JP6137834B2 - ｓｉＲＮＡの標的化送達のための組成物 - Google Patents

Description

ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接拡散を妨げる。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は、細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。

インビボで小さい核酸を送達するために用いられてきた1つの手段は、核酸を小さい標的化分子または脂質もしくはステロールのいずれかに結合することであった。これらの結合体でいくらかの送達および活性が観察されたが、これらの方法により必要とされる核酸用量は極端に大きい。

インビトロでポリヌクレオチドの細胞への適度に効率的な送達を達成する多くの形質移入試薬が開発されている。しかし、これらの同じ形質移入試薬を用いてのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、血清相互作用、および不良な標的化により複雑で無効となっている。インビトロで良好にはたらく形質移入試薬、カチオンポリマーおよび脂質は、典型的には大きい静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロ形質移入試薬の正電荷は電荷-電荷（静電）相互作用を介して核酸との結合を促進し、したがって核酸/形質移入試薬複合体を形成する。正電荷は媒体の細胞への非特異的結合、および膜融合、不安定化、または破壊のためにも有益である。膜の不安定化は実質的に細胞膜不透過性ポリヌクレオチドの細胞膜を通過しての送達を促進する。これらの特性はインビトロでの核酸移動を促進するが、これらはインビボで毒性および無効な標的化を引き起こす。カチオン電荷は血清成分との相互作用をもたらし、これはポリヌクレオチド-形質移入試薬相互作用の不安定化ならびに不良なバイオアベイラビリティおよび標的化を引き起こす。インビトロでは有効でありうる、形質移入試薬の膜活性は、インビボでは毒性につながることが多い。

インビボ送達のために、媒体（核酸および関連する送達物質）は小さい、直径100nm未満、好ましくは50nm未満であるべきである。さらにより小さい複合体、20nm未満または10nm未満がより有用であろう。100nmよりも大きい送達媒体はインビボで血管細胞以外の細胞にほとんど接近できない。静電相互作用により形成された複合体は、生理的塩濃度または血清成分に曝露されると凝集または分解する傾向にある。さらに、インビボ送達媒体上のカチオン電荷は有害な血清相互作用と、したがって不良なバイオアベイラビリティにつながる。面白いことに、高い負の電荷も、標的化に必須の相互作用を妨害することにより、インビボ送達を阻害しうる。したがって、インビボでの分布および標的化のために、中性に近い媒体が望ましい。注意深く調節しなければ、膜破壊または不安定化活性はインビボで用いると毒性である。媒体毒性と核酸送達との釣り合いを取ることは、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。

Rozemaらは、米国特許公報第20040162260号（特許文献1）で、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を示した。膜活性ポリアミンにより細胞膜を破壊する手段が提供された。pH依存性の可逆的調節により、標的細胞のエンドソームに対する活性を制限し、したがって毒性を制限する手段が提供された。彼らの方法は、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸によるポリアミン上のアミンの修飾に頼るものであった。

この修飾は、一級アミンの一対のカルボキシル基（βカルボキシルおよびγカルボキシル）への変換を介してポリカチオンをポリアニオンに変換し、ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害した。Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）（非特許文献1）は、βカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さず、それ自体では膜活性を阻害することができないと報告した。有効な膜活性阻害のためにはγカルボキシル基の追加が必須であると報告された。核酸と送達媒体の同時送達を可能にするために、核酸が送達ポリマーに共有結合された。彼らはその生物学的に不安定な結合体送達システムを用いて、インビトロでポリヌクレオチドの細胞への送達を示すことができた。しかし、媒体は高度に負に荷電しているため、高い負電荷密度を有する核酸および修飾ポリマーのいずれでも、この系はインビボ送達のために効率的ではなかった。負電荷は細網内皮系（RES）による細胞特異的標的化を阻害し、非特異的取り込みを増強する可能性がある。同様に、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸修飾ポリマーを用いて、Rozemaらは核酸、ポリカチオン、および2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸修飾ポリマーの小さい三元静電複合体の形成を示した。

Rozemaらは、米国特許公報第20080152661号（特許文献2）で、修飾膜活性ポリマーの高い負電荷密度を除去することにより、米国特許公報第20040162260号（特許文献1）の方法を改善した。2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のγカルボキシルの代わりに中性親水性標的化（ガラクトース）および立体安定化（PEG）基を用いることにより、Rozemaらは全般的水溶性および膜活性の可逆的阻害を保持する一方で、有効なインビボ肝実質細胞標的化を組み込むことができた。前と同様、ポリヌクレオチドが形質移入ポリマーに共有結合された。ポリヌクレオチドの形質移入ポリマーへの共有結合は、ポリヌクレオチドの形質移入ポリマーからの解離を防止することにより、インビボ投与中のポリヌクレオチドと形質移入ポリマーとの標的細胞への同時送達を確実にするために維持された。形質移入ポリマーは細胞外またはエンドサイトーシス区画内のいずれかからの細胞膜を通過してのポリヌクレオチドの細胞質への輸送を提供するため、ポリヌクレオチドと形質移入ポリマーとの同時送達が必要とされる。米国特許公報第20080152661号（特許文献2）は、この新しい改善された生理的反応性ポリ結合体を用いての、インビボでのポリヌクレオチド、具体的にはRNAiオリゴヌクレオチドの肝細胞への非常に効率的な送達を示した。

しかし、核酸のポリアミンへの共有結合は固有の制限を有する。核酸およびマスキング剤の両方を結合するための形質移入ポリマーの修飾は、電荷相互作用によって複雑になる。負に荷電した核酸の正に荷電したポリマーへの結合は凝集を起こしやすく、それにより混合物の濃度が制限される。凝集は過剰のポリカチオンまたはポリアニオンの存在によって克服することができる。しかし、この解決法は核酸とポリマーを製剤しうる比を制限する。同様に、負に荷電した核酸の非修飾カチオンポリマーへの結合は複合体の凝縮および凝集を引き起こし、ポリマー修飾を阻害する。負のポリマーを形成する、ポリマーの修飾は、核酸の結合を損なう。

米国特許公報第20040162260号 米国特許公報第20080152661号

Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）

好ましい態様において、本発明はインビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）を標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリアミン（送達ポリマー）および少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合されているRNA干渉ポリヌクレオチド（RNA結合体）を含む組成物を特徴とする。送達ポリマーおよびsiRNA結合体を別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。RNA干渉ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。

好ましい態様において、本発明はインビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリアミン（送達ポリマー）および三価ガラクトサミンに結合されているRNA干渉ポリヌクレオチド（RNA結合体）を含む組成物を特徴とする。送達ポリマーおよびsiRNA結合体を別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。RNA干渉ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。

一つの態様において、膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマーおよび低級疎水性基含有モノマーのランダム重合により生成した両親媒性ポリマーを含む。アミン含有モノマーは、一級アミンおよび二級アミンからなる群より選択されるアミン側基を含む。低級疎水性モノマーは、1〜6個の炭素原子を有する疎水性側基を含む。アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するよう選択され、好ましくは疎水性モノマー1つにつき≧1のアミンモノマーである。一つの態様において、ポリマーは60〜80％のアミンモノマーを有することになる。疎水性基はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択されてもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む置換またはヘテロ原子が認められることもある。特に適切な膜活性ポリアミンはポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを含む。

一つの態様において、膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、低級疎水性モノマー、および高級疎水性モノマーのランダム重合により生成した両親媒性ポリマーを含む。アミン含有モノマーは、一級アミンおよび二級アミンからなる群より選択されるアミン側基を含む。低級疎水性モノマーは、1〜6個の炭素原子を有する疎水性側基を含む。高級疎水性モノマーは、12〜36個以上の炭素原子を有する疎水性側基を含む。アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するよう選択され、好ましくは疎水性モノマー1つにつき≧1のアミンモノマーである。一つの態様において、ポリマーは60〜80％のアミンモノマーを有することになる。疎水性基はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択されてもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む置換またはヘテロ原子が認められることもある。特に適切な膜活性ポリアミンはポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムターポリマーを含む。

好ましい態様において、可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、ポリマー上のアミンのマスキング剤との反応により可逆的に修飾した本発明の膜活性ポリアミンを含む。修飾基の切断がアミンを復旧する場合、アミンは可逆的に修飾されている。膜活性ポリアミンの可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する。好ましくは、マスキング剤は標的化機能および/または血清相互作用回避機能も提供する。ポリマーアミンのマスキング剤による修飾は、好ましくはアミンの電荷の中和もする。好ましいマスキング剤は二置換無水マレイン酸アミン反応性基を有するガラクトサミンもしくはガラクトサミン誘導体またはポリエチレングリコールを含む。無水物のアミンとの反応は、アミンを可逆的に修飾してマレアマートまたはマレアミド酸を生成する。マスクした状態で、可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは膜破壊活性を示さない。膜活性を阻害し、細胞標的化機能を提供する、すなわち可逆的にマスクした膜活性ポリマーを生成するために、アミン上のアミンの50％よりも多く、55％よりも多く、60％よりも多く、65％よりも多く、70％よりも多く、75％よりも多く、または80％よりも多くのマスキング剤による可逆的修飾が必要とされることもある。記載する膜活性ポリアミンの膜活性阻害および/またはインビボ標的化は、ポリマーアミンの＞50％の修飾を必要とする。

好ましいマスキング剤は中性親水性置換アルキル無水マレイン酸を含む：

式中、R1は標的化部分または立体安定化部分を含む。置換アルキル無水マレイン酸の例は、2-プロピオン酸-3-アルキル無水マレイン酸誘導体からなる。中性親水性2-プロピオン酸-3-アルキル無水マレイン酸誘導体は、中性親水性基の2-プロピオン酸-3-アルキル無水マレイン酸への2-プロピオン酸-3-アルキル無水マレイン酸γカルボキシル基を通じての結合により生成する。一つの態様において、アルキル基はメチル基からなる。

好ましいマスキング剤は、細胞表面受容体に対する親和性を通じて標的化機能を提供し、すなわち、マスキング剤は細胞表面受容体のリガンドを含む。好ましいマスキング剤は、ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミンおよびガラクトース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない、ASGPrに対する親和性を有する糖類を含む。ASGPrに対する親和性を有するガラクトース誘導体は当技術分野において周知である。可逆的に修飾した膜活性ポリアミンの基本的特徴は、ポリマーに結合したマスキング剤の少なくともいくつか、および多ければすべては細胞標的化機能を提供することである。もう一つの好ましいマスキング剤は、可逆的に修飾したポリマーと血清成分または非標的細胞との間の非特異的相互作用の阻害を通じて、およびポリマーの凝集を低減することにより、改善された生体分布を提供する。立体安定化部分を有する好ましいマスキング剤には、ポリエチレングリコールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。一つの態様において、標的化および立体安定化マスキング剤の組み合わせを用いる。

RNAiポリヌクレオチド結合体および送達ポリマーを薬学的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与する。一つの態様において、哺乳動物への投与前に送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を溶液中で混合してもよい。もう一つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を別々の溶液中で哺乳動物に同時投与してもよい。さらにもう一つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を哺乳動物に逐次投与してもよい。逐次投与のために、送達ポリマーをRNAiポリヌクレオチド結合体の投与前に投与してもよい。または、逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド結合体を送達ポリマーの投与前に投与してもよい。

[本発明1001]
インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、下記を含む組成物：
a）少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性ポリマーであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合を介して該ポリマーに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、ポリマー。
[本発明1002]
インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、下記を含む組成物：
a）ガラクトーストリマーに共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性ポリマーであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合を介して該ポリマーに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、ポリマー。
[本発明1003]
インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための結合体送達システムであって、下記を含む送達システム：

式中、
Pは膜活性ポリアミンであり、
L ² はpHに不安定な連結であり、
M ¹ はガラクトース誘導体を含む電荷中性マスキング剤であり、
M ² はポリエチレングリコールを含む電荷中性マスキング剤であり、
yおよびzは1よりも大きい整数であり、ここでyおよびzを合わせた値はPのアミンの50％よりも大きく、
NはRNA干渉ポリヌクレオチドであり、
Aはガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
M ¹ およびM ² の生理的にpHに不安定な連結L ² を通じての結合による、Pアミンの50％よりも多くの修飾により、Pの正電荷は中和され、かつPの膜活性は可逆的に阻害され；かつ
pHの低下に反応してのL ² の切断が、Pのアミンおよび膜活性を復旧する。
[本発明1004]
下記の段階を含む、RNAオリゴヌクレオチド送達組成物の製造法：
a）膜活性ポリアミンを形成する段階；
b）ガラクトース誘導体を含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第一のマスキング剤を形成する段階；
c）ポリエチレングリコールを含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第二のマスキング剤を形成する段階；
d）膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する段階であって、ここで阻害は、ポリアミンを第一および第二のマスキング剤と反応させ、それにより、生理的にpHに不安定な二置換マレアマート連結を介して複数のガラクトース誘導体および複数のポリエチレングリコールを膜活性ポリマーに連結させることにより、ポリアミン上のアミンの50％以上を修飾することからなる、段階；および
e）RNA干渉ポリヌクレオチドをガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に連結する段階；
f）インビボでの投与に適した溶液中にRNA干渉ポリヌクレオチドおよび可逆的に阻害された膜活性ポリアミンを提供する段階。
[本発明1005]
RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
肝細胞が肝実質細胞からなる、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1007]
膜活性ポリマーが2つまたはそれ以上の異なるモノマーを含む、本発明1003または1004のいずれかの組成物。
[本発明1008]
膜活性ポリマーが、アミン含有モノマー、低級疎水性基モノマー、および高級疎水性基モノマーから構成される、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
可逆的にマスクした膜活性ポリアミンが水溶性である、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1010]
膜活性ポリアミンがランダムコポリマーである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1011]
ランダムコポリマーが、ポリ(ビニルエーテル)およびポリ(アクリラート)からなる群より選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
アミン含有モノマー、低級アルキルモノマー、および高級アルキルモノマーが、4〜8アミン含有モノマー：3〜5低級疎水性基モノマー：1高級疎水性基モノマーの比で存在する、本発明1001、1002、または1008のいずれかの組成物。
[本発明1013]
低級疎水性基がブチル基からなり、かつ高級疎水性基がオクタデシルまたはドデシル基からなる、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
マスキング剤がポリアミン上のアミンの少なくとも70％に可逆的に連結している、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1015]
マスキング剤がポリアミン上のアミンの少なくとも80％に可逆的に連結している、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+30から-30mVのゼータ電位を有する、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+20から-20mVのゼータ電位を有する、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+10から-10mVのゼータ電位を有する、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-30mVのゼータ電位を有する、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1020]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-20mVのゼータ電位を有する、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-10mVのゼータ電位を有する、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
薬学的に許容される担体または希釈剤中で提供される、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
L ² がマレアマート連結である、本発明1003の組成物。
[本発明1024]
L ² が二置換マレアマート連結である、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
NがAに生理的に不安定な連結L ¹ を介して連結されている、本発明1003の組成物。
[本発明1026]
L ¹ が、L ² に直交する生理的に不安定な共有結合である、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
Aが20個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1028]
Aがガラクトーストリマーを含む、本発明1003の組成物。
[本発明1029]
ポリマーに連結されているガラクトース誘導体のPEGに対する比が1対05.〜2である、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1030]
ガラクトース誘導体がN-アセチルガラクトサミンからなる、本発明1001〜1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
ガラクトーストリマーがN-アセチルガラクトサミントリマーからなる、本発明1002〜1030のいずれかの組成物。
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に読めば、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

両親媒性ポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーの重合のための反応スキームである。 遺伝子ノックダウンに対するsiRNA-コレステロール結合体用量の効果を例示するグラフである。 肝臓へのsiRNA-疎水性物質結合体標的化に対する疎水性物質のサイズの効果を例示するグラフである。 いくつかの疎水性基についての遺伝子ノックダウンに対するsiRNA-疎水性物質結合体用量の効果を例示するグラフである。 肝臓へのsiRNA-疎水性物質結合体送達に対する送達ポリマー用量の効果を例示するグラフである。 GalNAcクラスターのRNAへの連結を示す図である。 GalNAcクラスターのRNAへの連結を示す図である。

インビボでRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドを哺乳動物の肝細胞に送達するための改善された方法を本明細書において記載する。本方法は、RNAiポリヌクレオチド送達媒体の産生の改善された方法も可能にする。従来、ポリヌクレオチドのインビボ送達はポリヌクレオチドの送達媒体との物理的結合を必要とした。ポリヌクレオチドは、ポリカチオン/核酸複合体のように送達媒体と静電的に結合されているか、リポソームおよび安定な核酸-脂質粒子（SNALP）のように送達媒体によって封入されているか、またはDynamic PolyConjugate（Rozema et al. 2007）のように送達媒体に共有結合されているかのいずれかであった。驚くべきことに、発明者らは、適当なRNAiポリヌクレオチド結合体分子および適当な標的化送達ポリマーを用いることにより、RNAiポリヌクレオチドを送達ポリマーから分離し、なおポリヌクレオチドの効率的な肝実質細胞送達を達成することができることを見いだした。

ポリヌクレオチドを送達ポリマーから分離する能力は、製剤、合成、および製造における利点を提供する。

a）ポリヌクレオチドとポリマーが、共有結合または電荷-電荷相互作用のいずれかにより結合されているという必要条件を取り除くことにより、ポリマーおよびポリヌクレオチドの濃度およびそれらの間の比は、結合した複合体の溶解性または複合体を製造する能力ではなく、成分の溶解性によってのみ制限される。溶解性の上昇によりポリヌクレオチドまたは送達ポリマー濃度の上昇と、したがって用量の上昇を可能にする。

b）ポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを投与の前の任意の時点で混合してもよく、または別々に投与してもよい。したがって、分離により成分を溶液または乾燥状態のいずれかで別々に保存することが可能となる。

c）より大きい、本質的に不安定な非共有結合送達システムに比べて、より小さい、より安定な製剤が可能である。

d）マスクした送達ポリマーの製造は、共有結合した負に荷電したポリヌクレオチド非存在下または負に荷電したポリヌクレオチドを共有結合する必要性なしで、より容易である。

e）製造は、ポリヌクレオチドの送達ポリマーとの物理的結合非存在下で単純化され、より少ない段階を必要とする。

f）siRNAおよびポリマーの標的化における改善が観察される。

本発明は、下記の一般構造の結合体送達システムを含む：
(M¹-L)_x-P-(L-M²)_yプラスN-T、
式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tはポリヌクレオチド標的化部分（20個以上の炭素原子を有する疎水性基またはガラクトースクラスターのいずれか）であり、Pは膜活性ポリアミンであり、かつマスキング剤M¹は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する標的化部分、ガラクトースまたはガラクトース誘導体を含む。Lの切断はポリアミンP上の非修飾アミンを復旧する。マスキング剤M²は任意である。存在する場合、M²は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、親水性立体安定化部分である。xおよびyはそれぞれ整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。送達ポリマー(M¹-L)_x-P-(L-M²)_yは膜活性ではない。M¹および任意にM²の結合によるPアミンの可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化し、Pの正味の正電荷を低減する。十分なマスキング剤をPに結合して、ポリマーの膜活性を阻害する。x＋yは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの50％よりも大きい、より好ましくは60％よりも大きい、より好ましくは70％よりも大きい値を有する。可逆的連結Lの切断後、非修飾アミンが復旧し、それによりPをその非修飾、膜活性状態に戻す。可逆的連結Lの可逆的結合は、切断が所望の組織、臓器、または細胞下部位に存在するものなどの、所望の生理的条件において起こるように選択する。好ましい可逆的連結はpHに不安定な連結である。(M¹-L)_x-P-(L-M²)_y、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリマー（マスクしたポリマー）、およびT-N、ポリヌクレオチド結合体を別々に合成または製造する。TもNもP、L、M¹またはM²に直接または間接的に共有結合されていない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体のマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的また疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボ肝送達に必要とされていない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で供給することができる。これらは投与の前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。

ポリマー
本発明のポリマーは両親媒性膜活性ポリアミンである。ポリマーはモノマーと呼ばれるより小さい単位を繰り返し結合することにより構築される分子である。ポリマーは単一のモノマーを用いるホモポリマーでもありえ、またはポリマーは複数の異なるモノマーを用いるコポリマーもしくはヘテロポリマーでもありうる。ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされる原子からなる。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされない原子からなる。

より具体的には、本発明のポリマーは両親媒性膜活性ランダムコポリマーである。ランダムコポリマーのモノマーは規定された、または主鎖に沿った配列を持たず、例えば、-A_x-B_y-または-A_x-B_y-C_z-と書く。そのようなポリマーの一般的組成はインプットモノマーの比を反映する。しかし、1つのモノマーのもう1つのモノマーに対する正確な比は鎖間で異なる。モノマーの分布も1つのポリマーの長さに沿って異なりうる。同様に、モノマーの化学的性質がそのランダムコポリマーへの組み込み率およびそのポリマー内の分布に影響することもある。ランダムポリマーにおけるモノマーの比はモノマーのインプット比に依存するが、インプット比は組み込まれたモノマーの比に正確にマッチしないこともある。

両親媒性
両親媒性（amphipathic）、または両親媒性（amphiphilic）ポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性（極性、水溶性）および疎水性（非極性、親油性、水不溶性）基または部分の両方を有する。

親水性基は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（両性イオン）でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる：炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。

疎水性基は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。

両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア（親水性）およびブタン（疎水性）を生じる。1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア（2×）およびブタンである。しかし、1,4-ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。

本明細書において用いられる表面活性ポリマーは、水の表面張力および/または他の相との界面張力を低下させ、したがって、液体/蒸気界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は通常は、物質の分子が両親媒性（amphipathic）または両親媒性（amphiphilic）であるという事実による。

膜活性
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである：非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。

本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、HIV TATタンパク質由来のアルギニンを多く含むペプチド、アンテナペディアペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンを多く含む人工ペプチド、小さいグアニジニウムを多く含む人工ポリマーなどの化合物によって表される、細胞透過性ペプチドまたはポリマーと呼ばれるポリマーのクラスとは異なる。細胞透過性化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを必要とすることなく、また膜の完全性を妨害することなく、いくつかの分子を、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他の側へと膜を通過して輸送するようであるが、それらのメカニズムは不明である。

ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。

エンドソーム溶解性
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲（通常はpH5.5〜8）にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。

両親媒性膜活性ランダムコポリマー
本発明の両親媒性膜活性ポリアミンは、両親媒性膜活性ポリアミン（ランダムヘテロポリマー）を含む。

本発明のコポリマーのために、2つまたはそれ以上のモノマー種は最小限で、一級または二級アミン側基を含むモノマーおよび疎水性側基を含むモノマーからなる。より好ましい態様において、2つのモノマー種は最小限で、一級または二級アミン側基を含むモノマーおよび低級疎水性側基を含むモノマーからなる。本明細書において用いられる側基は、ポリマーに連結されているが、その結合はポリマー長の伸長のために必要とされない原子からなる基であり、すなわち、側基の原子または結合のいずれも、基が結合しているポリマーの主鎖または骨格の一部ではない。

本発明の両親媒性膜活性ポリアミンコポリマーは、2つまたはそれ以上のモノマー種の共重合の産物である。一つの態様において、本発明の両親媒性膜活性ヘテロポリマーは下記の一般構造を有する：
-(A)_a-(B)_b-
式中、Aは一級または二級アミン官能側基を含み、かつBは低級疎水性側基（2から約6個の炭素原子を含む）を含み、aおよびbは＞0の整数である。合成を助けるために、フタルイミド保護またはBOC保護アミンモノマーなどの保護アミン含有モノマーを重合中に用いてもよい。アミン保護基は重合後に除去してアミンを生じる。中級または高級疎水性側基（7個以上の炭素原子）を含む、10％までのモノマーの組み込みが許容される。少量（＜5％）のさらなるモノマー種の組み込みも許容される。例えば、ポリマーはさらなる反応性基含有モノマーを有していてもよい。反応性基含有モノマーを用いて、ポリマーの合成後に成分をポリマーに結合してもよい。モノマーは、重合反応に関与しない反応性基を有しうる。モノマーは、保護されている反応性基も有しうる。保護基は重合中の反応性基の反応を防止する。重合後、保護基を除去する。

もう一つの態様において、ターポリマー、すなわち少なくとも3つの異なるモノマー種を有するポリマーを、送達ポリマーとして用いてもよい。本発明のターポリマーのために、3つのモノマー種は最小限で、一級または二級アミン側基を含むモノマー、第一の疎水性側基を含むモノマー、および第二の疎水性側基を含むモノマーからなり、ここで第一と第二の疎水性側基は異なる。より好ましい態様において、3つ以上のモノマー種は最小限で、一級または二級アミン基を含むモノマー、低級疎水性側基を含むモノマー、および中級または高級疎水性側基を含むモノマーからなる。

一つの態様において、本発明の両親媒性膜活性ターポリマーは下記の一般構造を有する：
-(A)_a-(B)_b-(C)_c-
式中、Aは一級または二級アミン官能側基を含み、Bは低級疎水性側基（2から約6個の炭素原子を含む）を含み、かつCは高級疎水性側基（12個以上の炭素原子を含む）を含み、a、bおよびcは＞0の整数である。合成を助けるために、フタルイミド保護またはBOC保護アミンモノマーなどの保護アミン含有モノマーを重合中に用いてもよい。アミン保護基は重合後に除去してアミンを生じる。少量（＜5％）のさらなるモノマー種の組み込みが可能である。例えば、ポリマーはさらなる疎水性モノマーまたは反応性基含有モノマーを有していてもよい。反応性基含有モノマーを用いて、ポリマーの合成後に成分をポリマーに結合してもよい。モノマーは、重合反応に関与しない反応性基を有しうる。モノマーは、保護されている反応性基も有しうる。保護基は重合中の反応性基の反応を防止する。重合後、保護基を除去する。

疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む非極性置換または非極性ヘテロ原子が認められることもある。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる低級疎水性モノマーまたは基は、2から6個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる中級疎水性モノマーまたは基は、7から11個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる高級疎水性モノマーまたは基は、12から36個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む。

両親媒性ポリマーの生物物理学的性質は、重合されるモノマー種のクラス、それらがポリマーに組み込まれる比、およびポリマーのサイズによって決定される。異なるポリマーを、重合反応へのモノマーの供給比を変えることにより、またはポリマー骨格を修飾するために用いる基を変えることにより作成することができる。ポリマー中にモノマーが組み込まれる比はモノマーの供給比と同じでありうるが、比は異なることもある。モノマーが供給比で、または異なる比で組み込まれるかどうかにかかわらず、所望のモノマー組み込み比を達成するためにモノマーの供給比を変えることが可能である。

アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するように選択する。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、≧1mg/ml、≧5mg/ml、≧10mg/ml、≧15mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、および≧30mg/mlで水溶性である。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、表面活性である。本発明の膜活性ポリマーは、好ましくは約3kDaから約300kDaのサイズ範囲である。ポリマーは両親媒性であるため、水性溶液中で自己会合し、臨界会合濃度は≦1mg/mlである。

一つの態様において、膜活性ポリアミンコポリマーのモノマー組み込み比は約4〜8アミンモノマー：3〜5低級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約5.4〜7.5アミンモノマー：3〜3.5低級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約2アミンモノマー対約1低級疎水性モノマーである。一つの態様において、疎水性モノマーの疎水性基はアルキル基からなる。

一つの態様において、膜活性ポリアミンターポリマーのモノマー組み込み比は約4〜8アミンモノマー：3〜5低級疎水性モノマー：1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約5.4〜7.5アミンモノマー：3〜3.5低級疎水性モノマー：1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約6アミンモノマー対約3低級疎水性モノマー対約1高級疎水性モノマーである。一つの態様において、疎水性モノマーの疎水性基はアルキル基からなる。

一つの態様において、アミン/低級疎水性基コポリマーを、約4〜8アミンモノマー：約3〜5低級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン/低級疎水性基コポリマーを、約15アミンモノマー：4低級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。

一つの態様において、アミン/低級疎水性基/高級疎水性基ターポリマーを、約4〜8アミンモノマー：約3〜5低級アルキルモノマー：1高級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン/低級疎水性基/高級疎水性基ターポリマーを、約15アミンモノマー：4低級疎水性基モノマー：1高級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。

一つの態様において、特に適切な膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、ブチル含有モノマーおよび高級疎水性基含有モノマーを有するコポリマーを含み、ここで高級疎水性基は12〜18個の炭素原子を含む。特に適切な膜活性ポリアミンは、ポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムターポリマーを含む。

もう一つの態様において、特に適切な膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマーを有するコポリマーを含む。特に適切な膜活性ポリアミンは、ポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを含む。

特に適切な膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマーおよびブチル含有モノマーを有するコポリマーを含む。特に適切な膜活性ポリアミンは、ポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを含む。

生分解性ポリマー
ポリマーは1つまたは複数の切断可能な結合を有していてもよい。切断可能な結合が生理的条件下または細胞生理的条件下で自然に切断される場合、ポリマーは生分解性である。生分解性結合は主鎖中または側鎖中のいずれであってもよい。切断可能な結合が主鎖中にある場合、結合の切断はポリマー長の短縮および2つの分子の生成をもたらす。切断可能な結合が側鎖中にある場合、結合の切断はポリマーからの側鎖原子の消失をもたらす。膜活性ポリマーに対し、ポリマーの生分解はポリマーの膜活性の低減をきたすことになる。本明細書において用いられる生分解性なる用語は、ポリマーが酵素の作用により、加水分解作用により、および/または体内の他の類似のメカニズムにより、経時的に分解することを意味する。生分解性結合は、生物学的プロセスによって切断される結合であり、エステル、ホスホジエステル、特定のペプチド結合およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。エステルは加水分解を起こし、エステラーゼにより触媒的に切断もされる。ホスホジエステルはヌクレアーゼによって切断される。ペプチド結合はペプチダーゼによって切断される。特に、ポリマーからポリマー骨格が分解もしくは切断されるか、または側鎖（側基）が分解もしくは切断される。生分解性ポリマーにおける生分解性結合は、生理的条件下で、45分未満、45分よりも長い、2時間よりも長い、8時間よりも長い、24時間よりも長い、または48時間よりも長い半減期で切断されうる。生分解性ポリマーはインビボ送達のために有用であるが、ポリマーは水溶液中で十分なサイズのポリマーを生成するために、十分に安定でなければならない。同様に、生分解性結合の切断の速度は、マスキング剤をポリマーに結合するために用いる不安定な結合よりも遅くなければならない。好ましい態様において、生分解性ポリマーの分解はマスキング剤の切断よりも遅い速度で起こる。

マスキング
本発明の送達ポリマーは、可逆的修飾が膜活性を阻害し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、細胞型特異的標的化を提供し、かつポリマーの非特異的相互作用を阻害する、可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアミンを含む。ポリアミンはポリアミン上のアミンの可逆的修飾を通じて可逆的に修飾する。

本発明の膜活性ポリアミンは、形質膜またはリソソーム/エンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。この膜活性はポリヌクレオチドの細胞送達にとって必須の特徴である。しかし、ポリマーをインビボで投与すると、膜活性は毒性につながる。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望まれない生体破壊につながる。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。このマスキングは、マスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に結合して、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、かつ細胞特異的相互作用、すなわち標的化を提供する。

全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し（血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ）、かつインビボでの肝実質細胞標的化を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。膜活性ポリアミンは非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性ではない（不活性化）。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリマーの所望のレベルの修飾は、適当なポリマー活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリマーが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結する。マスキングは、いかなるマスキング剤も非存在下で、ポリマー上のアミンの定量により判定して、ポリマー上のアミン基の≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。

本明細書において用いられる膜活性ポリアミンは、修飾ポリマーが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的（すなわち、肝実質細胞）標的化を示す場合、マスクされている。膜活性ポリアミンは、マスキング剤をポリマーに連結している結合の切断がポリマー上のアミンを復旧させ、それにより膜活性を復旧させる場合、可逆的にマスクされている。

マスキング剤が膜活性ポリアミンに生理的に可逆的な結合を通じて共有結合していることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に可逆的な連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでポリマーから切断し、それによりポリマーのマスクを除去し、マスクしていないポリマーの活性を復旧することができる。適当な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的化させられた後に膜活性ポリマーの活性を復旧する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を提供する。可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、およびpHに極度に不安定な結合からなる群より選択されうる、可逆的または不安定な結合を含む。

本明細書において用いられるマスキング剤は、ASGPr標的化部分または立体安定化部分およびアミン反応性基を有する化合物を含み、ここでアミン反応性基のポリマー上のアミンとの反応はASGPr標的化部分または立体安定化部分の生理的に不安定な共有結合を介してのポリマーへの連結を生じる。ASGPr標的化部分は、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する基、典型的には糖類である。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）である。本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中でポリマーを修飾（ポリマーと可逆的結合を形成）することができる。好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は下記の構造で表される：

式中、R¹はメチル（-CH₃）基、エチル（-CH₂CH₃）基、またはプロピル（-CH₂CH₂CH₃）基などのアルキル基であり（置換アルキル無水マレイン酸を形成する）、かつR²はアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）標的化部分または立体安定化部分を含む。

膜活性ポリアミンは、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ポリマーの投与前に結合送達ポリマーから除去してもよい。

立体安定化部分
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、または非天然のいずれか）である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン（Da）、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。

ASGPr標的化部分
標的化部分または基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝実質細胞へと標的化させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的化部分は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的化部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的化および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。

ASGPr標的化部分は、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択されてもよい（Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686）。ASGPr標的化部分はモノマー（例えば、1つのガラクトサミンを有する）またはマルチマー（例えば、複数のガラクトサミンを有する）の部分でありうる。

いくつかの態様において、ガラクトース標的化部分を、下記の構造で例示するとおり、PEGリンカーを通じてアミン反応性基に連結する：

式中、nは1から19の間の整数である。

一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的化部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的化部分マスキング剤およびPEGマスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、ASGPr標的化部分マスキング剤は、PEGリンカーを介してアミン反応性基に連結されたASGPr標的化部分を含む。ASGPr標的化部分マスキング剤およびPEGマスキング剤の両方による膜活性ポリアミンマスキングのために、PEG対ASGPr標的化部分の比は約0〜4：1、より好ましくは約0.5〜2：1である。もう一つの態様において、約1のガラクトース誘導体マスキング剤に対して約1.3〜2のPEGマスキング剤がある。

表面電荷
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpH8で20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。

膜活性ポリアミンの正電荷、またはゼータ電位は、マスキング剤での修飾により低下する。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清成分または非標的細胞と望まれない相互作用を引き起こしうる。正の表面電荷は、ポリマーの負に荷電した細胞膜との相互作用を増強することにより、膜活性においても役割を果たす。したがって、インビボでのポリヌクレオチドの送達のために、ほぼ中性の正味の電荷またはゼータ電位を有する送達ポリマーが好ましい。本発明の送達ポリマー、ASGPr標的化部分マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の可逆的結合によりマスクした膜活性ポリアミンは、ほぼ中性の見かけの表面電荷を有し、血清中で安定である。より具体的には、本発明の送達ポリマーは、pH8で測定して+30から-30mVの間、+20から-20mVの間、+10から-10mVの間、または+5から-5mVの間のゼータ電位を有する。pH7では、結合体の正味の電荷はpH8よりも正であると予想される。正味の電荷、または表面電荷は、インビボ適用のための重要な因子である。

不安定な連結
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく；これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。

可逆的または不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い（熱力学的に）、またはより速やかに分解される（動力学的に）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期（t_1/2）（結合の半分が切断するのに要する時間）によって議論される。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。

適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在（ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど）、または添加した物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。

不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分（例えば、電子受容体または供与体）を付加することで、化学変換が起こる特定の条件（例えば、pH）に影響をおよぼしうる。

本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換（例えば、切断）を起こすように選択される。

本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。

化学変換（不安定な結合の切断）は、薬学的に許容される物質の細胞への添加によって開始されてもよく、または不安定な結合を含む分子が適切な細胞内および/または細胞外環境に到達した場合に自然に起こってもよい。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えられる。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えられる。

本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。

無水物のアミンとの反応はアミドおよび酸を生成する。多くの無水物にとって、逆反応（無水物およびアミンの生成）は非常に遅く、エネルギー的に好ましくない。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンとの反応はアミド酸、すなわちアミドおよび酸が同じ分子内にある分子を生じる。同じ分子内に両方の反応性基（アミドおよびカルボン酸）が存在することで、逆反応が加速される。特に、一級アミンの無水マレイン酸および無水マレイン酸誘導体との生成物であるマレアミド酸は、その非環式類縁体よりも1×10⁹から1×10¹³倍速くアミンおよび無水物に逆戻りする（Kirby 1980）。

アミドおよび酸を生成するアミンの無水物との反応

アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応

アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。シスアコニット酸はそのようなpH感受性リンカー分子として用いられてきた。γ-カルボキシラートをまず分子にカップリングさせる。第二段階で、αまたはβカルボキシラートのいずれかを第二の分子にカップリングさせて、2つの分子のpH感受性カップリングを生成する。このリンカーのpH5での切断の半減期は8から24時間の間である。

無水シスアコニット酸および無水マレイン酸の構造

切断が起こるpHを、不安定な部分に化学的成分を付加することにより制御する。マレアミド酸のアミンおよび無水マレイン酸への変換の速度は、無水マレイン酸系の置換（R2およびR3）に強く依存する。R2がメチルである場合、変換の速度はR2およびR3が水素である場合よりも50倍速い。R2およびR3の両方にアルキル置換がある場合（例えば、2,3-ジメチル無水マレイン酸）、速度の上昇は劇的であり：非置換無水マレイン酸よりも10,000倍速い。アミンの2,3-ジメチル無水マレイン酸による修飾から生成されたマレアマート結合は、pH5で4から10分の間の半減期で切断されて無水物およびアミンを復旧する。R2およびR3が水素よりも大きい基である場合、アミド酸のアミンおよび無水物への変換は、R2および/またはR3が水素である場合よりも速いと予測される。

pHに非常に不安定な結合：pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。

pHに極度に不安定な結合：pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。

二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明の膜活性ポリアミンへの結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復旧する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約1/20しか寄与しないようである（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、ポリアミンの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するポリマーを作成するよりもむしろ、ポリアミンの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性のポリマーが好ましい。

段階重合
段階重合において、重合は段階的様式で起こる。ポリマーの伸長はモノマー、オリゴマー、およびポリマーの間の反応によって起こる。同じ反応がずっと起こるため開始剤は必要ではなく、末端基がなお反応性であるように停止段階はない。重合速度は官能基が消費されるにつれて低下する。

同じモノマー中に2つの反応性基（AおよびB）を有するモノマー（ヘテロ二官能性）であって、Aは反応性基を含み、BはA反応性基（Aと共有結合を形成する反応性基）を含むモノマーを用いることによる段階重合を用いて、ポリマーを反応させることができる。A-Bの重合は-[A-B]_n-を生じる。反応性基AおよびBは1つまたは複数の共有結合によってつなぎ合わせ、それによりポリマーモノマーを生成することができる。A-A＋B-Bが-[A-A-B-B]_n-を生じるようなホモ二官能性モノマーを用いることによる段階重合を用いて、ポリマーを作成することもできる。一般に、これらの反応はアシル化またはアルキル化を含みうる。モノマーの2つの反応性基を、1つまたは複数の共有結合によりつなぎ合わせることができる。

反応性基Aがアミンである場合、Bはアミン反応性基であり、これはイソチオシアナート、イソシアナート、アシルアジド、N-ヒドロキシ-スクシンイミド、塩化スルホニル、アルデヒド（ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む）、ケトン、エポキシド、カルボナート、イミドエステル、カルボジイミドで活性化されたカルボキシラート、リン酸アルキル、ハロゲン化アリール（ジフルオロジニトロベンゼン）、無水物、酸ハロゲン化物、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリジニウム、およびカルボニルジメチルアミノピリジニウムを含む群より選択することができる。言い換えると、反応性基Aがアミンである場合、Bはアシル化もしくはアルキル化剤またはアミノ化剤でありうる。

反応性基Aがスルフヒドリル（チオール）である場合、Bはチオール反応性基であり、これはヨードアセチル誘導体、マレイミド、アジリジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体、およびジスルフィド誘導体（ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導体）を含む群より選択することができる。

反応性基Aがカルボキシラートである場合、反応性基Bはカルボキシラート反応性基であり、これはカルボジイミドを用いるジアゾアセタートおよびアミンを含む群より選択することができる。カルボニルジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン（DMAP）、N-ヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジイミドおよびDMAPを用いるアルコールなどの、他の添加剤を用いてもよい。

反応性基Aがヒドロキシルである場合、反応性基Bはヒドロキシル反応性基であり、これはエポキシド、オキシラン、活性化カルバマート、活性化エステル、およびハロゲン化アルキルを含む群より選択することができる。

反応性基Aがアルデヒドまたはケトンである場合、反応性基Bはアルデヒドまたはケトン反応性基であり、これはヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（NaCNBH₃などの還元剤により還元されてもよく、または還元されなくてもよい、シッフ塩基を生成するため）、およびヒドロキシル化合物を含む群より選択することができる。

A-Aプラスもう一つの物質が-[A-A]_n-を生じるような二官能性モノマーおよびもう一つの物質を用いることによる段階重合を用いて、ポリマーを作成することもできる。

反応性基Aがスルフヒドリル（チオール）である場合、これはヨウ素（I₂）、過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO₄）、または酸素（O₂）などの酸化剤によりジスルフィド結合に変換することができる。反応性基Aがアミンである場合、これは2-イミノチオラート（トラウト試薬）との反応によりチオールに変換することができ、これは次いで酸化およびジスルフィド形成を起こす。ジスルフィド誘導体（ピリジルジスルフィドまたはTNB誘導体など）を用いてジスルフィド結合形成を触媒することもできる。

前述の例のいずれかにおける反応性基AまたはBは、アリールアジド（ハロゲン化アリールアジドを含む）、ジアゾ、ベンゾフェノン、アルキン、またはジアジリン誘導体などの光反応性基でもありうる。

アミン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、またはカルボキシラート基の反応は、炭素がヒドロキシル基、チオエーテル、ジオール、ヒドラゾン、ジアゾ、またはスルホンに結合している、アミド、アミジン、ジスルフィド、エーテル、エステル、エナミン、イミン、尿素、イソチオ尿素、イソ尿素、スルホンアミド、カルバマート、アルキルアミン結合（二級アミン）、および炭素-窒素一重結合として記載される化学結合を生じる。

連鎖重合
連鎖反応重合において、ポリマーの伸長は限られた数の伸長中の鎖へのモノマー単位の連続的付加により起こる。開始および成長メカニズムは異なり、典型的には連鎖停止段階がある。連鎖重合反応はラジカル、アニオン、またはカチオン重合でありうる。連鎖重合のためのモノマーはビニル、ビニルエーテル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、およびメタクリルアミド基を含む群より選択されうる。連鎖重合はサイクルまたは開環重合によって達成することもできる。ペルオキシド、ヒドロキシペルオキシド、および2,2'-アゾビス(-アミジノプロパン)ジヒドロクロリド（AAP）などのアゾ化合物を含むが、それらに限定されるわけではない、いくつかの異なる型のフリーラジカル開始剤を用いることができる。

天然ポリマーは天然に見いだしうるポリマーである。例にはポリヌクレオチド、タンパク質、コラーゲン、および多糖（デンプン、セルロース、グリコサミノグリカン、キチン、寒天、アガロース）が含まれる。天然ポリマーは生物原料から単離することもでき、または合成によるものでもよい。合成ポリマーは「人による」化学的プロセスにより調合または製造され、天然の生物学的プロセスによって作成されるのではない。非天然ポリマーは、天然（動物または植物）の材料またはモノマー（アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類など）から作成されない合成ポリマーである。ポリマーは完全または部分的に天然、合成、または非天然であってもよい。

RNAiポリヌクレオチド結合体
発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの疎水性基またはガラクトースクラスターいずれかであるポリヌクレオチド標的化部分への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の送達ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝細胞、特に肝実質細胞への効率的、機能的送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。

RNAiポリヌクレオチド結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリヌクレオチド標的化部分に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。標的化部分も、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。

標的化部分は、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的化部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。

一つの態様において、ポリヌクレオチド標的化部分は疎水性基からなる。より具体的には、ポリヌクレオチド標的化部分は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的化部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的化部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択されうる。6個以下の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的化部分として有効ではないが、8から18個の炭素原子を有する疎水性基は疎水性基のサイズ増大（すなわち、炭素原子の数の増大）に伴い漸増するポリヌクレオチド送達を提供する。疎水性標的化部分のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、送達ポリマーの同時投与なしでは、RNAiポリヌクレオチドの効率的な機能的インビボ送達を提供しない。siRNA-コレステロール結合体は、他の研究者らによりインビボでsiRNA（siRNA-コレステロール）を肝細胞に送達すると報告されているが、任意のさらなる送達媒体なしでは、高濃度のsiRNAが必要で、送達効果は悪い。本明細書に記載の送達ポリマーと組み合わせると、ポリヌクレオチドの送達は大幅に改善される。siRNA-コレステロールを本発明の送達ポリマーと一緒に提供することにより、siRNA-コレステロールの有効性は約100倍高まる。

ポリヌクレオチド標的化部分として有用な疎水性基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性標的化部分は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。疎水性標的化部分は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。

もう一つの態様において、ポリヌクレオチド標的化部分はガラクトースクラスター（ガラクトースクラスター標的化部分）を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびアシアロ糖タンパク質受容体に対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC-1炭素を通じて結合する。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）は肝実質細胞に特有で、分枝ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端N-アセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合する（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ポリマーと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。

ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC-1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第5885968号；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG₃スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG₃スペーサー（3つのエチレン単位）である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。

好ましいガラクトース誘導体はN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）である。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する他の糖類は、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含むリストから選択されてもよい。多くのガラクトース誘導体のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性は研究されており（例えば：Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686参照）、または当技術分野において典型的な方法を用いて容易に判定される。

ガラクトースクラスターの一態様

分枝点と核酸との間にPEGスペーサーを有するガラクトースクラスター

ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。

RNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子（または短い）干渉RNA（siRNA）およびマイクロRNA（miRNA）である。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15〜50塩基対、好ましくは21〜25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ（完全に相補的）またはほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3'オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNA(miRNA）は、それらのmRNA標的の破壊または翻訳抑制を誘導する、約22ヌクレオチドの長さの小さい非コードRNA遺伝子産物である。miRNAと標的mRNAとの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が高度である場合、標的mRNAは切断される。miRNAについて、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3'UTRに通常は位置する標的部位に結合する。「シード領域」-その標的と完全な塩基対を形成する、miRNAの5'末端における約7つの連続するヌクレオチドのひと続きの配列-は、miRNA特異性において重要な役割を果たす。RISC/miRNA複合体のmRNAへの結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの切断および分解のいずれかを引き起こしうる。最近のデータは、シード領域でのみ完全な塩基対形成を示す代わりに、miRNAおよびその標的の全長にわたり完全な相同性がある場合に、mRNA切断が優先的に起こることを示している（Pillai et al. 2007）。

RNAiポリヌクレオチド発現カセットは細胞内で転写されて、siRNA、別々のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、またはmiRNAとして機能しうる小さいヘアピンRNAを産生することができる。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストから選択されるプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、ならびにmRNAプロモーターが含まれる。

公知のmiRNA配列のリストは、特にWellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究組織によって維持されるデータベース中に見いだすことができる。公知の有効なsiRNA配列および同族の結合部位も関連する文献中に詳細に示されている。RNAi分子は当技術分野において公知の技術によって容易に設計され、産生される。加えて、有効かつ特異的配列モチーフを見いだす機会を高めるコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。

本発明のポリヌクレオチドは化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチド作成物において用いる場合、細胞内でポリヌクレオチド活性を保存するが、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることが示されている。化学的に修飾したsiRNAは、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。

一つの態様において、本発明の化学的に修飾したRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、その一方または両方は化学的に修飾されていてもよく、ここで各鎖は約19から約29ヌクレオチドである。一つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むが、細胞または再構成したインビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持している。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学修飾は1つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、本発明のRNAiポリヌクレオチドは一般にはヌクレオチドの位置の約5から約100％（例えば、ヌクレオチドの位置の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）の修飾ヌクレオチドを含みうる。所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾パーセントはセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス両方の鎖中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。加えて、所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数にも依存しうる。例えば、ここでRNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。

RNAiポリペプチドは遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有しうるため、RNAiポリヌクレオチドは十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするよう設計することができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有される、または特定の遺伝子標的に特有である、配列に対する相補性を有する配列を含むことができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するRNA配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異体遺伝子など）を標的とするよう設計することができる。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドは、1つの遺伝子の特定のRNA配列に特有な配列を標的とするよう設計することができる。

相補性なる用語は、ポリヌクレオチドが伝統的なワトソン-クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによりもう一つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を意味する。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子のその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、例えば、酵素的mRNA切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は当技術分野において周知である（Frier et al. 1986, Turner et al. 1987）。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合（例えば、ワトソン-クリック塩基対形成）を形成しうる、第一のポリヌクレオチド分子の、近接鎖における塩基のパーセンテージ（例えば、10のうちの5、6、7、8、9、10は50％、60％、70％、80％、90％、および100％の相補性である）を示す。完全に相補性とは、ポリヌクレオチド配列の近接鎖中の塩基すべてが第二のポリヌクレオチド配列における同じ数の近接塩基と水素結合することを意味する。

遺伝子発現を阻害する、ダウンレギュレートする、またはノックダウンするとは、遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価しての遺伝子の発現が、本発明の阻止ポリヌクレオチド結合体非存在下で観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物により送達されるポリヌクレオチドによる、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、またはノックダウンは、好ましくは対照不活性核酸、混乱した配列もしくは不活化ミスマッチを含む核酸存在下、またはマスクしたポリマーへのポリヌクレオチドの結合非存在下で観察されるレベルよりも低い。

インビボ投与
薬理学および毒性学において、投与経路は薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる道である。一般に、哺乳動物を治療するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。

投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。

記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される特性および/または物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および特性を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。

RNAiポリヌクレオチド-標的化部分結合体を、送達ポリマーと同時投与する。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド-標的化部分結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド-標的化部分結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。

RNAiポリヌクレオチド-疎水性標的化部分結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の30分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-疎水性標的化部分結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の2時間前までに投与してもよい。

RNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的化部分結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の15分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的化部分結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の15分前までに投与してもよい。

治療効果
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。発明者らは、肝実質細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター（マーカー）遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる治療のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される：＜2％、重度；2〜5％、中等度；および5〜30％軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1％から2％への上昇は有益であると考えることができる。6％よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100％である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積％に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。

肝臓は、その代謝（例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質の分泌（例えば、血友病における凝固因子）における中心的役割を考慮すると、遺伝子療法の最も重要な標的組織の1つである。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、ポリヌクレオチドに基づく肝臓療法によって治療できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を通じて治療できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌（肝実質細胞癌、HCCを含む）、ウイルス感染症（肝炎を含む）、代謝障害（高脂血症および糖尿病を含む）、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。

投与することになる送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体の量（用量）は経験的に決定することができる。発明者らは、0.1〜10mg/kg動物体重のsiRNA結合体および5〜60mg/kg動物体重の送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示している。マウスにおける好ましい量は0.25〜2.5mg/kgのsiRNA結合体および10〜40mg/kgの送達ポリマーである。より好ましくは、約12.5〜20mg/kgの送達ポリマーを投与する。RNAiポリヌクレオチド結合体は典型的には大量でも非毒性であるため、その量は容易に増大させる。

本明細書において用いられるインビボとは、生物の内部で起こるもの、より具体的には、部分的または死んだものに対して、哺乳動物などの全体の生きている多細胞生物（動物）の生きている組織内または組織上で行われるプロセスを意味する。

ポリマー合成
実施例1. ポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマー
A. アミン含有モノマーの組み込みのためのビニルエーテルモノマー
2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、2-クロロエチルビニルエーテル（25g、0.24mol；CAS #110-75-8）およびフタルイミドカリウム（25g、0.135mol；CAS #1074-82-4）を100℃のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF、75ml）中、相転移触媒として臭化テトラn-ブチルアンモニウム（0.5g；CAS #1643-19-2）を用いて反応させることにより調製した。この溶液を6時間加熱し、次いで水中で粉砕し、ろ過した。次いで、この固体をメタノールから2回再結晶して、白色結晶を得た。

B. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(ビニルエーテル)ポリアミンターポリマーの合成
Xmol％アミン保護ビニルエーテル（例えば、2-ビニルオキシエチルフタルイミド）を乾燥器で乾燥した丸底フラスコの窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン中に加える。この溶液にYmol％低級疎水性基（例えば、プロピル、ブチル）ビニルエーテルおよび任意にZmol％高級疎水性基（例えば、ドデシル、オクタデシル）ビニルエーテルを加える（図1）。溶液を-50から-78℃の浴に入れ、2-ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10mol％BF₃・(OCH₂CH₃)₂を加え、-50から-78℃で2〜3時間反応を進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に加える。フタルイミドに対し20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を0.5mol/L HClに溶解し、15分間還流してポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温（RT）まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することもできる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィ（SEC-MALS）を含む、標準的手順によりカラムを用いて推定する。

C. DW1360の合成
アミン/ブチル/オクタデシルポリ(ビニルエーテル)ターポリマーを、2-ビニルオキシエチルフタルイミド（5g、23.02mmol）、ブチルビニルエーテル（0.665g、6.58mmol）、およびオクタデシルビニルエーテル（0.488g、1.64mmol）モノマーから合成した。2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む乾燥器で乾燥した200mL丸底フラスコのアルゴン雰囲気下、36mLの無水ジクロロメタン中に加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびn-オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温（RT）で完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1：1溶液にドライアイスを加えて作った-50℃の浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を形成させた。約1.5分間冷却した後、BF₃・(OCH₂CH₃)₂（0.058g、0.411mmol）を加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。-50℃で3時間反応を進行させた。メタノール中1％水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。

次いで、ポリマーを30mLの1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に溶解した。この溶液にヒドラジン（0.147g、46mmol）を加え、混合物を3時間加熱還流した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、次いで得られた固体を20mLの0.5mol/L HClに加え、15分間還流し、20mLの蒸留水で希釈し、さらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、RTまで冷却し、分子量3,500のセルロースチューブに移し、蒸留水に対して24時間（2×20L）透析し、凍結乾燥した。

示したビニルエーテルモノマーを含むポリマーを記載しているが、本発明はこれらの特定のモノマーに制限されることはない。

D. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンターポリマーの合成
ポリ(アクリラート)およびポリ(メチルアクリラート)ヘテロポリマーを一般的なフリーラジカル反応スキームを用いて合成してもよい（本明細書において用いられるポリ(メタクリラート)ポリアミンはポリ(アクリラート)ポリアミン属の亜属である）：

式中、Rは独立に水素またはメチル基であり、Xはポリマー中に所望の比で存在する所望のモノマー側基である。

ポリマー合成のために、適切なモノマーには下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない：
BOC保護アミン含有モノマー（M）：

式中、n＝1〜4であり、BOC保護基の除去により一級アミンが生じる。
低級疎水性基モノマー（N）：

式中、n＝1〜5であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。
高級疎水性基モノマー（O）：

式中、n＝8〜24であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。

前述のモノマーを用いて、以下の組成の膜活性ヘテロポリマーを合成することができる：Mは50〜90mol％でありえ；Nは10〜50mol％でありえ；Oは0〜10mol％でありうる。

E. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンターポリマーの合成

R、R'、およびR''は独立に水素またはメチルであり
x＝2、3、または4であり
y＝0、1、2、3、4、または5［メチル（C1）〜ヘキシル（C6）］であり
z＝≧8の整数［デシル（C10）またはそれ以上］であり
a、b、およびdはポリマーが所望の比の前述のモノマーを有するように選択した整数である。

Xmol％アミン保護アクリラートモノマー、Ymol％低級疎水性基アクリラートモノマー、および任意にZmol％高級疎水性基アクリラートモノマーを、撹拌子を備えた反応チューブに加える。適切な溶媒（例えば、アセトニトリルまたはジオキサン）と、続いて適切な触媒（例えば、AIBN）を加え、反応混合物をN₂でパージする。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、重合させるのに十分な時間（例えば、3時間）加熱する（例えば、60℃）。粗製ポリマーを、BOC保護基の除去の前に、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。BOC保護基を、氷酢酸中、2M HClとの反応により除去する。BOC保護基の除去によりポリマー一級アミンおよび水溶性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを得る。次いで、ポリマーを、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。

（Ant 40911-3 23-28、Ant 40911-35-2）の合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、ラジカル開始剤）、アセトニトリル、およびジオキサンはSigma Aldrichから購入した。アクリラートおよびメタクリラートモノマーをろ過して阻害剤を除去した。3-(BOC-アミノ)1-プロパノール（TCI）を塩化アクリロイル（CAS 814-68-6）と反応させて、BOC-アミノプロピルアクリラート（BAPA）を生成した。

撹拌子を備えた2L丸底フラスコ中、2-(2-アミノエトキシ)エタノール（21.1g、202.9mmol）を350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lフラスコ中、無水BOC（36.6g、169.1mmol）を660mLのジクロロメタンに溶解した。2L丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、無水BOC溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2L分液漏斗中、生成物を各300mlの10％クエン酸、10％K₂CO₃、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノールをNa₂SO₄で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いてDCMを蒸発させた。

撹拌子を備え、アルゴンを流した、500ml丸底フラスコ中、BOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノール（27.836g、135.8mmol）と、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（35.5ml、203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴に入れた。塩化アクリロイル（12.1ml、149.4mmol）を10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻して、終夜撹拌した。生成物を各100mlのdH₂O、10％クエン酸、10％K₂CO₃、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOC-アミノエチルエトキシアクリラート（BAEEA）をNa₂SO₄で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションを用いてDCMを蒸発させた。直径7.5cmのカラムを用い、29cmのシリカでのカラムクロマトグラフィにより生成物を精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAEEAを収率74％で得た。BAEEAをフリーザーで保存した。

ポリマー40911-3 23-28：70％BAPA、25％メタクリル酸ブチル（CAS 97-88-1）、5％メタクリル酸オクタデシル（CAS 4813-57-4）、（3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.0139mol）
BAPA（9.739mmol）（A）、メタクリル酸ブチル（3.478mmol）（B）、およびメタクリル酸オクタデシル（0.6957mmol）（D）を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。アセトニトリル（16ml）と、続いてAIBN（0.4174mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。粗製ポリマーを脱イオン水中で沈澱させ、ニートトリフルオロ酢酸（40ml）と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、一級アミンおよび水溶性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを生成した。200mLの脱イオンH₂O（dH₂O）を反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、100mLのdH₂Oに溶解し、凍結乾燥した。乾燥したポリマーを50％MeOH/100mMギ酸アンモニウム/0.2％ギ酸溶液に25mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（250mg、10ml）の3回の注入分を、S-200セファクリル担体で、XK50/30cmカラムを5.0ml/分の流速で用いて精製した。カラムを充填し、製造者の指示に従って用いた。（GE Healthcare、説明書56-1130-82 Al、52-2086-00 AH）。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。23分から28分までの分画を集め、各注入ごとに合わせた。溶媒を蒸発させ、精製したポリマーを2回凍結乾燥した。

ポリマーAnt 40911-35-2：80％BAEEA、15％メタクリル酸ブチル、5％アクリル酸オクタデシル、（3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.013913mol）
BAEEA（A）（11.13mmol）、メタクリル酸ブチル（B）（2.086mmol）、およびアクリル酸オクタデシル（D）（0.6957mmol）を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。ジオキサン（16ml）と、続いてAIBN（0.4174mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。ジオキサンをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを89.8％ジクロロメタン/10％テトラヒドロフラン/0.2％トリエチルアミン溶液に70mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（700mg、10ml）の3回の注入分を、Jordi gelジビニルベンゼン10⁴Åカラム（内径：22mm、長さ：500mm）を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。15.07分〜17.13分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。

約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに連結したWyatt Helos II多角光散乱検出器を用いて測定した。分子量172,000およびPDI 1.26を得た。

精製したBOC保護ポリマーをニートトリフルオロ酢酸（7ml）と1.5時間（または氷酢酸中2M HClと0.5時間）反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH₂Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、20〜30mLのdH₂Oに溶解し、2回凍結乾燥した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。

アミンをポリマーの骨格に連結する炭素原子の数およびリンカーが分枝しているかどうかは、アミンのpKaおよびアミン付近の立体効果に影響をおよぼす。例えば、前述のポリマーについて、エチルアミンは約8.1のpKaを有し、プロピルアミンは約9.3のpKaを有し、ペンチルアミンは約10.2のpKaを有する。アミンのpKaまたはアミン付近の立体効果は、アミンに結合しているマスキング基の不安定性に影響をおよぼす。無水マレイン酸のアミンへの可逆的結合について、アミン結果のより高いpKaはアミンからの無水物のより遅い放出速度である。同様に、イソプロピルリンカーによるなどの、アミン付近の立体障害増大は、アミンのpKaを増大させうる。

ポリマーLau 41305-38-17-19：80％BAPA、20％メタクリル酸エチル（CAS 97-63-2）、(3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.0105mol）
BAPA（A）（8.40mmol）およびメタクリル酸エチル（B）（2.10mmol）を、撹拌子を備えた15mL反応チューブに加えた。アセトニトリル（11.5ml）と、続いてAIBN（0.315mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。アセトニトリルをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを74.8％ジクロロメタン/25％テトラヒドロフラン/0.2％トリエチルアミン溶液に50mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（500mg、10ml）の3回の注入分を、Jordi gelフッ化ジビニルベンゼン10⁴Åカラム（内径：22mm、長さ：500mm）を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。17.16分〜19.18分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。精製したBOC保護ポリマーを氷酢酸中2M HCl（7ml）と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH₂Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、30mLのdH₂Oに溶解し、2回凍結乾燥した。

F. (保護)アミンモノマー、低級疎水性基モノマー、および高級疎水性基オクタデシル基から合成した同様のポリマーも、記載する発明の実施において有効であると予想される。

ポリマー特徴付け
実施例2. DW1360の特徴付け
A. 両親媒性分析
1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン（DPH、Invitrogen）蛍光（λ_ex＝350nm；λ_em＝452nm）は疎水性環境で増強される。この蛍光を用いてDW1360ポリマーを分析した。0.5μM（最終濃度）DPHを0.5mLの50mM HEPES緩衝液、pH8.0中10μgのDW1360に加えた。次いで、DPHの蛍光を測定することにより、溶液を疎水性環境におけるDPH蓄積について試験した。結合体存在下でのDPH蛍光の増大は、ポリマーによる疎水性環境の形成を示す。

B. 分子量
ポリマー分子量（質量）（MW）を、バッチモードでのoptilab rEXと一緒にWyatt Dawn Heleos IIで分析して求めた。ポリマーを様々な濃度で適切な溶媒に加え、それぞれをWyattシステムにロードした。次いで、Astraソフトウェアで濃度の関数としての屈折率の変化を計算し（dn/dc）、これをZimmプロットで用いてMWを計算した。精製したDW1360について求めた平均分子量は4000〜6000Daであった。精製したアクリラートポリマーの平均分子量は約100〜120kDaであった。

C. 分粒およびゼータ電位
ポリマーのゼータ電位をMalvern Zetasizerナノシリーズ（Nano ZS）機器を用いて測定した。CDMマスクポリマーのゼータ電位は0から-30mVの間で変動し、0から-20mVの間がより多かった。ゼータ電位は残留HEPESでpH8に緩衝化した等張グルコース中で測定した。pH7では、結合体はアミンの一部のプロトン化によりいくらかの正電荷を獲得すると予想される。

D. CDM試薬修飾後の結合体中のアミン基の定量
DW1360ポリマーを前述のとおりに合成し、続いて14重量当量のHEPES塩基および7重量当量のCDM-NAGとCDM-PEGとの重量比2：1の混合物（平均11単位）で処理した。1時間後、無水マレイン酸誘導体処理した結合体のアミン含量を、100mM NaHCO₃中のトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）で処理することにより測定した。マレイン酸修飾していない結合体に対して規準化すると、修飾アミンの量は全体の約75％であると定量された。この修飾の程度は加える無水マレイン酸の量を変えるか、または反応条件を変更することで変動しうる。

E. リポソーム溶解
10mgの卵ホスファチジルコリンを、100mMカルボキシフルオレセイン（CF）および10mM HEPES、pH7.5を含む緩衝液1mLで水和した。次いで、リポソームを孔径100nmのポリカーボネートフィルター（Nucleopore, Pleasanton, CA）を通して押し出した。捕捉されていないCFを、Sepharose 4B-200を用い、pH8の10mM HEPESおよび0.1mol/L NaClで溶出するサイズ排除クロマトグラフィにより除去した。一定量200μLのCFロードリポソームを等張緩衝液1.8mLに加えた。小胞懸濁液に0.25μgのポリマーを加えた30分後、蛍光（λ _ex＝488、λ _em＝540）を測定した。各実験終了時に、1％Triton X-100溶液40μlを加えて小胞を破壊し、最大溶解を判定した。

ポリマーマスキング剤
実施例3. マスキング剤
A. 2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸マスキング剤前駆体（カルボキシジメチル無水マレイン酸またはCDM）の合成

無水テトラヒドロフラン50mL中の水素化ナトリウム（0.58g、25mmol）の懸濁液に2-ホスホノプロピオン酸トリエチル（7.1g、30mmol）を加えた。水素ガスの発生停止後、無水テトラヒドロフラン10mL中の2-オキソグルタル酸ジメチル（3.5g、20mmol）を加え、30分間撹拌した。次いで、水10mLを加え、テトラヒドロフランをロータリーエバポレーションにより除去した。得られた固体と水との混合物をエチルエーテル3×50mLで抽出した。エーテル抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、淡黄色油状物を得た。油状物をシリカゲルクロマトグラフィで、エーテル：ヘキサン＝2：1で溶出して精製し、4g（収率82％）の純粋なトリエステルを得た。次いで、このトリエステルを、水酸化カリウム4.5g（5当量）を含む水およびエタノールの50/50混合物50mLに溶解することにより、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を生成した。この溶液を1時間加熱還流した。次いで、エタノールをロータリーエバポレーションにより除去し、溶液を塩酸でpH2まで酸性化した。次いで、この水溶液を酢酸エチル200mLで抽出し、分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、白色固体を得た。次いで、この固体をジクロロメタンおよびヘキサンから再結晶して、2g（収率80％）の2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を得た。

CDMを塩化オキサリルによりその酸塩化物に変換し、続いてチオール、エステル、またはアミンおよびピリジンを加えることにより、CDMからチオエステル、エステル、およびアミドを合成してもよい。CDMおよびその誘導体は、標的化リガンド、立体安定化部分、荷電基、および他の反応性基で、当技術分野において標準の方法により、容易に修飾される。得られた分子を用いて、アミンを可逆的に修飾することができる。

マスキング剤をCDMの修飾により合成して、好ましくは電荷中性物質を生成する：

式中、R1はASGPr標的化リガンドまたは立体安定化部分（例えば、PEG）である。

B. ASGPr標的化基を含むマスキング剤
最も広く研究された肝実質細胞標的化リガンドはガラクトースに基づいており、これは肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）によって結合される。ガラクトースまたはガラクトース誘導体の結合は、オリゴ糖のキトサン、ポリスチレン誘導体、およびポリアクリルアミドHPMAを含む、少数の水溶性が高く、非荷電のポリマーの肝実質細胞標的化を促進することが明らかにされている。ASGPr標的化基は、ラクトース、すなわちガラクトース-グルコース二糖を用い、グルコース残基の修飾を介して、容易に生成される。ラクトビオン酸（LBA、グルコースが酸化されてグルオン酸となっている、ラクトース誘導体）は、標準のアミドカップリング技術を用いて、無水マレイン酸に容易に組み込まれる。

C. 立体安定化部分CDM-PEGおよび標的化基CDM-NAG（N-アセチルガラクトサミン）合成
塩化メチレン50mL中のCDM（300mg、0.16mmol）の溶液に塩化オキサリル（2g、10重量当量）およびジメチルホルムアミド（5μl）を加えた。反応を終夜進行させ、その後過剰の塩化オキサリルおよび塩化メチレンをロータリーエバポレーションにより除去して、CDM酸塩化物を得た。酸塩化物を塩化メチレン1mLに溶解した。この溶液に、塩化メチレン10mL中の、CDM-PEGについてはポリエチレングリコールモノメチルエーテル（MW平均550）またはCDM-NAGについては(アミノエトキシ)エトキシ-2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（すなわち、アミノビスエトキシル-エチルNAG）1.1モル当量、およびピリジン（200μl、1.5当量）を加えた。次いで、溶液を1.5時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られた固体を水5mLに溶解し、0.1％TFA水/アセトニトリル勾配を用いての逆相HPLCにより精製した。

好ましくは、5から20のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。より好ましくは、10〜14のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。PEGは様々な長さのものであってもよく、5〜20または10〜14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13のエチレン単位を有する、単分散、均一または離散型であってもよい。

上に示すとおり、PEGスペーサーは無水物基とASGPr標的化基との間に位置してもよい。好ましいPEGスペーサーは1〜10のエチレン単位を含む。

可逆的ポリマー修飾
実施例4. 膜活性ポリアミンの可逆的修飾/マスキング；すなわち、膜活性ポリマーのCDM-NAGまたはCDM-NAGプラスCDM-PEGの混合物による修飾
等張グルコース中の膜活性ポリアミン（例えば、前述のDW1360）xmgの溶液にHEPES遊離塩基14xmgと、続いてCDM-NAG 7xmgまたはCDM-NAG 2.3xmgおよびCDM-PEG 4.6xmgの混合物のいずれか、合計7xの二置換無水マレイン酸マスキング剤を加えた。次いで、動物への投与の前に、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDM-NAGまたはCDM-PEGのポリアミンとの反応により下記を得た：

式中、Rはポリマーであり、R1はASGPr標的化部分または立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応において生じた無水物カルボキシルは、予想された電荷の約1/20を示した（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。

siRNA結合体
実施例5. RNAiポリヌクレオチド-標的化部分結合体
A. siRNA-疎水性物質結合体
様々な疎水性基をsiRNA分子の3'または5'末端に、当技術分野において標準の技術を用いて共有結合した。

B. siRNA-GalNAcクラスター結合体
GalNAcクラスターを、3つのGalNAc PEG₃基をジリシン分枝点上のアミンに結合することにより作成した。次いで、ジリシン上のカルボキシル基をsiRNAなどのRNAiポリヌクレオチドへの共有結合のために利用可能である。

インビボsiRNA送達
実施例6. インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス（C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis IN）から入手した。マウスを注射前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlan Teklad Rodent Diet（Harlan, Madison WI）で適宜行った。RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。マウスに送達ポリマーの溶液0.2mLおよびsiRNA結合体0.2mLを尾静脈に注射した。ポリマーおよびsiRNAの同時注射のために、注射前にsiRNA結合体を修飾ポリマーに加え、全量0.4mlを注射した。組成物は生理的条件において可溶性かつ非凝集性であった。ポリマーおよびsiRNAを別々に注射するために、ポリマーを製剤溶液0.2mL中で注射し、siRNAを等張グルコース0.2mL中で注射した。溶液を尾静脈内への注入により注射した。他の血管への注射、例えば、眼窩後注射も等しく有効であった。

血清ApoBレベル判定
マウスを4時間（ラットの場合は16時間）絶食させた後、顎下出血により血清を採取した。血清ApoBタンパク質レベルを標準のサンドイッチELISA法により求めた。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）を、それぞれ捕捉および検出抗体として用いた。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を後で適用し、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度をTecan Safire2（Austria, Europe）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。

血漿第VII因子（F7）活性測定
マウスからの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤（1体積）を含むマイクロ遠沈管への顎下出血により血液（9体積）を採取して調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット（Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH）を製造者の推奨に従って用いる発色法により測定する。発色の吸光度をTecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。

実施例7. siRNA-疎水性物質結合体をマスクしたDW1360送達ポリマーと同時投与して用いる、インビボでのsiRNAの肝実質細胞への送達
siRNAおよび送達ポリマーを、示した用量のsiRNAおよびポリマーを用い、前述のとおりに調製し、投与した。

A. インビボでの肝実質細胞へのRNAiポリヌクレオチド送達
siRNA-コレステロール結合体およびマスクしたDW1360送達ポリマーの同時投与は、血清ApoBタンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達およびapoB遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへのコレステロール結合の両方を必要とした（表1、図2）。5mg/kgまでの非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。さらに、疎水性基はsiRNAの5'または3'末端のいずれかに結合することができた。

（表１）siRNA-疎水性物質結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、siRNA結合体用量の効果

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するノックダウンパーセント。
^bICRマウス

B. 肝実質細胞へのRNAiポリヌクレオチド送達に対する疎水性基サイズの効果
DW1360送達ポリマーの同時投与を用いての、siRNAの肝実質細胞への効率的送達は、siRNAが約20個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基に結合していることが必要であった（表2、図3）。炭素原子20個未満の疎水性標的化部分を有するsiRNA-疎水性物質結合体は、段々と効率が低くなる機能的送達を示した。6個またはそれ以下の炭素を有する疎水性物質標的化部分は無効であった。送達効率は、炭素原子20個を超える疎水性物質標的化部分のサイズを増大することにより、有意に改善されることはなかった。

（表２）siRNA-疎水性物質結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン-疎水性基サイズの効果

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するノックダウンパーセント。
^bsiRNAに結合した疎水性基における炭素原子の数
^cC57BL/6マウス

C. 肝実質細胞へのsiRNA-疎水性物質結合体送達に対するsiRNA用量の効果
インビボでの標的遺伝子発現のノックダウンはsiRNA用量に依存する。マウスの治療において、1.25mg/kgを超えるsiRNA用量の投与はインビボでの標的遺伝子ノックダウンを改善しなかった（表3、図4）。しかし、0.25mg/kgという低い用量は、送達ポリマーと同時投与した場合に、マウスにおける標的遺伝子発現の有意なノックダウンを提供した。

（表３）siRNA-疎水性物質結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン-siRNA用量の効果

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するノックダウンパーセント。
^bC57BL/6マウス

D. インビボでの標的遺伝子発現のノックダウンは送達ポリマー用量に依存する
マウスの治療において、約12.5mg/kgの送達ポリマーの投与は、標的遺伝子阻害によって明示されるとおり、最大またはほぼ最大のRNAiポリヌクレオチド送達を提供した（表４、図5）。標的遺伝子のノックダウンはポリマー用量によって影響を受ける。過剰のsiRNA結合体は十分な送達のためのポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンを改善しなかった。

（表４）siRNA-疎水性物質結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン-送達ポリマー用量の効果

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するノックダウンパーセント。
^bICRマウス
^cC57BL/6マウス

E. 逐次投与
RNAiポリヌクレオチド-疎水性物質標的化部分結合体および送達ポリマーを動物に逐次投与してもよい。RNAiポリヌクレオチド-疎水性標的化部分結合体に対し、RNAi結合体を送達ポリマーの投与前30分以内に投与してもよい。同様に、RNAiポリヌクレオチド-疎水性標的化部分結合体に対し、送達ポリマーをRNAi結合体の投与前2時間以内に投与してもよい（表5）。

（表５）siRNA-疎水性物質結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン-siRNAおよびポリマーの逐次投与の効果

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するタンパク質パーセント。

F. 膜活性ポリ(アクリラート)送達ポリマー
可逆的にマスクした両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンは有効な送達ポリマーとして機能する。ポリ(アクリラート)ポリマーを前述のとおりに調製し、DW1360送達ポリマーについて記載したとおりに、マウスにsiRNA-コレステロール結合体と同時投与した。ポリ(アクリラート)送達ポリマーは、血清ApoB低下によって示されるとおり、インビボで肝実質細胞へのsiRNAの送達を促進する上で有効であった（表6）。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへのコレステロール結合の両方を必要とした。

（表６）siRNA-疎水性物質結合体プラスマスクしたポリ(アクリラート)送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン

G. RNAiポリヌクレオチド-疎水性物質結合体の肝臓への送達はLDL受容体またはリポタンパク質受容体関連タンパク質のいずれにも依存しなかった
第VII因子siRNA-コレステロール結合体およびマスクしたDW1360送達ポリマーの同時投与は、LDL受容体ノックアウトマウスおよびリポタンパク質受容体関連タンパク質/LDL受容体二重ノックアウトマウスにおいて血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こした。したがって、siRNA-コレステロールは、LDL粒子、LDL受容体またはリポタンパク質受容体関連タンパク質以外の手段によって肝実質細胞に標的化させられる（表7）。

（表７）siRNA-コレステロール結合体プラスDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；siRNA送達におけるLDL受容体およびリポタンパク質受容体関連タンパク質の効果

^aタンパク質相対パーセント

H. 凍結乾燥ポリ(ビニルエーテル)試料
保存および輸送を改善するために、送達ポリマーを凍結乾燥しうるかどうかを試験するために、溶液中の送達ポリマーを凍結し、凍結乾燥器の高減圧下に置いた。16時間後、試料は結晶性粉末となり、これを次いで脱イオン水の添加により再度溶解した。再度溶解したポリマー試料にsiRNA(5'コレステロールapoB)を加え、試料を注射した。凍結乾燥は送達ポリマーに対して有害な影響を示さなかった。

ガラクトースクラスター標的化siRNA
実施例8. siRNA-ガラクトースクラスター結合体をマスクしたDW1360送達ポリマーと同時投与して用いる、インビボでのsiRNAの肝実質細胞への送達
siRNAおよび送達ポリマーを、示した用量のsiRNAおよびポリマーを用い、前述のとおりに調製し、投与した。

A. siRNA-ガラクトースクラスター結合体およびマスクしたDW1360送達ポリマーの同時投与
siRNA-ガラクトースクラスター結合体およびマスクしたDW1360送達ポリマーの同時投与は、血清ApoBタンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達およびapoB遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへのガラクトースクラスター結合の両方を必要とした（表8）。5mg/kgまでの非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。前述の疎水性物質結合体siRNAと同様に、最大阻害の開始は約12.5mg/kgの送達ポリマー用量で得られる。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。ガラクトースクラスター-siRNA結合体はそれ自体では活性を示さなかった。

（表８）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

B. siRNA-ガラクトースクラスター対siRNA-ガラクトースモノマー
送達ポリマーと同時投与した場合の、インビボでの肝実質細胞へのsiRNAの機能的送達は、RNAi干渉ポリヌクレオチドに結合した三分岐ガラクトース標的化部分を必要とした。単一のガラクトース分子をsiRNAに結合した場合は、標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった（表9）。GalNPr（N-プロピオニルガラクトサミン）ガラクトース誘導体は、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）よりも高いASGPr親和性を有することが公知で、効率的送達のための三分岐ガラクトースクラスターの必要性をさらに示している。

（表９）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；三価対一価ガラクトースRNA結合体

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％
^cN-プロピオニルガラクトサミンモノマー
^dN-アセチルガラクトサミンクラスター（トリマー）

C. ガラクトース誘導体、PEG、またはガラクトース誘導体プラスPEGによるポリマーの修飾の効果
siRNA-ガラクトースクラスターおよび送達ポリマーを、下記以外は前述のとおりに調製した：送達ポリマーはN-アセチルガラクトサミン単独、PEG単独、またはN-アセチルガラクトサミンプラスPEGのいずれかでマスクした。次いで、siRNAおよび送達ポリマーをマウスに前述のとおりに投与した。次いで、血液試料をマウスから採取し、ApoBレベルを求めるために検定した。ガラクトースおよびPEGはいずれも最適な送達のために必要であった。膜活性ポリマーをガラクトースおよびPEGの両方で修飾することにより、ガラクトース単独で修飾したポリマーと同じ効果を達成するのに半分のsiRNA用量しか必要でなかった。ポリマーのPEG単独での修飾は、ガラクトース単独またはガラクトースプラスPEGで修飾したポリマーに比べて、siRNA送達の低減を引き起こした。

（表１０）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；ポリマー修飾の効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

D. siRNA-標的化部分結合体および送達ポリマーの同時投与後の配列特異的遺伝子ノックダウンの時間経過
siRNAおよび送達ポリマーを、前述のとおりに調製し、マウスに投与した。次いで、血液試料をマウスから指定の時点で採取し、ApoBレベルを求めるために検定した。ApoBレベルは、72時間後の対照レベルの3％に達するまで徐々に低下することが観察された。したがって、最大の標的遺伝子ノックダウンは約3日後に起こりうる。タンパク質レベルの最大低下の開始におけるこの遅延は、最大のRNAiポリヌクレオチド送達または遺伝子ノックダウンに必要な時間よりも、ApoBタンパク質を排出または分解するのに必要な時間を反映していると考えられる。

（表１１）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；標的遺伝子ノックダウンの時間経過

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

E. siRNA-ガラクトースクラスター結合体および送達ポリマーの逐次注射
指定の量のsiRNA-ガラクトースクラスター結合体および送達ポリマーを、前述のとおりに調製し、マウスに投与した。次いで、血液試料をマウスから採取し、ApoBレベルを求めるために検定した。ガラクトースクラスターにより肝臓に標的化させたsiRNAにおいて、最適な送達はsiRNAおよび送達ポリマーの一斉投与で観察された。有意なsiRNA送達は、siRNA結合体をポリマー投与後15分以内に投与した場合に観察された。siRNA結合体を送達ポリマーの前（15分以内）に投与した場合には、わずかな送達しか観察されなかった。

（表１２）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；一斉投与および別々の投与

F. ガラクトースクラスター標的化リガンドとRNAiポリヌクレオチドとの間のPEGリンカーの挿入
siRNA-ガラクトースクラスター結合体を、ガラクトースクラスターとsiRNAとの間にPEGスペーサー、PEG₁₉もしくはPEG₂₄を挿入して、またはガラクトースクラスターとsiRNAとの間にPEGスペーサーなしのいずれかで調製した。次いで、siRNA結合体を送達ポリマーと同時投与した。PEGスペーサーの挿入は、遺伝子ノックダウンにより判定して、siRNAの肝実質細胞への送達を改善しなかった。

PEGスペーサーなしのガラクトースクラスター；カルボキシル基を通じてsiRNAに結合された標的化リガンド

PEGスペーサーを有するガラクトースクラスター；カルボキシル基を通じてsiRNAに結合された標的化リガンド

（表１３）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン；RNA結合体におけるPEGリンカーの効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

実施例9. インビボでのsiRNAの霊長類肝実質細胞への送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを、前述のとおりに合成した。

アカゲザル（3.9kg雄）に、1.0mg/mlのコレステロール-siApoBおよび7.5mg/mlの7×重量比のCDM-PEG：CDM-NAG（2：1）で修飾したDW1360を含む溶液7.8mLをI.V.注射し、最終用量2mg/kgのコレステロール-siApoBおよび15mg/kgのDW1360を投与した。もう1匹のアカゲザル（4.5kg雄）に、等張グルコースを注射し、対照とした。

血清ApoBレベル判定
血清ApoBタンパク質レベルを経過中モニターした。霊長類を血清採取の前に4時間絶食させた。血清ApoBタンパク質レベルを標準のサンドイッチELISA法で求めた。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）を、それぞれ捕捉および検出抗体として用いた。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を後で適用し、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度をTecan Safire2（Austria, Europe）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。結果を表14に示す。コレステロール-siApoB siRNAを投与したアカゲザルは、経時的に血清ApoBレベルの低下を示し、第-1日の投与前レベルに比べて、注射後第15日に76％の最大ノックダウンに達した。ApoBレベルは第50日に第-1日の投与前レベル近くに回復した。対照動物では血清ApoBレベルの低下は観察されなかった。

（表１４）第1日に対して規準化した血清ApoBレベル

実施例10. 2つの遺伝子の一斉ノックダウン
2つの独立遺伝子、apoBおよび第VII因子へのsiRNA-コレステロール結合体、ならびにマスクしたDW1360送達ポリマーの同時投与は、両方の遺伝子の一斉阻害を引き起こした。組成物を前述のとおりにマウスに投与した。（表15）。

（表１５）2つの異なるsiRNA-疎水性物質結合体プラス400μgのDW1360送達ポリマー注射後のインビボでの標的遺伝子2個の一斉ノックダウン

^a等張グルコース溶液を注射した対照群（n＝3）に対するノックダウンパーセント

毒性評価
実施例11. 毒性
送達システムの潜在的毒性を、肝酵素およびサイトカインの血清レベルを測定することにより評価した。対照siRNAまたはapoB-1 siRNA結合体を投与したマウスでは、食塩水処置マウスに比べて、注射の48時間後にALTおよびASTレベルのわずかな上昇が検出された。しかし、上昇したレベルは有意ではなく（p＜0.05）、肝切片の組織検査からは肝毒性の徴候は見られなかった。同様に、ELISAを用いての血清中のTNF-αおよびIL-6レベルの分析により、siRNA-ポリマー結合体の注射の6時間後にいずれもわずかに上昇したことが明らかとなった。いずれのレベルも48時間までに基準線まで戻った。マウスまたはラットの最小有効用量で統計学的に有意な毒性は測定されなかった。これらの結果は、標的化送達システムが十分に耐容されることを示している。

実施例12.
siRNAは以下の配列を有していた：

小文字＝2'-O-CH₃置換
s＝ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf＝2'-F置換
ヌクレオチドの前のd＝2'-デオキシ

実施例13. GalNAcクラスターの合成
A. {2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステル

2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エタノール（62.2g、414mmol）をアルゴン雰囲気下で無水DMF 875mLに溶解し、0℃に冷却した。NaH（12.1g、277mmol、鉱油中55％）を注意深く加え、氷浴を取り除き、撹拌を80℃で1時間続けた。反応混合物を周囲温度まで冷却し、ブロモ酢酸（18.98g、137mmol）をDMF溶液（20ml）として滴加漏斗より加えて処理した。75℃でさらに30分後、ブロモメチル-ベンゼン（23.36g、137mmol）をニートで加え、エステル化を30分間進行させた。冷却し、砕氷上に注意深く加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、酢酸エチル/ヘプタン＝8/2）により、6.41gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS (ISP): 299.2 [M+H]⁺。

B. 酢酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-アセトキシ-5-アセトキシメチル-2-メチル-5,6,7,7a-テトラヒドロ-3aH-ピラノ[3,2-d]オキサゾル-7-イルエステル

市販の酢酸(2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルエステル（10.0g、26mmol）を無水CH₂Cl₂ 116mLに溶解し、トリメチルシリルトリフラート（14.27g、64mmol）で処理した。反応を45℃で終夜進行させた。0℃まで冷却した後、トリエチルアミン（4.88ml、35mmol）を加え、混合物をCH₂Cl₂で希釈し、NaHCO₃溶液および水で洗浄した。Na₂SO₄で乾燥し、溶媒を蒸発させて、10.3gの表題化合物を褐色油状物で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS (ISP): 330.0 [M+H]⁺。

C. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸ベンジルエステル

上で調製した酢酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-アセトキシ-5-アセトキシメチル-2-メチル-5,6,7,7a-テトラヒドロ-3aH-ピラノ[3,2-d]オキサゾル-7-イルエステル（10.3g、26mmol）および{2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステル（8.62g、29mmol）を520mLのCH₂Cl₂中で溶解し、4オングストロームモレキュラーシーブス63gで処理した。1時間後、トリメチルシリルトリフラート（6.13g、28mmol）を加えた。反応混合物を周囲温度で週末の間撹拌した。トリエチルアミン（5.21ml、37mmol）を加え、モレキュラーシーブスをろ去し、ろ液をCH₂Cl₂で希釈し、NaHCO₃溶液および水で洗浄した。Na₂SO₄で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、酢酸エチル/AcOH/MeOH/水＝60/3/3/2）により、15.7gの表題化合物を褐色油状物で得た。MS (ISP): 626.6 [M-H]^-。

D. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸

上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸ベンジルエステル（15.7g、25mmol）を酢酸エチル525mLに溶解し、1.6gのPd/C（10％）で、1atmのH₂雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH＝80/20）により、6.07gの表題化合物を褐色ゴムで得た。MS (ISP): 536.5 [M-H]^-。

E. GalNAcクラスターベンジルエステル

上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸（2.820g、5.246mmol）および(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩（調製は下記参照、0.829g、1.749mmol）をCH₂Cl₂ 32mLおよびDMF 3.2mLの混合物に溶解し、ヒューニッヒ塩基（2.096ml、12.25mmol）、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（0.714g、5.248mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.006g、5.248mmol）で逐次処理し、周囲温度で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧中で除去し、粗製反応混合物を調製用HPLC（38回、Gemini、5μ、C18）で精製し、凍結乾燥後に1.650gの表題生成物を白色粉末で得た。MS (ISP): 1945.8 [M+Na]⁺。NMR (600 MHz、DMSO)。

F. GalNAcクラスター遊離酸
(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-11-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘキサデカン-16-イル)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-11,18-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-12,19-ジアザヘニコサン-21-酸

上で調製したGalNAcクラスターベンジルエステル（0.674g、0.350mmol）をMeOH 50mLに溶解し、0.065gのPd/C（10％）で、1atmのH₂雰囲気下、周囲温度で4時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0.620gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS (ISP): 1917.0 [M+2H]²⁺。NMR (600 MHz、DMSO）。

実施例14. (S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩
必須の構築ブロックである(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩を以下のとおりに合成した。

A. (S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸（5.00g、10.67mmol）およびフェニル-メタノール（2.305g、21.34mmol）をCH₂Cl₂ 25mLに溶解し、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（1.933g、11.74mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC、2.250g、11.74mmol）、およびエチル-ジイソプロピル-アミン（2.137ml、12.49mmol）で逐次処理した。90分間撹拌した後、揮発性物質を周囲温度、減圧中で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、NH₄Cl溶液および食塩水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。次いで、粗製混合物をエタノール20mLに溶解し、水10mLを加えて生成物を沈澱させた。ろ過し、乾燥して、5.669gの表題化合物を得、これをエタノール/ヘキサンから再結晶して、4.27gの純粋なベンジルエステルを得た。MS (ISP): 559.2 [M+H]⁺。

B. (S)-2-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル（4.270g、7.643mmol）をTHF 15mLに溶解し、ジエチルアミン15mLで処理した。周囲温度で4時間後、MSおよびTLCは出発原料がないことを示した。溶媒を蒸発させ、トルエンと共沸乾燥して、4.02gの遊離アミンを得、これを次の段階で直接用いた。

市販の(S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸（3.177g、9.17mmol）をCH₂Cl₂ 13mLに溶解し、0℃でエチル-ジイソプロピル-アミン（4.71ml、27.5mmol）、O-(1,2-ジドロ-2-オキソ-ピリジル)--1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（TPTU、2.725g、9.172mmol）ならびに、15分後、上で調製したアミンの最小限のCH₂Cl₂溶液およびエチル-ジイソプロピル-アミン1.57mL（1,2当量）で処理した。反応を周囲温度で2時間進行させた。すべての揮発性物質を減圧中で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、NaHCO₃溶液、NH₄Cl溶液および水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、ヘプタン/酢酸エチル＝4/6）と、続いてヘプタン/最少量の酢酸エチルからの結晶化により、4.516gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 665.4 [M+H]⁺。

C. (S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル3塩酸塩

上で調製した(S)-2-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル（4.516、6.793mmol）をジオキサン中4mol/L HClに溶解した。数分後、ガスが発生し、沈澱が生じた。周囲温度で3時間後、反応混合物を注意深く蒸発させ、徹底的に乾燥して、3.81gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得、これをそれ以上精製せずに上の実施例13. E. GalNAcクラスターベンジルエステルで用いた。MS (ISP): 365.3 [M+H]⁺。

実施例15. GalNAcクラスター-siRNA結合体
A. 化合物1（150mg、0.082mmol）を無水メタノール（5.5ml）に溶解し、ナトリウムメチラート42μLを加えた（MeOH中25％溶液）。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。同量のメタノールと、同時にアニオン交換材料のAmberlite IR-120を分割して加え、pH約7.0とした。Amberliteをろ過により除去した。溶液をNa₂SO₄で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2を白色泡状物として定量的収率で得た。TLC（SiO₂、ジクロロメタン（DCM）/MeOH（5：1）＋0.1％CH₃COOH）：R_f2＝0.03；検出のために、MeOH中の硫酸の溶液（5％）を用い、続いて加熱した。ESI-MS、直接注入、負モード；[M-H]^-1 _計算値：1452.7；[M-H]^1- _測定値：1452.5。

B. 化合物2（20mg、0.014mmol）をピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMF（0.9ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の溶液（1.6mg、0.014mmol）を加えた。0℃でDMF中のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の溶液（3.2mg、0.016mmol）をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。化合物3をそれ以上精製せずにRNAへの結合に用いた。

C. アミノ修飾RNAの合成
センス鎖の5'末端にC-6-アミノリンカーを有するRNAを、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, Germany）および固体支持体として細孔制御ガラス（controlled pore glass）を用い、1215μmolの規模で、固相上、標準のホスホラミダイト化学により産生した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイトおよびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイトを用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製を、当技術分野において公知の方法により達成した（Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84）。

アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCにより特徴付け（純度：96.1％）、同一性をESI-MSにより確認した（[M+H]¹⁺ _計算値：6937.4；[M+H]¹⁺ _測定値：6939.0。配列：

；u、c：対応する塩基の2'-O-メチルヌクレオチド、s：ホスホロチオアート。

D. GalNAcクラスターのRNAへの結合
5'末端にC-6-アミノリンカーを有するRNA（2.54μmol）を凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/Lホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1mol/L KCl）および1.1mL DMSOに溶解した。8μLのN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液（理論的には0.014mmol）をゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC（Resource RPC 3ml、緩衝液：A：水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA、2.0M、pH7.0）、B：95％アセトニトリル中100mM TEAA、勾配：20CVで5％Bから22％B）を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム（3M）を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体4を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させ、純粋なRNA結合体を得た。結合体4を収率59％で単離した（1.50μmol）。結合体4の純度をアニオン交換HPLCで分析し（純度：85.5％）、同一性をESI-MSにより確認した（[M+H]¹⁺ _計算値：8374.4；[M+H]¹⁺ _測定値：8376.0。（図6）

E. 結合体4（センス鎖）を2'-O-メチル-修飾アンチセンス鎖とアニールさせた。配列：

アポリポタンパク質B mRNAに向けたsiRNA結合体を、アニーリング緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、pH6.8；100mM塩化ナトリウム）中の相補鎖の等モル溶液を混合し、85〜90℃の水浴中で3分間加熱し、3〜4時間の間に室温まで冷却することにより生成した。二重鎖形成を、未変性ゲル電気泳動により確認した。

実施例16. 疎水性基-siRNA結合体

RNA合成を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, Germany）および固体支持体としての細孔制御ガラス（CPG）を用い、固相上、標準のホスホラミダイト化学により実施した。

5'-C10-NHSエステル修飾センス鎖、

を、Glen Research（Virginia, USA）からの5'-Carboxy-Modifier C10アミダイトを用いて調製した。まだ固体支持体に結合している活性化合物RNAを以下の表に挙げる親油性アミンとの結合のために用いた。CfおよびUfは対応する塩基の2'-フルオロヌクレオチドであり、sはホスホロチオアート連結である。
センス鎖配列：

アンチセンス鎖配列：

センス鎖CPG 100mg（ローディング60μmol/g、RNA 0.6μmol）を、Sigma Aldrich Chemie GmbH（(Taufkirchen, Germany）またはFluka（Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland）から入手した対応するアミン0.25mmolと混合した。

（表１６）疎水性基-siRNA結合体生成において用いる親油性アミン

混合物を40℃で18時間振盪した。RNAを水酸化アンモニウム水溶液（NH₃、33％）により45℃で終夜処理して、固体支持体から切断し、脱保護した。2'-保護基をTEA×3HFにより65℃で3.5時間処理して除去した。粗製オリゴヌクレオチドをRP-HPLC（Resource RPC 3ml、緩衝液：A：水中100mM TEAA、B：95％CH₃CN中100mM TEAA、勾配：15CVで3％Bから70％B、ただしNr 7だけは勾配：15CVで3％Bから100％B）により精製した。

（表１７）疎水性基-RNA結合体、RP-HPLCおよびESI-MS（負モード）による特徴付け

RNA一本鎖からsiRNAを生成するために、等モル量の相補鎖およびアンチセンス鎖をアニーリング緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、pH6.8；100mM塩化ナトリウム）中で混合し、80℃で3分間加熱し、3〜4時間の間に室温まで冷却した。第VII因子mRNAに向けたsiRNAをゲル電気泳動により特徴付けた。

Claims (30)

1. 下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
   a）少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
   b）一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性膜活性ポリアミンであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合をそれぞれ介して該両親媒性膜活性ポリアミンに、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有する複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、両親媒性膜活性ポリアミン；そして、
   ここで前記オリゴヌクレオチドは該両親媒性膜活性ポリアミンに結合していない、かつ、前記両親媒性膜活性ポリアミンは赤血球を溶かすことができる。
2. 下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
   a）ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーに共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
   b）一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性膜活性ポリアミンであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合をそれぞれ介して該両親媒性膜活性ポリアミンに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、両親媒性膜活性ポリアミン；そして、
   ここで前記オリゴヌクレオチドは該両親媒性膜活性ポリアミンに結合していない、かつ、前記両親媒性膜活性ポリアミンは赤血球を溶かすことができる。
3. 下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
   

   

   式中、
   Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、
   L²はpHに不安定なマレアマート連結であり、
   M¹は、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトース誘導体を含む電荷中性マスキング剤であり、
   M²はポリエチレングリコールを含む電荷中性マスキング剤であり、
   yおよびzは、ゼロよりも大きいかまたは等しい整数であり、ここでyおよびzを合わせた値はPのアミンの50％よりも大きく、
   Nはオリゴヌクレオチドであり、
   Aは、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
   M¹およびM²のマレアマート連結L²を通じての結合による、両親媒性膜活性ポリアミンPの一級アミンの数の50％よりも多くの修飾により、Pの正電荷は中和され、かつPの膜活性は可逆的に阻害され；かつ
   pHの低下に反応してのL²の切断が、Pのアミンおよび膜活性を復旧する、かつ、前記両親媒性膜活性ポリアミンは赤血球を溶かすことができる。
4. 下記の段階を含む、オリゴヌクレオチド送達組成物の製造法：
   a）両親媒性膜活性ポリアミンを形成する段階；
   b）ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトース誘導体を含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第一のマスキング剤を形成する段階；
   c）ポリエチレングリコールを含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第二のマスキング剤を形成する段階；
   d）両親媒性膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する段階であって、ここで阻害は、両親媒性膜活性ポリアミンを第一および第二のマスキング剤と反応させ、それにより、生理的にpHに不安定な二置換マレアマート連結を介して複数のガラクトース誘導体および複数のポリエチレングリコールを両親媒性膜活性ポリアミンに連結させることにより、両親媒性膜活性ポリアミン上のアミンの数の50％以上を修飾することからなる、段階；および
   e）オリゴヌクレオチドを、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に連結する段階；
   f）インビボでの投与に適した溶液中にオリゴヌクレオチドおよび可逆的に阻害された両親媒性膜活性ポリアミンを提供する段階；
   ここで、前記両親媒性膜活性ポリアミンは赤血球を溶かすことができる。
5. オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
6. 肝細胞が肝実質細胞からなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
7. 両親媒性膜活性ポリアミンが一級アミン含有モノマーおよび疎水性基含有モノマーを含む、請求項3記載の組成物。
8. 両親媒性膜活性ポリアミンが、一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから構成される、請求項7記載の組成物。
9. 可逆的にマスクした両親媒性膜活性ポリアミンが水溶性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
10. 両親媒性膜活性ポリアミンがランダムコポリマーである、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
11. ランダムコポリマーが、ポリ(ビニルエーテル)およびポリ(アクリラート)からなる群より選択される、請求項10記載の組成物。
12. 一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーが、4〜8一級アミン含有モノマー：3〜5低級疎水性基含有モノマー：1高級疎水性基含有モノマーの比で存在する、請求項1、2、または8のいずれか一項記載の組成物。
13. 低級疎水性基がブチル基からなり、かつ高級疎水性基がオクタデシルまたはドデシル基からなる、請求項12記載の組成物。
14. マスキング剤が、両親媒性膜活性ポリアミン上の一級アミンの数の少なくとも70％に可逆的に連結している、請求項3記載の組成物。
15. マスキング剤が、両親媒性膜活性ポリアミン上の一級アミンの数の少なくとも80％に可逆的に連結している、請求項14記載の組成物。
16. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+30から-30mVのゼータ電位を有する、請求項1〜3および5〜15のいずれか一項記載の組成物。
17. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+20から-20mVのゼータ電位を有する、請求項16記載の組成物。
18. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+10から-10mVのゼータ電位を有する、請求項17記載の組成物。
19. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-30mVのゼータ電位を有する、請求項1〜3および5〜15のいずれか一項記載の組成物。
20. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-20mVのゼータ電位を有する、請求項19記載の組成物。
21. 可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-10mVのゼータ電位を有する、請求項20記載の組成物。
22. 薬学的に許容される担体または希釈剤中で提供される、請求項1〜3および5〜21のいずれか一項記載の組成物。
23. マレアマート連結が二置換マレアマート連結である、請求項3記載の組成物。
24. NがAに生理的に不安定な連結L¹を介して連結されている、請求項3記載の組成物。
25. L¹が、マレアマートに直交する生理的に不安定な共有結合である、請求項24記載の組成物。
26. Aが、20個またはそれ以上の炭素原子を有する前記疎水性基を含む、請求項3記載の組成物。
27. Aが、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有する前記ガラクトーストリマーを含む、請求項3記載の組成物。
28. 両親媒性膜活性ポリアミンに連結されているガラクトース誘導体のPEGに対する比が1対0.5〜2である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
29. ガラクトース誘導体がN-アセチルガラクトサミンからなる、請求項1〜3および5〜28のいずれか一項記載の組成物。
30. ガラクトーストリマーがN-アセチルガラクトサミントリマーからなる、請求項2〜3、5〜25または27〜29のいずれか一項記載の組成物。

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