9ORF72 expression |
JP6570447B2 (ja) | 2012-10-15 | 2019-09-04 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | C9orf72発現を調節するための組成物 |
WO2016024205A1 (en) | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Pfizer Inc. | Oligomers targeting hexanucleotide repeat expansion in human c9orf72 gene |
WO2016060919A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Allele selective inhibition of mutant c9orf72 foci expression by duplex rnas targeting the expanded hexanucleotide repeat |
WO2017079291A1 (en) | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating c90rf72 |
EP3443094B1 (en) | 2016-04-13 | 2022-10-19 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing c9orf72 expression |
US10399845B2 (en) | 2017-09-22 | 2019-09-03 | Emco Wheaton Retail Corporation | Testable overfill prevention valve for a liquid storage container |
-
2016
- 2016-04-15 KR KR1020177032588A patent/KR102104163B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-15 SI SI201630693T patent/SI3283080T1/sl unknown
- 2016-04-15 CN CN201680016814.1A patent/CN107427532B/zh active Active
- 2016-04-15 MX MX2017013199A patent/MX366128B/es active IP Right Grant
- 2016-04-15 CA CA2978103A patent/CA2978103A1/en active Pending
- 2016-04-15 MY MYPI2017703869A patent/MY181815A/en unknown
- 2016-04-15 BR BR112017016068-4A patent/BR112017016068A2/pt active Search and Examination
- 2016-04-15 US US15/130,818 patent/US9605263B2/en active Active
- 2016-04-15 KR KR1020207010994A patent/KR102258516B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-15 NZ NZ733882A patent/NZ733882A/en unknown
- 2016-04-15 RS RS20200535A patent/RS60230B1/sr unknown
- 2016-04-15 EP EP16780833.6A patent/EP3283080B1/en active Active
- 2016-04-15 PL PL16780833T patent/PL3283080T3/pl unknown
- 2016-04-15 CN CN202110535254.3A patent/CN113265404A/zh active Pending
- 2016-04-15 SG SG10202001856WA patent/SG10202001856WA/en unknown
- 2016-04-15 LT LTEP16780833.6T patent/LT3283080T/lt unknown
- 2016-04-15 JP JP2017546618A patent/JP6606557B2/ja active Active
- 2016-04-15 HU HUE16780833A patent/HUE049233T2/hu unknown
- 2016-04-15 SG SG11201708468YA patent/SG11201708468YA/en unknown
- 2016-04-15 ES ES16780833T patent/ES2791995T3/es active Active
- 2016-04-15 PT PT167808336T patent/PT3283080T/pt unknown
- 2016-04-15 RU RU2017139121A patent/RU2736574C2/ru active
- 2016-04-15 EP EP20163264.3A patent/EP3722424A1/en active Pending
- 2016-04-15 WO PCT/US2016/027747 patent/WO2016168592A2/en active Application Filing
- 2016-04-15 DK DK16780833.6T patent/DK3283080T3/da active
- 2016-04-15 AU AU2016249002A patent/AU2016249002B2/en active Active
-
2017
- 2017-01-12 US US15/404,979 patent/US10138482B2/en active Active
- 2017-07-18 IL IL253557A patent/IL253557B/en active IP Right Grant
- 2017-07-28 CO CONC2017/0007671A patent/CO2017007671A2/es unknown
- 2017-10-11 CL CL2017002567A patent/CL2017002567A1/es unknown
- 2017-10-12 MX MX2019007834A patent/MX2019007834A/es unknown
- 2017-10-13 PH PH12017501875A patent/PH12017501875B1/en unknown
- 2017-10-16 SA SA520412450A patent/SA520412450B1/ar unknown
- 2017-10-16 SA SA520412451A patent/SA520412451B1/ar unknown
- 2017-10-16 SA SA517390168A patent/SA517390168B1/ar unknown
-
2018
- 2018-07-09 HK HK18108871.7A patent/HK1250255A1/zh unknown
- 2018-10-17 US US16/163,402 patent/US10815483B2/en active Active
- 2018-12-12 CL CL2018003582A patent/CL2018003582A1/es unknown
-
2019
- 2019-10-16 AU AU2019250156A patent/AU2019250156B2/en active Active
- 2019-10-18 JP JP2019190648A patent/JP6924242B2/ja active Active
- 2019-12-02 PH PH12019502724A patent/PH12019502724A1/en unknown
-
2020
- 2020-05-25 HR HRP20200843TT patent/HRP20200843T1/hr unknown
- 2020-06-02 CY CY20201100520T patent/CY1122981T1/el unknown
- 2020-07-31 CL CL2020002018A patent/CL2020002018A1/es unknown
- 2020-07-31 CL CL2020002019A patent/CL2020002019A1/es unknown
- 2020-09-18 US US16/948,435 patent/US20210230589A1/en active Pending
- 2020-09-25 IL IL277624A patent/IL277624A/en unknown
-
2021
- 2021-07-30 JP JP2021124953A patent/JP2021184720A/ja not_active Ceased
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013030588A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | The University Of Manchester | Method for diagnosing a neurodegenerative disease |
WO2014062736A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for monitoring c9orf72 expression |
WO2014114660A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
WO2015054676A2 (en) | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating c9orf72 expression |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2019250156B2 (en) | Compositions for modulating c9orf72 expression | |
AU2020220099A1 (en) | Compositions for modulating c9orf72 expression | |
RU2730677C2 (ru) | Соединение для модуляции экспрессии гена c9orf72 и его применение | |
KR102285629B1 (ko) | Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물 | |
AU2016225852B2 (en) | Modulation of alpha synuclein expression | |
JP6684707B2 (ja) | タウ発現を調節するための組成物 | |
KR102366078B1 (ko) | Pkk 발현을 조절하는 조성물 및 방법 | |
KR102315836B1 (ko) | 아포지질단백질 (a) 발현을 조절하는 조성물 및 방법 | |
DK2906256T3 (en) | SELECTIVE ANTISENSE COMPOUNDS AND APPLICATIONS THEREOF | |
DK2534248T3 (en) | SELECTIVE REDUCTION OF ALLELVARIANS | |
AU2012275096B2 (en) | Methods for modulating kallikrein (KLKB1) expression | |
KR101839177B1 (ko) | Ptpib 발현의 안티센스 조절 | |
KR20210093970A (ko) | 프리온 발현을 감소시키기 위한 화합물 및 방법 | |
KR20200108315A (ko) | Tmem106b의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드 | |
TW202216996A (zh) | 調節plp1之化合物及方法 | |
KR20220035137A (ko) | Ppm1a 억제제 및 그의 사용 방법 | |
KR20240111010A (ko) | Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |