ES2812099T3 - Composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de la hormona del crecimiento - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que tiene la siguiente estructura química: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de la hormona del crecimiento
Campo
Los presentes casos proporcionan métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con un exceso de hormona del crecimiento usando compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento (GHR).
Antecedentes
La hormona del crecimiento se produce en la glándula pituitaria y se secreta en el torrente sanguíneo donde se une al receptor de la hormona del crecimiento (GHR) en muchos tipos de células, provocando la producción del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1). El IGF-1 se produce principalmente en el hígado, pero también en el tejido adiposo y el riñón, y se secreta al torrente sanguíneo. Varios trastornos, como la acromegalia y el gigantismo, están asociados con niveles elevados de hormona del crecimiento y/o niveles elevados de IGF-I en plasma y/o tejidos.
La producción excesiva de la hormona del crecimiento puede llevar a enfermedades como la acromegalia o el gigantismo. La acromegalia y el gigantismo están asociados con un exceso de hormona del crecimiento, provocado a menudo por un tumor hipofisario, y afecta a 40-50 por millón de personas en todo el mundo, con aproximadamente 15.000 pacientes en cada uno de los Estados Unidos y Europa y una incidencia anual de aproximadamente 4-5 por millón de personas. La acromegalia y el gigantismo se caracterizan inicialmente por un crecimiento anormal de las manos y los pies y cambios óseos en las características faciales. Muchos de los resultados relacionados con el crecimiento están mediados por niveles elevados de IGF-1 en suero.
Tachas et al. J Endocrinol. 2006 Abril:189(1):147-54 describe el análisis in vitro de un oligodesoxinucleótido de fosforotioato modificado con 2’-O-(2-metoxietilo).
Sumario de la invención
La invención proporciona un compuesto que tiene la siguiente estructura química:
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La invención proporciona además composiciones que comprenden el compuesto de la invención, o una sal del mismo y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención, o la composición de la invención, para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada con el exceso de la hormona del crecimiento en un humano, en donde el uso comprende administrar al humano la cantidad terapéuticamente eficaz, tratando de este modo la enfermedad asociada con el exceso de la hormona de crecimiento, opcionalmente en donde (a) la enfermedad asociado con el exceso de la hormona de crecimiento es acromegalia y/o (b) el tratamiento reduce los niveles de IGF-1.
Sumario de la divulgación
Los casos de la divulgación descrita en la presente se refieren a métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con el exceso de la hormona del crecimiento. Varios casos descritos en la presente están dirigidos a compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento (GHR). Varios casos están dirigidos al tratamiento, prevención o mejora de la acromegalia con compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento (GHR).
Descripción detallada
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son los bien conocidos y usados comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico. Ciertas de tales técnicas y procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" editado por Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"Nucleósido 2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende flúor en la posición 2'. A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido 2'-F está en la posición ribo (reemplazando el OH de una ribosa natural).
“2'-O-metoxietilo” (también de 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado 2'-MOE.
"Nucleósido 2’-sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido 2’-sustituido no es un nucleósido bicíclico.
"Fracción de azúcar 2’-sustituido" significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, una fracción de azúcar 2’-sustituido no es una fracción de azúcar bicíclico (es decir, el sustituyente en 2' de una fracción de azúcar 2’-sustituido no forma un puente con otro átomo del anillo de furanosilo.
“Sitio objetivo 3’ “ se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de ±10% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos efectuaron por lo menos aproximadamente un 70% de inhibición de GHR", está implicado que los niveles de GHR se inhiben dentro de un intervalo del 60% y el 80%.
"Administración" o "administrar" se refiere a vías para introducir un compuesto antisentido proporcionado en la presente a un sujeto para realizar su función pretendida. Un ejemplo de una vía de administración que puede usarse incluye, pero no está limitada a la administración parenteral como inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
"Alquilo", como se usa en la presente, significa un radical de hidrocarburos lineal o ramificado saturado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo lo más preferido de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, "alquenilo" significa un radical de cadena de hidrocarburos lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un enlace doble carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1 -metil-2-buten-1 -ilo, dienos como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo lo más preferido de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alquinilo" significa un radical de hidrocarburos lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo lo más preferido de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alicíclico" significa un sistema de anillos cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que por lo menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, como se usa en la presente, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alifático" significa un radical de hidrocarburos lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en donde la saturación entre dos átomos de carbono cualquiera es un enlace simple, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede estar interrumpida con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Tales grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en donde el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C1-C12 amino sustituido. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino puede estar localizado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede sustituirse con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.
Como se usa en la presente, "aralquilo" y "arilalquilo" significa un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción de radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Los ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Como se usa en la presente, "arilo" y "aromático" significan un radical de sistema de anillso carbocíclico mono- o policíclico que tiene uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillos de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Mejora" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. En ciertas realizaciones, la mejora incluye un retraso o desaceleración en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
"Mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o efecto de la hibridación es o la degradación del objetivo o la ocupación del objetivo con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el apareamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen invertida entre las nucleobases correspondientes.
"Fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo, pero no limitado a, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" o "nucleósidos de BNA" significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Estructura de tapa" o "fracción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"Carbohidrato" significa un carbohidrato de origen natural, un carbohidrato modificado o un derivado de carbohidrato.
"Agrupación de carbohidratos" significa un compuesto que tiene uno o más residuos de carbohidratos unidos a un andamiaje o grupo conector. (ver, por ejemplo, Maier et al., “Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,” Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18­ 29, o Rensen et al., "D ,“Design and Synthesis of Novel N- Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,” J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de agrupaciones de conjugados de carbohidratos)
"Derivado de carbohidratos" significa cualquier compuesto que pueda sintetizarse usando un carbohidrato como material de partida o producto intermedio.
"cEt" o "etilo restringido" significa una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
“Nucleósido de acetato restringido” (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Modificación química" significa una diferencia química en un compuesto en comparación con una contrapartida de origen natural. Las modificaciones químicas de los oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluyendo modificaciones de fracciones de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
"Compuestos antisentido quiméricos" significa compuestos antisentido que tienen por lo menos 2 regiones químicamente distintas, cada posición teniendo una pluralidad de subunidades.
"Enlace escindible" significa cualquier enlace químico capaz de dividirse. En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
"Fracción escindible" significa un enlace o grupo que es capaz de dividirse en condiciones fisiológicas. En ciertas realizaciones, una fracción escindible se escinde dentro de una celda o compartimentos subcelulares, como un lisosoma. En ciertas realizaciones, una fracción escindible es escindida por enzimas endógenas, como nucleasas. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración abarca la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de apareamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Comprender", "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Conjugado" o "grupo conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidos incluyendo, pero no limitado a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o eliminación.
"Conector conjugado" o "conector" en el contexto de un grupo conjugado significa una porción de un grupo conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1) un oligonucleótido con otra porción del grupo conjugado o (2) dos o más porciones del grupo conjugado.
Los grupos conjugados se muestran en la presente como radicales, proporcionando un enlace para formar una unión covalente a un compuesto oligomérico como un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3' del grupo hidroxilo 3' del nucleósido terminal 3' del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5' del grupo hidroxilo 5' del nucleósido terminal 5' del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el enlace para formar la unión al compuesto oligomérico es un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones, dicho enlace escindible constituye todo o parte de una fracción escindible.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden una fracción escindible (por ejemplo, un enlace escindible o nucleósido escindible) y una porción de la agrupación de carbohidratos, como una porción de una agrupación GalNAc. Dicha porción de agrupación de carbohidratos comprende: una fracción de direccionamiento y, opcionalmente, un conector conjugado. En ciertas realizaciones, la porción de la agrupación de carbohidratos se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la porción de la agrupación de carbohidratos comprende 3 grupos GalNAc y se designa "GalNAc3". En ciertas realizaciones, la porción de la agrupación de carbohidratos comprende 4 grupos GalNAc y se designa "GalNAc4". En la presente se describen porciones específicas de agrupaciones de carbohidratos (que tienen grupos específicos de unión, ramificación y conector conjugado) y se designan con un número romano seguido del subíndice "a". Por consiguiente "GalNAc3-1a" se refiere a una porción de la agrupación de carbohidratos específica de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNAc y grupos de unión, ramificación y enlace específicamente identificados. Dicho fragmento de agrupación de carbohidratos se une a un compuesto oligomérico a través de una fracción escindible, como un enlace escindible o un nucleósido escindible.
"Compuesto conjugado" significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados adecuado para usar como grupo conjugado. En ciertas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, que incluyen, pero no se limitan a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
“Nucleósido de etilo restringido” o “cEt” significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende aun puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende la fracción de azúcar furanosilo 2'-H, como se encuentra en los desoxirribonucleósidos (ADN) de origen natural. En ciertas realizaciones, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
"Diseñar" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseñar un compuesto oligomérico que híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Modificado de manera diferente" significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado están "modificados de manera diferente", incluso aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. De igual manera, el ADN y el ARN están "modificados de manera diferente", a pesar de que ambos son nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden nucleobases diferentes no están modificados de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no están modificados de manera diferente.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionado en una única administración, o en un período de tiempo específico. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no fácilmente acomodado por una única inyección, por lo tanto, pueden usarse dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cadena doble" se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que se hibridan entre sí. Dichos compuestos de cadena doble pueden tener uno o más nucleósidos no hibridantes en uno o ambos extremos de una o ambas cadenas (voladizos) y/o uno o más nucleósidos no hibridantes internos (malapareamientos) siempre que haya suficiente complementariedad para mantener la hibridación bajo condiciones fisiológicamente relevantes.
"Sentido descendente" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 3' o el extremo C terminal de un ácido nucleico.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo con necesidad del agente. La cantidad eficaz puede variar entre las personas dependiendo de la salud y la condición física de la persona a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo, y otros factores relevantes.
"Cantidad eficaz" en el contexto de la modulación de una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto con necesidad de dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o la profilaxis o la mejora de esa afección. La cantidad eficaz puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Esencialmente sin cambios" significa poco o ningún cambio en un parámetro particular, particularmente con respecto a otro parámetro que cambia mucho más. En ciertas realizaciones, un parámetro esencialmente no cambia cuando cambia menos del 5%. En ciertas realizaciones, un parámetro esencialmente no cambia si cambia menos de dos veces mientras que otro parámetro cambia por lo menos diez veces. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, la cantidad de un ácido nucleico no objetivo esencialmente no cambia si cambia mucho menos que lo que lo hace el ácido nucleico objetivo, pero el cambio no necesita ser cero.
"Expresión" significa el proceso por el cual un gen finalmente resulta en una proteína. La expresión incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional (por ejemplo, corte y empalme, poliadenilación, adición de tapa 5') y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Furanosilo" significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Receptor de hormona del crecimiento (GHR)" significa cualquier ácido nucleico o proteína de GHR. "Ácido nucleico de GHR" significa cualquier ácido nucleico que codifica GHR. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de GHR incluye una secuencia de ADN que codifica GHR, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica GHR (incluyendo el ADN genómico que comprende intrones y exones), que incluye una secuencia de ARN no codificante de proteínas (es decir, no codificante) , y una secuencia de ARNm que codifica GHR. “ARNm de GHR” significa un ARNm que codifica una proteína de GHR.
"Inhibidor específico de GHR" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión o actividad de ARN de GHR y/o proteína de GHR a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de GHR incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARN de GHR y/o proteína de GHR.
"Halo" y "halógeno" significan un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
"Heteroarilo" y "heteroaromático" significan un radical que comprende un anillo aromático mono- o policíclico, un sistema de anillo o un sistema de anillo fusionado en el que por lo menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se pretende que heteroarilo incluya sistemas de anillos fusionados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo típicamente incluyen un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo pueden unirse a una molécula original directamente o a través de una fracción de enlace, como un grupo alifático o un heteroátomo. Los grupos heteroarilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Hibridación" significa el alineamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un compuesto antisentido y un objetivo de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno y/o afección" significa identificar un animal que ha sido diagnosticado con la enfermedad, trastorno y/o afección o identificar un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos adyacentes inmediatos.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Grupo de enlace neutro internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que une directamente dos nucleósidos.
"Grupo de enlace de fósforo internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que une directamente dos nucleósidos.
Los oligonucleótidos antisentido "alargados" son aquellos que tienen uno o más nucleósidos adicionales con respecto a un oligonucleótido antisentido divulgado en la presente.
"Motivo de enlace" significa un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o región del mismo. Los nucleósidos de dicho oligonucleótido pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, los motivos que en la presente describen solo enlaces se pretende que sean motivos de enlace. Por tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
"Desoxinucleósido enlazado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa enlazada por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
"Nucleósidos enlazado" significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico.
"Núcleosido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" "Ácido nucleico bloqueado" o "LNA" o "nucleósidos de LNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no están limitados a, A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (B) p-D-metileneoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etileneoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-ON(R)-2') LNA y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA, como se muestra a continuación.
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Como se usa en la presente, los compuestos de LNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x y -N(R1)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2 -C12, alquenilo C2 -C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) y sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1 -C12 sustituido, alquenilo C2-C12 , alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12 , alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1 -C12 sustituido o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4'-2' incluidos en la definición de LNA incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1R2)-O-N(R1)-.. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de lNa son los puentes 4,-CH2-2,,4,-(CH2)2-2,,4,-(CH2)3-2,,4,-CH2-O-2,,4'-(CH2)2-O-2f,4f-CH2-O-N(R1)-2f y 4f-CH2-N(R1)-O-2f-, en donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
También se incluyen dentro de la definición de LNA de acuerdo con la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar de ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un puente metileneoxi (4'-CH2-O-2') para formar la fracción de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se usa el término metileneoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso de la fracción de azúcar bicíclico que tiene un grupo etileno puente en esta posición, se usa el término etilenoxi (4'-CH2CH2-O-2') LNA. El a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metileneoxi (4'-CH2-O-2') LNA también está incluido en la definición de LNA, como se usa en la presente.
"Trastorno metabólico" significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por la desregulación del metabolismo, el complejo conjunto de reacciones químicas asociadas con la descomposición de los alimentos para producir energía.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso cuando una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Carbohidrato modificado" significa cualquier carbohidrato que tenga una o más modificaciones químicas con respecto a los carbohidratos naturales.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa sustitución y/o cualquier cambio de una fracción de azúcar natural. "Fracción de azúcar modificado" significa una fracción de azúcar sustituido o un sustituto de azúcar.
"Modulación" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, la modulación del ARNm de GHR puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de GHR y/o proteína de GHR en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de GHR puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de GHR y/o proteína de GHR en una célula, tejido, órgano u organismo.
"MOE" significa -OCH2CH2OCH3.
"Monómero" se refiere a una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
Se entiende que "sistema de anillos mono o policíclico" incluye todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillo de radicales simples o policíclicos en donde los anillos están fusionados o enlazados y se entiende que incluye sistemas de anillo simples y mixtos seleccionados individualmente de alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tienen varios grados de saturación, incluyendo completamente saturado, parcialmente saturado o completamente insaturado. Cada anillo puede comprender átomos del anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como a anillos que comprenden solo átomos en el anillo C que pueden estar presentes en un motivo mixto, como por ejemplo bencimidazol, en donde un anillo tiene solo átomos en el anillo de carbono y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillos mono o policíclico puede sustituirse adicionalmente con grupos sustituyentes como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillos mono o policíclicos pueden unirse a las moléculas originales usando varias estrategias, como directamente a través de un átomo del anillo, fusionarse a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o a través de una fracción de enlace bifuncional.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido. "Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar encontrada en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). "Fracción de azúcar de origen natural" significa un ribofuranosilo como se encuentra en el ARN natural o un desoxirribofuranosilo que se encuentra en ADN de origen natural.
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Grupo de enlace neutro" significa un grupo de enlace que no está cargado. Los grupos de enlace neutro incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (ver, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (págs. 40-65)). Grupos de enlace neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o que soportan de otro modo la hibridación.
"Grupo de enlace neutro no internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Grupo de enlace de fósforo no internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla y ácidos nucleicos de cadena doble.
"Nucleobase" significa una fracción heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico. "Complementariedad de nucleobase" o "complementariedad" cuando se refiere a nucleobases significa una nucleobase que es capaz de aparearse por bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de aparearse por bases con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de unirse por hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico objetivo, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo se considera complementaria en ese par de nucleobases. Las nucleobases que comprenden ciertas modificaciones pueden mantener la capacidad de emparejarse con una nucleobase equivalente y, por lo tanto, todavía son capaces de complementariedad de nucleobases.
"Motivo de modificación de la nucleobase" significa un patrón de modificaciones a las nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de nucleobases.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobases.
"Nucleósido" significa un compuesto que comprende una fracción de nucleobase y una fracción de azúcar. Los nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos de origen natural (como se encuentran en el ADN y el ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar enlazados a una fracción de fosfato.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como por ejemplo miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcar de morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el mimético de nucleósido de término ligeramente más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillos de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar del azúcar o la combinación de enlace de azúcar-internucleosido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con un objetivo seleccionado.
"Motivo de nucleósido" significa un patrón de modificaciones de nucleósidos en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de dicho oligonucleótido pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, los motivos que describen en la presente solo nucleósidos se pretende que sean motivos de nucleósidos. Por tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
El "efecto fuera de objetivo" se refiere a un efecto biológico no deseado o nocivo asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen que no sea el ácido nucleico objetivo pretendido.
"Compuesto oligomérico" significa una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico consiste de un oligonucleótido. Los compuestos oligoméricos también incluyen ácidos nucleicos de origen natural. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende una estructura principal de una o más subunidades monoméricas enlazadas donde cada subunidad monomérica enlazada está unida directa o indirectamente a una fracción de base heterocíclica. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos también pueden incluir subunidades monoméricas que no están enlazadas a una fracción de base heterocíclica, proporcionando de este modo sitios abásicos. En ciertas realizaciones, los enlaces que unen las subunidades monoméricas, las fracciones o sustitutos de azúcar y las fracciones de base heterocíclica pueden modificarse independientemente. En ciertas realizaciones, la unidad de azúcar de enlace, que puede incluir o no una base heterocíclica, puede estar sustituida con un mimético como los monómeros en ácidos nucleicos peptídicos.
"Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que los enlaces internucleosídicos no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede modificarse o no modificarse, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa un molecular formado enlazando por lo menos dos aminoácidos por enlaces amida. Sin limitación, como se usa en la presente, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido conjugado dirigido a GHR es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Grupo de enlace de fósforo" significa un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, grupos que tienen la fórmula:
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en donde:
Ra y Rd son cada uno, independientemente, O, S, CH2 , NH, o NJ1 en donde J1 es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
Rb es O o S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tioalalquilfosfonato, fosfotriésteres, tioalalquilfosfotriéster y boranofosfato.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace de fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o impedir el inicio, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Profármaco" significa una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto, se metaboliza para formar el compuesto activo o más activo (por ejemplo, fármaco).
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Grupo protector" significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos no limitativos de grupos protectores pueden encontrarse en "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Compuesto antisentido a base de RISC" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC).
"Compuesto antisentido a base de RNasa H" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo y la posterior escisión del ácido nucleico objetivo por la RNasa H.
"Sales" significa una sal fisiológica y farmacéuticamente aceptable de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
Los "segmentos" se definen como porciones más pequeñas pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Regiones separadas" significa porciones de un oligonucleótido en las que las modificaciones químicas o el motivo de las modificaciones químicas de cualquier porción colindante incluyen por lo menos una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan entre sí.
"Motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o una porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, por tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo ninguna modificación química.
"Efectos secundarios" significa enfermedad y/o afecciones fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, los niveles de aminotransferasa aumentados en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, la bilirrubina aumentada puede indicar toxicidad hepática o anomalí de la función hepática.
"De cadena sencilla" significa un compuesto oligomérico que no hibrida con su complemento y que carece de suficiente autocomplementariedad para formar un auto-dúplex estable.
"Sitios", como se usan en la presente, se definen como posiciones únicas de nucleobases dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Retrasa la progresión" significa disminución en el desarrollo de dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o ninguno sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que un compuesto oligomérico hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Sustituyente" y "grupo sustituyente" significa un átomo o grupo que reemplaza el átomo o grupo de un compuesto original nombrado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo encontrado en un nucleósido de origen natural (por ejemplo, un sustituyente 2' modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H u OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o no protegidos. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una o en más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o mediante un grupo de enlace como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto original.
De igual manera, como se usa en la presente, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos normalmente presente en el grupo funcional nombrado. En ciertas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto del hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles de uso como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-ORaa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (-C(O)N(RbbHRcc) o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)- (Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2 Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) or -N(Rbb)S-(O)2Rbb). En donde cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en la presente están presentes en un grado recursivo.
"Fracción de azúcar sustituido" significa un furanosilo que no es una fracción de azúcar de origen natural. Las fracciones de azúcar sustituidos incluyen, pero no se limitan a furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Ciertas fracciones de azúcar sustituido son fracciones de azúcar bicíclico.
"Fracción de azúcar" significa una fracción de azúcar de origen natural o una fracción de azúcar modificada de un nucleósido.
"Motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar en un oligonucleótido o una región del mismo.
"Sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar la fracción de azúcar de origen natural de un nucleósido, de tal manera que las subunidades de nucleósidos resultantes son capaces de enlazarse entre sí y/o enlazarse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridar con un compuesto oligomérico complementario. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número diferente de átomos que el furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo que no es de oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Tales estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para fracciones de azúcar sustituido (por ejemplo, sustitutos del azúcar bicíclico carbocíclico de 6 miembros que opcionalmente comprenden sustituyentes adicionales). Los sustitutos del azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (por ejemplo, los sistemas sin anillo del ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
"Objetivo" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
“Ácido nucleico objetivo”, “ARN objetivo”, “transcripción de ARN objetivo” y “objetivo de ácido nucleico” significan todos un ácido nucleico capaz de ser el objetivo de compuestos antisentido. "Ácido nucleico objetivo" significa una molécula de ácido nucleico con la cual se pretende que hibride un compuesto antisentido para dar como resultado una actividad antisentido deseada. Los oligonucleótidos antisentido tienen suficiente complementariedad con sus ácidos nucleicos objetivo para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.
"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo a la que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Grupo terminal" significa uno o más átomos unidos a cualquiera, o ambos del extremo 3' o el extremo 5' de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.
"Enlace internucleosídico terminal" significa el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o región definida del mismo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"El mismo tipo de modificaciones" se refiere a modificaciones que son iguales entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen "el mismo tipo de modificación", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Dichos nucleósidos que tienen el mismo tipo de modificación pueden comprender diferentes nucleobases.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para realizar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertas realizaciones, pueden administrarse una o más composiciones farmacéuticas al animal.
"Tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
Nucleobases "no modificadas" o "nucleobase de origen natural" significa las nucleobases heterocíclicas de origen natural de ARN o ADN: las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) (incluyendo 5 -metil C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos de origen natural. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
"Sentido ascendente" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 5' o el extremo N-terminal de un ácido nucleico.
"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertos casos de la divulgación
Ciertos casos describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión del receptor de la hormona del crecimiento (GHR).
Ciertos casos proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de GHR. En ciertos casos, el ácido nucleico de GHR tiene la secuencia expuesta en el N° de registro GENBANK NM_000163.4 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), el N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncado de los nucleótidos 42411001 a 42714000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de registro GENBANK X06562.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de registro GENBANK DR006395.1 (incorporado en la presente como SEQ ID nO: 4), N° de registro GENBANK DB052048.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5), N° de registro GENBANK AF230800.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 6), el complemento del N° de registro GENBANK AA398260.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de registro GENBANK BC136496.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de registro GENBa Nk NM_001242399.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 9), N° de registro GENBANK NM_001242400.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 10), N° de registro GeNbANK NM_001242401.3 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 11), N° de registro GENBANK NM_001242402.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 12), N° de registro GENBANK NM_001242403.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 13), N° de registro GENBANK NM_001242404.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 14), N° de registro g En BANK NM_001242405.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 15), N° de registro GeNbANK NM_001242406.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 16), N° de registro GENBANK NM_001242460.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 17), registro GENBANK NM_001242461.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 18), o N° de registro g En BANK NM_001242462.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 19).
En ciertos casos, un compuesto comprende un compuesto antisentido u oligonucleótido y un grupo conjugado, en donde el compuesto antisentido u oligonucleótido está dirigido al intrón 2 de un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido u oligonucleótidos se dirigen dentro de los nucleótidos 145047-208139 (intrón 2) de un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 2 (N° de acceso GENBANK NT_006576.16 truncado de los nucleótidos 42411001 a 42714000).
En ciertos casos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, por lo menos un azúcar modificado y/o por lo menos una nucleobase modificada.
En ciertos casos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos un azúcar modificado. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2' o un grupo 4'-(CH2) 2-O-2'.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, como un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertos casos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos una nucleobase modificada, como una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende:
un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
Ciertos casos describen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 918, 479, 703, 1800, 1904, 2122, 2127 o 2194.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 918, 479 o 703, en donde el oligonucleótido modificado comprende un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 1800, 1904, 2122, 2127 o 2194, en donde el oligonucleótido modificado comprende nucleósidos que tienen una modificación de azúcar MOE, modificación de azúcar y (S)-cEt, o una modificación desoxi; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado de cadena sencilla y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 918, 479 o 703, en donde el modificado oligonucleótido comprende
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado de cadena sencilla y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 16 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 1800, 1904, 2122, 2127, o 2194, en donde el oligonucleótido modificado comprende nucleósidos que tienen o una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o una modificación desoxi; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR y un grupo conjugado. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 532401 y un grupo conjugado.
En cualquiera de los casos anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser por lo menos un 80%, por lo menos un 81%, por lo menos un 82%, por lo menos un 83%, por lo menos un 84%, por lo menos un 85%, por lo menos un 86%, por lo menos un 87%, por lo menos un 88%, por lo menos un 89%, por lo menos un 90%, por lo menos un 91%, por lo menos un 92%, por lo menos un 93%, por lo menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99% o 100% complementario con un ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona del crecimiento.
En cualquiera de los casos anteriores, el ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona del crecimiento puede comprender la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -19.
En cualquiera de los casos anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser de cadena sencilla.
En cualquiera de los casos anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser de cadena doble.
En ciertos casos, por lo menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado.
En ciertos casos, por lo menos un enlace internucleosídico modificado del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster.
En ciertos casos, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertos casos, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato.
En ciertos casos, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada.
En ciertos casos, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un azúcar modificado.
En ciertos casos, el azúcar modificado es un azúcar 2’-modificado', un BNA o un THP.
En ciertos casos, el azúcar modificado es cualquiera de un 2'-O-metoxietilo, 2'-O-metilo, un etilo restringido, un LNA o un 3'-fluoro-HNA.
En ciertos casos, el compuesto comprende por lo menos un nucleósido de 2'-O-metoxietilo, un nucleósido de 2'-O-metilo, un nucleósido de etilo restringido, un nucleósido de LNA o un nucleósido de 3'-fluoro-HNA.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de 5 nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de 5 nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado consiste de 19 nucleósidos enlazados.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado consiste de 18 nucleósidos enlazados.
Ciertos casos describen compuestos que consisten de un grupo conjugado y un oligonucleótido modificado de acuerdo con la fórmula siguiente: mCes mCes Aes mCes mCes Tds Tds Tds Gds Gds Gds Gds Tds Gds Ads Ads Tes Aes Ges mCes Ae; donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido, y
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc en el extremo 5'. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 532401 conjugado con GalNAc en el extremo 5', como se define en las reivindicaciones. En realizaciones adicionales, el compuesto tiene la siguiente estructura química que comprende o consiste de ISIS 532401 con 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente, como se define en las reivindicaciones:
Figure imgf000020_0001
en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc.
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido es un enlace de fosforotioato. En casos adicionales, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 719223 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente:
Figure imgf000021_0001
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido es un enlace de fosforotioato o un enlace de fosfodiéster. En casos adicionales, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 719224 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente:
Figure imgf000022_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido es un enlace de fosforotioato o un enlace fosfodiéster. En realizaciones adicionales, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 766720 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente:
Figure imgf000023_0001
En tales casos adicionales, el compuesto comprende la secuencia de ISIS 532401 conjugada con GalNAc, y está representada por la siguiente estructura química:
Figure imgf000024_0001
en donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-Ch (CH3)- y -O-CH2CH2-; y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: cualquier R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2- y R3 y R4 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-; y R5 se selecciona de H y -CH3 ; y Z se selecciona de S- y O-.
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO descritas en la WO 2004/078922 y un grupo conjugado descrito en la presente. Las secuencias de nucleobases de todas las SEQ ID NO mencionadas anteriormente se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, un compuesto comprende un oligonucleótido divulgado en la WO 2004/078922 conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido es un enlace de fosforotioato y tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000025_0001
Por ejemplo, un compuesto comprende un oligonucleótido divulgado en la WO 2004/078922 conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del compuesto de oligonucleótido es un enlace de fosforotioato o un enlace de fosfodiéster, y tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000026_0001
Ciertas realizaciones proporcionan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la composición tiene una viscosidad inferior a aproximadamente 40 centipoise (cP), inferior a aproximadamente 30 centipose (cP), inferior a aproximadamente 20 centipose (cP), inferior a aproximadamente 15 centipose (cP) o inferior a aproximadamente 10 centipose (cP). En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades mencionadas anteriormente comprende un compuesto proporcionado en la presente a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml. En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades y/o concentraciones de compuesto mencionadas anteriormente tiene una temperatura de temperatura ambiento o aproximadamente 20° C, aproximadamente 21° C, aproximadamente 22° C, aproximadamente 23° C, aproximadamente 24° C, aproximadamente 25° C, aproximadamente 26° C, aproximadamente 27° C, aproximadamente 28° C, aproximadamente 29° C, o aproximadamente 30° C.
Ciertos casos describen un método para tratar una enfermedad asociada con un exceso de hormona del crecimiento en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, tratando de este modo la enfermedad asociada con un exceso de hormona del crecimiento. En ciertos casos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia. En ciertos aspectos, el tratamiento reduce los niveles de IGF-1.
Ciertos casos describen un método para prevenir una enfermedad asociada con el exceso de la hormona del crecimiento en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, previniendo de este modo la enfermedad asociada con un exceso de la hormona del crecimiento. En ciertos casos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia.
Ciertos casos describen un método para reducir los niveles del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, reduciendo de este modo los niveles de GHR en el humano. En ciertos casos, el humano tiene una enfermedad asociada con un exceso de la hormona del crecimiento. En ciertos casos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia.
En ciertos casos, los métodos anteriores comprenden la coadministración del compuesto o composición y un segundo agente. En ciertos casos, el compuesto o composición y el segundo agente se administran concomitantemente.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertos casos, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige. En ciertos de tales casos, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de malapareamiento sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de malapareamiento cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl-2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido en tándem de 14 nucleobases, y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobase compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobase.
Ciertos motivos y mecanismos de compuestos antisentido
En ciertos casos, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión para un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo aumentadas.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen por lo menos una región modificada para conferir resistencia aumentada a la degradación de la nucleasas, captación celular aumentada, afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico objetivo y/o actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
La actividad antisentido puede ser el resultado de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico objetivo, en donde la hibridación da como resultado en última instancia un efecto biológico. En ciertos casos, se modula la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertos casos, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertos casos, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo finalmente da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertos casos, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo no da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertos de tales casos, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico objetivo (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertos casos, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no han sido aclarados. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microRNA; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de estos mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En ciertas realizaciones, la actividad antisentido resulta por lo menos en parte de la degradación del ARN objetivo por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "de tipo ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden por lo menos una porción de ADN o nucleósidos de tipo ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido comprenden por lo menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de RNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gapmers, como se describe en la presente. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de tipo ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de tipo ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos de tipo ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican el receptor de la hormona del crecimiento (GHR) dirigibles con los compuestos proporcionados en la presente incluyen, sin limitación, los siguientes: N° de registro GENBANK NM_000163.4 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncado de los nucleótidos 42411001 a 42714000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de registro GENBANK X06562.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de registro GENbAn K DR006395.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 4), N° de registro GENBANK DB052048.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5), N° de registro GENBANK AF230800.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 6), el complemento del N° de registro GENBANK AA398260.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de registro GENBANK BC136496.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de registro GENBANK NM_001242399.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 9), N° de registro GENBANK NM_001242400.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 10), N° de registro g En BANK NM_001242401.3 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 11), N° de registro GeNbANK NM_001242402.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 12), N° de registro GeNbANK NM_001242403.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 13), N° de registro g En BANK NM_001242404.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 14), N° de registro GeNbANK NM_001242405.2 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 15), N° de registro GENBANK NM_001242406.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 16), N° de registro g En BANK NM_001242460.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 17), registro GENBa Nk NM_001242461.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 18), N° de registro GENBANK NM_001242462.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 19), o N° de registro GENBANK NW_001120958.1 truncado de los nucleótidos 4410000 a 4720000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2332).
Hibridación
La hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de GHR. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen invertido) entre las nucleobases complementarias de las moléculas de ácidos nucleicos.
La hibridación puede producirse en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas del ácido nucleico que se hibridarán.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. Los compuestos antisentido proporcionados en la presente son específicamente hibridables con un ácido nucleico de GHR.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de GHR).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de GHR pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de GHR de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malapareamiento o estructura de horquilla).
El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias con una región objetivo y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido con 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo y, por lo tanto, estaría dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse de manera rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de Análisis de Secuencia Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wisconsin), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Math., 1981,2, 482489).
Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de aparearse por bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria con la porción de 20 nucleobase del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
Identidad
Los compuestos antisentido descritos en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción de la misma. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se aparean con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un apareamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se compara.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazase a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato son referidos comúnmente formando los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para el objetivo de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no de origen natural, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, una captación celular mejorada, una afinidad mejorada para los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
Cada enlace internucleosídico del oligonucleótido del compuesto de la invención se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. Es deseable disponer el número de los enlaces internucleosídicos de fosforotioato y de los enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. Es deseable disponer el número y posición de los enlaces internucleosídicos de fosforotioato y el número y la posición de los enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. El número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse. El número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa. Es deseable disminuir el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato mientras se retiene la resistencia a la nucleasa. Es deseable aumentar el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster mientras se retiene la resistencia a la nucleasa.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo de azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasas mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillo de ribofuranosa químicamente modificadas. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puente de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R), o C(R1)R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5',2'-bis divulgados) o el reemplazo de átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181 Publicado el 22/11/07 en la que el LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificados incluyen nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, alquilo O-C1-C10, OCF3 , OCH2 F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)- N(Rm)(Rn), and O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada Rl, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertos casos, los compuestos antisentido descritos en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, entre otros, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también referido como etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, ver la Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de, 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos ver Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver la Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Zhou et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos, ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También pueden encontrarse informes adicioanles relacionados con nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (ver, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97,5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26)8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N°. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes de Estados Unidos N° de serie 61/026.995 y 61/097.787; Solicitudes internacionales de PCT publicadas WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; WO 2009/006478; WO 2010/036698; WO 2011/017521; WO 2009/067647; WO 20009/100320. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la Solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
Como se usa en la presente, “azúcar 2’-modificado” significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2’. Los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitado a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000032_0001
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar se seleccionan de los que tienen la Fórmula VII:
Figure imgf000032_0002
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3'-terminal; q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido alquenilo, C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1 , N3, OC(=X)J1 , OC(=X)NJJ2 , NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en los que q1 , q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1 , q2 , q3, q4, q5 , q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP de fórmula VII en los que uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y las Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000032_0003
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Dichos sustitutos de azúcar son referidos en la presente como "morfolinos modificados".
También se describen combinaciones de modificaciones, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo
(ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos sustituidos con
5',2'-bis divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2’ (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de
2005) o alternativamente la sustitución 5’ de un ácido nucleico bicíclico (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11/07 en la que un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5’ con un grupo 5’-metilo o 5’-vinilo). También se ha descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J.
Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud PCT publicada de propiedad compartida
WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984;
Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem Soc., 2007, 129(30),
9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic
Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Sección F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499- 4505; Verbeure et al., Nucleic
Acids Research, 2001,29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001,66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud de
PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud de PCT publicada WO 01/049687. Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la Fórmula X.
Figure imgf000033_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo 5’- o 3’-terminal; y
q1 , q2 , q3 , q4 , q5 , q6, q7 , q8 y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2’-modificado" o "2’-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ diferente de H u OH. Los nucleósidos 2’-modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2’ y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2’ que no forman puentes como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, alquilo O-C1-C10, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3 , 2’-O(CH2)2SCH3,
O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2’-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2’-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2’-OMe" o "2’-OCH3" o "2’-O-metilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "2 '-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) Tales sistemas de anillo pueden someterse a varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobases (naturales, modificadas o una combinación de las mismas) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han demostrado que aumentan la estabilidad de dúplex de ácidos nucleicos en 0,6-1,2° C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Las fracciones de base heterocíclica también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, que incluyen 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilitosina.
La nucleobase modificada puede ser 5-metilcitosina. Cada citosina puede ser una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
En ciertas realizaciones, como se define en las reivindicaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertos casos, la presente divulgación describe métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertos casos, la presente divulgación describe métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) se ha descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, núm. 47, págs. 17125-17129 (2005). Dichos receptores se expresan en las células hepáticas, particularmente en los hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden agrupaciones de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, dando como resultado la captación del compuesto en la célula. Ver, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, págs. 5216-5231 (mayo de 2008). Por consiguiente, los conjugados que comprenden tales agrupaciones de GalNAc se han usado para facilitar la captación de ciertos compuestos en las células hepáticas, específicamente los hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En tales casos, el conjugado que contiene GalNAc se une típicamente a la cadena de sentido del dúplex de ARNip. Como la cadena de sentido se descarta antes de que la cadena antisentido finalmente hibride con el ácido nucleico objetivo, hay poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado se une al extremo 3' de la cadena de sentido del ARNip. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 8.106.022. Ciertos grupos conjugados descritos en la presente son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones de la presente invención, los conjugados se unen a compuestos antisentido de cadena sencilla, que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antisentido a base de RNasa H y compuestos antisentido que alteran el corte y empalme de un ácido nucleico objetivo de pre-ARNm. En tales realizaciones, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células) pero luego debe escindirse o no interferir de otro modo con los pasos posteriores necesarios para la actividad, como la hibridación con un nucleico objetivo ácido e interacción con RNasa H o enzimas asociadas con el corte y empalme o la modulación del corte y empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido de cadena sencilla que en los compuestos de ARNip, donde el conjugado puede simplemente unirse a la cadena de sentido. En la presente se divulgan compuestos antisentido de cadena sencilla conjugados que tienen potencia mejorada en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio de propiedades requerido para estos compuestos, tal potencia mejorada es sorprendente.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados de la presente comprenden una fracción escindible. Como se indica, sin desear estar limitado por un mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente para proporcionar una mejora en la captación, pero después de eso, es deseable que una parte o, idealmente, todo el conjugado se escinda, liberando el compuesto original (por ejemplo, compuesto antisentido) en su forma más activa. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido escindible. Dichas realizaciones aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo el resto del conjugado (la agrupación) al oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido a través de uno o más enlaces escindibles, como los de un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la agrupación se une al nucleósido escindible a través de un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el nucleósido escindible se une al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En tales realizaciones, tales nucleósidos escindibles están enlazados entre sí, al compuesto antisentido y/o a la agrupación a través de enlaces escindibles (como los de un enlace de fosfodiéster). Ciertos conjugados de la presente no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se muestra que esa escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido es proporcionada por al menos un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Tales profármacos se administran a un animal y en última instancia se metabolizan a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para eliminar todo o parte del conjugado, lo que da como resultado que la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido carezca de todo o parte del conjugado.
En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos en el extremo 5' de un oligonucleótido. Ciertos de tales conjugados 5' se escinden más eficientemente que sus contrapartidas que tienen un grupo conjugado similar unido en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, la actividad mejorada puede correlacionarse con la escisión mejorada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5' tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (ver, por ejemplo, los Ejemplos 56, 81,83 y 84). Además, la unión 5' permite una síntesis de oligonucleótidos más simple. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección de 3' a 5'. Para hacer un oligonucleótido 3’-conjugado, típicamente uno une un nucleósido 3' preconjugado al soporte sólido y luego se construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, unir ese nucleósido conjugado al soporte sólido añade complicación a la síntesis. Además, usando ese enfoque, el conjugado está presente a lo largo de la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante los pasos posteriores o puede limitar el tipo de reacciones y reactivos que pueden usarse. Usando las estructuras y técnicas descritas en la presente para oligonucleótidos 5’-conjugados, puede sintetizarse el oligonucleótido usando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (más 5') o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
En vista de la técnica y la presente divulgación, un experto en la técnica puede elaborar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de la presente. Además, la síntesis de ciertos de tales conjugados y oligonucleótidos conjugados divulgados en la presente es más fácil y/o requiere pocos pasos, y por lo tanto es menos costosa que la de los conjugados divulgados anteriormente, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de ciertos grupos conjugados consiste de menos pasos sintéticos, lo que da como resultado un mayor rendimiento con respecto a los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados como GalNAc3-10 en el Ejemplo 46 y GalNAc3-7 en el Ejemplo 48 son mucho más simples que los conjugados descritos anteriormente, como los descritos en los la U.S. 8.106.022 o la US 7.262.177 que requieren el ensamblaje de más productos químicos intermedios. En consecuencia, estos y otros conjugados descritos en la presente tienen ventajas sobre los compuestos descritos anteriormente para su uso con cualquier oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
De manera similar, en la presente se divulgan grupos conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Como se muestra, dichos grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Tales compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc pueden unirse a cualquier compuesto antisentido, incluyendo oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
En ciertas realizaciones, los conjugados de la presente no alteran sustancialmente ciertas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en la presente se muestra que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunogénicos que los compuestos originales no conjugados. Como se mejora la potencia, las realizaciones en las que la tolerabilidad permanece igual (o incluso si la tolerabilidad empeora solo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para la terapia.
En ciertas realizaciones, la conjugación permite alterar compuestos antisentido de maneras que tienen consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, reemplazar uno o más enlaces de fosforotioato de un compuesto antisentido completamente de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en ciertos casos, tales compuestos antisentido que tienen uno o más fosfodiéster son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en el que cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, en ciertos casos, como se muestra en el Ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster también da como resultado una captación celular reducida y/o pérdida de potencia. En ciertas realizaciones, Los compuestos antisentido conjugados descritos en la presente toleran dicho cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida en la captación y la potencia en comparación con la contrapartida de conjugada completamente con fosforotioato. De hecho, en ciertas realizaciones, por ejemplo, en los Ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y por lo menos un enlace internucleosídico de fosfodiéster en realidad muestran una potencia aumentada in vivo incluso en relación con una contrapartida de fosforotioato completa que también comprende el mismo conjugado. Además, dado que la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la captación/potencia, una pequeña pérdida en esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una tolerabilidad mejorada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden por lo menos un enlace de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, la conjugación de compuestos antisentido de la presente da como resultado una administración, captación y actividad aumentados en los hepatocitos. Por tanto, se adminitra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en ciertas realizaciones, esa administración aumentada por sí sola no explica el aumento completo de la actividad. En ciertas de tales realizaciones, entra más compuesto en los hepatocitos. En ciertas realizaciones, incluso esa captación aumentada de hepatocitos no explica el aumento completo de la actividad. En tales realizaciones, se incrementa la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 102, ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para los oligonucleótidos que se dirigen a los genes que se expresan en los hepatocitos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados de la presente dan como resultado una exposición renal reducida. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son más bajas en el riñón que la de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para indicaciones terapéuticas en las que no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón implica el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, la alta concentración en el riñón da como resultado generalmente la pérdida de compuesto en la orina, lo que da como resultado una depuración más rápida. De acuerdo con los objetivos no renales, no se desea la acumulación renal.
En ciertos casos, se describen compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000037_0001
En ciertos casos, se describen compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000037_0002
En ciertos casos, se describen compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
ASO Fracción escindible
Figure imgf000038_0001
NHAc Grupo de ramificación
En ciertos casos, se describen compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000039_0001
un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc en el extremo 5'. Por ejemplo, en ciertos casos, un compuesto comprende ISIS 532401 conjugado con GalNAc en el extremo 5' como se define en las reivindicaciones. En casos adicionales, el compuesto tiene la siguiente estructura química que comprende o consiste de ISIS 532401 con 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente, como se define en las reivindicaciones:
Figure imgf000040_0001
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido com es un enlace de fosforotioato. En casos adicionales, el compuesto comprende la secuencia de ISIS 532401 conjugada con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido com es un enlace de fosforotioato. En tales casos, la estructura química es la siguiente:
Figure imgf000041_0001
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido com es un enlace de fosforotioato o un enlace fosfodiéster. En casos adicionales, el compuesto comprende la secuencia de ISIS 532401 conjugada con GalNAc, y en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido com es un enlace de fosforotioato o un enlace fosfodiéster. En tales casos, la estructura química es la siguiente:
Figure imgf000042_0001
En ciertos casos, un compuesto comprende un oligonucleótido ISIS dirigido a GHR conjugado con GalNAc. En casos adicionales, el compuesto comprende la secuencia de ISIS 532401 conjugado con GalNAc, y está representada por la siguiente estructura química:
Figure imgf000043_0001
En donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
Y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2- y R3 y R4 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
Y R5 se selecciona de H y -CH3 ;
Y Z se selecciona de S- y O-.
Las Patentes representativas de los Estados Unidos, publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos y publicaciones de solicitud de patente internacional que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos de ramificación, ligandos, fracciones escindibles, así como otras modificaciones incluyen, US 5.994.517, US 6.300.319, US 6.660.720, US 6.906.182, US 7.262.177, US 7.491.805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012/037254.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de ciertos conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos de ramificación, ligandos, fracciones escindibles, así como otras modificaciones, incluyen, sin limitación, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSeN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, y Valentijn et al.,“Solidphase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor” Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
En ciertos casos, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido a base de RNasa H (como un gapmer) o un oligonucleótido de modulación de corte y empalme (como un oligonucleótido completamente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprenda por lo menos uno, dos o tres grupos de GalNAc. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado encontrado en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 19 8 3 , 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38- 43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132- 5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2 0 0 8 , 1 6 , 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798- 5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11,457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8 , 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2 0 0 2 , 1 2 , 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013 21, 5275-5281; Solicitudes Internacionales WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098 WO2008/098788 WO2004/101619; WO2012/037254 WO2011/120053 WO2011/100131 WO2011/163121 WO2012/177947 WO2013/033230; WO2013/075035 WO2012/083185 WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487 WO2010/144740; WO2010/148013 WO1997/020563 WO2010/088537 WO2002/043771 WO2010/129709 WO2012/068187; WO2009/126933 WO2004/024757 WO2010/054406 WO2012/089352 WO2012/089602 WO2013/166121; WO2013/165816; Patentes de Estados Unidos 4.751.219; 8.552.163 6.908.903 7.262.177 5.994.517; 6.300.319; 8.106.022; 7.491.805; 7.491.805; 7.582.744; 8.137.695; 6.383.812; 6.525.031 6.660.720 7.723.509; 8.541.548; 8.344.125; 8.313.772; 8.349.308 8.450.467; 8.501.930; 8.158.601; 7.262.177 6.906.182 6.620.916; 8.435.491; 8.404.862; 7.851.615; Publicaciones de Patente de Estados Unidos publicadas US2011/0097264 US2011/0097265 US2013/0004427 US2005/0164235 US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148 US2012/0128760 US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; y US2009/0203132
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTINA en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio sérico reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos de rutina. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, en cuyo momento los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo se miden por métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usado varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Ciertas indicaciones
Ciertos casos descritos en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con un exceso de hormona del crecimiento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de GHR, como un compuesto antisentido u oligonucleótido dirigido a GHR. En ciertos casos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia. En ciertos casos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es el gigantismo.
Ciertos casos describen un método para tratar, prevenir o mejorar la acromegalia en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de GHR, como un compuesto antisentido u oligonucleótido dirigido a GHR. La acromegalia es una enfermedad asociada con el exceso de la hormona del crecimiento (GH). En más del 90 por ciento de los pacientes con acromegalia, la sobreproducción de hormonas de crecimiento está provocada por un tumor benigno de la glándula pituitaria, llamado adenoma, que produce un exceso de hormona del crecimiento y comprime los tejidos cerebrales circundantes. La expansión del adenoma puede provocar dolores de cabeza y discapacidad visual que a menudo acompañan a la acromegalia. En algunos casos, la acromegalia está provocada por tumores del páncreas, los pulmones o las glándulas suprarrenales que llevan a un exceso de GH, ya sea produciendo GH o produciendo la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), la hormona que estimula a la glándula pituitaria para producir GH.
La acromegalia afecta más comúnmente a adultos de mediana edad y puede provocar desfiguración grave, complicaciones y muerte prematura. Debido a su patogénesis y progresión lenta, la acromegalia a menudo no se diagnostica hasta que se notan cambios en las características externas, como cambios en la cara. La acromegalia está asociada a menudo con el gigantismo.
Las características de la acromegalia incluyen hinchazón de los tejidos blandos que resulta en un agrandamiento de las manos, pies, nariz, labios y oídos, y un engrosamiento general de la piel; hinchazón de los tejidos blandos de los órganos internos, como el corazón y los riñones; hinchazón de las cuerdas vocales que da como resultado una voz baja y habla lenta; expansión del cráneo; protuberancia pronunciada de las cejas, a menudo con distensión ocular; protrusión de la mandíbula inferior pronunciada y agrandamiento de la lengua; hueco de dientes; y síndrome del túnel carpiano. En ciertas realizaciones, cualquiera o una combinación de estas características de la acromegalia puede tratarse, prevenirse o mejorarse administrando un compuesto o composición dirigidos a GHR proporcionados en la presente.
EJEMPLOS
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo.
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente divulgación y no son limitativos. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o uno similar. Y, por ejemplo, cuando una modificación de alta afinidad particular aparece en una posición particular, otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición se consideran adecuadas, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Método general para la preparación de fosforamiditas, compuestos 1, 1a y 2
Los compuestos 1, 1a y 2 se prepararon según procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en la especificación en la presente (ver Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, ucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); y también ver las Solicitudes Internacionales de PCT publicadas (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071), y la patente de Estados Unidos 7.569.686).
Figure imgf000046_0001
Bx es una base heterocíclica;
Ejemplo 2: Preparación del compuesto 7
Los compuestos 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desoxi-p-Dgalactopiranosa o galactosamina pentaacetato) están disponibles comercialmente. El compuesto 5 se preparó de acuerdo con procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991,34, 2692).
Figure imgf000046_0002
Ejemplo 3: Preparación del compuesto 11
Los compuestos 8 y 9 están disponibles comercialmente.
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 18
El compuesto 11 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 3. El compuesto 14 está disponible comercialmente. El compuesto 17 se preparó usando procedimientos similares informados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Figure imgf000047_0002
Ejemplo 7: Preparación del Compuesto 25
El compuesto 24 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 6.
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 39: Método general para la preparación del compuesto oligomerico 83h que comprende un conjugado de GalNAc3-3 en el extremo terminal 5' (GalNAc3-1 modificado para la unión del extremo 5') a través de un soporte sólido
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El compuesto 18 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 4. Los compuestos 83a y 83b están disponibles comercialmente. El Compuesto Oligomérico 83e que comprende una hexilamina enlazada a fosfodiéster se preparó usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoniaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5'-GalNAc3-3 (83h).
En donde GalNAc3-3 tiene la estructura:
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La porción de la agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En donde GalNAc3-3a tiene la fórmula:
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Ejemplo 44: Efecto de los enlaces PO/PS sobre la inhibición antisentido de los ASO que comprenden el conjugado GalNAc3-1 (ver el Ejemplo 9) en el extremo terminal 3' dirigido a SRB-1
Se probaron ISIS 655861 y 655862 que comprenden un conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3' cada uno dirigido a SRB-1 en un único estudio de administración para determinar su capacidad de inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto no conjugado original, ISIS 353382, se incluyó en el estudio para comparación.
Los ASO son gapmers 5-10-5 MOE, en donde la región de hueco comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y cada región de ala comprende cinco nucleósidos modificados con 2'-MOE. Los ASO se prepararon usando métodos similares a los ilustrados anteriormente en el Ejemplo 19 y se describen en la Tabla 36, a continuación.
Tabla 36
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS), "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y “o'” indica -OP(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1 " se muestra en el Ejemplo 9.
Tratamiento
Se inyecto subcutáneamente a ratones macho Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez a la dosificación mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861, 655862 o con control tratado con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con los protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron con respecto al ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado al control tratado con PBS y se denota como "% de PBS". Los ED50 se midieron usando métodos similares a los descritos anteriormente y se presentan a continuación.
Como se ilustra en la Tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprenden el conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3' (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces PS/PO mixtos mostró una mejora en la potencia con respecto a PS completo (ISIS 655861).
Tabla 37
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Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observó elevación en los niveles de transaminasas (Tabla 38) o en el peso de los órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control de PBS. Además, los ASO con enlaces PS/PO mixtos (ISIS 655862) mostraron niveles de transaminasas similares en comparación con el PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
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continuación
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Ejemplo 45: Preparación del éster PFP, Compuesto 110a
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El compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmoles) se trató con el compuesto 103a o 103b (38 mmoles), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml), y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, luego se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Luego la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (2%-->10% metanol/diclorometano) para dar los compuestos 104a y 104b con un rendimiento >80%. LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 105a y 105b con un rendimiento >90%. LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 105a y 105b se trataron, individualmente, con el compuesto 90 en las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar los compuestos 106a (80%) y 106b (20%). LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 106a y 106b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (Ejemplo 47), para dar 107a (60%) y 107b (20%). LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 108a y 108b con un rendimiento del 40-60%. LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 108a (60%) y 108b (40%) se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 109a y 109b con rendimientos >80%. LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
El Compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los compuestos 101 a-d (Ejemplo 47), para dar el Compuesto 110a con un rendimiento del 30-60%. LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura. Alternativamente, el Compuesto 110b puede prepararse de manera similar comenzando con el Compuesto 109b.
Ejemplo 48: Preparación del oligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
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116
El compuesto 112 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
El compuesto 112 (5 g, 8 , 6 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (22 ml/22 ml). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y se lavó con 1:1 metanol/acetato de etilo. El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron hasta la sequedad para producir el Compuesto 105a (cuantitativo). La estructura fue confirmada por LCMS.
El compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 ml, 16,2 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (17 ml) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esto se añadió una solución del Compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidro (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se eliminó a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (100 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 10 al 20% en diclorometano para producir el Compuesto 114 (1,45 g, 30%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H NMR.
El compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (4 ml/4 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,14 g). La mezcla de la reacción se enjuagó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir el Compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H NMR.
El compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 ml, 1,5 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (5 ml) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esto se le añadió una solución del Compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidro y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2Cl2. La capa orgánica se lavó con solución de NaHCO3saturada acuosa y salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La capa orgánica se concentró hasta la sequedad y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 3 al 15% en diclorometano para producir el Compuesto 116 (0,84 g, 61%). La estructura fue confirmada por LC MS y análisis de 1H NMR.
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El compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (5 ml/5 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La mezcla de la reacción se enjuagó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir el compuesto 117 (0,73 g, 98%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H NMR.
El compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) se disolvió en DMF anhidro (3 ml). A esta solución se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (70 pl, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 pl, 0,42 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución de NaHCO3 acuosa saturada. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta la sequedad y se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 5 al 10% en diclorometano para producir el compuesto 118 (0,51 g, 79%). La estructura fue confirmada por LCMS y 1H y 1H y 19F NMR.
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.5, rt
2. Amoniaco ac.. rt
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Se preparó el compuesto oligomérico 119, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-7, usando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La porción de agrupación de GalNAc3 de GalNAc3-7 del grupo conjugado (GalNAc3-7a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) se muestra a continuación:
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Ejemplo 51: Preparación del oligonucleótido 155 que comprende GalNAc3 -6
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El compuesto 146 se sintetizó como se describe en la literatura (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
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149
El compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y el compuesto 35b (14,3 gramos, 57 mmol) se disolvieron en CH2CI2 (200 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 Á. 2 g, en polvo), y la reacción se dejó agitar durante 30 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 ml, 22,77 mmol) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. Tras completarse, la reacción se inactivó vertiéndola en NaHCO3 acuoso saturado (500 ml) y hielo triturado (~150 g). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 , se filtró, y se concentró hasta un aceite naranja a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2Cl2 para producir el Compuesto 112 (16,53 g, 63%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el compuesto esperado.
El compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (40 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras finalizar (TLC 10% de MeOH en CH2CL y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 105a (3,28 g). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
El compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) se disolvió en DMF anhidro (100 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 3,9 ml, 22 mmol), seguido de HBTU (4 g, 10,5 mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar durante ~15 minutos bajo nitrógeno. A esto se añadió una solución del compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) en DMF seco y se agitó durante 2 h en atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El material en bruto se purificó por cromatografía en columna de MeOH al 2-5% en CH2CL para producir el Compuesto 148 (3,44 g, 73%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto esperado.
El compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (75 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 149 (2,6 g). LCMS fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seco (10 ml) que se usó inmediatamente en el siguiente paso.
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El compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) se disolvió en DMF seco (20 ml). A esto se le añadieron DIEA (450 pl, 2,6 mmol, 1,5 eq.) Y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidro (10 ml). El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (si era necesario). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Tras la finalización la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml), y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2Cl2 para producir el Compuesto 150 (0,62 g, 20%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
El compuesto 150 (0,62 g) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (5 l). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 pm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 151 (0,57 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seco y se usó inmediatamente en el paso siguiente.
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El compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) se disolvió en DMF anhidro (5 ml) y se añadieron N,N-diisopropiletilamina (75 pl, 1 mmol) y PFP-TFA (90 pl, 0,76 mmol). La mezcla de la reacción se volvió magenta tras el contacto y gradualmente se volvió naranja durante los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC y LCMS. Tras la finalización (formación del éster de PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de N,N-diisopropiletilamina (si fue necesario). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. Tras la finalización, la mayoría del solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH al 2-10% en CH2Cl2) para producir el Compuesto 152 (0,35 g, 55%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
El compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (10 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completado (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 pm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria, y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La LCMS fue consistente con el producto deseado.
El compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) se disolvió en DMF anhidro (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A esto se añadieron N,N-diisopropiletilamina (65 gl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 gl, 0,28 mmol). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. La mezcla de la reacción se volvió magenta al contacto y gradualmente se volvió naranja. El pH de la mezcla de la reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más N,N-diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC y LCMS. Tras la finalización, la mayoría del solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 (50 ml), y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2Cl2 para producir el Compuesto 154 (0,29 g, 79%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
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El compuesto oligomérico 155, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-6 , se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3 -6 (GalNAc3 - 6 a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3 -6 (GalNAc3 - 6 a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000063_0002
Ejemplo 56: Estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado 3' o 5' (comparación de GalNAc3-1,2, 3, 5, 6, 7 y 10) dirigido a SRB-1 in vivo
Los oligonucleótidos enumerados a continuación se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones. El ISIS 353382 no conjugado se incluyó como estándar. Cada uno de los diversos grupos conjugados de GalNAc3 se unió en el extremo terminal 5' del oligonucleótido respectivo mediante un nucleósido de 2'-desoxiadenosina enlazado a fosfodiéster (fracción escindible) excepto para ISIS 655861 que tenía el grupo conjugado GalNAc3 unido en el extremo terminal 3'.
Tabla 42
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continuación
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Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica un p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS), "o" indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y “o'” indica -OP(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-2a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-6a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 46.
Tratamiento
Se inyectó a ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez a la dosificación mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con los protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje omedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de solución salina.
Como se ilustra en la Tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados 5' mostraron un ligero aumento en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido conjugado 3'.
Tabla 43
Figure imgf000064_0002
continuación
Figure imgf000065_0001
Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, con respecto a los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total y BUN. El cambio en los pesos corporales se evaluó sin un cambio significativo del grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la Tabla 44 a continuación.
Tabla 44
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Figure imgf000066_0002
Efectos de los ASO conjugados dirigidos a SRB-1 in vitro
oligonucleótidos enumerados a continuación se probaron en un estudio de dosis múltiples para la itisentido de SRB-1 en hepatocitos primarios de ratón. ISIS 353382 se incluyó como un estándar no ada uno de los grupos conjugados se unió en el extremo terminal 3 'o 5 ' del oligonucleótido respectivo a fracción escindible de nucleósido de 2 '-desoxiadenosina enlazada a fosfodiéster.
Tabla 52
Figure imgf000067_0001
Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado con 2 '-MOE; "d" indica un p-D-2 '-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS), "o" indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y “o'” indica -OP(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-8 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 47. La estructura de GalNAc3-9 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 52. La estructura de GalNAc3-6 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-2 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-1 0 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-5 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-7 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Tratamiento
Los oligonucleótidos enumerados anteriormente se probaron in vitro en células de hepatocitos de ratón primarias colocadas en placas a una densidad de 25.000 células por pocillo y se trataron con oligonucleótidos modificados 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 o 20 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real y se ajustaron los niveles de ARNm de SRB-1 de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.
La IC50 se calculó usando métodos estándar y los resultados se presentan en la Tabla 53. Los resultados muestran que, en condiciones de captación libre en las que no se usan reactivos o técnicas de electroporación para promover artificialmente la entrada de los oligonucleótidos en las células, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes en los hepatocitos que el oligonucleótido original (ISIS 353382) que no comprende un conjugado GalNAc.
Tabla 53
Figure imgf000068_0002
Ejemplo 79: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos a APOC-III que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 a continuación se probaron en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tabla 70
Figure imgf000068_0001
La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3 - 3 a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3 - 7 a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3 - 10 a se ha mostrado en el Ejemplo 46 y GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó a ratones transgénicos de seis a ocho semanas de edad que expresan APOC-III humano por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 70 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 3 animales. Se extrajo sangre antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a las 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la dosis. Los niveles de triglicéridos en plasma y proteínas APOC-III se midieron como se describe en el Ejemplo 20. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de niveles de triglicéridos en plasma y APOC-III para cada grupo de tratamiento, normalizados a los niveles de referencia, mostrando que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc mostraron una duración más prolongada de acción que el oligonucleótido original sin un grupo conjugado (ISIS 304801) a pesar de que la dosificación del original fue tres veces la dosificación de los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc.
Tabla 71
Figure imgf000069_0001
continuación
Figure imgf000070_0001
Ejemplo 80: inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a la antitripsina alfa-1 (A1AT) que comprende un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 72 a continuación se probaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de A1AT en ratones.
Tabla 72
Figure imgf000070_0002
continuación
Figure imgf000071_0001
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46 y GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó a ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) cada uno por vía subcutánea una vez por semana a la dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm hepáticos de A1AT se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de proteína en plasma de A1AT se determinaron usando el ELISA de alfa 1 -antitripsina de ratón (N° de catálogo 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de ARNm hepático de A1AT y los niveles de proteína en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de PBS.
Como se ilustra en la Tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm hepático de A1AT y proteína de A1AT en plasma de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que el original (ISIS 476366).
Tabla 73
Figure imgf000071_0002
continuación
Figure imgf000072_0001
La transaminasa hepática y los niveles de BUN en plasma se midieron en el momento del sacrificio usando protocolos estándar. También se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los resultados se muestran en la Tabla 74 a continuación. El peso corporal se muestra como % con respecto al valor de referencia. Los pesos de los órganos se muestran como % del peso corporal con respecto al grupo de control de PBS.
Tabla 74
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Ejemplo 81: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos a A1AT que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 se probaron en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
Se inyectó a ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 5, 12, 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína A1AT en plasma se midieron mediante ELISA (ver el Ejemplo 80). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína de A1AT en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes y tuvieron una mayor duración de acción que el original que carecía de un conjugado GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 678381,678382, 678383, y 678384) fueron generalmente incluso más potentes con una duración de acción incluso más larga que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
Figure imgf000073_0002
continuación
Figure imgf000074_0002
Ejemplo 82: Inhibición antisentido in vitro por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado GalNAc3
Se sembraron hepatocitos de hígado de ratón primarios en placas de 96 pocilios a 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 76 se agregaron a 2, 10, 50 o 250 nM en medio de Williams E y las células se incubaron durante la noche a 37° C en 5% de CO2. Las células se lisaron 16 horas después de la adición de oligonucleótidos, y el ARN total se purificó usando RNease 3000 BioRobot (Qiagen). Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de IC50 se determinaron usando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden una variedad de diferentes grupos conjugados GalNAc y una variedad de fracciones escindibles diferentes son significativamente más potentes en un experimento de captación libre in vitro que los oligonucleótidos originales que carecen de un grupo conjugado GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
Tabla 76
Figure imgf000074_0001
(continuación)
Figure imgf000075_0001
(continuación)
Figure imgf000076_0002
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-5a se ha mostrado en el Ejemplo 49, GalNAc3-6a se ha mostrado en el Ejemplo 51, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-8a se ha mostrado en el Ejemplo 47, GalNAc3-9a se ha mostrado en el Ejemplo 52, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46, GalNAc3-12a se ha mostrado en Ejemplo 61, GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62, GalNAc3-14a se ha mostrado en el Ejemplo 63, GalNAc3-15a se ha mostrado en el Ejemplo 64, GalNAc3-17a se ha mostrado en el Ejemplo 68, GalNAc3-18a se ha mostrado en Ejemplo 69, GalNAc3-19a se ha mostrado en el Ejemplo 70, GalNAc3-20a se ha mostrado en el Ejemplo 71, y GalNAc3-23a se ha mostrado en el Ejemplo 76.
Ejemplo 83: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 a continuación se probaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis del Factor XI en ratones.
Tabla 77
Figure imgf000076_0001
continuación
Figure imgf000077_0002
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46 y GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
A cada uno de los ratones de seis a ocho semanas de edad se le inyectó por vía subcutánea una vez por semana a la dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado a continuación o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm de hígado del Factor XI se midieron usando PCR en tiempo real y se normalizaron a ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. También se midieron las transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de PBS.
Como se ilustra en la Tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo el ARNm de hígado de Factor XI de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
Figure imgf000077_0001
continuación
Figure imgf000078_0001
Ejemplo 84: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 se probaron en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
A cada uno de los ratones de seis a ocho semanas se le inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 77 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. La sangre se extrajo mediante sangrados en la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína del Factor XI en plasma se midieron por ELISA usando captura de Factor XI y anticuerpos de detección biotinilados de R & D Systems, Minneapolis, MN (N° de catálogo AF2460 y BAF2460, respectivamente) y el conjunto de reactivos OptEIA B (N° de catálogo 550534, Bd Biosciences, San José, CA). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína del Factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes con una duración de acción más larga que el original que carece de un conjugado GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron aún más potentes con una duración de acción aún más larga que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
Figure imgf000078_0002
continuación
Figure imgf000079_0001
Ejemplo 85: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 76 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tratamiento
A cada uno de los ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad se le inyectó por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 76 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con los protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de solución salina.
Como se ilustra en las Tablas 80 y 81, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis.
Tabla 80
Figure imgf000079_0002
continuación
Figure imgf000080_0002
Tabla 81
Figure imgf000080_0003
También se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, bilirrubina total, BUN y pesos corporales usando protocolos estándar. Los valores medios para cada grupo de tratamiento se muestran en la Tabla 82 a continuación.
Tabla 82
Figure imgf000080_0001
continuación
Figure imgf000081_0001
Ejemplo 86: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a TTR que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 83 a continuación se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de la transtiretina humana (TTR) en ratones transgénicos que expresan el gen de TTR humana.
Tratamiento
A cada uno de los ratones transgénicos TTR de ocho semanas de edad se le inyectó por vía subcutánea una vez por semana durante tres semanas, para un total de tres dosis, un oligonucleótido y dosificación enumerados en las tablas siguientes o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Se realizaron sangrados de la cola en varios puntos temporales durante todo el experimento, y los niveles de proteína de TTR, ALT y AST en plasma se midieron e informaron en las Tablas 84-87. Después de que se sacrificaron los animales, se midieron los niveles de ALT, AST y TTR humana en plasma , así como los niveles de peso corporal, peso de órganos y ARNm de TTR humana en el hígado. Los niveles de proteína de TTR se midieron usando un analizador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA).Se usaron PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, O) de acuerdo con protocolos estándar para determinar los niveles de ARNm de TTR humana en el hígado. Los resultados presentados en las Tablas 84-87 son los valores medios para cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARNm son los valores medios con respecto a la media para el grupo de PBS. Los niveles de proteínas en plasma son los valores medios con respecto al valor medio para el grupo de PBS al inicio del estudio. Los pesos corporales son el porcentaje de cambio de peso medio desde el inicio hasta el sacrificio por cada grupo de tratamiento individual. Los pesos de los órganos mostrados se normalizan al peso corporal del animal, y el peso medio de los órganos normalizado para cada grupo de tratamiento se presenta luego con respecto al peso medio de los órganos normalizado para el grupo de PBS.
En las Tablas 84-87, "BL" indica valor de referencia, medidas que se tomaron justo antes de la primera dosis. Como se ilustra en las Tablas 84 y 85, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de expresión de TTR de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado GalNAc (ISIS 420915). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc y enlaces internucleosídicos PS/PO mixtos fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado GalNAc y enlaces PS completos.
Tabla 83
Figure imgf000082_0002
La leyenda de la Tabla 85 puede encontrarse en el Ejemplo 74. La estructura de GalNAc3-1 se ha mostrado en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado en Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3 -10a se ha mostrado en el Ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62. La estructura de GalNAc3-19a se ha mostrado en el Ejemplo 70.
Tabla 84
Figure imgf000082_0001
Tabla 85
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Ejemplo 88: Modulación del corte y empalme in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SMN que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 90 se probaron para la modulación del corte y empalme de la supervivencia humana de la neurona motora (SMN) en ratones.
Tabla 90
Figure imgf000086_0002
La estructura de GalNAc3- 7 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. "X" indica una amina primaria 5' generada por Gene Tools (Philomath, OR), y GalNAc3- 7 b indica que la estructura de GalNAc3- 7 a careciendo de laa porción -NH-C6-O del conector, como se muestra a continuación:
Figure imgf000086_0001
Los números ISIS 703421 y 703422 son oligonucleótidos de morfolino, en donde cada nucleótido de los dos oligonucleótidos es un nucleótido de morfolino.
Tratamiento
A ratones transgénicos de seis semanas que expresan SMN humana se les inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 91 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió de 2 machos y 2 hembras. Los ratones se sacrificaron 3 días después de la dosis para determinar los niveles de ARNm de SMN humano en hígado con y sin exón 7 usando PCR en tiempo real de acuerdo con protocolos estándar. El ARN total se midió usando el reactivo Ribogreen. Los niveles de ARNm de SMN se normalizaron a ARNm total, y se normalizaron adicionalmente a las medias para el grupo de tratamiento con solución salina. Las relaciones medias resultantes de ARNm de SMN que incluía el exón 7 con respecto al ARNm de SMN que carece de exón 7 se muestran en la Tabla 91. Los resultados muestran que los oligonucleótidos totalmente modificados que modulan el corte y empalme y comprenden un conjugado GalNAc son significativamente más potentes para alterar el corte y empalme en el hígado que los oligonucleótidos originales que carecen de un conjugado GlaNAc. Además, esta tendencia se mantiene para las químicas de modificación múltiple, que incluyen oligonucleótidos modificados con 2 '-MOE y con morfolino.
Tabla 91
Figure imgf000087_0002
Ejemplo 89: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a Apolipoproteína A (Apo(a)) que comprenden un conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 92 a continuación se probaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de Apo(a) en ratones transgénicos.
Tabla 92
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La estructura de GalNAc3- 7 a se ha mostrado en el Ejemplo 48.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 hembra de ocho semanas (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó por vía subcutánea una vez por semana una dosificación mostrada a continuación, para un total de seis dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 92 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3-4 animales. Se realizaron sangrados en la cola el día anterior a la primera dosis y semanalmente después de cada dosis para determinar los niveles de proteína Apo(a) en plasma. Los ratones fueron sacrificados dos días después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de apo(a) se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. También se determinaron los niveles de proteína de Apo(a) en plasma usando ELISA y se determinaron los niveles de transaminasas hepáticas. Los resultados de ARNm y proteína en plasma en la Tabla 93 se presentan como el porcentaje medio del grupo de tratamiento con respecto al grupo tratado con PBS. Los niveles de proteína en plasma se normalizaron adicionalmente al valor de referencia (BL) para el grupo de PBS. Los niveles de transaminasas medios absolutos y los pesos corporales (% con respecto a las medias de referencia) se informan en la Tabla 94.
Como se ilustra en la Tabla 93, el tratamiento con los oligonucleótidos redujo los niveles de ARNm hepático y de proteína en plasma de Apo(a) de una manera dependiente de la dosis. Además, el oligonucleótido que comprendía el conjugado GalNAc fue significativamente más potente con una mayor duración de acción que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado GalNAc. Como se ilustra en la Tabla 94, los niveles de transaminasas y los pesos corporales no se vieron afectados por los oligonucleótidos, lo que indica que los oligonucleótidos fueron bien tolerados.
Tabla 93
Figure imgf000088_0001
Tabla 94
Figure imgf000088_0002
Ejemplo 90: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a TTR que comprendenun conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 95 a continuación se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de transtiretina humana (TTR) en ratones transgénicos que expresan el gen de TTR humana.
Tratamiento
A cada uno de los ratones transgénicos TTR se le inyectó por vía subcutánea una vez por semana durante tres semanas, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido y la dosificación enumerados en la Tabla 96 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Antes de la primera dosis, se realizó un sangrado de la cola para determinar los niveles de proteína de TTR en plasma al inicio del estudio (BL). Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Los niveles de proteína de TTR se midieron usando un analizador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA).Se usaron PCR en tiempo real y el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar para determinar los niveles de ARNm de TTR humana en el hígado. Los resultados presentados en la Tabla 96 son los valores medios para cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARNm son los valores medios con respecto a la media para el grupo de PBS. Los niveles de proteínas en plasma son los valores medios con respecto al valor medio para el grupo de PBS al inicio del estudio. "BL" indica valor de referencia, mediciones que se tomaron justo antes de la primera dosis. Como se ilustra en la Tabla 96, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de expresión de TTR de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado GalNAc (ISIS 420915), y los oligonucleótidos que comprenden una fracción escindible de fosfodiéster o desoxiadenosina mostraron mejoras significativas en la potencia en comparación con el original que carece de un conjugado (ver números ISIS 682883 y 666943 vs 420915 y los ejemplos 86 y 87).
Tabla 95
Figure imgf000089_0001
La leyenda para la Tabla 95 puede encontrarse en el Ejemplo 74. La estructura de GalNAc3- 3 a se ha mostrado en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3- 7 a se ha mostrado en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3- 1 0 a se ha mostrado en el Ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tabla 96
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Ejemplo 91: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos al Factor VII que comprenden un conjugado GalNAc3 en primates no humanos
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 97 siguiente se probaron en un estudio no terminal de incrementos de dosis para la inhibición antisentido del Factor VII en monos.
Tratamiento
Se inyectaron a monos no tratados por vía subcutánea los días 0, 15 y 29 dosis crecientes de un oligonucleótido enumerado en la Tabla 97 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 machos y 1 hembra. Antes de la primera dosis y en varios momentos posteriores, se realizaron extracciones de sangre para determinar los niveles de proteína de Factor VII en plasma. Los niveles de proteína de Factor VII se midieron por ELISA. Los resultados presentados en la Tabla 98 son los valores medios para cada grupo de tratamiento con respecto al valor medio para el grupo de PBS al inicio del estudio (BL), las mediciones tomadas justo antes de la primera dosis. Como se ilustra en la Tabla 98, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de expresión del Factor VII de una manera dependiente de la dosis, y el oligonucleótido que comprendía el conjugado GalNAc fue significativamente más potente en monos en comparación con el oligonucleótido que carecía del conjugado GalNAc.
Tabla 97
Figure imgf000090_0001
La leyenda para la Tabla 97 puede encontrarse en el Ejemplo 74. La estructura de GalNAc3- 1 0 a se ha mostrado en el Ejemplo 46.
Tabla 98
Figure imgf000090_0002
Ejemplo 92: Inhibición antisentido en hepatocitos primarios por oligonucleótidos antisentido dirigidos a Apo-CiII que comprende un conjugado GalNAc3
Se sembraron hepatocitos primarios de ratón en placas de 96 pocillos a 15.000 células por pocillo, y los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 99, dirigidos a ApoC-III de ratón, se añadieron a 0,46, 1,37, 4,12 o 12,35, 37,04, 111,11, o 333,33 nM o 1,00 pM. Después de la incubación con los oligonucleótidos durante 24 horas, se lisaron las células y se purificó el ARN total usando RNeasy (Qiagen). Los niveles de ARNm de ApoC-III se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc.) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de IC50 se determinaron usando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que independientemente de si la fracción escindible era un fosfodiéster o una desoxiadensoína, los oligonucleótidos que comprendían un conjugado GalNAc eran significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado.
Tabla 99
Figure imgf000091_0001
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46, GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62, y GalNAc3-19a se ha mostrado en el Ejemplo 70.
Ejemplo 93: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprende alas mixtas y un conjugado 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 100 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
Figure imgf000091_0002
(continuación)
Figure imgf000092_0002
La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6'-(S)-CH3 (cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO). Superíndice "m" indica 5-metilcitosinas.
Tratamiento
Se inyectó subcutáneamente a ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez la dosis mostrada a continuación con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 100 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron a los niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con los protocolos estándar. Los resultados se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Como se ilustra en la Tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gapmer que comprendían un conjugado GalNAc y que tenían alas que eran modificaciones de azúcar mixtas o de cEt completas fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado y que comprendía alas modificadas con cEt completamente.
También se midieron los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y el BUN, y los valores medios para cada grupo de tratamiento se muestran en la Tabla 101. El peso corporal se muestra como el porcentaje medio de peso corporal con respecto al peso corporal de referencia (% de BL) medido justo antes de la dosis de oligonucleótidos.
Tabla 101
Figure imgf000092_0001
continuación
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Ejemplo 94: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden modificaciones 2'-azúcar y un conjugado 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 102 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 102
Figure imgf000093_0002
El subíndice "m" indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo. Ver el Ejemplo 74 para la leyenda completa de la tabla. La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó usando el protocolo descrito en el Ejemplo 93. Los resultados se muestran en la Tabla 103 a continuación y muestran que tanto los oligonucleótidos modificados con 2'-MOE como con 2'-OMe que comprenden un conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que los oligonucleótidos origianles respectivos que carecen de un conjugado. Los resultados de las mediciones de pesos corporales, transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 103
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Ejemplo 95: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden nucleósidos bicíclicos y un conjugado 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 104 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 104
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Subíndice “g” indica un nucleósido fluoro-HNA, el subíndice “l” indica un nucleósido bloqueado que comprende un puente 2'-O-CH2-4'. Ver la leyenda de la tabla del Ejemplo 74 para otras abreviaturas. La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, la estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó usando el protocolo descrito en el Ejemplo 93. Los resultados se muestran en la Tabla 105 a continuación y muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc y varias modificaciones de nucleósidos bicíclicos fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado y que comprende modificaciones de nucleósidos bicíclicos. Además, el oligonucleótido que comprende un conjugado GalNAc y modificaciones de fluoro-HNA fue significativamente más potente que el original que carece de un conjugado y que comprende modificaciones de fluoro-HNA. Los resultados de las mediciones de los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 105
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Ejemplo 96: Unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 dirigidos a ApoC-III y los oligonucleótidos en la Tabla 106 dirigidos a Apo(a) se probaron en un ensayo de ultrafiltración para evaluar la unión a proteínas plasmáticas.
Tabla 106
Figure imgf000095_0001
continuación
Figure imgf000096_0001
Ver el Ejemplo 74 para la leyenda de la tabla. La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Se pre-acondicionaron unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulosa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) con 300 pl de Tween 80 al 0,5% y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, luego con 300 pl de una solución de 300 pg/ml de un oligonucleótido de control en H2O y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. A fin de evaluar la unión no específica a los filtros de cada oligonucleótido de prueba de las Tablas 70 y 106 a usar en los estudios, se colocaron 300 pl de una solución 250 ng/ml de oligonucleótido en H2O a pH 7,4 en los filtros preacondicionados y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Las muestras no filtradas y filtradas se analizaron mediante un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se usaron tres réplicas para obtener una concentración media para cada muestra. La concentración media de la muestra filtrada con respecto a la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% de recuperación).
Se adquirieron muestras de plasma entero congelado recogidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales libres de drogas, monos cynomolgus y ratones CD-1, de Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Los oligonucleótidos de prueba se añadieron a alícuotas de plasma de 1,2 ml a dos concentraciones (5 y 150 pg/ml). Se colocó una alícuota (300 pl) de cada muestra de plasma enriquecida en una unidad de filtro preacondicionada y se incubó a 37° C durante 30 minutos, seguido inmediatamente por centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Las alícuotas de las muestras de plasma enriquecidas filtradas y no filtradas se analizaron mediante un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótidos en cada muestra. Se usaron tres réplicas por concentración para determinar el porcentaje medio de oligonucleótido unido y no unido en cada muestra. La concentración media de la muestra filtrada con respecto a la concentración de la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido en el plasma que no está unido a las proteínas plasmáticas (% no unido). Los valores finales de oligonucleótidos no unidos se corrigen para la unión no específica dividiendo el % no unido por el % de recuperación para cada oligonucleótido. Los valores finales de % de oligonucleótidos unidos se determinan restando los valores finales de % no unido de 100. Los resultados se muestran en la Tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótidos probadas (5 y 150 pg/ml) en cada especie de plasma. Los resultados muestran que los grupos conjugados GalNAc no tienen un impacto significativo en la unión a proteínas plasmáticas. Además, los oligonucleótidos con enlaces internucleosídicos PS completos y enlaces PO/PS mixtos se unen ambos a proteínas plasmáticas, y aquellos con enlaces PS completos se unen a proteínas plasmáticas en un grado algo mayor que aquellos con enlaces PO/PS mixtos.
Tabla 107
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Ejemplo 97: Oligonucleótidos modificados dirigidos a TTR que comprende un grupo conjugado GalNAc3 Los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 108 que comprenden un conjugado GalNAc se diseñaron para dirigirse a TTR.
Tabla 108
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La leyenda para la Tabla 108 puede encontrarse en el Ejemplo 74. La estructura de GalNAc3-1 se ha mostrado en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado en Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62. La estructura de GalNAc3-19a se ha mostrado en el Ejemplo 70. Ejemplo 98: Evaluación de los efectos proinflamatorios de los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc en el ensayo de hPMBC
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 109 y se analizaron para determinar los efectos proinflamatorios en un ensayo de hPMBC como se describe en los Ejemplos 23 y 24. (Ver las Tablas 30, 83, 95 y 108 para obtener descripciones de los oligonucleótidos). ISIS 353512 es un respondedor alto usado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las Tablas 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la Tabla 109 se obtuvieron usando sangre de un donante voluntario. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden enlaces internucleosídicos de PO/PS mixtos produjeron respuestas proinflamatorias significativamente más bajas en comparación con los mismos oligonucleótidos que tienen enlaces de PS completos. Además, el grupo conjugado GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
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continuación
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Ejemplo 99: Afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc para el receptor de asialoglicoproteína
Se probaron las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 110 (ver Tabla 76 para las descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglicoproteína en un ensayo de unión al receptor competitivo. El ligando competitivo, la a1-glicoproteína ácida (AGP), se incubó en un tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37° C, y se confirmó >90% de desialilación por ensayo de ácido siálico o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó monocloruro de yodo para yodar el AGP de acuerdo con el procedimiento de Atsma et al. (ver J Lipid Res. 1991 enero; 32(1 ):173-81.) En este método, se añadió a1-glicoproteína ácida desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na 125I y glicina 1M en NaOH 0,25M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, la de-AGP marcada con 125I se separó del 125I libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna de centrifugación de 3 KDMWCO. La eficacia y la pureza del marcado de la proteína se probó en un sistema HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7.8x300 mm) y un contador p-RAM. Los experimentos de competición que utilizan de-AGP marcada con 125I y varios ASO que contienen agrupaciones de GalNAc se realizaron como sigue. Se colocaron en placas células HepG2 humanas (106 células/ml) en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Se usaron medios MEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS), L-Glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron 16-20 horas @ 37° C con 5% y 10% de CO2 respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 minutos @ 37° C con 1 ml de mezcla de competición que contenía medio de crecimiento apropiado con FBS al 2%, de-AGP marcada con 125I 10-8 M y ASO que contenían agrupaciones de GalNAc a concentraciones que variaban de 10-11 a 10-5 M. La unión no específica se determinó en presencia de azúcar GalNAc 10-2 M. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para eliminar la de-AGP marcada con 125I no unida y ASO de GalNAc competidor. Las células se lisaron usando tampón RLT de Qiagen que contenía un 1% de p-mercaptoetanol. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y se analizaron en un Y-contador. La unión no específica se sustrajo antes de dividir los recuentos de proteínas 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión de competición de sitio único usando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (KD).
Los resultados en la Tabla 110 se obtuvieron de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados de los oligonucleótidos marcados con el superíndice "a" son la media de los experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc en el extremo 5' se unen al receptor de asialoglicoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc en el extremo 3'.
Tabla 110
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Ejemplo 100: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc dirigido a Apo(a) in vivo
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 111a a continuación se probaron en un estudio de dosis única para la duración de la acción en ratones.
Tabla 111a
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La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48.
Tratamiento
Se inyectó a ratones transgénicos hembra que expresan Apo(a) humana por vía subcutánea una vez por semana, para un total de 6 dosis, un oligonucleótido y una dosificación enumerados en la Tabla 111b o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles de referencia de la proteína Apo(a) en plasma y a las 72 horas, 1 semana y 2 semanas después de la primera dosis. Se realizaron extracciones de sangre adicionales a las 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la primera dosis. Los niveles de proteína Apo(a) en plasma se midieron usando un ELISA. Los resultados en la Tabla 111b se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia (% BL). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc mostraron una reducción potente en la expresión de Apo(a). Este efecto potente se observó para el oligonucleótido que comprende enlaces internucleosídicos PS completos y el oligonucleótido que comprende enlaces PO y PS mixtos.
Tabla 111b
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Ejemplo 101: Inhibición antisentido por oligonucleótidos que comprenden un grupo GalNAc enlazado a través de una fracción estable
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 112 se probaron para la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. A cada uno de los ratones C57B1/6 se le inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 112 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Cada ratón tratado con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. Cada ratón tratado con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado GalNAc de ISIS 696847 está enlazado a través de una fracción estable, un enlace de fosforotioato en lugar de un enlace que contiene fosfodiéster fácilmente escindible. Los animales se sacrificaron 72 horas después de la dosis. Los niveles de ARNm de APOC-III en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan en la Tabla 112 como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de APOC-III para cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido que carece de un grupo conjugado. Además, el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado GalNAc enlazado al oligonucleótido a través de una fracción escindible (ISIS 680772) fue incluso más potente que el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado GalNAc enlazado al oligonucleótido a través de una fracción estable (ISIS 696847).
Tabla 112
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La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48.
Ejemplo 108: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc dirigidos a Apo(a) in vivo
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 118 siguiente se probaron en un estudio de dosis única en ratones.
Tabla 118
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La estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48.
Tratamiento
Se inyectó a cada uno de los ratones transgénicos machos que expresan Apo(a) humana por vía subcutánea una vez un oligonucleótido y la dosificación enumerada en la Tabla 119 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles de referencia de la proteína Apo(a) en plasma y 1 semana después de la primera dosis. Se realizaron extracciones de sangre adicionales semanalmente durante aproximadamente 8 semanas. Los niveles de proteína Apo(a) en plasma se midieron usando un ELISA. Los resultados en la Tabla 119 se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia (% BL). Los resultados muestran que los oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión de la proteína Apo(a). Además, los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc mostraron una reducción incluso más potente en la expresión de Apo(a) que el oligonucleótido que no comprende un grupo conjugado.
Tabla 119
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Ejemplo 113: oligonucleótidos antisentido dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento y que comprenden una agrupación de GalNAc
Los oligonucleótidos en la Tabla 121 se diseñaron para dirigirse al receptor de la hormona del crecimiento humana (GHR).
Tabla 121
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Ejemplo 114: Inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humana en células Hep3B por gapmers MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GHR in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB (secuencia directa CGAGTTCAGTGAGGTGCTCTATGT, designada en la presente como SEQ ID NO: 2329; secuencia inversa AAGAGCCATGGAAAGTAGAAATCTTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 2330; secuencia de sonda TTCCTCAGATGAGCCAATT, designada en la presente como SEQ ID NO: 2331) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE o 3-10-4 MOE. Los gapmers MOE 5-10-5 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de hueco central consiste de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 3-10-4 MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la está secuencia génica humana. Cada gapmer enumerado en las tablas siguientes está dirigido o al ARNm de GHR humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_000163.4) o la secuencia genómica de GHR humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncado de los nucleótidos 42411001 a 42714000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con una complementariedad del 100% con ese gen objetivo.
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Tabla 126
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 127
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continuación
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(continuación)
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Tabla 128
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 129
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continuación
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 130
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 132
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 133
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 134
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 135
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 136
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 137
Figure imgf000145_0002
(continuación)
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continuación
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(continuación)
Figure imgf000148_0001
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 138
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 139
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continuación
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(continuación)
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Tabla 140
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplo 115: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers MOE
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa de ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 pM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes.
Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 141
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Tabla 142
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Tabla 143
Figure imgf000159_0003
Tabla 144
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Tabla 145
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Tabla 146
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(continuación)
Figure imgf000161_0001
Tabla 147
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Tabla 14*
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continuación
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Tabla 14$
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Tabla 150
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Tabla 161
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Tabla 152
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Tabla 153
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(continuación)
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Tabla 154
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Ejemplo 116: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers MOE
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición significativa in vitro de ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,3125 gM, 0,625 gM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b la 155
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T a b la 156
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T a b la 157
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(continuación)
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T a b la 158
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Ejemplo 117: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers MOE
Los gapmers de estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición significativa in vitro de ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 pM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b la 159
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T a b la 1G0
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T a b la 161
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T a b la 162
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(continuación)
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T a b la 163
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T a b la 164
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(continuación)
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T a b la 165
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T a b la 166
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(continuación)
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T a b la 167
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Ejemplo 118: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers MOE
Los gapmers de estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición significativa in vitro de ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,3125 pM, 0,625 pM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b la 168
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T a b la 169
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T a b la 170
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T a b la 171
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Ejemplo 119: Inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humano en células Hep3B por gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GHR in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen 16 nucleósidos de longitud en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o una modificación desoxi. La columna 'Química' describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de GHR humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_000163.4) o la secuencia genómica de GHR humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncada de los nucleótidos 42411001 a 42714000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con una complementariedad del 100% con ese gen objetivo.
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Ejemplo 120: Inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humano en células Hep3B por gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GHR in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen 16 nucleósidos de longitud en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o una modificación desoxi. La columna 'Química' describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de GHR humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_000163.4) o la secuencia genómica de GHR humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncada de los nucleótidos 42411001 a 42714000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con una complementariedad del 100% con ese gen objetivo. Los oligonucleótidos de la Tabla 175 no se dirigen a las SEQ ID NO: 1 o 2, sino que se dirigen a las secuencias de genes variantes SEQ ID NO: 4 (N° de registro GENBANK DR006395.1) o SEQ ID NO: 7 (el complemento del N° de registro GENBANK AA398260.1).
Tabla 173
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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T a b l a 175
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T a b la 183
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(continuación)
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Tabla 185
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(continuación)
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Ejemplo 121: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers de desoxi, MOE y (S) -cEt
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 pM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,00 pM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 187
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Tabla 188
Figure imgf000222_0002
(continuación)
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Tabla 183
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Tabla 190
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Tabla 191
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Tabla 192
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Tabla 193
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(continuación)
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Tabla 194
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Tabla 195
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(continuación)
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Tabla 196
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Tabla 197
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Ejemplo 122: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humano en células Hep3B por gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,04 pM, 0,11 pM, 0,33 pM, 1,00 pM y 3,00 pM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 138
Figure imgf000227_0001
Tabla 199
Figure imgf000227_0002
(continuación)
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Tabla 200
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Tabla 201
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(continuación)
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Tabla 202
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Tabla 203
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(continuación)
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Tabla 204
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Ejemplo 123: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR de mono rhesus en células LLC-MK2 Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron para su potencia para ARNm de GHR de rhesus en células LLC-MK2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 gM, 0,37 gM, 1,11 gM, 3,33 gM y 10,00 |jM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 205
Figure imgf000230_0001
(continuación)
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T a b la 206
Figure imgf000231_0002
Ejemplo 124: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en hepatocitos primarios de cynomolgus
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron para su potencia para ARNm de GHR en hepatocitos primarios de mono cynomolgus. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 gM, 0,37 gM, 1,11 |jM, 3,33 gM y 10,00 gM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 207
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Tabla 208
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Ejemplo 125: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en células Hep3B
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron para su potencia para ARNm de GHR a varias dosis en células Hep3B. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 pM, 0,37 pM, 1,11 pM, 3,33 pM y 10,00 pM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b la 209
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Ejemplo 126: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en hepatocitos primarios de cynomolgus
Los gapmers de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en hepatocitos primarios de monos cynomolgus. Las células se colocaron en placas a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,04 gM, 0,12 gM, 0,37 gM, 1,11 gM, 3,33 gM y 10,00 gM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de GHR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b la 211
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Ejemplo 127: Análisis comparativo de la inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en células Hep3B
ISIS 532401 se comparó con oligonucleótidos antisentido específicos divulgados en lao US 2006/0178325 probando a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos se seleccionaron en base a la potencia demostrada en los estudios descritos en la solicitud. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,11 gM, 0,33 gM, 1,00 gM, 1,11 gM, 3,00 gM y 9,00 gM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3437_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los resultados indican que ISIS 532401 era marcadamente más potente que los oligonucleótidos más potentes de la US 2006/0178325. T a b la 212
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Ejemplo 128: tolerabilidad de gapmers 5-10-5 MOE dirigidos a GHR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® (Charles River, MA) son un modelo de ratones multipropósito, frecuentemente utilizado para pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones fueron tratados con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y evaluados para detectar cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS (dosis de 100 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 213. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 213
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Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 214. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 214
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continuación
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Ejemplo 129: tolerabilidad de gapmers 5-10-5 MOE dirigidos a GHR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores químicos de plasma.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis de 100 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 215. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 215
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Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de varias células sanguíneas, como WB), RBC y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 216. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 216
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Ejemplo 130: Tolerabilidad de gapmers 3-10-4 MOE dirigidos a GHR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores químicos de plasma.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis de 100 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 217. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 217
Figure imgf000237_0002
continuación
Figure imgf000238_0002
Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 218. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 218
Figure imgf000238_0001
(continuación)
Figure imgf000239_0001
Ejemplo 131: Tolerabilidad de gapmers de desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a GHR humano en ratones CD1 Los ratones CD1® se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 25 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis de 50 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 219. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 219
Figure imgf000239_0002
Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 220. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 220
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Ejemplo 132: Tolerabilidad de gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a GHR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron para determinar los cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma. El gapmer 3-10-4 MOE ISIS 539376 también se incluyó en el estudio.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 25 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis de 50 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 221. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 221
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Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 222. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 222
Figure imgf000241_0002
(continuación)
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Ejemplo 133: Tolerabilidad de gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a GHR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® fueron tratados con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron para determinar los cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 25 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis de 50 mg/kg/semana). A un grupo de ratones CD1 macho se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 223. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 223
Figure imgf000242_0001
(continuación)
Figure imgf000243_0002
Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 224. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 224
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Ejemplo 134: Tolerabilidad de gapmers MOE dirigidos a GHR humano en ratas Sprague-Dawley Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito usado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma.
Tratamiento
Ratas Sprague-Dawley macho se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno se les inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis semanal de 100 mg/kg). Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se extrajeron órganos y plasma para su análisis posterior.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la Tabla 225 expresada en UI/l. También se midieron los niveles en plasma de bilirrubina usando el mismo analizador químico clínico y los resultados también se presentan en la Tabla 225 expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 225
Figure imgf000244_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 226, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 226
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Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 227. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 227
Figure imgf000245_0001
continuación
Figure imgf000246_0001
Pesos de órganos
Los pesos del hígado, el corazón, el bazo y los riñones se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 228. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
T a b la 228
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Ejemplo 135: tolerabilidad de gapmers desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a GHR humano en ratas Sprague-Dawley
Las ratas Sprague-Dawley se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores químicos del plasma.
Tratamiento
Las ratas macho Sprague-Dawley se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno se les inyectaron una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS (dosis semanal de 50 mg/kg). A dos grupos de ratas se les inyectó por vía subcutánea una vez por semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se extrajeron órganos y plasma para su análisis posterior.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT y AST y los resultados se presentan en la Tabla 229 expresada en UI/l. También se midieron los niveles en plasma de bilirrubina usando el mismo analizador químico clínico y los resultados también se presentan en la Tabla 229 expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 229
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 230, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 230
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Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para realizar mediciones y análisis de hematocrito (HCT), así como mediciones de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en la Tabla 231. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de hematología fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
T a b la 231
Figure imgf000248_0001
(continuación)
Figure imgf000249_0001
Pesos de órganos
Los pesos del hígado, el corazón, el bazo y los riñones se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 232. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios posteriores.
T a b la 232
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Ejemplo 136: Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a GHR humano en monos cynomolgus Los monos Cynomolgus se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad de los oligonucleótidos antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y los riñones.
En el momento en que se realizó este estudio, la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba disponible en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia génica del mono cynomolgus. En cambio, las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS usados en los monos cynomolgus se compararon con una secuencia de mono rhesus por homología. Se espera que los oligonucleótidos ISIS con homología con la secuencia del mono rhesus también tengan reactividad cruzada completa con la secuencia del mono cynomolgus. Los oligonucleótidos antisentido humanos probados tienen reacción cruzada con la secuencia genómica de rhesus (N° de registro GENBANK NW_001120958.1 truncada de los nucleótidos 4410000 a 4720000, designada en la presente como SEQ ID NO: 2332). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, es más probable que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia del mono rhesus. Los sitios de inicio y detención de cada oligonucleótido para la SEQ ID NO: 2332 se presentan en la Tabla 233. El "sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen del mono rhesus.
T a b la 233
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Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante la cual los animales se observaron diariamente para su salud general. Los monos tenían 2-4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. A nueve grupos de 5 monos cynomolgus macho asignados aleatoriamente se les inyectó por vía subcutánea oligonucleótido ISIS o PBS usando una aguja de dosificación de acero inoxidable y una jeringuilla de tamaño apropiado en la región intracapsular y el muslo externo de los monos. A los monos se les dosificó tres veces (días 1, 4 y 7) durante la primera semana, y luego una vez a la semana durante 12 semanas con 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS. A un grupo de control de 5 monos cynomolgus se le inyectó PBS de manera similar y sirvió como grupo de control.
Durante el período de estudio, los monos fueron observados dos veces al día en busca de signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que experimentó más que dolor o angustia momentánea o leve debido al tratamiento, lesión o enfermedad fue tratado por el personal veterinario con analgésicos o agentes aprobados para aliviar el dolor después de consultar con el Director del Estudio. Se identificó cualquier animal con mala salud o en una posible condición moribunda para una mayor monitorización y posible eutanasia. La eutanasia programada de los animales se realizó el día 86 por desangrado después de anestesia inducida por ketamina/xilazina y la administración de pentobarbital sódico. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Reducción de objetivo hepático
Análisis de ARN
El día 86, se extrajo ARN del hígado, tejido adiposo blanco (WAT) y riñón para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión de ARNm de GHR. Los resultados se presentan como porcentaje de cambio de ARNm, con respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®.'nd' indica que los datos de ese oligonucleótido particular no se midieron. Como se muestra en la Tabla 234, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de GHR en comparación con el control de PBS. Específicamente, el tratamiento con ISIS 532401 dio como resultado una reducción significativa de la expresión de ARNm en todos los tejidos.
Tabla 234
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Análisis de proteínas
Se recogió aproximadamente 1 ml de sangre de todos los animales disponibles en el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal de potasio de EDTA. Los tubos se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente) para obtener plasma. Los niveles en plasma de IGF-1 y GH se midieron en el plasma. Los resultados se presentan en la Tabla 235. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de proteína IGF-1.
Tabla 235
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Estudios de tolerabilidad
Mediciones de peso corporal y de órganos.
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los pesos corporales se midieron el día 84 y se presentan en la Tabla 236. Los pesos de los órganos se midieron el día 86 y los datos también se presentan en la Tabla 236. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los pesos corporales y de los órganos estuvo dentro del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 532401 fue bien tolerado en términos del peso corporal y de órganos de los monos.
Tabla 236
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Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción venosa femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. Se recogió sangre en tubos que contenían anticoagulante K2-EDTA, que se centrifugó para obtener plasma. Los niveles de varios marcadores de función hepática se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Se midieron los niveles en plasma de ALT y AST y bilirrubina. Los resultados indican que los oligonucleótidos antisentido no tuvieron efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 532401 fue bien tolerado en términos de la función hepática en los monos.
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción venosa femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. Se recogió sangre en tubos que contenían anticoagulante K2-EDTA, que se centrifugó para obtener plasma. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón).
Los datos de la química del plasma indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 532401 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 1,3 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (RBC), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuentos de glóbulos blancos individuales, como el de monocitos, neutrófilos, linfocitos, así como para recuento de plaquetas, contenido de hemoglobina y hematocrito, usando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, USA).
Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron ningún cambio en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis. Específicamente, el tratamiento con ISIS 532401 fue bien tolerado en términos de los parámetros hematológicos de los monos.
Análisis de nivel de proteína C reactiva
Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, se tomaron muestras de sangre para su análisis. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. Se recogieron aproximadamente 1,5 ml de sangre de cada animal y se colocaron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para obtener suero.
La proteína C reactiva (PCR), que se sintetiza en el hígado y que sirve como marcador de inflamación, se midió usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 5 3 2 4 0 1 no provocó inflamación en los monos.
Ejemplo 137: Medición de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a GHR humano La viscosidad de oligonucleótidos antisentido seleccionados del estudio descrito en los Ejemplos anteriores se midió con el objetivo de detectar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad de más de 40 cP. Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad de más de 4 0 cp serán demasiado viscosos para adminitrarlos a cualquier sujeto.
Los ligonucleótidos ISIS (32-35 mg) se pesaron en un vial de vidrio, se añadieron 120 gl de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50° C. Una parte de (75 gl) de la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del micro-viscosímetro se fijó a 25° C y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 gl) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 ml de agua para lectura UV a 260 nM a 85° C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 237 e indican que todas las soluciones de oligonucleótidos antisentido son óptimas en su viscosidad bajo el criterio establecido anteriormente.
Tabla 237
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Ejemplo 138: Efecto de los oligonucleótidos ISIS conjugados con GalNAc3-7 frente a los no conjugados en un modelo de ratón.
Los oligonucleótidos ISIS dirigidos a GHR murino y que no se conjugaron o se conjugaron con GalNAc3-7 se probaron en ratones BALB/c para determinar su eficacia y tolerabilidad. Los ratones BALB/c son un modelo de ratones multipropósito, frecuentemente utilizado para pruebas de seguridad y eficacia.
Los oligonucleótidos son todos los gapmers 5-10-5 MOE, que tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica murina. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia génica murina. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de GHR murino, designado en la presente como SEQ ID NO: 2333 (N° de registro GENBANK NM_010284.2). Los oligonucleótidos se describen en detalle en la Tabla siguiente.
Tabla 238
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Tratamiento
A dos grupos de ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea durante 4 semanas 10 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana o 50 mg/kg/semana de ISIS 563223 o ISIS 563179. A dos grupos de ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea durante 4 semanas 1 mg/kg/semana, 5 mg/kg/semana, o 10 mg/kg/semana de ISIS 706937 o ISIS 739949. A un grupo de ratones BALB/c hembra se les inyectó subcutáneamente durante 4 semanas PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Reducción del objetivo
Para evaluar la eficacia de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles en plasma de IGF-1 y los niveles de expresión de ARNm de IGF-1 y GHR en el hígado, así como los niveles de expresión de ARNm de GHR en tejidos grasos y renales. Los resultados se presentan en las tablas siguientes.
Los resultados indican que los oligonucleótidos conjugados con GalNAc3-7, ISIS 706937 e ISIS 739949, son 7-8 veces más potentes que los oligonucleótidos originales con la misma secuencia, ISIS 563223 e ISIS 563179, en la reducción de los niveles de ARNm de hígado de GHR y fueron de 6 a 8 veces más potentes para reducir los niveles de IGF-1 en el hígado y el plasma. La expresión de los niveles de GHR en los tejidos renales y grasos no disminuyó con los oligonucleótidos conjugados con GalNAc3-7, ya que el grupo conjugado GalNAc3-7 dirigió el oligonucleótido específicamente al hígado. Esta pérdida en la reducción de grasa y riñón con oligonucleótidos conjugados con GalNAc3-7 no afectó a la reducción de IGF-1.
Tabla 239
Figure imgf000254_0001
Tabla 240
Figure imgf000254_0002
(continuación)
Figure imgf000255_0003
Tabla 241
Figure imgf000255_0002
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, glucosa, colesterol y triglicéridos usando un analizador químico clínico automatizado (Beckman Coulter AU480, Brea, CA). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Ninguno de los oligonucleótidos ISIS provocó cambios en los niveles de ninguno de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos conjugados con GalNAc3-7 tenían un perfil ligeramente mejorado sobre los oligonucleótidos originales.
Tabla 242
Figure imgf000255_0001
(continuación)
Figure imgf000256_0001
Los resultados tomados en conjunto indican que los oligonucleótidos dirigidos a la expresión de ARNm de GHR cuando se conjugan con GalNAc3-7 tenían una potencia diez veces mayor y perfiles de tolerabilidad similares o mejorados en comparación con los oligonucleótidos originales.
Ejemplo 139: Estudio de tolerabilidad de un oligonucleótido ISIS conjugado con GalNAc3-7 y dirigido a GHR humano en ratones.
ISIS 766720 fue diseñado con la misma secuencia que ISIS 532401, un oligonucleótido potente y tolerable dirigido a GHR humano y descrito en los estudios anteriores. ISIS 766720 es un gapmer 5-10-5 MOE con química de estructura principal mixta y conjugado con GalNAc3-7. La estructura química de ISIS 766720 sin el grupo conjugado GalNAc3-7 se denota como mCes mCes Aeo mCeo mCes Tds Tds Tds Gds Gds Gds Tds Gds Ads Ads Teo Aeo Ges mCes Ae (SEQ ID NO: 703) y se denota completamente como:
Figure imgf000257_0001
Tratamiento
A grupos de ratones CD-1 macho de seis semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea durante 6 semanas 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana o 100 mg/kg/semana de ISIS 766720. A un grupo de ratones se le inyectó por vía subcutánea durante 6 semanas (días 1, 5, 15, 22, 29, 36 y 43) PBS. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma fueron recogidos para su análisis posterior.
Marcadores químicos del plasma
Para evaluar el efecto de ISIS 766720 sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, bilirrubina, creatinina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. ISIS 766720 no provocó cambios en los niveles de ninguno de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido y se consideró muy tolerable.
Tabla 243
Figure imgf000258_0001
Peso corporal y de órganos
Los pesos corporales y de los órganos se midieron al final del estudio. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. ISIS 766720 no provocó cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido y se consideró muy tolerable.
Tabla 244
Figure imgf000258_0002

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000259_0001
2. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
3. El compuesto de la reivindicación 1, o la composición de la reivindicación 2, para su uso en terapia.
4. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la reivindicación 1, o la composición de la reivindicación 2, para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada con un exceso de la hormona de crecimiento en un humano, en donde el uso comprende administrar al humano la cantidad terapéuticamente eficaz, tratando de este modo la enfermedad asociada con el exceso de la horman de crecimiento, opcionalmente en donde (a) la enfermedad asociada con el exceso de la hormona de crecimiento es acromegalia y/o (b) el tratamiento reduce los niveles de IGF-1
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