KR102366078B1 - Pkk 발현을 조절하는 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
PKK mRNA 및 단백질 발현을 감소시키기 위한 안티센스 화합물 및 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법, 화합물, 및 조성물은 PKK 연관된 질환, 장애, 및 병태를 치료, 예방 또는 개선하는데 유용하다.
Description
서열 목록
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분야
동물에서 인간 혈장 프리칼리크레인 (PKK) mRNA 및 단백질의 발현을 억제하기 위한 화합물, 조성물, 및 방법이 본원에서 제공된다. 본 발명에서는 염증성 및 혈전색전성 병태를 치료, 예방 또는 개선하는데 유용한, 그러한 조성물 및 방법이 제공된다.
혈장 프리칼리크레인 (PKK)은, KLKB1 유전자로부터 암호화된 혈장 칼리크레인 (PK)의 전구체이다. PKK는 혈액 응고, 섬유소용해, 키닌 생성, 및 염증의 표면-의존성 활성에 참여하는 당단백질이다. PKK는 내부 Arg-Ile 펩티드 결합의 절단에 의한 인자 XIIa에 의하여 PK로 전환된다. PK는 키니노겐으로부터 키닌을 방출시키고, 또한 플라스미노겐으로부터 플라스민을 생성한다. PK는 키닌-칼리크레인 경로의 구성원이며, 이는 염증, 혈압 제어, 응고 및 고통에서 역할을 하는 몇몇의 단백질로 구성되어 있다.
요약
PKK mRNA 및 단백질의 발현을 조절하기 위한 화합물, 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, PKK mRNA 및 단백질의 발현을 조절하기 위한 화합물은 안티센스 화합물이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 조절은 세포 또는 조직에서 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 조직은 동물 내의 것이다. 특정 구현예에서, 동물은 인간이다 특정 구현예에서, PKK mRNA 수준은 감소된다. 특정 구현예에서, PKK 단백질 수준은 감소된다. 그러한 감소는 시간-의존적 방식 또는 용량-의존적 방식으로 발생할 수 있다.
본 발명에서는 PKK와 연관된 질환, 장애, 및 병태를 예방, 치료, 및 지연하는데 유용한 화합물, 조성물, 및 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 그러한 PKK 연관된 질환, 장애, 및 병태는 염증성 질환이다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 급성 또는 만성 염증성 질환일 수 있다. 특정 구현예에서, 그러한 염증성 질환은 유전성 혈관부종(HAE), 부종, 혈관부종, 종창, 눈꺼풀의 혈관부종, 눈의 부종, 황반 부종, 및 뇌 부종을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 그러한 PKK 연관된 질환, 장애, 및 병태는 혈전색전성 질환이다. 특정 구현예에서, 그러한 혈전색전성 질환은 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 심부정맥혈전증, 폐색전증, 심근경색증, 뇌졸중, 및 경색을 포함할 수 있다.
그러한 질환, 장애, 및 병태는 하나 이상의 위험인자, 원인 또는 결과를 공통적으로 가질 수 있다.
염증성 질환의 발병에 대한 특정 위험 인자 및 원인은 염증성 질환에 대한 유전적 소인 및 환경적 인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 변이된 보체 1 에스테라아제 억제제 (C1-INH) 유전자 또는 변이된 인자 12 유전자를 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACE 억제제) 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)를 투여받았거나 투여 중이다. 특정 구현예에서, 대상체는 혈관부종을 야기하는 알레르기 반응을 보인 것이 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 유형 I HAE를 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 유형 II HAE를 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 유형 III HAE를 갖는다.
염증성 질환의 발병과 연관된 특정 결과는 하기를 포함한다: 사지 (즉, 손, 발, 다리), 장 (복부), 안면부, 생식기, 후두 (즉, 성낭)을 포함하는 다양한 신체 부위에서의 부종/종창; 혈관투과성; 혈관 유출, 일반화된 염증; 복부 통증; 팽만; 구토; 설사; 피부 가려움증; 호흡기 (천식성) 반응; 비염; 아나필락시스; 기관지수축; 저혈압; 코마; 및 사망.
혈전색전성 질환의 발병에 대한 특정 위험 인자 및 원인은 혈전색전성 질환, 부동성, 수술 (특히 정형외과적 수술), 악성종양, 임신, 노령, 구강 피임제의 사용, 심방 세동, 과거 혈전색전성 병태, 만성 염증성 질환 및 유전성 또는 후천성 예비혈전성 응고 장애에 대한 유전적 소인을 포함한다. 혈전색전성 병태의 발병과 연관된 특정 결과는 환부 혈관을 통한 감소된 혈류, 조직 괴사 및 사망을 포함한다.
특정 구현예에서, 치료 방법은 PKK 안티센스 화합물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료 방법은 PKK 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 실시예 124에 기술된 혈액 샘플로부터의 HMWK 웨스턴 블랏 정량화이다.
도 2은 실시예 127에 기술된 혈액 샘플로부터의 HMWK 웨스턴 블랏 정량화이다.
도 2은 실시예 127에 기술된 혈액 샘플로부터의 HMWK 웨스턴 블랏 정량화이다.
전술된 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 모두는 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 청구될 때 본 발명을 제한하지 않음이 이해되어야 한다. 본원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않으면 복수를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않으면 "및/또는"를 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, 용어들 예컨대 "요소" 또는 "성분"은, 달리 구체적으로 언급되지 않으면 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분 둘 모두 및 1 초과의 하부단위을 포함하는 요소 및 성분을 포함한다.
달리 구체적인 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 약효 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그것들의 절차 및 기술은 잘 알려져 있고 당해기술에서 통상적으로 사용된 것들이다. 표준 기술 화학적 합성, 및 화학적 분석을 위해 사용될 수 있다. 특정 그와 같은 기술 및 절차는 예를 들면 하기에서 발견될 수 있다: "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society , Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21st edition, 2005; 및 "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; and Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (이들은 임의의 목적을 위해 참고로 본원에 편입되어 있음). 허용되는 경우, 본 개시내용에서 명세서에서 언급된 모든 특허들, 적용, 공개 출원 및 다른 공보 및 다른 데이터는 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
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정의
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달리 지적되지 않으면, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다:
"2'-O-메톡시에틸" (또한 2'-MOE 및 2'- OCH2CH2-OCH3 및 MOE)은 푸로실 환의 2' 위치의 O-메톡시에틸 변형을 나타낸다. 2'-O-메톡시에틸 변형된 당은 변형된 당이다.
"2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드" (또한 2'-MOE 뉴클레오시드)는 2'-MOE-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-치환된 뉴클레오시드"는 H 또는 OH 이외의 푸라노스 환의 2' 위치에서 치환체를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구현예에서, 2' 치환된 뉴클레오시드는 이환식 당 변형을 갖은 뉴클레오시드를 포함한다.
"2'-데옥시뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 당 부분의 2' 위치에 수소를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"3' 표적 부위"는 특정한 안티센스 화합물의 3'-모스트 (most) 뉴클레오티드에 대해서 상보적인 표적 핵산의 뉴클레오티드를 나타낸다.
"5' 표적 부위"는 특정한 안티센스 화합물의 5'-모스트 (most) 뉴클레오티드에 대해서 상보적인 표적 핵산의 뉴클레오티드를 나타낸다.
"5-메틸시토신"은 5 위치에 부착된 메틸 기에 의해서 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 핵염기이다.
"약"은 값의 ±7% 범위 내를 의미한다. 예를 들어, "화합물은 PKK 억제의 적어도 약 70%만큼 영향을 미칠 수 있다"라고 언급된 경우에, 이것은 PKK 수준이 63%-77% 범위 내로 억제될 수 있음을 시사한다.
"수반하여 투여된다"는 둘 다의 약물학적 효과가 환자에게서 동시에 나타나도록 하는 임의의 방식으로의 두 가지 약제학적 제제의 공동-투여를 나타낸다. 수반되는 투여는 두 가지 약제학적 제제를 단일 약제학적 조성물로, 단일 투약형으로, 또는 동일한 투여 경로에 의해서 투여할 것을 필요로 하지 않는다. 두 가지 약제학적 제제의 효과는 그들 자체가 동시에 나타날 필요는 없다. 효과는 일정 기간 동안 단지 중첩될 필요는 있고 동일한 시(공)간에 걸칠 필요는 없다.
"투여하는"은 약제학적 제제를 동물에게 제공하는 것을 의미하며, 의료 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알킬"은, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬 기의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 등. 알킬그룹은 전형적으로 1 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1 내지 약 12의 탄소 원자 (C1-C12 알킬)를 포함하고, 1 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알케닐"은, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는, 곧은 또는 분지된 탄화수소 사슬 라디칼을 의미한다. 알케닐 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 디엔 예컨대 1,3-부타디엔 등. 알케닐 그룹은 전형적으로 2 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2 내지 약 12의 탄소 원자를 포함하고 2 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 알케닐 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 1 이상의 추가 치환기 그룹을 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알키닐"은, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알키닐 그룹의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐, 등. 알키닐 그룹은 전형적으로 2 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2 내지 약 12의 탄소 원자를 포함하고 2 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 알키닐 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 1 이상의 추가 치환기 그룹을 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아실"은, 유기산으로부터 하이드록실 그룹의 제거에 의해 형성될 라디칼을 의미하고 일반식 -C(O)-X (여기서 X은 전형적으로 지방족, 지환족 또는 방향족임)을 갖는다. 예들은 지방족 카보닐, 방향족 카보닐, 지방족 설포닐, 방향족 설피닐, 지방족 설피닐, 방향족 포스페이트, 지방족 포스페이트 등을 포함한다. 아실 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지환족"은 환형 환계를 의미하고, 상기 환은 지방족이다. 환계는 1 이상의 환를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 하나의 환은 지방족이다. 바람직한 지환족은 환 중 약 5 내지 약 9 개의 탄소 원자를 갖는 환를 포함한다. 지환족은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지방족"은 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하는 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미하고, 상기 임의의 2 개의 탄소 원자 사이의 포화는 단일, 이중 또는 삼중결합이다. 지방족 그룹은 바람직하게는 1 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1 내지 약 12의 탄소 원자를 함유하고, 1 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 지방족 그룹의 곧은 또는 분지된 사슬은 질소, 산소, 황 및 인을 포함하는 1 이상의 헤테로원자로 방해될 수 있다. 헤테로원자에 의해 방해된 그와 같은 지방족 그룹은 비제한적으로, 폴리알콕시, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민, 및 폴리이민을 포함한다. 지방족 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알콕시"는 알킬 기와 산소 원자 사이에 형셩된 라디칼을 의미하고, 상기 산소 원자는 알콕시 기를 모 분자에 부착하도록 사용된다. 알콕시 기의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시, n-헥소시 등. 알콕시 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노알킬"은 아미노 치환된 C1-C12 알킬 라디칼을 의미한다. 라디칼의 알킬부는 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 아미노 그룹은 임의의 위치에 있을 수 있고 아미노알킬 그룹은 알킬 및/또는 아미노 부분에서 추가 치환기 그룹으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아랄킬" 및 "아릴알킬"은 C1-C12 알킬 라디칼에 공유 결합된 방향족 그룹을 의미한다. 수득한 아랄킬 (또는 아릴알킬) 그룹의 알킬 라디칼 부는 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 예는 제한 없이, 벤질, 페네틸 등을 포함한다. 아랄킬 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 알킬, 아릴, 또는 라디칼 그룹을 형성하는 둘 모두 그룹에 부착된 추가 치환기 그룹을 임의로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아릴" 및 "방향족"은 1 이상의 방향족 환를 갖는, 단환 또는 다환식 탄소환식 환계 라디칼을 의미한다. 아릴 기의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 이데닐 등. 바람직한 아릴 환계는 1 이상의 환 중 약 5 내지 약 20 개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
"개선"은 병태 또는 질환의 중증도의 적어도 하나의 지표를 감경, 완화, 정지, 또는 반전시키는 것을 의미한다. 지표의 중증도는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있는 주관적 또는 객관적 척도에 의해서 결정될 수 있다.
"동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 원숭이 및 침팬지를 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 비-인간 영장류를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 인간 또는 비-인간 동물을 나타낸다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물의 그의 표적 핵산에 대한 혼성화에 기인할 수 있는 임의의 검출 가능하거나 측정 가능한 활성을 의미한다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해서 암호화된 단백질의 양 또는 발현의 감소이다. "안티센스 화합물"은 수소 결합을 통해서 표적 핵산에 대한 혼성화를 겪을 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다. 안티센스 화합물의 예시는 단일 가닥 및 이중 가닥 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, ssRNA, 및 점유도-기반 화합물을 포함한다.
"안티센스 화합물"은 수소 결합을 통해서 표적 핵산에 대한 혼성화를 겪을 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다. 안티센스 화합물의 예시는 단일 가닥 및 이중 가닥 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, ssRNA, 및 점유도-기반 화합물을 포함한다.
"안티센스 억제"는 안티센스 화합물의 부재 하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준에 비해, 표적 핵산에 대해 상보적인 안티센스 화합물의 존재 하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다. "안티센스 기전"은 표적 핵산을 갖는 화합물의 혼성화를 포함하는 모든 기전이며, 여기서 상기 혼성화의 결과 또는 효과는 예를 들어 전사 또는 스플라이싱을 포함하는 세포 기작의 수반된 스톨링(stalling)을 갖는 표적 저하 또는 표적 점유이다.
"안티센스 기전"은 표적 핵산을 갖는 화합물의 혼성화를 포함하는 모든 기전이며, 여기서 상기 혼성화의 결과 또는 효과는 예를 들어 전사 또는 스플라이싱을 포함하는 세포 기작의 수반된 스톨링(stalling)을 갖는 표적 저하 또는 표적 점유이다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 상응하는 분절에 대한 혼성화를 허용하는 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. "염기 상보성"은 표적 핵산 (즉, 혼성화)에서의 상응하는 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 정확한 염기 짝짓기에 대한 능력을 지칭하며, 이는 상응하는 핵염기 사이의 왓슨-크릭, 후그스텐 또는 역방향 후그스텐 수소 결합을 지칭한다.
"염기 상보성"은 표적 핵산 (즉, 혼성화)에서의 상응하는 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 정확한 염기 짝짓기에 대한 능력을 지칭하며, 이는 상응하는 핵염기 사이의 왓슨-크릭, 후그스텐 또는 역방향 후그스텐 수소 결합을 지칭한다.
"이환식 당"은 두 개의 원자의 가교화 (bridging)에 의해서 변형된 푸로실 환을 의미한다. 이환식 당은 변형된 당이다.
"이환식 핵산" (또는 BNA)는 당 환의 두 개의 탄소 원자를 결합하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖고, 이로써 이환식 환계를 형성하는 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 가교는 당 환의 4'-탄소 및 2' 탄소를 연결한다.
"캡 (cap) 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 임의의 하나의 말단에 포함된 화학적 변형을 의미한다.
"탄수화물"은 자연 발생 탄수화물, 변형된 탄수화물, 또는 탄수화물 유도체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탄수화물 클러스터"는 스캐폴드 또는 링커 그룹에 부착된 1 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 화합물을 의미한다. 예를 들면 하기 (참고: Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, 이것은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있음, 또는 Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med . Chem . 2004, (47): 5798-5808 (탄수화물 콘주게이트 클러스터의 예시로)).
"탄수화물 유도체"는 탄수화물을 개시 물질 또는 중간체로서 사용하여 합성될 수 있는 임의의 화합물을 의미한다.
"cEt" 또는 "제한된 에틸"은 4'-탄소 및 2' 탄소를 연결하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 이환식 뉴클레오시드를 의미하며, 이때 상기 가교는 하기 화학식을 갖는다: 4’-CH(CH3)-O-2'.
"cEt 변형된 뉴클레오시드" (또한 "제한된 에틸 뉴클레오시드")는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"화학적으로 구분되는 영역"은 특정 점에서 동일한 안티센스 화합물의 또 다른 영역과 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드를 갖는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형이 없는 뉴클레오시드를 갖는 영역과 화학적으로 구분된다.
"화학적 변형"은 자연 발생 대응물과 비교할 때 화합물에서 화학적 차이를 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형은 뉴클레오시드 변형 (당 모이어티 변형 및 핵염기 변형 포함) 및 뉴클레오시드간 연결 변형을 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 관하여, 화학적 변형은 핵염기 서열에서 단지 차이를 포함하지 않는다.
"키메라 안티센스 화합물"은 적어도 두 개의 화학적으로 구분되는 영역을 갖고, 각 위치는 다수의 하부단위를 갖는 안티센스 화합물을 의미한다.
"절단가능 결합"은 분열될 수 있는 임의의 화학 결합을 의미한다. 특정 구현예에서, 절단가능 결합은 하기 중으로부터 선택된다: 아미드, 폴리아미드, 에스테르, 에테르, 포스포디에스테르의 에스테르 하나 또는 둘 모두, 포스페이트 에스테르, 카바메이트, 디-설파이드, 또는 펩티드.
"절단가능 모이어티"는 생리적 조건 하에서 분열될 수 있는 결합 또는 그룹을 의미한다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 세포 또는 아-세포성 구획, 예컨대 용해소체 내에서 절단된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 내인성 효소, 예컨대 뉴클레아제에 의해 절단된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 그 초과의 4 개의 절단가능 결합을 갖는 원자의 그룹을 포함한다.
"공동-투여"는 개체에게 두 개 이상의 약제학적 제제를 투여하는 것을 의미한다. 두 개 또는 그 이상의 약제학적 제제는 단일 약제학적 조성물 내에 존재할 수 있거나, 별개의 약제학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 약제학적 제제 각각은 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 공동-투여는 병행 또는 순차적 투여를 포함한다.
"상보성"은 제1 핵산과 제2 핵산의 핵염기 사이의 짝짓기 능력을 의미한다.
본 명세서 전체에서, "포함하다" 또는 이것의 변형인 "포함하는" 등의 용어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 집합들을 포함한다는 뜻이나, 그 밖의 다른 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 집합들이 배제된다는 뜻이 아님이 이해될 것이다.
"콘주게이트" 또는 "콘주게이트 그룹"은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머 화합물에 결합된 원자 또는 원자의 그룹을 의미한다. 일반적으로, 콘주게이트 그룹은 약동학적, 약력학적, 결합, 흡수, 세포성 분포, 세포성 흡수, 전하 및/또는 청소능 특성을 비제한적으로 포함하는, 부착된 화합물의 1 이상의 특성을 변형시킨다.
콘주게이트 그룹의 문맥 중 "콘주게이트 링커" 또는 "링커"는 임의의 원자 또는 원자의 그룹을 포함하고 (1) 올리고뉴클레오티드를 콘주게이트 그룹의 또 하나의 부분 또는 (2) 콘주게이트 그룹의 2 이상의 부분에 공유 결합하는 콘주게이트 그룹의 구분을 의미한다.
콘주게이트 그룹은 올리고머 화합물 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 공유 결합을 형성하는 결합을 제공하는 라디칼로서 본원에서 보여진다. 특정 구현예에서, 올리고머 화합물 상의 부착점은 올리고머 화합물의 3' 말단 뉴클레오시드의 3'-하이드록실 그룹의 3'-산소 원자이다. 특정 구현예에서 올리고머 화합물 상의 부착점은 올리고머 화합물의 5' 말단 뉴클레오시드의 5'-하이드록실 그룹의 5'-산소 원자이다. 특정 구현예에서, 올리고머 화합물에 대한 부착을 형성하는 결합은 절단가능 결합이다. 특정 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 절단가능 결합은 절단가능 모이어티의 모두 또는 일부를 구성한다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티 (예를 들면, 절단가능 결합 또는 절단가능 뉴클레오시드) 및 탄수화물 클러스터 부분, 예컨대 GalNAc 클러스터 부분을 포함한다. 그와 같은 탄수화물 클러스터 부분은 하기를 포함한다: 표적 모이어티, 및 임의로, 콘주게이트 링커. 특정 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 리간드의 수 및 동일성에 의해 확인된다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 3 개의 GalNAc 그룹을 포함하고 "GalNAc3"로 칭한다. 특정 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 4 개의 GalNAc 그룹을 포함하고 "GalNAc4"로 칭한다. (구체적인 연결기, 분지화 및 콘주게이트 링커 그룹을 갖는) 구체적인 탄수화물 클러스터 부분은 본원에서 기재되어 있고, 로마 숫자 그 다음 하첨자 "a"로 지정된다. 따라서 "GalNac3-1a"는 3 개의 GalNAc 그룹을 갖는 콘주게이트 그룹 및 구체적으로 확인된 연결기, 분지화 및 연결 그룹의 구체적인 탄수화물 클러스터 부분을 의미한다. 그와 같은 탄수화물 클러스터 단편은 절단가능 모이어티, 예컨대 절단가능 결합 또는 절단가능 뉴클레오시드를 통해 올리고머 화합물에 부착된다.
"콘주게이트 화합물"은 임의의 원자, 원자의 그룹, 또는 콘주게이트 그룹으로서 사용하기에 적당한 연결된 원자의 그룹을 의미한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 화합물은 약동학적, 약력학적, 결합, 흡수, 세포성 분포, 세포성 흡수, 전하 및/또는 청소능 특성을 비제한적으로 포함하는 1 이상의 특성을 보유하거나 부여할 수 있다.
"인접 핵염기"는 서로에 대해 바로 인접한 핵염기를 의미한다.
"설계" 또는 "~를 위하여 설계된"은 선택된 핵산 분자와 특히 혼성화하는 올리고머 화합물을 창조하는 과정을 지칭한다.
"희석제"는 약물학적 활성을 결여하고 있지만, 약제학적으로 필요하거나 바람직한 조성물 내의 성분을 의미한다. 예를 들어, 주사용 약물 내의 희석제는 액체, 예를 들어, 식염수일 수 있다.
"용량"은 단일 투여에서, 또는 명시된 기간 동안에 제공된 약제학적 제제의 명시된 양을 의미한다. 특정 구현예에서, 용량은 하나, 둘 또는 그 이상의 볼러스 (boluses), 정제, 또는 주사제로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여를 원하는 특정 구현예에서, 원하는 용량은 단일 주사에 의해서 쉽게 수용되지 않는 용적을 필요로 하며, 따라서 두 개 또는 그 이상의 주사제를 사용하여 원하는 용량을 달성할 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 장시간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주, 또는 개월 당 약제학적 제제의 양으로 언급될 수 있다.
"다운스트림(downstream)"은 핵산의 3' 말단 또는 C-말단으로의 상대적인 방향을 지칭한다.
병태를 치료 또는 예방의, 또는 이의 활성을 조절하는 맥락에서 "효과적인 양"은 그러한 조절, 치료, 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 약제학적 제제의 그와 같은 양을, 그러한 병태의 치료 또는 예방 또는 개선을 위하여, 또는 그러한 병태의 효과 조절에 대해 효과적인, 단일 투여 또는 일련의 것 중 부분으로 투여하는 것을 의미한다. 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체 조건, 치료될 개체의 분류군, 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태의 평가, 및 그 밖의 다른 관련된 인자에 따라 개체들 사이에서 달라질 수 있다.
"효능"은 원하는 효과를 생성하는 능력을 의미한다.
"발현"은 유전자 암호화된 정보가 세포 내에서 존재 및 작동하는 구조로 전환되는 모든 기능을 포함한다. 그러한 구조는 비제한적으로 전사 및 번역의 생성물을 포함한다.
"완전히 상보적" 또는 "100% 상보적"은 제1 핵산의 핵염기 서열의 각각의 핵염기가 제2 핵산의 제2 핵염기 서열 내에 상보적인 핵염기를 갖는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 제2 핵산이다.
"갭머 (gapmer)"는 RNase H 분해를 지지하는 다수의 뉴클레오시드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오시드를 갖는 외부 영역들 사이에 배치된 키메라 안티센스 화합물을 의미하며, 여기에서 내부 영역을 구성하는 뉴클레오시드는 외부 영역을 구성하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드들과 화학적으로 구분된다. 내부 영역은 "갭"으로 지칭될 수 있으며, 외부 영역은 "윙 (wing)"으로 지칭될 수 있다.
"할로" 및 "할로겐"은, 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 의미한다.
"헤테로아릴," 및 "헤테로방향족"은, 단환식 또는 다환식 방향족 환, 환계 또는 융합 환계를 포함하는 라디칼을 의미하고, 여기서 환 중 적어도 하나는 방향족이고 1 이상의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴은 또한, 융합 환 중 1 이상이 헤테로원자를 함유하지 않는 시스템을 포함하는 융합 환계를 포함하는 것을 의미한다. 헤테로아릴 그룹은 전형적으로, 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 하나 이상의 환 원자를 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등. 헤테로아릴 라디칼은 연결 모이어티 예컨대 지방족 그룹 또는 헤테로 원자를 통해 모 분자에 부착될 수 있다. 헤테로아릴 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
"혼성화"는 상보적 핵산 분자의 어닐링 (annealing)을 의미한다. 특정 구현예에서, 상보적 핵산 분자는 비제한적으로 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 상보적 핵산 분자는 비제한적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 핵산 표적을 포함한다.
"염증성 질환을 갖는 동물을 동정하는 것"은 염증성 질환을 갖는 것으로 진단되었거나 염증성 질환을 발병할 소인이 있는 동물을 동정하는 것을 의미한다. 염증성 질환을 발병할 소인이 있는 개체는 하나 이상의 염증성 질환에 개인 또는 가족력, 또는 유전적 소인을 갖는 환경적 요인을 포함하는 염증성 질환의 발병에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체를 포함한다. 그러한 동정은 개체의 병력 및 표준 임상 시험 또는 평가, 예컨대 유전자 시험을 평가하는 단계를 포함하는 임의의 방법에 의하여 수반될 수 있다.
"PKK 연관된 질환을 갖는 동물을 동정하는 것"은 PKK 연관된 질환으로 진단되었거나 PKK 연관된 질환을 발병할 소인이 있는 동물을 동정하는 것을 의미한다. PKK 연관된 질환을 발병할 소인이 있는 개체는 하나 이상의 PKK 연관된 질환에 개인 또는 가족력, 또는 유전적 소인을 포함하는 PKK 연관된 질환의 발병에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체를 포함한다. 그러한 동정은 개체의 병력 및 표준 임상 시험 또는 평가, 예컨대 유전자 시험을 평가하는 단계를 포함하는 임의의 방법에 의하여 수반될 수 있다.
"혈전색전성 질환을 갖는 동물을 동정하는 것"은 혈전색전성 질환으로 진단되었거나 혈전색전성 질환을 발병할 소인이 있는 동물을 동정하는 것을 의미한다. 혈전색전성 질환을 발병하는 소인을 가진 개체는 개인 또는 가족력, 또는 혈전색전성 질환, 부동성, 수술 (특히 정형외과적 수술), 악성종양, 임신, 노령, 구강 피임제의 사용, 심방 세동, 과거 혈전색전성 병태, 만성 염증성 질환 및 유전성 또는 후천성 예비혈전성 응고 장애 중 하나 이상의 유전적 소인을 포함하는 혈전색전성 질환 발병에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체들을 포함한다. 그러한 동정은 개체의 병력 및 표준 임상 시험 또는 평가, 예컨대 유전자 시험을 평가하는 단계를 포함하는 임의의 방법에 의하여 수반될 수 있다.
"바로 인접한"은 바로 인접한 요소들 사이에 개입성 요소가 없는 것을 의미한다. "개체" 는 치료 또는 치료법을 위해서 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"개체" 는 치료 또는 치료법을 위해서 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"PKK 억제"는 PKK mRNA 및/또는 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, PKK mRNA 및/또는 단백질 수준은, PKK 안티센스 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서 PKK mRNA 및/또는 단백질 수준의 발현과 비교하여, PKK를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PKK 표적화하는 안티센스 화합물의 존재 하에서 억제된다.
"발현 또는 활성을 억제하는"은 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 나타내며, 반드시 발현 또는 활성의 전체 제거를 나타내지는 않는다.
"뉴클레오시드간 연결"은 뉴클레오시드들 사이의 화학적 결합을 나타낸다.
"뉴클레오시드간 중성 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오시드를 직접적으로 연결하는 중성 연결 그룹을 의미한다.
"뉴클레오시드간 인 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오시드를 직접적으로 연결하는 인 연결 그룹을 의미한다.
"연결 모티프"는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 영역에서 연결 변형의 패턴을 의미한다. 그와 같은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드는 변형 또는 비변형될 수 있다. 달리 지적되지 않으면, 연결을 단지 기재하는 본원의 모티프는 연결 모티프인 것으로 의도된다. 따라서, 그와 같은 경우에, 뉴클레오시드는 제한되지 않는다.
"연결된 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드간 연결에 의하여 함께 연결된 인접한 뉴클레오시드를 의미한다.
"잠금 핵산" 또는 "LNA" 또는 "LNA 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드 당 단위의 4' 및 2' 위치 사이의 두 개의 탄소 원자를 연결하여, 이로써 이환식 당을 형성하는, 가교를 갖는 핵산 모노머를 의미한다. 이환식 당의 예시는, 비제한적으로, 하기와 같이 A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4’-CH2-O-2’) LNA, (C) 에틸렌옥시 (4’-(CH2)2-O-2’) LNA, (D) 아미노옥시 (4’-CH2-O-N(R)-2’) LNA 및 (E) 옥시아미노 (4’-CH2-N(R)-O-2’) LNA를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, LNA 화합물은, 비제한적으로, 당의 4' 및 2' 위치 사이의 적어도 하나의 가교를 갖는 화합물을 포함하고, 여기서 상기 가교 중 각각은 독립적으로, -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- 및 -N(R1)-부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 내지 4개의 연결기를 포함하고; 여기서 x는 0, 1, 또는 2이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 각각의 R1 및 R2는, 독립적으로, H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로환 라디칼, 치환된 헤테로환 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; 그리고 각각의 J1 및 J2는, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로환 라디칼, 치환된 헤테로환 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
LNA 정의 내에 포괄된 4' - 2' 가교기의 예시는, 다음 화학식 중 하나를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)-. 더욱이, LNA의 정의 내에서 포괄된 다른 가교 그룹은 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' 및 4'-CH2-N(R1)-O-2'- 가교이고, 이때 R1 및 R2 각각은 독립적으로, H, 보호기, 또는 C1-C12 알킬이다.
또한 본 발명에 따른 LNA의 정의 내에 포함된 것은 리보실 당 환의 2'-히드록실 기가 당 환의 4' 탄소 원자와 연결되어, 이로써 이환식 당 모이어티를 형성하는 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 가교를 형성하는 LNA이다. 상기 가교는 또한 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 (-CH2-) 기일 수 있으며, 이에 대해 용어 메틸렌옥시 (4’-CH2-O-2’) LNA가 사용된다. 더욱이, 이러한 위치에서 에틸렌 가교 그룹을 갖는 이환식 당 모이어티의 경우에서, 용어 에틸렌옥시 (4’-CH2CH2-O-2’) LNA가 사용된다. α-L- 메틸렌옥시 (4’-CH2-O-2’), 메틸렌옥시 (4’-CH2-O-2’) LNA의 이성질체는 또한 본원에 사용된 바와 같이 LNA의 정의 내에 포괄된다.
"미스매치 (mismatch)" 또는 "비-상보적 핵염기"는 제1 핵산의 핵염기가 제2 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 짝짓기 할 수 없는 경우를 나타낸다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 천연적으로 발생하는 뉴클레오시드간 결합 (즉, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합)으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 나타낸다.
"변형된 핵염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘 (또한 5-메틸우라실로 알려짐), 또는 우라실이 아닌 임의의 핵염기를 나타낸다. "비변형된 핵염기"는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오시드"는 독립적으로, 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결, 변형된 당, 및/또는 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당 모이어티로부터의 치환 또는 임의의 변화를 나타낸다.
용어 "단환 또는 다환식 환계"는 단환 또는 다환식 라디칼 환계로부터 선택된 모든 환계를 포함하는 것을 의미하고, 상기 환은 융합 또는 연결되고, 지방족, 지환족, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 아릴알킬, 헤테로환, 헤테로아릴, 헤테로방향족 및 헤테로아릴알킬로부터 개별적으로 선택된 단일 및 혼합된 환계를 포함하는 것을 의미한다. 그와 같은 단환식 및 다환식 환형 구조는, 각각이 동일한 수준의 포화를 갖거나, 각각이, 독립적으로, 완전 포화된, 부분적으로 포화된 또는 완전 불포화된을 포함하는 가변 포화도를 갖는 환를 함유할 수 있다. 각각의 환은 C, N, O 및 S로부터 선택된 환 원자를 포함하여 헤테로환 뿐만 아니라 혼합된 모티프 예컨대 벤즈이미다졸에서 존재할 수 있는 C 환 원자만을 포함하는 환를 얻을 수 있고, 여기서 하나의 환은 유일한 탄소 환 원자를 가지며 융합 환은 2 개의 질소 원자를 갖는다. 단환 또는 다환식 환계는 치환기 그룹 예컨대 환 중의 하나에 부착된 2개의 =O 그룹을 갖는 프탈이미드로 추가로 치환될 수 있다. 단환 또는 다환식 환계는 다양한 전략을 사용하여 예컨대 직접적으로 환 원자를 통해 모 분자에 부착될 수 있고, 다중 환 원자를 통해, 치환기 그룹을 통해 또는 이작용성 연결 모이어티를 통해 융합될 수 있다.
"모노머"는 올리고머의 단일 단위를 의미한다. 모노머는 비제한적으로 천연 발생하거나, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 포함한다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내에서 비변형 및 변형된 뉴클레오시드의 패턴을 의미한다.
"천연 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH)에서 발견되는 당 모이어티를 의미한다.
"천연적으로 발생하는 뉴클레오시드간 연결"은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 연결을 의미한다.
"중성 연결 그룹"은 충전되지 않은 연결 그룹을 의미한다. 중성 연결 그룹은 비제한적으로 하기를 포함한다: 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), 아미드-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), 아미드-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), 포름아세탈 (-O-CH2-O-), 및 티오포름아세탈 (-S-CH2-O-). 추가의 중성 연결 그룹은 실록산 (디알킬실록산), 카복실레이트 에스테르, 카복사마이드, 설파이드, 설포네이트 에스테르 및 아미드를 포함하는 비이온성 연결을 포함한다 (참고 예를 들면: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, (pp. 40-65)). 추가의 중성 연결 그룹은 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 포함하는 비이온성 연결을 포함한다.
"비-상보적 핵염기"는 다른 하나와 수소 결합을 형성하거나 달리 혼성화를 지지하지 않는 핵염기 쌍을 지칭한다.
"비-뉴클레오시드간 중성 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오시드를 직접적으로 연결하지 않는 중성 연결 그룹을 의미한다. 특정 구현예에서, 비-뉴클레오시드간 중성 연결 그룹은 뉴클레오시드를 뉴클레오시드 이외의 그룹에 연결한다. 특정 구현예에서, 비-뉴클레오시드간 중성 연결 그룹은 2 개의 그룹을 연결하고, 이것 중 특정 것도 뉴클레오시드가 아니다.
"비-뉴클레오시드간 인 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오시드를 직접적으로 연결하지 않는 인 연결 그룹을 의미한다. 특정 구현예에서, 비-뉴클레오시드간 인 연결 그룹은 뉴클레오시드를 뉴클레오시드 이외의 그룹에 연결한다. 특정 구현예에서, 비-뉴클레오시드간 인 연결 그룹은 2 개의 그룹을 연결하고, 이것 중 특정 것도 뉴클레오시드가 아니다.
"핵산"은 모노머 뉴클레오티드로 구성된 분자를 지칭한다. 핵산에는 비제한적으로, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 소형 개입성 리보핵산 (siRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)가 포함된다.
"핵염기"는 또 다른 핵산의 염기와 짝짓기 할 수 있는 헤테로환 모이어티를 의미한다.
"핵염기 상보성"은, 또 하나의 핵염기와 염기 짝짓기할 수 있는 핵염기를 지칭한다. 예를 들면, DNA에서, 아데닌 (A)은 티민 (T)에 대해 상보적이다. 예를 들면, RNA에서, 아데닌 (A)은 우라실 (U)에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 상보적 핵염기는 그것의 표적 핵산의 핵염기와 염기 짝짓기할 수 있는 안티센스 화합물의 핵염기를 지칭한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 있는 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치에서 핵염기와 수소 결합할 수 있다면, 이때 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사아의 수소 결합의 위치는 핵염기쌍에서 상보적인 것으로 간주된다.
"핵염기 변형 모티프"는 올리고뉴클레오티드에 따른 핵염기에 대한 변형의 패턴을 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 핵염기 변형 모티프는 핵염기 서열에 독립적이다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 연결 및/또는 핵염기 변형에 독립적인 인접 핵염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오시드 모방체"는 당 또는 당 및 염기, 및 반드시는 아니지만 예를 들어, 모폴리노, 사이클로헥세닐, 사이클로헥실, 테트라하이드로피라닐, 바이사이클로 또는 트리사이클로 당 모방체, 예를 들어, 비-푸라노스 당 단위를 갖는 뉴클레오시드 모방체와 같은 올리고머 화합물의 하나 또는 그 이상의 위치에서의 연결을 대체시키기 위해서 사용된 이들 구조를 포함한다. 뉴클레오티드 모방체는 뉴클레오시드 및 하나 이상의 위치에서의 연결을, 예를 들어, 펩티드 핵산 또는 모폴리노 (-N(H)-C(=O)-O- 또는 다른 비-포스포디에스테르 연결에 의해서 연결된 모폴리노)와 같은 올리고머 화합물로 대체하기 위하여 사용된 이들 구조를 포함한다. "당 대용물"은 조금 더 넓은 용어 "뉴클레오시드 모방체"와 중복되나, 오직 당 단위 (푸라노스 환)의 대체를 지시하도록 의도된다. 본원에 제공된 테트라히드로피라닐 환은 당 대용물의 예로 예시되고, 이때 푸라노스 당 그룹은 테트라히드로피라닐 환계로 대체되었다. "모방체"는 당, 핵염기, 및/또는 뉴클레오시드간 연결을 대신하는 그룹을 지칭한다. 일반적으로, 모방체는 당 또는 당-뉴클레오시드간 연결 조합에서 사용되고, 핵염기는 선택된 표적으로의 혼성화를 위하여 유지된다.
"뉴클레오시드 모티프"는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 영역에서 뉴클레오시드 변형의 패턴을 의미한다. 그와 같은 올리고뉴클레오티드의 연결은 변형 또는 비변형될 수 있다. 달리 지적되지 않으면, 뉴클레오시드를 단지 기재하는 본원의 모티프는 뉴클레오시드 모티프인 것으로 의도된다. 따라서, 그와 같은 경우에, 연결은 제한되지 않는다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"오프-타겟 효과"는 의도된 표적 핵산 이외의 유전자의 RNA 또는 단백질 발현 조절과 연관된 원하지 않거나 유해한 생물학적 효과를 지칭한다.
"올리고머 화합물" 또는 "올리고머"는 적어도 하나의 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는, 연결된 모노머 하부단위의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 각각 서로 독립적으로 변형되거나 비변형될 수 있는 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
"비경구 투여"는 주사 (예컨대 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들어, 척추강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
"펩티드"는 아미드 결합에 의해 적어도 두 개의 아미노산을 연결시킴으로써 형성된 분자를 의미한다. 제한 없이, 본원에서 사용된 바와 같이, 펩티드는 폴리펩티드 및 단백질을 지칭한다.
"약제학적 제제"는 개체에게 투여하였을 때 치료학적 이점을 제공하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, PKK에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 약제학적 제제이다.
"약제학적 조성물"은 개체에게 투여하는데 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한 유도체"는 본 명세서에 기술된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 콘주게이트, 프로드럭 (prodrug) 또는 이성질체를 포괄한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 안티센스 화합물의 생리적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 올리고뉴클레오티드의 원하는 생물학적 활성을 유지하며, 원치 않는 독물학적 효과를 그에 부여하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 연결"은 포스포디에스테르 결합이 비-가교화 산소 원자들 중의 하나를 황 원자로 대체시킴으로써 변형된 뉴클레오시드들 사이의 연결을 의미한다. 포스포로티오에이트 연결은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
"인 연결 그룹"은 인 원자를 포함하는 연결 그룹을 의미한다. 인 연결 그룹은 하기 식을 갖는 그룹을 비제한적으로 포함한다:
상기 식 중에서,
Ra 및 Rd 각각은, 독립적으로, O, S, CH2, NH, 또는 NJ1이고 여기서 J1은 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
Rb 는 O 또는 S이고;
Rc은 OH, SH, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, 아미노 또는 치환된 아미노이고; 그리고
J1은 Rb는 O 또는 S이다.
인 연결 그룹은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로티오아미데이트, 티오알킬포스포네이트, 포스포트리에스테르, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트.
"PKK"는 인간 혈장 프리칼리크레인을 포함하는 포유류 혈장 프리칼리크레인을 의미한다. 혈장 프리칼리크레인 (PKK)은, KLKB1 유전자로부터 암호화된 혈장 칼리크레인 (PK)의 전구체이다.
"PKK 연관된 질환"은 임의의 PKK 핵산 또는 이의 발현 생성물과 연관된 임의의 질환을 의미한다. 그러한 질환은 염증성 질환 또는 혈전색전성 질환을 포함할 수 있다. 그러한 질환은 유전성 혈관부종 (HAE)을 포함할 수 있다.
"PKK mRNA"는 PKK를 암호화하는 임의의 DNA 서열의 메신저 RNA 생성물을 의미한다.
"PKK 핵산"은 PKK를 암호화하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, PKK 핵산은 PKK를 암호화한 DNA 서열, PKK를 암호화한 DNA (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA를 포함)로부터 전사된 RNA 서열, 및 PKK를 암호화한 mRNA 서열을 포함한다. "PKK mRNA"는 PKK 단백질을 암호화한 mRNA를 의미한다.
"PKK 단백질"은 PKK 핵산의 폴리펩티드 발현 생성물을 의미한다.
"부분"은 핵산의 인접 (즉, 연결된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. 특정 구현예에서, 구분은 표적 핵산의 인접 핵염기의 규정된 수이다. 특정 구현예에서, 부분은 안티센스 화합물의 인접 핵염기의 규정된 수를 의미한다.
"예방하다"는 질환, 장애 또는 상태의 시작 또는 발생을 몇 분으로부터 무한대까지의 기간 동안 지연시키거나 미연에 방지하는 것을 나타낸다.
"프로드럭"은 내인성 효소 또는 다른 화학물질 또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 그의 세포 내에서 활성 형태 (즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조된 치료제를 의미한다.
"예방학적 유효량"은 예방학적 또는 방지적 이점을 동물에게 제공하는 약제학적 제제의 양을 의미한다.
"보호기"는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 임의의 화합물 또는 보호기를 의미한다. 보호기의 비-제한적인 예는 하기에서 발견될 수 있다: "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts , ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, New York” (이의 전문이 본원에 참조로 인용됨).
"영역"은 적어도 하나의 식별가능한 구조, 기능 또는 특성을 갖는 표적 핵산의 부분으로서 정의된다.
"리보뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 당 부분의 2' 위치에 히드록시를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 리보뉴클레오티드는 다양한 치환체 중의 임의의 것에 의해서나 변형될 수 있다.
"RISC 기반 안티센스 화합물"은 안티센스 화합물을 의미하고, 여기서 안티센스 화합물의 안티센스 활성의 적어도 일부는 RNA 유도된 사일런싱 복합체 (RISC)가 그 원인이다.
"RNase H 기반 안티센스 화합물"이란, 안티센스 화합물을 의미하고, 여기서 안티센스 화합물의 안티센스 활성의 적어도 일부는 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화 및 RNase H에 의한 표적 핵산의 차후의 절단이 그 원인이다.
"염"은 안티센스 화합물의 생리적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 올리고뉴클레오티드의 원하는 생물학적 활성을 유지하며, 원치 않는 독물학적 효과를 그에 부여하지 않는 염을 의미한다.
"분절"은 표적 핵산 내의 더 작거나 아-부분의 영역으로서 정의된다.
"별개의 영역"은 올리고뉴클레오티드의 부분을 의미하고, 상기 화학적 변형 또는 임의의 인접하는 구분의 화학적 변형의 모티프는 별개의 영역이 서로 구별되도록 하는 적어도 하나의 차이를 포함한다.
"서열 모티프"는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 부분을 따라 배열된 핵염기의 패턴을 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 서열 모티프는 화학적 변형에 독립적이고 따라서 화학적 변형을 포함하지 않으면서 화학적 변형의 임의의 조합을 가질 수 있다.
"부작용"은 원하는 효과 이외에 치료에 기인하는 생리적 반응을 의미한다. 특정 구현예에서, 부작용은 비제한적으로 주사 부위 반응, 간 기능 시험 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상, 근병증, 및 권태감을 포함한다.
"단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적 가닥에 혼성화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위"는 표적 핵산 내의 특별한 핵염기 위치로 정의된다.
"특이적으로 혼성화할 수 있는" 또는 "특이적으로 혼성화하는"은 특이적 결합이 바람직한 조건 하에서, 즉 생체내 검정 및 치료학적 치료의 경우에 생리적 조건 하에서, 비-표적 핵산에 대해서는 최소의 효과를 나타내거나 효과를 나타내지 않으면서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에서 원하는 효과를 유도하기에 충분한 정도의 상보성을 갖는 안티센스 화합물을 지칭한다.
"엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물이 이의 표적 서열에 혼성화하나, 다른 서열의 최소 수로 혼성화할 것인 조건을 의미한다.
"대상체"는 치료 또는 치료법을 위해서 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"치환기" 및 "치환기 그룹"은, 명명된 모 화합물의 원자 또는 그룹을 대체하는 원자 또는 그룹을 의미한다. 예를 들면 변형된 뉴클레오시드의 치환그룹은 자연 발생 뉴클레오시드에서 발견된 원자 또는 그룹과 상이한 임의의 원자 또는 그룹이다 (예를 들면, 변형된 2'-치환그룹은 H 또는 OH 이외의 뉴클레오시드의 2'-위치에 있는 임의의 원자 또는 그룹이다). 치환기 그룹은 보호 또는 비보호될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 화합물은 모 화합물의 하나 또는 하나 초과의 위치에서 치환기를 갖는다. 치환그룹은 또한, 다른 치환기 그룹으로 추가로 치환될 수 있고 직접적으로 또는 연결 그룹 예컨대 알킬 또는 하이드로카르빌 그룹을 통해 모 화합물에 부착될 수 있다.
마찬가지로, 본원에서 사용된 바와 같이, 화학적 관능 그룹에 관한 "치환기"는 명명된 관능 그룹에 통상적으로 존재하는 원자 또는 원자의 그룹과 상이한 원자 또는 원자의 그룹을 의미한다. 특정 구현예에서, 치환그룹은 관능 그룹의 수소 원자를 대체한다 (예를 들면, 특정 구현예에서, 치환된 메틸 그룹의 치환그룹은 비치환된 메틸 그룹의 수소 원자 중의 하나는 대체하는 수소 이외의 원자 또는 그룹이다). 달리 지적되지 않으면, 치환기로서 잘 받아들이는 그룹은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 (-C-(O)-Raa), 카복실 (-C(O)O-Raa), 지방족 그룹, 지환족 그룹, 알콕시, 치환된 옥시 (-O-Raa), 아릴, 아랄킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노 (-N(Rbb)-(Rcc)), 이미노(=NRbb), 아미도 (-C(O)N-(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)C(O)Raa), 아지도 (-N3), 니트로 (-NO2), 시아노 (-CN), 카바미도 (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)-C(O)-ORaa), 우레이도 (-N(Rbb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), 티오우레이도 (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)-(Rcc)), 구아니디닐 (-N(Rbb)-C(=NRbb)-N(Rbb)(Rcc)), 아미디닐 (-C(=NRbb)--N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), 티올 (-SRbb), 설피닐 (-S(O)Rbb), 설포닐 (-S(O)2Rbb) 및 설폰아미딜 (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)-S-(O)2Rbb). 여기서 각각의 Raa, Rbb 및 Rcc는, 독립적으로, H, 임의로 연결된 화학적 관능 그룹 또는 추가 치환기 그룹이고, 바람직한 목록은 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로사이클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함한다. 본원에서 기재된 화합물 내의 선택된 치환그룹은 반복되는 정도로 존재한다.
"치환된 당 모이어티"는 자연 발생 당 모이어티가 아닌 푸라노실을 의미한다. 치환된 당 모이어티는 2'-위치, 3'-위치, 5'-위치 및/또는 4'-위치에서 치환기를 포함하는 푸라노실을 비제한적으로 포함한다. 특정 치환된 당 모이어티는 이환식 당 모이어티이다.
"당 모이어티"는 뉴클레오시드의 자연 발생 당 모이어티 또는 변형된 당 모이어티를 의미한다.
"당 모티프"는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 영역에서 당 변형의 패턴을 의미한다.
"당 대용물"은 푸라노실을 포함하지 않고 뉴클레오시드의 자연 발생 당 모이어티를 대체할 수 있는 구조를 의미하고, 이로써 수득한 뉴클레오시드 하부단위는 함께 연결될 수 있고/거나 다른 뉴클레오시드에 연결되어 상보적 올리고머 화합물을 혼성화할 수 있는 올리고머 화합물을 형성할 수 있다. 그와 같은 구조는 푸라노실보다 상이한 원자를 포함하는 환 (예를 들면, 4, 6, 또는 7-원 환); 비-산소 원자 (예를 들면, 탄소, 황, 또는 질소)에 의한 푸라노실의 산소의 대체; 또는 원자의 수의 변화 및 산소의 대체 둘 모두를 포함한다. 그와 같은 구조는 치환된 당 모이어티를 대신하는 것 (예를 들면, 추가의 치환기를 임의로 포함하는 6-원 탄소환식 이환식 당 대용물)에 상응하는 치환을 또한 포함할 수 있다. 당 대용물은 또한 더 많은 복합 당 대체물질 (예를 들면, 펩티드 핵산의 비-환계)를 포함한다. 당 대용물은 비제한적으로 모폴리노, 사이클로헥세닐 및 사이클로헥시톨을 포함한다.
"표적"은 이의 조절을 원하는 단백질을 지칭한다.
"표적 유전자"는 표적을 암호화하는 유전자를 지칭한다.
"표적화" 또는 "표적화된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 원하는 효과를 유도할 것인, 안티센스 화합물의 설계 및 선택의 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA", "표적 RNA 전사체" 및 "핵산 전사체"는 모두 안티센스 화합물에 의해서 표적화될 수 있는 핵산을 나타낸다.
"표적 영역"은 하나 이상의 활성 안티센스 화합물이 표적화된 표적 핵산 영역의 부분을 의미한다.
"표적 분절"은 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 핵산의 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 분절의 5'-최말단 뉴클레오티드를 의미한다. "3' 표적 부위"는 표적 분절의 3'-최말단 뉴클레오티드를 의미한다.
"말단기"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단 중 하나 또는 둘 모두에 부착된 1 이상의 원자를 의미한다. 특정 구현예에서 말단그룹은 콘주게이트 그룹이다. 특정 구현예에서, 말단그룹은 1 이상의 말단기 뉴클레오시드를 포함한다.
"말단 뉴클레오시드간 연결"은 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 규정된 영역의 마지막 2 개의 뉴클레오시드의 사이의 연결을 의미한다.
"치료학적 유효량"은 개체에게 치료학적 이점을 제공하는 약제학적 제제의 양을 의미한다.
"치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 개선을 달성하기 위해서 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
"유형"의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드에 관한 "변형의 유형"은 뉴클레오시드의 화학적 변형을 의미하고 변형된 및 비변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 따라서, 달리 지적되지 않으면, "제 1 형의 변형을 갖는 뉴클레오시드"는 비변형된 뉴클레오시드일 수 있다.
"비변형된 핵염기"는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"비변형 뉴클레오티드"는 천연적으로 발생하는 핵염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오시드간 연결로 구성된 뉴클레오티드를 의미한다. 특정 구현예에서, 비변형 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-리보뉴클레오시드) 또는 DNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-데옥시리보뉴클레오시드)이다.
"업스트림(upstream)"은 핵산의 5' 말단 또는 N-말단으로의 상대적인 방향을 지칭한다.
"윙 분절"은 예컨대 개선된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도, 또는 생체내 뉴클라아제에 의한 저하에 대한 내성과 같은 올리고뉴클레오티드 특성을 부여하기 위하여 변형된 다수의 뉴클레오시드를 의미한다.
특정
구현예
특정 구현예는 인간 혈장 프리칼리크레인 (PKK) mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 화합물, 조성물, 및 방법을 제공한다. 특정 구현예는 PKK mRNA 및 단백질 수준을 억제시키기 위한 화합물, 조성물, 및 방법을 제공한다.
특정 구현예는 혈장 프리칼리크레인 (PKK) 핵산에 표적화된 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 구현예에서, PKK는 하기에 제시된 서열을 갖는다: 유전자은행 수탁 번호 NM_000892.3 (서열번호: 1과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 DC412984.1 (서열번호: 2와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CN265612.1 (서열번호: 3과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 AK297672.1 (서열번호: 4와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 DC413312.1 (서열번호: 5와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 AV688858.2 (서열번호: 6과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CD652077.1 (서열번호: 7과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 BC143911.1 (서열번호: 8과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CB162532.1 (서열번호: 9와 같이 본원에 포함), 핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19 (본원에서 서열 번호: 10과 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 NM_008455.2 (서열번호: 11과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 BB598673.1 (서열번호: 12와 같이 본원에 포함), 핵염기 6114001 내지 6144000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_039460.7 (본원에서 서열 번호: 13과 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 NM_012725.2 (서열번호: 14와 같이 본원에 포함), 핵염기 10952001 내지 10982000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NW_047473.1 (본원에서 서열 번호: 15와 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 XM_002804276.1 (서열번호: 17과 같이 본원에 포함), 및 핵염기 2358000 내지 2391000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NW_001118167.1 (본원에서 서열 번호: 18과 같이 포함).
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 30-2226의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 570의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 705의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 1666의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 570의 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 705의 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 16개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 1666의 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 62, 72, 103, 213, 312, 334-339, 344, 345, 346, 348, 349, 351, 369, 373, 381, 382, 383, 385, 387-391, 399, 411, 412, 414, 416, 444, 446-449, 452, 453, 454, 459, 460, 462-472, 473, 476, 477, 479, 480, 481, 484, 489-495, 497, 500, 504, 506, 522, 526, 535, 558, 559, 560, 564, 566, 568-571, 573, 576, 577, 578, 587, 595, 597-604, 607, 608, 610, 613, 615, 618, 619, 622, 623, 624, 633, 635, 636, 638, 639, 640, 642, 643, 645, 652, 655-658, 660, 661, 670, 674-679, 684, 685, 698, 704, 705, 707, 708, 713, 716, 717, 728, 734, 736, 767, 768, 776, 797, 798, 800, 802, 810, 815, 876, 880, 882, 883, 886, 891, 901-905, 908-911, 922, 923, 924, 931, 942, 950-957, 972, 974, 978, 979, 980, 987-991, 1005, 1017-1021, 1025, 1026, 1029, 1030, 1032, 1034, 1035, 1037, 1040, 1041, 1045, 1046, 1051, 1054, 1059, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1075, 1076, 1087, 1089, 1111, 1114, 1116, 1117, 1125, 1133, 1153, 1169, 1177, 1181, 1182, 1187, 1196, 1200, 1214, 1222, 1267, 1276, 1277, 1285, 1286, 1289, 1290, 1291, 1303, 1367, 1389, 1393, 1398-1401, 1406, 1407, 1408, 1411, 1419-1422, 1426, 1430, 1431, 1432, 1434-1437, 1439, 1440, 1443, 1444, 1451, 1452, 1471, 1516, 1527, 1535, 1537, 1538, 1539, 1540, 1541, 1563, 1564, 1567, 1568, 1616, 1617, 1623, 1629, 1664, 1665, 1666, 1679, 1687, 1734, 1804, 1876, 1886, 1915, 2008, 2018, 2100, 2101, 2115, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 80% PKK mRNA 억제를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 62, 72, 103, 213, 334-339, 344, 346, 348, 349, 351, 381, 382, 383, 385, 389, 390, 391, 446, 448, 452, 453, 454, 466-473, 476, 481, 484, 491, 492, 494, 495, 497, 504, 526, 558, 559, 566, 568-571, 576, 578, 587, 595, 597, 598, 600-604, 607, 610, 613, 618, 619, 624, 635, 638, 639, 645, 652, 656, 657, 658, 660, 674, 675, 676, 684, 698, 704, 705, 707, 713, 716, 768, 876, 880, 901-905, 908-911, 922, 923, 924, 931, 942, 951, 954-957, 972, 974, 978, 979, 987, 988, 990, 1005, 1019, 1020, 1021, 1025, 1032, 1037, 1040, 1041, 1045, 1054, 1059, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1075, 1111, 1116, 1117, 1125, 1133, 1153, 1169, 1177, 1200, 1222, 1267, 1285, 1290, 1291, 1303, 1367, 1398, 1399, 1401, 1406, 1408, 1411, 1419, 1420, 1421, 1426, 1430, 1431, 1432, 1434-1437, 1440, 1443, 1444, 1451, 1537-1540, 1563, 1616, 1679, 1687, 1804, 2008, 2101, 2115, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 85%의 PKK mRNA 억제를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 346, 351, 382, 390, 391, 446, 448, 452, 453, 468, 469, 470, 471, 472, 476, 481, 491, 495, 504, 558, 566, 568, 570, 571, 578, 587, 597, 598, 600, 604, 613, 635, 638, 645, 656, 658, 660, 674, 675, 684, 704, 705, 880, 901-905, 909, 922, 931, 951, 954, 956, 990, 1005, 1020, 1032, 1037, 1040, 1041, 1045, 1054, 1075, 1111, 1125, 1133, 1153, 1200, 1267, 1291, 1303, 1398, 1399, 1401, 1406, 1420, 1426, 1430, 1431, 1434, 1435, 1436, 1440, 1443, 1451, 1537-1540, 2115, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 90% PKK mRNA 억제를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 391, 448, 468, 469, 568, 570, 598, 635, 658, 674, 684, 705, 901, 903, 904, 922, 990, 1267, 1291, 1420, 1430, 1431, 1434, 1435, 1436, 1537, 1538, 및 1540. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 95% PKK mRNA 억제를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 338, 346, 349, 382, 383, 390, 448, 452, 453, 454, 495, 526, 559, 570, 587, 598, 635, 660, 705, 901, 903, 904, 908, 923, 931, 955, 974, 988, 990, 1020, 1039, 1040, 1111, 1117, 1267, 1291, 1349, 1352, 1367, 1389, 1393, 1399, 1401, 1408, 1411, 1426, 1499, 1516, 1535, 1544, 1548, 1563, 1564, 1568, 1569, 1598, 1616, 1617, 1623, 1624, 1643, 1661, 1665, 1666, 1673, 1679, 1695, 1720, 1804, 1817, 1876, 1881, 1886, 1940, 1947, 2008, 2018, 2019, 2031, 2044, 2100, 2101, 2115, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 0.4 이하의 IC50 (μM)를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 346, 349, 382, 453, 454, 495, 526, 570, 587, 598, 635, 660, 901, 903, 904, 931, 955, 990, 1020, 1111, 1267, 1349, 1352, 1367, 1389, 1399, 1408, 1411, 1426, 1516, 1535, 1544, 1548, 1563, 1564, 1568, 1569, 1598, 1616, 1617, 1623, 1643, 1661, 1665, 1666, 1673, 1695, 1804, 1876, 1881, 2019, 2044, 2100, 2101, 2115, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 0.3 이하의 IC50 (μM)를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 346, 382, 453, 495, 526, 570, 587, 598, 635, 901, 904, 931, 955, 1020, 1111, 1349, 1352, 1389, 1426, 1516, 1535, 1544, 1548, 1564, 1569, 1598, 1616, 1617, 1665, 1666, 1804, 1876, 1881, 2019, 2044, 2101, 및 2116. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 0.2 이하의 IC50 (μM)를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 하기 서열번호의 임의의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다: 334, 495, 587, 598, 635, 1349, 1352, 1389, 1516, 1544, 1548, 1569, 1598, 1617, 1665, 1666, 1804, 1881, 및 2019. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 0.2 미만의 IC50 (μM)를 달성한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 27362-27524와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, PKK 핵산의 엑손 9, 엑손 12, 또는 엑손 14와 동등한 길이 부분에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 서열 번호: 10에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상보적이다.
특정 구현예에서, 화합물은 단일가닥 변형된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 및 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 변형된 핵염기를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 당은 2' 변형된 당, BNA, 또는 THP이다.
특정 구현예에서, 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 제한된 에틸, LNA, 또는 3'-플루오로-HNA 중 임의의 것이다.
특정 구현예에서, 화합물은 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드, 2'-O-메틸 뉴클레오시드, 제한된 에틸 뉴클레오시드, LNA 뉴클레오시드, 또는 3'-플루오로-HNA 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는:
10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 윙 분절; 및
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 윙 분절을 포함하고;
여기서 상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 그리고 각각의 윙 분절의 각 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 20 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 19 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 18 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹으로 구성된, 화합물을 제공한다: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; 여기서
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 콘주게이트 그룹 및 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물을 제공한다: mCes mCes mCes mCes mCes Tds Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds Ads Gds mCes mCes Aes Ges mCe;
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 콘주게이트 그룹 및 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물을 제공한다: mCes Ges Aks Tds Ads Tds mCds Ads Tds Gds Ads Tds Tds mCks mCks mCe;
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
K는 cEt 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 변형된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 변형된 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 적어도 1개의 N- 아세틸갈락토사민 (GalNAc), 적어도 2개의 N- 아세틸갈락토사민 (GalNAcs), 또는 적어도 3개의 N- 아세틸갈락토사민 (GalNAcs)를 포함한다.
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 화합물을 제공한다:
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 화합물을 제공한다:
특정 구현예는 하기 화학식에 따른 화합물을 제공한다:
특정 구현예에서, 본 화합물은 본원에서 기술된 임의의 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 화합물은, 하기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다: 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열 번호: 30-2226의 핵염기 서열 중 임의의 것의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 그룹.
특정 구현예에서, 아래 화학 구조를 갖는 화합물은 5'-X를 갖는 ISIS 721744을 포함하거나 그것으로 이루어진다, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다:
특정 구현예에서, 아래 화학 구조를 갖는 화합물은 5'-X를 갖는 ISIS 546254을 포함하거나 그것으로 이루어진다, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다:
특정 구현예는 하기 화학식을 포함하거나 이로 구성된 화합물을 제공한다:
특정 구현예는 하기 화학식을 포함하거나 이로 구성된 화합물을 제공한다:
특정 구현예는 하기 화학식을 포함하거나 이로 구성된 화합물을 제공한다:
여기서 R1은 -OCH2CH2OCH3 (MOE)이고 R2는 H이거나; 또는 R1 및 R2는 함께 가교를 형성하고, 여기서 R1은 -O-이고 R2는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는-CH2CH2-이고, 그리고 R1 및 R2는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 가교는 하기로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 동일한 환 상의 R3 및 R4의 각각의 쌍에 대해, 독립적으로 각각의 환에 대해: 둘 중 하나의 R3은 H 및 -OCH2CH2OCH3로부터 선택되고 R4는 H이거나; 또는 R3 및 R4는 함께 가교를 형성하고, 여기서 R3은 -O-이고, 그리고 R4는 CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고 R3 및 R4는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 가교는 하기로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 R5는 H 및 -CH3로부터 선택되고;
그리고 Z는 S- 및 O-로부터 선택된다.
특정 구현예는 선행 청구항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예는 동물에게 선행 청구항 중 어느 한 항의 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 동물은 인간이다
특정 구현예에서, 상기 화합물의 투여는 PKK 연관된 질환 또는 장애 또는 병태를 예방, 치료, 또는 개선한다.
특정 구현예에서, PKK 연관된 질환 또는 장애 또는 병태는 유전성 혈관부종(HAE), 부종, 혈관부종, 종창, 눈꺼풀의 혈관부종, 눈의 부종, 황반 부종, 및 뇌 부종, 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 심부정맥혈전증, 폐색전증, 심근경색증, 뇌졸중, 또는 경색이다.
특정 구현예는 염증성 질환 또는 혈전색전성 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 선행 청구항 중 어느 한 항의 화합물 또는 조성물의 용도를 제공한다.
안티센스 화합물
올리고머 화합물은, 비제한적으로, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA를 포함한다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대한 "안티센스"일 수 있고, 이것은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화를 경험할 수 있다는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 안티센스 화합물은, 5'에서 3' 방향으로 쓰여질 때, 그것이 표적화된 표적 핵산의 표적 분절의 역보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 그와 같은 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로 쓰여질 때, 그것이 표적화된 표적 핵산의 표적 분절의 역보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 12 내지 30 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 12 내지 25 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 12 내지 22 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 14 내지 20 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 15 내지 25 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 18 내지 22 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 19 내지 21 개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 길이가 8 내지 80개, 12 내지 50개, 13 내지 30개, 13 내지 50개, 14 내지 30개, 14 내지 50개, 15 내지 30개, 15 내지 50개, 16 내지 30개, 16 내지 50개, 17 내지 30개, 17 내지 50개, 18 내지 30개, 18 내지 50개, 19 내지 30개, 19 내지 50개, 또는 20 내지 30개 연결된 하부 단위이다.
특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 12개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 13개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 14개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 15개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 16개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 17개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 18개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 19개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 20개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 21개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 22개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 23개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 24개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 25개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 26개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 27개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 28개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 29개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 30개의 하부단위이다. 특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 그 길이가 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 연결된 하부단위 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위 내이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 상기 연결된 하부단위는 뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단축되거나 절단될 수 있다. 예를 들어, 단일 하부단위는 5' 말단 (5' 절단), 또는 대안적으로 3' 말단 (3' 절단)로부터 결실될 수 있다. PKK 핵산에 표적화된 단축된 또는 절단된 안티센스 화합물은 상기 안티센스 화합물의 5' 말단으로부터 결실된 2 개의 하부단위를 가질 수 있고, 또는 대안적으로 이의 3' 말단으로부터 결실된 2개의 하부단위를 가질 수 있다. 대안적으로, 결실된 뉴클레오시드는, 예를 들면, 5' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드 및 3' 말단로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드를 갖는 안티센스 화합물에서 변형된 올리고뉴클레오티드를 통해 분산될 수 있다.
단일 부가적 하부 단위가 늘어난 안티센스 화합물에서 존재할 때, 부가적 하부 단위는 안티센스 화합물의 5' 또는 3' 말단에서 위치할 수 있다. 2 개 이상의 부가적 하부단위가 존재할 때, 부가된 하부단위는, 예를 들면, 안티센스 화합물의 5' 말단 (5' 부가), 또는 대안적으로 3' 말단 (3' 부가)에 부가된 2개의 하부 단위를 갖는 안티센스 화합물에서 서로 인접할 수 있다. 대안적으로, 부가된 뉴클레오시드는, 예를 들면, 5' 말단에 부가된 하나의 뉴클레오시드 및 3' 말단에 부가된 하나의 하부단위을 갖는 올리고뉴클레오티드에서 안티센스 화합물을 통해 분산될 수 있다.
안티센스 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이를 증가 또는 감소시키고/시키거나 활성을 제거하지 않으면서 미스매치 염기를 도입할 수 있다. 예를 들어, 다음을 참고하며: 예를 들면, Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)에서, 길이가 13-25 핵염기인 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그것의 능력에 대해 시험되어 난모세포 주입 모델에서 표적 RNA의 절단을 유도했다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단 근처의 8 또는 11 미스매치 염기를 가지며 그 길이가 25개 핵염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 미스매치를 함유하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 더 적을지라도 표적 mRNA의 직접적인 특이적 절단이 가능했다. 마찬가지로, 표적 특이적 절단은 1 또는 3 미스매치를 갖는 것을 포함하는 13개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 달성되었다.
Gautschi 등 (J.Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)는 bcl-2 및 bcl-xL 둘 다의 시험관내 및 생체내 발현을 감소시키기 위해 bcl-2 mRNA에 대해100% 상보성을 가지며 bcl-xL mRNA에 대한 3 개의 미스매치를 갖는 올리고뉴클레오티드의 능력을 실증했다. 더욱이, 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내 강력한 항-종양 활성을 실증했다.
Maher 및 Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988)는 토끼 망상적혈구 검정에서 인간 DHFR의 번역을 저지하는 그것의 능력에 대한, 각각의 탠덤 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2개 또는 3개 서열로 구성된, 일련의 탠덤 14 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드 및, 28 및 42 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험했다. 각각의 3 개의 14 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드 단독은 28 또는 42 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 더 보통의 수준일지라도 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 안티센스 화합물 특성 예컨대 증대된 억제 활성, 증가된 표적 핵산에 대한 결합 친화도, 또는 생체내 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 부여하기 위해 패턴, 또는 모티프에서 배열된 화학적으로 변형된 하부단위를 갖는다.
키메라 안티센스 화합물은 전형적으로 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산의 증가된 결합 친화도, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 키메라 안티센스 화합물의 제 2 영역은 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제 RNase H의 기질로서 임의로 쓰일 수 있다.
갭머 모티프를 갖는 안티센스 화합물은 키메라 안티센스 화합물로 간주된다. 갭머에서 RNaseH 절단을 지지하는 복수의 뉴클레오티드를 갖는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오시드로부터 화학적으로 뚜렷한 복수의 뉴클레오티드를 갖는 외부 영역 사이에 배치된다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에, 갭 분절은 일반적으로 엔도뉴클레아제 절단의 기질로서 쓰이지만, 윙 분절은 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 영역은 각각의 뚜렷한 영역을 포함하는 당 모이어티의 유형에 의해 분화된다. 갭머의 영역을 분화시키기 위해 사용된 당 모이어티의 유형은 일부 구현예에서 하기를 포함할 수 있다: β-D-리보뉴클레오시드, β-D-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (그와 같은 2'-변형된 뉴클레오시드는 기타 중에서 2'-MOE 및 2'-O-CH3를 포함할 수 있다), 및 이환식 당 변형된 뉴클레오시드 (그와 같은 이환식 당 변형된 뉴클레오시드는 4'-(CH2)n-O-2' 가교 (여기서 n=1 또는 n=2 및 4'-CH2-O-CH2-2’)을 갖는 것을 포함할 수 있다). 특정 구현예에서, 윙은, 예를 들면 2'-MOE를 포함하는 몇 개의 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 윙은 몇 개의 변형된 및 비변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 윙은 2'-MOE 뉴클레오시드, 및 2'-데옥시뉴클레오시드의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
각각의 뚜렷한 영역은 균일한 당 모이어티, 변이체, 또는 교차 당 모이어티를 포함할 수 있다. 윙-갭-윙 모티프는 "X-Y-Z"로서 빈번히 기재되고, 여기서 "X"는 5'-윙의 길이를 나타내고, "Y"는 갭의 길이를 나타내고, "Z"는 3'-윙의 길이를 나타낸다. "X" 및 "Z"는 균일한, 변이체, 또는 교대 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, "X" 및 "Y"는 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함할 수 있다. "Y"는 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "X-Y-Z"로서 기재된 갭머는, 갭이 각각의 5'-윙 및 3' 윙에 바로 인접하여 배치되는 정도의 배치를 갖는다. 따라서, 개재(intervening) 뉴클레오티드는 5'-윙 및 갭, 또는 갭 및 3'-윙 사이에 존재하지 않는다. 본원에 기재된 안티센스 화합물의 임의의 것은 갭머 모티프를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, "X" 및 "Z"는 동일하고, 다른 구현예에서 y는 상이하다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 갭머는 예를 들어 5-10-5의 모티프를 갖는 20 량체(20 - mers)를 포함한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오티드 서열
인간 혈장 프리칼리크레인 (PKK)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비제한적으로 하기를 포함한다: 유전자은행 수탁 번호 NM_000892.3 (서열번호: 1과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 DC412984.1 (서열번호: 2와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CN265612.1 (서열번호: 3과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 AK297672.1 (서열번호: 4와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 DC413312.1 (서열번호: 5와 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 AV688858.2 (서열번호: 6과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CD652077.1 (서열번호: 7과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 BC143911.1 (서열번호: 8과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 CB162532.1 (서열번호: 9와 같이 본원에 포함), 핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19 (본원에서 서열 번호: 10과 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 NM_008455.2 (서열번호: 11과 같이 본원에 포함), 유전자은행 수탁 번호 BB598673.1 (서열번호: 12와 같이 본원에 포함), 핵염기 6114001 내지 6144000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_039460.7 (본원에서 서열 번호: 13과 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 NM_012725.2 (서열번호: 14와 같이 본원에 포함), 핵염기 10952001 내지 10982000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NW_047473.1 (본원에서 서열 번호: 15와 같이 포함), 유전자은행 수탁 번호 XM_002804276.1 (서열번호: 17과 같이 본원에 포함), 및 핵염기 2358000 내지 2391000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NW_001118167.1 (본원에서 서열 번호: 18과 같이 포함).
본원에 함유된 실시예에서 각각의 서열 번호로 제시된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 임의의 변형에 독립적인 것으로 이해된다. 그것으로서, 서열 번호에 의해 규정된 안티센스 화합물은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 하나 이상의 변형을 독립적으로 포함할 수 있다. ISIS 번호 (Isis No)에 의해 기재된 안티센스 화합물은 핵염기 서열 및 모티프의 조합을 나타낸다.
특정 구현예에서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 규정된 영역이다. 예를 들면, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합, 암호화 영역, 번역 개시 영역, 번역 종료 영역, 또는 다른 규정된 핵산 영역을 포함할 수 있다. PKK의 구조적으로 규정된 영역은 서열 데이타베이스 예컨대 NCBI로부터의 승인 번호에 의해 수득될 수 있고 그와 같은 정보는 본원에 참고로 포함되어 있다. 특정 구현예에서, 표적 영역은 표적 영역 내의 하나의 표적 분절의 5' 표적 부위로부터 표적 영역 내의 또 하나의 표적 분절의 3' 표적 부위로의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 안티센스 화합물이 혼성화하는 적어도 하나의 표적 분절의 결정을 포함하고, 이로써 원하는 효과가 발생한다. 특정 구현예에서, 원하는 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소이다. 특정 구현예에서, 원하는 효과는 표적 핵산 또는 표적 핵산과 연관된 표현형 변화에 의해 암호화된 단백질의 수준의 감소이다.
표적 영역은 하나 이상의 표적 분절을 함유할 수 있다. 표적 영역 내의 다중 표적 분절은 중복일 수 있다. 대안적으로, 이들은 비-중첩성일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 영역 내의 표적 분절은 약 300개 이하의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 표적 영역 내의 표적 분절은 표적 핵산 상의 약 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 또는 그 이하의 뉴클레오티드이고, 이전의 값의 임의의 2개에 의해 규정된 범위인 수많은 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 표적 영역 내의 표적 분절은 표적 핵산 상의 약 5개 이하의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 표적 분절은 인접한다. 본원에서 열거된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위의 임의의 것인 개시 핵산을 갖는 범위에 의해 규정된 표적 영역이 고려된다.
적당한 표적 분절은 5' UTR, 암호화 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손, 또는 엑손/인트론 접합 내에서 발견될 수 있다. 개시 코돈 또는 정지 코돈을 함유하는 표적 분절은 또한 적당한 표적 분절이다. 적당한 표적 분절은 특정의 구조적으로 규정된 영역 예컨대 개시 코돈 또는 정지 코돈을 명시적으로 제외할 수 있다.
적당한 표적 분절의 결정은 게놈 도처의 다른 서열에 대한 표적 핵산의 서열의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들면, BLAST 알고리즘은 상이한 핵산 중에서 유사성의 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산 이외의 서열 (즉, 비-표적 또는 오프-타겟(off-target) 서열)과 비특이적 방식으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물의 서열의 선택을 방지할 수 있다.
활성 표적 영역 내의 안티센스 화합물의 활성의 변화 (예를 들면, 표적 핵산 수준의 퍼센트 감소에 의해 규정된 바와 같이) 가 있을 수 있다. 특정 구현예에서, PKK mRNA 수준의 감소는 타우 발현의 억제를 가리킨다. PKK 단백질의 수준 감소는 또한 표적 mRNA 발현의 억제를 가리킨다. 게다가, 표현형 변화는 PKK 발현의 억제를 가리킨다. 예를 들어, 감소되거나 예방된 염증은 PKK 발현의 억제를 나타낼 수 있다. 또 다른 예시에서, 감소되거나 예방된 부종/종창은 PKK 발현의 억제를 나타낼 수 있다. 또 다른 예시에서, 감소되거나 예방된 혈관투과성은 PKK 발현의 억제를 나타낼 수 있다. 또 다른 예시에서, 감소되거나 예방된 혈관 유출은 PKK 발현의 억제를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 혈관투과성은 염료, 예컨대 에반스 블루(Evans Blue) 정량화에 의하여 측정된다.
혼성화
일부 구현예에서, 혼성화는 본원에 개시된 안티센스 화합물 및 표적 핵산 사이에서 발생한다. 혼성화의 가장 일반적인 기전은 핵산 분자의 상보적 핵염기 사이의 수소 결합 (예를 들면, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스텐(Hoogsteen) 또는 역전된 후그스텐(Hoogsteen) 수소 결합)을 수반한다.
혼성화는 가변 조건 하에서 발생할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 혼성화될 핵산 분자의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있는 지를 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있다.
상보성
안티센스 화합물 및 표적 핵산은, 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소결합할 수 있을 때 서로 상보적이고, 이로써 원하는 효과가 발생할 것이다 (예를 들면, 표적 핵산, 예컨대 PKK 핵산의 안티센스 억제).
안티센스 화합물 및 PKK 핵산 사이에서의 비-상보적 핵염기는, 상기 안티센스 화합물이 표적 핵산에 특이적으로 혼성화 가능하도록 남아있는 경우 용인될 수 있다. 더욱이, 안티센스 화합물은 PKK 핵산의 하나 이상의 분절 상에서 혼성될 수 있고 이로써 개재 또는 인접한 분절은 혼성화 사건 (예를 들면, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조)에 관여되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물, 또는 명시된 그의 부분은 PKK 핵산, 표적 영역, 표적 분절, 또는 명시된 그의 부분에 대해 적어도, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적이다. 표적 핵산을 갖는 안티센스 화합물의 퍼센트 상보성은 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
예를 들면, 20개 안티센스 화합물의 핵염기 중 18개는 표적 영역에 대해 상보적이고 따라서 특이적으로 혼성화하는, 안티센스 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예시에서, 잔류 비-상보적 핵염기는 무리를 이루거나 상보적 핵염기와 함께 사이에 배치될 수 있고, 서로 또는 상보적 핵염기에 인접할 필요가 없다. 그것으로서, 표적 핵산에 완전한 상보성을 갖는 2 개의 영역에 의해 플랭킹된 4 개의 비-상보적 핵염기를 갖는 길이가 18개의 핵염기인 안티센스 화합물은 표적 핵산에 77.8% 전체 상보성을 가질 것이며, 따라서 본 발명의 범위 내에 있을 것이다. 표적 핵산의 영역을 갖는 안티센스 화합물의 퍼센트 상보성은 당해기술에서 공지된 BLAST 프로그램 (기본적 국소 정렬 연구 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). 퍼센트 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 Smith 및 Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)의 알고리즘을 사용하는 디폴트 세팅을 사용하여, 예를 들면, 갭(Gap) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물, 또는 이의 명시된 부분은 표적 핵산, 또는 명시된 이의 부분에 대해 완전 상보적 (즉, 100% 상보적)이다. 예를 들면, 안티센스 화합물은 혈장 프리칼리크레인 핵산, 또는 이의 표적 영역, 또는 표적 분절 또는 표적 서열에 대해 완전히 상보적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "완전히 상보적"은, 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확한 염기 짝짓기를 할수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 20 핵염기 안티센스 화합물은, 안티센스 화합물에 대해 완전 상보적인 표적 핵산의 상응하는 20 핵염기 부분이 있는 한, 400 핵염기 길이인 표적 서열에 대해 완전 상보적이다. 완전 상보성은 제 1 및/또는 제 2 핵산의 명시된 부분을 참조하여 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 30 핵염기 안티센스 화합물의 20 핵염기 부분은 400개 핵염기 길이인 표적 서열에 대해 "완전히 상보적"일 수 있다. 30 핵염기 올리고뉴클레오티드의 20 핵염기 부분은, 표적 서열이 상응하는 20 핵염기 부분을 갖고, 이때 각각의 핵염기가 안티센스 화합물의 20 핵염기 부분에 대해 상보적이라면, 표적 서열에 대해 완전히 상보적이다. 동시에, 전체 30 핵염기 안티센스 화합물은, 안티센스 화합물의 잔류 10개 핵염기가 표적 서열에 대해 또한 상보적인지에 따라 표적 서열에 대해 또한 완전히 상보적이거나 그렇지 않을 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단에 있을 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 있을 수 있다. 두개 이상의 비-상보적 핵염기가 존재할 때, 이들은 인접하거나(즉, 연결되거나), 또는 비-인접할 수 있다. 일 구현예에서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드의 윙 분절에 위치한다.
특정 구현예에서, 길이가 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개이거나, 또는 최대로 상기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 또는 명시된 이의 부분에 대해 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하의 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
특정 구현예에서, 길이가 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 핵염기이거나, 또는 최대로 상기 길이의 핵염기인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 또는 명시된 이의 부분에 대해 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하의 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
제공된 안티센스 화합물은 또한 표적 핵산의 부분에 대해 상보적인 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "부분"은 표적 핵산의 영역 또는 분절 내의 규정된 수의 인접한 (즉, 연결된) 핵염기를 의미한다. "부분"은 또한 규정된 수의 안티센스 화합물의 인접한 핵염기를 의미할 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 8 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 9 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 10 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 11 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 12 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 13 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 14 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 15 핵염기 부분에 대해 상보적이다. 표적 분절의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 초과, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위의 핵염기 부분에 대해 상보적인 안티센스 화합물이 또한 고려된다.
동일성
본원에서 제공된 안티센스 화합물은 특정한 뉴클레오티드 서열, 서열 번호, 또는 특정 ISIS 번호로 나타내는 화합물, 또는 이의 부분에 대한 규정된 퍼센트 동일성을 또한 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 안티센스 화합물은, 동일한 핵염기 짝짓기 능력을 갖는다면, 본원에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들면, 우라실 및 티미딘 둘 다 아데닌과 쌍을 이루므로, 개시된 DNA 서열에서 티미딘 대신에 우라실을 함유하는 RNA가 DNA 서열과 동일한 것으로 간주된다. 본원에 기재된 안티센스 화합물 뿐만 아니라 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 대해 비-동일한 염기를 갖는 화합물의 단축된 및 늘어난 버전이 또한 고려된다. 비-동일한 염그룹은 안티센스 화합물에 도처에서 분산되거나 서로 인접할 수 있다. 안티센스 화합물의 퍼센트 동일성은 비교되는 서열에 대해 동일한 염기 짝짓기를 갖는 염기의 수에 따라 산출된다.
특정 구현예에서, 안티센스 화합물, 또는 이의 부분은, 본원에 개시된 안티센스 화합물 또는 서열 번호, 또는 이의 부분의 하나 이상과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
특정 구현예에서, 안티센스 화합물의 부분은 표적 핵산 부분과 동등한 길이 부분으로 비교된다. 특정 구현예에서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 핵염기 부분은 표적 핵산 부분과 동등한 길이 부분과 비교된다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부분은 표적 핵산 부분과 동등한 길이 부분과 비교된다. 특정 구현예에서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 핵염기 부분은 표적 핵산 부분과 동등한 길이 부분과 비교된다.
변형
뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 핵염기 (또한 염기로서 공지됨) 부분은 보통 헤테로환 염기 모이어티이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 연결된 인산기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드에 대해, 인산그룹은 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 서로에 대한 인접한 뉴클레오시드의 공유연결을 통해 형성되어, 선형 폴리머 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에, 인산그룹은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결을 형성하는 것으로 간주된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오시드간 연결, 당 모이어티, 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포괄한다. 변형된 안티센스 화합물은 바람직한 특성 예컨대, 예를 들면, 증대된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증대된 친화도, 뉴클레아제의 존재에서의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성 때문에 천연 형태와 비교하여 종종 바람직하다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 그것의 표적 핵산에 대해, 단축된 또는 절단된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키기 위해 또한 이용될 수 있다. 결과적으로, 비교할만한 결과는 그와 같은 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 갖는 더 짧은 안티센스 화합물로 종종 수득될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
RNA 및 DNA의 "천연적으로 발생하는 뉴클레오시드간 연결"은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 연결을 의미한다. 하나 이상의 변형된, 즉 비-천연 발생, 뉴클레오시드간 연결을 갖는 안티센스 화합물은 바람직한 특성 예컨대, 예를 들면, 증대된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증대된 친화도, 및 뉴클라아제의 존재에서 증가된 안정성 때문에 천연 발생 뉴클레오시드간 연결을 갖는 안티센스 화합물과 비교하여 종종 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 연결 뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 대표적인 인을 함유하는 뉴클레오시드간 연결은, 비제한적으로, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트를 포함한다. 인-함유 및 비-인-함유 연결의 제조 방법은 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 혈장 프리칼리크레인 핵산에 표적화된 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 구현예에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 규정된 패턴 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결 모티프에서 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 영역을 따라 배열된 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드간 연결은 갭핑된 모티프에서 배열되어 있다. 그러한 구현예에서, 2개 윙 영역 중 각각에서 뉴클레오시드간 연결은 갭 영역에서의 뉴클레오시드간 연결과 상이하다. 그러한 구현예에서, 윙 영역 중에서 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르이고, 갭에서의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다. 뉴클레오시드 모티프는 독립적으로 선택되며, 따라서 갭핑된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 그러한 올리고뉴클레오티드는 갭핑된 뉴클레오시드를 가지지 않을 수 있고, 만약 그것이 갭핑된 뉴클레오시드를 갖지 않는다면, 윙 및 갭 길이는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 교대 뉴클레오시드간 연결 모티프를 갖는 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 균일하게 변형된 뉴클레오시드간 연결의 영역을 포함한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의해 균일하게 연결된 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트에 의해 균일하게 연결된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택되고 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 6 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 8 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개의 연속적인 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개의 연속적인 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 연속적인 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 12개의 연속적인 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 적어도 블록을 포함한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 적어도 하나의 그와 같은 블록은 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 적어도 하나의 그와 같은 블록은 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 3개의 뉴클레오시드 내에 위치한다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 메틸포스포네이트 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머 뉴클레오시드 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드는 1 또는 2의 메틸포스포네이트 연결을 제외한 모든 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 연결 모티프를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나의 메틸포스포네이트 연결은 갭머 뉴클레오시드 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드의 중앙 갭 내에 있다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 내성을 유지하기 위하여 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 수를 배열하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 내성을 유지하기 위하여 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 수 및 위치와 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 수 및 위치를 배열하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 수는 감소할 수 있고, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 수는 증가할 수 있다. 특정 구현예에서, 여전히 뉴클레아제 내성을 유지하는 동안, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 수는 감소할 수 있고, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 수는 증가할 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 내성을 유지하는 동안 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 내성을 유지하기 위하여 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 수를 증가시키는 것이 바람직하다.
변형된 당 모이어티
안티센스 화합물은 임의로 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유할 수 있으며, 여기서 당 그룹은 변형되었던 것이다. 그와 같은 당 변형된 뉴클레오시드는 안티센스 화합물에 대한 증대된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화도, 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 환 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 환의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 치환체 그룹의 부가 (5' 및 2' 치환체 그룹, 이환식 핵산 (BNA)를 형성하기 위한 비-제미널(geminal) 환 원자의 가교, 리보실 환 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R2)의 교체 포함) (R, R1 및 R2각각은 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기로부터 선택된다) 및 이들의 조합. 화학적으로 변형된 당의 예시는 하기를 포함한다: 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (참고, PCT 국제 출원 WO 2008/101157, 다른 개시된 5', 2'-비스 치환된 뉴클레오시드에 대해 8/21/08에 공개됨), 또는 2'-위치에서 추가 치환에 의해 S에 의한 리보실 환 산소 원자의 교체 (참고, 공개된 미국 특허 출원 US2005/0130923, 2005년 6월 16일에 공개됨), 또는 대안적으로, BNA의 5'-치환 (참고, PCT 국제 출원 WO 2007/134181, 11/22/07에 공개됨, LNA는, 예를 들면, 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹으로 치환됨).
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드의 예는 5'-비닐, 5'-메틸 (R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환체 그룹을 포함하는 뉴클레오시드를 비제한적으로 포함한다. 2' 위치에서의 치환체는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 Rl, Rm 및 Rn은 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이환식 뉴클레오시드"는 이환식 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오시드를 의미한다. 이환식 뉴클레오시드의 예는 4' 및 2' 리보실 환 원자 사이의 가교를 포함하는 뉴클레오시드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 4' 내지 2' 가교를 포함하는 하나 이상의 이환식 뉴클레오시드를 포함한다. 그와 같은 4' 내지 2' 이환식 뉴클레오시드의 하기 식 중의 하나를 비제한적으로 포함한다: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (또한 제한된 에틸 또는 cEt로 지칭됨) 및 4'-C-H(CH2OCH3)-O-2' (및 이의 유사체, 참고: 미국 특허 7,399,845, 2008년 7월 15일 발행됨); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체, 참고: 국제 출원 공보 WO/2009/006478, 2009년 1월 8일 공보됨); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 이의 유사체, 참고: 국제 출원 공보 WO/2008/150729, 2008년 12월 11일 공보됨); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (참고: 국제 출원 공보 US2004-0171570, 2004년 9월 23일 공보됨); 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기 (참고: 미국 특허 7,427,672, 2008년 9월 23일 발행됨); 4'-CH2-C-(H)(CH3)-2' (참고: Zhou et al., J. Org . Chem., 2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (및 이의 유사체, 참고: 국제 출원 공보 WO 2008/154401, 2008년 12월 8일 공보됨)이다.
이환식 뉴클레오티드와 관련된 추가적인 보고는 다음 출판 문헌에서 발견될 수 있다 (예를 들어, 참고: Singh et al., Chem . Commun ., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc . Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem . Biol ., 2001, 8, 1-7; 및 Orum et al., Curr . Opinion Mol . Ther ., 2001, 3, 239-243; 미국 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; 및 7,696,345; 미국 특허 공보 번호 US2008-0039618; US2009-0012281; 미국 특허 시리즈 번호 61/026,995 및 61/097,787; 공보된 PCT 국제 출원 WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; WO 2009/006478; WO 2010/036698; WO 2011/017521; WO 2009/067647; WO 2009/100320. 각각의 상기 이환식 뉴클레오시드는 예를 들면 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 배치를 갖도록 제조될 수 있다 (참고 PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393, WO 99/14226로서 1999년 3월 25일 공개).
특정 구현예에서, BNA 뉴클레오시드의 이환식 당 모이어티는, 비제한적으로, 펜토푸라노실 당 모이어티의 4' 및 2' 위치 사이의 적어도 하나의 가교를 갖는 화합물을 포함하고, 여기서 상기 가교는 독립적으로,[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 내지 4개의 연결기를 포함하며;
상기 식 중에서,
x 는 0, 1, 또는 2이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
각각의 Ra 및 Rb는, 독립적으로, H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환족 라디칼, 치환된 C5-C7 지환족 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고;
그리고 J1 및 J2 각각은 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로환 라디칼, 치환된 헤테로환 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티의 가교는, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는 -C(RaRb)-O-N(R)-이다. 특정 구현예에서, 가교는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2'- 이고, 이때 각각의 R은 독립적으로, H, 보호기, 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 이성질체 배치에 의하여 추가로 정의된다. 예를 들면, 4'-2' 메틸렌-옥시 가교를 포함하는 뉴클레오시드는, α-L 배치 또는 β-D 배치로 존재한다. 이전에, α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA'는 안티센스 활성을 보여준 안티센스 올리고뉴클레오티드에 통합되었다 (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는, 비제한적으로, (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, 및 (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) 메틸렌-티오 (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 탄소환식 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) 프로필렌 탄소환식 (4'-(CH2)3-2') BNA 및 (K) 비닐 BNA를, 이하에서 묘사된 바와 같이 포함한다:
여기서 Bx는 염기 모이어티이고 R은, 독립적으로, H, 보호기 또는 C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알콕시이다.
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 I을 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
-Qa-Qb-Qc- 는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH2 이고;
Rc는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이고; 그리고
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 II를 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올, 또는 치환된 티오이다.
일 구현예에서, 각각의 치환된 그룹은, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, 및 NJeC(=X)NJcJd로부터 독립적으로 선택된 치환체 그룹으로 단일 또는 다중 치환되고, 여기서 각각의 Jc, Jd 및 Je는, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고 X는 O 또는 NJc이다.
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 III을 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
Zb는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 또는 치환된 아실(C(=O)-)이다.
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 IV를 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
각각의 qa, qb, qc 및 qd는 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다;
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 V를 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
qa, qb, qe 및 qf 각각은, 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)-NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
또는 qe 및 qf는 함께 =C(qg)(qh)이고;
qg 및 qh 각각은, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬, 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA 모노머 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민, 및 우라실의 합성 및 제조는, 그것의 올리고머화, 및 핵산 인식 특성과 함께 기재되었다 (참고: Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA 및 이의 제조는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 또한 설명되어 있었다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, 및 2'-티오-BNAs의 유사체가 또한 제조되었다 (참고: Kumar et al., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 1998, 8, 2219-2222). 올리고데옥시리보뉴클레오티드 듀플렉스를 핵산 폴리머라제의 기질로서 포함하는 락킹된(locked) 뉴클레오시드 유사체의 제조가 또한 기재되었다 (참고, Wengel et al., WO 99/14226). 더욱이, 2'-아미노-BNA, 신규 형태적으로 제한된 고-친화도 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성은 당해기술에 기재되었다 (참고: Singh et al., J. Org. Chem ., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA'가 제조되었고 상보적 RNA 및 DNA 가닥을 갖는 그것의 듀플렉스의 열 안정성은 이전에 보고되었다.
특정 구현예에서, 이환식 뉴클레오시드는 하기 화학식 VI을 갖는다:
상기 식 중에서,
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 콘주게이트 그룹, 반응성 인 그룹, 인 모이어티, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착(covalent attachment)이고;
qi, qj, qk 및 ql 각각은, 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)-NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고; 그리고
qi 및 qj 또는 ql 및 qk는 함께 =C(qg)(qh)이고, 여기서 qg 및 qh은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 가교를 갖는 하나의 탄소환식 이환식 뉴클레오시드 및 알케닐 유사체, 가교 4'-CH=CH-CH2-2'가 기재되었다 (참고: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek et al., J. Org . Chem., 2006, 71, 7731-7740). 탄소환식 이환식 뉴클레오시드의 합성 및 제조는 그것의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 또한 기재되었다 (참고: Srivastava et al., J. Am. Chem . Soc ., 2007, 129(26), 8362-8379).
본원에서 사용된 바와 같이, "4'-2' 이환식 뉴클레오시드" 또는 "4' 내지 2' 이환식 뉴클레오시드"는 당 환의 2' 탄소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하는 푸라노스 환을 포함하는 이환식 뉴클레오시드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단환식 뉴클레오시드"는 이환식 당 모이어티가 아닌 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드의 당 모이어티, 또는 당 모이어티 유사체는 임의의 위치에서 변형 또는 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-변형된 당"은 2' 위치에서 변형된 푸라노실 당을 의미한다. 특정 구현예에서, 2' 변형은 하기를 비제한적으로 포함하는 치환체로부터 선택된다: 치환된 및 비치환된 알콕시, 치환된 및 비치환된 티오알킬, 치환된 및 비치환된 아미노 알킬, 치환된 및 비치환된 알킬, 치환된 및 비치환된 알릴, 및 치환된 및 비치환된 알키닐을 비제한적으로 포함하는 할라이드. 특정 구현예에서, 2' 변형은 하기를 비제한적으로 포함하는 치환체로부터 선택된다: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 , 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 2'- 치환체 그룹은 하기로부터 또한 선택될 수 있다: C1-C12 알킬; 치환된 알킬; 알케닐; 알키닐; 알카릴; 아랄킬; O-알카릴 또는 O-아랄킬; SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단 그룹; 리포터 그룹; 삽입제; 약력학적 특성을 개선하는 그룹; 및 안티센스 화합물의 약동학적 특성을 개선하는 그룹, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다 (참고: Baker et al., J. Biol . Chem., 1997, 272, 11944-12000). 그와 같은 2'-MOE 치환은 비변형된 뉴클레오시드 및 다른 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2'- O-메틸, O-프로필, 및 O-아미노프로필과 비교하여 개선된 결합 친화도를 갖는 것으로 기재되었다. 2'-MOE 치환체를 갖는 올리고뉴클레오티드는 또한 생체내 사용을 위해 유망한 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 보여졌다 (참고, Martin, Helv . Chim . Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem . Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; 및 Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 테트라하이드로피란 뉴클레오시드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오시드"는 노말 뉴클레오시드 (당 대용물)에서 펜토푸라노실 잔기를 대체하기 위해 치환된 6-원 테트라하이드로피란 "당"을 갖는 뉴클레오시드를 의미한다. 변형된 THP 뉴클레오시드는, 비제한적으로, 헥시톨 핵산 (HNA), 아니톨 핵산 (ANA), 만니톨 핵산 (MNA)로서 당해분에서 불리는 것들 (참고 Leumann, Bioorg. Med . Chem ., 2002, 10, 841-1954) 또는 플루오로 HNA (F-HNA) (하기 예시된 바와 같이 테트로하이드로피란 환계를 갖는다).
특정 구현예에서, 당 대용물은 하기 화학식 VII으로부터 선택된다:
여기서 독립적으로 식 VII의 각각의 상기 적어도 하나의 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체에 대해:
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
Ta 및 Tb 각각은, 독립적으로, 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 결합시키는 뉴클레오시드간 연결기이거나 Ta 및 Tb 중 하나는 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 결합시키는 뉴클레오시드간 연결기이고, Ta 및 Tb 중 다른 것은 H, 히드록실 보호 그룹, 결합된 콘주게이트 그룹, 또는 5' 또는 3'-말단기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; 그리고 각각의 R1 및 R2는 수소, 하이드록실, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 선택되고, 여기서 X는 O, S 또는 NJ1이고, 그리고 각각의 J1, J2 및 J3은 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구현예에서, 화학식 VII의 변형된 THP 뉴클레오시드가 제공되며, 여기서 q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7는 각각 H이다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 H 이외의 것이다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 메틸이다. 특정 구현예에서, 식 VII의 THP 뉴클레오시드가 제공되고, 여기서 R1 및 R2 중 하나는 플루오로이다. 특정 구현예에서, R1 은 플루오로이고 R2 는 H이고, R1 은 메톡시이고 R2 는 H이고, R1 은 메톡시에톡시이고 R2 는 H이다.
특정 구현예에서, 당 대용물은 5개 초과의 원자를 갖고 1개 초과의 헤테로원자를 갖는 환을 포함한다. 예를 들어, 모폴리노 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드 및 올리고머 화합물에서의 그들의 용도가 보고되었다 (예를 들어 참고: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; 및 미국 특허 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; 및 5,034,506). 본원에서 사용된 바와 같이, "모폴리노"는 하기 구조를 갖는 당 대용물을 의미한다:
특정 구현예에서, 모폴리노는, 상기 모폴리노 구조로부터의 다양한 치환기 그룹을 부가하거나 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 그와 같은 당 대용물은 본원에서 "변형된 모폴리노"라 칭한다.
하기와 같은 변형의 조합이 또한 비제한적으로 제공된다: 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (참고 다른 개시된 5', 2'-비스 치환된 뉴클레오시드에 대해 8/21/08에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157) 및 2'-위치에서의 리보실 환 산소 원자 대신에 S에 의한 대체 및 추가 치환 (참고 2005년 6월 16일에 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923) 또는 대안적으로 이환식 핵산의 5'-치환 (참고 11/22/07에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181, 여기서 4'-CH2-O-2' 이환식 뉴클레오시드는 5' 위치에서 5'-메틸 또는 5'-비닐기로 추가로 치환된다). 탄소환 이환식 뉴클레오시드의 합성 및 제조는 그것의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 또한 기재되었다 (참고, 예를 들면, Srivastava et al., J. Am. Chem . Soc . 2007, 129(26), 8362-8379).
특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 천연 유래 뉴클레오시드에서 펜토퓨라노실 잔기 대신에 6-원 사이클로헥센닐을 가지는 뉴클레오시드인 하나 이상의 변형 사이클로헥센닐 뉴클레오시드를 포함한다. 변형된 사이클로헥세닐 뉴클레오시드는 당업계에서 다음에 기술된 것들을 비제한적으로 포함한다(예를 들어 일반적으로 보유된, 다음 참고: 공개된 PCT 출원 WO 2010/036696 (2010년 4월 10일 발표), Robeyns et al., J. Am. Chem . Soc ., 2008, 130(6), 1979-1984; 
et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem . Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides , Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica , Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org . Chem ., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org . Chem ., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; 공개 PCT 출원, WO 06/047842; 및 공개 PCT 출원 WO 01/049687; 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 편입되어 있다). 특정 변형 사이클로헥센닐 뉴클레오시드는 하기 화학식 X를 가진다.
여기서 화학식 X의 상기 적어도 하나의 사이클로헥센닐 뉴클레오시드 유사체 각각에 대하여, 독립적으로:
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
T3 및 T4 각각은, 독립적으로, 사이클로헥센닐 뉴클레오시드 유사체를 T3 및 T4의 안티센스 화합물에 연결시키는 뉴클레오시드간 연결기이거나 이들 중 하나는 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 연결시키는 뉴클레오시드간 연결기이고, 그리고 T3 및 T4 중 다른 것은 H, 히드록실 보호기, 연결된 콘주게이트 그룹, 또는 5' 또는 3'-말단기이고; 그리고
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 및 q9는 각각, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 다른 당 치환체 그룹이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-변형된" 또는 "2'-치환된"은 H 또는 OH 이외의 2' 위치에서 치환체를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 2'-변형된 뉴클레오시드는, 비제한적으로, 이환식 뉴클레오시드를 포함하고, 여기서 당 환의 2 개의 탄소 원자를 연결하는 가교는 당 환의 2' 탄소 및 다른 탄소; 그리고 뉴클레오시드를 비-가교 2' 치환체, 예컨대 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)와 연결하고, 여기서 각각의 Rm 및 Rn는, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 2'-변형된 뉴클레오시드는 예를 들면, 당의 다른 위치에서 및/또는 핵염기에서 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-F"는 당 환의 2' 위치에서 플루오로 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-OMe" 또는 "2'-OCH3" 또는 "2'-O-메틸" 각각은 당 환의 2' 위치에서 -OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MOE" 또는 "2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3" 또는 "2'-O-메톡시에틸" 각각은 당 환의 2' 위치에서 -OCH2CH2OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"는 복수의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 화합물을 지칭한다. 소정의 실시형태에 있어서, 복수의 뉴클레오시드 중 하나 이상이 변형된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 리보뉴클레오시드(RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오시드(DNA)를 포함한다.
많은 다른 바이사이클로 및 트리사이클로 당 대용물 환계는 또한 당해기술에 공지되어 있고 안티센스 화합물에 통합시키기 위한 뉴클레오시드를 변형하기 위해 사용될 수 있다 (참고, 예를 들면, 검토 논문: Leumann, Bioorg . Med. Chem ., 2002, 10, 841-1954). 그와 같은 환계는 활성을 향상시키기 위해 다양한 부가적 치환을 경험할 수 있다.
변형된 당류의 제조 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이러한 변형 당의 제조를 교시하는 일부 대표적인 미국 특허는, 제한 없이, 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,670,633호; 제5,700,920호; 제5,792,847호 및 제6,600,032호 및 2005년 6월 2일에 출원되고 2005년 12월 22일에 WO 2005/121371로서 공개된 국제 출원 PCT/US 2005/019219를 포함하고, 이들 중 특정한 것은 본 출원과 공동으로 소유되며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 편입된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티 (천연, 변형된, 또는 이들의 조합)은 적절한 핵산 표적과의 혼성화를 위해 유지된다.
특정 구현예에서, 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 구현예에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드는 갭머 모티프에서 배열된다. 특정 구현예에서, 상기 변형된 당 모이어티는 (4’-CH(CH3)-O-2’) 가교기를 갖는 이환식 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 상기 (4’-CH(CH3)-O-2’) 변형된 뉴클레오시드는 갭머 모티프의 윙에 걸쳐 배열된다.
콘주게이트된 안티센스 화합물
특정 구현예에서, 본 개시내용은 콘주게이트된 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 핵산 전사체에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 콘주게이트된 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 세포를 핵산 전사체에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 콘주게이트된 안티센스 화합물와 접촉시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 콘주게이트된 안티센스 화합물과 접촉시키고 세포에서 핵산 전사체의 양 또는 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)가 이전에 기재되었다. 예를 들어, 참고: Park et al., PNAS vol. 102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). 그와 같은 수용체들은 간 세포, 특히 간세포(hepatocyte) 상에서 발현된다. 게다가, 3개의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 리간드들의 클러스터를 포함하는 화합물은 ASGP-R에 결합하여, 세포 내로 상기 화합물의 흡수를 야기할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들면, 문헌[Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, pp 5216-5231 (May 2008)]을 참조한다. 따라서, 그와 같은 GalNAc 클러스터를 포함하는 콘주게이트들은 간 세포, 특이적으로 간세포 내로 특정 화합물의 흡수를 촉진하는데 사용되어 왔다. 예를 들면 특정 GalNAc-함유 콘주게이트들은 생체내에서 간 세포에서 듀플렉스 siRNA 화합물의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그와 같은 경우에, GalNAc-함유 콘주게이트는 전형적으로 siRNA 듀플렉스의 센스 가닥에 부착된다. 센스 가닥은 안티센스 가닥이 결국 표적 핵산과 혼성화되기 전에 버려지므로, 상기 콘주게이트는 활성을 방해할 염려가 거의 없다. 전형적으로, 상기 콘주게이트는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 예를 들면, U.S. 특허 제8,106,022호를 참고한다. 본원에서 기재된 특정 콘주게이트 그룹은 더 활성이고/거나 이전에 기재된 콘주게이트 그룹보다 합성하기 더 쉽다.
본 발명의 특정 구현예에서, 콘주게이트는 비제한적으로 RNase H 기반 안티센스 화합물 및 전-mRNA의 표적 핵산의 스플라이싱을 변경하는 안티센스 화합물을 포함하는, 단일가닥 안티센스 화합물에 부착된다. 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트는 이점 (세포 내로의 개선된 흡수)을 제공하기에 충분히 긴 안티센스 화합물에 계속 부착되어 있어야 하지만, 이후에 절단되거나, 또는 표적 핵산에 대한 혼성화 및 스플라이싱 또는 스플라이스 조절과 연관된 RNase H 또는 효소와의 상호작용과 같은, 활성에 필요한 차후 단계를 방해하지 않을 수 있다. 특성들의 이러한 균형이 siRNA 화합물에서보다 단일가닥 안티센스 화합물의 설정에서 더 중요하며, 상기 콘주게이트는 센스 가닥에 간편하게 부착될 수 있다. 콘주게이트가 결여된 동일한 안티센스 화합물과 비교하여 생체내에서 간 세포에서 개선된 효능을 갖는 콘주게이트된 단일가닥 안티센스 화합물이 본원에 개시된다. 이들 화합물에 대해 특성들의 요구되는 균형을 고려할 때, 그와 같은 개선된 효능은 놀랍다.
특정 구현예에서, 본원의 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함한다. 언급한 바와 같이, 기전에 의해 얽매이지 않으면서, 콘주게이트가 흡수 증진을 제공하기 위해 충분히 긴 화합물 상에 유지되어야 하는 것이 논리적이지만, 이후에, 상기 콘주게이트의 일부분 또는 이상적으로는 모두가 절단되어 그것의 가장 활성 형태의 모 화합물 (예를 들면, 안티센스 화합물)을 방출하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 뉴클레오시드이다. 그와 같은 구현예는하나 이상의 절단가능 결합, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통한 뉴클레오시드를 통해 상기 콘주게이트 (클러스터)의 나머지를 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착시킴으로써 세포에서 내인성 뉴클레아제의 이점을 이용한다. 특정 구현예에서, 클러스터는 포스포디에스테르 연결을 통해 절단가능 뉴클레오시드에 결합된다. 특정 구현예에서, 절단가능 뉴클레오시드는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드 (안티센스 화합물)에 부착된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 2 또는 3 개의 절단가능 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 절단가능 뉴클레오시드는 서로 연결되고/거나, 안티센스 화합물에 연결되고/거나 절단가능 결합 (예컨대 포스포디에스테르 연결)을 통해 클러스터에 연결된다. 본원의 특정 콘주게이트는 절단가능 뉴클레오시드를 포함하지 않으며 대신에 절단가능 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오티드로부터의 콘주게이트의 충분한 절단은 세포에서 절단에 취약한 적어도 하나의 결합 (절단가능 결합)에 의해 제공되는 것으로 나타난다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 프로드럭이다. 그와 같은 프로드럭은 동물에게 투여되고 결국 더 많은 활성 형태로 대사작용된다. 예를 들면, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 콘주게이트의 모두 또는 일부를 제거하기 위해 절단되어 콘주게이트의 모두 또는 일부가 결여된 안티센스 화합물의 활성 (또는 더 많은 활성) 형태를 야기한다.
특정 구현예에서, 콘주게이트는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 부착된다. 특정 그와 같은 5'-콘주게이트는 3' 말단에서 부착된 유사한 콘주게이트 그룹을 갖는 대응물보다 더 효율적으로 절단된다. 특정 구현예에서, 개선된 활성은 개선된 절단과 관련될 수 있다. 특정 구현예에서, 5' 말단에 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 더 큰 효능을 갖는다 (예를 들면, 실시예 56, 81, 83, 및 84 참고). 게다가, 5'-부착은 보다 간단한 올리고뉴클레오티드 합성을 허용한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 3'에서 5' 방향으로 고체 지지체 상에서 합성된다. 3'-콘주게이트된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 전형적으로 전-콘주게이트된 3' 뉴클레오시드를고체 지지체에 부착시킨 다음 종래와 같이 올리고뉴클레오티드를 만든다. 그러나, 상기 콘주게이트된 뉴클레오시드를 고체 지지체에 부착하는 것은 합성에 문제가 된다. 게다가, 상기 접근법을 이용시, 이후 콘주게이트가 올리고뉴클레오티드의 합성 내내 존재하고 이후 단계 동안 분해될 수 있거나 사용될 수 있는 반응 및 시약의 종류를 제한할 수 있다. 5'-콘주게이트된 올리고뉴클레오티드에 대해 본원에 기재된 구조 및 기술을 이용하여, 당업자는 표준 자동화된 기술을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하고 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체로부터 절단된 후 최종 (5'-최말단) 뉴클레오시드를 갖는 콘주게이트를 도입할 수 있다.
본 기술분야 및 본 개시내용에 비추어, 숙련가는 본원에서 임의의 콘주게이트 및 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드를 쉽게 제조할 수 있다. 게다가, 본원에 개시된 특정 그와 같은 콘주게이트 및 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드의 합성은 더 쉽고/쉽거나 단계를 거의 필요로 하지 않으며, 따라서 이전에 개시된 콘주게이트보다 덜 비싸, 제조시 이점을 제공한다. 예를 들면, 특정 콘주게이트 그룹의 합성은 더 적은 합성 단계로 구성되어, 이전에 기재된 콘주게이트 그룹과 비교하여 증가된 수율을 야기한다. 실시예 46에서의 GalNAc3-10 및 실시예 48에서의 GalNAc3-7과 같은 콘주게이트 그룹들은 더 많은 화학적 중간체들의 조립을 요구하는 U.S. 제8,106,022호 또는 U.S. 제7,262,177호에 기술된 것과 같은 이전에 기재된 콘주게이트보다 훨씬 더 단순하다. 따라서, 본원에 기재된 이들 및 다른 콘주게이트들은 단일가닥 올리고뉴클레오티드 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 중 임의의 가닥 (예를 들면, siRNA)을 포함하는,임의의 올리고뉴클레오티드를 이용하기 위해 이전에 기재된 화합물보다 이점을 갖는다.
유사하게, 단지 1 또는 2개의 GalNAc 리간드를 갖는 콘주게이트 그룹들이 본원에서 개시된다. 나타난 바와 같이, 그러한 콘주게이트 그룹들은 안티센스 화합물의 활성을 개선한다. 그러한 화합물들은 3개의 GalNAc 리간드를 포함하는 콘주게이트보다 제조하기 훨씬 더 쉽다. 1 또는 2개의 GalNAc 리간드를 포함하는 콘주게이트 그룹들은 단일가닥 올리고뉴클레오티드 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 (예를 들면, siRNA)를 포함하는, 임의의 안티센스 화합물에 부착될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 콘주게이트들은 내성의 특정 측정값을 실질적으로 변화시키지 않는다. 예를 들면, 콘주게이트된 안티센스 화합물들은 비콘주게이트된 모 화합물보다 더 면역원성이 아닌 것으로 본원에 나타나 있다. 효능이 개선되므로, 내성이 동일하게 유지되는 (또는 사실상 내성이 효능 증가와 비교하여 단지 약간 악화되긴 하지만) 구현예는 치료요법에 대해 개선된 특성을 갖는다.
특정 구현예에서, 콘주게이션은 콘주게이션 부재시 덜 매력적인 결과를 갖는 방식으로 안티센스 화합물을 변경시키는 것을 허용한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 완전히 포스포로티오에이트 안티센스 화합물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포스포디에스테르 연결로 대체하는 것은 내성의 일부 측정에서 개선을 야기한다. 예를 들면, 특정 예에서, 하나 이상의 포스포디에스테르를 갖는 그와 같은 안티센스 화합물은 각각의 연결이 포스포로티오에이트인 동일한 화합물보다 덜 면역원성이다. 그러나, 특정 예에서, 실시예 26에서 나타난 바와 같이, 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결의 포스포디에스테르 연결로의 동일한 대체는 또한 감소된 세포성 흡수 및/또는 효능의 손실을 야기한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트된 안티센스 화합물은 콘주게이트된 완전한-포스포로티오에이트 대응물과 비교하여 흡수 및 효능에서 손실이 거의 없거나 전혀 없이 연결에서 그와 같은 변화를 견딘다. 사실상, 특정 구현예에서, 예를 들면, 실시예 44, 57, 59, 및 86에서, 콘주게이트및 적어도 하나의 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드들은 실제로 또한 동일한 콘주게이트를 포함하는 완전한 포스포로티오에이트 대응물과 비교하여도 생체내에서 증가된 효능을 나타낸다. 게다가, 콘주게이션은 흡수/효능에서 실질적인 증가를 야기하므로, 상기 실질적인 증가에서의 작은 손실은 개선된 내성을 달성하기 위해 허용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원의 안티센스 화합물의 콘주게이션은 간세포에서 증가된 전달, 흡수 및 활성을 야기한다. 따라서, 더 많은 화합물은 간 조직에 전달된다. 그러나, 특정 구현예에서, 상기 그러한 증가된 전달은 단독으로 활성의 전체 증가를 설명하지 못한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 더 많은 화합물은 간세포에 들어간다. 특정 구현예에서, 심지어 증가된 간세포 흡수도 활성의 전체 증가를 설명하지 못한다. 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트된 화합물의 생산적인 흡수는 증가된다. 예를 들면, 실시예 102에 나타난 바와 같이, GalNAc-함유 콘주게이트의 특정 구현예는 비-실질 세포에 비해 간세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 강화를 증가시킨다. 이러한 강화는 간세포에서 발현된 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 대해 유익하다.
특정 구현예에서, 본원의 콘주게이트된 안티센스 화합물은 감소된 신장 노출을 야기한다. 예를 들면, 실시예 20에 나타난 바와 같이, GalNAc-함유 콘주게이트의 특정 구현예를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 GalNAc-함유 콘주게이트가 없는 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 신장에서 더 낮다. 이것은 몇 개의 유익한 치료적 연루성을 갖는다. 신장에서의 활성이 추구되지 않는 치료적 징후에 대해, 신장에의 노출은 상응하는 이점 없이 신장 독성을 위태롭게 한다. 게다가, 신장의 고농도는 전형적으로 화합물의 소변으로 손실을 야기하고, 이로써 더 빠른 청소능을 얻는다. 따라서 비-신장 표적에 대해, 신장 축적은 바람직하지 않다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 하기 식으로 나타낸 콘주게이트된 안티센스 화합물을 제공한다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
C는 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
본원의 상기 도표 및 유사한 도표에서, 분지화 그룹 "D"는 "q"에 의해 명시되는 바와 같이 (E-F) 그룹의 수를 수용하기 위해 필요한 만큼 여러 번 분기된다. 따라서, q = 1인 경우, 식은 하기와 같다:
q = 2인 경우, 식은 하기와 같다:
q = 3인 경우, 식은 하기와 같다:
q = 4인 경우, 식은 하기와 같다:
q = 5인 경우, 식은 하기와 같다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
특정한 변수의 1 초과 (예를 들면, 1 초과 "m" 또는 "n")를 갖는 구현예에서, 달리 지적되지 않으면, 각각의 그와 같은 특정한 변수는 독립적으로 선택된다. 따라서, 1 초과 n을 갖는 구조에 대해, 각각의 n은 선택된 독립적으로 선택되고, 이로써, 서로 동일하거나 그렇지 않을 수 있다.
i.
특정 절단가능 모이어티
특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 결합이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 특정 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 세포-표적화 모이어티에 직접적으로 부착된다. 특정 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 콘주게이트 링커에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스페이트 또는 포스포디에스테르를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체는 퓨린, 치환된 퓨린, 피리미딘 또는 치환된 피리미딘로부터 선택된 임의로 보호된 헤테로환 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 우라실, 티민, 시토신, 4-N-벤조일시토신, 5-메틸시토신, 4-N-벤조일-5-메틸시토신, 아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 구아닌 및 2-N-이소부티릴구아닌로부터 선택된 임의로 보호된 헤테로환 염기를 포함하는 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된 2'-데옥시 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된2'-데옥시 아데노신이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된2'-데옥시 아데노신이다.
특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 위치에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2' 위치에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 링커에 부착된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는, 표적화된 세포에 의해 내면화된 직후에 복합물이 동물에게 투여된 후에 절단된다. 세포 내에서 절단가능 모이어티는 절단되고 그렇게 함으로써 활성 안티센스 올리고뉴클레오티드를 방출한다. 이론에 의해 제한되지를 바라지 않지만 절단가능 모이어티가 세포 내의 1 이상의 뉴클레아제에 의해 절단되는 것으로 믿는다. 특정 구현예에서, 1 이상의 뉴클레아제는 절단가능 모이어티와 링커 사이의 포스포디에스테르 연결을 절단한다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 각각의 Bx, Bx1, Bx2, 및 Bx3은 독립적으로 헤테로환 염기 모이어티이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
i.
특정 링커
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 링커를 포함한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 링커는 절단가능 모이어티에 공유결합된다. 특정 그와 같은 구현예에서, 링커는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 링커는 세포-표적화 모이어티에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 링커는 추가로, 고형 지지체에 대한 공유 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 추가로, 단백질 결합 모이어티에 대한 공유 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 추가로, 고형 지지체에 대한 공유결합을 포함하고, 추가로, 단백질 결합 모이어티에 대한 공유 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 연결된 리간드의 부착을 위한 다중 위치를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 연결된 리간드의 부착을 위한 다중 위치를 포함하고 분지화 그룹에 부착되지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 추가로, 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 링커를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 링커는 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 (-S-) 및 하이드록실아미노 (-O-N(H)-) 군으로부터 선택된 그룹을 포함하는 적어도 하나의 선형 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 알킬, 아미드 및 에테르 군으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 알킬 및 에테르 군으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 인 연결 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 포스포디에스테르 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 중성 연결 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티 및 절단가능 모이어티에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티 및 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티, 절단가능 모이어티 및 고형 지지체에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티, 절단가능 모이어티, 고형 지지체 및 단백질 결합 모이어티에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 링커는 스캐폴드 그룹에 공유결합된 선형 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 스캐폴드는 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록실아미노 군으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 스캐폴드는 알킬, 아미드 및 에테르 군으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 스캐폴드는 적어도 하나의 단환 또는 다환식 환계를 포함한다. 특정 구현예에서, 스캐폴드는 적어도 2 개의 단환 또는 다환식 환계를 포함한다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티 및 링커에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커 및 고형 지지체에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커 및 단백질 결합 모이어티에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고, 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커, 단백질 결합 모이어티 및 고형 지지체에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 링커는 단백질 결합 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 하기를 비제한적으로 포함하는 지질이다: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 그룹, 헥사데실글리세롤, 용뇌, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 펜옥사진), 비타민 (예를 들면, 폴레이트, 비타민 A, 비타민 E, 바이오틴, 피리독살), 펩티드, 탄수화물 (예를 들면, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고당, 다당류), 엔도솜분해적 구성성분, 스테로이드 (예를 들면, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜 (예를 들면, 트리테르펜, 예를 들면, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리에델라놀 유도된 리토콜산), 또는 양이온성 지질. 특정 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 C16 내지 C22 장쇄 포화된 또는 불포화된 지방산, 콜레스테롤, 콜산, 비타민 E, 아다만탄 또는 1-펜타플루오로프로필이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고 p는 1 내지 6이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, n은 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 L은, 독립적으로, 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, n은 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
i.
특정 세포-
표적화
모이어티
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 세포-표적화 모이어티를 포함한다. 특정 그와 같은 세포-표적화 모이어티는 안티센스 화합물의 세포성 흡수를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 분지화 그룹, 1 이상의 연결기, 및 1 이상의 리간드를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 분지화 그룹, 1 이상의 연결기, 1 이상의 리간드 및 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
1.
특정
분지화
그룹
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹 및 적어도 2 개의 연결된 리간드를 포함하는 표적 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 콘주게이트 링커를 첨부한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 절단가능 모이어티를 첨부한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 첨부한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 링커 및 각각의 연결된 리간드에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록실아미노 군으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬, 아미드 및 에테르 군으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬 및 에테르 군으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 단환 또는 다환식 환계를 포함한다. 특정 구현예에서, 분지화 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
j는 1 내지 3이고; 그리고
m은 2 내지 6이다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
m은 2 내지 6이다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
2.
특정
연결기
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹에 공유결합된 1 이상의 연결기를 포함한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 연결 그룹에 공유결합된 1 이상의 연결기를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 임의의 조합으로 알킬, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 아미드 및 폴리에틸렌 글리콜 군으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 임의의 조합으로 알킬, 치환된 알킬, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 아미드, 포스포디에스테르 및 폴리에틸렌 글리콜 군으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 임의의 조합으로 알킬, 에테르 및 아미드 군으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 임의의 조합으로 알킬, 치환된 알킬, 포스포디에스테르, 에테르 및 아미드 군으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 임의의 조합으로 알킬 및 포스포디에스테르로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기는 적어도 하나의 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹을 포함한다.
특정 구현예에서, 연결기는 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 연결기는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 포스포디에스테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 에테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 특정 구현예에서, 연결기는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다.
특정 구현예에서, 각각의 연결기는 리간드와 분지화 그룹 사이에 약 8 내지 약 20 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기 그룹은 리간드와 분지화 그룹 사이에 약 10 내지 약 18 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 연결기 그룹은 약 13 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다.
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
각각의 p는 1 내지 약 6이다.
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, L은 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹이고;
Z1 는 C(=O)O-R2 이고;
Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알키(alky)이고;
R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알키(alky)이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 연결기에 대해 0 초과이다.
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 연결기에 대해 0 초과이다.
특정 구현예에서, 연결기는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
특정 구현예에서, 연결기는 인 연결 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서, 연결기는 임의의 아미드 결합을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 연결기는 인 연결 그룹을 포함하고 임의의 아미드 결합을 포함하지 않는다.
3.
특정 리간드
특정 구현예에서, 본 개시내용은 리간드를 제공하고, 여기서 각각의 리간드는 연결기에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖는 각각의 리간드가 선택된다. 특정 구현예에서, 포유동물 간 세포의 표면 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드가 선택된다. 특정 구현예에서, 간 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)에 대해 친화성을 갖는 리간드가 선택된다. 특정 구현예에서, 각각의 리간드는 탄수화물이다. 특정 구현예에서, 각각의 리간드는, 갈락토오스, N-아세틸 갈락토오스아민, 만노스, 글루코오스, 글루코사몬 및 푸코스로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 각각의 리간드는 N-아세틸 갈락토오스아민 (GalNAc)이다. 특정 구현예에서, 표적 모이어티는 2 내지 6 개의 리간드를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 모이어티는 3 개의 리간드를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 모이어티는 3 N-아세틸 갈락토오스아민 리간드를 포함한다.
특정 구현예에서, 리간드는 탄수화물, 탄수화물 유도체, 변형된 탄수화물, 다가 탄수화물 클러스터, 다당류, 변형된 다당류, 또는 다당류 유도체이다. 특정 구현예에서, 리간드는 아미노 당 또는 티오 당이다. 예를 들면, 아미노 당은 당해기술에서 공지된 임의의 수의 화합물, 예를 들면 글루코사민, 시알산, α-D-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 2-아세트아미도-2-데옥시-D-갈락토파이라노스 (GalNAc), 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코파이라노스 (β-뮤람산), 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코파이라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노파이라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코파이라노스 및 N-설포-D-글루코사민, 및 N-글리콜로일-α-뉴라민산으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 티오 당류는 5-티오-β-D-글루코파이라노스, 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토파이라노스, 및 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코-헵토피라노사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 N-아세틸 갈락토사민으로서 문헌에서 통상적으로 칭해지는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 특정 구현예에서, "N-아세틸 갈락토사민"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 특정 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 특정 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 지힝하고, 이는 하기 β-유형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 하기 α-유형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 둘 다를 포함한다. 특정 구현예에서, β-유형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 α-유형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 형태가 묘사된 구조에서, 이들 구조는 다른 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, α-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스의 구조가 보여지는 경우, 이러한 구조는 다른 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 특정 바람직한 구현예에서, β-형 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스는 바람직한 구현예이다.
특정 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 R1은 OH 및 NHCOOH로부터 선택된다.
특정 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
i. 특정
콘주게이트
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 상기의 구조적 특징을 포함한다. 특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
상기 식 중에서, 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고;
Q는 안티센스 화합물이고;
X는 O 또는 S이고; 그리고
Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트는 피롤리딘을 포함하지 않는다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 6 내지 11 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 10 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 4 내지 11 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이고 상기 연결기는 정확하게 하나의 아미드 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y 및 Z는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹, 또는 에테르, 케톤, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 트리아졸, 피롤리딘, 디설파이드, 또는 티오에테르를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y 및 Z는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 기, 또는 정확하게 하나의 에테르 또는 정확하게 2 개의 에테르, 아미드, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 또는 포스포로티오에이트를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y 및 Z는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 m 및 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 독립적으로 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 m은 4, 5, 6, 7, 또는 8이고, n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 8 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이고, 상기 연결기는 정확하게 하나의 아미드 결합을 포함하고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 연결기이고, 상기 연결기는 아미드 결합 및 치환된 또는 비치환된 C2-C11 알킬 기로 구성된다.
특정 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹, 또는 에테르, 케톤, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 트리아졸, 피롤리딘, 디설파이드, 또는 티오에테르를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 기, 또는 에테르, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 또는 포스포로티오에이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 군으로부터 선택된다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
여기서 n은 4, 5, 6, 7, 또는 8이다.
a. 특정
콘주게이트된
안티센스
화합물
특정 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오시드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드에 결합된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
C는 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
C는 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 링커는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 그와 같은 구현예에서, 분지화 그룹은 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서 각각의 연결기는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오시드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드에 결합된다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
C는 콘주게이트 링커이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오시드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드에 결합된다. 특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
C는 콘주게이트 링커이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
여기서,
A는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 연결기이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
특정 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 링커는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서 각각의 연결기는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
상기 언급된 콘주게이트, 콘주게이트된 안티센스 화합물, 연결기, 링커, 분지화 그룹, 리간드, 절단가능 모이어티 뿐만 아니라 다른 변형 중 특정 것의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허들, 미국 특허 출원 공보, 및 국제 특허 출원 공보는 비제한적으로, 하기를 포함한다: US 5,994,517, US 6,300,319, US 6,660,720, US 6,906,182, US 7,262,177, US 7,491,805, US 8,106,022, US 7,723,509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 및 WO 2012/037254, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
상기 언급된 콘주게이트, 콘주게이트된 안티센스 화합물, 연결기, 링커, 분지화 그룹, 리간드, 절단가능 모이어티 뿐만 아니라 다른 변형의 특정 것의 제조를 교시하는 대표적인 공보는 비제한적으로, 하기를 포함한다: BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, 및 Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, (이들 각각은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨).
특정 구현예에서, 콘주게이트된 안티센스 화합물은 RNase H 기반 올리고뉴클레오티드 (예컨대 갭머) 또는 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드 (예컨대 완전 변형된 올리고뉴클레오티드) 및 적어도 1, 2, 또는 3개의 GalNAc 그룹을 포함하는 임의의 콘주게이트 그룹을 포함한다. 특정 구현예에서 접합된 안티센스 화합물은 하기 참조 중 임의의 것에서 발견된 임의의 콘주게이트 그룹을 포함한다: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; 국제 출원 WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788; WO2004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131; WO2011/163121; WO2012/177947; WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185; WO2012/083046; WO2009/082607; WO2009/134487; WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563; WO2010/088537; WO2002/043771; WO2010/129709; WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757; WO2010/054406; WO2012/089352; WO2012/089602; WO2013/166121; WO2013/165816; 미국 특허 4,751,219; 8,552,163; 6,908,903; 7,262,177; 5,994,517; 6,300,319; 8,106,022; 7,491,805; 7,491,805; 7,582,744; 8,137,695; 6,383,812; 6,525,031; 6,660,720; 7,723,509; 8,541,548; 8,344,125; 8,313,772; 8,349,308; 8,450,467; 8,501,930; 8,158,601; 7,262,177; 6,906,182; 6,620,916; 8,435,491; 8,404,862; 7,851,615; 공보된 미국 특허 국제 출원 US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740; US2008/0281044; US2010/0240730; US2003/0119724; US2006/0183886; US2008/0206869; US2011/0269814; US2009/0286973; US2011/0207799; US2012/0136042; US2012/0165393; US2008/0281041; US2009/0203135; US2012/0035115; US2012/0095075; US2012/0101148; US2012/0128760; US2012/0157509; US2012/0230938; US2013/0109817; US2013/0121954; US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; 및 US2009/0203132 (이들 각각은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨).
세포 배양물 및
안티센스
화합물 치료
PKK 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과는 다양한 세포 유형에서 시험관내에서 시험될 수 있다. 그와 같은 분석을 위해 사용된 세포 유형은 상업적 판매인 (예를 들면 American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)으로부터 이용가능하고 세포는 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하여 판매인의 지침에 따라 배양된다 (예를 들면 Life Technologies, Carlsbad, CA). 예시적인 세포 유형은, 비제한적으로, HepaRG™ T 세포 및 마우스 일차 간세포를 포함한다.
안티센스
올리고뉴클레오티드의
시험관내
시험
다른 안티센스 화합물에 의한 치료를 위해 적절하게 변형될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 세포의 치료 방법이 본원에 기재되어 있다.
일반적으로, 세포는, 세포가 배양물에서 대략 60-80% 밀집도에 도달할 때 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 통상적으로 사용된 하나의 시약은 양이온성 지질 형질감염 시약 LIPOFECTIN (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 원하는 최종 농도 및 2 내지 12 ug/mL / 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 범위인 LIPOFECTIN 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 LIPOFECTIN와 혼합될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 사용된 또 하나의 시약은 LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 원하는 농도 및 2 내지 12 ug/mL / 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 범위인 LIPOFECTAMINE 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM 1 감소된 혈청 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 LIPOFECTAMINE와 혼합된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 사용된 또 하나의 기술은 전기천공을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양 세포에 도입하기 위해 사용된 또 하나의 기술은 세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 자유 흡수를 포함한다.
세포는 일상적인 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드로 치료된다. 세포는 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 16-24 시간 후에 수확되고, 그 시간에 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준은 당해분야에서 공지되고 본원에 기재된 방법으로 측정된다. 일반적으로, 치료가 다중 복제물에서 수행될 때, 데이터는 복제물 치료의 평균으로서 제공된다.
사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주에서 세포주로 변한다. 특정한 세포주에 대한 최적의 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 LIPOFECTAMINE으로 형질감염될 때 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도에서 전형적으로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전기천공을 사용하여 형질감염될 때 625 내지 20,000 nM 범위의 고농도에서 사용된다.
RNA 단리
RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행될 수 있다. RNA 단리의 방법은 당해기술에 공지되어 있다. RNA는 제조자의 추천된 프로토콜에 따라 당해기술에서 공지된 방법, 예를 들면, TRIZOL 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조된다.
표적 수준 또는 발현의 억제 분석
PKK 핵산의 수준 또는 발현의 억제는 당해기술에서 공지된 다양한 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산 수준은, 예를 들면, 노던 블랏 분석, 경쟁적 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 또는 정량적 실시간 PCR에 의해 정량화될 수 있다. RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행될 수 있다. RNA 단리의 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 노던 블랏 분석은 당해기술에서 또한 일상적이다. 정량적 실시간 PCR은 상업적으로 이용가능한 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA로부터 이용가능)을 사용하여 편리하게 달성될 수 있고 제조자의 지침에 따라 사용된다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간
PCR
분석
표적 RNA 수준의 정량화는 제조자의 지침에 따라 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 달성될 수 있다. 정량적 실시간 PCR의 방법은 당해기술에 공지되어 있다.
실시간 PCR 전에, 단리된 RNA에 대해 역전사효소 (RT) 반응이 수행되고, 이 반응은 상보적 DNA (cDNA)을 생산하고 그 다음 실시간 PCR 증폭에 대한 기질로서 사용된다. RT 및 실시간 PCR 반응은 동일 샘플 웰에서 순차적으로 수행된다. RT 및 실시간 PCR 시약은 Invitrogen (Carlsbad, CA)로부터 수득될 수 있다. RT, 실시간-PCR 반응은 당해분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 수행된다.
실시간 PCR에 의해 수득된 유전자 (또는 RNA) 표적 양은, 발현이 일정한 유전자, 예컨대 시클로필린 A의 발현 수준을 사용하거나, RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)을 사용하여 총 RNA를 정량화하여 정규화된다. 시클로필린 A 발현은 실시간 PCR에 의해, 표적과 동시에, 다중화, 또는 별도로 시행하여 정량화된다. 총 RNA는 RIBOGREEN RNA 정량화 시약 (Invitrogen, Inc. Eugene, OR)을 사용하여 정량화된다. RIBOGREEN에 의한 RNA 정량화의 방법은 하기에서 교시된다: Jones, L.J., 등, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). CYTOFLUOR 4000 기기 (PE Applied Biosystems)는 RIBOGREEN 형광을 측정하기위해 사용된다.
프로브 및 프라이머는 PKK 핵산에 대한 혼성화를 위해 설계된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하는 방법은 당해기술에 공지되어 있고 소프트웨어 예컨대 PRIMER EXPRESS 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 사용을 포함할 수 있다.
단백질 수준 분석
PKK 핵산의 안티센스 억제는 PKK 단백질 수준을 측정하여 평가될 수 있다. PKK의 단백질 수준은 당해기술에 공지된 다양한 방식, 예컨대 면역침전, 웨스턴 블랏 분석 (면역블로팅), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 정량적 단백질 검정, 단백질 활성 검정 (예를 들면, 카스파제 활성 검정), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)으로 평가 또는 정량화될 수 있다. 표적에 대해 지향된 항체는 다양한 공급원, 예컨대 항체의 MSRS 카탈로그 (Aerie Corporation, Birmingham, MI)으로부터 동정 및 수득될 수 있고, 또는 당해기술에 잘 공지된 종래의 단클론성 또는 다클론성 항체 생성 방법을 통해 제조될 수 있다.
안티센스
화합물의 생체내 시험
안티센스 화합물, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, PKK의 발현을 억제하고 표현형 변화를 생성하기 위해 그것의 능력을 평가하기 위해 동물에서 시험된다.
특정 구현예에서, 그러한 표현형 변화는 예컨대 감소된 염증, 부종/종창, 혈관투과성, 및 혈관 유출과 같은 염증성 질환과 관련된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 염증은 동물에서의 부종, 온도, 고통, 조직의 색, 및 복부 기능의 증가 또는 감소를 측정함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 그러한 표현형 변화는 예컨대 연장된 aPTT, 정상 PT와 조합한 연장된 aPTT 시간, 혈소판 인자 4 (PF-4)의 감소된 양, 및 혈전 형성에 대한 감소된 혈전 형성 또는 증가된 시간과 같은 혈전색전성 질환과 관련된 것들을 포함한다.
시험은 정상동물, 또는 실험 질환 모델에서 수행될 수 있다. 동물에의 투여에 대해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 예컨대 포스페이트-완충 식염수에서 제형된다. 본 발명의 화합물에 대한 투여 경로는, 복강내, 정맥내, 근육내, 및 피하내와 같은 비경구 투여 경로를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여 및 투여 빈도의 산출은 당업자의 능력 내에 있으며, 투여 경로 및 동물 체중과 같은 인자에 따라 달라진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료 기간 다음에, RNA는 간 조직으로부터 단리되고 PKK 핵산 발현의 변화가 측정된다.
특정 징후
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체의 치료 방법이 제공된다.
특정 구현예에서, 개체는 염증성 질환을 갖는다. 특정 구현예에서, 개체는 유전성 혈관부종(HAE), 부종, 혈관부종, 종창, 눈꺼풀의 혈관부종, 눈의 부종, 황반 부종, 및 뇌 부종을 비제한적으로 포함하는 염증성 병태를 발병할 위험이 있다. 이는 염증, 예를 들어 염증성 병태에 대한 유전적 소인, 환경적 인자, 및 특정 약제, 예를 들어 ACE 억제제 및 ARB에 대한 노출의 위험을 야기하는 후천적 문제, 질환, 또는 장애를 갖는 개체를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체는 항-염증 요법이 필요한 것으로 식별되었다. 그러한 개체의 예시는 비제한적으로, 보체 1 에스테라아제 억제제 (즉, C1-INH) 또는 인자 12에 대한 유전자 코드의 변이를 갖는 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 비정상 코드는 C1-INH (즉, 유형 I HAE)의 결핍, 기존 C1-INH을 정상 기능 불능 (유형 II HAE), 또는 과기능성 인자 12 (즉, 유형 III HAE)를 야기할 수 있다.
특정 구현예에서, 개체는 혈전색전성 질환을 갖는다. 특정 구현예서, 개체는 비제한적으로 경색, 혈전증, 색전증, 심부정맥혈전증, 폐색전증과 같은 혈전색전증, 심근경색증, 및 뇌졸중을 포함하는 혈액 응고 장애에 대한 위험에 처해있다. 이는 혈전증의 위험, 예를 들어 수술, 암, 부동성, 패혈증, 죽상동맥경화증, 심방 세동을 야기하는 후천적 문제, 질환, 또는 장애를 갖는 개체들 뿐만 아니라 예를 들어 항인지질항체증후군 및 상염색체 우성 병태, 인자 V 레이든(Leiden)과 같은 유전적 소인을 갖는 개체들을 포함한다. 특정 구현예에서, 개체는 항-응고 요법이 필요한 것으로 식별되었다. 그와 같은 개체의 예는 비제한적으로, 주요 정형외과 수술을 겪은 개체 (예를 들어 둔부/무릎 치환술 또는 둔부 골절 수술) 및 만성 치료를 필요로 하는 환자, 예를 들어 뇌졸중 전 단계의 심방 세동으로 고통받고 있는 개체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 개체에서 PKK 발현을 예방적으로 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예는 PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물의 치료학적 유효량을 개체에 투여함으로써 이를 필요로하는 개체를 치료하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물의 치료학적 유효량의 투여는 개체의 혈청에서 PKK 수준을 모니터링하여 안티센스 화합물 투여에 대한 개체의 반응을 측정하는 것을 수반한다. 안티센스 화합물 투여에 대한 개체의 반응은 치료적 처치의 양 및 기간을 결정하는 의료진에 의하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, PKK 핵산에 표적화된 안티센스 화합물의 투여는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 만큼 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위 내로 PKK 발현의 감소를 초래한다. 특정 구현예에서, PKK에 대해 표적화된 안티센스 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 염증성 질환 또는 혈전색전성 질환을 앓고 있거나 그것에 민감한 환자를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 사용된다.
특정 조성물
1. ISIS
546254
특정 구현예에서, ISIS 546254는 5-10-5 MOE 갭머로 특징화되고, 이는 TGCAAGTCTCTTGGCAAACA (서열 번호: 570로서 본원에서 포함)의 서열 (5'로부터 3'으로)을 갖고, 여기서 각 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2’-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이며, 그리고 각 뉴클레오시드 6-15는 2'-데옥시뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, ISIS 546254은 하기 화학 표기로 기재될 수 있다: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; 여기서
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, ISIS 546254은 하기 화학 구조로 기재될 수 있다:
구조 1. ISIS 546254
특정 구현예에서, 실시예 2 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISIS 546254는, 24시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 5,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 인간 PKK mRNA의 95%의 억제를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 5 (본원의 하기표 34 및 41 참고)에 제공된 바와 같이, ISIS 546254는, 16시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 4 포인트 용량 반응 곡선 (0.19 μM, 0.56 μM, 1.67 μM, 및 5.0 μM)에서의 0.2μM 및 0.3μM의 IC50를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 7 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISIS 546254는, ISIS 546254로 2.5 mg/kg/주, 5.0 mg/kg/주, 10 mg/kg/주 또는 20 mg/kg/주로 3주간 일주일에 2회 피하로 주사될 때, 인간 PKK 유전자 서열을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 PKK mRNA 억제를 31%, 55%, 84%, 및 83%, 그리고 인간 PKK 단백질 억제를 0%, 36%, 51%, 및 76% 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 8 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISISI 546254는 PKK mRNA 및 단백질 발현을 억제하는데 효과적인고, 영장류에서 내성이 있다.
2. ISIS
546343
특정 구현예에서, ISIS 546343는 5-10-5 MOE 갭머로 특징화되고, 이는 CCCCCTTCTTTATAGCCAGC (서열 번호: 705로서 본원에서 포함)의 서열 (5'로부터 3'으로)을 갖고, 여기서 각 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각 시토신은 5-메틸시토신이고, 그리고 뉴클레오시드 1-5 및 16-20은 2’-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이며, 그리고 각 뉴클레오시드 6-15는 2'-데옥시뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, ISIS 546343는 다음 화학 표기: mCes mCes mCes mCes mCes Tds Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds Ads Gds mCes mCes Aes Ges mCe로 기재되며;
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, ISIS 546343은 하기 화학 구조로 기재될 수 있다:
구조 2. ISIS 546343
특정 구현예에서, 실시예 2 (본원의 하기 표 9 및 10 참고)에 제공된 바와 같이, ISIS 546343은, 24시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 5,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 인간 PKK mRNA의 97% 및 91%의 억제를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 5 (본원의 하기 표 34 및 41 참고)에 2회 제공된 바와 같이, ISIS 546343는, 16시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 4 포인트 용량 반응 곡선 (0.19 μM, 0.56 μM, 1.67 μM, 및 5.0 μM)에서의 0.4 μM의 IC50를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 7 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISIS 546343은, ISIS 546343으로 2.5 mg/kg/주, 5.0 mg/kg/주, 10 mg/kg/주 또는 20 mg/kg/주로 3주간 일주일에 2회 피하로 주사될 때, 인간 PKK 유전자 서열을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 PKK mRNA 억제를 46%, 66%, 및 86%, 그리고 인간 PKK 단백질 억제를 0%, 38%, 및 79% 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 8 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISISI 546343는 PKK mRNA 및 단백질 발현을 억제하는데 효과적인고, 영장류에서 내성이 있다.
3. ISIS
548048
특정 구현예에서, ISIS 548048는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 특징화되고, 이는 CGATATCATGATTCCC (서열 번호: 1666으로서 본원에서 포함)의 핵염기 서열 (5'로부터 3'으로)을 갖고, 이는 16개의 2'-데옥시뉴클레오시드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드 및 cEt 변형된 뉴클레오시드로 이루어지고, 뉴클레오시드 1, 2, 및 16 각각은 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이며, 여기서 뉴클레오시드 3, 14, 및 15 각각은 cEt 변형된 뉴클레오시드이고, 뉴클레오시드 4-13 각각은 2'-데옥시뉴클레오시드이고, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 그리고 각 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구현예에서, ISIS 548048는 다음 화학 표기: mCes Ges Aks Tds Ads Tds mCds Ads Tds Gds Ads Tds Tds mCks mCks mCe로 기재되며;
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
K는 cEt 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 구현예에서, ISIS 548048은 하기 화학 구조로 기재될 수 있다:
구조 3. ISIS 548048
특정 구현예에서, 실시예 3 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISIS 548048은, 24시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 mRNA의 84%의 억제를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 6 (본원의 하기 참고)에 제공된 바와 같이, ISIS 548048는, 16시간의 처리 기간 후, 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의하여 측정되고 RIBOGREEN®에 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정된 바와 같이, 전기천공을 사용하여 형질감염될 때, 배양된 HepaRG™ 세포 (웰 당 20,000 세포의 농도) 내의 4 포인트 용량 반응 곡선 (0.11 μM, 0.33 μM, 1.00 μM, 및 3.00 μM)에서의 0.1 μM의 IC50를 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 7 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISIS 548048은, ISIS 548048로 2.5 mg/kg/주, 5.0 mg/kg/주, 10 mg/kg/주 또는 20 mg/kg/주로 3주간 일주일에 2회 피하로 주사될 때, 인간 PKK 유전자 서열을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 PKK mRNA 억제를 7%, 77%, 72% 및 80%, 그리고 인간 PKK 단백질 억제를 23%, 70%, 89%, 및 98% 달성하였다.
특정 구현예에서, 실시예 8 (본원의 하기)에 제공된 바와 같이, ISISI 548048는 PKK mRNA 및 단백질 발현을 억제하는데 효과적인고, 영장류에서 내성이 있다.
4. ISIS
721744
특정 구현예에서, ISIS 721744는 5-10-5 MOE 갭머로 특징화되고, 이는 TGCAAGTCTCTTGGCAAACA (서열 번호: 570로서 본원에서 포함)의 서열 (5'로부터 3'으로)을 갖고, 여기서 뉴클레오시드 3 내지 4, 4 내지 5, 16 내지 17, 및 17 내지 18 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이고, 뉴클레오시드 1 내지 2, 2 내지 3, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 18 내지 19, 및 19 내지 20 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 각 시토신은 5’-메틸시토신이고, 뉴클레오시드 1-5 및 16-20의 각각은 2’-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고, 그리고 뉴클레오시드 6-15 각각은 2’-데옥시뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, ISIS 721744은 하기 화학 표기로 기재될 수 있다: GalNAc3-7a-o’Tes Ges mCeo Aeo Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aeo Aeo Aes mCes Ae; 여기서,
A는 아데닌이고,
mC는 5-메틸시토신이며,
G는 구아닌이고,
T는 티민이며,
e는 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오시드이고,
d는 2'-데옥시뉴클레오시드이며,
o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이고, 그리고
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
GalNAc3-7a-o’ =
특정 구현예에서, ISIS 721744은 하기 화학 구조로 기재될 수 있다:
특정 빈발 영역
1. 서열 번호: 10의
핵염기
27427-27466
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 27427-27466을 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 530993, 530994, 530995, 546251, 546252, 546253, 546254, 546255, 546256, 547410, 547411, 547978, 547979, 547980, 및 547981.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 94, 95, 96, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 1597, 1598, 1599, 및 1600.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27466을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
2. 서열 번호: 10의
핵염기
33183-33242
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 33183-33242를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531052, 531053, 531054, 531055, 531056, 531057, 531158, 546343, 546345, 547480, 547481, 547482, 및 547483.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 261, 702, 703, 704, 705, 706, 및 707.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33183-33242를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK mRNA 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
3. 서열 번호: 10의
핵염기
30570-30610
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 30570-30610를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531026, 546309, 546310, 546311, 546313, 547453, 547454, 547455, 547456, 547457, 547458, 548046, 548047, 548048, 548049, 및 548050.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 129, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 1664, 1665, 1666, 1667, 및 1668.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30570-30610를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK mRNA 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
4. 서열 번호: 10의
핵염기
27427-27520
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 27427-27520를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 530993-530999, 546251-546256, 546258-546260, 546263, 546265-546268, 547410-547417, 및 547978-547992.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 94-100, 566-587, 및 1597-1611.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27427-27520를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
5. 서열 번호: 10의
핵염기
33085-33247
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 33085-33247를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531041-531158, 546336, 546339, 546340, 546343, 546345, 547474-547483, 547778, 548077-548082, 및 548677-548678.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 144-160, 261, 693-707, 1256, 1320-1325, 2214, 및 2215.
특정 구현예에서, 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33085-33247를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
6. 서열 번호: 10의
핵염기
30475-30639
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 30475-30639를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531021-531029, 531146, 546297, 546299-546304, 546306-546311, 546313, 546316-546319, 547444-547462, 548031, 548032, 및 548034-548056.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 124-132, 249, 633-669, 및 1650-1674.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30475-30639를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
7. 서열 번호: 10의
핵염기
27362-27524
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 27362-27524를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 핵염기 27362-27524는 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19) PKK의 엑손 9에 상응한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27362-27524는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27362-27524는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27361-27524는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 530985-530999, 546244, 546247-546256, 546258-546260, 546263, 546265-546268, 547403-547417, 547723, 547968-547970, 및 547972-547992.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27361-27524는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 86-100, 554-587, 1217, 및 1588-1611.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 27362-27524를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
8. 서열 번호: 10의
핵염기
33101-33240
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 33101-33240를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 핵염기 33101-33240는 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19) PKK의 엑손 14에 상응한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531041-531158, 546336, 546339, 546340, 546343, 546345, 547474-547483, 548077-548082, 및 548678-548678.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 144-160, 261, 693-707, 1320-1325, 및 2215.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 33101-33240를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
9. 서열 번호: 10의
핵염기
30463-30638
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 10의 표적 핵염기 30463-30638를 표적화하도록 설계된다 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19). 특정 구현예에서, 핵염기 30463-30638는 (핵염기 111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자 은행 수탁 번호 NT_016354.19) PKK의 엑손 12에 상응한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638는 빈발 영역이다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 표적화된다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 특정 구현예에서, 갭머는 5-10-5 MOE 및 cEt 갭머, 4-9-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 4-10-3 MOE 및 cEt 갭머, 3-10-4 MOE 및 cEt 갭머, 또는 3-10-3 MOE 및 cEt 갭머이다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결에 의하여 연결된다.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638는 하기 ISIS 번호에 의하여 표적화된다: 531021-531029, 531146, 546297, 546299-546304, 546306-546311, 546313, 546316-546319, 547444-547462, 548031, 548032, 및 548034-548056.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638는 하기 서열 번호에 의하여 표적화된다: 124-132, 249, 633-669, 및 1650-1674.
특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 핵염기 30463-30638를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 시험관 내 및 생체내 PKK 및/또는 단백질 수준의 감소를 달성한다.
실시예
비-제한된 개시내용 및 참고에 의한 혼입
본원에서 기재된 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예에 따라 구체적으로 기재되었지만, 하기 실시예는 본원에서 기재된 화합물을 단지 설명하기 위해 쓰이고 그것을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 인용된 참고 문헌 각각은, 이의 전문이 참고로 본원에 혼입되어 있다.
하기 실시예는 본 개시내용의 특정 구현예를 설명하고 제한하지는 않는다. 게다가, 특정 구현예가 제공되는 경우, 본 발명자들 특정 구현예의 포괄적인 적용을 고려했다. 예를 들면, 특정한 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드의 개시내용은 동일한 또는 유사한 모티프를 갖는 추가의 올리고뉴클레오티드에 대한 합리적인 지지를 제공한다. 그리고, 예를 들면, 특정한 고-친화성 변형이 특정한 위치에서 나타나는 경우, 동일한 위치에서의 다른 고-친화성 변형은, 달리 지적되지 않으면 적당한 것으로 고려된다.
실시예
1:
포스포아미다이트
, 화합물 1, 1a, 및 2의 제조를 위한 일반 방법
Bx는 헤테로환 염기이다;
화합물 1, 1a, 및 2를 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 분야에서 잘 알려진 절차에 따라 제조하였다 (참고: Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); 및 또한 참고: 공보된 PCT 국제 출원 (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478, 및 WO 2007/090071), 및 미국 특허 7,569,686).
실시예
2: 화합물
7의 제조
화합물 3 (2-아세트아미도-1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-데옥시-β-D갈락토파이라노스 또는 갈락토사민 펜타아세테이트)는 시판되고 있다. 화합물 5은 공개된 절차에 따라 제조되었다 (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
실시예
3: 화합물
11의 제조
화합물 8 및 9는 시판되고 있다.
실시예
4: 화합물
18의 제조
화합물 11은 실시예 3에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 14는 시판되고 있다. 화합물 17은 하기에 의해 보고된 유사한 절차를 사용하여 제조되었다: Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
실시예
5: 화합물
23의 제조
화합물 19 및 21는 시판되고 있다.
실시예
6: 화합물
24의 제조
화합물 18 및 23는 실시예 4 및 5에서 실증된 절차에 따라 제조되었다.
실시예
7: 화합물
25의 제조
화합물 24은 실시예 6에서 실증된 절차에 따라 제조되었다.
실시예
8: 화합물
26의 제조
화합물 24은 실시예 6에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
9: GalNAc3
-
1를
3' 말단에서 포함하는
콘주게이트된
ASO의
일반적인 제조, 화합물 29
상기 보호된 GalNAc 3 - 1는 하기 구조를 갖는다:
콘주게이트 그룹 GalNAc3-1의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-1a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-1a은 하기 화학식을 갖는다:
고형 지지체 결합된 보호된 GalNAc 3 -1, 화합물 25는 실시예 7에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. GalNAc 3 -1을 3' 말단에서 포함하는 올리고머 화합물 29는 자동화된 DNA/RNA 합성에서 표준 절차를 사용하여 제조되었다 (참고: Dupouy et al., Angew . Chem . Int . Ed., 2006, 45, 3623-3627). 포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 1 및 1a는 실시예 1에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적이고, 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록이 사용되어 소정의 순서 및 조성을 갖는 올리고 화합물을 제조할 수 있는 것처럼 한정으로서 의도되지 않는다는 것을 의미한다. 고형 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 조정되어 본원에서 기재된 갭핑된 올리고머 화합물을 제조할 수 있다. 그와 같은 갭핑된 올리고머 화합물은 임의의 주어진 표적에 의해 지시되는 바와 같이 소정의 조성물 및 염기 서열을 가질 수 있다.
실시예
10: GalNAc
3
-
1를
5' 말단에서 포함하는
콘주게이트된
ASO의
일반적인 제조, 화합물 34
UnylinkerTM 30는 시판되고 있다. GalNAc 3 -1을 5' 말단에서 포함하는 올리고머 화합물 34는 자동화된 DNA/RNA 합성에서 표준 절차를 사용하여 제조되었다 (참고: Dupouy et al., Angew . Chem . Int . Ed., 2006, 45, 3623-3627). 포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 1 및 1a는 실시예 1에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적이고, 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록이 사용되어 소정의 순서 및 조성을 갖는 올리고 화합물을 제조할 수 있는 것처럼 한정으로서 의도되지 않는다는 것을 의미한다. 고형 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 조정되어 본원에서 기재된 갭핑된 올리고머 화합물을 제조할 수 있다. 그와 같은 갭핑된 올리고머 화합물은 임의의 주어진 표적에 의해 지시되는 바와 같이 소정의 조성물 및 염기 서열을 가질 수 있다.
실시예
11: 화합물
39의 제조
화합물 4, 13 및 23는 실시예 2, 4, 및 5에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 35는 하기에서 공지된 유사한 절차를 사용하여 제조된다: Rouchaud et al., Eur. J. Org. Chem., 2011, 12, 2346-2353.
실시예
12: 화합물
40의 제조
화합물 38은 실시예 11에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
13: 화합물
44의 제조
화합물 23 및 36은 실시예 5 및 11에서 실증된 절차에 따라 제조된다. 화합물 41는 하기에서 공지된 유사한 절차를 사용하여 제조된다: WO 2009082607.
실시예
14: 화합물
45의 제조
화합물 43은 실시예 13에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
15: 화합물
47의 제조
화합물 46는 시판되고 있다.
실시예
16: 화합물
53의 제조
화합물 48 및 49는 시판되고 있다. 화합물 17 및 47은 실시예 4 및 15에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
17: 화합물
54의 제조
화합물 53은 실시예 16에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
18: 화합물
55의 제조
화합물 53은 실시예 16에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
19: 3
' 고체상 기술을 통해 위치에서
GalNAc
3
-1을 포함하는
콘주게이트된
ASO의
일반적인 제조 방법 (ISIS 647535, 647536 및 651900의 제조)
달리 언급되지 않으면, 올리고머 화합물의 합성을 위해 사용된 모든 시약 및 용액은 상업적 공급원으로부터 구매된다. 표준 포스포르아미다이트 빌딩 블록 및 고체 지지체는, 예를 들면 T, A, G, 및 mC 잔기를 포함하는 뉴클레오시드 잔기의 혼입을 위해 사용된다. 무수 아세토니트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1 M 용액을 β-D-2’-데옥시리보뉴클레오시드 및 2'-MOE에 사용하였다.
ASO 합성은 ABI 394 합성기 (1-2 μmol 규모) 상에서, 또는 칼럼에 충전된 GalNAc 3 -1 로딩된 VIMAD 고형 지지체 (110 μmol/g, Guzaev 등, 2003) 상에서 포스포르아미다이트 커플링 방법에 의해 GE Healthcare Bioscience 
올리고파일럿 합성기 (40-200 μmol 규모) 상에서 수행되었다. 커플링 단계의 경우, 포스포르아미다이트를 고체 지지체의 로딩에 대해 4배 과량으로 전달하였고, 포스포르아미다이트 응축을 10분 동안 수행하였다. 모든 다른 단계는 제조자에 의해 공급된 표준 프로토콜을 따랐다. 톨루엔 중 6% 디클로로아세트산의 용액은 디메톡시트리틸 (DMT) 그룹을 뉴클레오티드의 5'-하이드록실 그룹로부터 제거하기 위해 사용되었다. 무수 CH3CN 중 4,5-디시아노이미다졸 (0.7 M)은 커플링 단계 동안에 활성제로서 사용되었다. 포스포로티오에이트 연결을 3분의 접촉 시간 동안에 1:1 피리딘/CH3CN 중의 크산탄 하이드라이드의 0.1 M 용액을 이용한 황화에 의해 도입하였다. 6% 물을 함유하는 CH3CN 중의 20% tert-부틸하이드로퍼옥사이드의 용액을 산화제로서 사용하여 12분의 접촉 시간으로 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 제공하였다.
원하는 서열이 조립된 후, 시아노에틸 포스페이트 보호 그룹은 45 분의 접촉 시간과 함께 트리에틸아민 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물을 사용하여 탈보호되었다. 상기 고체-지지체 결합된 ASO를 암모니아수 (28-30 중량 %)에 현탁시키고 55 에서 6시간 동안 가열하였다.
그리고 나서, 미결합된 ASO를 여과하고 암모니아를 가열로 제거하였다. 잔류물을 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다(GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 μm, 2.54 x 8 cm, A = 30% 수성 CH3CN 중의 100 mM 암모늄 아세테이트, B = A 중의 1.5 M NaBr, 60분에 0-40%의 B, 유량 14 mL min-1, λ = 260 nm). 잔류물을 역상 칼럼 상의 HPLC에 의해 탈염하여, 고체 지지체 상의 초기 로딩을 기준으로 15-30%의 단리된 수율로 원하는 ASO를 얻었다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는 이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
콘주게이트를 포함하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당해기술에서 잘 알려진 표준 올리고뉴클레오티드 합성 절차를 사용하여 합성되었다.
이들 방법을 사용하여, ApoC III을 표적으로 하는 3 개의 별개의 안티센스 화합물이 제조되었다. 아래의 표 17에서 요약된 바와 같이, 각각의 ApoC III를 표적으로 하는 3 개의 안티센스 화합물은 동일한 핵염기 서열을 가졌고; ISIS 304801는 모든 포스포로티오에이트 연결을 갖는 5-10-5 MOE 갭머이고; ISIS 647535은 ISIS 304801와 동일하고, 단, 3' 말단에서 콘주게이트된 GalNAc 3 -1을 가졌고; 그리고 ISIS 647536은 ISIS 647535와 동일하고, 단, 상기 화합물의 특정 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 표 17에서 추가로 요약된 바와 같이, SRB-1을 표적으로 하는 2 개의 별개의 안티센스 화합물이 합성되었다. ISIS 440762는 모든 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 2-10-2 cEt 갭머였고; ISIS 651900는 ISIS 440762와 동일하고, 단, 3'-말단에서 GalNAc 3 -1을 포함했다.
표 17
ApoC III 및 SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
하첨자: 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "k"는 6’-(S)-CH3 이환식 뉴클레오시드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc 3 -1"는 실시예 9에서 이전에 보여진 구조를 갖는 콘주게이트 그룹을 나타낸다. GalNAc 3 -1은 ASO를 “GalNAc 3 -1 a "인 것으로 지정된 콘주게이트의 나머지에 연결하는 절단가능 아데노신을 포함하는 것에 주목한다. 이러한 명명법은 콘주게이트의 일부인 아테노신을 포함하는 완전한 핵염기 서열을 보여주기 위해 상기 표에서 사용된다. 따라서, 상기 표에서, 서열은 "GalNAc 3 - 1"와 함께 생략된 "A do "로 종료되는 바와 같이 또한 열거될 수 있었다. 절단가능 뉴클레오시드 또는 절단가능 모이어티가 없는 콘주게이트 그룹의 부분을 나타내기 위해 하첨자 "a"를 사용하는 이러한 관례는 이들 실시예를 통해 사용된다. 절단가능 모이어티가 없는 콘주게이트 그룹의 이러한 부분은 "클러스터" 또는 "콘주게이트 클러스터" 또는 "GalNAc3 클러스터"로서 본원에서 칭해진다. 특정 예에서 그것의 클러스터 및 그것의 절단가능 모이어티를 별도로 제공하여 콘주게이트 그룹을 기재하는 것이 편리하다.
실시예
20:
huApoC
III 형질전환 마우스에서 인간
ApoC
III의 용량-의존적 안티센스 억제
인간 ApoC III를 각각 표적으로 하고 상기에서 기재된 ISIS 304801 및 ISIS 647535는, 별도로 시험되었고 인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 인간 ApoC III을 억제하기 위한 그것의 능력에 대한 용량-의존적 연구에서 평가되었다.
치료
인간 ApoCIII 형질전환 마우스는 12-시간 명/암 사이클에서 유지되었고 임의로 Teklad 실험실 초우에 공급되었다. 동물은 실험의 개시 전 연구 시설에서 적어도 7일 동안 순응되었다. ASO는 PBS에서 제조되었고 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하여 멸균되었다. ASO는 주사를 위해 0.9% PBS에서 용해되었다.
인간 ApoC III 형질전환 마우스에게 복강내로 2 주 동안 1주 1회 ISIS 304801 또는 647535가 0.08, 0.25, 0.75, 2.25 또는 6.75 μmol/kg 또는 PBS (대조군으로서)가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마지막 용량의 투여 48 시간 후, 혈액을 각 마우스로부터 뽑고 그리고 마우스는 희생되었고 조직은 수집되었다.
ApoC
III
mRNA
분석
마우스의 간 중 ApoC III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). ApoC III mRNA 수준은 PBS-처리된 대조군에 대한 정상화 전에 (리보그린을 사용하여) 총 RNA에 대해 결정되었다. 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 ApoC III mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제공되고, "PBS %"로서 나타낸다. 각 ASO의 반 최대 효과적인 투여량 (ED50)은 아래의 표 18에서 또한 제공된다.
실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 PBS 대조군에 대한 ApoC III RNA를 감소시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 콘주게이트된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 18
인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 ApoC III mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
ApoC
III 단백질 분석 (
비탁
검정)
혈장 ApoC III 단백질 분석은 하기에 의해 보고된 절차를 사용하여 결정되었다: Graham 등, Circulation Research, 2013년 3월 29일 인쇄 전에 온라인에서 공개.
마우스로부터 단리된 대략 100 μl의 혈장은 Olympus 임상 분석기 및 시판되는 비탁 ApoC III 검정을 사용하여 희석없이 분석되었다 (Kamiya, Cat# KAI-006, Kamiya Biomedical, Seattle, WA). 검정 프로토콜은 판매인에 의해 기재된 바와 같이 수행되었다.
아래의 표 19에서 보여진 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 PBS 대조군에 대한 ApoC III 단백질을 감소시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 콘주게이트된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 19
인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 ApoC III 혈장 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
혈장 트리글리세라이드 및 콜레스테롤은 블라이 및 다이어 (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)의 방법에 의해 추출되었고, Beckmann Coulter 임상 분석기 및 시판되는 시약을 사용하여 측정되었다.
트리글리세라이드 수준은 PBS 주입된 마우스에 대해 측정되었고 "PBS %"로서 나타낸다. 결과는 표 20에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 트리글리세라이드 수준을 감소시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 콘주게이트된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 20
형질전환 마우스에서 트리글리세라이드 수준에 대한 ASO 처리의 효과
혈장 샘플은 HPLC에 의해 분석되어 총 콜레스테롤 및 콜레스테롤 (HDL 및 LDL)의 상이한 분획의 양을 결정했다. 결과는 표 21 및 22에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 총 콜레스테롤 수준을 낮게 했고; 둘 모두는 LDL을 낮게 했고; 그리고 둘 모두는 HDL을 상승시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 콘주게이트된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다. HDL의 증가 및 LDL 수준의 감소는 ApoC III의 안티센스 억제의 심혈관성 유익한 효과이다.
표 21
형질전환 마우스에서 총 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 22
형질전환 마우스에서 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리 효과
약동학 분석 (PK)
ASO의 PK가 또한 평가되었다. 간 및 신장 샘플은 다져졌고 표준 프로토콜을 사용하여 추출되었다. 샘플은 IP-HPLC-MS을 이용하여 MSD1 상에서 분석되었다. 전장 ISIS 304801 및 647535의 조직 수준 (μg/g)은 측정되었고 결과는 표 23에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 총 전장 안티센스 화합물의 간 농도는 2 개의 안티센스 화합물에 대해 유사했다. 따라서, GalNAc 3 -1 콘주게이트된 안티센스 화합물이 (상기의 RNA 및 단백질 데이터에 의해 실질되는 바와 같이) 간에서 활성이 더 많을 지라도, 간에서 실질적으로 더 높은 농도로 존재하지 않는다. 사실상, 계산된 EC50 (표 23에서 제공)은, 콘주게이트된 화합물의 효능의 관찰된 증가가 증가된 축적에 전적으로 기인할 수 없다는 것을 확인해 준다. 이러한 결과는, 콘주게이트가 안티센스 화합물의 세포로의 생산적인 흡수를 가능하게 개선하여 간 축적 단독 이외의 기전에 의해 효능을 개선했다는 것을 암시한다.
상기 결과는 또한, 신장 중 GalNAc 3 -1 콘주게이트된 안티센스 화합물의 농도가 GalNAc 콘주게이트가 없는 안티센스 화합물의 농도보다 더 낮다는 것을 보여준다. 이것은 몇 개의 유익한 치료적 연루성을 갖는다. 신장에서의 활성이 추구되지 않는 치료적 징후에 대해, 신장에의 노출은 상응하는 이점 없이 신장 독성을 위태롭게 한다. 게다가, 신장의 고농도는 전형적으로 화합물의 소변으로 손실을 야기하고, 이로써 더 빠른 청소능을 얻는다. 따라서, 비-신장 표적에 대해, 신장 축적은 원치 않는다. 이들 데이터는, GalNAc 3 -1 콘주게이션이 신장 축적을 감소시킨다는 것을 암시한다.
표 23
형질전환 마우스에서 ASO 처리의 PK 분석
ISIS 647535의 대사물이 또한 확인되었고, 그것의 질량은 고분해능 질량 분광분석법 분석에 의해 확인되었다. 관찰된 대사물의 절단 부위 및 구조는 아래에서 보여진다. 전장 ASO의 상대 %는 표준 절차를 사용하여 계산되었고 결과는 표 23a에서 제공된다. ISIS 647535의 주요 대상물은 아래에서 보여진 절단 부위 A에서의 절단을 야기하는 전체 콘주게이트 (즉 ISIS 304801)가 없는 전장 ASO였다. 게다가, 다른 절단 부위로부터 수득된 추가 대상물이 또한 관찰되었다. 이들 결과는, 다른 절단가능 결합 예컨대 에스테르, 펩티드, 디설파이드, 포스포르아미데이트 또는 아실-하이드라존을 GalNAc 3 - 1 당과 ASO (이것은 세포 내의 효소에 의해 절단될 수 있거나, 사이토졸의 환원 환경에서 전달될 수 있거나 엔도솜 및 리소좀 내의 산성 pH에 대해 불안정함) 사이에 도입하는 것이 또한 유용할 수 있다는 것을 암시한다.
표 23a
ISIS 647535의 관찰된 전장 대사물
실시예
21: 단일 투여 연구에서 인간
ApoC
III 형질전환 마우스에서 인간
ApoC
III의
안티센스
억제
인간 ApoC III를 표적으로 하고 표17에서 기재된 ISIS 304801, 647535 및 647536 각각은, 인간 ApoC III 형질전환 마우스 인간 ApoC III을 억제하기 위해 그것의 능력에 대한 단일 투여 연구에서 추가로 평가되었다.
치료
인간 ApoCIII 형질전환 마우스는 12-시간 명/암 사이클에서 유지되었고 임의로 Teklad 실험실 초우에 공급되었다. 동물은 실험의 개시 전 연구 시설에서 적어도 7일 동안 순응되었다. ASO는 PBS에서 제조되었고 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하여 멸균되었다. ASO는 주사를 위해 0.9% PBS에서 용해되었다.
인간 ApoC III 형질전환 마우스에게 복강내로 1 회 아래에서 보여진 투여량으로 ISIS 304801, 647535 또는 647536 (상기에서 기재됨) 또는 PBS 처리된 대조군이 주입되었다. 처리 그룹은 3마리의 동물로 구성되었고 대조군 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스는 마지막 투여 72 시간 후에 희생되었다.
샘플을 수집하고 분석하여 HDL 및 LDL 분획을 포함하는 간; 혈장 트리글리세라이드; 및 콜레스테롤에서 ApoC III mRNA 및 단백질 수준을 측정하고, 상기에서 기재된 바와 같이 평가하였다 (실시예 20). 이들 분석으로부터의 데이터는 아래의 표 24-28에서 제공된다. 혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정하였다. ALT 및 AST 수준은, 안티센스 화합물이 모든 투여된 용량으로 용인되었다는 것을 보여주었다.
이들 결과는 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물과 비교하여 3' 말단 (ISIS 647535 및 647536)에서 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 화합물에 대한 효능의 개선을 보여준다. 게다가, GalNAc 3 -1 콘주게이트 및 일부 포스포디에스테르 연결을 포함하는 ISIS 647536은 동일한 콘주게이트를 포함하는 ISIS 647535만큼 강력했고, ASO 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
표 24
인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 ApoC III mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 25
인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 ApoC III 혈장 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 26
형질전환 마우스에서 트리글리세라이드 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 27
형질전환 마우스에서 총 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 28
형질전환 마우스에서 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리 효과
이들 결과는, GalNAc 3 -1 콘주게이트가 안티센스 화합물의 효능을 개선한다는 것을 확인한다. 결과는 또한, GalNAc 3 -1 콘주게이트된 안티센스 화합물의 동등한 효능을 보여주고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 혼합된 연결 (6개의 포스포디에스테르 연결을 갖는 ISIS 647536) 및 동일한 안티센스 화합물의 완전한 포스포로티오에이트 버전 (ISIS 647535)을 갖는다.
포스포로티오에이트 연결은 안티센스 화합물에 대한 몇 개의 특성을 제공한다. 예를 들면, 뉴클레아제 소화에서 저장하고 단백질에 결합하고, 이것은 신장/소변에서보다 간에서 화합물의 축적을 야기한다. 이들은, 특히 간에서 조짐을 치료할 때 바람직한 특성이다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결은 또한 염증성 반응과 연관되었다. 따라서, 화합물 중 포스포로티오에이트 연결의 수를 감소시키는 것은 염증의 위험, 뿐만 아니라 간에서 저농도의 화합물을 감소시키고, 신장 및 소변에서 농도를 증가시키고, 뉴클레아제의 존재에서의 안정성을 증가시키고, 더 낮은 전체 효능을 낮추는 것으로 기대된다. 본 결과는, 특정 포스포로티오에이트 연결이 포스포디에스테르 연결로 대체되었던 GalNAc 3 -1 콘주게이트된 안티센스 화합물이 완전한 포스포로티오에이트 연결을 갖는 대응물로서 간에서 표적에 대항하여 강력하다는 것을 보여준다. 그와 같은 화합물은 전염증이 덜한 것으로 기재된다 (PS의 감소를 보여주는 실험은 감소된 염증성 효과를 야기한다는 것을 기재하는 실시예 24 참고).
실시예
22:
생체내에서
SRB
-1을 표적으로 하는
GalNAc
3
-1
콘주게이트된
변형된
ASO의
효과
SRB-1을 표적으로 하고 표 17에서 기재된 ISIS 440762 및 651900 각각을 대상으로 Balb/c 마우스에서 SRB-1을 억제하는 그 능력을 용량-의존적 연구에서 평가하였다.
치료
6주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900 또는 PBS 처리된 대조군을하기에 제시된 투여량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 48 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 내에서의 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제시되어 있고, "PBS %"로서 표시되어 있다.
표 29에서 입증된 바와 같이, 두 안티센스 화합물들은 SRB-1 mRNA 수준을 낮추었다.게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 651900)에 콘주게이트된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 440762)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다. 이들 결과는, GalNAc 3 -1 콘주게이트의 효능 이점이 상이한 표적에 대해 상보적이고 상이한 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 관찰된다는 것을 입증하고, 이러한 예에서 변형된 뉴클레오시드는 제한된 에틸 당 모이어티 (이환식 당 모이어티)를 포함한다.
표 29
Balb/c 마우스에서 SRB-1 mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
실시예
23: 인간
말초 혈액
단핵
세포 (
hPBMC
) 검정 프로토콜
hPBMC 검정은 BD Vautainer CPT 튜브 방법을 사용하여 수행하였다. US HealthWorks clinic (Faraday & El Camino Real, Carlsbad)에서 고지에 의한 동의로 자원된 공여체로부터 전혈 샘플을 얻어 4-15 BD 진공채혈기 CPT 8 ml 튜브 (VWR Cat.# BD362753)에 모았다. BD362753). 각 공여체에 대한 CPT 튜브에서의 대략적인 개시되는 총 전혈액량을 PBMC 검정 데이터 시트를 사용하여 기록하였다.
튜브를 8-10회 뒤집어 원심분리 바로 전에 혈액 샘플을 재혼합하였다. CPT 튜브를브레이크 없이(2700 RPM Beckman Allegra 6R)1500-1800 RCF에서 30분간 수평 (swing-out) 로터에서 실온(18-25 oC)에서 원심분리하였다. 세포를 버피 코트 계면 (피콜 및 폴리머 겔 층 사이)로부터 회수하고; 멸균한 50 ml 원뿔형 튜브로 옮기고 5 CPT 튜브/50 ml 원뿔형 튜브/공여체까지 모았다. 그리고 나서, 세포를 PBS (Ca++, Mg++없음; GIBCO)로 2회 세정하였다. 튜브를 50 ml까지 가득 채우고몇 번 뒤집어 혼합하였다. 그리고 나서, 샘플을 330 x g에서 15분 동안 실온에서 원심분리하고(Beckman Allegra 6R에서 1215 RPM), 펠렛을 건드리지 않고 가능한 한 많은 상청액을 흡인하였다. 튜브를 와류시켜 세포 펠렛을 제거하고 RPMI+10% FBS+펜/스트렙 (~1 ml / 10 ml 시작하는 전혈량)에서 세포를 재현탁시켰다. 60 μl 샘플을 600 μl VersaLyse 시약 (Beckman Coulter Cat# A09777)을 갖는 샘플 바이알 (Beckman Coulter) 내로 피펫팅하고 10-15초 동안 부드럽게 볼텍싱하였다. 샘플을 10분 동안 실온에서 10분 동안 배양하고 다시 혼합한 후 계수하였다. 세포 현탁액을 PBMC 세포형 (1:11의 희석 인자가 다른 파라미터를 이용하여 보관되었음)을 이용하여 Vicell XR 세포 생존력 분석기 (Beckman Coulter) 상에서 계수하였다. 생존 세포/ml 및 생존력을 기록하였다. 세포 현탁액을 1 x 107 생존 PBMC/ RPMI+ 10% FBS+펜/스트렙 중에서의 ml로 희석하였다.
세포를 50 μl/웰의 96-웰 조직 배양판 (Falcon Microtest)에 5 x 105로 플레이팅하였다. RPMI+10% FBS+펜/스트렙에 희석된 50 μl/웰의 2x 농도 올리고/대조군을 실험 템플레이트 (100 μL/웰 총)에 따라 부가하였다. 플레이트를 진탕기에 놓고 대략 1분간 혼합하였다. 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후; 5% CO2, 플레이트를 400 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 MSD 사이토카인 검정 (즉 인간 IL-6, IL-10, IL-8 및 MCP-1)을 위해 상청액을 제거하였다.
실시예
24:
GalNAc
3
-1
콘주게이트된
ASO를
위한
hPBMC
검정에서의
전염증
효과의 평가
표 30에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 대해 실시예 23에서 기재된 프로토콜을 사용하여 hPBMC 검정에서의 전염증(proinflammatory) 효과를 평가하였다. ISIS 353512는 검정에서의 IL-6 방출에 대한 고반응군인 것으로 알려진 내부 표준이다. hPBMC를 신선한, 지원된 공여체로부터 단리하고 0, 0.0128, 0.064, 0.32, 1.6, 8, 40 및 200 μM 농도의 ASO로 처리하였다. 24시간 처리 후, 사이토카인 수준을 측정하였다.
IL-6의 수준을 일차 판독으로서 사용하였다. EC50 및 Emax를 표준 절차를 이용하여 계산하였다. 결과는 두 공여체로부터 Emax/EC50의 평균 비로서 표현되고 "Emax/EC50"로 나타내어진다. 더 낮은 비율은 전염증 반응에서 상대적 감소를 가리키고 더 높은 비율은 전염증 반응에서 상대적 증가를 가리킨다.
시험 화합물과 관련하여, 가장 낮은 전염증 화합물은 PS/PO 연결된 ASO (ISIS 616468)였다. GalNAc 3 -1 콘주게이트된 ASO인 ISIS 647535는 그의 비-콘주게이트된 대응물 ISIS 304801보다 약간 덜 전염증이었다. 이들 결과는, 일부 PO 연결의 혼입이 전염증 반응을 감소시키며 GalNAc 3 -1 콘주게이트의 부가가 화합물을 더 전염증성으로 만들며 전염증 반응을 감소시킬 수 있음을 가리킨다. 따라서, 당업자라면 혼합된 PS/PO 연결 및 GalNAc 3 -1 콘주게이트 모두를 포함하는 안티센스 화합물이 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 갖거나 갖지 않는 완벽한 PS 연결된 안티센스 화합물과 비교하여 더 낮은 전염증 반응을 생성할 것임을 예상할 것이다. 이들 결과는, GalNAc 3- 1 콘주게이트된 안티센스 화합물, 특히 감소된 PS 함량을 갖는 화합물이 덜 전염증이라는 것을 보여준다.
함께, 이들 결과는, GalNAc 3 -1 콘주게이트된 화합물, 특히 감소된 PS 함량을 갖는 화합물이 GalNAc 3 -1 콘주게이트가 없는 대응되는 완전한 PS 안티센스 화합물보다 더 높은 용량으로 투여될 수 있음을 제시한다. 이들 화합물의 경우 반감기가 실질적으로 상이할 것으로 예상되지 않으므로, 그러한 더 높은 투여는 덜 빈번한 투여을 야기할 것이다. 사실상 그러한 투여는 훨씬 덜 빈번할 수 있는데, GalNAc 3 -1 콘주게이트된 화합물이 더 강하고(실시예 20-22 참고), 화합물의 농도가 효능에 기초하여 원하는 수준 이하로 떨어지면 재-투여이 필요하기 때문이다.
표 30
변형된 ASO
하첨자: 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "k"는 6’-(S)-CH3 이환식 뉴클레오시드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "A do’ -GalNAc 3 -1 a "는, 명시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된 실시예 9에 나타난 구조 GalNAc 3 -1를 갖는 콘주게이트를 가리킨다.
표 31
hPBMC 검정에서 ApoC III를 표적으로 하는 ASO의 전염증 효과
실시예
25:
시험관 내
에서 인간
ApoC
III을 표적으로 하는
GalNAc
3
-1
콘주게이트된
변형된
ASO의
효과
상기 기재된 ISIS 304801 및 647535를 시험관 내에서 시험하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 형질전환 마우스 유래의 일차 간세포 세포를 0.03,0.08, 0.24, 0.74, 2.22, 6.67 및 20 μM 농도의 변형된 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 대략 16시간의 처리 기간 후, RNA를 상기 세포로부터 분리하고 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하고 hApoC III mRNA 수준을, 리보그린에 의해 측정된 바와 같이, 총 RNA 함량에 따라 조정하였다.
IC50을 표준 방법을 사용하여 계산하였고 그 결과가 표 32에서 제시되어 있다. 예시된 바와 같이, 대조군 ISIS 304801과 비교하여 ISIS 647535로 처리된 세포에서 비교할만한 효능이 관찰되었다.
표 32
일차 간세포에서 인간 ApoC III를 표적으로 하는 변형된 ASO
이 실험에서, 생체내에서 관찰된 GalNAc 3 -1 콘주게이션의 큰 효능 이점은 시험관 내에서 관찰되지 않았다. 시험관 내에서 일차 간세포에서의 차후의 자유 흡수 실험은 GalNAc 콘주게이트가 없는 올리고뉴클레오티드(실시예 60, 82, 및 92 참고)와 비교하여 다양한 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 증가된 효능을 나타내지 않았다.
실시예
26: ApoC
III
ASO
활성에 대한 PO/PS 연결의 효과
인간 ApoC III 형질전환 마우스에게 25 mg/kg의 ISIS 304801, 또는 ISIS 616468 (모두 상기에 기재됨)를 1회 복강내로 주입하거나 PBS 처리된 대조군은 2주간 주당 1회 주입하였다. 처리 그룹은 3마리의 동물로 구성되었고 대조군 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스를 마지막 투여 72시간 후에 희생시켰다.
샘플을 수집하고 상기에서 기재된 바와 같이(실시예 20)간에서의 ApoC III 단백질 수준을 분석하였다. 이들 분석으로부터의 데이터가 하기 표 33에 나타나 있다.
이들 결과는 전체 PS (ISIS 304801) 대비 윙에서 PO/PS (ISIS 616468)를 갖는 안티센스 화합물의 효능 감소를 보여준다.
표 33
인간 ApoC III 형질전환 마우스에서 ApoC III 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
실시예
27: 화합물
56
화합물 56은 Glen Research사부터 상업적으로 이용가능하거나 문헌[Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454]에 의해 보고된 공개된 과정에 따라 제조할 수 있다.
실시예
28: 화합물
60의 제조
화합물 4는 실시예 2에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 57은 시판되고 있다. 화합물 60을 구조적 분석에 의해 확인하였다.
화합물 57은 대표적인 것으로 여겨지며, 소정의 조성물을 갖는 포스포르아미다이트를 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이제 제한되지 않는 다른 단일보호된(monoprotected) 치환된 또는 비치환된 알킬 디올로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
29: 화합물
63의 제조
화합물 61 및 62를 하기에 의해 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조한다: Tober et al., Eur . J. Org . Chem ., 2013, 3, 566-577; 및 Jiang et al., Tetrahedron, 2007, 63(19), 3982-3988.
대안적으로, 화합물 63을 Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; 및 Kim et al.,공개된 PCT 국제 출원, WO 2004063208에 의해 과학 및 특허 문헌에 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조한다.
실시예
30: 화합물
63b의 제조
화합물 63a를 하기에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조한다: Hanessian et al., Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74(9), 1731-1737.
실시예
31: 화합물
63b의 제조
화합물 63c를 Chen et al., Chinese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조한다.
실시예
32: 화합물
67의 제조
화합물 64은 실시예 2에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 65는 Or 등, 공개된 PCT 국제 출원, WO 2009003009에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조된다. 화합물 65에 대해 사용된 보호 그룹은 대표적인 것을 의미하며, 사용될 수 있는 본원 명세서에 제시된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 보호 그룹으로서 제한되지 않는 것으로 의도된다.
실시예
33: 화합물
70의 제조
화합물 64은 실시예 2에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 68는 시판되고 있다. 화합물 68에 대해 사용된 보호 그룹은 대표적인 것을 의미하며, 사용될 수 있는 본원 명세서에서 제공된 것들 것 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 보호 그룹으로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
34: 화합물
75a의 제조
화합물 75를 Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454에 의해 공개된 과정을 이용하여 제조한다.
실시예
35: 화합물
79의 제조
화합물 76을 Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454에 의해 공개된 과정을 이용하여 제조하였다.
실시예
36: 화합물
79a의 제조
화합물 77은 실시예 35에서 실증된 절차에 따라 제조된다.
실시예
37: 고체
지지체를 통해 5' 말단에
포스포디에스테르
연결된 GalNAc
3
-2
콘주게이트를
포함하는
콘주게이트된
올리고머 화합물 82의 일반적인 제조 방법 (방법 I)
여기서 GalNAc3-2은 하기 화학식을 갖는다:
콘주게이트 그룹 GalNAc3-2의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-2a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-2a은 하기 화학식을 갖는다:
VIMAD-결합된 올리고머 화합물 79b를 하기에 대한 표준 과정을 이용하여 제조하였다: 자동화된 DNA/RNA 합성 (참고: Dupouy et al., Angew . Chem . Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). 포스포르아미다이트 화합물 56 및 60을 각각 실시예 27 및 28에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 콘주게이트 그룹을 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록으로 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 소정의 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예
38: 5
' 말단에
포스포디에스테르
연결된
GalNAc
3
-2
콘주게이트를
포함하는 올리고머 화합물 82의 대안적인 제조 방법 (방법 II)
VIMAD-결합된 올리고머 화합물 79b를 하기에 대한 표준 과정을 이용하여 제조하였다: 자동화된 DNA/RNA 합성 (참고: Dupouy et al., Angew . Chem . Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). GalNAc3-2 클러스터 포스포르아미다이트인 화합물 79를 실시예 35에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 이 대안적인 방법은 합성의 최종 단계에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트의 올리고머 화합물에의 1-단계 설치를 허용한다. 예시된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 5' 말단에 포스포디에스테르 콘주게이트를 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록으로서 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 소정의 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예
39: 고체
지지체를 통한 5' 말단에 (5' 말단 부착을 위해 변형된 GalNAc
3
-1)
GalNAc
3
-3
콘주게이트를
포함하는 올리고머 화합물 83h의 일반적인 제조 방법
화합물 18은 실시예 4에서 실증된 절차에 따라 제조되었다. 화합물 83a 및 83b는 상업적으로 이용가능하다. 포스포디에스테르 연결된 헥실아민을 포함하는 올리고머 화합물 83e를 표준 올리고뉴클레오티드 합성 과정을 이용하여 제조하였다. 암모니아수를 이용한 상기 보호된 올리고머 화합물의 처리는 5'-GalNAc3-3 콘주게이트된 올리고머 화합물 (83h)을 제공하였다.
여기서 GalNAc3-3은 하기 화학식을 갖는다:
콘주게이트 그룹 GalNAc3-3의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-3a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-3a은 하기 화학식을 갖는다:
실시예
40: 고체
지지체를 통해 3' 말단에
포스포디에스테르
연결된 GalNAc
3
-4
콘주게이트를
포함하는 올리고머 화합물 89의 일반적인 제조 방법
여기서 GalNAc3-4은 하기 화학식을 갖는다:
여기서 CM은 절단가능 모이어티이다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 아래와 같다:
콘주게이트 그룹 GalNAc3-4의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-4a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-4a은 하기 화학식을 갖는다:
보호된 Unylinker 관능화된 고체 지지체 화합물 30은 상업적으로 이용가능하다. 화합물 84는 문헌에 의해 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조된다: (hchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 3035-3041; 및 Hornet et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4842-4849 참고).
포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 60 및 79a를 실시예 28 및 36에 예시된 과정에 따라 제조한다. 예시된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 소정의 순서 및 조성으로 3' 말단에 포스포디에스테르 연결된 콘주게이트를 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 소정의 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예
41: 고체상
기술을 통해 5' 위치에
포스포디에스테르
연결된 GalNAc
3
-2 (
실시예
37 참고,
Bx는
아데닌임)
콘주게이트를
포함하는
ASO의
일반적인 제조 방법(ISIS 661134의 제조)
달리 언급되지 않으면, 올리고머 화합물의 합성을 위해 사용된 모든 시약 및 용액은 상업적 공급원으로부터 구매된다. 표준 포스포르아미다이트 빌딩 블록 및 고체 지지체는, 예를 들면 T, A, G, 및 mC 잔기를 포함하는 뉴클레오시드 잔기의 혼입을 위해 사용된다. 사용된 포스포르아미다이트 화합물 56 및 60을 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 합성하기 위해 사용하였다. 무수 아세토니트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1 M 용액을 β-D-2’-데옥시리보뉴클레오시드 및 2'-MOE에 사용하였다.
ASO 합성을 칼럼 내에 패킹된 VIMAD 고체 지지체 (110 μmol/g, Guzaev et al., 2003) 상의 포스포르아미다이트 커플링 방법에 의해 ABI 394 합성기 (1-2 μmol 크기) 또는 GE Healthcare Bioscience 
올리고파일럿 합성기 (40-200 μmol 크기) 상에서 수행하였다. 커플링 단계의 경우, 포스포르아미다이트를 고체 지지체의 초기 기로딩에 대해 4배 과량으로 전달하였고, 포스포르아미다이트 커플링을 10분 동안 수행하였다. 모든 다른 단계는 제조자에 의해 공급된 표준 프로토콜을 따랐다. 톨루엔 중의 6% 디클로로아세트산 용액을 뉴클레오티드의 5'-하이드록실 군으로부터 디메톡시트리틸 (DMT) 그룹을 제거하는데 사용하였다. 무수 CH3CN 중 4,5-디시아노이미다졸 (0.7 M)은 커플링 단계 동안에 활성제로서 사용되었다. 포스포로티오에이트 연결을 3분의 접촉 시간 동안에 1:1 피리딘/CH3CN 중의 크산탄 하이드라이드의 0.1 M 용액을 이용한 황화에 의해 도입하였다. 6% 물을 함유하는 CH3CN 중의 20% tert-부틸하이드로퍼옥사이드의 용액을 산화제로서 사용하여 12분의 접촉 시간으로 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 제공하였다.
원하는 서열이 조립된 후, 시아노에틸 포스페이트 보호 그룹을 45분의 접촉 시간으로 톨루엔 (v/v) 중의 20% 디에틸아민을 이용하여 탈보호화시켰다. 상기 고체-지지체 결합된 ASO를 암모니아수 (28-30 중량 %)에 현탁시키고 55 에서 6시간 동안 가열하였다.
그리고 나서, 미결합된 ASO를 여과하고 암모니아를 가열로 제거하였다. 잔류물을 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다(GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 μm, 2.54 x 8 cm, A = 30% 수성 CH3CN 중의 100 mM 암모늄 아세테이트, B = A 중의 1.5 M NaBr, 60분에 0-40%의 B, 유량 14 mL min-1, λ = 260 nm). 잔류물을 역상 칼럼 상의 HPLC에 의해 탈염하여, 고체 지지체 상의 초기 로딩을 기준으로 15-30%의 단리된 수율로 원하는 ASO를 얻었다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는 이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
표 34
SRB
-
1를
표적화하는
5' 위치에
포스포디에스테르
연결된
GalNAc
3
-2
콘주게이트를
포함하는
ASO
하첨자: 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "k"는 6’-(S)-CH3 이환식 뉴클레오시드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다.상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc3-2a"의 구조가 실시예 37에 나타나 있다.
실시예
42: 고체상
기술을 통해 5' 위치에
GalNAc
3
-3
콘주게이트를
포함하는
ASO의
일반적인 제조 방법(ISIS 661166의 제조)
ISIS 661166을 위한 합성을 실시예 39 및 41에 예시된 것과 유사한 과정을 이용하여 수행하였다.
ISIS 661166은 5-10-5 MOE 갭머이며, 상기 5' 위치는 GalNAc3-3 콘주게이트를 포함한다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는 이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
표 34a
Malat
-1을
표적화하는
헥실아미노
포스포디에스테르
연결을 통한 5' 위치에서의 GalNAc
3
-3 콘주게이트를 포함하는
ASO
하첨자: “e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "5’-GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다.
실시예
43:
생체내
에서
SRB
-1을
표적화하는
5' 말단에서의
포스포디에스테르
연결된
GalNAc
3
-2 (
실시예
37 및 41 참고,
Bx는
아데닌임)의 용량-의존적 연구
5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ISIS 661134 (실시예 41 참고)를 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제를 위해 용량-의존적 연구에서 시험하였다. 비콘주게이트된 ISIS 440762 및 651900 (3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트, 실시예 9 참고)를 비교를 위해 연구에 포함시켰고, 이들은 앞서 표 17에 기재되어 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900, 661134 또는 PBS 처리된 대조군으로 하기 제시된 투여량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제시되어 있고, "PBS %"로서 표시되어 있다. ED50은 전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정되었고 아래에서 제공된다.
표 35에 예시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 SRB-1 mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 낮추었다. 사실상, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 661134) 또는 3' 말단에 연결된 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ISIS 651900)는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 440762)와 비교하여 실질적인 효능 개선을 나타내었다. 게다가, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ISIS 661134는 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 651900과 비교하여 효능이 동등하였다.
표 35
SRB
-1을 표적으로 하는
GalNAc
3
-1 또는
GalNAc
3
-2를 함유하는
ASO
3’ GalNAc3-1 및 5’ GalNAc3-2에 대한 구조는 실시예 9 및 37에 앞서 기술되었다.
약동학 분석 (PK)
고용량 그룹 (7 mg/kg)으로부터의 ASO의 PK를 조사하고 실시예 20에 예시된것과 동일한 방식으로 평가하였다. 간 샘플을 갈고 표준 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 661134 (5’ GalNAc3-2) 및 ISIS 651900 (3’ GalNAc3-1)의 전장 대사물을 확인하고 이들의 질량을 고분해능 질량 분광분석법 분석에 의해 확인하였다. 상기 결과는 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ASO (ISIS 661134)에 대해 검출된 주요 대사물이 ISIS 440762였음을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음). 검출가능한 수준에서 추가의 대사물이 관찰되지 않았다. 그의 대응물과 달리, 표 23a에서 이전에 보고된 것과 유사한 추가의 대사물이 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 갖는 ASO에 대해 관찰되었다(ISIS 651900). 이들 결과는, 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 또는 GalNAc3-2 콘주게이트를 갖는 것이 그것의 효능을 없애지 않고 ASO의 PK 프로파일을 개선할 수 있음을 제시한다.
실시예
44: SRB
-1을
표적화하는
3' 말단에
GalNAc
3
-1
콘주게이트를
포함하는
ASO
(
실시예
9 참고)의
안티센스
억제에 대한 PO/PS 연결의 효과
각각 SRB-1을 표적화하는 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861 및 655862를 대상으로 단일 투여 연구에서 마우스에서 SRB-1을 억제하는 이들의 능력을 시험하였다. 모 비콘주게이트된 화합물인 ISIS 353382를 비교를 위해 연구에 포함시켰다.
ASO는 5-10-5 MOE 갭머이며, 상기 갭 영역은 10개의 2'-데옥시리보뉴클레오시드를 포함하고 각 윙 영역은 5개의 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. ASO를 실시예 19에서 앞서 예시된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조하였고 이는 하기 표 36에 기술되어 있다.
표 36
SRB
-
1를
표적화하는
3' 말단에
GalNAc
3
-1
콘주게이트를
포함하는 변형된
ASO
하첨자: “e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 655862 또는 PBS 처리된 대조군으로 하기 제시된 투여량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제시되어 있고, "PBS %"로서 표시되어 있다. ED50은 전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정되었고 아래에서 보고된다.
표 37에서 예시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 PBS 처리된 대조군과 비교하여 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮추었다. 사실상, 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 655861 및 655862)는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 353382)와 비교하여 실질적인 효능 개선을 나타내었다. 게다가, 혼합된 PS/PO 연결을 갖는 ISIS 655862는전체 PS (ISIS 655861)와 비교하여 효능 개선을 나타내었다.
표 37
SRB
-
1를
표적화하는
3' 말단에
GalNAc
3
-1
콘주게이트를
포함하는
ASO의
안티센스
억제에 대한 PO/PS 연결의 효과
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 장기 중량을 또한 평가하였다. 상기 결과는 PBS 대조군과 비교하여 ASO 처리된 마우스에서 트랜스아미나제 수준 (표 38) 또는 장기 중량 (데이터 도시되지 않음)의 상승이 관찰되지 않았음을 입증하였다 (데이터 도시되지 않음). 게다가, 혼합된 PS/PO 연결을 갖는 ASO (ISIS 655862)는 전체 PS (ISIS 655861)와 비교하여 유사한 트랜스아미나제 수준을 나타내었다.
표 38
SRB
-
1를
표적화하는
3' 말단에
GalNAc
3
-1
콘주게이트를
포함하는
ASO의
트랜
스아미나제 수준에 대한 PO/PS 연결의 효과
실시예
45:
PFP
에스테르, 화합물 110a의 제조
화합물 4 (9.5g, 28.8 mmol)를 개별적으로 화합물 103a 또는 103b (38 mmol), 및 디클로로메탄 (200 mL) 중 TMSOTf (0.5 eq.) 및 분자체로 처리하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 때, 유기 층을 셀라이트를 통해 여과한 다음 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->10% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여 >80% 수율로 화합물 104a 및 104b를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 104a 및 104b를 화합물 100a-d (실시예 47)와 동일한 조건으로 처리하여>90% 수율로 화합물 105a 및 105b를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 105a 및 105b를 화합물 901a-d와 동일한 조건 하에서 화합물 90으로 개별적으로 처리하여, 화합물 106a (80%) 및 106b (20%)를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 106a 및 106b를 화합물 96a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여 107a (60%) 및 107b (20%)를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 107a 및 107b를 화합물 97a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여, 화합물 108a 및 108b를 40-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 108a (60%) 및 108b (40%)을 화합물 100a-d (실시예 47)와 동일한 조건으로처리하여, 화합물 109a 및 109b를 >80% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 109a를 화합물 101a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여, 화합물 110a를 30-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다. 대안적으로, 화합물 110b는 화합물 109b로 시작하는 개시되는 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
실시예
46:
PFP
에스테르 (올리고뉴클레오티드
111)과의
콘주게이션을
위한 일반적인 절차; ISIS 666881 (
GalNAc
3
-
10)의
제조
5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하고 표준 고체상 올리고뉴클레오티드 과정을 이용하여 정제하였다. 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 0.1 M 나트륨 테트라보레이트, pH 8.5 (200 μL)에 용해시키고 DMSO (50 μL)에 용해된 3 당량의 선택된 PFP 에스테르화된 GalNAc3 클러스터를 부가하였다. 만약 PFP 에스테르가 ASO 용액 부가시 침전되면, 모든 PFP 에스테르가 용액 내에 있을 때까지 DMSO를 부가하였다. 반응은 실온에서 약 16시간 혼합 후 완료하였다. 수득한 용액을 12 mL의 물로 희석한 다음 스핀 필터에서 3000 Da의 질량 컷오프로 3000 rpm으로 스핀다운하였다. 이 과정을 2회 반복하여 소분자 불순물을 제거하였다. 그 다음 용액을 동결건조하고 농축된 암모니아수에서 재용해하고 실온에서 2.5시간 동안 혼합한 다음 진공에서 농축하여 대부분의 암모니아를 제거하였다. 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드를 정제하고 RP-HPLC로 탈염하고 동결건조하여 GalNAc3 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공하였다.
올리고뉴클레오티드 111은 GalNAc3-10과 콘주게이트된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-10의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-10a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기 GalNAc3-10을 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드 (ISIS 666881)에서 나타난 바와 같은 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
일반적인 절차에 따라 ISIS 666881을 제조하였다. 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오티드 ISIS 660254을 합성하고 표준 고체상 올리고뉴클레오티드 과정을 이용하여 정제하였다. ISIS 660254 (40 mg, 5.2 μmol)을 0.1 M 나트륨 테트라보레이트, pH 8.5 (200 μL)에 용해시키고 DMSO (50 μL)에 용해된 3 당량의 PFP 에스테르 (화합물 110a)를 부가하였다. PFP 에스테르는 PFP 에스테르를 완전히 용해시키기 위해 추가의 DMSO (600 μL)를 필요로 하는 ASO 용액에 부가시 침전되었다. 상기 반응을 실온에서 16시간 혼합한 후 완료하였다. 상기 용액을 물로 12 mL 총 용적으로 희석하고 스핀 필터에서 3000 Da의 질량 컷오프로 3000 rpm으로 스핀다운하였다. 이 과정을 2회 반복하여 소분자 불순물을 제거하였다. 용액을 동결건조하고 실온에서 2.5시간 동안 혼합하면서 농축된 암모니아수에 재용해한 다음 진공에서 농축하여 대부분의 암모니아를 제거하였다. 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드를 정제하고 RP-HPLC로 탈염하고 동결건조하여 중량으로 90% 수율로 ISIS 666881를 얻었다 (42 mg, 4.7 μmol).
GalNAc
3
-10
콘주게이트된
올리고뉴클레오티드
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
실시예
47:
GalNAc
3
-
8를
포함하는 올리고뉴클레오티드 102의 제조
3가산 90 (4 g, 14.43 mmol)을 DMF (120 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.35 mL, 72 mmol)에 용해시켰다. 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (8.9 mL, 52 mmol)를 아르곤 하에 적가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. Boc-디아민 91a 또는 91b (68.87 mmol)를 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.35 mL, 72 mmol)과 함께 부가하고, 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->10% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여 화합물 92a 및 92b를 대략적인 80% 수율로 생성하였다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 92a 또는 92b (6.7 mmol)를 20 mL의 디클로로메탄 및 20 mL의 트리플루오로아세트산으로 실온에서 16시간 동안 처리하였다. 얻어진 용액을 증발시킨 다음 메탄올에 용해시키고 DOWEX-OH 수지로 30분 동안 처리하였다. 얻어진 용액을 여과하고 오일 감압 하에서 환원하여 화합물 93a 및 93b를 85-90% 수율로 얻었다.
화합물 7 또는 64 (9.6 mmol)를 DMF (20 mL) 중의 HBTU (3.7g, 9.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (5 mL)로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 93a 또는 93b (3 mmol) 중 하나를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (5%-->20% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 96a-d를 20-40% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 96a-d (0.75 mmol)를 개별적으로, 에탄올 (75 mL)에서 3시간 동안 라니 니켈에 대해 수소첨가하였다. 이때, 촉매를 셀라이트를 통해 여과에 의해 제거하고, 에탄올을 감압 하에서 제거하여 화합물 97a-d를 80-90% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 23 (0.32g, 0.53 mmol)을 DMF (30mL) 중에서 HBTU (0.2g, 0.53 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.19 mL, 1.14 mmol)으로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 97a-d (0.38 mmol)를 개별적으로 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->20% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 98a-d를 30-40% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 99 (0.17g, 0.76 mmol)을 DMF (50mL) 중에서 HBTU (0.29 g, 0.76 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.35 mL, 2.0 mmol)으로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 97a-d (0.51 mmol)를 개별적으로 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (5%-->20% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 100a-d를 40-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 100a-d (0.16 mmol)를 개별적으로, 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1, 50 mL) 중에서 3시간 동안 10% Pd(OH)2/C에 대해 수소첨가하였다. 이때, 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거하고, 유기물을 감압 하에서 제거하여 화합물 101a-d를 80-90% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 101a-d (0.15 mmol)를 개별적으로 DMF (15 mL) 및 피리딘 (0.016 mL, 0.2 mmol)에 용해시켰다. 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (0.034 mL, 0.2 mmol)를 아르곤 하에서 적가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->5% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 102a-d를약 80% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
GalNAc3-8 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 102를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-8의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-8a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-8 (GalNAc3-8a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 48: GalNAc
3
-7를 포함하는 올리고뉴클레오티드 119의 제조
화합물 112를 하기 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Med . Chem . 2004, 47, 5798-5808).
화합물 112 (5 g, 8.6 mmol)를 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (22 mL/22 mL)에 용해시켰다. 탄소상 수산화팔라듐 (0.5 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 1:1 메탄올/에틸 아세테이트로 패드로 세정하였다. 여과물과 세정물을 조합하고 농축 건조하여 화합물 105a (정량적)를 얻었다. 상기 구조를 LCMS에 의해 확인하였다.
화합물 113 (1.25 g, 2.7 mmol), HBTU (3.2 g, 8.4 mmol) 및 DIEA (2.8 mL, 16.2 mmol)를 무수 DMF (17 mL)에 용해시키고상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF (20 mL) 중의 화합물 105a (3.77 g, 8.4 mmol)의 용액을 부가하였다. 상기 반응을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여 오일을 얻었다. 잔류물을 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고 수성 포화된 NaHCO3 용액 (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 10 내지 20 % MeOH로 용출시켜 화합물 114 (1.45 g, 30%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 114 (1.43 g, 0.8 mmol)를 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (4 mL/4 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (습식 0.14 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 수소로 씻어내고 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 셀라이트 패드를 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1)로 세정하였다. 여과물과 세정물을 함께 조합하고 감압 하에서 증발시켜 화합물 115 (정량적)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 83a (0.17 g, 0.75 mmol), HBTU (0.31 g, 0.83 mmol) 및 DIEA (0.26 mL, 1.5 mmol)를 무수 DMF (5 mL)에 용해시키고 상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF 중의 화합물 115 (1.22 g, 0.75 mmol)의 용액을 부가하고 반응을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류물을 CH2Cl2에 용해시켰다. 유기층을 수성 포화된 NaHCO3 용액 및 염수로 세정하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하였다. 유기층을 농축 건조하고 수득된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 3 내지 15 % MeOH로 용출시켜 화합물 116 (0.84 g, 61%)을 얻었다. 구조를 LC MS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 116 (0.74 g, 0.4 mmol)를 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (5 mL/5 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (습식 0.074 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 수소로 씻어내고 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 셀라이트 패드를 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1)로 세정하였다. 여과물과 세정물을 함께 조합하고 감압 하에서 증발시켜 화합물 117 (0.73 g, 98%)을 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 117 (0.63 g, 0.36 mmol)을 무수 DMF (3 mL)에 용해시켰다. 이용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (70 μL, 0.4 mmol) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (72 μL, 0.42 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하고 수성 포화된 NaHCO3 용액에 부었다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세정하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 상기 디클로로메탄 용액을 농축 건조하고 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중 5 내지 10 % MeOH로 용출하여 화합물 118 (0.51 g, 79%)을 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H 및 1H 및 19F NMR에 의해 확인하였다.
GalNAc3-7 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 119를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-7의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-7a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 49: GalNAc
3
-5를 포함하는 올리고뉴클레오티드 132의 제조
화합물 120 (14.01 g, 40 mmol) 및 HBTU (14.06 g, 37 mmol)를 무수 DMF (80 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민 (11.2 mL, 80.35 mmol)을 부가하고 5분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각하고 무수 DMF (20 mL) 중의 화합물 121 (10 g, mmol)의 용액을 부가하였다. 추가의 트리에틸아민 (4.5 mL, 32.28 mmol)을 부가하고 반응 혼합물을 18시간 동안 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 반응을 TLC (에틸 아세테이트:헥산; 1:1; Rf = 0.47)에 의해 관찰하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 EtOAc (300 mL)에서 취하고 1M NaHSO4 (3 x 150 mL), 수성 포화된 NaHCO3 용액 (3 x 150 mL) 및 염수 (2 x 100 mL)로 세정하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시켰다. 건조제를 여과로 제거하고 유기층을 회전식 증발로 농축하였다. 조 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중 35 50% EtOAc를 사용하여 용출하여 화합물 122 (15.50 g, 78.13%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다. 질량 m/z 589.3 [M + H]+.
물 (20 mL) 및 THF (10 mL) 중의 LiOH (92.15 mmol)의 용액을 메탄올 (15 mL)에 용해된 화합물 122 (7.75 g,13.16 mmol)의 냉각된 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하고 TLC (EtOAc:헥산; 1:1)로 관찰하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 절반 용적으로 농축하였다. 남아있는 용액을 빙욕에서 냉각하고 농축된 HCl를 부가하여 중화하였다. 상기 반응 혼합물을 희석하고, EtOAc (120 mL)로 추출하고 염수 (100 mL)로 세정하였다. 에멀젼 형성하고 밤새 정치하여 제거하였다. 유기층을 분리하고, (Na2SO4)로 건조시키고, 여과하고 증발시켜 화합물 123 (8.42 g)을 얻었다. 잔류 염은 과다 질량의 원인인 것 같다. LCMS는 구조와 일치한다. 생성물을 임의의 추가 정제없이 사용하였다. M.W.cal:574.36; M.W.fd:575.3 [M + H]+.
화합물 126를 하기 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Am. Chem . Soc. 2011, 133, 958-963).
화합물 123(7.419 g, 12.91 mmol), HOBt (3.49 g, 25.82 mmol) 및 화합물 126 (6.33 g, 16.14 mmol)을 DMF (40 mL)에 용해시키고 수득한 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각하였다. 여기에 N,N-디이소프로필에틸아민 (4.42 mL, 25.82 mmol), PyBop (8.7 g, 16.7 mmol) 그 다음 Bop 커플링 시약 (1.17 g, 2.66 mmol)을 아르곤 대기 하에서 부가하였다. 얼음 수조를 제거하고 용액을 실온으로 가온하였다. 반응을 TLC (DCM:MeOH:AA; 89:10:1)에 의해 결정된 바와 같이 1시간 후에 완료시켰다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (200 mL)에 용해시키고 1 M NaHSO4 (3x100 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (3x100 mL) 및 염수 (2x100 mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 50% 헥산/EtOAC 내지 100% EtOAc의 구배로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 포말로서 화합물 127 (9.4 g)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 778.4 [M + H]+.
트리플루오로아세트산 (12 mL)을 디클로로메탄 (12 mL) 중의 화합물 127 (1.57 g, 2.02 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 톨루엔 (30 mL)으로 공-증발시켜 건조하였다. 수득된 잔류물을 아세토니트릴 (30 mL) 및 톨루엔 (40 mL)으로 2회 공-증발시켜 화합물 128 (1.67 g)을 트리플루오로 아세테이트 염으로서 얻었고 다음 단계 동안에 추가 정제없이 사용하였다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 478.2 [M + H]+.
화합물 7 (0.43 g, 0.963 mmol), HATU (0.35 g, 0.91 mmol), 및 HOAt (0.035 g, 0.26 mmol)을 함께 조합하고 둥근바닥 플라스크에서 감압 하에서 P2O5로 4시간 동안 건조시킨 다음 무수 DMF (1 mL)에 용해시키고 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF (0.2 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.2 mL) 중의 화합물 128 (0.20 g, 0.26 mmol)의 용액을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 반응을 LCMS 및 TLC (7% MeOH/DCM)에 의해 결정된 바와 같이 30분 후에 완료시켰다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 DCM (30 mL)에 용해시키고 1 M NaHSO4 (3x20 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (3 x 20 mL) 및 염수 (3x20 mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중의 5-15% MeOH를 이용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 129 (96.6 mg)를 얻었다. LC MS 및 1H NMR은 구조와 일치한다. 질량 m/z 883.4 [M + 2H]+.
화합물 129 (0.09 g, 0.051 mmol)를 20 mL 섬광 바이알 내에서 메탄올 (5 mL)에 용해시켰다. 여기에 소량의 10% Pd/C (0.015 mg)를 부가하고 반응 용기를 H2 가스로 씻어 내었다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 H2 대기 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 셀라이트 패드를 메탄올로 세정하였다. 여과물 및 세정물을 모으고 감압 하에서 농축하여 화합물 130 (0.08 g)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 생성물을 추가 정제없이 사용하였다. 질량 m/z 838.3 [M + 2H]+.
10 mL 표시된 둥근바닥 플라스크에 화합물 130 (75.8 mg, 0.046 mmol), 0.37 M 피리딘/DMF (200 μL) 및 교반 바를 부가하였다. 이 용액에 0.7 M 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트/DMF (100 μL)를 교반하면서 적가하였다. 반응을 LC MS에 의해 결정된 바와 같이 1시간 후에 완료하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류물을 CHCl3 (~ 10 mL)에 용해시켰다. 유기층을 NaHSO4 (1 M, 10 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (10 mL) 및 염수 (10 mL)에 대해 각각 3회 분할하였다. 유기상을 분리하고 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하여 화합물 131 (77.7 mg)을 얻었다. LCMS는 구조와 일치한다. 추가 정제없이 사용하였다. 질량 m/z 921.3 [M + 2H]+.
GalNAc3-5 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 132를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-5의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-5a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 50: GalNAc
4
-11를 포함하는 올리고뉴클레오티드 144의 제조
화합물 134의 합성. 메리필드 플라스크에 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 아세토니트릴로 세정된 아미노메틸 VIMAD 수지 (2.5 g, 450 μmol/g)를 부가하였다. 상기 수지를 아세토니트릴 (4 mL)에서 팽창시켰다. 화합물 133을 20 (1.0 mmol, 0.747 g), TBTU (1.0 mmol, 0.321 g), 아세토니트릴 (5 mL) 및 DIEA (3.0 mmol, 0.5 mL)를 첨가하여 100 mL 둥근바닥 플라스크에서 전-활성화시켰다. 이 용액을 5분 동안 교반한 다음, 흔들면서 메리필드 플라스크에 첨가하였다. 상기 현탁액을 3시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 빼내고 수지를 아세토니트릴, DMF 및 DCM으로 세정하였다. 새로운 수지 로딩을 DCM 중에서 500 nm (소멸 계수 = 76000)에서 DMT 양이온의 흡광도를 측정하여 정량화하였고 238 μmol/g인 것으로 결정되었다. 상기 수지를 아세트산 무수물 용액에서 10분간 3회 현탁시켜 캠핑하였다.
고체 지지체 결합된 화합물 141을 반복적인 Fmoc-기반 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 합성하였다. 소량의 고체 지지체를 빼내고, 암모니아수 (28-30 wt%)에서 6시간 동안 현탁시켰다. 절단된 화합물을 LC-MS에 의해 분석하였고 상기 관찰된 질량은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 1063.8 [M + 2H]+.
고체 지지체 결합된 화합물 142를 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 합성하였다.
고체 지지체 결합된 화합물 143을 DNA 합성기 상에서 표준 고체상 합성을 사용하여 합성하였다.
고체 지지체 결합된 화합물 143을 암모니아수 (28-30 wt%)에 현탁시키고 55 oC 에서 16시간 동안 가열하였다. 상기 용액을 냉각하고 고체 지지체를 여과하였다. 상기 여과물을 농축하고 잔류물을 물에서 용해시키고 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 HPLC로 정제하였다. 전장 화합물 144을 함유하는 분획들을 모으고 탈염하였다. 수득한 GalNAc4-11 콘주게이트된 올리고머 화합물을 LC-MS로 분석하였고, 상기 관찰된 질량은 구조와 일치하였다.
콘주게이트 그룹 GalNAc4-11의 GalNAc4 클러스터 부분 (GalNAc4-11a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc4-11 (GalNAc4-11a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 51: GalNAc
3
-6를 포함하는 올리고뉴클레오티드 155의 제조
화합물 146을 문헌에 기재된 바와 같이 합성하였다: (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
화합물 4 (15 g, 45.55 mmol) 및 화합물 35b (14.3 그램, 57 mmol)를 CH2Cl2 (200 ml)에 용해시켰다. 활성화된 분자체 (4 Å. 2 g, 분말화됨)를 첨가하고, 반응을 30분 동안 질소 대기 하에서 교반하였다. TMS-OTf를 첨가하고(4.1 ml, 22.77 mmol), 반응을 밤새 실온에서 교반하였다. 완료되자마자, 상기 반응을 포화된 수성 NaHCO3의 용액 (500 ml) 및 부서진 얼음 (~ 150 g) 내로 부어 켄칭하였다. 유기층을 단리하고, 염수로 세정하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 오렌지색 오일을 얻었다. 조 물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10% MeOH로 용출시켜 화합물 112 (16.53 g, 63%)를 얻었다. LCMS 및 1HNMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
화합물 112 (4.27 g, 7.35 mmol)를 1:1 MeOH/EtOAc (40 ml)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐, 400 mg)를 부가하고, 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시 (CH2Cl2 중의 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 셀라이트의 패드를 통해 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 진공 하에서 잠시 건조하여 화합물 105a (3.28 g)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 147 (2.31 g, 11 mmol)을 무수 DMF (100 mL)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 3.9 mL, 22 mmol)을 부가한 다음 HBTU (4 g, 10.5 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 ~ 15 분 동안 질소 하에서 교반하였다. 여기에, 건조 DMF 중의 화합물 105a (3.3 g, 7.4 mmol)의 용액을 부가하고 질소 대기 하에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 EtOAc로 희석하고 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 조 물질을 CH2Cl2 중의 칼럼 크로마토그래피 2-5 % MeOH에 의해 정제하여 화합물 148(3.44 g, 73 %)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
화합물 148 (3.3 g, 5.2 mmol)를 1:1 MeOH/EtOAc (75 ml)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (350 mg). 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시 (DCM 중의 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 셀라이트의 패드를 통해 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 간단히 건조하여 화합물 149 (2.6 g)를 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다. 잔류물을 건조 DMF (10 ml)에 용해시키고 이것을 다음 단계에서 즉시 사용하였다.
화합물 146 (0.68 g, 1.73 mmol)을 건조 DMF (20 ml)에 용해시켰다. 여기에, DIEA (450 μL, 2.6 mmol, 1.5 eq.) 및 HBTU (1.96 g, 0.5.2 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 15분 동안 실온에서 질소 하에서 교반하였다. 무수 DMF (10 mL) 중의 화합물 149 (2.6 g)의 용액을 부가하였다. 반응의 pH을 DIEA (필요한 경우)를 첨가하여 pH = 9-10으로 조정하였다. 반응을 실온에서 질소 하에서 2시간 동안 교반하였다. 완료시, 반응을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 수성 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10% MeOH로 용출시켜 화합물 150 (0.62 g, 20 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
화합물 150 (0.62 g)을 1:1 MeOH/ EtOAc (5 L)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (60 mg). 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시 (DCM 중 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 여과 (주사기-팁 테플론 필터, 0.45 μm)에 의해 제거하였다. 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 간단히 건조하여 화합물 151 (0.57 g)을 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다. 생성물을 4 mL 건조 DMF에서 용해시키고 다음 단계에서 즉시 사용하였다.
화합물 83a (0.11 g, 0.33 mmol)을 무수 DMF (5 mL)에서 용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민 (75 μL, 1 mmol) 및 PFP-TFA (90 μL, 0.76 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물은 접촉시 자홍색으로 변하였고, 그 다음 30분 동안 점차 오렌지색으로 변하였다. 반응의 진행을 TLC 및 LCMS로 관찰하였다. 완료시 (PFP 에스테르의 형성), DMF 중의 화합물 151(0.57 g, 0.33 mmol)의 용액을 부가하였다. 반응의 pH를 N,N-디이소프로필에틸아민 (필요한 경우)을 첨가하여 pH = 9-10으로 조정하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 ~ 30분 동안 교반하였다. 완료시, 대다수의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 CH2Cl2로 희석하고 수성 포화된 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 2-10 % MeOH)에 의해 정제하여 화합물 152(0.35 g, 55 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
화합물 152 (0.35 g, 0.182 mmol)를 1:1 MeOH/EtOAc (10 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (35 mg). 용액에 수소 가스를 30분간 기포발생시켰다. 완료시 (DCM 중 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 여과 (주사기-팁 테플론 필터, 0.45 μm)에 의해 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 잠시 건조하여 화합물 153 (0.33 g, 정량적)을 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 153 (0.33 g, 0.18 mmol)을 교반하면서 질소 하에서 무수 DMF (5 mL)에 용해시켰다. 여기에 N,N-디이소프로필에틸아민 (65 μL, 0.37 mmol) 및 PFP-TFA (35 μL, 0.28 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 ~ 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 접촉시 자홍색으로 변하였고, 점차 오렌지색으로 변하였다. 더 많은 N,-디이소프로필에틸아민을 첨가하여 상기 반응 혼합물의 pH를 pH = 9-10으로 유지시켰다. 반응의 진행을 TLC 및 LCMS로 관찰하였다. 완료시, 대다수의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하고 수성 포화된 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 조 물질을 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10% MeOH로 용출시켜 화합물 154 (0.29 g, 79 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
GalNAc3-6 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 155를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-6의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-6a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 52: GalNAc
3
-9를 포함하는 올리고뉴클레오티드 160의 제조
화합물 156를 하기 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Med . Chem . 2004, 47, 5798-5808).
화합물 156(18.60 g, 29.28 mmol)을 메탄올 (200 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (6.15 g, 10 wt%, 로딩 (건조 기준), 매트릭스 탄소 분말, 습성)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 수소 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 셀라이트 패드를 메탄올로 철저히 세정하였다. 조합된 여과물을 세정하고 농축 건조하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 5-10 % 메탄올로 용출시켜 화합물 157 (14.26 g, 89%)을 얻었다. 질량 m/z 544.1 [M-H]-.
화합물 157 (5 g, 9.17 mmol)을 무수 DMF (30 mL)에 용해시켰다. HBTU (3.65 g, 9.61 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (13.73 mL, 78.81 mmol)을 부가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에, 화합물 47 (2.96 g, 7.04 mmol)의 용액을 부가하였다. 반응을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 수용액에 부었다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고 유기층을 염수로 세정하고 건조시키고 (Na2SO4 상에서), 여과하고 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중의 50% 에틸 아세테이트로 용출시켜 화합물 158 (8.25g, 73.3%)을 얻었다. 구조를 MS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 158 (7.2 g, 7.61 mmol)을 감압 하에서 P2O5로 건조시켰다. 상기 건조된 화합물을 무수 DMF (50 mL)에 용해시켰다. 여기에, 1H-테트라졸 (0.43 g, 6.09 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (0.3 mL, 3.81 mmol) 및 2-시아노에틸-N,N,N’,N’-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (3.65 mL, 11.50 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하였다. 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중의 50-90 % 에틸 아세테이트로 용출시켜 화합물 159 (7.82 g, 80.5%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 31P NMR 분석에 의해 확인하였다.
GalNAc3-9 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 160을 표준 올리고뉴클레오티드 합성 과정을 이용하여 제조하였다. 화합물 159의 3 유닛을 고체 지지체에 커플링시킨다음 뉴클레오티드 포스포르아미다이트에 커플링시켰다. 암모니아수를 이용한 상기 보호된 올리고머 화합물의 처리는 화합물 160을 생성하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-9의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-9a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-9 (GalNAc3-9a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 53: 화합물 18 (GalNAc
3
-1a 및 GalNAc
3
-3a)의 제조를 위한 대안적인 절차
락톤 161을 디아미노 프로판 (3-5 eq) 또는 모노-Boc 보호된 디아미노 프로판 (1 eq)과 반응시켜 알코올 162a 또는 162b를 제공하였다. 비보호된 프로판디아민이 상기 반응에 사용되는 경우, 과잉 디아민을 고진공 하에서 증발에 의해 제거하였고, 162a 내의 유리 아미노 그룹을 CbzCl을 이용하여 보호하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제 후백색 고체물로서 162b를 제공하였다. 알코올 162b를 TMSOTf의 존재하에 화합물 4와 추가 반응시켜 163a를 제공하였고, 이는 촉매적 수소첨가를 이용한 Cbz 그룹의 제거에 의해 163b로 전환되었다. 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르 164를 3가산 113 (참고 실시예 48)을 DMF (0.1 내지 0.5 M) 중의 PFPTFA (3.5 eq) 및 피리딘 (3.5 eq)과 반응시켜 제조하였다. 상기 트리에스테르 164를 아민 163b (3-4 eq) 및 DIPEA (3-4 eq)와 직접 반응시켜 화합물 18을 제공하였다. 상기 방법은 중간체의 정제를 상당히 용이하게 하며 실시예 4에 기재된 과정을 이용하여 형성된 부산물의 형성을 최소화한다.
실시예 54: 화합물 18 (GalNAc
3
-1a 및 GalNAc
3
-3a)의 제조를 위한 대안적인 절차
triPFP 에스테르 164를 상기 실시예 53에 개괄된 절차를 이용하여 산 113으로부터 제조하였고 모노-Boc 보호된 디아민과 반응시켜 165를 본질적으로 정량적 수율로 제공하였다. 상기 Boc 그룹을 염산 또는 트리플루오로아세트산으로 제거하여 트리아민을 제공하였고, 이를 적당한 염기, 예컨대 DIPEA의 존재하에 PFP 활성화된 산 166과 반응시켜 화합물 18을 제공하였다.
PFP 보호된 Gal-NAc 산 166을 DMF 중 PFPTFA (1-1.2 eq) 및 피리딘 (1-1.2 eq)으로 처리하여 상응하는 산으로부터 제조하였다. 전구체 산을 결국, 아세토니트릴 및 물 중의 TEMPO (0.2 eq) 및 BAIB를 아용한 산화에 의해 상응하는 알코올로부터 제조하였다. 전구체 알코올을 실시예 47에 앞서 기재된 조건을 이용하여 1,6-헥산디올 (또는 1,5-펜탄디올 또는 다른 n 값에 대한 다른 디올) (2-4 eq) 및 TMSOTf와의 반응에 의해 당 중간체 4로부터 제조하였다.
실시예
55:
생체내
에서
SRB
-1을 표적으로 하는 3' 또는 5'-
콘주게이트
그룹 (GalNAc
3
-1, 3, 8 및 9의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비콘주게이트된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 다양한 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 (절단가능 모이어티)에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에서 부착되었다.
표 39
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. "GalNAc3-9"의 구조가 실시예 52에 나타나 있다. "GalNAc3-3"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. "GalNAc3-8"의 구조가 실시예 47에 나타나 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 40에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다. 사실상, 3' 말단에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 및 GalNAc3-9 콘주게이트 (ISIS 655861 및 ISIS 664078) 및 5' 말단에서 연결된 GalNAc3-3 및 GalNAc3-8 콘주게이트 (ISIS 661161 및 ISIS 665001)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 353382)와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 더욱이, 3' 말단에서 GalNAc3-9 콘주게이트를 포함하는 ISIS 664078은 3' 말단에서 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861와 비교하여 본질적으로 동등하게 강력했다. GalNAc3-3 또는 GalNAc3-9, 각각을 포함하는 5' 콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드, ISIS 661161 및 ISIS 665001은, 3' 콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 655861 및 ISIS 664078)와 비교하여 증가된 효능을 가졌다.
표 40
SRB-1을 표적으로 하는 GalNAc
3
-1, 3, 8 또는 9를 함유하는 ASO
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 군으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표에서 보여진다.
표 41
실시예
56:
생체내
에서
SRB
-1을 표적으로 하는 3' 또는 5'-
콘주게이트
그룹 (GalNAc
3
-1, 2, 3, 5, 6, 7 및 10의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비콘주게이트된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 다양한 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 (절단가능 모이어티)에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 부착되었고, 단 3' 말단에서 부착된 GalNAc3 콘주게이트 그룹을 갖는 ISIS 655861는 제외된다.
표 42
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. "GalNAc3-2a"의 구조가 실시예 37에 나타나 있다. "GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. "GalNAc3-5a"의 구조가 실시예 49에 나타나 있다. "GalNAc3-6a"의 구조가 실시예 51에 나타나 있다. "GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다. "GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 43에 예시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 SRB-1 mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 낮추었다. 사실상, 콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 353382) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 5' 콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 3' 콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 효능의 약간의 증가를 보여주었다.
표 43
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 군으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 44에서 보여진다.
표 44
실시예
57:
생체내
에서
ApoC
III을 표적으로 하는 3'-
콘주게이트
그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 작용 연구의 지속 시간
마우스에게 아래에서 명시된 용량이 1 회 주입되었고 42 일의 과정 동안 ApoC-III 및 혈장 트리글리세라이드 (혈장 TG) 수준에 대해 모니터링되었다. 연구는 각 그룹에서 인간 APOC-III을 발현시키는 3 개의 형질전환 마우스를 사용하여 수행되었다.
표 45
ApoC III를 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다.
표 46
ApoC III mRNA (1 일째 염수 %) 및 혈장 TG 수준 (1 일째 염수 %)
상기 표에서 보여질 수 있는 바와 같이, 작용의 지속시간은 비콘주게이트된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 3'-콘주게이트 그룹의 부가와 함께 증가되었다. 콘주게이트된 완벽한 PS 올리고뉴클레오티드 647535와 비교하여 콘주게이트된 혼합된 PO/PS 올리고뉴클레오티드 647536에 대한 작용의 지속시간이 추가로 증가되었다.
실시예
58:
생체내
에서
SRB
-1을 표적으로 하는 3'-
콘주게이트
그룹 (
GalNAc
3
-1 및 GalNAc
4
-11의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비콘주게이트된 ISIS 440762은 비콘주게이트된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 부착되었다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. "GalNAc3-11a"의 구조가 실시예 50에 나타나 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900, 663748 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 47에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다. 3' 말단(ISIS 651900 및 ISIS 663748)에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 및 GalNAc4-11 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 440762) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드, GalNAc3-1 및 GalNAc4-11는, 동등하게 강력했다.
표 47
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "k"는 6’-(S)-CH3 이환식 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 군으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 48에서 보여진다.
표 48
실시예
59:
생체내
FXI을
표적으로 하는
GalNAc
3
-1
콘주게이트된
ASO의
효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 FXI의 안티센스 억제에 대한 다중 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 404071은 비콘주게이트된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 부착되었다.
표 49
FXI를 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다.
치료
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 피하로 매주 2회 3 주 동안 아래에서 보여진 투여량으로 ISIS 404071, 656172, 656173 또는 PBS 처리된 대조군이 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 FXI mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 혈장 FXI 단백질 수준은 ELISA을 사용하여 또한 측정되었다. FXI mRNA 수준은 PBS-처리된 대조군에 대한 정상화 전에 (RIBOGREEN®를 사용하여) 총 RNA에 대해 결정되었다. 아래의 결과는 각 처리 그룹에 대한 FXI mRNA 수준의 평균 퍼센트로저 제공된다. 데이터는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화되었고 "% PBS"로 나타낸다. ED50은 전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정되었고 아래에서 제공된다.
표 50
인자 XI mRNA (염수 %)
표 50에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 FXI mRNA 수준을 감소시켰다. 3'-GalNAc3-1 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 404071) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드 사이에 효능의 개선이 추가로, PS 연결의 일부를 PO (ISIS 656173)로 치환하여 제공되었다.
표 50a에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 FXI 단백질 수준을 감소시켰다. 3'-GalNAc3-1 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 404071) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드 사이에 효능의 개선이 추가로, PS 연결의 일부를 PO (ISIS 656173)로 치환하여 제공되었다.
표 50a
인자 XI 단백질 (염수 %)
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈, 총 알부민, CRE 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 군으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표에서 보여진다.
표 51
실시예 60:
시험관내
SRB-1을 표적으로 하는 콘주게이트된 ASO의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 일차 마우스 간세포에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 다중 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 353382은 비콘주게이트된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에서 부착되었다.
표 52
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. "GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. "GalNAc3-8a"의 구조가 실시예 47에 나타나 있다. "GalNAc3-9a"의 구조가 실시예 52에 나타나 있다. "GalNAc3-6a"의 구조가 실시예 51에 나타나 있다. "GalNAc3-2a"의 구조가 실시예 37에 나타나 있다. "GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다."GalNAc3-5a"의 구조가 실시예 49에 나타나 있다. "GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
치료
상기 열거된 올리고뉴클레오티드는 25,000 세포/웰의 밀도에서 플레이팅된 일차 마우스 간세포 세포에서 시험관 내에서 시험되었고, 0.03, 0.08, 0.24, 0.74, 2.22, 6.67 또는 20 nM 변형된 올리고뉴클레오티드로 처리되었다. 대략 16 시간의 치료 기간 후, RNA는 세포로부터 단리되었고 mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR에 의해 측정되었고 SRB-1 mRNA 수준은 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정되었다.
IC50을 표준 방법을 사용하여 계산하였고 그 결과가 표 53에서 제시되어 있다. 이 결과는, 시약 또는 전기천공 기술이 올리고뉴클레오티드의 세포로의 유입을 인공적으로 촉진하기 위해 사용되지 않은 유리 흡수 조건 하에서, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 모 올리고뉴클레오티드 (ISIS 353382)보다 간세포에서 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다.
표 53
실시예 61: GalNAc
3
-12를 포함하는 올리고머 화합물 175의 제조
화합물 169는 시판되고 있다. 화합물 172를, 벤질 (퍼플루오로페닐) 글루타레이트를 화합물 171에 부가하여 제조했다. 벤질 (퍼플루오로페닐) 글루타레이트를, DMF 중 PFP-TFA 및 DIEA을 5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산에 부가하여 제조했다. GalNAc3-12 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 175를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 174로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-12의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-12a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.다. GalNAc3-12 (GalNAc3-12a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
62:
GalNAc
3
-
13를
포함하는 올리고머 화합물 180의 제조
화합물 176은 실시예 2에서 보여진 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. GalNAc3-13 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 180를 실시예 49에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 177로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-13의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-13a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.이다. GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 63: GalNAc
3
-14를 포함하는 올리고머 화합물 188의 제조
화합물 181 및 185는 시판되고 있다. GalNAc3-14 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 188를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 187로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-14의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-14a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
64:
GalNAc
3
-15를 포함하는 올리고머 화합물 197의 제조
화합물 189는 시판되고 있다. 화합물 195은 실시예 31에서 보여진 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. GalNAc3-15 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 197은, 표준 올리고뉴클레오티드 합성 절차를 사용하여 화합물 194 및 195로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-15의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-15a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-15 (GalNAc3-15a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
65:
생체내
에서
SRB
-1을 표적으로 하는 5'-
콘주게이트
그룹 (GalNAc
3
-3, 12, 13, 14, 및 15의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비콘주게이트된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 54
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. "GalNAc3-12a"의 구조가 실시예 61에 나타나 있다. "GalNAc3-13a"의 구조가 실시예 62에 나타나 있다. "GalNAc3-14a"의 구조가 실시예 63에 나타나 있다. "GalNAc3-15a"의 구조가 실시예 64에 나타나 있다.
치료
6 내지 8 주령 C57bl6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 아래에서 보여진 투여량으로 ISIS 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262, 또는 염수가 1 회 또는 2 회 피하로 주입되었다. 2 회 투여된 마우스는 제 1 용량 3일 후에 제 2 용량을 수용했다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 55에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다. 표준 녹다운의 유의미한 차이는 단회 용량을 수용한 동물과 2 회 용량을 수용한 동물 사이에 관찰되지 않았다 (참고 ISIS 353382 투여량 30 및 2 x 15 mg/kg; 및 ISIS 661161 투여량 5 및 2 x 2.5 mg/kg). 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-3, 12, 13, 14, 및 15 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비콘주게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 335382) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다.
표 55
SRB-1 mRNA (% 염수)
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화는 염수 군으로부터 유의미한 차이 없이 평가되었다 (데이터 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 56에서 보여진다.
표 56
실시예
66: 5
’-
GalNAc
3
클러스터를 포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스
억제에 대한 다양한 절단가능
모이어티의
효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드 (절단가능 모이어티(CM))에 의해 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 57
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. "GalNAc3-13a"의 구조가 실시예 62에 나타나 있다.
치료
6 내지 8 주령 C57bl6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 661161, 670699, 670700, 670701, 671165, 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 58에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다. 다양한 절단가능 모이어티 모두을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유사한 효능을 보여주었다.
표 58
SRB-1 mRNA (% 염수)
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화는 염수 군으로부터 유의미한 차이 없이 평가되었다 (데이터 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 56에서 보여진다.
표 59
실시예
67:
GalNAc
3
-
16를
포함하는 올리고머 화합물 199의 제조
GalNAc3-16 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 199를 실시예 7 및 9에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-16의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-16a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-16 (GalNAc3-16a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
실시예 68: GalNAc
3
-17를 포함하는 올리고머 화합물 200의 제조
GalNAc3-17 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 200를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-17의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-17a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-17 (GalNAc3-17a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
69:
GalNAc
3
-
18를
포함하는 올리고머 화합물 201의 제조
GalNAc3-18 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 201를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-18의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-18a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-18 (GalNAc3-18a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 70: GalNAc
3
-19를 포함하는 올리고머 화합물 204의 제조
GalNAc3-19 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 204를 실시예 52에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 64로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-19의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-19a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-19 (GalNAc3-19a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 71: GalNAc
3
-20를 포함하는 올리고머 화합물 210의 제조
화합물 205을, 트리플릭산 무수물을 6-아미노헥산산에 부가하여 제조된 아세토니트릴에서 PFP-TFA 및 DIEA을 6-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)헥산산에 부가하여 제조했다. 반응 혼합물을 80 oC로 가열하고, 그 다음 실온으로 온도를 낮추었다. GalNAc3-20 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 210를 실시예 52에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 208로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-20의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-20a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-20 (GalNAc3-20a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 72: GalNAc
3
-21를 포함하는 올리고머 화합물 215의 제조
화합물 211는 시판되고 있다. GalNAc3-21 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 215를 실시예 52에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 213로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-21의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-21a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-21 (GalNAc3-21a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 73: GalNAc
3
-22를 포함하는 올리고머 화합물 221의 제조
화합물 220은 디이소프로필암모늄 테트라졸라이드를 사용하여 화합물 219로부터 제조되었다. GalNAc3-21 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 221를 실시예 52에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 화합물 220로부터 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-22의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-22a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
74: 5
’-
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제에 대한 다양한 절단가능 모이어티의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 60
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
모든 표에서, 대문자는 각 뉴클레오시드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
"GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. GalNAc3-17a의 구조는 실시예 68에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-18a의 구조는 실시예 69에서 보여졌다.
치료
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 표 60에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 61에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사한 효능을 보여주었고 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다.
표 61
SRB-1 mRNA (% 염수)
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 군으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다 (데이터 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 62에서 보여진다.
표 62
실시예 75: 5'-콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 분석
상기 표 54, 57 및 60 중 ASO의 PK를, 실시예 65, 66, 및 74에서 기재된 처리 절차에 따라 수득된 간 샘플을 사용하여 평가했다. 간 샘플을 다지고 표준 프로토콜을 사용하여 추출하고 내부 표준과 함께 IP-HPLC-MS로 분석했다. 모든 대사물의 조합된 조직 수준 (㎍/g)은 적절한 UV 피크를 통합하여 측정되었고, (이 경우에 Isis 번호 353382인 "모") 콘주게이트를 누락한 전장 ASO의 조직 수준을 적절한 추출된 이온 크로마토그램 (EIC)를 사용하여 측정했다.
표 63
간 중 PK 분석
상기 표 63의 결과는, 특히 GalNAc3 콘주게이트 그룹의 유무에 따라 올리고뉴클레오티드 사이의 투여의 차이를 고려할 때, 올리고뉴클레오티드 투여 72 시간 후에 GalNAc3 콘주게이트 그룹 (ISIS 353382)를 포함하지 않는 모 올리고뉴클레오티드보다 GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 간 조직 수준이 더 크다는 것을 보여준다. 더욱이, 72 시간까지, GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 각 올리고뉴클레오티드의 40-98%는 대사작용되어 모 화합물을 얻었고, 이것은, GalNAc3 콘주게이트 그룹이 올리고뉴클레오티드로부터 절단되었다는 것을 나타낸다.
실시예 76: GalNAc
3
-23를 포함하는 올리고머 화합물 230의 제조
화합물 222는 시판되고 있다. 44.48 ml (0.33 mol)의 화합물 222를 피리딘 (500mL) 중 토실 클로라이드 (25.39 g, 0.13 mol)로 16 시간 동안 처리했다. 그 다음 반응을 증발시켜 오일을 얻고, EtOAc에서 용해시키고 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 농축 건조하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, EtOAc/헥산 (1:1) 그 다음 CH2Cl2 중 10% 메탄올로 용출하여 화합물 223을 무색 오일로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 10 g (32.86 mmol)의 1-토실트리에틸렌 글리콜 (화합물 223)을 DMSO (100mL) 중 아지드화나트륨 (10.68 g, 164.28 mmol)로 실온에서 17 시간 동안 처리했다. 그 다음 반응 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 추출했다. 유기 층을 물로 3 회 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층을 농축 건조하여 5.3g의 화합물 224 (92%)을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 1-아지도트리에틸렌 글리콜 (화합물 224, 5.53 g, 23.69 mmol) 및 화합물 4 (6 g, 18.22 mmol)을 4A 분자체 (5g), 및 디클로로메탄 (100mL) 중 TMSOTf (1.65 ml, 9.11 mmol)로 불활성 대기 하에서 처리했다. 14 시간 후, 반응을 여과하여 체를 제거하고, 유기 층을 포화 NaHCO3, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층을 농축 건조하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, 디클로로메탄 중 2 내지 4% 메탄올의 구배로 용출하여 화합물 225를 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 225 (11.9 g, 23.59 mmol)을 펄만 촉매 상에서 EtOAc/메탄올 (4:1, 250mL)에서 수소첨가했다. 8 시간 후, 촉매를 여과로 제거하고 용매를 제거하고 건조시켜 화합물 226을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다.
화합물 227를 산출하기 위해, DMF (100mL) 중 니트로메탄트리스프로피온산 (4.17 g, 15.04 mmol) 및 휘니그 염기 (10.3 ml, 60.17 mmol)의 용액을 펜타플루오로트리플루오로 아세테이트 (9.05 ml, 52.65 mmol)로 적가 처리했다. 30 분 후, 반응을 빙수에 붓고 EtOAc로 추출했다. 유기 층을 물, 염수로 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층을 농축 건조하고 그 다음 헵탄으로부터 재결정화하여 화합물 227을 백색 고형물로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물227(1.5 g, 1.93 mmol) 및 화합물 226 (3.7 g, 7.74 mmol)을 실온에서 아세토니트릴 (15 mL)에서 2 시간 동안 교반했다. 그 다음 반응을 증발 건조하고 디클로로메탄 중 2 내지 10% 메탄올의 구배로 용출하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 228을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 228 (1.7 g, 1.02 mmol)을 에탄올 (100mL) 중 라니 니켈 (약 2g 습성)로 수소의 대기에서 처리했다. 12 시간 후, 촉매를 여과로 제거하고 유기 층을 증발시켜 고형물을 얻었고, 이것을 직접적으로 다음 단계에서 사용했다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 이러한 고형물 (0.87 g, 0.53 mmol)을 DMF (5mL) 중 벤질글루타르산 (0.18 g, 0.8 mmol), HBTU (0.3 g, 0.8 mmol) 및 DIEA (273.7 μL, 1.6 mmol)로 처리했다. 16 시간 후, DMF를 감압 하에서 65에서 제거하여 오일을 얻었고, 오일을 디클로로메탄에서 용해시켰다. 유기 층을 포화 NaHCO3, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층의 증발 후, 화합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중 2 내지 20% 메탄올의 구배로 용출하여 커플링된 생성물을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 벤질 에스테르를 수소 대기 하에서 1 시간 동안 펄만 촉매로 탈보호했다. 그 다음 촉매를 여과로 제거하고 용매를 제거하고 건조시켜 산을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 산 (486 mg, 0.27 mmol)을 건조 DMF (3 mL)에서 용해시켰다. 피리딘(53.61 μL, 0.66 mmol)을 부가하고 반응을 아르곤으로 퍼지했다. 펜타플루오로트리플루오로 아세테이트 (46.39 μL, 0.4 mmol)을 반응 혼합물에 서서히 부가했다. 반응의 색상은 담황색에서 암적색으로 변했고, 옅은 연기가 생겼고, 이것을 아르곤의 스트림으로 없앴다. 반응을 실온에서 1 시간 동안 교반되도록 했다 (반응의 완료는 LCMS으로 확인되었다). 용매를 감압 (회전증발기) 하에서 70 ℃에서 제거했다. 잔류물을 DCM으로 희석하고 1N NaHSO4, 염수로 세정하고, 포화된 중탄산나트륨 및 염수로 다시 세정했다. 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축 건조하여 225 mg의 화합물 229를 잘 부서지는 황색 폼으로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다.
GalNAc3-23 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 230은, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 229로부터 제조되었다. GalNAc3-23 콘주게이트 그룹의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-23a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc3-23 (GalNAc3-23a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예
77:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 64
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-9a의 구조는 실시예 52에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌고, GalNAc3-20a의 구조는 실시예 71에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-23a의 구조는 실시예 76에서 보여졌다.
치료
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 아래에서 보여진 투여량으로 표 64에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 염수가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여로부터 72 시간 후에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 65에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다.
표 65
SRB-1 mRNA (% 염수)
혈청 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 또한 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화가 평가되었고, 염수 군으로부터 유의미한 변화는 없었다 (데이터 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 66에서 보여진다.
표 66
실시예
78:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
안지오텐시노겐을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 정상혈압 스프래그 다우리 래트에서 안지오텐시노겐 (AGT)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 67
AGT을 표적으로 하는 변형된 ASO
"GalNAc3-1a"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다.
치료
6 주령, 수컷 스프래그 다우리 래트 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 투여량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 67에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 래트는 최종 용량 후 72 시간에 희생되었다. AGT 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). AGT 혈장 단백질 수준은 총 안지오텐시노겐 ELISA (카탈로그 # JP27412, IBL International, Toronto, ON)을 1:20,000 희석된 혈장과 함께 사용하여 측정되었다. 아래의 결과는 간에서 AGT mRNA 수준 또는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹의 혈장에서 AGT 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 68에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 AGT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드 보다 유의미하게 더 강했다.
표 68
AGT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
혈장 및 체중 중 간 트랜스아미나제 수준, 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)는, 또한 표준 프로토콜을 사용하여 희생 시에 측정되었다. 결과는 아래의 표 69에서 보여준다.
표 69
간 트랜스아미나제 수준 및 래트 체중
실시예
79:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
APOC
-III을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의
생체내
작용의 지속시간
아래의 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 70
APOC-III을 표적으로 하는 변형된 ASO
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
치료
인간 APOC-III을 발현시키는 6 내지 8 주령 형질전환 마우스 각각에게 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 투여 전에 채혈하여 기준선을 결정하고 투여 후 72 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 및 6 주에서 결정했다. 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준은 실시예 20에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹의 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 수준의 평균 퍼센트로서 나타내고, 이것은, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드가, 모의 투여량이 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 투여량의 3 배일지라도, 콘주게이트 그룹 (ISIS 304801)없는 모 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 작용의 지속시간을 나타낸다는 것을 보여준다.
표 71
형질전환 마우스 중 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준
실시예
80:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는 알파-1
항트립신(A1AT)을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래의 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 A1AT 의용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 72
A1AT을
표적으로 하는 변형된
ASO
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
치료
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 투여량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. A1AT 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). A1AT 혈장 단백질 수준은 마우스 알파 1-항트립신 ELISA을 사용하여 결정되었다 (카탈로그 # 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). 아래의 결과는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 A1AT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준의 평균 퍼센트로부터 나타낸다.
표 73에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 A1AT 간 mRNA 및 A1AT 혈장 단백질 수준을 감소시켰다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 모 (ISIS 476366)보다 유의미하게 더 강했다.
표 73
A1AT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
혈장 중 간 트랜스아미나제 및 BUN 수준은 표준 프로토콜을 사용하여 희생 시에 측정되었다. 체중 및 장기 중량이 또한 측정되었다. 결과는 아래의 표 74에서 보여준다. 체중은 기준선에 대한 %로서 보여진다. 장기 중량은 PBS 대조군 그룹에 대한 체중의 %로서 보여진다.
표 74
실시예
81:
GalNAc
3
클러스터를 포함하는
A1AT을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의
생체내
작용의 지속시간
표 72에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
치료
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 각각에게 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 혈액을 투여 전날에 취하여 기준선을 결정했고 투여 후 5, 12, 19, 및 25 일에서 결정했다. 혈장 A1AT 단백질 수준은 ELISA을 통해 측정되었다 (참고 실시예 80). 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 A1AT 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더 강했고 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 476366) 없는 모보다 더 긴 작용의 지속시간을 가졌다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 678381, 678382, 678383, 및 678384)을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656326)을 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 더욱 더 긴 작용의 지속시간과 함께 일반적으로 더욱 더 강했다.
표 75
마우스 중 혈장 A1AT 단백질 수준
실시예
82:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
시험관내
안티센스 억제
일차 마우스 간 간세포는 96 웰 플레이트에서 15,000 세포/웰에서 처리 2시간 전에 씨딩되었다. 표 76에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 2, 10, 50, 또는 250 nM에서 Williams E 배지에서 부가되었고 세포는 밤새 37 oC에서 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 세포는 올리고뉴클레오티드 부가 다음 16 시간 동안 용해되었고, 총 RNA는 RNease 3000 BioRobot (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). IC50 값은 Prism 4 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하여 측정되었다. 이 결과는, 다양한 상이한 GalNAc 콘주게이트 그룹 및 다양한 상이한 절단가능 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 GalNAc 콘주게이트 그룹 (ISIS 353382 및 666841)이 없는 모 올리고뉴클레오티드보다 시험관내 유리 흡수 실험에서 유의미하게 더 강하다는 것을 보여준다.
표 76
시험관내
SRB
-1 발현의 억제
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-5a의 구조는 실시예 49에서 보여졌고, GalNAc3-6a의 구조는 실시예 51에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-8a의 구조는 실시예 47에서 보여졌고, GalNAc3-9a의 구조는 실시예 52에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-12a의 구조는 실시예 61에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌고, GalNAc3-14a의 구조는 실시예 63에서 보여졌고, GalNAc3-15a의 구조는 실시예 64에서 보여졌고, GalNAc3-17a의 구조는 실시예 68에서 보여졌고, GalNAc3-18a의 구조는 실시예 69에서 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌고, GalNAc3-20a의 구조는 실시예 71에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-23a의 구조는 실시예 76에서 보여졌다.
실시예
83:
GalNAc
3
클러스터를 포함하는 인자 XI를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래의 표 77에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 인자 XI의 용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 77
인자 XI를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
치료
6 내지 8 주령 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 투여량으로, 총 3 회 용량 동안, 아래에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스를 최종 투여로부터 72시간 후 희생시켰다. 인자 XI 간 mRNA 수준은 실시간 PCR을 사용하여 측정되었고 표준 프로토콜에 따라 시클로필린에 대해 정규화되었다. 간 트랜스아미나제, BUN, 및 빌리루빈이 또한 측정되었다. 아래의 결과는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 78에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 인자 XI 간 mRNA를 감소시켰다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 404071)가 없는 모보다 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 663086, 678347, 678348, 및 678349)을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656173)을 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 더욱 더 강했다.
표 78
인자 XI 간 mRNA, 간 트랜스아미나제, BUN, 및 빌리루빈 수준
실시예
84:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는 인자 XI를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의
생체내
작용의 지속시간
표 77에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
치료
6 내지 8 주령 마우스 각각에게 표 77에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 혈액을 투여 전날에 꼬리 출혈에 의해 취해서 기준선을 결정하고 투여 후 3, 10, 및 17 일에서 측정했다. 혈장 인자 XI 단백질 수준은 인자 XI 포획 및 바이오티닐화된 검출 항체 (R & D SYSTEMS, Minneapolis, MN (카탈로그 # AF2460 및 # BAF2460, 각각)) 및 OptEIA 시약 세트 B (카탈로그 # 550534, BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 인자 XI 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 404071) 없는 모보다 더 긴 작용의 지속시간과 함께 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 663086, 678347, 678348, 및 678349)을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656173)을 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 더욱 더 긴 작용의 지속시간과 함께 더 더욱 더 강했다.
표 79
마우스 중 혈장 인자 XI 단백질 수준
실시예
85:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
표 76에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
치료
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 투여량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 76에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 염수가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 48 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군으로 정규화된 각 처리 그룹에 대한 간 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 80 및 81에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다.
표 80
간 중 SRB-1 mRNA
표 81
간 중 SRB-1 mRNA
간 트랜스아미나제 수준, 총 빌리루빈, BUN, 및 체중은 표준 프로토콜을 사용하여 또한 측정되었다. 각 처리 그룹의 평균 값은 아래의 표 82에서 보여진다.
표 82
실시예
86:
GalNAc
3
클러스터를 포함하는
TTR를
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래의 표 83에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 인간 TTR 유전자를 발현시키는 형질전환 마우스에서 인간 트랜스티레틴 (TTR)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
치료
8 주령 TTR 형질전환 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 3 주 동안, 총 3 회 용량 동안, 아래의 표에서 열거된 올리고뉴클레오티드 및 투여량 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 꼬리 출혈은 실험을 통해 다양한 시점에서 수행되었고, 혈장 TTR 단백질, ALT, 및 AST 수준은 측정되고 표 85-87에서 보고되었다. 상기 동물이 희생된 후, 혈장 ALT, AST, 및 인간 TTR 수준은 체중, 장기 중량, 및 간 인간 TTR mRNA 수준에서와 같이 측정되었다. TTR 단백질 수준은 임상 분석기 (AU480, Beckman Coulter, CA)를 사용하여 측정되었다. 간 인간 TTR mRNA 수준을 측정하기 위하여 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하였다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) . 표 84-87에서 제공된 결과는 각 처리 그룹의 평균 값이다. mRNA 수준은 PBS 그룹의 평균에 대한 평균 값이다. 혈장 단백질 수준은 기준선에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 평균 값이다. 체중은 각 개별적인 처리 그룹에 대한 희생까지 기준선으로부터의 평균 퍼센트 체중 변화이다. 보여진 장기 중량은 동물의 체중으로 정규화되고, 그 다음 각 처리 그룹의 평균 정규화된 장기 중량은 PBS 그룹의 평균 정규화된 장기 중량에 대해 나타낸다.
표 84 내지 87에서, "BL"는 제 1 용량 직전에 취한 기준선, 측정을 나타낸다. 표 84 및 85에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 TTR 발현 수준을 감소시켰다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 420915)가 없는 모보다 더 강했다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 및 혼합된 PS/PO 뉴클레오시드간 연결를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트 및 완벽한 PS 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
표 83
인간
TTR을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드
표 85에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. "GalNAc3-1"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. “GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. “GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다. “GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다. “GalNAc3-13a"의 구조가 실시예 62에 나타나 있다. “GalNAc3-19a"의 구조가 실시예 70에 나타나 있다.
표 84
생체내
인간 TTR의 안티센스 억제
표 85
생체내
인간 TTR의 안티센스 억제
표 86
트랜스아미나제 수준, 체중 변화, 및 장기 중량
표 87
트랜스아미나제
수준, 체중 변화, 및 장기 중량
실시예
87:
GalNAc
3
클러스터를 포함하는
TTR을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 단회 용량에 의한
생체내
작용의 지속시간
ISIS 번호 420915 및 660261 (참고 표 83)은 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 번호 420915, 682883, 및 682885 (참고 표 83)은 또한 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
치료
인간 TTR을 발현시키는 8 주령, 수컷 형질전환 마우스 각각에게 100 mg/kg ISIS 번호 420915 또는 13.5 mg/kg ISIS 번호 660261가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 투여 전에 수행되어 기준선을 결정했고 투여 3, 7, 10, 17, 24, 및 39 일 후에 측정했다. 혈장 TTR 단백질 수준은 실시예 86에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 TTR 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 88
혈장 TTR 단백질 수준
치료
인간 TTR을 발현시키는 암컷 형질전환 마우스 각각에게 100 mg/kg ISIS 번호 420915, 10.0 mg/kg ISIS 번호 682883, 또는 10.0 mg/kg 682885가 피하로 한번 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 투여 전에 수행되어 기준선을 결정했고 투여 3, 7, 10, 17, 24, 및 39 일 후에 측정했다. 혈장 TTR 단백질 수준은 실시예 86에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 TTR 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 89
혈장 TTR 단백질 수준
표 88 및 89의 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드 (ISIS 420915)보다 더 긴 지속시간과 함께 더 강하다는 것을 보여준다.
실시예
88:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SMN을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
스플라이싱 조절
표 90에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 운동 뉴런 (SMN)의 인간 생존의 스플라이싱 조절에 대해 시험되었다.
표 90
SMN를
표적으로 하는 변형된
ASO
"GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다. "X"는 유전자 도구(Gene Tools) (Philomath, OR)에 의해 산출된 5' 일차 아민을 나타내고, GalNAc3-7b는 이하에서 보여진 바와 같은 링커의 -NH-C6-O 부분이 없는 GalNAc3-7a의 구조를 나타낸다:
ISIS 번호 703421 및 703422는 모플리노 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 2 개의 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오티드는 모폴리노 뉴클레오티드이다.
치료
인간 SMN를 발현시키는 6 주령 형질전환 마우스는 표 91에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 염수가 피하로 한번 주입되었다. 각 처리 그룹은 2 마리 수컷 및 2 마리 암컷으로 구성되었다. 마우스는 투여 3 일 후에 희생되어 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 사용하여 엑손 7 유무에 따른 간 인간 SMN mRNA 수준을 측정했다. 총 RNA는 리보그린 시약을 사용하여 측정되었다. SMN mRNA 수준은 총 mRNA로 정규화되었고, 염수 처리 그룹의 평균으로 추가로 정규화되었다. 엑손 7 포함 SMN mRNA 대 엑손 7 누락 SMN mRNA의 수득한 평균 비는 표 91에서 보여진다. 이 결과는, 스플라이싱을 조절하고 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 완전히 변형된 올리고뉴클레오티드가 GlaNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드보다 간에서 스플라이싱을 변경할 때 유의미하게 더 강하다는 것을 보여준다. 더욱이, 이러한 추세는 2'-MOE 및 모폴리노 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중 변형 화학을 위해 유지된다.
표 91
생체내
에서 인간 SMN을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 효과
실시예
89:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
아포지질단백질
A (
아포
(a))을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
아래의 표 92에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 형질전환 마우스에서 아포(a)의 용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 92
아포(a)를 표적으로 하는 변형된 ASO
“GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
치료
8 주령, 암컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 투여량으로, 총 6 번 용량 동안에, 표 92에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 3 내지 4 마리의 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 제 1 용량 전날에 및 각 용량 다음 매주 수행되어 혈장 아포(a) 단백질 수준을 측정했다. 마우스는 최종 투여 2 일 후에 희생되었다. 아포(a) 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아포(a) 혈장 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었고, 간 트랜스아미나제 수준이 측정되었다. 표 93의 mRNA 및 혈장 단백질 결과는 PBS 처리된 그룹에 대한 처리 그룹 평균 퍼센트로서 나타낸다. 혈장 단백질 수준은 PBS 그룹의 기준선 (BL) 값으로 추가로 정규화되었다. 평균 절대적인 트랜스아미나제 수준 및 체중 (기준선 평균에 대한 %)은 표 94에서 보고된다.
표 93에서 실증된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 아포(a) 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준을 감소시켰다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 작용의 지속시간과 함께 유의미하게 더 강했다. 표 94에서 실증된 바와 같이, 트랜스아미나제 수준 및 체중은 올리고뉴클레오티드에 의해 영향을 받지 않았고, 이것은, 올리고뉴클레오티드가 잘 용인되었다는 것을 나타낸다.
표 93
아포(a) 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
표 94
실시예
90:
GalNAc
3
클러스터를 포함하는
TTR를
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스
억제
아래의 표 95에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 인간 TTR 유전자를 발현시키는 형질전환 마우스에서 인간 트랜스티레틴 (TTR)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
치료
TTR 형질전환 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 3 주 동안, 총 3 회 용량 동안, 표 96에서 열거된 올리고뉴클레오티드 및 투여량 또는 PBS이 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 제 1 용량 전에, 꼬리 출혈이 수행되어 기준선 (BL)에서 혈장 TTR 단백질 수준을 측정했다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. TTR 단백질 수준은 임상 분석기 (AU480, Beckman Coulter, CA)를 사용하여 측정되었다. 간 인간 TTR mRNA 수준을 측정하기 위하여 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하였다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 표 96에서 제공된 결과는 각 처리 그룹의 평균 값이다. mRNA 수준은 PBS 그룹의 평균에 대한 평균 값이다. 혈장 단백질 수준은 기준선에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 평균 값이다. "BL"는 제 1 용량 직전에 취한 기준선, 측정을 나타낸다. 표 96에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 TTR 발현 수준을 감소시켰다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 420915)가 없는 모보다 더 강했고, 포스포디에스테르 또는 데옥시아데노신 절단가능 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 콘주게이트가 없는 모체와 비교하여 효능의 유의미한 개선을 보여주었다 (참고 ISIS 번호 682883 및 666943 vs 420915 및 실시예 86 및 87 참고).
표 95
인간
TTR을
표적으로 하는 올리고뉴클레오티드
표 95에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. “GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. “GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다. “GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다. “GalNAc3-13a"의 구조가 실시예 62에 나타나 있다.
표 96
생체내
인간 TTR의 안티센스 억제
실시예
91: 비-인간 영장류에서
GalNAc3
콘주게이트를
포함하는 인자 VII를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
아래의 표 97에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 원숭이에서 인자 VII의 안티센스 억제에 대해 비-말단, 용량 단계적 확대 연구에서 시험되었다.
치료
비-나이브 원숭이 각각에게 0, 15, 및 29일에 상승하는 용량의 표 97에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS가 피하로 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷으로 구성되었다. 제 1 용량 전에 및 그 후 다양한 시점에서, 채혈이 수행되어 혈장 인자 VII 단백질 수준을 측정했다. 인자 VII 단백질 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. 표 98에서 제공된 결과는 기준선 (BL)에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 각 처리 그룹의 평균 값이고, 상기 측정은 제 1 용량 직전에 취해졌다. 표 98에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식으로 인자 VII 발현 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 올리고뉴클레오티드와 비교하여 원숭이에서 유의미하게 더 강했다.
표 97
인자 VII을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드
표 97에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. “GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다.
표 98
인자 VII 혈장 단백질 수준
실시예
92:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
Apo
-
CIII을
표적으로 하는
안티센스
올리고뉴클레오티드에 의한 일차 간세포에서의
안티센스
억제
일차 마우스 간세포는 15,000 세포/웰에서 96-웰 플레이트에서 씨딩되었고, 마우스 ApoC-III을 표적으로 하는, 표 99에서 열거된 올리고뉴클레오티드는, 0.46, 1.37, 4.12, 또는 12.35, 37.04, 111.11, 또는 333.33 nM 또는 1.00 μM에서 부가되었다. 24 시간 동안 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션한 후, 세포는 용해되었고 총 RNA는 RNeasy (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. ApoC-III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약 (Molecular Probes, Inc.)을 사용하여 측정되었다. IC50 값은 Prism 4 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하여 측정되었다. 이 결과는, 절단가능 모이어티가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-연결된 데옥시아데노신인 지와는 무관하게, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다.
표 99
마우스 일차 간세포 중 마우스
APOC
-III 발현의 억제
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌고, 그리고 GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌다.
실시예
93: 혼합된 윙 및 5’-
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
표 100에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 100
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "k"는 6’-(S)-CH3 이환식 뉴클레오시드 (cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다.
치료
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 표 100에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 염수가 아래에서 보여진 투여량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 간 SRB-1 mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 시클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 결과는 염수 대조군 그룹에 대한 각 처리 그룹을 위해 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 표 101에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하고 완전한 cEt 또는 혼합된 당 변형이었던 윙을 갖는 갭머 올리고뉴클레오티드는 콘주게이트가 없고 완전한 cEt 변형된 윙을 포함하는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다.
체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN가 또한 측정되었고, 각 처리 그룹에 대한 평균 값은 표 101에서 보여진다. 체중은 올리고뉴클레오티드 용량 직전에 측정된 기준선 체중 (% BL)에 대한 평균 퍼센트 체중로서 보여진다.
표 101
SRB-1 mRNA, ALT, AST, BUN, 및 총 빌리루빈 수준 및 체중
실시예
94: 2
’-당 변형 및 5’-
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
SRB
-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
표 102에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 102
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
하첨자 "m"은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드를 나타낸다. 완전한 표 범례에 대한 실시예 74 참고. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다.
치료
이러한 연구는 실시예 93에서 기재된 프로토콜을 사용하여 완료되었다. 결과는 아래의 표 103에서 보여지고 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 2'-MOE 및 2'-OMe 변형된 올리고뉴클레오티드 둘 모두가 콘주게이트가 없는 각 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN 측정의 결과는, 모든 화합물이 용인되었다는 것을 명시했다.
표 103
SRB-1 mRNA
실시예
95: 이환식 뉴클레오시드 및 5’-
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
표 104에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 104
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된
ASO
하첨자 "g"는 플루오로-HNA 뉴클레오시드를 나타내고, 하첨자 "l"는 2’-O-CH2-4’ 가교를 포함하는 잠겨진 뉴클레오시드를 나타낸다. 다른 약어에 대한 실시예 74 표 범례 참고. GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다.
치료
이러한 연구는 실시예 93에서 기재된 프로토콜을 사용하여 완료되었다. 결과는 아래의 표 105에서 보여지고 GalNAc 콘주게이트 및 다양한 이환식 뉴클레오시드 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 콘주게이트가 없고 이환식 뉴클레오시드 변형을 포함하는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 및 플루오로-HNA 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 콘주게이트가 없고 플루오로-HNA 변형을 포함하는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다. 체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN 측정의 결과는, 모든 화합물이 용인되었다는 것을 명시했다.
표 105
SRB-1 mRNA, ALT, AST, BUN, 및 총 빌리루빈 수준 및 체중
실시예
96:
GalNAc
3
콘주게이트
그룹을 포함하는
안티센스
올리고뉴클레오티드의 혈장 단백질 결합
ApoC-III을 표적으로 하는 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오티드 및 아포(a)을 표적으로 하는 표 106에서의 올리고뉴클레오티드는 한외 검정에서 시험되어 혈장 단백질 결합을 평가했다.
표 106
아포(a)을
표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
표 범례에 대한 실시예 74 참조. "GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
Ultrafree-MC 한외여과 장치 (30,000 NMWL, 저-결합 재생된 셀룰로오스 막, 밀리포어, Bedford, MA)을 300 μL의 0.5% Tween 80으로 사전-컨디셔닝하고 10 분 동안 2000 g에서 원심분리하고, 그 다음 H2O 중 대조군 올리고뉴클레오티드의 300μL의 300 μg/mL 용액으로 사전-컨디셔닝하고 16 분 동안 2000 g에서 원심분리했다. 본 연구에서 사용될 표 70 및 106으로부터의 각 시험 올리고뉴클레오티드의 필터에 대한 비-특이적 결합을 평가하기 위해, H2O 중 올리고뉴클레오티드의 300 μL의 250 ng/mL 용액을 pH 7.4에서 사전-컨디셔닝된 필터 내에 두었고 16 분 동안 2000 g에서 원심분리했다. 비여과된 및 여과된 샘플을 ELISA 검정로 분석하여 올리고뉴클레오티드 농도를 측정했다. 3개의 복제물을 사용하여 각 샘플에 대한 평균 농도를 얻었다. 미여과된 샘플에 대한 여과된 샘플의 평균 농도를 사용하여 혈장의 부재에서 필터를 통해 회수된 올리고뉴클레오티드의 퍼센트를 결정한다 (% 회수율).
정상, 무약물 인간 지원자, 시노몰구스 원숭이, 및 CD-1 마우스로부터의 K3-EDTA에서 수집된 냉동된 전체의 혈장 샘플을, Bioreclamation LLC (Westbury, NY)로부터 구매했다. 시험 올리고뉴클레오티드를 1.2 mL 분취량의 혈장에 2 개의 농도 (5 및 150 μg/mL)에서 부가했다. 분취량 (300 μL)의 각 스파이킹된 혈장 샘플을 사전-컨디셔닝된 필터 장치에 내에 두고 37°에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 즉시 그 다음 2000 g에서 16 분 동안 원심분리했다. 분취량의 여과된 및 미여과된 스파이킹된 혈장 샘플을 ELISA로 분석하여 각 샘플 중 올리고뉴클레오티드 농도를 측정했다. 농도 당 3 개의 복제물을 사용된 각 샘플 중 결합된 및 미결합된 올리고뉴클레오티드의 평균 백분율을 측정했다. 미여과된 샘플의 농도에 대한 여과된 샘플의 평균 농도는 사용되어 혈장 단백질에 결합되지 않는 혈장(미결합된 %) 중 올리고뉴클레오티드의 퍼센트를 측정한다. 최종 미결합된 올리고뉴클레오티드 값은 각 올리고뉴클레오티드에 대해 % 미결합된 %를 % 회수율로 나누어서 비-특이적 결합을 위해 수정된다. 최종 % 결합된 올리고뉴클레오티드 값은 100에서 최종 % 미결합된 값을 빼서 결정된다. 결과는 각 종의 혈장에서 시험된 2 개의 올리고뉴클레오티드의 농도 시험 (5 및 150 μg/mL)에 대해 표 107에서 보여진다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹이 혈장 단백질 결합에 대한 유의미한 영향을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 더욱이, 완벽한 PS 뉴클레오시드간 연결 및 혼합된 PO/PS 연결 둘 모두를 갖는 올리고뉴클레오티드는 혈장 단백질에 결합하고, 완벽한 PS 연결을 갖는 것은 혼합된 PO/PS 연결을 갖는 것보다 임의의 정도 더 큰 정도로 혈장 단백질에 결합한다.
표 107
혈장 단백질에 결합된 변형된 올리고뉴클레오티드의 퍼센트
실시예
97:
GalNAc
3
콘주게이트
그룹을 포함하는
TTR을
표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
GalNAc 콘주게이트를 포함하는 표 108에서 보여진 올리고뉴클레오티드는 설계되어 TTR을 표적으로 했다.
표 108
TTR을
표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
표 108에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. "GalNAc3-1"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다. “GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다. “GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다. “GalNAc3-10a"의 구조가 실시예 46에 나타나 있다. “GalNAc3-13a"의 구조가 실시예 62에 나타나 있다. “GalNAc3-19a"의 구조가 실시예 70에 나타나 있다.
실시예
98:
hPMBC
검정에서
GalNAc
콘주게이트를
포함하는 올리고뉴클레오티드의 전-염증 효과의 평가
표 109에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 실시예 23 및 24에서 기재된 바와 같이 hPMBC 검정에서 전-염증 효과에 대해 시험되었다. (올리고뉴클레오티드의 기술에 대하여, 표 30, 83, 95, 및 108 참고). ISIS 353512는 양성 대조군으로서 사용된 고반응군이고, 다른 올리고뉴클레오티드는 표 83, 95, 및 108에서 기재되어 있다. 표 109에서 보여진 이러한 결과는 하나의 지원자 공여체로부터의 혈액을 사용하여 수득되었다. 이 결과는, 혼합된 PO/PS 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드가 완벽한 PS 연결을 갖는 동일한 올리고뉴클레오티드와 비교하여 유의미하게 더 낮은 전-염증 반응을 생산했다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 그룹은 이러한 검정에서 유의미한 효과를 가지지 않았다.
표 109
실시예
99:
아시알로당단백질
수용체에 대한
GalNAc
콘주게이트를
포함하는 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성
아시알로당단백질 수용체에 대한 표 110에서 열거된 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성 (올리고뉴클레오티드의 설명에 대한 표 76 참고)은 경쟁적 수용체 결합 검정에서 시험되었다. 경쟁자 리간드, α1-산 당단백질 (AGP)는, 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에서 1 U 뉴라미니다제-아가로스와 함께 16 시간 동안 37에서 인큐베이션되었고, > 90% 탈시알릴화(desialylation)는 시알산 검정 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 확인되었다. 요오드 모노클로라이드는 사용되어 Atsma 등에 의한 절차에 따라 AGP를 요오드화했다 (참고: J Lipid Res. 1991 Jan; 32(1):173-81.) 이러한 방법에서, 탈시알릴화된 α1-산 당단백질 (de-AGP)을 0.25 M NaOH 중 10 mM 염화요오드, Na125I, 및 1 M 글리신에 부가했다. 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 125I -표지된 de-AGP를, 3 KDMWCO 스핀 칼럼을 시용하여 혼합물을 2회 농축하여 유리 125I로부터 분리했다. 단백질을, Agilent SEC-3 칼럼 (7.8x300mm) 및 β-RAM 계수기가 구비된 HPLC 시스템 상에서 표지 효율 및 순도에 대해 시험했다. 125I-표지된 de-AGP 및 ASO를 함유하는 다양한 GalNAc-클러스터를 이용하는 경쟁 실험을 하기와 같이 수행했다. 인간 HepG2 세포 (106 세포/ml)을 2 mL의 적절한 성장 배지에서 6-웰 플레이트 상에서 플레이팅했다. 10% 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민 및 10mM HEPES로 보강된 MEM 배지를 사용했다. 세포를 16-20 시간 동안 37에서 5% 및 10% CO2 각각과 함께 인큐베이션했다. 세포를 실험 전에 FBS가 없는 배지로 세정했다. 세포를, 적절한 성장 배지를 2% FBS, 10-8 M 125I-표지된 de-AGP와 함게 함유하는 1ml 경쟁 혼합물 및 10-11 내지 10-5 범위의 농도에서 ASO를 함유하는 GalNAc-클러스터로 30 분 동안 37˚C에서 인큐베이션했다. 비-특이적 결합을 10-2 M GalNAc 당의 존재에서 결정했다. 세포를 FBS가 없는 배지로 2회 세정하여 미결합된 125I-표지된 de-AGP 및 경쟁자 GalNAc ASO를 제거했다. 세포를, 1% β-머캅토에탄올을 함유하는 Qiagen's RLT 완충액를 사용하여 용해시켰다. 용해물을 짧은 10 분 동결/융해 사이클 후 둥근바닥 검정 튜브로 이동시키고 γ-계수기 상에서 검정했다. 비-특이적 결합을 공제한 후 125I 단백질 카운트를 최저 GalNAc-ASO 농도 카운트의 값으로 나누었다. 억제 곡선 비선형회귀 알고리즘을 사용하는 단일 부위 경쟁적 결합 방정식에 따라 적합화되어 결합 친화성 (KD’s)을 계산했다.
표 110의 결과는 5 개의 상이한 날에 수행된 실험으로부터 수득되었다. 상첨자 "a"로 나타낸 올리고뉴클레오티드에 대한 결과는 2 개의 상이한 날에 실험 구동의 평균이다. 이 결과는, 5'-말단 상에 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 상에 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 1.5 내지 16-배 더 큰 친화성을 갖는 인간 HepG2 세포 상에서 아시알로당단백질 수용체를 결합햇다는 것을 보여준다.
표 110
아시알로당단백질 수용체 결합 검정 결과
실시예 100:
생체내
에서 아포(a)를 표적으로 하는 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
아래의 표 111a에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 111a
아포(a)를
표적으로 하는 변형된
ASO
“GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
치료
인간 아포(a)을 발현시키는 암컷 형질전환 마우스 각각에게, 피하로 주당 1회, 총 6 번 용량 동안에, 표 111b에서 열거된 올리고뉴클레오티드 및 투여량 또는 PBS이 주입되었다. 각 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 혈액을, 투여 전날에 뽑아서 아포(a) 단백질의 기준선 수준을 혈장에서 그리고 제 1 용량 다음72 시간, 1 주, 및 2 주에서 측정했다. 추가의 채혈은 제 1 용량 다음 3 주, 4 주, 5 주, 및 6 주에서 일어날 것이다. 혈장 아포(a) 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 표 111b의 결과는 기준선 수준 (% BL)에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 아포(a) 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 제공되고, 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 아포(a) 발현에서 강력한 감소를 나타내었다는 것을 보여준다. 이러한 강력한 효과는 완벽한 PS 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 혼합된 PO 및 PS 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 대해 관찰되었다.
표 111b
아포(a) 혈장 단백질 수준
실시예 101: 안정한 모이어티를 통해 연결된 GalNAc 클러스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 억제
표 112에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스 APOC-III 발현의 억제에 대해 생체내에서 시험되었다. C57Bl/6 마우스 각각에게 표 112에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. ISIS 440670로 처리된 각각의 마우스는 2, 6, 20, 또는 60 mg/kg의 용량을 수용했다. ISIS 680772 또는 696847로 처리된 각각의 마우스는 0.6, 2, 6, 또는 20 mg/kg을 수용했다. ISIS 696847의 GalNAc 콘주게이트 그룹은 쉽게 절단가능 포스포디에스테르 함유 연결 대신에 안정한 모이어티, 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다. 동물은 용량 후 72 시간에 희생되었다. 간 APOC-III mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. APOC-III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 시클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 결과는 염수 대조군 그룹에 대한 각 처리 그룹을 위해 APOC-III mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 표 112에서 제공된다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 콘주게이트 그룹이 없는 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 절단가능 모이어티 (ISIS 680772)를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결된 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 안정한 모이어티 (ISIS 696847)를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결된 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드보다 더욱 더 강했다.
표 112
마우스
APOC
-III를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
“GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
실시예 102: GalNAc 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 간에서의 분포
GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 ISIS 353382 (참고 표 36) 및 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861 (참고 표 36)의 간 분포는 평가되었다. 수컷 Balb/c 마우스에게 표 113에서 열거된 투여량으로 ISIS 353382 또는 655861을 피하로 1회 주입했다. 각각의 처리 그룹은 2 마리의 동물로 구성된 ISIS 655861에 대한 18 mg/kg 그룹을 제외하고 3 마리의 동물로 구성되었다. 동물을 투여 48 시간 후에 희생시켜 올리고뉴클레오티드의 간 분포를 측정했다. 세포 당 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 수를 측정하기 위해, 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 태그 (MSD TAG, 중간 규모발견)을 안티센스 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브에 콘주게이트된다. 표 113에 존재하는 결과는 세포 당 올리고뉴클레오티드 분자의 수백만 단위로 각 처리 그룹에 대한 올리고뉴클레오티드의 평균 농도이다. 이 결과는, 동등 투여량에서, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드보다 전체 간 및 간세포에서 더 높은 농도로 존재한다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드 보다 더 낮은 비-실질 간 세포 중 농도로 존재했다. 그리고 간세포 및 비-실질 간 세포 중 ISIS 655861의 농도는 세포에 대해 유사했지만, 간은 용적으로 대략 80% 간세포이다. 따라서, 간에 존재했던 대다수의 ISIS 655861 올리고뉴클레오티드는 간세포에서 발견되었고, 반면에 간에 존재했던 대다수의 ISIS 353382 올리고뉴클레오티드는 비-실질 간 세포에서 발견되었다.
표 113
실시예
103:
GalNAc
3
콘주게이트를
포함하는
APOC
-III을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의
생체내
작용의 지속시간
아래의 표 114에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 114
APOC-III을 표적으로 하는 변형된 ASO
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-19a는 실시예 70에서 보여졌다.
치료
인간 APOC-III을 발현시키는 암컷 형질전환 마우스 각각에게 표 114에서 열거된 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 투여 전에 채혈하여 투여 다음에 기준선 및 3, 7, 14, 21, 28, 35, 및 42 일에서 측정했다. 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준은 실시예 20에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 표 115에서의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 실시예 79의 표 71의 결과와 아래의 표 115의 결과와의 비교는, 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결만을 포함하는 동등한 올리고뉴클레오티드보다 작용의 증가된 지속시간을 나타냈다는 것을 보여준다.
표 115
형질전환 마우스 중 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준
실시예 104: 5’-GalNAc
2
콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
화합물 120은 시판되고 있고, 화합물 126의 합성은 실시예 49에서 기재되어 있다. 화합물 120 (1 g, 2.89 mmol), HBTU (0.39 g, 2.89 mmol) 및 HOBt (1.64 g, 4.33 mmol)를 DMF (10 mL에 용해시켰다. 그리고 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.75 mL, 10.1 mmol)을 부가하였다. 약 5 분 후, 아미노헥산산 벤질 에스테르 (1.36 g, 3.46 mmol)을 반응에 부가했다. 3 시간 후, 반응 혼합물을 100 mL의 1 M NaHSO4에 붓고 2 x 50 mL 에틸 아세테이트로 추출했다. 유기 층들을 조합하고 3 x 40 mL 포화 NaHCO3 및 2 x 염수로 세정하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축했다. 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (DCM:EA:Hex, 1:1:1)로 정제하여 화합물 231을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 231 (1.34 g, 2.438 mmol)을 디클로로메탄 (10 mL)에서 용해시키고 트리플루오르아세트산 (10 mL)을 부가했다. 실온에서 2 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고 톨루엔 (3 x 10 mL)로 공-증발시켰다. 잔류물을 감압 하에서 건조하여 화합물 232을 트리플루오르아세테이트 염으로서 얻었다. 화합물 166의 합성은 실시예 54에서 기재되어 있다. 화합물 166 (3.39 g, 5.40 mmol)을 DMF (3 mL)에서 용해시켰다. 화합물 232 (1.3 g, 2.25 mmol)의 용액을 DMF (3 mL)에서 용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.55 mL)을 부가했다. 반응을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 그 다음 물 (80 mL)에 붓고 수성 층을 EtOAc (2x100 mL)로 추출했다. 유기 상을 분리하고 포화 수성 NaHCO3 (3 x 80 mL), 1 M NaHSO4 (3 x 80 mL) 및 염수 (2 x 80 mL)로 세정하고, 그 다음 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축했다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 233을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 233 (0.59 g, 0.48 mmol)을 메탄올 (2.2 mL) 및 에틸 아세테이트 (2.2 mL)에서 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (10 wt% Pd/C, 습성, 0.07 g)을 부가하고, 반응 혼합물을 수소 대기 하에서 3 시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 농축하여 카복실산을 얻었다. 카복실산 (1.32 g, 1.15 mmol, 클러스터 유리 산)을 DMF (3.2 mL)에서 용해시켰다. 이것에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.3 mL, 1.73 mmol) 및 PFPTFA (0.30 mL, 1.73 mmol)을 부가했다. 실온에서 30 분 교반 후 반응 혼합물을 물 (40 mL)에 붓고 EtOAc (2 x 50 mL)로 추출했다. 표준 워크업은 상기에서 기재된 바와 같이 완료되어 화합물 234를 산출했다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 올리고뉴클레오티드 235는 실시예 46에서 기재된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-24의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-24a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc2-24 (GalNAc2-24a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 105: GalNAc
1
-25 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
화합물 166의 합성은 실시예 54에서 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드 236는 실시예 46에서 기재된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다.
대안적으로, 올리고뉴클레오티드 236은 아래에서 보여진 도식을 사용하여 합성되었고, 및 화합물 238은 사용되어 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오티드 236을 형성했다.
콘주게이트 그룹 GalNAc1-25의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-25a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-25 (GalNAc1-25a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 106: 5’-GalNAc
2
또는 5’-GalNAc
3
콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
안티센스 억제
표 116 및 117에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
치료
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 2, 7, 또는 20 mg/kg의 ISIS 번호 440762; 또는 0.2, 0.6, 2, 6, 또는 20 mg/kg의 ISIS 번호 686221, 686222, 또는 708561; 또는 염수가 피하로 1회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 간 SRB-1 mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 시클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했고, ED50 결과는 표 116 및 117에서 제공된다. 이전의 연구는, 3가 GalNAc-콘주게이트된 올리고뉴클레오티드가 결국 1가 GalNAc 콘주게이트된 올리고뉴클레오티드로부터 유의미하게 더 강했던 2가 GalNAc-콘주게이트된 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여주었지만, (참고, 예를 들면, Khorev et al., Bioorg. & Med. Chem., Vol. 16, 5216-5231 (2008)), 1가, 2가, 및 3가 GalNAc 클러스터를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한처리는 표 116 및 117에서 보여진 바와 같은 유사한 효능으로 SRB-1 mRNA 수준을 감소시켰다.
표 116
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
표 범례에 대한 실시예 93 참조. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 이전에 보여졌고, GalNAc2-24a의 구조는 실시예 104에서 보여졌다.
표 117
SRB
-1을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오티드
표 범례에 대한 실시예 93 참조. GalNAc1-25a의 구조가 실시예 105에 나타나 있다.
간 중 표 116 및 117에서의 올리고뉴클레오티드의 농도는 실시예 75에서 기재된 절차를 사용하여 또한 평가되었다. 아래의 표 117a 및 117b에서 보여진 결과는 μg 올리고뉴클레오티드 / 간 조직의 그램의 단위로 UV에 의해 측정된 바와 같이, 각 처리 그룹에 대한 평균 총 안티센스 올리고뉴클레오티드 조직 수준이다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 GalNAc 콘주게이트 그룹이 없는 올리고뉴클레오티드의 동일한 용량보다 유의미하게 더 높은 수준에서 간에서 축적된다는 것을 보여준다. 더욱이, 그의 각 콘주게이트 그룹 모두 중 1, 2 또는 3 개의 GalNAc 리간드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유사한 수준으로 간에서 축적된다. 이러한 결과는 상기에서 인용된 Khorev 등 문헌 참조의 관점에서 놀랍고 상기 표 116 및 117에서 보여진 활성 데이터와 일치한다.
표 117a
GalNAc
2
또는 GalNAc
3
콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 간 농도
표 117b
GalNAc
1
콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 간 농도
실시예 107: GalNAc
1
-26 또는 GalNAc
1
-27 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
올리고뉴클레오티드 239는 DMF 중 HBTU 및 DIEA를 사용하여 화합물 47 (참고 실시예 15)의 산 64 (참고 실시예 32)에의 커플링을 통해 합성된다. 수득한 아미드 함유 화합물은 포스피틸화되고, 그 다음 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 부가된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-26의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-26a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-26 (GalNAc1-26a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
GalNAc1 콘주게이트 그룹을 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 부가하기 위해, 화합물 47 및 64의 반응으로부터 형성된 아미드는 실시예 7에서 기재된 절차를 사용하여 고형 지지체에 부가된다. 그 다음 올리고뉴클레오티드 합성은 실시예 9에서 기재된 절차를 사용하여 완료되어 올리고뉴클레오티드 240을 형성한다.
콘주게이트 그룹 GalNAc1-27의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-27a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-27 (GalNAc1-27a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 108:
생체내
에서 아포(a)를 표적으로 하는 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 의한
생체내
의 안티센스 억제
아래의 표 118에서 열거된 올리고뉴클레오티드는 마우스에서 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 118
아포(a)를
표적으로 하는 변형된
ASO
“GalNAc3-7a"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
치료
인간 아포(a)를 발현시키는 수컷 형질전환 마우스 각각에게, 올리고뉴클레오티드가 그리고 표 119에서 열거된 투여량으로 또는 PBS가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 혈액은 혈장 중 아포(a) 단백질의 기준선 수준을 측정하기 위해 투여 전 날 및 제 1 용량 다음 1 주에 뽑았다. 추가의 채혈은 대략 8 주 동안 매주 일어날 것이다. 혈장 아포(a) 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 표 119의 결과는 기준선 수준 (% BL)으로 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 아포(a) 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 이 결과는, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 아포(a) 단백질 발현을 감소시킨다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 콘주게이트 그룹을 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드보다 아포(a) 발현에서 더욱 더 강한 감소를 나타내었다.
표 119
아포(a) 혈장 단백질 수준
실시예 109: GalNAc
1
-28 또는 GalNAc
1
-29 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
올리고뉴클레오티드 241은 실시예 71에서 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 합성되어 포스포르아미다이트 중간체를 형성하고, 그 다음 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-28의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-28a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-28 (GalNAc1-28a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
GalNAc1 콘주게이트 그룹을 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 부가하기 위해, 실시예 71에서 기재된 것과 유사한 절차가 사용되어 하이드록실 중간체를 형성하고, 그 다음 이것은 실시예 7에서 기재된 절차를 사용하여 고형 지지체에 부가된다. 그 다음 올리고뉴클레오티드 합성은 실시예 9에서 기재된 절차를 사용하여 완료되어 올리고뉴클레오티드 242을 형성한다.
콘주게이트 그룹 GalNAc1-29의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-29a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-29 (GalNAc1-29a-CM) 의 구조는 하기와 같다:
실시예 110: GalNAc
1
-30 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
GalNAc1-30 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드 246(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)는, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-30의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-30a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, Y는 절단가능 모이어티의 일부이다. 특정 구현예에서, Y는 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오티드 상에 존재한다. "GalNAc1-30a"의 구조가 하기에 나타나 있다:
실시예 111: GalNAc
2
-31 또는 GalNAc
2
-32 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
GalNAc2-31 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드 250(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)는, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-31의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-31a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 절단가능 모이어티의 일부이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오티드 상에 존재한다. "GalNAc2-31a"의 구조가 하기에 나타나 있다:
GalNAc2-32 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성은 아래에서 보여진다.
GalNAc2-32 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드 252(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)는, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-32의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-32a)은 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 절단가능 모이어티의 일부이다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오티드 상에 존재한다. "GalNAc2-32a"의 구조가 하기에 나타나 있다.
실시예 112: GalNAc
1
콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성
SRB-1를 표적으로 하는 표 120 중 올리고뉴클레오티드는 1 개의 GalNAc 리간드를 함유하는 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 효능을 추가 시험하기 위해 GalNAc1 콘주게이트 그룹으로 합성되었다.
표 120
실시예 113: GalNAc 클러스터를 포함하는 칼리크레인 B, 혈장 (플레처(Fletcher) 인자) 1을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드
표 121에서의 올리고뉴클레오티드를 인간 칼리크레인 B, 혈장 (플레쳐(Fletcher) 인자) 1 또는 프리칼리크레인 (PKK)를 표적화하도록 설계하였다.
표 121
실시예
114: 2
'-
MOE
당 변형을 갖는
안티센스
올리고뉴클레오티드로의 HepaRG™
T
세포에서의 인간 PKK 안티센스 억제
안티센스 올리고뉴클레오티드는 PKK 핵산을 표적화하도록 설계되었으며, 시험관내에서 PKK mRNA에 대한 그들의 효과에 대해서 시험하였다. HepaRG™ 세표 (인간 간 전구 세포주로부터 유래된, 최종 분화된 단 세포이고, 1차 인간 간 세포의 많은 특성을 보유함 (Lubberstedt M. et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2011 63: 59-68), 이 스크리닝에 사용되었다.
하기 표에서 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-10-5 MOE 갭머 (gapmer)로서 설계되었다. 상기 갭머는 20 개의 뉴클레오시드 길이이며, 여기서 중심 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드로 구성되어 있고 각각 5개의 뉴클레오시드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에 윙 분절의 측면에 있다. 5' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드 및 3' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체적인 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다. "개시 부위"는, 갭머가 인간 유전자 서열내에서 표적화된 5'-대부분의 뉴클레오시드를 나타낸다. "정지 부위"는 인간 유전자 서열 내에서 갭머가 표적으로 하는 3'-모스트 뉴클레오시드를 나타낸다. 하기 표에 열거된 각각의 갭머는 본원에 개시된 서열 번호: 1과 같이 지정된 인간 PKK mRNA (유전자은행 수탁 번호 NM_000892.3) 또는 서열 번호: 10과 같이 본원에서 지정된 인간 PKK 게놈 서열 (111693001 내지 111730000로부터 절단된 유전자은행 수탁 번호 NT_016354.19)로 표적화된다. 'n/a'는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 특정 유전자 서열을 표적화하지 않는다는 것을 나타낸다.
웰당 20,000 세포의 밀도로 배양된 HepaRG™ 세포를 전기천공을 사용하여 3,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 24 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454 (정방향 서열 CCAAAAAAGGTGCACCAGTAACA, 서열 번호: 20으로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 CCTCCGGGACTGTACTTTAATAGG, 서열 번호: 21로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 CACGCAAACATTTCACAAGGCAGAGTACC, 서열 번호: 22로 본원에서 지정됨)를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다.
표 122
표 123
표 124
표 125
실시예 115: 2'-MOE 당 변형을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 HepaRG™ 세포에서의 인간 PKK 안티센스 억제
추가적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PKK 핵산을 표적화하도록 설계되었으며, 시험관내에서 PKK mRNA에 대한 그들의 효과에 대해서 시험하였다.
하기 표에서 새롭게 설계된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-10-5 MOE 갭머, 4-9-4 MOE 갭머, 4-10-4 MOE 갭머, 4-10-3 MOE 갭머, 3-10-4 MOE 갭머, 또는 3-10-3 MOE 갭머로서 설계되었다. 5-10-5 MOE 갭머는, 길이가 20개 뉴클레오티드이고, 여기서 중심 갭 분절은 10개의 2' 데옥시뉴클레오시드를 포함하며 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향에서 윙 분절에 의해 플랭킹되어 있다. 4-9-4 MOE 갭머는 길이가 17개의 뉴클레오시드이고, 여기서 중앙 갭 분절은 9개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고, 각각 4개의 뉴클레오시드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에서의 윙 분절에 의하여 플랭킹된다. 4-10-4 MOE 갭머는 길이가 18개의 뉴클레오시드이고, 여기서 중앙 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고, 각각 4개의 뉴클레오시드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에서의 윙 분절에 의하여 플랭킹된다. 4-10-3 MOE 갭머는 길이가 17개의 뉴클레오시드이고, 여기서 중앙 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고, 각각 4개 및 3개의 뉴클레오시드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에서의 윙 분절에 의하여 플랭킹된다. 3-10-4 MOE 갭머는, 길이가 17개 뉴클레오티드이고, 여기서 중심 갭 분절은 10개의 2' 데옥시뉴클레오시드를 포함하고 각각 3개 및 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향에서 윙 분절에 의해 플랭킹되어 있다. 3-10-3 MOE 갭머는 길이가 16개의 뉴클레오시드이고, 여기서 중앙 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고, 각각 3개의 뉴클레오시드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에서의 윙 분절에 의하여 플랭킹된다. 5' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드 및 3' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체적인 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다. "개시 부위"는, 갭머가 인간 유전자 서열내에서 표적화된 5'-대부분의 뉴클레오시드를 나타낸다. "정지 부위"는 인간 유전자 서열 내에서 갭머가 표적으로 하는 3'-모스트 뉴클레오시드를 나타낸다. 하기 표에 열거된 각각의 갭머는 본원에 개시된 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 10에 표적화된다.‘n/a'는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 특정 유전자 서열을 표적화하지 않는다는 것을 나타낸다.
웰당 20,000 세포의 밀도로 배양된 HepaRG™ 세포를 전기천공을 사용하여 5,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 24 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다.
표 126
표 127
표 128
표 129
표 130
표 131
표 132
표 133
표 134
표 135
표 136
표 137
표 138
표 139
실시예 116: MOE, 데옥시 및 cEt 당 변형을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 HepaRG™ 세포에서의 인간 PKK 안티센스 억제
추가적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PKK 핵산을 표적화하도록 설계되었으며, 시험관내에서 PKK mRNA에 대한 그들의 효과에 대해서 시험하였다.
하기 표에서 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 데옥시, MOE 및 cEt 갭머 (gapmer)로서 설계되었다. 갭머는 길이가 16개의 뉴클레오시드이며, 여기서 상기 뉴클레오시드는 MOE 당 변형, cEt 당 변형, 또는 데옥시 변형을 갖는다. '화학' 칼럼은 각 올리고뉴클레오티드의 당 변형을 개시한다. 'k'는 cEt 당 변형을 나타내고; 수는 데옥시뉴클레오시드의 수를 나타내고; 달리는, 'd'는 데옥시뉴클레오시드를 나타내고, 'e'는 2'-O-메톡시에틸 변형을 나타낸다. 각각의 갭머 전체적인 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 각각의 올리고뉴클레오티드 전체에서 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다. "개시 부위"는, 갭머가 인간 유전자 서열내에서 표적화된 5'-대부분의 뉴클레오시드를 나타낸다. "정지 부위"는 인간 유전자 서열 내에서 갭머가 표적으로 하는 3'-모스트 뉴클레오시드를 나타낸다. 하기 표에 열거된 각각의 갭머는 본원에 개시된 서열 번호: 1과 같이 지정된 인간 PKK mRNA 또는 서열 번호: 10과 같이 지정된 인간 PKK 게놈 서열에 표적화된다. ‘n/a'는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 특정 유전자 서열을 표적화하지 않는다는 것을 나타낸다.
웰당 20,000 세포의 밀도로 배양된 HepaRG™ 세포를 전기천공을 사용하여 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 24 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 상기 검정에 ISIS 531231 또한 포함되었다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다.
표 140
표 141
표 142
표 143
표 144
표 145
표 146
표 147
표 148
표 149
표 150
표 151
표 152
실시예 117: HepaRG™ 세포에서 인간 PKK의 용량-의존적 안티센스 억제
PKK mRNA의 뚜렷한 시험관내 억제를 나타내는 상기 기술된 연구로부터의 갭머는 HepaRG™ 세포에서의 다양한 용량에서 선택 및 시험되었다. 세포를 웰당 20,000 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 사용하여 0.12 μM, 0.37 μM, 1.11 μM, 3.33 μM, 및 10.00 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 PKK 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다.
각각의 올리고뉴클레오티드의 절반 최대 억제 농도 (IC50)를 하기 표에 또한 제시하였다. PKK mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 뚜렷하게 감소되었다.
표 153
표 154
실시예 118: HepaRG™ 세포에서 인간 PKK의 용량-의존적 안티센스 억제
PKK mRNA의 뚜렷한 시험관내 억제를 나타내는 상기 기술된 연구로부터의 갭머는 HepaRG™ 세포에서의 다양한 용량에서 선택 및 시험되었다. 세포를 웰당 20,000 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 사용하여 0.19 μM, 0.56 μM, 1.67 μM, 및 5.00 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 PKK 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다. n/a’는 특정 용량에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 측정이 없다는 것을 나타낸다.
각각의 올리고뉴클레오티드의 절반 최대 억제 농도 (IC50)를 하기 표에 또한 제시하였다. PKK mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 뚜렷하게 감소되었다.
표 155
표 156
표 157
표 158
표 159
표 160
표 161
표 162
표 163
표 164
실시예 119: HepaRG™ 세포에서 인간 PKK의 용량-의존적 안티센스 억제
PKK mRNA의 뚜렷한 시험관내 억제를 나타내는 상기 기술된 연구로부터의 갭머는 HepaRG™ 세포에서의 다양한 용량에서 선택 및 시험되었다. 세포를 웰당 20,000 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 사용하여 0.11 μM, 0.33 μM, 1.00 μM, 및 3.00 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, PKK mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 인간 PKK 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 각 실험에 대한 결과는 하기 나타난 별개의 표에서 제시된다. 결과는 비처리 대조군 세포에 대비한 PKK의 억제 퍼센트로서 표현된다. n/a’는 특정 용량에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 측정이 없다는 것을 나타낸다.
각각의 올리고뉴클레오티드의 절반 최대 억제 농도 (IC50)를 하기 표에 또한 제시하였다. PKK mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 뚜렷하게 감소되었다.
표 165
표 166
표 167
표 168
실시예 120: 형질전환 마우스에서 인간 PKK를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능
인간 KLKB1 유전자 서열의 37,390개 염기쌍 단편을 함유하는 형질전환 마우스 (염색체 4: 위치 187148672-187179625, 수탁 번호: NC_000004.11)를 상기 기술된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였고, 이는 이러한 모델의 효능에 대해 평가되었다.
치료
형질전환 마우스의 그룹 각각에게 ISIS 546232, ISIS 546251, ISIS 546254, ISIS 546343, ISIS 546828, ISIS 547455, ISIS 547457, ISIS 547927, 및 ISIS 548048를 3 주일 동안, 주당 2 회 피하로 2.5 mg/kg/주, 5.0 mg/kg/주, 10 mg/kg/주, 또는 20 mg/kg/주로 주사하였다. 형질전환 마우스 중 하나의 그룹에 PBS를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 마우스를 마지막 용량 후 48시간에 마취시키고, 추가 분석을 위해 장기 및 혈장을 수확하였다.
RNA 분석
표적 감소에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해서, RNA를 인간 PKK의 실시간 PCR 분석을 위하여 간 조직으로부터 추출하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK mRNA의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 169에 나타낸 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PKK mRNA의 뚜렷한 감소를 초래하였다.
표 169
PBS 대조군과 비교한 형질전환 마우스 간에서의 PKK mRNA 억제 퍼센트
단백질 분석
혈장 PKK 단백질 수준을 모든 그룹에서 평가하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK 단백질의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 170에 나타낸 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PKK 단백질 수준의 뚜렷한 감소를 초래하였다.
표 170
PBS 대조군과 비교한 형질전환 마우스에서의 PKK 단백질 수준 감소율
실시예 121: 시노몰구스 원숭이에서 인간 PKK를 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과
시노몰구스 원숭이를 상기 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 활성 및 내성을 평가하였다. 시험된 인간 안티센스 올리고뉴클레오티드를 붉은털 원숭이 게놈 서열 (서열 번호: 18로서 지정되고, 뉴클레오티드 2358000 내지 2391000로부터 절단된 유전자은행 수탁번호 NW_001118167.1)로 교차-반응시킨다. 서열 번호: 18에 대한 각 올리고뉴클레오티드의 표적 개시 부위는 결과는 표 171에서 제공된다. '미스매치'는 올리고뉴클레오티드가 붉은털 원숭이 서열에 미스매치된 만큼의 뉴클레오티드의 수를 나타낸다. 인간 올리고뉴클레오티드와 붉은털원숭이 서열 사이의 상보성이 크면 클수록, 아마도 인간 올리고뉴클레오티드가 붉은털원숭이 서열과 더 교차-반응할 수 있다. ‘n/a’는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 붉은털 원숭이 유전자 서열과 3개 초과의 미스매치를 갖는다는 것을 나타낸다.
표 171
서열 번호: 18에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드
치료
연구 전에, 원숭이를 30일 기간 동안 격리 상태로 유지시켰으며, 이 기간 중에 동물들은 일반적인 건강에 대해서 매일 관찰하였다. 원숭이들은 2-4세였고 체중은 2 내지 4 kg 사이였다. 4 마리의 무작위로 배정된 수컷 시노몰구스 원숭이의 10개 그룹에게 각각 ISIS 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 피하 주사하였다. 40 mg/kg의 용량으로 PBS 용액 또는 ISIS 올리고뉴클레오티드를, 연구 첫주에 (1, 3, 5, 및 7일째에) 4개 용향으로 구성된 부하 레지멘(loading regimen)으로 최초 투여하였고, 이후 14일째 (2주째 내지 13주째)부터 시작하여 1주일에 1회 투여로 구성된 유지 레지멘(maintenance regimen)을 투여하였다. 피하 투여를 등에 시계 방향으로 4개 부위; 용량당 1부위씩 수행하였다. 주사 부위를 문신으로 기술하였으며, 이때 케타민을 사용하여 진정시켰고, 최소 3cm로 간격을 두었다.
연구 기간 중에, 원숭이는 병 또는 고통의 징후에 대해서 최소 1일 1회 관찰하였다. 처리, 손상 또는 병에 기인하여 일시적이거나 미약한 통증 또는 고통 이상을 경험하는 임의의 동물은 연구 지도자 및 수의사에게 즉시 보고하였다. 건강하지 못하거나 가능한 빈사 상태에 있는 특정 동물은 추가 관찰 및 가능한 안락사를 확인하였다. 예를 들어, ISIS 547445로 처리된 두마리의 원숭이를 둔화된 행동, 측면 위치, 자극 반응 부족, 및 감소된 호흡으로 인하여 마취시켰다. 본 실시예에 기재된 프로토콜은 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다.
표적 감소
RNA 분석
최종 투여 후 87 또는 88, 48 시간째 되는 날에, RNA를 프라이머 프로브 세트 RTS3455를 사용한 PKK의 실시간 PCR 분석을 위하여 간 조직으로부터 추출하였다 (정방향 서열 CCTGTGTGGAGGGTCACTCA, 서열 번호: 23으로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 CCACTATAGATGCGCCAAACATC, 서열 번호: 24로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 CCCACTGCTTTGATGGGCTTCCC, 서열 번호: 25로 본원에서 지정됨). 결과는 하우스키핑 유전자, 시크로필린(Cyclophilin)에 대해 정규화하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK mRNA의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 172에 나타낸 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PKK mRNA의 뚜렷한 감소를 초래하였다.
표 172
PBS 대조군과 비교한 시노몰구스 원숭이 간에서의 PKK mRNA 억제 퍼센트
단백질 분석
약 0.9 mL의 혈액을 모든 수득가능한 동물로부터 각각 예비-투여, 17일째, 31일째, 45일째, 59일째, 및 73일째에 수집하였고, 3.2% 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브에 위치시켰다. 튜브를 원심분리 (실온에서 10 분 동안 3000 rpm)하여 혈장을 수득하였다. PKK 단백질 수준은 ELISA에 의해 혈장에서 측정되었다. 결과는 PBS 대조군 수준과 비교한 억제 퍼센트로 표현되어 표 173에 제시된다. 결과는 ISIS 올리고뉴클레오티드가 PKK 단백질 수준을 상당히 감소시켰음을 나타낸다.
표 173
대조군 수준과 비교한 시노몰구스 원숭이 혈장 내에서의 PKK 단백질 수준 감소율 (%)
내성 연구
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해서, 원숭이를 하룻밤 단식시켰다. 약 1.5 mL의 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 혈액을 혈청 분리를 위해 항응고제없이 튜브 속에 수집하였다. 튜브를 최소 90분간 실온에서 두었고, 이후 10분 동안 3,000rpm에서 원심분리하였다. 다양한 간 기능 마커의 수준은 Toshiba 120FR NEO 화학 분석기 (Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 결과는 표 174에 제시되며, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 예상된 범위를 벗어나는 범위에서 간 기능에 대한 효과가 없다는 것을 나타낸다.
표 174
시노몰구스 원숭이 혈장에서의 간 기능 마커
혈액학
혈액학적 파라미터에 대한 시노몰구스 원숭이 내의 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해서, 혈액의 약 1.2 mL의 혈액 샘플을 예비-투여량 및 87일째 또는 88일째에 K2-EDTA를 함유하는 튜브 내에 수득가능한 연구 동물 각각으로부터 수집하였다. 샘플은 ADVIA2120i 혈액학 분석기 (SIEMENS, USA)를 사용하여 적혈구 (RBC) 수, 백혈구 (WBC) 수, 혈소판 수, 헤모글로빈 함량 및 헤마토크리트(hematocrit) (%)에 대해 분석하였다. 데이터는 표 175에 제시된다.
이러한 데이터는 나머지 올리고뉴클레오티드들에 의한 처리가 이러한 투여에서 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 예상된 범위를 벗어나는 혈액학적 파라미터 상의 임의의 변화를 야기하지 않았다는 것을 나타낸다.
표 175
시노몰구스 원숭이에서의 혈액학적 파라미터
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해서, 원숭이를 하룻밤 단식시켰다. 약 1.5 mL의 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 혈액을 혈청 분리를 위해 항응고제없이 튜브 속에 수집하였다. 튜브를 최소 90분간 실온에서 두었고, 이후 10분 동안 3,000rpm에서 원심분리하였다. BUN 및 크레아티닌 마커의 수준은 Toshiba 120FR NEO 화학 분석기 (Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 결과는 ㎎/dL로 표현하여 표 176에 제시된다. 혈장 화학은, 대부분의 ISIS 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 예측된 범위를 벗어나는 신장 기능에 임의의 영향도 미치지 않았음을 나타낸다. 특히, ISIS 546254로의 처리는 원숭이의 신장 기능 관점에서 높은 내성을 가졌다.
신장 기능을 또한 요분석에 의해 평가하였다. 모든 동물로부터의 신선한 소변을 습식 얼음 상에서 깨끗한 케이지 팬(clean cage)을 사용하여 수집하였다. 신선한 소변 수집 하루 전에 밤새 먹이를 제거하였으나, 물은 공급하였다. 총 단백질 및 크레아티닌의 수준은 Toshiba 120FR NEO 화학 분석기 (Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였고, 단백질 대 크레아티닌 비율을 산출하였다. 결과는 표 177에 제시된다.
표 176
시노몰구스 원숭이에서 혈장 BUN 및 크레아티닌 수준 (㎎/dL)
표 177
시노몰구스 원숭이에서의 소변 단백질/크레아티닌 비율
C-반응성 단백질 수준 분석
시노몰구스 원숭이에서 ISIS 올리고뉴클레오티드들의 임의의 염증성 효과를 평가하기 위해서, 원숭이를 하룻밤 단식시켰다. 약 1.5 mL의 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 혈액을 혈청 분리를 위해 항응고제없이 튜브 속에 수집하였다. 튜브를 최소 90분간 실온에서 두었고, 이후 10분 동안 3,000rpm에서 원심분리하였다. 간에서 합성되고 염증 마커로서 역할을 하는 C-반응성 단백질 (CRP)을 Toshiba 120FR NEO 화학 분석기 (Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 보체 C3를 또한 유사하게 측정하였고, 데이터는 기준선 값의 백분율로 제시된다. 결과는 표 178에 제시되며, ISIS 올리고뉴클레오티드로의 치료가 원숭이에서 특정 염증도 야기하지 않았다는 것을 나타낸다.
표 178
시노몰구스 원숭이 혈장에서의 C-반응성 단백질 및 C3 수준
실시예
122: 마우스 일차 간세포 중
뮤린
PKK
mRNA의
안티센스
억제
뮤린 PKK 핵산을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하였으며, 시험관내에서 PKK mRNA에 대한 그들의 효과에 대해서 시험하였다. 웰당 10,000 세포의 밀도로 배양된 마우스 1차 간세포를 시토펙틴(Cytofectin) 시약을 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드의 12.5 nM, 25.0 nM, 50.0 nM, 100.0 nM, 및 200.0 nM로 형질감염시켰다. 대략 24 시간의 처리 기간 후에, RNA를 세포로부터 분리시키고, 마우스 PKK mRNA 수준을 뮤린 프라이머 프로브 세트 RTS3313 (정방향 서열 TGCCTGCTGTTCAGCTTTCTC, 서열 번호: 2228로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 TGGCAAAGTCCCTGTAATGCT, 서열 번호: 2229로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 CGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACG, 서열 번호: 2230으로 본원에서 지정됨)을 사용한 정량적 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. PKK mRNA 수준은 리보그린(RIBOGREEN)에 의해서 측정되는 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조정되었다.
키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-10-5 MOE 갭머 (gapmer)로서 설계되었다. 갭머들은 길이가 20개의 뉴클레오티드이고, 여기에서 중앙 갭 분절은 10 개의 2'-데옥시뉴클레오시드로 이루어지며, 각각 5 개의 뉴클레오시드를 포함하는, 양 측면 (5' 및 3' 방향으로) 상의 윙 분절에 의하여 플랭킹된다. 5' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드 및 3' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체적인 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다. 결과는 PKK mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 뚜렷하게 감소되었다는 것을 나타낸다.
일 특정 예시에서, ISIS 482584 (GGCATATTGGTTTTTGGAAT; 서열 번호: 2244)가 용량 의존적 방식으로 PKK mRNA를 감소시켜 84 nM의 절반 최대 억제 농도 (IC50)를 산출하였다 (표 179 참고). ISIS 482584 (서열 번호: 11에 표적화되며 (유전자은행 수탁 번호 NM_008455.2), 1586의 표적 개시 부위 및 1605의 표적 정지 부위를 갖는다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 5'-모스트 뉴클레오티드를 나타낸다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 3'-모스트 뉴클레오티드를 나타낸다.
표 179
ISIS 482584에 의한 마우스 PKK mRNA 수준의 용량-의존적 억제
실시예
123:
BALB
/c 마우스에서의
PKK
mRNA의
안티센스
억제
ISIS 482584를 생체내 뮤린 PKK mRNA 상의 효과에 대해 시험하였다.
치료
6개 그룹의 수컷 BALB/c 마우스를 각각 ISIS 482584 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10.0 mg/kg, 20.0 mg/kg, 40.0 mg/kg, 또는 80.0 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 5.0 mg/kg, 10.0 mg/kg, 20.0 mg/kg, 40.0 mg/kg, 80.0 mg/kg, 또는 160.0 mg/kg). BALB/c 마우스의 대조군을 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS의 최종 투여 후 2일째에, 모든 그룹의 마우스에 10 mg/kg 자일라진과 혼합된 150mg/kg의 케타민으로 복강내 주사로 투여하여 마취시켰다. 간을 RNA 분석을 위하여 수집하였다.
RNA 분석
RNA를 인간 PKK의 실시간 PCR 분석을 위하여 간 조직으로부터 추출하였다. PKK mRNA 수준을 뮤린 프라이머 프로브 세트 (정방향 서열 ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC, 서열 번호: 2231로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT, 서열 번호: 2232로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC, 서열 번호: 2233으로 본원에서 지정됨)를 사용하여 측정하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 180에 나타낸 바와 같이, ISIS 482584로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PKK mRNA의 뚜렷한 용량-의존적 감소를 초래하였다.
표 180
BALB/c 마우스 간에서의 PKK mRNA의 용량-의존적 감소
단백질 분석
혈장을 항응고제로서 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브 내에서 수집하였다. 샘플을 4-12% 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen) 상에서 수행하고, 이후 뮤린 PKK 항체 (R&D Systems)로 면역블롯팅하였다. 블롯(Blot)을 2차 형광단(fluorophore)-표지된 항체 (LI-COR)로 인큐베이션하였고, 오디세이 이미지화기(Odyssey Imager) (LI-COR)에서 이미지화하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 181에 나타낸 바와 같이, ISIS 482584로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PKK 혈장 단백질의 뚜렷한 용량-의존적 감소를 초래하였다.
표 181
BALB/c 마우스 혈장에서의 PKK 단백질의 용량-의존적 감소
n.d. 데이터 없음
실시예
124: 혈관부종 마우스 모델에서의
뮤린
PKK
안티센스
억제의
생체내
효과
유전성 혈관부종 (HAE)은 피하 조직에서의 국지적 종창 및 혈관투과성 증가에 의하여 특징화된다 (Morgan, B.P. N. Engl. J. Med. 363: 581-83, 2010). 363: 581-83, 2010). 이는 C1 억제제, 보체계의 단백질 결핍에 의하여 야기된다. 2개의 마우스 모델이 본 연구에 사용되었으며, 이는 C1-INH 결핍의 확립된 마우스 모델, 캅토프릴-유도된 부종 모델을 포함하며, 이의 양자 모두는 혈관 투과성, 즉 HAE 특징을 야기한다. 혈관 투과성의 역전은 고농도 중량 키니노겐 (HMWK)의 증가된 혈장 수준을 수반한다.
제1 모델에서, 혈관부종은 알려진 항고혈압성 제제인 캅토프릴로의 처리에 의하여 유도되고, 이는 마우스에서 혈관 투과성을 증가시키고, 유전성 혈관부종의 병리학을 복제한다.
제2 모델에서, 혈관부종은 ISIS 461756, 뮤린 C1 억제제 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리로 유도되고, 이는 마우스에서 혈관 투과성을 증가시키고, 유전성 혈관부종의 병리학을 복제한다. ISIS 461756 (서열 번호: 2245; AAAGTGGTTGATACCCTGGG)는 NM_009776.3의 뉴클레오시드 1730-1749를 표적화하는 5-10-5 MOE 갭머이다 (서열 번호: 2243).
HOE-140 및 ISIS 482584, PKK 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제의 효과를 혈관 투과성의 캅토프릴 및 ISIS 461756-유도된 마우스 모델에서 평가하였다. 뮤린 그룹 일부를 HOE-140, 브라디키닌 B2 수용체의 선택적 길항제로 처리하였고, 이는 혈관확장 및 혈관 투과성을 차단한다 (Cruden and Newby, Expert Opin. Pharmacol. 9: 2383-90, 2008). 다른 마우스를 ISIS 482584로 처리하였고, 이는 PKK mRNA 발현을 억제한다. HOE-140로의 처리 효과를 ISIS 482584로의 처리 효과와 비교하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 182에 제시된다.
4마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대해 PBS 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 3을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 14일째에, 마우스를 C1 억제제, ISIS 461756를 표적화하는 50 mg/kg의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 2주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 3은 캅토프릴 및 ISIS 461756-유도된 혈관 투과성에 대해 PBS 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 4을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 14일째에, 마우스를 C1 억제제, ISIS 461756를 표적화하는 50 mg/kg의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 2주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 이후, 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 4는 HOE-140로의 혈관 투과성 억제에 대해 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 5를 40 mg/kg의 대조군 올리고뉴클레오티드 ISIS 141923, 알려지지 않은 뮤린 표적을 갖는 5-10-5 MOE 갭머, (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC; 서열 번호: 2246)로 피하로 4주간 일주일에 2회 투여하였다. 14일째에, 마우스를 C1 억제제, ISIS 461756를 표적화하는 50 mg/kg의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 2주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 5는 캅토프릴 및 ISIS 461756-유도된 혈관 투과성에 대해 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 6을 40 mg/kg의 ISIS 482584로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 6은 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 PKK ASO 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
8마리의 C57BL/6J-Tyrc-2J 마우스로 구성된 그룹 7을 40 mg/kg의 ISIS 482584로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 14일째에, 마우스를 C1 억제제, ISIS 461756를 표적화하는 50 mg/kg의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 2주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 7는 캅토프릴 및 ISIS 461756-유도된 혈관 투과성에 대한 PKK ASO 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다. 혈액 샘플을 심장 천자(cardiac puncture)를 통하여 채취하였다.
표 182
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 귀, 및 장으로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 183에 제시된다. 혈관부종의 임의의 발현을 보여주는 마우스는 더욱 많은 염료를 흡수하고, 그러므로 높은 OD 값을 나타낸다.
표 183에 제시된 바와 같이, ISIS 482584로의 처리는 각각의 PBS 대조군 (그룹 2 및 3)과 비교하여 캅토프릴로 처리된 마우스 (그룹 6) 및 캅토프릴 및 ISIS 461756로 처리된 마우스 (그룹 7)에서의 혈관 투과성을 예방한다. 그룹 6 및 7의 마우스에서의 혈관 투과성의 측정은 또한, 대조군 올리고뉴클레오티드, ISIS 141923로 처리된 마우스 (그룹 5)와 비교하여, 대부분의 조직에서 감소되었으며, 여기서 혈관 투과성은 캅토프릴 및 ISIS 461756로 유도되었다. 두개의 처리 그룹 (그룹 6 및 7)의 결장 및 족부 조직에서의 혈관 투과성 측정은 PBS 단독으로 처리된 마우스 (그룹 1)에서 측정된 바와 같은 기초 수준과 비교가능하였다. ISIS 482584로 처리된 마우스에서의 혈관 투과성 감소는 본 검정에서 양성 대조군으로 작용한 브라디키닌 2 수용체 길항제, HOE140로 처리된 마우스에서 보여지는 그것과 비교가능하였다.
따라서, PKK mRNA의 안티센스 억제는 HAE의 증상인 혈관 투과성의 치료 및 예방에 이로울 수 있다.
표 183
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
고농도
키니노겐
(
HMWK
)의 정량화
혈액 샘플로부터의 HMWK 웨스턴 블랏 정량화는 도 1에 제시된다.
도 1에 보여지는 바와 같이, 그룹 1 및 2로부터의 샘플은, 그룹 6 및 7과 비교하여 낮은 수준의 HMWK를 가지며, 이는 혈관 투과성이 그룹 6 및 7에서 역전된다는 것을 나타낸다. 도 1에 보여지는 바와 같이, 그룹 1 및 2로부터의 샘플은, 그룹 6 및 7과 비교하여 증가된 HMWK 절단 생성물을 갖는다. 따라서, HMWK의 부족은 HMWK에서 절단 생성물로의 PKK 절단에 의하여 야기된다 (브라디키닌 및 HKa 포함).
실시예 125: 마우스에서의 기초 투과성 및 캅토프릴-유도된 투과성 상에서의 뮤린 PKK의 안티센스 억제의
생체내
효과
기초 투과성은 천연, 비처리 마우스의 조직 내에서 발생하는 혈관 투과성의 수준이다. 혈관 투과성의 예방에서의, 기초의 또는 캅토프릴-유도된, ISIS 482584의 효과를 평가하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 184에 제시된다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대해 PBS 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 3을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 기간 종료 시에, 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 3은 기초 혈관 투과성의 억제에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 4을 PBS로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 4는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성의 억제에 대해 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 5를 40 mg/kg의 ISIS 482584로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 그룹 5는 기초 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 6를 40 mg/kg의 ISIS 482584로 4주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 6은 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다.
표 184
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 귀, 및 장으로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 185에 제시된다. 혈관부종의 임의의 발현을 보여주는 마우스는 더욱 많은 염료를 흡수하고, 그러므로 높은 OD 값을 나타낸다.
표 185에 제시된 바와 같이, ISIS 482584로 처리된 마우스는 PBS 대조군과 비교하여 감소된 기초 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 5 대 그룹 1). ISIS 482584로의 처리에 의한 기초 혈관 투과성 감소는 HOE-140로의 처리에 의하여 야기된 것 (양성 대조군으로서 역할을 한 그룹 3)과 비교가능하였다. ISIS 482584로 처리된 마우스는 PBS 대조군과 비교하여 대부분 조직에서 감소된 캅토프릴-유도된 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 6 대 그룹 2). ISIS 482584로의 처리에 의한 캅토프릴-유도된 혈관 투과성 감소는 HOE-140로의 처리에 의하여 야기된 것 (양성 대조군으로서 역할을 한 그룹 4)과 비교가능하였다.
표 185
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
실시예 126: 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 뮤린 PKK의 안티센스 억제의 용량-의존적 효과
캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 다양한 용량의 효과를 평가하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 186에 제시된다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 대조군으로서 역할을 하였다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 3을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 또한, 마우스에 이카티벤트(HOE-140) 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 4는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성의 억제에 대해 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
그룹 4, 5, 6, 7, 8, 및 9는 8마리의 마우스로 구성되었고, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg로 (주당 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg, 또는 160 mg/kg에 상응하여)처리하였고, 각각 ISIS 482584로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 기간 종료 시에, 모든 그룹의 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 4-9는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다. 혈액 샘플을 심장 천자(cardiac puncture)를 통하여 채취하였다.
표 186
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 55℃까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 187에 제시된다. 혈관부종의 임의의 발현을 보여주는 마우스는 더욱 많은 염료를 흡수하고, 그러므로 높은 OD 값을 나타낸다.
표 187에 제시된 바와 같이, 더 높은 농도의 ISIS 482584로 처리된 마우스(그룹 4, 5, 및 6)는 PBS 대조군 (그룹 2)과 비교하여 감소된 수준의 캅토프릴-유도된 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 2). 이러한 처리 그룹 (그룹 4 및 5)의 마우스 내 혈관 투과성 감소는 HOE-140로 처리된 마우스 (그룹 3) 내 뿐만 아니라 기초 혈관 투과성의 기초 수준과 (그룹 1에서 나타난 바와 같이) 비교가능하였다.
표 187
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
혈관 유출의 정량화
심장 천자를 통해 견인된 혈액을 얼음처럼 차가운 에탄올의 용적에 3배로 즉시 혼합하였다. 용액을 20분 동안 15,000g, 40C에서 원심분리시켜서 세포 파편 및 침전된 혈장 단백질을 제거하였다. 에탄올 추출물을 추가로 10 kDa MWCO 필터를 통하여 한외여과기로 정제하였다. 에탄올 추출된 혈장 용액의 색 강도를 이후 OD620nm에서 측정하였다. 표 188에서 제공된 결과는 그룹 1 PBS 대조군의 OD 값의 증가율 또는 감소율로서 제시된다. 혈관부종의 발현을 보여주는 마우스로부터의 조직은 혈장으로부터 더욱 많은 염료를 흡수할 것이고, 그러므로 높은 OD 값을 나타낼 것이며, 반면 처리 그룹은 감소된 혈관 유출로 인하여 더 높은 OD 값을 보여줄 것으로 기대된다. ISIS 482584를 160 mg/kg/주 및 80 mg/kg/주로 처리한 마우스 (그룹 4 및 5)는 캅토프릴로 처리한 PBS 음성 대조군 (그룹 2)와 비교하여 더 적은 혈관 유출을 나타냈다. 그룹 4 및 5로부터의 결과는 HOE-140로 처리한 양성 대조군 (그룹 3)과 비교가능하였다.
표 188
혈관 유출을 측정하기 위한 PBS 기초 대조군과 비교한 에반스 블루 염료의 OD620nm의 백분율
실시예 127: 마우스 내 기초 투과성에 대한 뮤린 PKK의 안티센스 억제의 용량-의존적 효과
기초 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 다양한 용량의 효과를 평가하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 189에 제시된다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 기간 종료 시에, 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2은 기초 혈관 투과성의 억제에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
그룹 3, 4, 5, 6, 7, 및 8는 8마리의 마우스로 구성되었고, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg로 (주당 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg, 또는 160 mg/kg에 상응하여)처리하였고, 각각 ISIS 482584로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 그룹 4-9는 기저 혈관 투과성에 대한 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였고 투과성 결함에 대하여 관찰하였다. 혈액 샘플을 심장 천자(cardiac puncture)를 통하여 채취하였다.
표 189
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 귀, 및 장으로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 190에 제시된다. 더 높은 OD 값은 투과성의 더 높은 수준과 연관된다.
표 190에 제시된 바와 같이, 모든 용량에서의 ISIS 482584로 처리된 마우스의 대부분의 조직 (그룹 3-8)은 PBS 대조군과 비교하여 감소된 기초 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 1). ISIS 올리고뉴클레오티드-처리된 그룹의 기초 혈관 투과성 감소는 HOE-140로 처리된 양성 대조군 내 나타난 동등한 것과 비교가능하였다 (그룹 2).
표 190
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
혈관 유출의 정량화
심장 천자를 통해 견인된 혈액을 얼음처럼 차가운 에탄올의 용적에 3배로 즉시 혼합하였다. 용액을 20분 동안 15,000g, 40C에서 원심분리시켜서 세포 파편 및 침전된 혈장 단백질을 제거하였다. 에탄올 추출물을 추가로 10 kDa MWCO 필터를 통하여 한외여과기로 정제하였다. 에탄올 추출된 혈장 용액의 색 강도를 이후 OD620nm ·에서 측정하였다. 표 191에서 제공된 결과는 그룹 1 PBS 대조군의 OD 값의 증가율 또는 감소율로서 제시된다. 처리 그룹은 감소된 혈관 유출로 인하여 더 높은 OD 값을 보여줄 것으로 기대된다. ISIS 올리고뉴클레오티드-처리된 그룹 내의 모든 마우스는 PBS 음성 대조군과 비교하여 뚜렷하게 감소된 혈관 유출을 나타냈다.
표 191
혈관 유출을 측정하기 위한 PBS 기초 대조군과 비교한 에반스 블루 염료의 OD620nm의 백분율
고농도
키니노겐
(
HMWK
)의 정량화
혈액 샘플로부터의 HMWK 웨스턴 블랏 정량화는 도 2 및 표 192 및 193에 제시된다.
표 192에 나타난 바와 같이, 482584로 처리된 그룹은 용량-의존 방식에서 PBS 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 HMWK를 갖는다. PKK 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 HMWK의 안정화를 초래한다. 따라서, 혈관 투과성은 용량-의존 방식에서 ISIS 482584-처리된 그룹 내에서 감소한다. 표 193에 나타난 바와 같이, ISIS 482584로 처리된 그룹은 용량-의존 방식에서 감소하는, PBS 대조군과 비교하여 더 적은 HMWK 절단 생성물을 갖는다. 따라서, 감소된 HMWK는 HMWK에서 절단 생성물로의 PKK 절단에 의하여 야기된다 (브라디키닌 및 HKa 포함). 데이터는 덴시토미터(densitometer)에 의해 측정된 강도 단위로 제시된다.
표 192
덴시토미터에 의한 HMWK의 정량화
표 193
덴시토미터에 의한 HMWK 절단의 정량화
실시예 128: 마우스내 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 PKK 및 인자 12를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합 요법
마우스에 인자 12를 표적화하는 5-10-5 MOE 갭머, ISIS 410944 (GCATGGGACAGAGATGGTGC; 서열 번호: 2247), 및 캅토프릴-유도된 혈관 투과성 모델 내의 ISIS 482584를 다양한 용량으로 처리하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 194에 제시된다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 대조군으로서 역할을 하였다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 3을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 3는 캅토프릴-유도된 혈관 투과성의 억제에 대해 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
그룹 4, 5, 6, 7, 및 8은 8마리의 마우스로 구성되었고, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg으로 (주당 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg에 상응하여)처리하였고, 각각 ISIS 482584 및 ISIS 410944으로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 종료 시에, 모든 그룹의 마우스에 캅토프릴 20 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 4-8은 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 ISIS 410944 및 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다.
표 194
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 귀, 및 장으로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 195에 제시된다. 더 높은 OD 값은 투과성의 더 높은 수준과 연관된다.
표 195에 제시된 바와 같이, 모든 용량에서의 ISIS 482584 및 ISIS 410944 의 조합으로 처리된 마우스의 대부분의 조직 (그룹 3-8)은 PBS 대조군과 비교하여 감소된 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 1). ISIS 올리고뉴클레오티드-처리된 그룹의 혈관 투과성 감소는 기초 PBS 대조군 (그룹 1), 뿐만 아니라 HOE-140로 처리된 양성 대조군 내 나타난 동등한 것과 비교가능하였다 (그룹 2). PKK 및 인자 12 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합은 투과성의 상승작용적 감소를 초래한다. 예상한 바와 같이, 혈관 유출의 상응하는 상승작용적 감소 또한 관찰되었다.
표 195
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
실시예 129: 마우스내 기초 투과성에 대한 PKK 및 인자 12를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합 요법
기초 혈관 투과성 모델에서 마우스에 ISIS 410944, 인자 12 및 ISIS 482584를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 다양한 용량으로 처리하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 196에 제시된다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 혈관 투과성의 기초 수준을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
4마리의 마우스로 구성된 그룹 2을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 처리 기간 종료 시에, 마우스에 HOE-140 30 μg을 복강내 투여하였다. 그룹 2은 기초 혈관 투과성의 억제에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
그룹 3, 4, 5, 6, 및 7은 8마리의 마우스로 구성되었고, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg으로 (주당 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg에 상응하여)처리하였고, 각각 ISIS 482584 및 ISIS 410944으로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 그룹 3-7은 캅토프릴-유도된 혈관 투과성에 대한 ISIS 410944 및 ISIS 482584의 효과를 관찰하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다.
표 196
처치 그룹
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 장, 및 귀로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 귀 및 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였고, 이는 표 197에 제시된다. 더 높은 OD 값은 투과성의 더 높은 수준과 연관된다.
표 197에 제시된 바와 같이, 모든 용량에서의 ISIS 482584 및 ISIS 410944의 조합으로 처리된 마우스의 대부분의 조직 (그룹 2-7)은 PBS 대조군과 비교하여 감소된 혈관 투과성을 나타냈다 (그룹 1). ISIS 올리고뉴클레오티드-처리된 그룹의 혈관 투과성 감소는 HOE-140로 처리된 양성 대조군 내 나타난 동등한 것과 비교가능하였다 (그룹 2). PKK 및 인자 12 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합은 투과성의 상승작용적 감소를 초래한다. 예상한 바와 같이, 혈관 유출의 상응하는 상승작용적 감소 또한 관찰되었다.
표 197
혈관 투과성을 측정하는 에반스 블루 염료의 OD600nm
실시예 130: ISIS 482584에 의한 인자 12 단백질 활성의 억제
인자 12 단백질 활성에 대한 PKK mRNA의 안티센스 억제 효과를 평가하였다.
치료
이러한 검정에 대한 다양한 처리 그룹은 표 198에 제시된다.
8마리의 마우스로 구성된 그룹 1을 PBS로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 인자 12 활성을 측정하기 위한 대조군 그룹의 역할을 하는 그룹 1에는 다른 처리는 투여하지 않았다.
그룹 2, 3, 4, 5, 및 6은 8마리의 마우스로 구성되었고, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg으로 (주당 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg에 상응하여)처리하였고, ISIS 482584를 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 그룹 2-6은 인자 12 활성에 대한 ISIS 482584의 효과를 측정하기 위한 실험적 처리 그룹으로서 작용하였다.
처리 기간 종료 시에, 혈장 내 인자 12에 대한 스펙트로자임(Spectrozyme)® 인자 12a 기반 아미돌리틱(amidolytic) 검정을 위하여 마우스로부터 혈장을 수집하였다.
표 198
처치 그룹
혈장 내 인자 12 활성에 대한 검정
혈장 (5 μL)을 96 웰 폴리프로펠렌 마이크로플레이트 내에 1ug/ml 덱스트란 황산 (500kDa)을 갖는 85 μL의 PBS에 부가하였고, 용액을 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 스펙트로자임(Spectrozyme)® FXIIa (10 μL의 2 mM 용액) 및 0.2 mM KALLISTOP™ 용액을 부가하였고, 흡광 역학은 405nm에서 측정되었다. 인자 12 활성은 흡광 누적의 선형 단계에서 측정되었다. 결과는 PBS 대조군 샘플내 측정된 인자 12 활성의 백분율로 표 199에 제시된다. 표 199에 관찰된 바와 같이, ISIS 482584에 의한 PKK의 억제는 그의 기질에 의하여 인자 12의 감소된 활성을 초래하며, 이는 PKK가 적절한 인자 12 활성을 위하여 요구된다는 것을 나타낸다.
표 199
PBS 대조군과 비교한 인자 12 활성 백분율
실시예
131: C1-
INH
안티센스
올리고뉴클레오티드-유도된 혈관 투과성에 대한 뮤린 PKK 안티센스 억제의
생체내
효과
혈관 투과성은 ISIS 461756, 뮤린 C1 억제제 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리로 유도되고, 이는 마우스에서 혈관 투과성을 증가시키고, 유전성 혈관부종의 병리학을 복제한다. 본 모델에서의 ISIS 482584의 다양한 용량의 효과를 평가하였다.
치료
8마리의 마우스로 구성된 하나의 그룹에 40 mg/kg의 ISIS 482584로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다 (주간 용량: 80 mg/kg). 8마리의 마우스로 구성된 제2 그룹에 40 mg/kg의 대조군 올리고뉴클레오티드, ISIS 141923로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다 (주간 용량: 80 mg/kg). 8마리의 마우스로 구성된 제3 그룹에 PBS를 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 14일째에, 모든 그룹에 12.5 mg/kg의 ISIS 461756로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다 (주간 용량: 25 mg/kg). 마우스의 대조군에 PBS를 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였으나, ISIS 461756는 투여하지 않았다.
처리 기간 종료 시에, 모든 그룹에 이후 30 mg/kg의 에반스 블루(Evans Blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 에반스 블루 용액 투여 이후 30분째에 희생시키고, 결장, 족부, 귀, 및 장을 수확하였다. 간을 또한 RNA 분석을 위하여 수집하였다.
RNA 분석
RNA를 C1-INH 및 PKK mRNA의 실시간 RT-PCR 분석를 위하여 간으로부터 단리하였다. C1-INH에 대한 프라이머 프로브 세트는 RTS3218 (정방향 서열 GAGTCCCCCAGAGCCTACAGT, 서열 번호: 2234로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 TGTCATTTGTTATTGTGATGGCTACA, 서열 번호: 2235로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 CTGCCCTCTACCTGGCCAACAACCA, 서열 번호: 2236으로 본원에서 지정됨)이다. PKK에 대한 프라이머 프로브 세트는 RTS3287 (정방향 서열 ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC, 서열 번호: 2237로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT, 서열 번호: 2238로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC, 서열 번호: 2239로 로 본원에서 지정됨)이다. 결과는 ISIS 461756로 처리되지 않은 PBS 대조군과 비교한 억제 퍼센트로 표현되어 표 200에 제시된다. 데이터는 ISIS 461756가 C1-INH mRNA 발현을 뚜렷하게 감소시키고, ISIS 482584로의 처리가 PKK 발현을 뚜렷하게 감소시켰음을 나타내었다.
표 200
비처리된 PBS 대조군과 비교하여 ISIS 461756로 처리된 마우스 내 mRNA 발현의 억제 퍼센트
혈관 투과성의 정량화
족부, 결장, 및 장으로부터 수확된 조직은 포름아미드 용액에 분리하여 밤새 두어 에반스 블루 염료로 침출하였다. 족부 조직을 함유하는 포름아미드를 550C까지 가열하고 밤새 두었다. 염료-주입된 포름아미드 용액의 색 강도를 이후 OD600nm에서 측정하였다. 데이터는 ISIS 461756로 처리되지 않은 PBS 대조군과 비교한, 증가율 또는 감소율로서 표 201에 제시된다. 데이터는 ISIS 482584로의 처리가 ISIS 461756에 의하여 유도된 혈관 투과성을 예방한다는 것을 나타낸다.
표 201
비처리된 PBS 대조군과 비교한 ISIS 461756로 처리한 마우스 내 혈관 투과성의 % 변화
실시예 132: FeCl
3
-유도된 하대정맥 혈전증 모델에서의 뮤린 PKK 안티센스 억제의
생체내
효과
PKK의 뚜렷한 시험관내 및 생체내 억제를 나타내었던 ISIS 482584를 FeCl3-유도된 장간막 혈전증 마우스 모델에서 평가하였다.
치료
3개 그룹의 8마리 수컷 BALB/c 마우스를 각각 ISIS 482584 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg). 12마리의 BALB/c 마우스의 2개 대조군을 각각 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS의 최종 투여 후 2일째에, 모든 그룹의 마우스에 10 mg/kg 자일라진과 혼합된 150mg/kg의 케타민으로 복강내 주사로 투여하여 마취시켰다. 제1 대조군 그룹을 제외하고, 마취된 마우스의 모든 그룹에서 혈전 형성은 FeCl3로 유도되었다.
FeCl3 처리를 경험하는 마우스에서, 혈전 형성은 대정맥 상에 직접적으로10 % FeCl3 용액으로 예비-포화된 여과지 (2 x 4 mm)를 인가함으로써 유도된다. 노출 후 3분째에, 여과지를 제거하였다. 여과지 인가 후 30분째에, 고정 길이의 혈전을 함유하는 혈관을 혈소판 분석을 위하여 해부하였다. 간을 RNA 분석을 위하여 수집하였다.
혈소판 구성성분의 정량화
혈소판 인자-4 (PF-4)의 실시간 PCR 정량화를 혈전 형성의 척도로서 대정맥내 혈소판을 정량화하는데 사용하였다. PF-4 mRNA 수준을 뮤린 프라이머 프로브 세트 mPF4_LTS_00086 (정방향 서열 AGACCCATTTCCTCAAGGTAGAACT, 서열 번호: 2240으로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 CGCAGCGACGCTCATG, 서열 번호: 2241로 본원에서 지정됨; 프로브 서열 TCTTTGGGTCCAGTGGCACCCTCTT, 서열 번호: 2242로 본원에서 지정됨)을 사용하여 측정하였다. 결과는 2개의 PBS-처리된 대조군과 비교한 ISIS 올리고뉴클레오티드-처리된 마우스내 PF-4 백분율로서 제시된다. 표 202에서 나타난 바와 같이, ISIS 482584로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 PF-4의 뚜렷한 감소를 초래하였다. 따라서, 본 발명에서 제공된 화합물에 의한 PKK 감소는 혈전 형성을 억제하는데 유용하다.
표 202
FeCl3 유도된 정맥 혈전증 모델에서의 PF-4의 실시간 PCR 정량화에 의한 혈전 형성 분석
실시예
133: 꼬리 채혈 검정에서의
뮤린
PKK
안티센스
억제의
생체내
효과
꼬리-채혈을, ISIS 482584로의 처리가 마우스내 초과 출혈(bleeding) 또는 출혈(hemorrhage)을 야기하는지 관찰하기 위하여 측정하였다.
치료
10마리 수컷 BALB/c 마우스를 각각 ISIS 482584 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg). 8마리 BALB/c 마우스의 대조군을 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다.
꼬리-채혈 검정
ISIS 올리고뉴클레오티드 또는 PBS로의 최종 처리 후 2일째에, 마우스를 꼬리 채혈 챔버에 두었다. 마우스를 이소플루레인(isoflurane)으로 챔버내에서 마취시켰다. 이후, 꼬리의 작은 부분 (대략 끝에서 4mm)을 멸균 가위로 잘랐다. 잘려진 꼬리를 즉시 37℃로 데워진 약 10 mL의 0.9 % NaCl 완충액 용액으로 채워진 15 mL 팰콘(Falcon) 튜브에 두었다. 혈액을 40분 과정에 걸쳐 수집하였다. 염수가 채워진 튜브를 채혈 전, 후 모두 칭량하였다. 결과는 표 203에 제공된다.
ISIS 482584에 의한 처리는 채혈에 대해 뚜렷한 영향을 미치지 않았다. 이러한 데이터는 본원에서 제공된 화합물의 출혈 가능성이 낮다는 것을 나타낸다. 실시예 19에서 제공된 결과와 함께, 이러한 데이터는 본원에 개시된 화합물로의 PKK 억제가 연관된 채혈 위험 없이 항-혈전성 활성을 제공하는데 유용하나는 것을 나타낸다.
표 203
ISIS 482584로의 처리 후 꼬리 채혈 검정
실시예 134: FeCl
3
-유도된 장간막 혈전증 모델에서의 뮤린 PKK 안티센스 억제의
생체내
효과
ISIS 482584를 FeCl3-유도된 장간막 혈전증 마우스 모델에서 평가하였다.
치료
6-8마리의 스위스-웹스터(Swiss-Webster) 마우스 그룹에 40 mg/kg의 ISIS 482584로 3주간 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다 (주간 용량: 80 mg/kg). 6마리의 스위스-웹스터(Swiss-Webster ) 마우스의 대조군을 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS의 최종 투여 후 2일째에, 모든 그룹의 마우스에 25 mg/kg 자일라진과 혼합된 75 mg/kg의 케타민으로 피하 주사로 투여하여 마취시켰다.
로다민(Rhodamine) 6G 염료를 혈소판 염색을 위하여 5 mg/kg 용량으로 피하 주사하였다. Alexa-647-표지된 항-피브리노겐 항체를 피브린 염색을 위하여 꼬리 정맥을 통하여 1 mg/kg의 용량으로 주사하였다. 복부를 중앙선 절개를 이용해서 개방하였다. 내장 장간막을 유리 커버슬립(coverslip)에 도포하고, 장간막 소동맥 (70-120 m)을 현미경 관찰 하에 위치시켰다. 혈전 형성은 표적 혈관 상에 직접적으로 6 % FeCl3 용액으로 예비-포화된 면사(cotton thread) (2 x 0.3 mm)를 인가함으로써 유도된다. 노출 후 3분째에, 상기 면사를 제거하고 염료 양자의 색 각도를 형광 현미경(올림푸스 FluoView 1000 공초점 레이터 스캐닝 현미경)으로 70분간 적절한 필터와 함께 관찰하였다.
대조군 및 처리 그룹 내의 혈소판 응집에 대한 결과는 표 204에 제시되며, 이는 비표준화 단위(arbitrary unit; a.u.)로 표현된다. 혈소판 응집은 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 80 mg/kg/주의 용량으로 ISIS 482584 처리한 마우스에서 감소하였다. 대조군 및 처리 그룹 내의 피브린 형성에 대한 결과는 표 205에 제시되며, 이는 비표준화 단위(arbitrary unit; a.u.)로 표현된다. 피브린 형성은 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 80 mg/kg/주의 용량으로 ISIS 482584 처리한 마우스에서 감소하였다. 따라서, 이러한 결과는 ISIS 482584가 혈전 형성을 억제한다는 것을 나타낸다.
표 204
FeCl3 유도된 장간막 혈전 모델에서의 형광 강도 (a.u.)의 실시간 측정에 의한 혈소판 응집 분석
표 205
FeCl3 유도된 장간막 혈전 모델에서의 형광 강도 (a.u.)의 실시간 측정에 의한 피브린 형성 분석
실시예 135: 협착증-유도된 하대정맥 혈전증 모델에서의 뮤린 PKK 안티센스 억제의
생체내
효과
ISIS 482584를 협착증-유도된 하대정맥 (IVC) 혈전증 마우스 모델에서 평가하였다. 감소된 혈류 및 내피성 손상은 이러한 모델의 특징이며, 이는 또한 세인트 토마스(St. Tomas) 모델로도 알려져 있다.
치료
4개 그룹의 6-8마리 수컷 BALB/c 마우스를 각각 ISIS 482584 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 40 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 80 mg/kg). 8마리 BALB/c 마우스의 대조군을 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS의 최종 투여 후 2일째에, 모든 그룹의 마우스에 2.5%의 흡입성 이소플루레인으로 투여하여 마취시켰다. 마우스의 IVC를 좌측 신장 정맥 아래에서 복부 중선 절개로 노출하고, 비절개 박리(blunt dissection)로 복대동맥으로부터 분리하였다. 6-0 실크 타이 (Ethicon, UK)를 좌측 신장 정맥 바로 아래에 혈관 뒤에 두었고, 금속 4-0 봉합재 (Ethicon, UK)를 IVC에 걸쳐 세로로 위치시켜 실크 타이가 상부에 묶여 있도록 하였다. 금속 봉합재를 이후 제거하였다. 2개의 신경혈관 수술용 클립 (Braun Medical Inc, PA)을, 그것들을 제거한 후 각 20초째에 결찰 하에 두개의 별개의 위치에 두었다. 복강 내용물을 이후 교체하고, 복부를 닫았다. 24시간 후, IVC를 노출시키고 혈전 형성에 대해 확인하였다. 모든 형성된 혈전을 수집하고 24시간동안 10% 포르말린에서 고정시켰다.
혈전을 칭량하였고, 결과는 표 206에 밀리그램으로 제시된다. 결과에 의하여 나타난 바와 같이, 용량 증가된 ISIS 482584로의 처리는 상응 하는 혈전 중량의 감소를 초래하였다. 상기 결과는 PKK의 안티센스 억제가 혈전 형성을 억제하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
표 206
협착증-유도된 IVC 혈전증 모델에서의 혈전 중량
실시예
136:
GalNAc
3
콘주게이트
그룹을 포함하는
안티센스
올리고뉴클레오티드를 갖는
뮤린
PKK의
억제
하기 표에 나타낸 ISIS 482584 및 ISIS 722059를 뮤린 PKK 생체내에서의 그들의 효과에 대해 시험하였다.
표 207
GalNAc3 콘주게이트 그룹 및 이의 모체를 포함하는 ISIS 722059, ISIS 482584
하첨자: “e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc3-7"의 구조가 실시예 48에 나타나 있다.
치료
4개 그룹의 4마리의 C57Bl/6J-Tyrc -2J 마우스를 각각 ISIS 482584 5.0 mg/kg, 10.0 mg/kg, 20.0 mg/kg, 또는 40.0 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 10.0 mg/kg, 20.0 mg/kg, 40.0 mg/kg, 또는 80.0 mg/kg). 4개 그룹의 4마리 BALB/c 마우스를 각각 ISIS 722059 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 또는 8.0 mg/kg로 처리하고 3주간 일주일에 2회 피하 투여하였다 (주간 용량 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 또는 16.0 mg/kg). 4마리의 BALB/c 마우스의 대조군을 PBS로 처리하였고, 이를 피하로 3주간 일주일에 2회 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS의 최종 투여로부터 3일 후, 모든 그룹의 마우스를 유도를 위하여 공기 중 2.5%의 증기화된 이소플루레인, 이후 유지를 위하여 노즈콘에 의한 1-2% 이소플루레인으로 마취시켰다. 이후 경부 변위(cervical dislocation)하였다. 안락사 후, 간을 RNA 분석을 위하여 수집하였다.
RNA 분석
RNA를 인간 PKK의 실시간 PCR 분석을 위하여 간 조직으로부터 추출하였다. PKK mRNA 수준을 뮤린 프라이머 프로브 세트 (정방향 서열 ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC, 서열 번호: 2231로 본원에서 지정됨; 역방향 서열 GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT, 서열 번호: 2232로 지정됨; 프로브 서열 AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC, 서열 번호: 2233로 지정됨)을 사용하여 측정하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교한 PKK의 억제 퍼센트로서 제시된다. 표 208에서 나타난 나와 같이, GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 Isis 722059는 모체 안티센스 올리고뉴클레오티드, Isis 482584보다 유의미한 정도로 더욱 강력하게 PKK mRNA를 감소시켰다. 이러한 결과는, GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 모체 안티센스 올리고뉴클레오티드보다, 마우스 및 인간 둘 모두에서의 많은 표적 유전자에 대해 유의미하게 더욱 강력하다는 상기 실시예에서의 결과와 일치한다. 따라서, 이는, GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 인간 PKK 안티센스 올리고뉴클레오티드가 콘주게이트 그룹을 포함하지 않는 그들의 모체 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 유의미한 정도로 더욱 강력하게 인간 PKK mRNA를 그와 같이 감소시킬 것으로 예상된다.
표 208
PBS 대조군과 비교한 간 내에서의 PKK mRNA 억제 퍼센트
실시예
137:
GalNAc
3
콘주게이트
그룹을 포함하는
안티센스
올리고뉴클레오티드를 갖는 인간
PKK의
억제
하기 표에 나타낸 ISIS 546254 및 ISIS 721744를 인간 PKK 시험관내에서의 그들의 효과에 대해 시험하였다.
표 209
GalNAc3 콘주게이트 그룹 및 이의 모체를 포함하는 ISIS 721744, ISIS 546254
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결 (PO)을 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. “GalNAc3-7”의 구조는 실시예 48에 나타나 있고, “GalNAc3-7a-o’”는 절단가능한 모이어티가 -O-P(=O)(OH)-인 GalNAc3-7 콘주게이트 그룹을 나타낸다.
일차 인간 간세포 공배양물 (시험관내 간의 생리학적 미세환경을 모방하기 위하여 기질 세포를 포함 (HepatoPac kit HPHU-TX-96S, Hepregen, Medford, MA))을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 하기 표에 열거된 농도의 Isis 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 임의의 형질감염 시약의 부재 하에 각 웰에 부가하였다. 96시간 후, 세포를 용해시키고 RNA를 세포로부터 단리시켰다. PKK mRNA 수준을 프라이머 프로브 세트 RTS3454를 사용하여 정량화 실시간 PCR을 사용하여 측정하고, RIBOGREEN®로 측정 시, 총 RNA 함량으로 정규화하였다. 결과를 PBS 처리된 세포와 비교하여 하기 표에 PKK mRNA 수준의 억제 퍼센트로서 제시하였고, IC50 값을 4-파라미터 논리 모델을 이용하여 산출하였다 (JMP Software, Cary, NC). 이 결과는, 시약 또는 전기천공 기술이 올리고뉴클레오티드의 세포로의 유입을 인공적으로 촉진하기 위해 사용되지 않은 유리 흡수 조건 하에서, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 모 올리고뉴클레오티드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다.
표 210
PBS 대조군과 비교한 PKK mRNA 억제 퍼센트
SEQUENCE LISTING
<110> Isis Pharmaceuticals
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING PKK EXPRESSION
<130> BIOL0252WO
<150> 62/088,459
<151> 2014-12-05
<150> 62/058,629
<151> 2014-10-01
<150> 61/987,478
<151> 2014-05-01
<160> 2281
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2252
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
agaacagctt gaagaccgtt catttttaag tgacaagaga ctcacctcca agaagcaatt 60
gtgttttcag aatgatttta ttcaagcaag caacttattt catttccttg tttgctacag 120
tttcctgtgg atgtctgact caactctatg aaaacgcctt cttcagaggt ggggatgtag 180
cttccatgta caccccaaat gcccaatact gccagatgag gtgcacattc cacccaaggt 240
gtttgctatt cagttttctt ccagcaagtt caatcaatga catggagaaa aggtttggtt 300
gcttcttgaa agatagtgtt acaggaaccc tgccaaaagt acatcgaaca ggtgcagttt 360
ctggacattc cttgaagcaa tgtggtcatc aaataagtgc ttgccatcga gacatttata 420
aaggagttga tatgagagga gtcaatttta atgtgtctaa ggttagcagt gttgaagaat 480
gccaaaaaag gtgcaccagt aacattcgct gccagttttt ttcatatgcc acgcaaacat 540
ttcacaaggc agagtaccgg aacaattgcc tattaaagta cagtcccgga ggaacaccta 600
ccgctataaa ggtgctgagt aacgtggaat ctggattctc actgaagccc tgtgcccttt 660
cagaaattgg ttgccacatg aacatcttcc agcatcttgc gttctcagat gtggatgttg 720
ccagggttct cactccagat gcttttgtgt gtcggaccat ctgcacctat caccccaact 780
gcctcttctt tacattctat acaaatgtat ggaaaatcga gtcacaaaga aatgtttgtc 840
ttcttaaaac atctgaaagt ggcacaccaa gttcctctac tcctcaagaa aacaccatat 900
ctggatatag ccttttaacc tgcaaaagaa ctttacctga accctgccat tctaaaattt 960
acccgggagt tgactttgga ggagaagaat tgaatgtgac ttttgttaaa ggagtgaatg 1020
tttgccaaga gacttgcaca aagatgattc gctgtcagtt tttcacttat tctttactcc 1080
cagaagactg taaggaagag aagtgtaagt gtttcttaag attatctatg gatggttctc 1140
caactaggat tgcgtatggg acacaaggga gctctggtta ctctttgaga ttgtgtaaca 1200
ctggggacaa ctctgtctgc acaacaaaaa caagcacacg cattgttgga ggaacaaact 1260
cttcttgggg agagtggccc tggcaggtga gcctgcaggt gaagctgaca gctcagaggc 1320
acctgtgtgg agggtcactc ataggacacc agtgggtcct cactgctgcc cactgctttg 1380
atgggcttcc cctgcaggat gtttggcgca tctatagtgg cattttaaat ctgtcagaca 1440
ttacaaaaga tacacctttc tcacaaataa aagagattat tattcaccaa aactataaag 1500
tctcagaagg gaatcatgat atcgccttga taaaactcca ggctcctttg aattacactg 1560
aattccaaaa accaatatgc ctaccttcca aaggtgacac aagcacaatt tataccaact 1620
gttgggtaac cggatggggc ttctcgaagg agaaaggtga aatccaaaat attctacaaa 1680
aggtaaatat tcctttggta acaaatgaag aatgccagaa aagatatcaa gattataaaa 1740
taacccaacg gatggtctgt gctggctata aagaaggggg aaaagatgct tgtaagggag 1800
attcaggtgg tcccttagtt tgcaaacaca atggaatgtg gcgtttggtg ggcatcacca 1860
gctggggtga aggctgtgcc cgcagggagc aacctggtgt ctacaccaaa gtcgctgagt 1920
acatggactg gattttagag aaaacacaga gcagtgatgg aaaagctcag atgcagtcac 1980
cagcatgaga agcagtccag agtctaggca atttttacaa cctgagttca agtcaaattc 2040
tgagcctggg gggtcctcat ctgcaaagca tggagagtgg catcttcttt gcatcctaag 2100
gacgaaaaac acagtgcact cagagctgct gaggacaatg tctggctgaa gcccgctttc 2160
agcacgccgt aaccaggggc tgacaatgcg aggtcgcaac tgagatctcc atgactgtgt 2220
gttgtgaaat aaaatggtga aagatcaaaa aa 2252
<210> 2
<211> 578
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
atgctctctc tctctcctgc tgccttgtga agaaggtacc tgcttcccct tcaccttcca 60
ccataattct gaacacggat aggatgttca tggaatatgt tgacaggaca aaaagttgaa 120
actgttggca gaaacccaaa gtcaatattg aagccaagca aaatattgcc tgcagtgcca 180
cattagaaca gcttgaagac cgttcatttt taagtgacaa gagactcacc tccaagaagc 240
aattgtgttt tcagaatgat tttattcaag caagcaactt atttcatttc cttgtttgct 300
acagtttcct gtggatgtct gactcaactc tatgaaaacg ccttcttcag aggtggggat 360
gtagcttcca tgtacacccc aaatgcccaa tactgccaga tgaggtgcac attccaccca 420
aggtgtttgc tattcagttt tcttccagca agttcaatca atgacatgga gaaaaggttt 480
ggttgcttct tgaaagatag tgttacagga accctgccaa aagtacatcg aacaggtgca 540
gtttctggac attccttgaa gcaatgtggt catcaaat 578
<210> 3
<211> 681
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
ggaagccatt cactagtcag attgaccaga gattgttggt gggctgtctg ttggggtcta 60
tgcacaggat ttctgctgga gttctaagga caaaaagttg aaactgttgg cagaaaccca 120
aagtcaatat tgaagccaag caaaatattg cctgcagtgc cacattagaa cagcttgaag 180
accgttcatt tttaagtgac aagagactca cctccaagaa gcaattgtgt tttcagaatg 240
attttattca agcaagcaac ttatttcatt tccttgtttg ctacagtttc ctgtggatgt 300
ctgactcaac tctatgaaaa cgccttcttc agaggtgggg atgtagcttc catgtacacc 360
ccaaatgccc aatactgcca gatgaggtgc acattccacc caaggtgttt gctattcagt 420
tttcttccag caagttcaat caatgacatg gagaaaaggt ttggttgctt cttgaaagat 480
agtgttacag gaaccctgcc aaaagtacat cgaacaggtg cagtttctgg acattccttg 540
aagcaatgtg gtcatcaaat aagtgcttgc catcgagaca tttataaagg agttgatatg 600
agaggagtca attttaatgt gtctaaggtt agcagtgttg aagaatgcca aaaaaggtgc 660
accagtaaca ttcgctgcca g 681
<210> 4
<211> 2175
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
agaacagctt gaagaccgtt catttttaag tgacaagaga ctcacctcca agaagcaatt 60
gtgttttcag tttcctgtga gggagttttc tctgtgtccc cacaaggcat gattctgggt 120
ctatggtgac ttaagagggc cacacaacaa tgagtattta attttcctca gatgtatggc 180
tacaataaac atctatagga tgtctgactc aactctatga aaacgccttc ttcagaggtg 240
gggatgtagc ttccatgtac accccaaatg cccaatactg ccagatgagg tgcacattcc 300
acccaaggtg tttgctattc agttttcttc cagcaagttc aatcaatgac atggagaaaa 360
ggtttggttg cttcttgaaa gatagtgtta caggaaccct gccaaaagta catcgaacag 420
gtgcagtttc tggacattcc ttgaagcaat gtggtcatca aataagtgct tgccatcgag 480
acatttataa aggagttgat atgagaggag tcaattttaa tgtatctaag gttagcagtg 540
ttgaagaatg ccaaaaaagg tgcaccaatg acattcgctg ccagtttttt tcatatgcca 600
cgcaaacatt tcacaaggca gagtaccgga acaattgcct attaaagtac agtcccggag 660
gaacacctac cgctataaag gtgctgagta acgtggaatc tggattctca ctgaagccct 720
gtgccctttc agaaattggt tgccaaatga acatcttcca gcatcttgcg ttctcagatg 780
tggatgttgc cagggttctc actccagatg cttttgtgtg tcggaccatc tgcacctatc 840
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ctaaaattta cccgggagtt gactttggag gagaagaatt gaatgtgact tttgttaaag 1080
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ctttactccc agaagactgt aaggaagaga agtgtaagtg tttcttaaga ttatctatgg 1200
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tgtgtaacac tggggacaac tctgtctgca caacaaaaac aagcacacgc attgttggag 1320
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actgctttga tgggcttccc ctgcaggatg tttggcgcat ctatagtggc attttaaatc 1500
tgtcagacat tacaaaagat acacctttct cacaaataaa agagattatt attcaccaaa 1560
actataaagt ctcagaaggg aatcatgata tcgccttgat aaaactccag gctcctttga 1620
attacactga attccaaaaa ccaatatgcc taccttccaa aggtgacaca agcacaattt 1680
ataccaactg ttgggtaacc ggatggggct tctcgaagga gaaagggaga ttcaggtggt 1740
cccttagttt gcaaacacaa cggaatgtgg cgtttggtgg gcatcaccag ctggggtgaa 1800
ggctgtgccc gcagggagca acctggtgtc tacaccaaag tcgctgagta catggactgg 1860
attttagaga aaacacagag cagtgatgga aaagctcaga tgcagtcacc agcatgagaa 1920
gcagtccaga gtctaggcaa tttttacaac ctgagttcaa gtcaaattct gagcctgggg 1980
ggtcctcatc tgcaaagcat ggagagtggc atcttctttg catcctaagg acgaaagaca 2040
cagtgcactc agagctgctg aggacaatgt ctggctgaag cccgctttca gcacgccgta 2100
accaggggct gacaatgcga ggtcgcaact gagatctcca tgactgtgtg ttgtgaaata 2160
aaatggtgaa agatc 2175
<210> 5
<211> 569
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
agtgccacat tagaacagct tgaagaccgt tcatttttaa gtgacaagag actcacctcc 60
aagaagcaat tgtgttttca gtttcctgtg gatgtctgac tcaactctat gaaaacgcct 120
tcttcagagg tggggatgta gcttccatgt acaccccaaa tgcccaatac tgccagatga 180
ggtgcacatt ccacccaagg tgtttgctat tcagttttct tccagcaagt tcaatcaatg 240
acatggagaa aaggtttggt tgcttcttga aagatagtgt tacaggaacc ctgccaaaag 300
tacatcgaac aggtgcagtt tctggacatt ccttgaagca atgtggtcat caaataagtg 360
cttgccatcg agacatttat aaaggagttg atatgagagg agtcaatttt aatgtgtcta 420
aggttagcag tgttgaagaa tgccaaaaaa ggtgcaccaa taacattcgc tgccagtttt 480
tttcatatgc cacgcaaaca tttcacaagg cagagtaccg gaacaattgc ctattaaagt 540
acagtcccgg aggaacacct accgctata 569
<210> 6
<211> 392
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (379)..(379)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
ttgaagaccg ttcattttta agtgacaaga gactcacctc caagaagcaa ttgtgttttc 60
agaatgattt tattcaagca agcaacttat ttcatttcct tgtttgctac agtttcctgt 120
ggatgtctga ctcaactcta tgaaaacgcc ttcttcagag gtggggatgt agcttccatg 180
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ttcagttttc ttccagcaag ttcaatcaat gacatggagg gtttggttgc ttcttgaaag 300
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<210> 7
<211> 802
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (760)..(760)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (775)..(775)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (796)..(796)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (800)..(800)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (802)..(802)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
gggtaatcct cttcagttac ttcaggtcat ctagatgtat acgtgcaggc ctgggcccag 60
aggcgacatt cctgtcttct tatattaata agaaaaagaa aacgaaatag tggttgccac 120
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gatgcttttg tgtgtcggac catctgcacc tatcacccca actgcctctt ctttacattc 240
tatacaaatg tatggaaaat cgagtcacaa aggcgagtat gcatggaaaa tcgcatcaca 300
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tcttaaaagt ttcgttcatt tccctcaaaa cacttgaacc tgcagtttca gtaggtactg 420
ttctgccagg tgcagattag ttaagagatt agcagacttc tctgcctatc ttctcttact 480
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gacgcctttg aatgaagatt caaaacatga tcttcatgtt ttgtattagc ttggagtaaa 600
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ctcttctgca cacagcatgg agctaagaga aggtgtctan gtatgtatat catcngcagc 780
ataaatccca gaattngtcn tn 802
<210> 8
<211> 2058
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
tcacctccaa gaagcaattg tgttttcaga atgattttat tcaagcaagc aacttatttc 60
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ttcagaggtg gggatgtagc ttccatgtac accccaaatg cccaatactg ccagatgagg 180
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catcgaacag gtgcagtttc tggacattcc ttgaagcaat gtggtcatca aataagtgct 360
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gttagcagtg ttgaagaatg ccaaaaaagg tgcaccaata acattcgctg ccagtttttt 480
tcatatgcca cgcaaacatt tcacaaggca gagtaccgga acaattgcct attaaagtac 540
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ctgaagccct gtgccctttc agaaattggt tgccacatga acatcttcca gcatcttgcg 660
ttctcagatg tggatgttgc cagggttctc actccagatg cttttgtgtg tcggaccatc 720
tgcacctatc accccaactg cctcttcttt acattctata caaatgtatg gaaaatcgag 780
tcacaaaggc gagtatgcat ggaaaatcgc atcacaaaga aatgtttgtc ttcttaaaac 840
atctgaaagt ggcacaccaa gttcctctac tcctcaagaa aacaccatat ctggatatag 900
ccttttaacc tgcaaaagaa ctttacctga accctgccat tctaaaattt acccgggagt 960
tgactttgga ggagaagaat tgaatgtgac ttttgttaaa ggagtgaatg tttgccaaga 1020
gacttgcaca aagatgattc gctgtcagtt tttcacttat tctttactcc cagaagactg 1080
taaggaagag aagtgtaagt gtttcttaag attatctatg gatggttctc caactaggat 1140
tgcgtatggg acacaaggga gctctggtta ctctttgaga ttgtgtaaca ctggggacaa 1200
ctctgtctgc acaacaaaaa caagcacacg cattgttgga ggaacaaact cttcttgggg 1260
agagtggccc tggcaggtga gcctgcaggt gaagctgaca gctcagaggc acctgtgtgg 1320
agggtcactc ataggacacc agtgggtcct cactgctgcc cactgctttg atgggcttcc 1380
cctgcaggat gtttggcgca tctatagtgg cattttaaat ctgtcagaca ttacaaaaga 1440
tacacctttc tcacaaataa aagagattat tattcaccaa aactataaag tctcagaagg 1500
gaatcatgat atcgccttga taaaactcca ggctcctttg aattacactg aattccaaaa 1560
accaatatgc ctaccttcca aaggtgacac aagcacaatt tataccaact gttgggtaac 1620
cggatggggc ttctcgaagg agaaaggtga aatccaaaat attctacaaa aggtaaatat 1680
tcctttggta acaaatgaag aatgccagaa aagatatcaa gattataaaa taacccaacg 1740
gatggtctgt gctggctata aagaaggggg aaaagatgct tgtaagggag attcaggtgg 1800
tcccttagtt tgcaaacaca atggaatgtg gcgtttggtg ggcatcacca gctggggtga 1860
aggctgtgcc cgcagggagc aacctggtgt ctacaccaaa gtcgctgagt acatggactg 1920
gattttagag aaaacacaga gcagtgatgg aaaagctcag atgcagtcac cagcatgaga 1980
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gggtcctcat ctgcaaag 2058
<210> 9
<211> 577
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
gttaccattc taaaatttac ccgggagttg actttggagg agaagaattg aatgtgactt 60
ttgttaaagg agtgaatgtt tgccaagaga cttgcacaaa gatgattcgc tgtcagtttt 120
tcacttattc tttactccca gaagactgta aggaagagaa gtaaaggaaa ttttattttt 180
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tactgttcat ttcatctagg tgtaagtgtt tcttaagatt atctatggat ggttctccaa 300
ctaggattgc gtatgggaca caagggagct ctggttactc tttgagattg tgtaacactg 360
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tgattcactt ctaattccaa ccattagcgt caacgctctc ttttcagtct gcacaacaaa 540
aacaagcaca cgcattgttg gaggaacaaa ctcttct 577
<210> 10
<211> 37000
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
agagcctctg cctagatttc acaggatgtg tggaaacacc tggctgtcca ggcagaagcc 60
tgctgcaggg acccagccct catggagaac ctctattagg gcagtgcaga ggtgaactgt 120
ggggttggag cccacacaca gagaccccac tggagcactg cccagtggag ctgtgaaaag 180
agttccccca tcttccagat gccagaatgg tagatccact gactggaaag ttgcaggcac 240
tcagtgccgg cccatgaagg cagccgtagg ggctgtaccc tgcaaagcca cagggacaga 300
gctgcccaag gccttaacag cccacacctt gcatcagcat gccctgggtg tgagacaggg 360
gctccaagga gattattttg gagctttaaa atttaatgac ttccctgcta ggttttgcat 420
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aggctcattg agggaaggga cttgccttgt ctcaaatgag actttggact cggacttttg 600
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gtgtcctcat ccaaatctcg tcttgaattg taatccccac atgggattac atgggagggg 780
cctggtgaga ggtgattgga tcatggaggt ggtttcccct gtgctgtgat ctcatgatag 840
tgagggattt aaaagtgaca gtttcccctg cacatacaca ctctctctct cgtatcacct 900
tgtgaagaag gtgtctgctt cccctctgcc ttccatcgtg attataagtt tcctgaggcc 960
tccccagcca tgggtaactg tgagtcagtt aaacctcttt tgtttataaa ttacccagtc 1020
tcaggtagta tctttacagc agtgtgaaac tggactaata catctgggaa attctttttg 1080
tctccttcct ttctgaagga cagctttgcc tgatattata ttcttggttg ccaggttttg 1140
tactttcaat actttgaata tatcatccca ctctctcttg gcctacatga tttctgctga 1200
gaaatccacc aataatctta tgaagcttcc cttgtatgtg aagaattgct tttctcttgc 1260
ttctttgaaa attctctctt tgtcatggtg aggatttctt tttttttttt ttttttttag 1320
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actgcaagct ccgtctcctg ggttcacacc attttcctgt ctcagcctct ggagtagctg 1440
agactacagg tgcccaccac cacgcctggc taaatttttt ttgtattttt agtagagatg 1500
gggtttcact gtgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcatgatc cacccatctt 1560
ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccactgc acctggccga ggatctcttt 1620
atatttaatc tatttggagt tcttttgggc ttcataaatc tggatgttta tttcatttat 1680
gtctccaaat tttgagagtt ttctattctt atttttttaa ataagtttct gcaactttct 1740
ctttctctac ttcttctgga actcttctaa tgcatattaa ttttcttaac agtgtcctat 1800
aagtcttgtc agctttctgc aatttttatc attcctttta ttactctgac tgggtaattt 1860
caaatgacct gtatctgagc atgctgattc tttctcctgc ttgatctagt ctgctgctga 1920
agctgtttgt gaattttttc aattcagtca ttttgttctt tagctccaga atttctgttt 1980
cattcttttt tatggttcct atctatcttt ttgttgaact tctaattttg ctcatgtatt 2040
gttttcctga ttttgtttac tgtctatcta tattgttttg tagcttattg agctttctta 2100
aggcaattat ttttagctct tgtcatgcag taaagatctc catttcttta gggtcacctc 2160
ctgctgcttt atttccttcc tttggtggtt tcttgtttcc ccgattattt gtgatcagtg 2220
tggccttgca ctgaagtagg cacctatttc agtctttaca tactagcttc agcagagaaa 2280
gccattcact agtcagattg accagagatt gttggtgggc tgtctgttgg ggtctatgca 2340
caggatttct gctggagttc taaggtggga agggctggat tctgggttca ttcactgtgg 2400
ttgtctgtat tctgtgcaca aggactggct tgaagcatgg atccttgggg gctgacttgg 2460
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gtccactggg gtgagcccag catctgggtc cacatggccc agcatggagc caagatctct 2640
ggaggctgac ctggtgctgg atctgcaggg gatggcctgg attctaggcc catgggtgcc 2700
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gtggtgaagt taggttctat cttaactgtc cctcctccat gcaagagggc atctctctcc 3000
atactgtgct gcccaggctt gaaggtgaga tgacaccggt aatgtgaaat tgtccttcct 3060
atacacttct atgtgtcttt tcttatttct gtgctgcaac caggtggcat aacctctcac 3120
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tatttttatt atcaacagta aaaaattaaa ctttatctga aaattcaaaa gagtgctagg 4500
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tctggaccgc tagggaacca tttcaaaaat gaaagtaact ggtttaaatt taacttagca 4620
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ctctattaat ttcattaatt tttggagaat aaaaatgatt ctggacattt cattaatcat 4740
tacagaggga gttttctctg tgtccccaca aggcatgatt ctgggtctat ggtgacttaa 4800
gagggccaca caacaatgag tatttaattt tcctcagatg tatggctaca ataaacatct 4860
ataggtaagg tttacattca taaagagacc tttttttttc caggaaaaaa gacttttatt 4920
ccccctaaat cacaactccc ctgtgtctgt ccctcaaccc tgatttctct tctaaaccgt 4980
aatttacaaa cccatgtgca aacccactga aaggtgagaa ggagcataag ccagagacac 5040
tgggaaccac agccaactac agggggtttt tcattttttt gttttgtttt gttttttggc 5100
aaaataaatc atgattatgg ctaggaaaat cagggatgta agtaagcaaa aatttagaaa 5160
ctacatattg catgtagtcc ccaaattcag aaacagtcat cgttaaacat cttttattta 5220
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gctcttattc agttatttct gtagaataca atttttgaaa taaaaatact agattcaaag 5460
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tttttccaat ttgacttgaa acttaagaca atacacaggc ctgagttgtt ggtactattt 5880
tgctactacg tggagcttga gagtaatggt aacaccaaga ctggagcaag tggaaggaga 5940
catattgtcc actgatgcta tcagttgagc acaatgtgca gttacttttt aagccagatt 6000
caccatgggc tttttggctc ctgaaccaat agatttcatt tgttttcaag ccactttgta 6060
ctaggttttc catcatttgc aatcaaaacc agtatacaaa cactggttat ttaatttttc 6120
atttttgcta atctcaggga taaaatggct tctagttgtt ttaacttggc tatatttgtg 6180
attcttccca ttttcatata cttactaatc acttctattt cttttgtaaa ttatcttttc 6240
atatttgtta tctaattctt taaaatttga gtactttaat tctcattatt gtttgtggaa 6300
ttgttaaaca agactgaata atctgcccaa agtccatgga catgggggcc catgtaaaag 6360
ctttgaaagc caccatcatt atgagataaa ttatataata gtactttaca taggctccaa 6420
aatacagcac agacacagct atcattgtca tggtcatcat tatcatcatg atcaccaact 6480
tatgaggata agcaagaaca cctactagaa gtttctttcc attcagcaac aaaattggtg 6540
tctttctagt cactcccttc cctgactgtc acatagcagt tcacagaggc tcagttgcag 6600
aatgagaagc tctgggccag gacctgccat tgtatgcatc cttgcatggg aactgggggc 6660
tggaagagga gtgactgctt gataattatg agtcagtcaa aaccaccaac tgtctgaaaa 6720
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catgaaatct aggcaataca cttgtattcc caaaagcttc cacttgaaga gatctgtgct 6840
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taggatagtg cagagaagat ggcactctcc agtgcttaat aaaatgcacg tggtctaagc 7020
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tgaaatgaat gtgctacctg aacaggaaag cttattaacc agatttcaaa gacagtcttt 7200
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gctttgtagc ccaggctgga gtgcagtggc gtgatctcgg ctcactgcaa cttccacctc 8880
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ttattaatca cgagccacag tttcatctta atgatttttc cttttgatta atatccagag 9180
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gagaaaactc agattgtatg tgaggatcat catattaaaa gtggaggaag gttctagaat 9360
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taagtgcaga ctacaaggag ttaataagca agatgaacac gatatacaaa tccagctctt 9480
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ttataggaaa ctagtacagt gatactgtta gagttatagg tacagtgaca taggacagtg 15060
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aagagccaaa tgtaaatttt tgcttctttt tccatacaca taactttcat cttcaactat 8940
gtgaatttaa gaattagaat tttaaaactc attctctgat ccctacatgc taatctgtac 9000
caaaaaaaac ccaaacaaac aaacaaacaa acaaaaaaac ccagaccata tgtgagattt 9060
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cgttgatatt gaagacagaa aaagcctccc attacatgga cactaccggg aatcaataca 9180
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atggaatgtt gtctttcttt tctctccacc ccttcaagaa aatgtgctaa gaaaaaggag 23100
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<210> 14
<211> 2513
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 14
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<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
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aagaaggcag ctgctgatag tccaaggcaa gaacctctcc ttagatacat tactcctgac 4560
acagaacggg gtgggggggg aacttagaag cttcaatgct tctgctagca gaaatttctg 4620
tatcaagatt tctctctagc agagtcctcc caccccaaag atttgcttgt gtttattacc 4680
agccctctaa ataaaaactc tacctgaaaa tcggaaagaa tatcagatat tgcataatga 4740
ttgagtccaa tccaagcttc tgattagtat atggtatttt taatataagg catagagagc 4800
catttctgaa ctgaaaacac ctgctttgga tttaatgagt gtagtaaccc tttggtagtg 4860
tggatggaca gctttaacac tagatgtcag tgttctttct ctgtgaattc cattacggtt 4920
cagaatgtga gcatggccct ggacaccccc ttctcaatag tcattataga gtgagatttc 4980
cctgggcata tcatagtatt ccgatcaaag ctgactttgt ctagccacac ctcaagggct 5040
gatcttgact ctcaagtatt tggcaaagat gagcttatcc ttgtcaatag aagccatttc 5100
tctgggtaaa ctcattgttt tccctctctg ctccctccat ctggcccatc aactgtaact 5160
gcttttctgt gccacaacta ctgccatgat caaaccaatt aaacacgagc agtggtagtc 5220
agagatgcta tgggccatgg ctataaaatt tacgatcatg acaggaacgt gagacatgga 5280
aatacattta atacttgaga acaagtactt tacatagtcc taaagtacaa aataatgatt 5340
gcttgctttt ctttagtctt tcttattttt ctgcatgaat ctgttgtata aaagtgttat 5400
tcgtgaataa taattttaat gagaaattat gactattaat gacaaatcat ttttgactta 5460
cctttgctat ttatagctaa tgttaacaca aacaagcact tttgtcattc gttcttcttc 5520
acgctattct gtatgcatgt gacattctat gcacacattc aattatttct actgattcaa 5580
attttagaaa taaaaatttt tagatacaaa catgtgaata cctttgaagg ttttatggca 5640
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cggatggccc acatggtact ggagatgatt ctcctgctgc agtcagacca gaactgcaga 5880
cagtgctggt gtgatgacct gaccagagct agtcttgtaa caggcttttt ctcagactta 5940
gaaaaaggct cagatttatt tttatttcca actcaacttg agctgctggt cctgccttac 6000
tagtgtgcat cttgagatga aggcagcatc acacaataga gtaaatcaac gctgacacac 6060
tgtgcatgga tgccattcct gagcagtgtc tagtgctcca taagccattg gctgtggaca 6120
catgggtttc tgaactgtta aactcattta tattcaaact gctctgattg attttctttt 6180
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tttaatattg acatatcatt tctaagagat tatattgtta attcagaaaa agaatgtgtt 6360
atctacattc ttaaaatatc ataaagattt agacaatgat ttctttttta gaaagttatc 6420
taaattatca ctaatatgaa atatcaggtg gaatatcgtg tatttgtttt tctagtttag 6480
aaagaattaa tctgtagctt gtatgtattg actttgtgaa tgatgatagt ttttaaatgt 6540
ttttaattga cactaggatt ataccacccc tttcctccct ctagtttctc ctaggaacac 6600
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gtattaatgc tacatatgta catatgtaca cagagatgta tgaatgcaac ttgttgagtc 6720
catttttgtt tgtgggtata tggtttgtgt gtgcttgtgc atattgaaca actagtaagt 6780
gggctcagct ctggaaaagg ttaattctct ttctccaaaa ggtcattagc tgcctatagt 6840
tctttgtcta aggtggggcc ccatgaaatt cccccttcca tgttactaca tccattgata 6900
ttgccatcgt tctggtccct tctgggaggg actgtttcac agcaaacttc ctgatattct 6960
ggctatcatt acctttctgt gttctctttc atgatatccc tcgagccata ggtttgggat 7020
atgagatgta gatatatcga ctggggctgg gagccccaca gtatgttgac ctccgcattg 7080
tgtccagttg tggatttttg tgatggtgtc tgtcttagtt agggttttac tgctgtgaac 7140
agacaccatg accaagataa gtcttataaa ggacagcatt taattggggc tggcttacac 7200
attcagaggt tcagcccatt atcatcaagg caggaacatg gtagtgtcca aggcaggcgt 7260
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ccaggcagtt aggatgaggg tcttaaagcc cacacccaca gtggcacatc tactccaaca 7380
gggccacacc ttcgaatcat gctaatccct gagttgagca aatacaaacc atcagtgtcc 7440
atttgctacc aagagaggct tctttgatga gagagagtag ctacctttat ctaggaaggg 7500
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ttatcttttc atatctgatg ctgaatttta aaagttttag catttattta tttttactct 7620
atatctgcac atgcgtatac atatatacac atgtgctgtg gagcacatgt ggagatgaga 7680
ggacaacatg tggaggctca gttttctctc tgccactcac ctagagtttt gagttaagat 7740
gcttcattta tctatggaat ttttcctttt ctttcttttt gattatgtac atttttaata 7800
tgactaaata actcagtcat ggtccatgga cctgcagttt attgaaagac atcattatag 7860
atcaattagg tcatacagac tctgtgcaaa caaggctgtc attgttctaa tcattactgc 7920
tcaccatcgt tatcattgct gccatcatca actgaggagg ataatccatt ctccagttag 7980
aatgtttcga ctcattcatt ctcattgact gagtcacgtg ttagtttacc aacactcaac 8040
tgcaggatag aaacttctag gctgccactc gatgatggtt tgtgattttg tatgtgtctg 8100
tgcaatggga tagtgaggga gtctctgctc aataattatg agatgctaac acattaaaaa 8160
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aaaatctcct ctttccaaat ataaatctga cttaagaagg taggcatggc aacacccctc 8340
tgataagaag aaaaacagta ttgcaaggtt gcctcatcca aattggactc agtggcagga 8400
tctccatata agtagaacat agaaactctt aactttccgg ttcttattga aaaacgtatt 8460
gtctagatag ctattcctta acaaacaatg gcaacatgga caacactgcc actggagtat 8520
tgcataatta atgaaaactt gactgctgaa aatggacagg ctgcctgttg gaaagctaag 8580
taaaatgatt tgaactgaat cttttcaggg aaatccgaat tcttcaatgg atttaaagac 8640
agttctctaa tgatatatgg ggtgcaggat acccacataa tggagttgtg agtcagcaca 8700
agcagtgtat cttattttca agttagctta ctttcatttt tgtaataatt tgaaaattat 8760
ttagcctttc cccattatat tgaaaataga gtcttttctc atgcaatata ttctgattat 8820
gacttcccct cttcttcccc ttccagttcc acccccacct cccatcttct cctggtctaa 8880
tccctttctg cctctcatta gataagaaca aaacttctaa gagatagcaa tcagacacaa 8940
caaaataaaa tataataaaa cagaaaccat cacatgaaag ttgtacaagg caacccaaca 9000
gaaggaaaag agcctaagag aaggcacaag aatcggagac ccattcagga gtcccataaa 9060
aatactcagc tgaaagctat aaaatatatg tagaggaccc tgtgcagacc tgtctaggcc 9120
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ccctcagctc tgaggggagg gatttgatgg agacacacca tcagagctat gtgtcctaag 9300
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tctctctctc tctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtaat gtctgaatgt 9420
gggtctctac aaatacaatt ttattaagaa atgagctagt aggaaatcag tactcaatat 9480
ttattatttt atttaagtaa ggctgggtaa acagcatcat gggacagcac ctgctgtgct 9540
ggaaaaaagg acagaaaagg attgtgagtc aggaaggatg agtttatgtc cgaggatatt 9600
tattcactgt gtggtactaa tgacatctga actctgagac tcagttattg acttccttca 9660
tggaaaaaaa aaaggaaaaa acaaaaaaaa agaaatgcaa ataatagtcc tgacctcaag 9720
tcgcccttaa agcgctgagg aatctaggga gattgttgtc ctaaaagcgt tttgaaaaaa 9780
tgctgtattt ccatttttaa ggtgagatgt ttccccagcc tgttagacag caggcagaaa 9840
aaatatattt taacagatac tttatgtaaa attatatagg caataaaaat tttattgcat 9900
aaatttattc aattttatgc ataaatgtcc ataggatgac tttatttatt tttttttttt 9960
acgccccgcg ggggcccata ggatgacttt aaatagcgtg ctgtattgtt taaacagttg 10020
tcatatgttt cattctacct gtgtggttgt atatatcttt gggtagtcat tgggataaat 10080
aaaaaggaaa aacaacatag atgtatttct actaaaatgg ttacactttc tccggaatca 10140
acttttatat cacagggtgt ctgtcacaac tgtatgcaaa taccttcttc agaggtgggg 10200
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ccaggtgcct gctcttcagc ttccttgccg tgagtccaac caaggagaca gataaaaggt 10320
aagatgtccg tgagtccaac caaggagaca gataaaaggt aagatgtccg tgagtccaat 10380
caaggagaca gataaaaggt aagatgtgct gttttatcac tgccgggtga gacgtttctc 10440
aaatagcttc ctgtcgtatg caaaattggt gtcatagttc tcagagtgtt cacagactga 10500
ttgcatcaga agctcctagg ctgggttttc tccaatgcaa actactagag tgctgaaccc 10560
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ttcagccaag gcctgaagac agagcgtgta acaagaacgg gtccttcctc acgctgtaat 10680
acttagcttt cttcttcact ttcaacacgc tatactgtcc ccacgtgtac acttgttatg 10740
tgtataaata tgttattagt caggttctgc atctgaggga gaacatgagt tttttccttt 10800
ctgagattat gtggcttcac ttaatatcac acattctaag tccatccatt ttcatacagt 10860
ttttgtgatt tgatttttct tcagcactaa atagcattcc tttatatatt ttctgtttta 10920
ttcatgattt attatgcatt aattataatt tactacaaat gctacaaatg aaacaatcac 10980
acacccaaat taaccagatc cagagactgt acaattcagg gaccttctat ccagttacag 11040
tagtcatttg aaaaggaagc atggaacttc gcaaggattc tatactttat caaatatata 11100
tatatatata tatattttaa tcatatatat atattgcttg ctgatagaag gtgaaaattt 11160
cacctgcata aagaaatata tttgttttac ttgttaccgt atttatgggg agcaaagttg 11220
aagatgtaca aaccaggaat tttgttgata atagatttga aatccagcag gcaagcctca 11280
atggtatatg tagtgagcct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 11340
ctctctgtgt atgtgcatgc atgtgcatgt atgcatgtgc gtgtatcatt aagtggtaat 11400
tttggcaagg acaaatatta gaaatatagt tcggaatttt accttaattt tctttcattt 11460
gatcaatagt caaatgtaaa tttttgcctt ccattttcat acacattact tttatcttcg 11520
gtctatctga atttaagaat tagaaatttg aaactcattc tctgatctct acatgcttac 11580
ctgtacaaaa caaaataaaa caacaaaaac aaaaccaaaa cccagactgt atgtgtgatt 11640
cacttttttt aaaacttgaa ctaggtccta ggattcttat aaagagtaaa gttaacaccg 11700
agctgatatt gaagattgaa aaaacctccc cttatatgga aactaccaga tcaataaacc 11760
agatgaatat cacatacaga cccaacttag ctgattcaaa ttttttaaag taaattacaa 11820
tatttataaa aataatcacc attttagaaa acgtagaagt ttcagacagg agaatcattg 11880
gttttaaaat cagcttgtgt aagttaacaa gatcttttct caaaatagac taaataaaag 11940
ctggcagtgg aatgggaaga acgaggctgt tgagtgatta gcacttgatg aacatatctg 12000
aagcccaggc tttcctcctc agtcccacat aaaccaaaac caaaaccgat tatcttctgg 12060
aaagaggagc tatgaaataa tcctcaactc tgggatgtgg gtggccttct gcactcgaag 12120
catgaacact aagaaaacca acgattgtag atagtatgaa cttgtcttaa gaatgtcctt 12180
tccagcacat gtcgagaaat gtaattagtt tcctgacctt attttattta ttaacatatc 12240
caaaatgctg tataatttct taatgtgtat ttgtcgtttt attccccttt taaaatgtga 12300
ttttttttta aaccaggttt gggtgcttca tgaaagagag cattacaggg actttgccaa 12360
gaatacaccg gacaggggcc atttctggtc attctttaaa acagtgtggc catcaattaa 12420
gtggtaagat gtggattttt tttccaacta aatttatgtt actagcactc aaactcagag 12480
tagtttttgc tgaaagtcta tactatgatg gacttttaga agagaacacc gagaaagata 12540
acagacggag cagcatcatg gacctaagga ggggtctttc ttcctgataa tgttcatgtc 12600
tttatcagtt gtaatgcacg gccttaaagg gcttccatta tctatagtac tcacacacaa 12660
tgtaagattt gtgggaaatg aatgtgtagt ccagataata ggtcttctgt tccatagcag 12720
acatttcaga taagattcag gacacatctc accccaaagt gaaccctgga gagtaagtca 12780
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tgcagtcaga cacaacaaca acaaaaaaag ttctgaaaag ttctggcccc cactagggtc 12960
attgagaagg gtttaagata gtggctctca actgtcctta cgctgcagct ctttctcttg 13020
ttgtggtggc tcccaaccat aaactattta catcaccatt tcataactat aattttgcta 13080
ctcttatgaa tcataattat aaatatttgt gttttccagt ggtcttaggc aactcctgtg 13140
aaagggtctt tcaatccccc caaaaggggt catgacccac aggttcagaa atgctggctt 13200
aagagatctt gtttgtcact cagtccagac tgcaggactg agttctgtca atcttgctaa 13260
gcatactatt tcttgcaagg ggtgtaaatg caaggatgtt agagagcttt ctctcaggcc 13320
accattgtaa ctgatgtcct aggaaacaac atcctaattt ccacaccatc ttaaaggctt 13380
aatacaaaga gggcgtttta ataaaacgat gggggctgtt agaaagtgaa agtgctaaca 13440
aagaatgagt tgggttgtat cgtttagctt tgtttttaac gtcattcatt ccgtaggctc 13500
aaatttcaaa tgttctcatt ttgccccaat aacaacaacc ctctcaccac atatacagtc 13560
agagtctgaa acttaagctt tagggagtta atgaagggtg acaatggctt agttataaat 13620
actgcttcac tggtgtaata tcttctctat cttataagat caaacccata taccaatata 13680
acttgctgca tattatttga tgaaatgttg tgtctaatta ttgtgaccaa caacaaaata 13740
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ccctagctta accttcttca ctgagtttgg ctctaaagtt tatttgcaac tttctcccaa 13860
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catttttatg atttacaatt ttctgccctg taaactgctg ggagcttagc acccctacac 14100
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ctcctcttgg tctgtaatca tcttggagta gaaggtgacg tcacggtaca cactggtcaa 14760
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taagaaagtt ttaaagcaag aaggaaaatg atttcattgt gcatataaat aaattgagat 15060
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taccaatact gaatgctggc cctacaccag gccctgtgtt aggtttccga attctgtggt 17040
atgacctctg tctgaaagac tgagaagtca gaagcaacat agctctttcc ctatttgtgt 17100
tttcttttct ctatgtgtcc ccaccaggct gtgccattca gatggcttaa atatattaac 17160
tatttaattt taatattccc cttttctagt ttttggaaac ttgtctatag gagatagggc 17220
tctttattca acagtgttcc cttttgtata ctgcgcttat cttagactgc accctgcagc 17280
tatagccaga tgccagagga ctgggaaaca ggcaatttaa aactcaggat gctgactgct 17340
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<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (23228)..(23609)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
actgttggaa agacatcatt ggttttgaaa tctgaaaagg acgtgagatt tgggaaaggc 60
caggggaaga atgatatagt ttggctccat gtccccaccc aaacctcatc ttgaattgta 120
atccctgcat gttgaaggag gggcctggtg ggaggtgata ggatcattgg ggtggtttcc 180
cctgtgctgt gttctcatga tagtgaggga tttaaaagta gctgtttccc ctgcacatgc 240
acactctgtc tctcctatca ccttgtgaag aaggtgtctg cttcccctct gccttccatc 300
atgattataa gtttcctgag gcctccccag ccatgggtaa ccgtgggtca gttcaacctc 360
ttttgtttat aaattgccca gtctcaggta gtatctttac agcaatgtga aactgaacta 420
atacatctgg gaaattcttt ttctctcctt cctttctgaa ggacagcttt gcctgatatt 480
atattcctgg ttgccaggtt ttgtactttc agtactttga atatatcatc ccattctctc 540
agcctacatg atttctgctg agaaatccac tgataatctt atgaagcttc ccttgtatgt 600
gaagaattgc ttttctcttg cttctttgaa aattctctct ttgtcatggt gaggatctct 660
ttatatttaa tctattggag ttcttttggg cttcataaat ctggatgttt atttcattta 720
tgtctccaaa ttttgagagt tttctgttct tatttttaaa aataagtttc tgcaactttc 780
tctttctctg cttcttctgg aactcttgtc atgcatatta gttttcttaa cagtgtcctg 840
taatttttgt cagctttctg caatctttat cattcctttt attactctga ctgggtaatt 900
tcaaatgacc tgtatctgag tgtgctgatc ctttctcctg cttgatcaag tctgctgctg 960
aagatgtttg tgaatttttt caattcagtc attgtgttct tcagttcgag aatttctgtt 1020
tggttctttt tatggttcct atctatcttt ttgttgaact tctaattttg ctcatgtatt 1080
attttcctga ttttgtttac tgtctatcta tattgttttg tagctcactg agctttctta 1140
agataattat ttttaactct ttgtcatgca gtatagatct ccatttcttt agagtcgcct 1200
cctgctgctt tattttcttc ctttggtggt ttcttgtttc cctgattatt tgtgatcagt 1260
gtggccttgc attgaagtag gtacctattt cagtctttac atactagctt cagtagagga 1320
agccgttcac tagtcagatt gaccagagat tatgggtggg ctgtctgttg gggtctatgc 1380
acaggatttc tgttggagtt ctaaggtagg cagggctgga ttctgggttc attcattgtg 1440
gttgtctgta ttctgtgcac aaggactggc ttgaagcatg gatccttgag ggctgacttg 1500
gcactgaaat gagccttaag cctgagtctg caggggccag cctaacatgg ggatcaccta 1560
gcacctgagt tcatggggac agacctgttc ctgagtttat tcaggctgtc ctgggaccag 1620
ggtccactgg ggtgagccca gcatctgggt ccacatggcc aagatctctg gaggctgacc 1680
tggtgctgga tctgcagggg atggcctgaa ttctaggccc atgggtacca acttggagcc 1740
ttgggctgct ggggctaatg tggaggctag agtcttgggg gccaggctag agctggggca 1800
ggtctgaagt ctaggtcttc tgtggccacc ttggagtcta gacccccagg ggctgacctg 1860
gtctggggtg agcatggggc tgaggccaca gaggccagtc tggcctgtgg caggcctgaa 1920
tcctggtgcc ggggtttact ggagtgggct tggtgcttgg ggtctgtggt gaaggtgggt 1980
gctatcttaa ctgtctctct tccacgcaag agggtatctc tctccatgct gtgctgccca 2040
ggcttgaagg tggggtgaca ctggtaatgt gaaattgtcc ttcctatgca cttcaatgtg 2100
tcttttctta cttctgtgct gcaactgggt ggtacaacct ctcacctgat tcctgagctc 2160
tagtgaagtt attttcgtgc atggatactt attcaaattg atgtttctgc aagggatgag 2220
cactagaaac tcctgttctg acaaactcct attccggttc ttgctgacat cactccctga 2280
aatagttaat atacttaaca gctgaacacg gataggatgt tcacggaata tgttgacagg 2340
acaaaaagtt gaaactgttg gcagaaaccc aaagtcaata tcgaagccaa ggaaaacatt 2400
gcctgcggtg ccacattaga acagcttgaa gaccgttcat ttttaagtga caagagactc 2460
acctccaaga agcaattgtg tttgcaggta gcaaatttct attattctga ttgtttccaa 2520
agaaactata atttttaaag tatagttttt tactttatga gaaaattagt catttatatt 2580
ctaatttcct gagtatatag atagtagaga aggaactaat attcctttat gtagaaatat 2640
ttaaatgtaa gatgacttta aatcaaaaag aatacttgat tgatttaaaa tttttaattg 2700
ggctttaata ttttcagagg ttttctttac ttagggattt ttggactgac attattgcca 2760
ttatttatta attttctttt tgctcaaatc aagaggtttc ataactgttt aatctctctc 2820
tctaccaatt ccctttccaa cattactagc cacagagttt gccaatcaac aataaacaca 2880
acagtagtct ggaggtctca atttgtatct tgggaagcat tataaacttt ccaactccct 2940
agacacaaat gtagagaaaa aaccccttgt tttctatacc agaaactgtg tgctttgtct 3000
tgtaattcag acatttacaa gaaaatctgt atcaccttaa attaagattt atgttaaatg 3060
cagtctaaaa ccaacagagt tatgtattgt tttctttttt agaatgattt tattcaagca 3120
agcaacttat ttcatttcct tgtttgctac agtttcctgt ggtaagtgaa ttatctataa 3180
agcatgaaat tcaggctaag acaggagtag ccaagcaagt cgcaccacct ctggagaaag 3240
ctattgaaca tacagcttcg gggatggaga tagtccctga tgattcagga cacgtgtcta 3300
tttaatgttc cagaacaagt acgacttgtg agatatattg ctgtatacat acattgcaga 3360
ccagaggaag gagctcagaa gcgggaatgt cttgggactt gtgttaataa aaacttctgt 3420
tcacagatga cactctgcaa aacaaaactc aaaacaaaaa aattactcct ctatttttat 3480
caacattaaa aaattaaaca ttatctgaaa tttcaaaaga gtgctgggca ttatatagtg 3540
tctgggtcca atccaagtat ctgttaggta catgatacat agttttactc tggacagcca 3600
gggaaccatt tcaaaaatga aagtacctgg tttaaattta acttagcaaa ccaggcattt 3660
ggatagttct aggtgaataa ctttcaacac tagatttcga tctcatttct ctattaatat 3720
cattaatttt tggagaataa aaatgattct ggacatttca ttaatcgcta tagagggagt 3780
tttctctgtg tccccacaag gcatgattct gagtctatgg tgacttaaga gggccacata 3840
acaatgagta tttaactttc ctctcgtatg gctacaataa acgtctacag ggaaggttta 3900
cattcataaa gagactactt ttccaggaaa aaaggctttg attcccccta aatcacaact 3960
cccctgtgtc tgtccctcaa ccctgattgc ttttctaaac cgtaatttac caacccatgt 4020
gcaaacccac tgaaaactga aaaggagcat gagccaggga tactgtgaac cacggccacc 4080
tccaggtggt ttctcatttt ctgttttttt cttctggcaa aataaatcat gattatggct 4140
aggaaaatta aggatgtaaa taagcaaaaa actataaact acatattgca tgtagtcccc 4200
aaattcagaa gcagtcgttg ttaaacatct tttgtttagt ctttcagata tttttctaca 4260
tatgcctatt tgcacatttt acaaaaaaga gttattaact atggatactc tttgacttgc 4320
attttccact tacagctacc ttttggtgca aataaatgac attttttgga gcttgctatt 4380
ctctttttat ggtatgtttg tgtgcacatt cttatgcact tagttatttc tgtagaatac 4440
attttttgaa ataaaaatac tagattcaaa ggtatgaata ttttagaagg ttttatggtg 4500
tggcatcatg aaattatctt tcagaaaagt tactccctag ttgacttctt ctaccagcta 4560
ataagagtcc ttatttaccc cacttaggcc aacactaaca ggcttctgtt gctttgcatc 4620
ccgacatgtt tatctttctg gaaacagtat cctaatttat ttctgcagag ctactgcctc 4680
tcagttttgg tccatgtggt tctggtgacc ctgactcttc tgctgaacca ggaagtgcac 4740
acatcctgct gactgcagtg acccaatcag agccaacatc ttgcaatgaa gcgtttgttt 4800
agacgtctag aaataggact cttacttttt tttttccaat ttaacttgaa acataagaga 4860
atacagaggc ctgagctgct ggtcctattt tgctactatg tggagcttga gagtaatggt 4920
aacaccatga ctggagcaag cggaaggaga ctattgtcca ctgatgctat ccgttgagca 4980
caatgtgggg ttactcctta agccagagtc accatgggct ttttggctcc tgaaccaata 5040
gatttcattt gtattcaagc cactttgtac taggttttcc atcatttgca atcaaaacca 5100
gtatacaaat actggttatt taatttttca tttttactaa tctcatggaa aactggcttc 5160
tagttgtttt aacttgcctg tatttgtgat tcttcccatt ttcgtgtact tactaatcac 5220
ttctatttct tttgtaaatt atcttttcat atttgtccac taattcttta aaattagagt 5280
acttttcttc tccttattgt ttatgtaatt gttaaacaag actgaataac ctgcccaaaa 5340
tccgtggaca tgggagccca tgtgaaagct ttgaaagcca ccatcattat gagataaact 5400
atataacagt actttacata tgctccaaaa tacagtacag acacggctat cattgtcatg 5460
atcatgatca tcattatcag catgatcacc aacttaggag gataagcaag aacacctact 5520
agaagtttct ttccattcag caacaaagtt ggcgtttttc tagtcactcc cttccctgac 5580
tgagtcacat ggcaggtcac agaggctcaa tggcagaatg ggaagctctg ggccagcacc 5640
agccattgtg tgcatccttg cgtgtgaacc taggtgctgg aagaggagtg actgcttgat 5700
aattatgagt cagtcaaaac caccaactgt ctgacaaaac agacctcttt gtaacctgta 5760
ttgtcactaa accaatgcct ccatgctttg tgcatacatg aaatctaggc aatacacttg 5820
tattccccaa agcttccatt tgaagagatc tgtgctcttc ccaaatgtaa accttacccg 5880
agaggtggtc atctggccgc acctctgaga gggatagaag tcttgctgtg ttgggtggtc 5940
agactggggc tcagggccag aattcccagg gggtaggatt gtgcagagaa gatggcactc 6000
tccagtgctt aataaaatgc acgtggtcta agttgcccat tccctcaaag gcaataaaaa 6060
aataggtact atttaaattg aagagtaact actgccccag cgaatggaca ggttgtcatc 6120
ggaatagcca tggttaatgc cccagcgaat ggacaggttg tcatcggaat agccatggtt 6180
aatgccccag cgaatggaca ggttatcatc ggagtagcca tggttaatgg tcagttgact 6240
gactgaaatg aatatgctgg ctgaccagga aagctcatta agcagacttg gaagagagtc 6300
tttccaggta aatccacatt tacaaattaa agcagtaatg acacctaatt ctctaataat 6360
aggtggggtg cagtgtattt tagagctggg aataattcca aacagcaaat agttcaaaat 6420
ttattttcca tttagcatat gcatgcattt gcttaaacta tcttaaaaat gagtaaaaaa 6480
tattgtcagt ttgcttgaat catactgaga tgcggaacaa tatttagcac tgcatgctag 6540
aaaaggacac aggattggga gtcagggctg ggtgactgtc gcaggatttt cattaagtgt 6600
gtggatcttg ggcaagtctg tatgccctga gattcagtta tttaactttc tttcaaaaaa 6660
cctaatccag atgcagataa caaaacctgc ttctaacttc ccttacagaa ttgtgagaag 6720
ctggtggaga tgtttgtaac caaagtgttt tgaaaataga gcaaatatta ttctttttaa 6780
ggcatgatat tttcatagca tgtcaggcaa cagggaaaaa ctaagttagg attttatttt 6840
attgtgggta atttatgtgc aaattttggt gcaatttaat gaaaataagc caaagtttta 6900
atgcagaagt gcccagaaaa ttaaataaca atctacattg ttcaaatggt tgccttaata 6960
tattttattt tctcagcata attagaatta tattatacag gtcttggagt agtcagtcag 7020
tgggagaagt taagacaaca gatatctttt tgttaaaatt attatttgaa ttatctcaaa 7080
ttaactttta tggttctatc acaggatgtc tgactcaact atatgaaaac gccttcttca 7140
gaggtgggga tgtagcttcc atgtacaccc cgaacgccca gcactgccag atgatgtgca 7200
cattccaccc aaggtgtttg ctattcagtt ttcttccagc aagttccatc aatgacatgg 7260
agaaaaggta aaagttgata tttcattatt ggagaagcca tttttctaaa ctgaatcggt 7320
tttgtgcaaa gaggtgtagt ataactgaga gttctgtctc agacggggct caaggaccag 7380
cttcagcaaa atcccttcaa gtggttctta ccaatgcaga ttcctcggca acaacccaga 7440
tttgctgaac caaagtttct tgggactaga aattgcattt taaacaatca ctgtgtttat 7500
ttaaagtagt agaagttagt cattttctat tcaaagcctc aaaatgcttg aacatcgttg 7560
ggctaagaga ttgtctccag aaagcatcta acaggcgaac atttcatctg aataaagaaa 7620
cagacttaac tgtgtgaccc gtgatcacat tagtggctag cacagtccga aggaaataac 7680
gtaagacaag cattttgcgg agaatataat tgagaaacat ctagaacttg tgattttggg 7740
acagggcaga tctgaatgac gcctaaagtg agccagtttg ggcacctatg gcatgatgct 7800
atgtatggta tgtgtgtgtt catgtgtgct tgtgcttgtg tgaatatgta ttattaactg 7860
gagatttgta aaagtattgg aaaaatacta cttatgattt tttttttttt tgagatggag 7920
tcttgctttg taacccaggc tggagtgcag tggcacgatc ttggctcact gcaacttccg 7980
cctcccaggt tcaagcgatt ctcctgcctt agcctcccaa gtagctggga ttacaggcac 8040
gcaccactac atctggctaa tttttgtatt tttagtagag acggggtttc accatattgg 8100
ccaggctggc cttgaactcc tgaccttgtg atccacctgc ctctgcctcc taaagtgctg 8160
ggattacagg cgtgagccac cgcacccggc tgtaattaca atttttatta catcagagag 8220
atgcttatta atcacaagct acagtttcat cttaatgatt ttcattttga ataagaataa 8280
gcttttcttt gttcttccca tttccatatt cataactctt ttctcatctt ctccacgtga 8340
gtttgtgaac tagaaattgg atagtcattc tctgatccta catgttaaac ttgtagagaa 8400
aacccagatt gtatgtgagg atcatcatct taaaagtgga ggtaggttct agaattctta 8460
taaataatga aattaacatg gaggctgaca tttgagacag agggaagtct ttcattaagt 8520
gcagactaca aggagttaat aagcaagatg aacacacaat atacagatcc agctcttatc 8580
actaagttaa ttttttaagt aaatgaaagt atttgcaaaa ataattacca attaaggaca 8640
tagttgcctg aaggtttaag aatacaggaa aagtcattaa ctcttcaatg tggttgactt 8700
cctgtactta aaaaatgtga gtgtaaagaa aacgcaatgc tgaagttaaa tattatgggg 8760
atgttataaa attacctcta agagtgttct ttccagcaag ttttggggaa gctatattat 8820
ttcccttatt cctggtttta tgttagtgta tagaaaatgc tagacatttc ctcaatgtat 8880
gtttgttgtt ctacttccta aataaagcta cttttaaaac aggtttggct gcttcttgaa 8940
agatagtgtt acaggaacct tgccaaaagt acgtcgagca ggtgcaattt ctggacattc 9000
cttaaagcag tgtggtcatc aaataagtgg taagctgcga atttcttagc tacatttgag 9060
ttaatattga atctacctta gaacagcttt tgctaaaagt ctgtactgct acagcctttg 9120
ggaaggaatc actcataaag atagaagatg gggcagtatt ctggacacaa aagagggacc 9180
catattcatc tggacacttc tgttgtcttt atcaatcgac acgtatttaa tgagcctcta 9240
ttatttatga ggttagcact caagtgtaag atttgcagaa aatgaatcca aataatcgtg 9300
tctccttgtt tccagataag aatttttaag aaaacacgag ggaacatctc tctcaggttc 9360
acgtgagggt aatttttata tcagtgattc tcaactggca gtgatttttg tctcttccat 9420
taggggacat ttgacaatgt ctggagacac ttttggttgc tatgactagg gagggcgtta 9480
ttagcattta ctaagtagag gccagaatgc ctctctcatt tactaagaag aggccagaac 9540
gttcgaatgc tgctgcccaa ccttctacaa ggcacagagc agtcctccac agcaaataat 9600
cttctggccc aaaatgtcaa cagtgctgac atcaagaaac tctgatatac cattaggccc 9660
aaactgaaga actgggttct gcaaatcttg ctaagaataa tacttcttaa aggaaacttg 9720
aggactagga tgctagagaa ctttgatttt acatctgaag ctactgatgt cttgggaaat 9780
aatttccaac actatcctaa taaatttaag acaaatgaac tatttctcaa acatgactgg 9840
gactgatcag aaagtgagaa gtgctgaaaa gattcaactg atgggttgtc ggaatcttaa 9900
aatagctgtg ctgtgattct atgtgtgact atacatcata actattttat ttgtattatg 9960
cacaattaat tttgtaggtt caaatttcag atgtttttaa atttgtcatc ctttcctccc 10020
tcattgatat caccccttcg atacatacac actttgagcc tgctgtttgc atgttaacca 10080
gttatcaaag gatggcaaag cgttcgttat gaatatgggc ctgacttagc cagtgtaata 10140
agtgtagtct acctgaggtg gggtacattt cctgttttat aagaccaatg tgtatgttca 10200
tctaatttgg tataaagtat tcaaggaagt gctgtttcca attgttgtat cttatagcaa 10260
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gtctgcaaat tcctgtgttt aagaaccact gtgaataatc cacctcccta cccaattccc 10620
aattcgacat gcagttttcc tgacagtttg tatgttttct gtctttccca cccttaaatt 10680
tagttttatg acttcaacca cacttcttag gagtggaaag ttacctgtaa tagattatgg 10740
tttattccac ataatcttgg ggaataaaac tttaaaaaag tttatggttt agacttctgg 10800
tttacattac ttccttaacc aaaagtctaa ctaagaaatt tgaatattta aaaaaaaaaa 10860
gagcctaatt ttgcttcctt gtctgtgaaa agaattatct atatcttttg catgtaagac 10920
aaatctcagt gaaaagggtg cttaaataga agttaacact attttaaagc aagaatggaa 10980
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atggtggtga caaattttct tgaatcaata gccttagaag ttgggcagaa agcaaaaaag 28560
ttattcttgg tgctactcta tagaaagaga agacagaaaa agaaaaagat gtatttttaa 28620
agtctatatc cataacttta tttgaccaaa ctctaattta aaaattatgt ttcagaattc 28680
caaaaaccaa tatgcctacc ttccaaaggt gacacaaaca caatttatac caactgttgg 28740
gtaactggat ggggcttctc gaaggaaaaa ggtacagcat gatgctttaa atattgcttc 28800
tagagtaagt cttacatgtt gagatgcatg gagtgggtcg ttttaatcgg cttctctctg 28860
aaattatatc gaaccccttt atctttccta cctatttatt ccccaatatt tattcagtta 28920
ttcttaaaaa acgtattttt gctttggctt gaaaaaaaaa ttttagggag aattttaagc 28980
atcttacttc attctaaaga tcgtttgctt gacttcgcat gaaagattgt ccccatctaa 29040
ggctgacgag cccgtgcaag accatctggt cctcagtgtt agcagcattc ccatctccca 29100
ataccatgtt ctcccttgat gctaatggcc gggagcacag gcaggcgtgt cgcctctctc 29160
tgtggccagt tcttcatctt cttcttccag gcacccttcc tgcaatctga ggaagcctag 29220
gaaccacttc tctaacaatg cttttaaatg cttaaataaa atacacagga ttacaaaaga 29280
aaccaagtga agtgcaagac agttctcaaa atactttcaa aaagtactac aataatatat 29340
atgcctcttt attaatcctc tacatagcga gttattctaa taccaaacct acttttgaaa 29400
tagtggtgag cataaatggc attttcactt atctgccaca acagaaaagg gatatgaaaa 29460
tatctgtaat ctctgttgat ggcaaagtca taggtgccac tgatactgct gtgtttgttg 29520
tctgcattcg taatcgaagg gagtggtagg cttcatctgg aggtttgtga aaacaaagac 29580
tttttttcta cacaaattta taagccatgt gaattctttc tgaggacctt aggtttgcaa 29640
ttcctacttg tgggtatctg gagtgttcca atcgtccttg aactttttaa aaaacagacc 29700
agtctccctt tccaaaatta tgttcctgat agacactatg gagaataata tctgtgtcat 29760
tctttacaga agaaggtagc ttgccaaact ctctccatct ttcccgattc agtccttagt 29820
tcaagtgatt cacattttta gattttttac tggtaatctg agacaagaag aaattaaaag 29880
taatcttcac taagcaacga aagctcccaa cactgtcctc cccatgagag atgctcgctt 29940
gcatttactc agaaacaaaa gaccccaaga cccctctgtc gcgaaagctc ggagggcttt 30000
tcagaaacga tagggctttc aattataatt tggaatatat gaaacaaaaa aatgaaaagt 30060
gagaacttcc aggctttgga tttttgtaga tgataaatat aaaatgggat ttctggggga 30120
ctgttaccga gatgagggga tggaagaaga cacggaagca aggtctctgg tcagcccagg 30180
gtgctgggct tgtcccaaca ccacacaggt aataagagga cagtgcaggg ctccgtgtct 30240
ctctctctct ctctctctct gtgtgtgtgt gtgtgtgtaa cactaccttc ctaattttta 30300
ctatttgtat tcaaagatac ggcccttata aaaaagtaca ctgctctgat tcacttgaaa 30360
acttatttcc atatttacta tttattgtgt ttcctccctc tgaagttata tattggttac 30420
ttcacaggtg aaatccaaga tattctacaa aaggtaaata ttcctttggt aacaaatgaa 30480
gaatgccaga aaagatatca agattataaa ataacccaac ggatggtctg tgctggctat 30540
aaagaagggg gaaaagatgc ttgtaaggta atgcatgaga ttatgaaaaa cacaataggc 30600
tgcttgagaa aattcacttc aaaatatatt ttccaatagc ataatttatt atagttttta 30660
aaaaaaattc agagacaaat gatctgataa atttataagc aacttttaac aaattgaata 30720
tatacaatac atatttatat tattcatgat gtatgtcaca atctatgcat gtgctaattt 30780
aagagggaca aaaatacata caataattgc actaaaatat aaaaacatta gatttctttg 30840
tcattgggat gatgatatca agatttcttt gttagattta tttaagaatt gaagagggga 30900
tacaaaaaat gcaggcacat gagatacttg gagaacttta agaaagtttg tgtgtgtgtg 30960
tgtgtgtatg tgtatgtgtg tgttgctgtg tagtggacta cagaatttta gaggtggtca 31020
cttatttgag tcccattgtc ataactttct accattttat ttttcccctg tgactcaggg 31080
agattcaggg ggtcccttag cttgcaaaca caatggaatg tggcgtttgg tgggcatcac 31140
cagctggggc gaaggctgtg cccgcaggga gcaacctggt gtctacacca aagtcgctga 31200
gtacatggac tggattttag agaaaacaca gagcagtgat ggaaacgctc ggatgcaggc 31260
gccagcatga ggagcagccc agagtcttgg cgagttttac aacctgggtt caagtcaaat 31320
tctgagcctg ggggtcctca tctgcaaagc atggagagtg gcatctactt tgcatcctgt 31380
cataaggaca aaagacagtg cactcagagc tgctgaggac aatgttttgc tgaagccagc 31440
tttcagcatt cagtaactgg gagctgataa tgtgaagtcg caaccgagat ctccatgatt 31500
gtgtgtcgta aaataaaatg gtaaaagatc acaattagca agtgttttct tctggttgtg 31560
aaacagaact gaaagtaagt ggttgaggtt ctagcacagt gcctggactc cctctaattg 31620
cactacttct tctggaactc agtctatctc aaagatgtaa tttcctctcc ttgctgcacc 31680
tggttagcca ctgaaaccca cgattgtctg cttcacttgt ggcaaagagc tagcaggctt 31740
gggttctgtt ctgccgagtg gaagggagaa cacctgcgtc acacccactc ttataagaaa 31800
gagatgggtt acctgaaccc atagggtata tttgcctctt ggcctcctaa ctttgctact 31860
ggggcatgga taggagggtc caggctgcgt gtgtggagga actcgagggg ctgcagcatt 31920
gcacagcctt catggtaggc aaggaatctg ctttgcaagg ggcattagcc ctggaggctc 31980
agtggatatg ggctattgca atactaattc aaggagcatt tttaggatgg cacattggct 32040
catgcctgta attccaacaa tttgggagat cacggcaggt ggatctcttg agcctaggag 32100
ttcaagacca gcctgggcaa tgtgacaaaa ccccatctct acaaaaatta gctgggcgtg 32160
gtggtgcata cctgtaatcc cagctccccc agaagctgag gcaggaggat cacttgagtg 32220
tggctgcagt gagcagagat cgcactactg cattccagcc tggacgacag agtgagactc 32280
tgtctcaaaa aaaaaaggaa gcattgttag gtataaatta ctattattta tttatttatt 32340
tttgaaagga gtctcgctct gtcacccagg ctgcagtgca gtggcgccat ctcggctcac 32400
tgcaagctcc gcctcccagg ttcacagcat tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg 32460
attataggtg cccgccacca cgcctggcta attttttgta tttttagtag aaacggggtt 32520
tcactgtgtt ggccaggatg gtctcgatct cctgactttg tgatccacct gccttggcct 32580
cccaaagtgc tgggattaca gacttgaacc accatgcccg gccctgttag gtataaacta 32640
tttcataaaa ttcagacttg taaatttatc atagccttta gaatggatga tagaaatcct 32700
tatgccacac aaattcctca tatgccaggg ctcaccataa ctgataccag ctcacttgat 32760
tcagctcagt ttaacattta cacagaattg gccatttaca aaatcttaca taagttaagt 32820
agaaaaatag aaaagtgagg ttttctgaaa gagtttgggt ttttccttca atgctcaaca 32880
acagaggtcc ccaatctttc tggcaccaga gaccagtttt gtgcaagaca ctttttccat 32940
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g 33001
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<223> Primer
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<223> Probe
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cacgcaaaca tttcacaagg cagagtacc 29
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<223> Primer
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cctgtgtgga gggtcactca 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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ccactataga tgcgccaaac atc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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aacggtcttc aagctgttct 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 31
aaatgaacgg tcttcaagct 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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cttaaaaatg aacggtcttc 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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tgtcacttaa aaatgaacgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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tggaggtgag tctcttgtca 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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cttcttggag gtgagtctct 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 42
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 45
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 46
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 94
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 110
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 115
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 140
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<210> 141
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 142
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 142
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 159
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 161
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 162
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 163
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 167
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 168
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 170
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 172
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<210> 173
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 173
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<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 174
ctgctctgtg ttttctctaa 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 175
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 176
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<210> 177
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 177
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<210> 178
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 178
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 179
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 180
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 181
agcagctctg agtgcactgt 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 182
tcctcagcag ctctgagtgc 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 183
cattgtcctc agcagctctg 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 184
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<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 186
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 187
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<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 188
aggcacagag ccagcaccca 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 190
ccaggtgtgg acagcagctg 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 191
ggttttgttt gtaaaattag 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 192
aaaacaccat taaatccatt 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 193
acagaaacca tgatgttgct 20
<210> 194
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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tcagcccaat gtcctaacct 20
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 196
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 401
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 402
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 406
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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gcatctggag tgagaaccct 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 809
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 829
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 830
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 855
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 887
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 894
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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aacagtatca ctgtactagt 20
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<211> 20
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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taacagtatc actgtactag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 907
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<211> 20
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<213> Artificial sequence
<220>
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1113
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1114
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1153
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ggtggtggga ttggtgctga 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1199
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1200
gattggtggc gggatcggtg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ggattggtgg cgggatcggt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1208
gggtatcttc actgttccag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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cgtcatgctt acctttctcc 20
<210> 1210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1210
gccctccgag ctttggcaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1211
gcagcccccc agaaatccca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 20
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1213
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1214
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1215
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1216
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1252
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1257
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1258
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1260
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1264
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1272
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1282
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1288
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<213> Artificial sequence
<220>
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1294
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1295
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1296
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1297
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1299
tatatcactg tcctata 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1300
tatcactgtc ctatatc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1301
gtatcactgt cctatat 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1302
agtatcactg tcctata 17
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1304
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1306
ctataacagt atcactg 17
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1308
tcctataact ataacag 17
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1309
cctataacta taacaat 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1310
gtaacagtat cactgta 17
<210> 1311
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1311
ataacagtat cactgta 17
<210> 1312
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1312
gtcctataac tataaca 17
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1512
tcattgattg aacttg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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caaacctttt ctccat 16
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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gcaaccaaac cttttc 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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agcaaccaaa cctttt 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1517
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1518
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1519
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1520
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1521
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1524
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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tgtgtcccat acgcaa 16
<210> 1616
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ttgtgtccca tacgca 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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cttgtgtccc atacgc 16
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1619
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1697
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1702
cctcgcattg tcagcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1703
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1704
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1705
cgacctcgca ttgtca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1706
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1707
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1708
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1710
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1713
ctcagttgcg acctcg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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tctcagttgc gacctc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1715
atctcagttg cgacct 16
<210> 1716
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1716
gatctcagtt gcgacc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1717
agatctcagt tgcgac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1718
gagatctcag ttgcga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1719
ggagatctca gttgcg 16
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1882
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1884
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1892
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1896
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1899
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1900
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<210> 1901
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1901
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<210> 1902
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1902
tggctaagtc aggccc 16
<210> 1903
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1903
tgtactccac ctcacg 16
<210> 1904
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1904
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<210> 1905
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1905
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<210> 1906
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1910
gatacctttc cactcc 16
<210> 1911
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1911
tccccaagat tatgtg 16
<210> 1912
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1912
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<210> 1913
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1913
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<210> 1914
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1914
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<210> 1915
<211> 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1916
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1920
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1920
caactataac agtatc 16
<210> 1921
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ctataccacg gtaact 16
<210> 1922
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1922
cctatatcac tgtaac 16
<210> 1923
<211> 16
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1924
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1925
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1926
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1966
<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1966
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1976
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1982
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1982
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1983
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<210> 1984
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1984
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 1986
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1986
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1991
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1992
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<210> 1993
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1993
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<210> 1994
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1994
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2000
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2001
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<210> 2002
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2002
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<210> 2003
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2003
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<210> 2004
<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2004
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<210> 2005
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2005
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<210> 2006
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2006
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<210> 2007
<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2007
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<210> 2008
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2008
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<210> 2009
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2009
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<210> 2010
<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2010
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<210> 2011
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2011
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<210> 2012
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2012
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<210> 2013
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2013
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<210> 2014
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2014
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<210> 2015
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2015
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<210> 2016
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 2017
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 2018
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2018
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<210> 2019
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<210> 2020
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2020
gagactgaag ccctca 16
<210> 2021
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2021
cactgcctag aaaggc 16
<210> 2022
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2022
tgtagtatcc agagta 16
<210> 2023
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2023
agatgacctg cagatg 16
<210> 2024
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2024
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<211> 16
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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cagtatcact gtccta 16
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cctataacta taacag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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tacctataac tctaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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actgtaccta taactc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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tatcactgta cctata 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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acaatatcac tgtacc 16
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aacaatatca ctgtac 16
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ctataacagt atcacc 16
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2162
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2174
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2175
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2180
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2181
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2182
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2183
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2185
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2186
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<211> 16
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2187
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2188
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2189
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2192
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2193
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2194
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2195
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2196
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2197
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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tgcttaaaag tctccc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2200
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2201
gcgggtggtc ttgcac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2202
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2203
tctccatagt gagacg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2204
tggcaagcta ccttct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2205
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2206
aatgcaggcc agcatc 16
<210> 2207
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2207
gaaaagccct ccgagc 16
<210> 2208
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2208
caacaatcca aagcct 16
<210> 2209
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2209
ccccccagaa atccca 16
<210> 2210
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2210
gaccttgctt ccatgt 16
<210> 2211
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2211
gagagacggc accctg 16
<210> 2212
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2212
gggaaggtag tgttac 16
<210> 2213
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2213
gtgaatcaga gcagtg 16
<210> 2214
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2214
tcacctgtga gtaacc 16
<210> 2215
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2215
gagttacctt acaagc 16
<210> 2216
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2216
tctcaagcag cctatt 16
<210> 2217
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2217
gcccctctta aatagc 16
<210> 2218
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2218
gatatcatca tcccaa 16
<210> 2219
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2219
gtatcccctt ttctat 16
<210> 2220
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2220
agtatctcat gtgcct 16
<210> 2221
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2221
caagaccttg cttgcc 16
<210> 2222
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2222
tagtccacta cacagc 16
<210> 2223
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2223
acgacaatgg gattca 16
<210> 2224
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2224
gaatctccct gagtca 16
<210> 2225
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2225
tagagggatc ccagga 16
<210> 2226
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2226
ccaggtgcag cacgga 16
<210> 2227
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2227
gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27
<210> 2228
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2228
tgcctgctgt tcagctttct c 21
<210> 2229
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2229
tggcaaagtc cctgtaatgc t 21
<210> 2230
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2230
cgtgactcca cccaaagaga caaataaacg 30
<210> 2231
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2231
acaagtgcat tttacagacc agagtac 27
<210> 2232
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2232
ggttgtccgc tgactttatg ct 22
<210> 2233
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2233
aagcacagtg caagcggaac accc 24
<210> 2234
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2234
gagtccccca gagcctacag t 21
<210> 2235
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2235
tgtcatttgt tattgtgatg gctaca 26
<210> 2236
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2236
ctgccctcta cctggccaac aacca 25
<210> 2237
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2237
acaagtgcat tttacagacc agagtac 27
<210> 2238
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2238
ggttgtccgc tgactttatg ct 22
<210> 2239
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2239
aagcacagtg caagcggaac accc 24
<210> 2240
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2240
agacccattt cctcaaggta gaact 25
<210> 2241
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2241
cgcagcgacg ctcatg 16
<210> 2242
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2242
tctttgggtc cagtggcacc ctctt 25
<210> 2243
<211> 1837
<212> DNA
<213> mus musculus
<400> 2243
actgattctc tgcgactgtc tgctcagtct gtcctgaagc tgcctagtga ccaagaactt 60
ggaccaggac gcagctgaca tcgctgccca gatggcctcc aggctgaccc cactgaccct 120
cctgctgctg ctgctggctg gggatagagc cttctcagat cccgaagcta ccagccacag 180
cacccaggat ccactggagg ctcaagcgaa aagcagagag agcttccctg aaagagatga 240
ctcctggagt cccccagagc ctacagtact gccctctacc tggccaacaa ccagtgtagc 300
catcacaata acaaatgaca ccatgggtaa agtagccaac gagtccttca gccagcacag 360
ccagccagct gctcagctac ccacagattc tccaggacag ccccctctga attcttccag 420
ccagccctcc actgcctcag atcttcccac ccaggctact actgaaccct tctgcccgga 480
gccgcttgct cagtgctctg attcagacag agactcctca gaggcaaagc tctcagaggc 540
tttgacagat ttctctgtga agctctacca cgccttctca gctaccaaga tggctaagac 600
caacatggcc ttttccccat tcagcattgc cagcctcctc acacaggttc ttcttggggc 660
tggagacagc accaagagca acttggagag catcctttcc taccccaagg attttgcctg 720
tgtccaccaa gcactaaagg gcttttcatc caaaggtgtc acttctgtgt ctcagatttt 780
ccacagccca gatctggcca taagggacac ctatgtgaat gcatctcaga gcctgtatgg 840
aagcagcccc agagtcctgg gcccagacag tgctgctaac ttagaactca tcaacacctg 900
ggtggctgag aacaccaacc ataagatccg caagctgctg gacagcctgc cttctgacac 960
ctgcctcgtc cttctcaatg ctgtctactt gagtgccaag tggaagataa catttgaacc 1020
aaaaaagatg atggcgcctt tcttctacaa aaactctatg attaaagtgc ccatgatgag 1080
tagcgtaaag taccctgtgg cccaattcga tgaccatact ttgaaggcca aggtgggaca 1140
gctgcagctc tctcacaacc tgagctttgt gatcgtggta cccgtgttcc caaagcacca 1200
acttaaagat gtagaaaagg ctctcaaccc cactgtcttc aaggccatca tgaagaagct 1260
ggagctgtcc aaattcctgc ccacttacct gacgatgcct catataaaag taaagagcag 1320
ccaagacatg ctgtcagtca tggagaaact ggaattcttt gacttcactt acgatctcaa 1380
cctgtgcggg ctgaccgagg acccagatct tcaggtgtct gccatgaaac acgagacagt 1440
gctggaactg acagagtcag gggtggaagc agctgcagcc tctgccatct cctttggccg 1500
aagcttaccc atctttgagg tgcagcgacc tttcctcttc ctgctctggg accagcaaca 1560
caggttccca gtcttcatgg gtcgtgtata tgaccccagg ggttgagaca ggcttgggta 1620
aacattgtca cccaagcttc agctcctccg gttatttcct tgccactgcc tgcccgagcc 1680
acttcaagcc ttaggaactg gcagacggaa ctgtttccat ccaccaaccc ccagggtatc 1740
aaccactttt ttgcagcttt tacggttcaa acctatcaaa ctctacaaat aaaacttgca 1800
gacattttct tctctcacta aaaaaaaaaa aaaaaaa 1837
<210> 2244
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2244
ggcatattgg tttttggaat 20
<210> 2245
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2245
aaagtggttg ataccctggg 20
<210> 2246
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2246
ccttccctga aggttcctcc 20
<210> 2247
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2247
gcatgggaca gagatggtgc 20
<210> 2248
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2248
agcttcttgt ccagctttat 20
<210> 2249
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2249
agcttcttgt ccagctttat a 21
<210> 2250
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2250
tcagtcatga cttc 14
<210> 2251
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2251
tcagtcatga cttca 15
<210> 2252
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2252
gctgattaga gagaggtccc 20
<210> 2253
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2253
tcccatttca ggagacctgg 20
<210> 2254
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2254
atcagtcatg acttc 15
<210> 2255
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2255
cggtgcaagg cttaggaatt 20
<210> 2256
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2256
gcttcagtca tgacttcctt 20
<210> 2257
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2257
gcttcagtca tgacttcctt a 21
<210> 2258
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2258
agcttcagtc atgacttcct t 21
<210> 2259
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2259
tggtaatcca ctttcagagg 20
<210> 2260
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2260
tggtaatcca ctttcagagg a 21
<210> 2261
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2261
tgcttcagtc atgacttcct t 21
<210> 2262
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2262
cactgatttt tgcccaggat 20
<210> 2263
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2263
cactgatttt tgcccaggat a 21
<210> 2264
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2264
aagcttcttg tccagcttta t 21
<210> 2265
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2265
acccaattca gaaggaagga 20
<210> 2266
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2266
acccaattca gaaggaagga a 21
<210> 2267
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2267
aacccaattc agaaggaagg a 21
<210> 2268
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2268
atggtaatcc actttcagag g 21
<210> 2269
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2269
tcttggttac atgaaatccc 20
<210> 2270
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2270
tcttggttac atgaaatccc a 21
<210> 2271
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2271
attcactttc ataatgctgg 20
<210> 2272
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2272
attcactttc ataatgctgg a 21
<210> 2273
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2273
atcttggtta catgaaatcc c 21
<210> 2274
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2274
atgcatggtg atgcttctga 20
<210> 2275
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2275
cagctttatt agggacagca 20
<210> 2276
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2276
cagctttatt agggacagca a 21
<210> 2277
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2277
acagctttat tagggacagc a 21
<210> 2278
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2278
ttcagtcatg acttcc 16
<210> 2279
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Bases at these positions are RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(18)
<223> Bases at these positions are RNA
<400> 2279
gcuucagtca tgactucc 18
<210> 2280
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2280
tgctccgttg gtgcttgttc a 21
<210> 2281
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2281
tgctccgttg gtgcttgttc 20
Claims (219)
- 하기 화학식: GalNAc3-7a-o' Tes Ges mCeo Aeo Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aeo Aeo Aes mCes Ae (서열번호: 570)에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로, 여기서,
A는 아데닌 핵염기이고,
mC는 5-메틸시토신 핵염기이며,
G는 구아닌 핵염기이고,
T는 티민 핵염기이며,
e는 2'-O(CH2)2OCH3 푸라노실 당 모이어티이고,
d는 2'-데옥시푸라노실 당 모이어티이며,
o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결이고,
s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이며,
GalNAc3-7a-o'는 하기 화학 구조:
이고, 여기서, 절단가능 모이어티(CM)는 5'-P(OH)(=O)-O-3'인, 화합물. - 제1항에 있어서, 콘주게이트 기가 변형된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드의 5'-하이드록실 그룹의 5'-산소 원자에서 부착되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 기로 이루어진 화합물.
- 제2항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드 및 콘주게이트 기로 이루어진 화합물.
- 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 나트륨 염인 화합물.
- 제2항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 나트륨 염인 화합물.
- 제3항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 나트륨 염인 화합물.
- 제4항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 나트륨 염인 화합물.
- 화합물의 음이온 형태가 하기 화학 구조를 갖는 것인 화합물.
(서열번호: 570)
- 제9항에 있어서, 화합물이 염이고, 상기 염의 양이온이 나트륨인 화합물.
- 하기 화학 구조에 따른 화합물 또는 그의 염.
(서열번호: 570)
- 제11항에 있어서, 나트륨 염 또는 칼륨 염인 화합물.
- 부종, 종창, 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 및 경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 부종인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 부종이 황반 부종인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 부종이 눈의 부종인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 부종이 뇌 부종인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 부종이 혈관부종인 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 혈관부종이 유전성 혈관부종(HAE)인 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 혈관부종이 눈꺼풀의 혈관부종인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 종창인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 혈전증인 약제학적 조성물.
- 제22항에 있어서, 혈전증이 심부정맥혈전증인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 색전증인 약제학적 조성물.
- 제24항에 있어서, 색전증이 폐색전증인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 혈전색전증인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, PKK와 연관된 질환, 장애 또는 병태가 경색인 약제학적 조성물.
- 제27항에 있어서, 경색이 심근경색증 또는 뇌졸중인 약제학적 조성물.
- 염증성 질환, 장애 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 희석제가 인산염 완충 식염수(PBS)인 약제학적 조성물.
- 제31항에 있어서, 본질적으로 상기 화합물 및 PBS로 이루어진 약제학적 조성물.
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