BR112016022742B1 - Composto químico, composição compreendendo o composto e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

profármaco, composição, compostos, suas quantidades terapeuticamente eficazes, seus usos e método para modular a expressão de receptor de hormônio do crescimento. as presentes modalidades referem-se a métodos, compostos e composições para o tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença associada com o excesso do hormônio de crescimento usando compostos antissenso ou oligonucleotídeos direcionados ao receptor do hormônio de crescimento (ghr).

Description

Listagem de Sequência
[001] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado BIOL0253WOSEQ_ST25.txt criado em 27 de abril de 2015, que é de 1,29 MB em tamanho. As informações no formato eletrônico da listagem de sequência são incorporadas a este documento por referência em sua totalidade.
Campo
[002] As presentes modalidades fornecem métodos, compostos e composições para o tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença associada com o excesso do hormônio de crescimento usando compostos antissenso ou oligonucleotídeos direcionados ao receptor do hormônio de crescimento (GHR).
ANTECEDENTES
[003] O hormônio do crescimento é produzido na pituitária e secretada na corrente sanguínea, em que se liga ao receptor do hormônio de crescimento (GHR) em vários tipos de células, levando à produção do fator-1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-1). IGF- 1 é produzido principalmente no fígado, mas também no tecido adiposo e no rim e é secretado na corrente sanguínea. Vários distúrbios, como acromegalia e gigantismo estão associadas a níveis elevados de hormônios do crescimento e/ou níveis elevados de IGF-I no plasma e/ou nos tecidos.
[004] A produção excessiva do hormônio do crescimento pode levar a doenças como a acromegalia ou o gigantismo. A acromegalia e o gigantismo estão associados com o excesso de hormônios do crescimento, muitas vezes causadas por um tumor na hipófise e afeta 40-50 milhões de pessoas ao redor do mundo, com 15.000 pacientes na Europa e nos EUA e uma incidência de 4-5 milhões de pessoas. A acromegalia e o gigantismo são inicialmente caracterizados pelo crescimento anormal das mãos e dos pés e alterações ósseas nas feições do rosto. Muitas das consequências relacionadas ao crescimento são mediadas por elevados níveis do soro de IGF-1.
Sumário
[005] As modalidades fornecidas aqui se relacionam a métodos, compostos e composições para tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença associada ao excesso de hormônio do crescimento. Várias modalidades fornecidas aqui são voltadas para compostos antissenso ou oligonucleotídeos direcionados ao receptor do hormônio do crescimento (GHR). Diversas modalidades são voltadas para o tratamento, prevenção ou melhoramento da acromegalia com compostos antissenso ou oligonucleotídeos direcionados ao receptor do hormônio do crescimento (GHR).
Descrição Detalhada
[006] Deve-se compreender que a descrição geral mencionada e a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas, tão somente, e não restringem a invenção, conforme reivindicado. Aqui, o uso do singular inclui o plural, salvo quando houver outra especificação. Conforme usado aqui, o uso de "ou" significa "e/ou", salvo quando houver outra especificação. Ademais, o uso do termo "incluindo", bem como outras formas, como "que inclui" ou "incluído", não é limitativo. Além disso, termos como "elemento" ou "componente" abrangem elementos e componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, salvo quando se estabelecer de outra forma.
[007] Os títulos das seções usados aqui são para fins organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitadores do objeto descrito. Todos os documentos, ou partes dos documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não se limitando a, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados por meio deste para as partes do documento discutidas neste documento, bem como em sua totalidade.
[008] A menos que definições específicas sejam apresentadas, a nomenclatura utilizada associada e os procedimentos e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química farmacêutica e medicinal descrita neste documento é aquela bem conhecida e comumente usada na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para a síntese química e análise química. Certas técnicas e procedimentos podem ser encontrados, por exemplo, em "Carbohydrate Modifications in Antissenso Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington'sPharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edição, 2005; e "Antissenso Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; e Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, que estão incorporados por meio deste por referência para qualquer finalidade. Quando permitido, todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações e outros dados mencionados toda a descrição são incorporados por referência neste documento na sua totalidade.
[009] Salvo indicado de outra forma, os termos a seguir têm os seguintes significados:
[0010] "Nucleosídeo 2'-F" se refere a um nucleosídeo que compreende um açúcar compreendendo um flúor na posição 2'. Salvo indicação em contrário, o flúor em um nucleosídeo 2'-F está na posição ribo (substituindo o OH de uma ribose natural).
[0011] "2'-O-metoxietil" (também 2'-MOE e 2'-O(CH2)2-OCH3) refere-se a uma modificação de O-metóxi-etil na posição 2' de um anel de furanosil. Um açúcar modificado em 2'-O-metoxietil é um açúcar modificado.
[0012] "Nucleosídeo de 2'-MOE" (também chamado nucleosídeo de 2'-O-metoxietil) denota um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar modificada em 2'-MOE.
[0013] "Nucleosídeo substituído em 2'" significa um nucleosídeo que compreende um substituinte na posição 2' diferente de H ou OH. Salvo indicação em contrário, um nucleosídeo substituído em 2' não é um nucleosídeo bicíclico.
[0014] "Porção de açúcar substituída em 2'" se refere a um furanosil que compreende um substituinte na posição 2' diferente de H ou OH. Salvo indicação em contrário, uma porção de açúcar substituída em 2' não é uma porção de açúcar bicíclica (isto é, substituinte em 2' de uma porção de açúcar substituída em 2' não forma uma ponte para outro átomo do anel de furanosil).
[0015] "Local-alvo 3'" refere-se ao nucleotídeo de um ácido nucleico alvo que é complementar ao nucleotídeo mais próximo de 3' de um composto antissenso particular.
[0016] "Local-alvo 5'" refere-se ao nucleotídeo de um ácido nucleico alvo que é complementar ao nucleotídeo mais próximo de 5' de um composto antissenso particular.
[0017] "5-metilcitosina" denota uma citosina modificada com um grupo metil ligado à posição 5. Uma 5-metilcitosina é uma nucleobase modificada.
[0018] "Cerca de" significa dentro de ±10% de um valor. Por exemplo, se for afirmado que "os compostos afetaram pelo menos 70% a inibição do GHR", isso implica que os níveis do GHR são inibidos em uma faixa de 60% e 80%.
[0019] "Administração" ou "administrar" refere-se a vias de introdução de um composto antissenso fornecido aqui a um indivíduo para desempenhar sua função pretendida. Um exemplo de uma via de administração que pode ser utilizada inclui, mas não está limitado a ,administração parentérica, tal como subcutânea, intravenosa, ou injeção intramuscular ou infusão.
[0020] Como usado neste documento, "alquila" se refere um radical hidrocarboneto saturado linear ou ramificado que contém até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem, entre outros, metila, etila, propila, butila, isopropila, n-hexila, octila, decila, dodecil e similares. Os grupos alquila incluem tipicamente de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a cerca de 12 átomos de carbono ( C1- C12 alquila), sendo que de 1 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial.
[0021] Como usado neste documento, "alquenila" se refere a um radical de uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que contém até vinte e quatro átomos de carbono e que tem pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono. Exemplos de grupos alquenila incluem, entre outros, etenila, propenila, butenila, 1-metil-2-buten-1-ila, dienos como 1,3-butadieno e similares. Os grupos alquenila incluem tipicamente de 2 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 2 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial. Grupos alquenil usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0022] Como usado neste documento, "alquinila" se refere a um radical de uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que contém até vinte e quatro átomos de carbono e que tem pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono. Exemplos de grupos alquinil incluem, entre outros, etinila, 1-propinila, 1-butinila e similares. Os grupos alquinila incluem tipicamente de 2 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 2 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial. Grupos alquinila usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0023] Como usado neste documento, "acila" se refere a um radical formado pela remoção de um grupo hidroxila de um ácido orgânico e que tem fórmula geral -C(O)-X em que X é normalmente alifático, alicíclico ou aromático. Os exemplos incluem carbonilas alifáticas, carbonilas aromáticas, sulfonilas alifáticas, sulfinilas aromáticas, sulfinilas alifáticas, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos e similares. Grupos acila usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0024] Como usado neste documento, "alicíclico" se refere a um sistema de anel cíclico, em que o anel é alifático. O sistema de anel pode compreender um ou mais anéis, em que pelo menos um anel é alifático. Alicíclicos preferenciais incluem anéis com cerca de 5 a cerca de 9 átomos de carbono no anel. Alicíclicos usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0025] Como usado neste documento, "alifático" se refere a um radical de hidrocarboneto linear ou ramificado contendo até vinte e quatro átomos de carbono, em que a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação simples, dupla ou tripla. O grupo alifático contém, preferencialmente, de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 1 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial. A cadeia linear ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos que incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Esses grupos alifáticos interrompidos por heteroátomos incluem, entre outros, polialcóxis, como polialcaleno glicóis, poliaminas e poliminas. Grupos alifáticos usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0026] Como usado neste documento, "alcóxi" se refere a um radical formado entre um grupo alquila e um átomo de oxigênio, em que o átomo de oxigênio é usado para afixar o grupo alcóxi a uma molécula de origem. Exemplos de grupos alcóxi incluem, sem limitação, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n-pentóxi, neopentóxi, n-hexóxi e similares. Grupos alcóxi usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0027] Como usado neste documento, "aminoalquila" se refere um radical alquila C1-C12 substituído por amina. A parte da alquila do radical forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. O grupo amina pode estar localizado em qualquer posição e o grupo aminoalquila pode ser substituído por um grupo substituinte nas partes alquila e/ou amina.
[0028] Como usado neste instrumento, "aralquila" e "arilalquila" se refere a um grupo aromático que é ligado covalentemente a um radical alquila C1-C12. A parte do radical alquila do grupo aralquila (ou arilalquila) resultante forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. Os exemplos incluem, entre outros, benzila, fenetila e similares. Os grupos aralquila usados neste documento podem incluir ainda, opcionalmente, grupos substituintes afixados a alquila, arila ou a ambos os grupos que formam o grupo radical.
[0029] Como usado neste documento, "arila" e "aromático" se refere a radicais de um sistema de anel carboxílico mono- ou policíclico com um ou mais anéis aromáticos. Os exemplos de grupos aril incluem, entre outros, fenila, naftila, tetra-hidronaftila, indanila, idenila e similares. Os sistemas de anel aril preferenciais têm cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Grupos aril usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0030] "Melhora" refere-se a uma diminuição de pelo menos um indicador, sinal ou sintoma de uma doença, distúrbio ou condição associada. Em determinadas modalidades, melhora inclui um retardo ou diminuição da progressão de um ou mais indicadores de uma condição médica ou doença. A gravidade dos indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0031] "Animal" refere-se a um ser humano ou animal não-humano, incluindo, mas não limitado a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não humanos, incluindo, mas não se limitando a, macacos e chimpanzés.
[0032] "Atividade antissenso" significa qualquer atividade detectável ou mensurável atribuível à hibridização de um composto antissenso a seu ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a atividade antissenso é uma diminuição da quantidade ou da expressão de um ácido nucleico alvo ou de uma proteína codificada por esse ácido nucleico alvo.
[0033] "Composto antissenso" significa um composto oligomérico que é capaz de sofrer hibridização em um ácido nucleico alvo através da ligação de hidrogênio. Exemplos de compostos antissenso incluem compostos de fita simples e de fita dupla, tais como, oligonucleotídeos antissenso, siRNAs, shRNAs, ssRNAs e compostos à base de ocupação.
[0034] "Inibição antissenso" significa a redução de níveis de ácido nucleico alvo na presença de um composto antissenso complementar a um ácido nucleico alvo em comparação a níveis de ácido nucleico alvo na ausência do composto antissenso.
[0035] "Mecanismos antissenso" são todos aqueles mecanismos que envolvem a hibridização de um composto com um ácido nucleico alvo, em que o resultado ou efeito da hibridização é ou degradação alvo ou ocupação alvo com retardamento concomitante da maquinaria celular envolvendo, por exemplo, a transcrição ou junção.
[0036] "Oligonucleotídeo antissenso" significa um oligonucleotídeo de fita única tendo uma sequência de nucleobases que permite a hibridização em uma região ou segmento correspondente de um ácido nucleico alvo.
[0037] "Complementaridade da base" refere-se à capacidade de o emparelhamento de bases precisas de nucleobases de um oligonucleotídeo antissenso com correspondentes nucleobases de um ácido nucleico alvo (isto é, hibridização), e é mediada pela Watson- Crick, de Hoogsteen ou invertida de Hoogsteen hidrogênio ligação entre nucleobases correspondentes.
[0038] "Porção de açúcar bicíclico" significa uma porção de açúcar modificada compreendendo um anel de 4 a 7 membros (incluindo, mas não se limitando a um furanosil) compreendendo uma ponte que conecta dois átomos do anel de 4 a 7 membros para formar um segundo anel, resultando em uma estrutura bicíclica. Em determinadas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um anel de açúcar. Em determinadas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um furanosil. Em certas modalidades, a ponte conecta o carbono 2' e o carbono 4' do furanosil.
[0039] "Ácido nucleico bicíclico" ou "BNA" ou "nucleosídeos BNA" significa um nucleosídeo tendo uma porção de açúcar compreendendo uma ponte que conecta dois átomos de carbono do anel de açúcar, assim formando um sistema de anel bicíclico. Em certas modalidades, a ponte conecta o 4'-carbono e o 2'-carbono do anel de açúcar.
[0040] "Estrutura cap" ou "porção cap terminal" significa modificações químicas que foram incorporadas em qualquer terminal de um composto antissenso.
[0041] "Carboidrato" se refere a um carboidrato de ocorrência natural, um carboidrato modificado ou um derivado do carboidrato.
[0042] "Grupo de carboidrato" se refere a um composto que tem um ou mais resíduos de carboidrato afixados a um grupo andaime ou a um grupo ligante. (Ver, por exemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, que é incorporado aqui pela referência na sua totalidade, ou Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para exemplos de agrupamentos conjugados de carboidrato).
[0043] "Derivado de carboidrato" se refere a qualquer composto que pode ser sintetizado usando um carboidrato como matéria-prima ou intermediário.
[0044] "cEt" ou "etila limitada" significa uma porção de açúcar bicíclico tendo uma porção de açúcar compreendendo uma ponte que liga o 4'-carbono e o grupo 2'-carbono, em que a ponte tem a fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0045] "Nucleosídeo de etil limitado" (também nucleosídeo de cEt) significa um nucleosídeo compreendendo uma porção de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte de 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0046] "Região quimicamente distinta" refere-se a uma região de um composto antissenso que é, de alguma forma, quimicamente diferente de outra região do mesmo composto antissenso. Por exemplo, uma região tendo nucleotídeos de 2'-O-metoxietila é quimicamente distinta de uma região tendo nucleotídeos sem modificações de 2'-O- metoxietila.
[0047] "Modificação química" significa uma diferença química em um composto quando comparado a uma contraparte de ocorrência natural. As modificações químicas dos oligonucleotídeos incluem modificações de nucleosídeos (incluindo modificações da porção de açúcar e modificações da nucleobase) e modificações da ligação internucleosídica. Em referência a um oligonucleotídeo, a modificação química não inclui diferenças apenas na sequência de nucleobase.
[0048] "Compostos antissenso quiméricos" denota os compostos antissenso que têm pelo menos 2 regiões quimicamente distintas, cada posição tendo uma variedade de subunidades.
[0049] "Ligação clivável" se refere a qualquer ligação química capaz de ser quebrada. Em certas modalidades, uma ligação clivável é selecionada dentre: uma amida, uma poliamida, um éster, um éter, um ou ambos ésteres de um fosfodiéster, um éster de fosfato, um carbamato, uma dissulfeto ou um peptídeo.
[0050] "Porção clivável" se refere a uma ligação ou grupo que é capaz de ser quebrado em condições fisiológicas. Em determinadas modalidades, uma porção clivável está no interior de compartimentos celulares ou subcelulares, como um lisossomo. Em determinadas modalidades, uma porção clivável é clivada por enzimas endógenas, como as nucleases. Em determinadas modalidades, uma porção clivável compreende um grupo de átomos com um, dois, três, quatro ou mais de quatro ligações cliváveis.
[0051] "Coadministração" significa a administração de dois ou mais agentes farmacêuticos a um indivíduo. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem estar em uma única composição farmacêutica ou podem estar em composições farmacêuticas separadas. Cada um dos dois ou mais agentes farmacêuticos podem ser administrados através de vias de administração iguais ou diferentes. A coadministração engloba a administração sequencial ou paralela.
[0052] "Complementaridade" significa a capacidade para parear entre nucleobases de um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico.
[0053] "Compreendem", "compreende" e "compreendendo" será entendido como implicando a inclusão de uma etapa referida ou elemento ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos.
[0054] "Conjugado" ou "grupo conjugado" se refere a um átomo ou grupo de átomos ligados a um oligonucleotídeo ou composto oligomérico. Em geral, grupos conjugados modificam uma ou mais propriedades do composto ao qual estão afixados, incluindo entre outros, propriedades de farmacodinâmica, farmacocinética, absorção, distribuição celular, absorção celular, carga e/ou depuração.
[0055] "Ligante conjugado" ou "ligante" no contexto de um grupo conjugado representa uma parte de um grupo conjugado que consiste em qualquer átomo ou grupo de átomos e que liga covalentemente (1) um oligonucleotídeo a outra parte do grupo conjugado ou (2) duas ou mais partes do grupo conjugado.
[0056] Os grupos conjugados são mostrados neste instrumento como radicais, fornecendo uma ligação para a formação de ligação covalente com um composto oligomérico como um oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o ponto de ligação em um composto oligomérico é o átomo de oxigênio 3' do grupo 3'-hidroxila do nucleosídeo terminal 3' do composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o ponto de ligação ao composto oligomérico é o átomo de oxigênio 5' do grupo 5'-hidroxila do nucleosídeo terminal 5' do composto oligomérico. Em determinadas modalidades, a ligação para a formação da ligação com um composto oligomérico é uma ligação clivável. Em certas modalidades, tal ligação clivável constitui a totalidade ou parte de uma porção clivável.
[0057] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem uma porção clivável (por exemplo, uma ligação clivável ou um nucleosídeo clivável) e uma parte do grupo de carboidrato, como uma parte do grupo GalNAc. Tal porção de grupo de carboidrato compreende: uma porção-alvo e, opcionalmente, um ligante conjugado. Em determinadas modalidades, a parte do grupo de carboidrato é identificada pelo número e identidade do ligante. Por exemplo em certas modalidades, a porção de grupo de carboidrato compreende 3 grupos GalNAc e é designado "GalNAc3". Em certas modalidades, a porção de grupo de carboidrato compreende 4 grupos GalNAc e é designado "GalNAc4". Porções de agrupamentos específicos de carboidrato (com correntes específicas, a ramificação e a grupos de conjugado de ligante) são aqui descritos e designados por algarismos romanos seguidos de índice "a". Assim "GalNAc3-1a" refere-se a uma porção de grupo de carboidrato específico de um grupo conjugado possuindo 3 grupos GalNAc e correntes especificamente identificadas, ramificação e grupos de ligação. Esse fragmento de grupo do carboidrato está afixado a um composto oligomérico via porção clivável, como uma ligação clivável ou nucleosídeo clivável.
[0058] "Composto conjugado" se refere a quaisquer átomos, grupo de átomos ou grupo de átomos ligados adequados para serem usados como um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, os compostos conjugados podem possuir ou conferir uma ou mais propriedades do composto ao qual estão afixados, incluindo entre outros, propriedades de farmacodinâmica, farmacocinética, absorção, distribuição celular, absorção celular, carga e/ou depuração.
[0059] "Nucleobases contíguas" significam nucleobases imediatamente adjacentes uma à outra.
[0060] "Nucleosídeo de etil limitado" ou "cEt" significa um nucleosídeo compreendendo uma porção de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte de 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0061] "Desoxirribonucleosídeo" significa um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar de furanosil 2'-H, como encontrado nos desoxirribonucleosídeos de ocorrência natural (DNA). Em determinadas modalidades, um 2-desoxinucleosídeo pode compreender uma nucleobase modificada ou pode compreender uma nucleobase de RNA (por exemplo, uracil).
[0062] "Concepção" ou "concebido para" referem-se ao processo de concepção de um composto oligomérico que hibrida especificamente com uma molécula de ácido nucleico selecionado.
[0063] "Diferentemente modificado" se refere às modificações químicas ou substituintes químicos que são diferentes uns dos outros, incluindo ausência de modificações. Assim, por exemplo, um nucleosídeo MOE e um nucleosídeo de DNA não modificado são "diferentemente modificados" embora o nucleosídeo do DNA não seja modificado. Da mesma forma, DNA e RNA são "diferentemente modificados" embora ambos sejam nucleosídeos não modificados de ocorrência natural. Os nucleosídeos que são os mesmos, mas por compreenderem nucleobases diferentes não são diferentemente modificados. Por exemplo, um nucleosídeo que compreende um açúcar modificado 2'-OMe e uma nucleobase adenina não modificada e um nucleosídeo compreendendo um açúcar modificado 2'-OMe e uma nucleobase timina não modificada não são diferentemente modificados.
[0064] "Diluente" significa um ingrediente em uma composição que carece de atividade farmacológica, mas é farmaceuticamente necessário ou desejável. Por exemplo em que as drogas são injetadas, o diluente pode ser um líquido, por exemplo solução salina.
[0065] "Dose" significa uma quantidade especificada de um agente farmacêutico fornecido em uma administração única ou num período de empo especificado. Em determinadas modalidades, uma dose pode ser administrada em um, dois ou mais bolus, comprimidos ou injeções. Por exemplo em determinadas modalidades em que a administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado por uma única injeção, portanto, duas ou mais injeções podem ser usadas para obter a dose desejada. Em determinadas modalidades, o agente farmacêutico é administrado por infusão durante um período de tempo estendido ou continuamente. As doses podem ser indicadas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês.
[0066] "Fita dupla" refere-se a dois compostos oligoméricos separados que são hibridizados um com o outro. Esses compostos de fita dupla podem ter um ou mais nucleosídeos não hibridizantes em uma ou ambas as extremidades de uma ou ambas as fitas (overhangs) e/ou um ou mais nucleosídeos não-hibridizantes internos (incompatibilidades) desde que exista complementaridade suficiente para manter a hibridização em condições fisiologicamente relevantes.
[0067] "A jusante" refere-se à direção relativa em direção à extremidade 3 'ou extremidade C-terminal de um ácido nucleico.
[0068] "Quantidade eficaz" significa a quantidade de agente farmacêutico ativo suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo em necessidade do agente. A quantidade eficaz pode varia dentre os indivíduos, dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, a formulação da composição, avaliação da condição médica do indivíduo e outros fatores relevantes.
[0069] "Quantidade eficaz", no contexto de modulação em uma atividade ou para o tratamento ou prevenção de uma condição significa que a administração dessa quantidade do agente farmacêutico a um indivíduo em necessidade de tal modulação, o tratamento ou profilaxia, quer em uma dose única ou como parte de uma série, que é eficaz para a modulação do efeito do que ou para o tratamento ou para a profilaxia ou o melhoramento de que a condição. A quantidade eficaz pode varia dentre os indivíduos, dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, a formulação da composição, avaliação da condição médica do indivíduo e outros fatores relevantes.
[0070] "Eficácia" significa a capacidade para produzir um efeito desejado.
[0071] "Essencialmente inalterado" se refere a pouca ou nenhuma alteração em um determinado parâmetro especificamente em relação a outro parâmetro que muda muito mais. Em determinadas modalidades, um parâmetro é essencialmente inalterado quando muda em menos de 5%. Em determinadas modalidades, um parâmetro é essencialmente inalterado se ele muda menos de duas vezes enquanto outro parâmetro muda pelo menos dez vezes. Por exemplo em determinadas modalidades, uma atividade antissenso é uma mudança na quantidade de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a quantidade de ácido nucleico não alvo é essencialmente inalterada se ela muda muito menos do que o ácido nucleico alvo, mas a mudança não precisa ser zero.
[0072] "Expressão" se refere ao processo pelo qual um gene resulta em última análise em uma proteína. Expressão inclui entre outros, transcrição, modificação pós-transcricional (por exemplo, junção, poliadenilação, adição de 5'-cap) e tradução.
[0073] "Totalmente complementar" ou "100% complementar" significa que cada uma das nucleobases de um primeiro ácido nucleico tem uma nucleobase complementar em um segundo ácido nucleico. Em determinadas modalidades, um primeiro ácido nucleico é um composto antissenso e um ácido nucleico alvo é um segundo ácido nucleico.
[0074] "Furanosil" significa uma estrutura compreendendo um anel de 5 membros compreendendo quatro átomos de carbono e um átomo de oxigênio.
[0075] "Mero de lacuna" denota um composto antissenso químico em que uma região interna com uma variedade de nucleosídeos que sustentam a clivagem de H RNase é posicionada entre as regiões externas com um ou mais nucleosídeos em que os nucleosídeos compreendendo a região interna são quimicamente distintos do nucleotídeo ou dos nucleosídeos que compreendem as regiões externas. A região interna pode ser referida como a "de lacuna" e as regiões externas podem ser referidas como as "asas".
[0076] "Receptor do hormônio do crescimento (GHR)" denota qualquer ácido nucleico ou proteína de GHR. "Ácido nucleico de GHR" denota qualquer ácido nucleico que codifica GHR. Por exemplo em certas modalidades, um ácido nucleico de GHR inclui uma sequência de DNA que codifica GHR, uma sequência de RNA transcrita a partir de DNA que codifica GHR (incluindo DNA genômico compreendendo íntrons e éxons), incluindo uma não-proteína que codifica (ou seja, uma sequência não codificadora) de RNA e uma sequência de mRNA que codifica GHR. "mRNA de GHR" denota um mRNA que codifica uma proteína de GHR.
[0077] "Inibidor específico de GHR" refere-se a qualquer agente capaz de inibir especificamente o RNA de GHR e/ou a expressão ou atividade da proteína de GHR no nível molecular. Por exemplo, os inibidores específicos de GHR incluem ácidos nucleicos (incluindo compostos antissenso), peptídeos, anticorpos, moléculas pequenas e outros agentes capazes de inibir a expressão do mRNA de GHR e/ou da proteína de GHR.
[0078] "Halo" e "halogênio" se referem a um átomo selecionado do flúor, cloro, bromo e iodo.
[0079] "Heteroarila" e "heteroaromático" se referem a um radical que compreende um sistema de anel aromático mono ou policíclico, um sistema de anel ou um sistema de anel fundido em que pelo menos um dos anéis seja aromático e inclua um ou mais heteroátomos. Heteroarila também deve incluir sistemas de anel fundidos incluindo sistemas em que um ou mais anéis fundidos não contêm heteroátomos. Os grupos heteroarila incluem tipicamente um átomo do anel selecionado do enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupos de heteroaril incluem, entre outros, piridinila, pirazinila, pirimidinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, oxazolila, isooxazolila, tiadiazolila, oxadiazolila, tiofenila, furanila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzooxazolila, quinoxalinila e similares. Os radicais heteroarila podem ser afixados a uma molécula de origem diretamente ou através de uma porção de ligação como um grupo alifático ou heteroátomo. Grupos heteroarila usados neste instrumento podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.
[0080] "Hibridização" significa o anelamento de moléculas de ácido nucleico complementares. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico complementares incluem, mas não estão limitados a um composto antissenso e um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico complementares incluem, mas não se limitam a um oligonucleotídeo antissenso e um alvo de ácido nucleico.
[0081] "Identificação de um animal tendo, ou em risco de ter, uma doença, distúrbio e/ou condição clínica" denota a identificação de um animal que foi diagnosticado com a doença, distúrbio e/ou condição médica ou a identificação de um animal pré-disposto a desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição clínica. Essa identificação pode ser realizada por qualquer método incluindo a avaliação do histórico médico de um indivíduo e testes padrão ou avaliações clínicas.
[0082] "Imediatamente adjacente" significa que não há nenhum elemento interveniente entre os elementos imediatamente adjacentes.
[0083] "Indivíduo" significa um animal humano ou não-humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0084] "Inibir a expressão ou atividade" se refere a uma redução ou bloqueio da expressão ou atividade e não necessariamente indica uma eliminação total da expressão ou atividade.
[0085] "Ligação internucleosídica" refere-se à ligação química entre os nucleosídeos.
[0086] "Grupo de ligação neutro de internucleosídeo" se refere a um grupo de ligação neutro que liga diretamente dois nucleosídeos.
[0087] "Grupo de ligação de fósforo" significa um grupo de ligação de fósforo que liga diretamente dois nucleosídeos.
[0088] Oligonucleotídeos antissenso "alongados" são aqueles que têm um ou mais nucleosídeos relativos a um oligonucleotídeo antissenso divulgado aqui.
[0089] "Motivo da ligação" se refere a um padrão de modificações da ligação em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo. Os nucleosídeos desse oligonucleotídeo podem ser modificados ou não modificados. Salvo indicação em contrário, os motivos descritos neste documento são apenas ligações destinadas a serem motivos de ligação. Assim, nesses casos, os nucleosídeos não são limitados.
[0090] "Deoxinucleosídeo ligado" denota uma base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) substituída por deoxirribose ligada por um éster de fosfato de modo a formar um nucleotídeo.
[0091] "Nucleosídeos ligados" denota nucleosídeos adjacentes ligados entre si por uma ligação internucleosídica.
[0092] "Nucleosídeo de ácido nucleico bloqueado" ou "LNA" ou "ácido nucleico bloqueado ou "nucleosídeos LNA" significa monômeros de ácido nucleico possuindo uma ponte de ligação entre dois átomos de carbono entre o 4' e 2' posição da unidade de açúcar de nucleosídeo, formando assim um açúcar bicíclico. Exemplos deste tipo de açúcar bicíclico incluem, mas não estão limitados a A) a-L-metileno-oxi (4'-CH2- O-2') LNA, (B) D-β-metilenc-δx (4'-CH2-O-2') LNA, (C) etileno (4'- (CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA e (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2'), LNA, tal como descrito abaixo.
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[0093] Tal como aqui utilizado, os compostos de LNA incluem, mas não estão limitados aos compostos possuindo pelo menos uma ponte entre a posição do açúcar 2' e 4' em que cada uma das pontes compreende, independentemente, 1 ou de 2 a 4 grupos ligados independentemente selecionados a partir de -[C(R1)(R2)]n-, - C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- e -N(R1)-; em que: x é 0, 1 ou 2; n é 1, 2, 3 ou 4; cada R1 e R2 são, de forma independente, H um grupo protegendo, hidroxila, C1C12 alquila, substituído C1- C12 alquila, C2- C12 alceno, substituído C2C12 alceno, C2- C12 alceno, substituído C2- C12 alceno, C5- C20 arila,substituído C5- C20 arila, radical um anel, um anel substituído radical, heteroarila, substituído heteroarila, C5- C7 radical alicíclico, substituiu C5- C7 alicíclico radical, halogênio, oJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), acila substituída, CN, sulfonil (S(=O)2-J1) ou sulfoxil (S(=O)- J-1); e cada J1 e J2 são, de forma independente, H, C1- C12 alquila substituída C1- C12 alquila, C2- C12 alceno, substituído C2- C12 alceno, C2- C12 alceno, substituído C2- C12 alceno, C5- C20 arila, C5- C20 arila substituída, acila, acil (C(=O)-H), acila substituída, um radical de heterociclo, um radical de heterociclo substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-C12 aminoalquila substituído ou um grupo de proteção.
[0094] Exemplos de grupos ponte 4'-2' abrangidos pela definição do LNA incluem, mas não estão limitados a uma das fórmulas: - [C(Ri)(R2)]n-, -[C(Ri)(R2)]n-O-, -C(RIR2)-N(RI)-O- cu -C(RiR2)-O-N(Ri)- . Ademais outros grupos de pontes abrangidos pela definição de LNA são 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'- CH2-O-N(R1)-2' e 4'-CH2-N(R1)-O-2'-pontes em que cada R1 e R2 é, independentemente, H ou um grupo de proteção ou C1-C12 alquila.
[0095] Também incluído dentro da definição de LNA de acordo com a invenção são LNAs em que o grupo hidroxila em 2' do anel de açúcar ribosila é conectado ao átomo de carbono 4' do anel de açúcar, assim formando uma ponte metilenóxi (4'-CH2-O-2') para formar uma porção de açúcar bicíclica. A ponte também um grupo metileno (-CH2-) conectando o átomo de oxigênio 2' e o átomo de carbono 4', para que o termo LNA metilenoxi (4'-CH2-O-2') seja usado. Além disso, no caso de a porção açúcar bicíclica tendo um grupo etileno da ponte nesta posição, o termo etilenóxi (4'-CH2CH2-O-2 ') LNA é usado, α -L- metileno-óxi (4'-CH2-O-2'), um isômero de metileno-óxi (4'-CH2-O-2 ') LNA também está englobado no âmbito da definição de LNA, tal como aqui utilizado.
[0096] "Distúrbio metabólico" se refere a uma doença ou condição caracterizada principalmente pela desregulação do metabolismo - o conjunto complexo de reações químicas associadas à degradação de alimentos para produzir energia.
[0097] "Incompatibilidade" ou "nucleobase não complementar" refere-se ao caso quando uma nucleobase de um primeiro ácido nucleico não é capaz de se parear com a nucleobase correspondente de um segundo ácido nucleico alvo.
[0098] "Carboidrato modificado" se refere a qualquer carboidrato que tem uma ou mais modificações químicas relativas a carboidratos de ocorrência natural.
[0099] "Ligação internucleosídica modificada" refere-se a uma substituição ou qualquer alteração de uma ligação internucleosídica de ocorrência natural (isto é, uma ligação internucleosídica fosfodiéster).
[00100] "Nucleobase modificada" significa qualquer nucleobase diferente de adenina, citosina, guanina, timidina ou uracila. Uma "nucleobase não modificada" significa as bases purínicas, adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidínicas, timina (T), citosina (C) e uracila (U).
[00101] "Nucleosídeo modificado" significa um nucleosídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificado e/ou uma nucleobase modificada.
[00102] "Nucleotídeo modificado" significa um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada, ligação internucleosídica modificada ou nucleobase modificada.
[00103] "Oligonucleotídeo modificado" significa um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleosídeos modificados, açúcar modificado e/ou de nucleobases modificadas.
[00104] "Açúcar modificado" denota a substituição e/ou qualquer alteração a partir de uma porção de açúcar natural. "Porção de açúcar modificado" se refere a uma porção de açúcar substituída ou a um substituto do açúcar.
[00105] "Modulação" refere-se à alteração ou ao ajuste de uma característica em uma célula, um tecido, um órgão ou um organismo. Por exemplo, modulação do mRNA de GHR significa aumentar ou diminuir o nível de mRNA de GHR e/ou a proteína de GHR em uma célula, um tecido, um órgão ou um organismo. Um "modulador" efetua a mudança na célula, tecido, órgão ou organismo. Por exemplo, um composto antissenso de GHR pode ser um modulador que diminui a quantidade de mRNA de GHR e/ou proteína de GHR em uma célula, tecido, órgão ou organismo.
[00106] "MOE" significa -OCH2CH2OCH3.
[00107] "Monômero" refere-se a uma unidade única de um oligômero. Os monômeros incluem, mas não estão limitados aos nucleosídeos e nucleotídeos, quer ocorram naturalmente, quer sejam modificados.
[00108] "Sistema de anel mono ou policíclico" deve incluir todos os sistemas de anel selecionados a partir de sistemas de anel de radical simples ou policíclico em que os anéis são fundidos ou ligados e deve incluir também sistemas de anel simples e mistos individualmente selecionados a partir de aril alifático, alicíclico, heteroarila, aralquila, arilalquila, heterocíclico, heteroarila, heteroaromático e heteroarilalquila. Essas estruturas mono e policíclicas podem conter anéis tendo o mesmo nível de saturação ou tendo cada um, de maneira independente, diferentes graus de saturação incluindo totalmente saturados, parcialmente saturados ou totalmente insaturados. Cada anel pode compreender átomos do anel selecionados a partir de C, N, O e S para dar origem a anéis heterocíclicos, bem como anéis que compreendem apenas anel apenas com átomos de C que podem estar presentes em um motivo misto, como por exemplo, benzimidazol em que um anel tem apenas átomos de carbono anel e o anel fundido tem dois átomos de nitrogênio. O sistema de anel mono ou policíclico pode ser ainda substituído por grupos substituintes, como por exemplo, ftalimida que tem dois grupos =O afixados a um dos anéis. Os sistemas de anel mono ou policíclico podem ser afixados a moléculas de origem usando várias estratégias como diretamente através de um átomo do anel, fundido através de vários átomos do anel, através de um grupo substituinte ou através de uma porção de ligação bifuncional.
[00109] "Motivo" significa o padrão de nucleotídeos modificados e não-modificados em um composto antissenso.
[00110] "Porção de açúcar natural" significa um açúcar encontrado no DNA (2'-H) ou RNA (2'-OH). "Porção de açúcar de ocorrência natural" se refere a um ribofuranosil como é encontrado no RNA de ocorrência natural ou a um desoxirribofuranosil como é encontrado no DNA de ocorrência natural.
[00111] "Ligação internucleosídica de ocorrência natural" significa uma ligação fosfodiéster 3' a 5'.
[00112] "Grupo de ligação neutro" se refere a um grupo de ligação não é carregado. Grupos de ligação neutros incluem, sem limitação, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (CH2-N (CH3)-O-), amida-3 (-CH2- C (=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N (H)-C (=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) e tioformacetal (-S-CH2-O-). Outros grupos de ligação neutros incluem ligações não iônicas compreendendo siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamida, sulfeto, sulfonato de éster e amidas (ver, por exemplo: Carbohydrate Modifications in Antissenso Research; Y.S. Sanghvi e P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 e 4, (pp. 40-65)). Outros grupos de ligação neutros incluem ligações não- iônicas, compreendendo partes do componente misturadas N, O, S e CH2.
[00113] "Nucleobase não complementar" refere-se a um par de nucleobases que não formam ligações de hidrogênio umas com as outras ou de outro modo suportam a hibridação.
[00114] "Grupo de ligação neutro de não-internucleosídeo" se refere a um grupo de ligação neutro que não se liga diretamente a dois nucleosídeos. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação neutro de não-internucleosídeo liga um nucleosídeo a um grupo diferente de um nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação neutro de não-internucleosídeo liga dois grupos, sendo que nenhum deles é um nucleosídeo.
[00115] "Grupo de ligação fósforo não-internucleosídeo" se refere a um grupo de ligação fósforo que não se liga diretamente a dois nucleosídeos. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação fósforo não-internucleosídeo liga um nucleosídeo a um grupo diferente de um nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação fósforo não internucleosídeo liga dois grupos, sendo que nenhum deles é um nucleosídeo.
[00116] "Ácido nucleico" refere-se a moléculas compostas por nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui, mas não está limitado a ácidos ribonucleicos (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de fita simples e ácidos nucleicos de fita dupla.
[00117] "Nucleobase" significa uma porção heterocíclica capaz de se parear com uma base de outro ácido nucleico.
[00118] "Complementaridade da nucleobase" ou "complementaridade" quando em referência às nucleobases se refere a uma nucleobase capaz de se emparelhar com outra nucleobase. Por exemplo, no DNA, a adenina (A) é complementar à timina (T). Por exemplo, no RNA, a adenina (A) é complementar à uracil (U). Em certas modalidades, nucleobase complementar se refere a uma nucleobase de um composto antissenso que é capaz de se emparelhar com uma nucleobase do seu ácido nucleico alvo. Por exemplo, se uma nucleobase em uma determinada posição de um composto antissenso for capaz de fazer ligação de hidrogênio com uma nucleobase em uma determinada posição de um ácido nucleico alvo então a posição da ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo são considerados complementares nesse par de nucleobase. As nucleobases que compreendem determinadas modificações podem manter a capacidade de se emparelhar com uma nucleobase equivalente e, assim, são ainda capazes da complementaridade de base.
[00119] "Motivo de modificação da nucleobase" se refere a um padrão de modificações de nucleobases ao longo de um oligonucleotídeo. Salvo indicação em contrário, um motivo de modificação da nucleobase é independente da sequência de nucleobase.
[00120] "Sequência de nucleobases" significa a ordem de nucleobases contíguas independente de qualquer açúcar, ligação e/ou modificação de nucleobase.
[00121] "Nucleosídeo" se refere a um composto que compreende uma porção de nucleobase e uma porção de açúcar. Os nucleosídeos incluem, mas não estão limitados a nucleosídeos de ocorrência natural (como encontrado no DNA e RNA) e nucleosídeos modificados. Os nucleosídeos podem estar ligados a uma porção de fosfato.
[00122] "Nucleosídeo mimético" inclui aquelas estruturas usadas para substituir o açúcar ou o açúcar e a base, e não necessariamente a ligação em uma ou mais posições de um composto oligomérico, tais como, por exemplo, miméticos de nucleosídeo que têm morfolino, ciclo- hexenila, ciclo-hexila, tetra-hidropiranila, biciclo ou triciclo miméticos de açúcar, por exemplo, unidades de açúcar de não furanose. Mimético de nucleotídeo inclui aquelas estruturas usadas para substituir o nucleosídeo e a ligação em uma ou mais posições de um composto oligomérico, tal como, por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeos ou morfolinos (morfolinos ligados por -N(H)-C(=O)-O- ou outra ligação não fosfodiéster). Substituto do açúcar se sobrepõe com o mimético nucleosídeo ligeiramente mais largo, mas destina-se a indicar a substituição da unidade de açúcar (anel furanose) somente. Os anéis de tetra-hidropiranil aqui proporcionados são ilustrativos de um exemplo de um substituto de açúcar, em que o grupo açúcar furanose foi substituído com um sistema em anel tetra-hidropiranil. "Mimético" refere-se a grupos que são substituídos por um açúcar, uma nucleobase e/ou ligação internucleosídeo. Geralmente, um mimético é usado em lugar do conjunto de ligação de açúcar ou açúcar-internucleosídeos, e a nucleobase é mantida por hibridização para um alvo selecionado.
[00123] "Motivo do nucleosídeo" se refere a um padrão de modificações do nucleosídeo em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo. As ligações desse oligonucleotídeo podem ser modificadas ou não modificadas. Salvo indicação em contrário, os motivos descritos neste documento apenas nucleosídeos destinados a serem motivos de nucleosídeos. Assim, nesses casos, as ligações não são limitadas.
[00124] "Nucleotídeo" significa uma nucleosídeo tendo um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo.
[00125] "Efeito fora do alvo" refere-se a um efeito biológico indesejável ou prejudicial associada com modulação de RNA ou proteína de expressão de um gene diferente do ácido nucleico alvo pretendido.
[00126] "Composto oligoméricos" se refere a uma estrutura polimérica que compreende duas ou mais subestruturas. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico compreende um oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico compreende um ou mais grupos conjugados e/ou grupos terminais. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico consiste em um oligonucleotídeo. Compostos oligoméricos incluem também ácidos nucleicos de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico compreende uma estrutura principal de uma ou mais subunidades monoméricas ligadas em que cada subunidade monomérica está direta ou indiretamente afixada a uma porção de base heterocíclica. Em determinadas modalidades, os compostos oligoméricos também podem incluir subunidades monoméricas que não estão ligadas a uma porção de base heterocíclica fornecendo, assim, sítios abásicos. Em determinadas modalidades, as ligações juntam subunidades monoméricas, frações ou substitutos de açúcar e as frações de base heterocíclica podem ser independentemente modificadas. Em determinadas modalidades, a unidade de açúcar de ligação, que pode ou não incluir uma base heterocíclica, pode ser substituída por um mimético como monômeros em ácidos nucleicos de peptídeo.
[00127] "Oligonucleosídeo" denota um oligonucleotídeo em que as ligações internucleosídicas não contêm um átomo de fósforo.
[00128] "Oligonucleotídeo" significa um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais pode ser modificado ou não modificado, independente um do outro.
[00129] "Administração parentérica" significa administração através de injeção ou infusão. A administração parentérica inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitoneal ou administração intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular.
[00130] "Peptídeo" significa uma molécula formada pela ligação de pelo menos dois aminoácidos por ligações amida. Sem limitação, tal como aqui utilizado, refere-se ao peptídeo de polipeptídeos e proteínas.
[00131] "Agente farmacêutico" significa uma substância que proporciona um benefício terapêutico quando administrada a um indivíduo. Por exemplo em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso conjugado direcionado a GHR é um agente farmacêutico ativo.
[00132] "Composição farmacêutica" significa uma mistura de substâncias adequadas para a administração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais agentes farmacêuticos ativos e uma solução aquosa estéril.
[00133] "Sais farmaceuticamente aceitáveis" significam sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos antissenso, isto é, sais que mantêm a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo de origem e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis aos mesmos.
[00134] "Grupo de ligação de fósforo "significa um grupo de ligação que compreende um átomo de fósforo. Grupos de ligação de fósforo incluem, sem limitação, grupos que têm a fórmula:
Figure img0002
[00135] em que:
[00136] Ra e Rd são cada um, independentemente, O, S, CH2, NH, ou NJ1 em que J1 é C1- C6 alquila ou C1-C6 ou alquila substituída;
[00137] Rb é O ou S;
[00138] Rc é OH, SH, C1- C6 alquila substituída por C1- C6 alquila ,alcóxi C1-C6, alcóxi substituído, amino ou C1-C6 amino substituído, e
[00139] J1 é Rb é O ou S.
[00140] Grupos de ligação de fósforo incluem, sem limitação, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres,tionoalquilfosfotriéster e boranofosfato.
[00141] "Ligação de fosforotioato" significa uma ligação entre nucleosídeos em que a ligação fosfodiéster é modificada pela substituição de um dos átomos de oxigênio que não fazem ponte por um átomo de enxofre. Uma ligação de fosforotioato é uma ligação internucleosídica modificada.
[00142] ""Porção" significa um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) de um ácido nucleico. Em determinadas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um composto antissenso.
[00143] "Prevenir" refere-se ao retardamento ou antecipação do início, do desenvolvimento ou avanço de uma doença, de um distúrbio ou de uma condição clínica por um período de tempo que vai de minutos até um período indefinido. Prevenir também significa reduzir o risco de desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição.
[00144] "Profármaco" se refere a uma forma menos ativa ou inativa de um composto que, quando administrado a um assunto, é metabolizada para formar o composto ativo ou mais ativo (por exemplo, drogas).
[00145] "Quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente farmacêutico que proporciona um benefício profiláctico ou preventivo de um animal.
[00146] "Grupo de proteção" se refere a qualquer composto ou grupo de proteção conhecido pelos versados na técnica. Exemplos não limitantes de grupos protetores podem ser encontrados em "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, New York, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00147] "Região" é definida como uma porção do ácido nucleico alvo que tem pelo menos uma estrutura, função ou característica identificável.
[00148] "Ribonucleotídeo" significa um nucleotídeo tendo um hidróxi na posição 2' da porção de açúcar do nucleotídeo. Os ribonucleotídeos podem ser modificados por qualquer um de uma variedade de substituintes.
[00149] "Composto antissenso à base de RISC" se refere a um composto antissenso em que pelo menos alguma atividade antissenso do composto antissenso é atribuída ao Complexo de Silenciamento Induzido do RNA (RISC).
[00150] "Composto antissenso à base de RNase H" se refere a um composto antissenso em que pelo menos alguma atividade antissenso do composto antissenso é atribuível à hibridização do composto antissenso para um ácido nucléico alvo e clivagem subsequente do ácido nucleico alvo pela RNase H.
[00151] "Sais" significam sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos antissenso, isto é, sais que mantêm a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo de origem e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis aos mesmos.
[00152] "Segmentos" são definidos como subporções ou menores de regiões dentro de um ácido nucleico.
[00153] "Regiões separadas" se referem às partes de um oligonucleotídeo em que as modificações químicas ou o motivo das modificações químicas de quaisquer partes vizinhas incluem pelo menos uma diferença para permitir que regiões separadas se distinguam uma da outra.
[00154] "Motivo de sequência" se refere a um padrão de nucleobases dispostos ao longo de um oligonucleotídeo ou parte do mesmo. Salvo indicação em contrário, um motivo de sequência é independente de modificações químicas e, portanto, pode ter qualquer combinação de modificações químicas, inclusive não ter modificações químicas.
[00155] "Efeitos colaterais" denota uma doença fisiológica e/ou condições clínicas passíveis de atribuição a um tratamento diferente dos efeitos desejados. Em determinadas modalidades, os efeitos colaterais incluem reações no local de injeção, anormalidades do teste de função hepática, anormalidades da função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central, miopatias e mal-estar. Por exemplo, níveis aumentados de aminotransferase no soro podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, a bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.
[00156] "De fita única" se refere a um composto oligomérico que não é hibridizado ao seu complemento e que não possui autocomplementaridade suficiente para formar um dúplex autoestável.
[00157] "Sítios", tal como aqui utilizados, são definidos como as posições das bases nucleotídicas únicas dentro de um ácido nucleico alvo.
[00158] "Retarda a progressão" denota a diminuição no desenvolvimento da referida doença.
[00159] "Especificamente hibridizável" refere-se a um composto antissenso possuindo um grau suficiente de complementaridade entre um oligonucleotídeo antissenso e um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado, enquanto exibem um mínimo ou nenhum efeito sobre os ácidos nucleicos não alvo, sob condições em que é desejada a ligação específica, isto é, sob condições fisiológicas, no caso de in vivo ensaios e tratamentos terapêuticos. "Condições rigorosas de hibridização" ou "condições rigorosas" refere-se a condições sob as quais um composto oligomérico hibridará com a sua sequência-alvo, mas para um número mínimo de outras sequências.
[00160] "Indivíduo" significa um animal humano ou não-humano selecionado para tratamento ou terapia.
[00161] "Substituinte" e "grupo substituinte" se refere a um átomo ou grupo que substitui o átomo ou grupo de um composto nomeado de origem. Por exemplo, um substituinte de um nucleosídeo modificado é qualquer átomo ou grupo que difere do átomo ou do grupo encontrado em um nucleosídeo de ocorrência natural (por exemplo, um substituinte 2' modificado é qualquer átomo ou grupo na posição 2' de um nucleosídeo diferente de H ou OH). Os grupos substituintes podem ser protegidos ou desprotegidos. Em determinadas modalidades, os compostos de presente descrição têm substituintes em uma ou em mais de uma posição do composto de origem. Os substituintes também podem ser substituídos ainda por outros grupos substituintes e podem ser afixados diretamente ou através de um grupo de ligação como um grupo alquila ou hidrocarbila a um composto de origem.
[00162] Da mesma forma, como usado neste documento, "substituinte" em relação a um grupo funcional químico, se refere a um átomo ou grupo de átomos que difere do átomo ou do grupo de átomos normalmente presente no grupo funcional mencionado. Em determinadas modalidades, um substituinte substitui um átomo de hidrogênio do grupo funcional (por exemplo em determinadas incorporações, o substituinte de um grupo metil substituído é um átomo ou grupo diferente do hidrogênio que substitui um dos átomos de hidrogênio de um grupo metila não substituído). A menos que indicado de outra forma, grupos favoráveis para uso como substituintes incluem, sem limitação, halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, acil (- C(O)Raa), carboxil (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcóxi, óxi (-O-Raa) substituído, arila, aralquila, radical heterocíclico, heteroarila, heteroarilalquila, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (-C(O)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (- CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (- N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinil (- N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinil (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) ou - N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinil (-S(O)Rbb), sulfonil (-S(O)2Rbb) e sulfonamidil (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)S(O)2Rbb). Em que Raa, Rbb e Rcc é, independentemente, H, um grupo funcional químico opcionalmente ligado ou um outro grupo substituinte com uma lista preferencial incluindo entre outros, alquila, alquenila, alquinila, alifático, alcóxi, acila, arila, aralquila, heteroarila, alicíclico, heterocíclico e heteroarilalquila. Os substituintes selecionados nos compostos descritos neste documento estão presentes em grau recursivo.
[00163] "Porção de açúcar substituída" significa um furanosil que não é uma porção de açúcar de ocorrência natural. As frações de açúcar substituídas incluem, mas não estão limitadas a furanosis que compreendem substituintes na posição 2', posição 3', posição 5' e/ou posição 4'. Determinadas frações de açúcar substituídas são frações de açúcar bicíclico.
[00164] "Porção de açúcar" significa uma porção de açúcar de ocorrência natural ou uma porção de açúcar modificada de um nucleosídeo.
[00165] "Motivo do açúcar" se refere a um padrão de modificações do açúcar em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo.
[00166] "Substituto de açúcar" significa uma estrutura que não compreende uma furanosila e que é capaz de substituir a porção de açúcar de ocorrência natural de um nucleosídeo, tal que as subunidades do nucleosídeo resultantes sejam capazes de se ligar e/ou de se ligar a outros nucleosídeos para formar um composto oligomérico que seja capaz de se hibridizar em um composto oligomérico complementar. Essas estruturas incluem anéis compreendendo um número diferente de átomos que furanosil (por exemplo, anéis com 4, 6 ou 7 membros); substituição do oxigênio de um furanosil por um átomo de não-oxigênio (por exemplo, carbono, enxofre ou nitrogênio); ou uma mudança no número de átomos e uma substituição do oxigênio. Tais estruturas podem também compreender substituições correspondentes aos descritos para frações de açúcar substituídas (por exemplo, 6 membros substitutos de açúcar carbocíclicos bicíclicos compreendendo, opcionalmente, substituintes adicionais). Substitutos do açúcar também incluem substituições de açúcar mais complexo (por exemplo, sistemas de não anel do ácido nucleico do peptídeo). Os substitutos do açúcar incluem, sem limitação, morfolino, ciclo-hexenila e ciclo-hexitol.
[00167] "Alvo" refere-se a uma proteína, a modulação da qual é desejada.
[00168] "Gene-alvo" refere-se a um gene que codifica um alvo.
[00169] "Direcionamento" ou "direcionado" significa o processo de projeto e seleção de um composto antissenso que se hibridizará em um ácido nucleico alvo e induzir um efeito desejado.
[00170] "Ácido nucleico alvo", "RNA alvo", "transcrito de RNA alvo" e " ácido nucleico alvo" denota, um ácido nucleico capaz de ser alvejado pelos compostos antissensos. "Ácido nucleico alvo" se refere a uma molécula de ácido nucleico à qual um composto antissenso destina-se a hibridizar para resultar em uma atividade antissenso desejada. Oligonucleotídeos antissenso têm complementaridade suficiente para seus ácidos nucleicos alvo para permitir a hibridação em condições fisiológicas.
[00171] "Região-alvo" significa uma parte de um ácido nucleico alvo à qual um ou mais compostos antissenso se destinam.
[00172] "Segmento-alvo" significa a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo ao qual um composto antissenso é direcionado. "Local-alvo '5" refere-se ao nucleotídeo mais próximo de 5' de um segmento alvo. "Local-alvo 3'" refere-se ao nucleotídeo mais próximo de 3' de um segmento-alvo.
[00173] "Grupo terminal" se refere a um ou mais átomo incorporado à extremidade 3' ou à extremidade 5' ou a ambas extremidades de um oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, um grupo terminal é um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, um grupo terminal compreende um ou mais nucleosídeos do grupo terminal.
[00174] "Ligação internucleosídica terminal" significa a ligação entre os últimos dois nucleosídeos de um oligonucleotídeo ou da respectiva região definida.
[00175] "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um agente farmacêutico que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.
[00176] "O mesmo tipo de modificações" se refere às modificações que são iguais entre elas, incluindo a ausência de modificações. Assim, por exemplo, dois nucleosídeos de DNA não modificados têm "o mesmo tipo de modificação" embora o nucleosídeo de DNA não seja modificado. Esses nucleosídeos que têm o mesmo tipo de modificação podem incluir nucleobases diferentes.
[00177] "Tratar" refere-se à administração de uma composição farmacêutica a um animal para efetuar no animal uma alteração ou melhora de uma doença, distúrbio ou condição clínica. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas podem ser administradas ao animal.
[00178] "Tipo de modificação" em relação a um nucleosídeo ou um nucleosídeo de um "tipo" se refere à modificação química de um nucleosídeo e inclui nucleosídeos modificados e não modificados. Portanto, salvo indicação em contrário, um "nucleosídeo com uma modificação do primeiro tipo" pode ser um nucleosídeo não modificado.
[00179] Nucleobases "não modificadas" ou "nucleobases de ocorrência natural" significam as nucleobases heterocíclicas que ocorrem naturalmente de RNA ou DNA: as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) (incluindo 5-metil C) e uracil (U).
[00180] "Nucleotídeo não-modificado" denota um nucleotídeo composto de nucleobases de ocorrência natural, frações de açúcar e ligações de internucleosídeos. Em certas modalidades, um nucleotídeo não modificado é um nucleotídeo de RNA (isto é, p-ribonucleosídeos-D) ou um nucleotídeo de DNA (ou seja, p-D-desoximbonucleotídeo).
[00181] "A montante" refere-se à direção em relação para com a extremidade 5 'ou extremidade N-terminal de um ácido nucleico.
[00182] "Segmento de asa" significa uma pluralidade de nucleosídeos modificados para transmitir para um oligonucleotídeo propriedades tal como atividade inibitória aumentada, afinidade de ligação aumentada para um ácido nucleico alvo ou resistência à degradação por nucleases in vivo.
Modalidades Determinadas
[00183] Determinadas modalidades fornecem métodos, compostos e composições para inibir a expressão do receptor do hormônio do crescimento (GHR).
[00184] Determinadas modalidades fornecem compostos antissenso direcionados a um ácido nucleico de GHR. Em certas modalidades, o ácido nucleico de GHR tem a sequência apresentada no N° de Acesso GenBank NM_000163.4 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 1), N° de Acesso GENBANK NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000 (aqui incorporados como SEQ ID NO: 2) N° de Acesso GENBANK X06562.1 (incorporado aqui como a SEQ ID NO: 3), No de Acesso GENBANK: DR006395.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 4) ou N° de Acesso GENBANK DB052048.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 5), N° de Acesso GENBANK AF230800.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 6), o complemento de número de acesso GenBank No. AA398260.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 7), No de Acesso GENBANK BC136496.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 8), N° de Acesso GENBANK NM_001242399.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 9), N° de Acesso GENBANK NM_001242400.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 10). N° de Acesso GENBANK NM_001242401.3 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 11), N° de Acesso GENBANK NM_001242402.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 12), N° de Acesso GENBANK NM_001242403.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 13), N° de Acesso GENBANK NM_001242404.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 14), N° de Acesso GENBANK NM_001242405.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 15), N° de Acesso GENBANK NM_001242406.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 16), N° de Acesso GENBANK NM_001242460.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 17), N° de Acesso GENBANK NM_001242461.1 (incorporado aqui como a SEQ ID NO: 18) ou N° de Acesso GenBank NM_001242462.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 19).
[00185] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobase da SEQ ID NO: 20-2295.
[00186] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 9 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobase da SEQ ID NO: 20-2295.
[00187] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 10 nucleobases contíguas das sequências de nucleobase de qualquer das SEQ ID NOs: 20-2295.
[00188] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 11 nucleobases contíguas das sequências de nucleobase de qualquer das SEQ ID NOs: 20-2295.
[00189] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas das sequências de nucleobase de qualquer das SEQ ID NOs: 20-2295.
[00190] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma da SEQ ID NOs: 20-2295.
[00191] Determinadas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste da sequência de nucleobase de qualquer uma da SEQ ID NOs: 20-2295.
[00192] Certas modalidades proporcionam um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados complementares dentro de nucleotídeos 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 1340013415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279,15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 1794317958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829,20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 2280322818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565,30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 3318733202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684,36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250- 40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 4394743962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 5019550210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 ou 54645-54660 de SEQ ID NO: 1 em que o referido oligonucleotídeo modificado é pelo menos 90% complementar à SEQ ID NO: 1.
[00193] Certas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo de conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo uma porção de pelo menos 8 nucleobases contíguas 100% complementares a uma porção de comprimento igual de nucleobases 30-51, 63-82, 103118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 13601383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 16831698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 23062321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 29632978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 39753990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 83958410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 1340013415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279,15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 1794317958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829,20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 2280322818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565,30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 3318733202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 4025040265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 4394743962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 5019550210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 ou 54645-54660 da SEQ ID NO: 1 em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar à SEQ ID NO: 1.
[00194] Certas modalidades proporcionam um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados complementares dentro de nucleotídeos 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 1246912920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555,14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 1713017149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773,19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 2182021837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522,29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 3146831483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157,34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 3602336042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295,37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 4070640937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760,43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 5007250210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143,52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751- 64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183,66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727- 68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584- 72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410- 77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524- 81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901- 86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273- 91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292- 95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258- 99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 102549-102568, 105255-105274, 108514-108788, 110701-110974, 112842-112861, 114446-114465, 120376-120497, 122180-122199, 123671-124055, 126357-126434, 128467-128482, 131036-131056, 101080-101103, 103566-103625, 106147-106364, 109336-109505, 111203-111322, 113028-113056, 115087-115106, 120738-120845, 122588-122770, 124413-124608, 126736-126751, 128813-129111, 131286-131305, 101242-101320, 104067-104086, 106632-106647, 109849-109864, 112030-112049, 113646-113665, 119269-119284, 121209-121228, 123031-123050, 125178-125197, 126998-127236, 129976-130013, 131676-131691, 101788-101906 104277-104858 106964-107735 110403-110442 112499-112514 113896-113911 119659-119703 121823-122013 123152-123167 125533-125616 127454-127682 130308-130323 132171-132517 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223, 157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 ou 300835-301295 de SEQ ID NO: 2 em que o referido oligonucleotídeo modificado é pelo menos 90% complementar à SEQ ID NO: 2.
[00195] Certas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo de conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo uma porção de pelo menos 8 nucleobases contíguas 100% complementares a uma porção de comprimento igual de nucleobases 2571-2586, 28673059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 61286265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 99319946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 1246912920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 1713017149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 2182021837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 3146831483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 3602336042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 4070640937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 5007250210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 6375164662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 6872768742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 7258472670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 7641077095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524- 81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 8690186920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 9127391292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 9529295583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258- 99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 102549-102568, 105255-105274, 108514-108788, 110701-110974, 112842-112861, 114446-114465, 120376-120497, 122180-122199, 123671-124055, 126357-126434, 128467-128482, 131036-131056, 133168-133241, 134441-134617, 136111-136130, 137750-137765, 140593-140701, 143021-143048, 144990-145078, 147028-147043, 101080-101103, 103566-103625, 106147-106364, 109336-109505, 111203-111322, 113028-113056, 115087-115106, 120738-120845, 122588-122770, 124413-124608, 126736-126751, 128813-129111, 131286-131305, 133522-133877, 135015-135030, 136282-136595, 138048-138067, 141116-141131, 143185-143486, 145428-145525, 147259-147284, 101242-101320, 104067-104086, 106632-106647, 109849-109864, 112030-112049, 113646-113665, 119269-119284, 121209-121228, 123031-123050, 125178-125197, 126998-127236, 129976-130013, 131676-131691, 134086-134101, 135431-135519, 136996-137152, 138782-139840, 141591-141719, 143836-144109, 145937-145952, 147671-147686, 101788-101906 104277-104858 106964-107735 110403-110442 112499-112514 113896-113911 119659-119703 121823-122013 123152-123167 125533-125616 127454-127682 130308-130323 132171-132517 134240-134259 135818-135874 137372-137387 140343-140358 142113-142342 144558-144650 146235-146386 148059-148154 148564-148579, 150236-150251, 152549-152771, 154171-154186, 155591-155616, 157198-157223, 158542-158631, 160812-160827, 162064-162083, 164839-165059, 166837-166852, 169062-169092, 170407-170426, 171431-171568, 173045-173756, 181514-187644, 196536-196873, 198715-199007, 201258-201861, 204181-204740, 209999-210014, 211836-212223, 213825-213933, 215446-215508, 218526-218541, 221044-221059, 222914-222998, 224717-224769, 227025-227040, 229174-229189, 149491-149506, 151373-151659, 153349-153364, 154724-154828, 156233-156612, 157552-157567, 159539-159793, 161461-161607, 162531-162770, 165856-165875, 168004-168019, 169601-169711, 171021-171036, 172447-172462, 175014-177830, 190109-194159, 198145-198170, 199816-199838, 202382-202717, 206412-206764, 210502-210583, 213025-213044, 214622-214647, 216192-217595, 219342-219633, 221947-221962, 223948-224122, 225436-225761, 227485-227500, 229615-229640, 149787-149877, 152201-152388, 153831-154112, 155283-155304, 156847-156907, 157927-158029, 160352-160429, 161821-161969, 163019-163557, 166241-166450, 168760-168823, 170081-170291, 171207-171226, 172733-172956, 178895-180539, 194425-195723, 198307-198381, 200249-200635, 203098-203934, 207510-207532, 210920-211418, 213425-213440, 214884-214951, 218132-218248, 219886-220705, 222569-222584, 224409-224430, 226785-226898, 227914-228837, 230042-230057, 230313-230595, 232823-232848, 234447-234466, 236071-236213, 244873-244897, 246936-247031, 248223-248363, 250693-250708, 252665-252680, 254036-254083, 255397-255422, 257317-257332, 262021-262036, 267375-268051, 272631-274145, 277391-278380, 282229-283668, 295475-297012, 231218-231345, 232884-232899, 234876-234918, 236684-237196, 245319-245334, 247203-247240, 248694-248762, 251214-251233, 252838-252863, 254246-254345, 255618-255633, 257818-259305, 262453-262779, 268366-269447, 274205-275747, 278932-279063, 290035-290474, 297587-298115, 231817-232037, 233210-233225, 235258-235328, 237585-237698, 245701-245780, 247431-247450, 249494-249509, 251601-251637, 253140-253166, 254641-254660, 255992-256704, 259500-259515, 263338-266518, 270038-271850, 275808-276636, 279303-281001, 290924-292550, 298161-298418, 232088-232408 233623-233646 235770-235785 237949-237557 246152-246523 247644-247659 250001-250020 251950-252060 253594-253819 254905-254920 257018-257092 261294-261656 266861-267131 271950-271969 276932-277064 281587-281610 292860-294408 298489-298738 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504, ou 300835-301295 da SEQ ID NO: 2 em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar à SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados complementares aos nucleosídeos 155594-155613, 72107-72126, 153921-153940, 159252-159267, 213425-213440, 153004-153019, 155597-155612, 248233-248248 da SEQ ID NO: 2.
[00196] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma da SEQ ID NOs: 20-2295.
[00197] Determinadas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste da sequência de nucleobase de qualquer uma da SEQ ID NOs: 20-2295.
[00198] Em certas modalidades, um composto que compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado a um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento e é complementar no interior das regiões de nucleotídeos seguintes da SEQ ID NO: 1: 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 1054910564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010- 46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 5175651771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-535471 ou 54645-54660.
[00199] Em certas modalidades, um composto que compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado a um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento e tem como alvo as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1: 30-51, 63-82, 103118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 13601383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 16831698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 23062321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 29632978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 39753990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 83958410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 1340013415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 1794317958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 2280322818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 3318733202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 4025040265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 4394743962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195- 50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-535471 ou 54645-54660.
[00200] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para uma região de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinadas modalidades, tais compostos ou oligonucleotídeos direcionados a uma região de um ácido nucleico de GHR têm uma porção de nucleobase contígua que é complementar a uma porção de nucleobase de comprimento igual da região. Por exemplo, a porção pode ser pelo menos uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16nucleobases contíguas complementares a uma porção de comprimento igual de uma região enunciada aqui. Em determinadas modalidades, tais compostos ou oligonucleotídeo direcionam as seguintes regiões de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1: 30-51, 63-82, 103118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 13601383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 16831698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 23062321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 29632978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 39753990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 83958410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 1340013415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 1794317958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 2280322818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187- 33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 4025040265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 4394743962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 5019550210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-535471 ou 54645-54660.
[00201] Em certas modalidades, um composto que compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado a um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento e é complementar no interior das regiões de nucleotídeos seguintes da SEQ ID NO: 2: 25712586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 53925817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 95549569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 1179312229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 1644716545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 2121521606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 3091531191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 3566935684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 3971640538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 4842348438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886- 54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 6766267929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 7210772241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 7597976066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 8120781222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 8655486655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 9107391088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839- 94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810- 99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 101788-101906, 104277-104858, 106964-107735, 110403-110442, 112499-112514, 113896-113911, 119659-119703, 121823-122013, 123152-123167, 125533-125616, 127454-127682, 130308-130323, 100742-100828, 102549-102568, 105255-105274, 108514-108788, 110701-110974, 112842-112861, 114446-114465, 120376-120497, 122180-122199, 123671-124055, 126357-126434, 128467-128482, 131036-131056, 101080-101103, 103566-103625, 106147-106364, 109336-109505, 111203-111322, 113028-113056, 115087-115106, 120738-120845, 122588-122770, 124413-124608, 126736-126751, 128813-129111, 131286-131305, 101242-101320 104067-104086 106632-106647 109849-109864 112030-112049 113646-113665 119269-119284 121209-121228 123031-123050 125178-125197 126998-127236 129976-130013 131676-131691 132171-132517, 134240-134259, 135818-135874, 137372-137387, 140343-140358, 142113-142342, 144558-144650, 146235-146386, 148059-148154, 149787-149877, 152201-152388, 153831-154112, 155283-155304, 156847-156907, 157927-158029, 160352-160429, 161821-161969, 163019-163557, 166241-166450, 168760-168823, 170081-170291, 171207-171226, 172733-172956, 178895-180539, 194425-195723, 198307-198381, 200249-200635, 203098-203934, 207510-207532, 210920-211418, 133168-133241, 134441-134617, 136111-136130, 137750-137765, 140593-140701, 143021-143048, 144990-145078, 147028-147043, 148564-148579, 150236-150251, 152549-152771, 154171-154186, 155591-155616, 157198-157223, 158542-158631, 160812-160827, 162064-162083, 164839-165059, 166837-166852, 169062-169092, 170407-170426, 171431-171568, 173045-173756, 181514-187644, 196536-196873, 198715-199007, 201258-201861, 204181-204740, 209999-210014, 211836-212223, 133522-133877, 135015-135030, 136282-136595, 138048-138067, 141116-141131, 143185-143486, 145428-145525, 147259-147284, 148904-149084, 150588-151139, 153001-153026, 154502-154521, 155889-155992, 157330-157349, 159216-159267, 161248-161267, 162132-162147, 165419-165575, 167107-167122, 169134-169153, 170703-170814, 171926-171945, 174122-174885, 187857-189904, 197326-197961, 199506-199563, 202079-202094, 205549-205915, 210189-210296, 212606-212816, 134086-134101, 135431-135519, 136996-137152, 138782-139840, 141591-141719, 143836-144109, 145937-145952, 147671-147686, 149491-149506, 151373-151659, 153349-153364, 154724-154828, 156233-156612, 157552-157567, 159539-159793, 161461-161607, 162531-162770, 165856-165875, 168004-168019, 169601-169711, 171021-171036, 172447-172462, 175014-177830, 190109-194159, 198145-198170, 199816-199838, 202382-202717, 206412-206764, 210502-210583, 213025-213044, 213425-213440, 214884-214951, 218132-218248, 219886-220705, 222569-222584, 224409-224430, 226785-226898, 227914-228837, 230042-230057, 232088-232408, 233623-233646, 235770-235785, 237949-237557, 246152-246523, 247644-247659, 250001-250020, 251950-252060, 253594-253819, 254905-254920, 257018-257092, 261294-261656, 266861-267131, 271950-271969, 276932-277064, 281587-281610, 292860-294408, 298489-298738, 213825-213933, 215446-215508, 218526-218541, 221044-221059, 222914-222998, 224717-224769, 227025-227040, 229174-229189, 230313-230595, 232823-232848, 234447-234466, 236071-236213, 244873-244897, 246936-247031, 248223-248363, 250693-250708, 252665-252680, 254036-254083, 255397-255422, 257317-257332, 262021-262036, 267375-268051, 272631-274145, 277391-278380, 282229-283668, 295475-297012, 299082-299187, 214622-214647, 216192-217595, 219342-219633, 221947-221962, 223948-224122, 225436-225761, 227485-227500, 229615-229640, 231817-232037, 233210-233225, 235258-235328, 237585-237698, 245701-245780, 247431-247450, 249494-249509, 251601-251637, 253140-253166, 254641-254660, 255992-256704, 259500-259515, 263338-266518, 270038-271850, 275808-276636, 279303-281001, 290924-292550, 298161-298418, 299723-299749, 299788-300504 ou 300835-301295.
[00202] Em certas modalidades, um composto que compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado a um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento e tem como alvo as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2: : 2571-2586, 28673059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 61286265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 99319946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 1246912920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 1713017149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 2182021837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 3146831483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 3602336042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 4070640937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 5007250210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 6375164662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 6872768742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 7258472670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 7641077095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 8152481543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901- 86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 9127391292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 9529295583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258- 99273, 99478-99503, 99791-99858 , 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 154171-154186, 155591-155616, 157198-157223, 158542-158631, 160812-160827, 162064-162083, 164839-165059, 166837-166852, 169062-169092, 170407-170426, 171431-171568, 173045-173756, 181514-187644, 196536-196873, 198715-199007, 201258-201861, 204181-204740, 209999-210014, 211836-212223, 213825-213933, 215446-215508, 218526-218541, 221044-221059, 222914-222998, 224717-224769, 227025-227040, 229174-229189, 230313-230595, 232823-232848, 153349-153364, 154724-154828, 156233-156612, 157552-157567, 159539-159793, 161461-161607, 162531-162770, 165856-165875, 168004-168019, 169601-169711, 171021-171036, 172447-172462, 175014-177830, 190109-194159, 198145-198170, 199816-199838, 202382-202717, 206412-206764, 210502-210583, 213025-213044, 214622-214647, 216192-217595, 219342-219633, 221947-221962, 223948-224122, 225436-225761, 227485-227500, 229615-229640, 231817-232037, 233210-233225, 153831-154112, 155283-155304, 156847-156907, 157927-158029, 160352-160429, 161821-161969, 163019-163557, 166241-166450, 168760-168823, 170081-170291, 171207-171226, 172733-172956, 178895-180539, 194425-195723, 198307-198381, 200249-200635, 203098-203934, 207510-207532, 210920-211418, 213425-213440, 214884-214951, 218132-218248, 219886-220705, 222569-222584, 224409-224430, 226785-226898, 227914-228837, 230042-230057, 232088-232408, 233623-233646, 234447-234466, 236071-236213, 244873-244897, 246936-247031, 248223-248363, 250693-250708, 252665-252680, 254036-254083, 255397-255422, 257317-257332, 262021-262036, 267375-268051, 272631-274145, 277391-278380, 282229-283668, 295475-297012, 234876-234918, 236684-237196, 245319-245334, 247203-247240, 248694-248762, 251214-251233, 252838-252863, 254246-254345, 255618-255633, 257818-259305, 262453-262779, 268366-269447, 274205-275747, 278932-279063, 290035-290474, 297587-298115, 235258-235328, 237585-237698, 245701-245780, 247431-247450, 249494-249509, 251601-251637, 253140-253166, 254641-254660, 255992-256704, 259500-259515, 263338-266518, 270038-271850, 275808-276636, 279303-281001, 290924-292550, 298161-298418, 235770-235785 237949-237557 246152-246523 247644-247659 250001-250020 251950-252060 253594-253819 254905-254920 257018-257092 261294-261656 266861-267131 271950-271969 276932-277064 281587-281610 292860-294408 298489-298738 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 ou 300835-301295.
[00203] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para uma região de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinadas modalidades, tais compostos ou oligonucleotídeos direcionados a uma região de um ácido nucleico de GHR têm uma porção de nucleobase contígua que é complementar a uma porção de nucleobase de comprimento igual da região. Por exemplo, a porção pode ser pelo menos uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16nucleobases contíguas complementares a uma porção de comprimento igual de uma região enunciada aqui. Em determinadas modalidades, tais compostos ou oligonucleotídeo direcionam as seguintes regiões de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2: : 2571-2586, 28673059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 61286265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 99319946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 1246912920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 1713017149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 2182021837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 3146831483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 3602336042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 4070640937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 5007250210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 6375164662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 6872768742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 7258472670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 7641077095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 8152481543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 8690186920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273- 91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 9529295583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258- 99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 157198-157223, 158542-158631, 160812-160827, 162064-162083, 164839-165059, 166837-166852, 169062-169092, 170407-170426, 171431-171568, 173045-173756, 181514-187644, 196536-196873, 198715-199007, 201258-201861, 204181-204740, 209999-210014, 211836-212223, 213825-213933, 215446-215508, 218526-218541, 221044-221059, 222914-222998, 224717-224769, 227025-227040, 229174-229189, 230313-230595, 232823-232848, 234447-234466, 236071-236213, 156233-156612, 157552-157567, 159539-159793, 161461-161607, 162531-162770, 165856-165875, 168004-168019, 169601-169711, 171021-171036, 172447-172462, 175014-177830, 190109-194159, 198145-198170, 199816-199838, 202382-202717, 206412-206764, 210502-210583, 213025-213044, 214622-214647, 216192-217595, 219342-219633, 221947-221962, 223948-224122, 225436-225761, 227485-227500, 229615-229640, 231817-232037, 233210-233225, 235258-235328, 237585-237698, 156847-156907, 157927-158029, 160352-160429, 161821-161969, 163019-163557, 166241-166450, 168760-168823, 170081-170291, 171207-171226, 172733-172956, 178895-180539, 194425-195723, 198307-198381, 200249-200635, 203098-203934, 207510-207532, 210920-211418, 213425-213440, 214884-214951, 218132-218248, 219886-220705, 222569-222584, 224409-224430, 226785-226898, 227914-228837, 230042-230057, 232088-232408, 233623-233646, 235770-235785, 237949-237557, 244873-244897, 246936-247031, 248223-248363, 250693-250708, 252665-252680, 254036-254083, 255397-255422, 257317-257332, 262021-262036, 267375-268051, 272631-274145, 277391-278380, 282229-283668, 295475-297012, 245319-245334, 247203-247240, 248694-248762, 251214-251233, 252838-252863, 254246-254345, 255618-255633, 257818-259305, 262453-262779, 268366-269447, 274205-275747, 278932-279063, 290035-290474, 297587-298115, 245701-245780, 247431-247450, 249494-249509, 251601-251637, 253140-253166, 254641-254660, 255992-256704, 259500-259515, 263338-266518, 270038-271850, 275808-276636, 279303-281001, 290924-292550, 298161-298418, 246152-246523 247644-247659 250001-250020 251950-252060 253594-253819 254905-254920 257018-257092 261294-261656 266861-267131 271950-271969 276932-277064 281587-281610 292860-294408 298489-298738 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 ou 300835-301295.
[00204] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um alvo íntron 1 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 3058-144965 (íntron 1) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.00142.714.000).
[00205] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 2 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 145047-208139 (íntron 2) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00206] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 3 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 208206-267991 (íntron 3) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00207] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 4 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 268122-274018 (íntron 4) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00208] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 5 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 274192-278925 (íntron 5) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00209] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 6 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 279105-290308 (íntron 6) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00210] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 7 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 270475-292530 (íntron 7) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00211] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 8 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 292622-297153 (íntron 8) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00212] Em certas modalidades, um composto compreende um composto antissenso ou oligonucleotídeo e um grupo conjugado em que o composto antissenso ou oligonucleotídeo é direcionado para um íntron 9 de um ácido nucleico do receptor do hormônio de crescimento. Em determinados aspectos, os compostos antissenso ou oligonucleotídeos são direcionados aos nucleotídeos 297224-297554 (íntron 9) de um ácido nucleico do receptor do hormônio do crescimento com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000).
[00213] Em certas modalidades, qualquer um dos compostos anteriores ou oligonucleotídeos compreende pelo menos uma ligação internucleosídeos modificados, pelo menos, um açúcar modificado e/ou pelo menos uma nucleobase modificada.
[00214] Em certas modalidades, qualquer um dos compostos ou oligonucleotídeos supracitados compreende pelo menos um açúcar modificado. Em certos aspectos, pelo menos um açúcar modificado compreende um grupo 2'-O-metoxietil. Em certos aspectos, pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico, como um do grupo 4'-CH (CH3)-O-2', grupo 4'-CH2-O-2' ou grupo 4'-(CH2)2-O-2'.
[00215] Em certos aspectos, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação de internucleosídeo modificado, como uma ligação de internucleosídeo de fosforotioato.
[00216] Em certas modalidades, qualquer um dos compostos ou oligonucleotídeos supramencionados compreende pelo menos uma nucleobase modificada, como 5-metilcitosina.
[00217] Em certas modalidades, qualquer um dos compostos ou oligonucleotídeos supramencionados compreende:
[00218] um segmento de lacuna que consiste em desoxinucleosídeos ligados;
[00219] um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e
[00220] um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados;
[00221] em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[00222] Determinadas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo consistindo em 10 a 30 nucleotídeos ligados com uma sequência de nucleobase que compreende a sequência enunciada na SEQ ID NO: 918, 479, 703, 1800, 1904, 2122, 2127 ou 2194.
[00223] Em certos aspectos, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que compreende a sequência enunciada nas SEQ ID NOs: 918, 479 ou 703 em que o oligonucleotídeo modificado compreende
[00224] um segmento de lacuna que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados;
[00225] um segmento de asa 5' que consiste em cinco nucleosídeos ligados; e
[00226] um segmento de asa 3' que consiste em cinco nucleosídeos ligados;
[00227] em que um segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[00228] Em certos aspectos, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que compreende a sequência enunciada nas SEQ ID NOs: 1800, 1904, 2122, 2127 ou 2194 em que o oligonucleotídeo modificado compreende nucleosídeos que têm uma modificação de açúcar MOE, uma modificação de açúcar (S)-cEt ou uma modificação desóxi; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[00229] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado de fita simples e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobases que consiste na sequência recitada nas SEQ ID NOs: 918, 479 ou 703 em que o oligonucleotídeo modificado compreende
[00230] um segmento de lacuna que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados;
[00231] um segmento de asa 5' que consiste em cinco nucleosídeos ligados; e
[00232] um segmento de asa 3' que consiste em cinco nucleosídeos ligados;
[00233] em que um segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[00234] Em certas modalidades, um composto compreende de um oligonucleotídeo modificado de fita simples e um grupo conjugado em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 16 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobases que consiste na sequência recitada nas SEQ ID NOs: 1800, 1904, 2122, 2127 ou 2194 em que o oligonucleotídeo modificado compreende nucleosídeos que têm uma modificação de açúcar MOE, uma modificação de açúcar (S)-cEt ou uma modificação desóxi; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[00235] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR e um grupo conjugado. Por exemplo em certas modalidades, um composto compreende um grupo conjugado e ISIS 532401.
[00236] Em qualquer das modalidades anteriores, o composto ou oligonucleotídeo pode ser de pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementar a um receptor do hormônio de crescimento de codificação de ácido nucleico.
[00237] Em qualquer das modalidades supramencionadas, o ácido nucleico que codifica o receptor do hormônio de crescimento pode compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19.
[00238] Em qualquer das modalidades supramencionadas, o composto ou oligonucleotídeo pode ser de fita única.
[00239] Em qualquer das modalidades supramencionadas, o composto ou oligonucleotídeo pode ser de fita dupla.
[00240] Em determinadas modalidades, pelo menos uma ligação internucleosídeos do oligonucleotídeo modificado é uma ligação internucleosídeos modificada.
[00241] Em determinadas modalidades, pelo menos uma ligação de internucleosídeos modificada um do oligonucleotídeo modificado é uma ligação de internucleosídeo de fosforotioato.
[00242] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[00243] Em determinadas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo modificado é selecionada de uma ligação internucleosídica de fosfodiéster e uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[00244] Em certas modalidades, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo modificado é uma ligação de fosforotioato.
[00245] Em determinadas modalidades, pelo menos um nucleosídeo do oligonucleotídeo modificado compreende uma nucleobase modificada.
[00246] Em certas modalidades, a nucleobase modificada é uma 5- metilcitosina.
[00247] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos um açúcar mmodificado.
[00248] Em certas modalidades, o açúcar modificado é um açúcar modificado 2', um BNA ou um THP.
[00249] Em certas modalidades, o açúcar modificado é qualquer um dentre uma 2'-O-metoxietila, 2'-O-metila, uma etila restrita, um LNA ou um 3'-flúor-HNA.
[00250] Em certas modalidades, o composto compreende pelo menos um nucleosídeo de 2'-O-metoxietila, nucleosídeo de 2'-O-metila, acetato de nucleosídeo restrito, nucleosídeo LNA ou nucleosídeo de 3'- fluoro-HNA.
[00251] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende:
[00252] um segmento de de lacuna consistindo em 10 desoxinucleosídeos ligados;
[00253] um segmento de asa de 5' consistindo em 5 nucleosídeos ligados; e
[00254] um segmento de asa de 3' consistindo em 5 nucleosídeos ligados;
[00255] em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[00256] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados.
[00257] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em 19 nucleosídeos ligados.
[00258] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em 18 nucleosídeos ligados.
[00259] Certas modalidades proveem compostos que consistem em um grupo conjugado e um oligonucleotídeo modificado de acordo com a seguinte fórmula: mCes mCes Aes mCes mCes Tds Tds Tds Gds Gds Gds Tds Gds Ads Ads Tes Aes Ges mCes Ae; em que,
[00260] A = uma adenina,
[00261] mC = a 5'-metilcitosina
[00262] G = uma guanina,
[00263] T = uma timina,
[00264] e = um nucleosídeo modificado com 2'-O-metoxietila,
[00265] d = um 2'-desoxinucleosídeo e
[00266] s = uma ligação de internucleosídeo de fosforotioato.
[00267] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc na extremidade 5'. Por exemplo em certas modalidades, um composto compreende ISIS 532401 conjugado com GalNAc na extremidade 5'. Em Em outras modalidades, o composto tem a seguinte estrutura química compreendendo ou consistindo em ISIS 532401 com 5'-X em que X é um grupo conjugado compreendendo GalNAc, tal como aqui descrito:
Figure img0003
em que X é um grupo de conjugado que compreende GalNAc.
[00268] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato. Em outras modalidades, um composto com a seguinte estrutura química compreende ou consiste em ISIS 719223 com 5'-X, em que X é um grupo conjugado que compreende GaINAc conforme descrito neste documento:
Figure img0004
[00269] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato ou de uma ligação de fosfodiéster. Em outras modalidades, um composto com a seguinte estrutura química compreende ou consiste em ISIS 719224 com 5'-X, em que X é um grupo conjugado que compreende GaINAc conforme descrito neste documento:
Figure img0005
[00270] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato ou de uma ligação de fosfodiéster. Em outras modalidades, um composto com a seguinte estrutura química compreende ou consiste em ISIS 766720 com um 5'-X, em que X é um grupo conjugado que compreende GaINAc conforme descrito neste documento:
Figure img0006
[00271] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc. Em outras dessas modalidades, o composto compreende a sequência de ISIS 532401 conjugado com GalNAc e é representado pela seguinte estrutura química:
Figure img0007
[00272] em que ou R1 é -OCH2CH2OCH3 (MOE) e R2 é H; ou R1 e R2 em conjunto, formam uma ponte em que R1 é -O- e R2 é -CH2-, -CH (CH3) - ou -CH2CH2- e R1 e R2 estão diretamente ligados de tal modo que a ponte resultante é selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH (CH3) - e -O-CH2CH2-; e para cada par de R3 e R4 no mesmo anel, independentemente para cada anel: ou R3 é selecionado a partir de H e -OCH2CH2OCH3 e R4 é H; ou R3 e R4 em conjunto formam uma ponte em que R3 é -O- e R4 é -CH2-, -CH (CH3) - ou -CH2CH2-e R3 e R4 estão diretamente ligados de tal modo que a ponte resultante é selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH (CH3) - e -O-CH2CH2-; e R5 é selecionado a partir de H e -CH3; e Z é selecionado a partir de S- e O-.
[00273] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo antissenso que possui uma sequência de nucleobases de quaisquer SEQ ID NOs divulgadas no WO 2004/078922 e um grupo conjugado aqui descrito. As sequências de nucleobases de todas as SEQ ID NOs referenciadas anteriormente estão incorporadas por referência neste documento. Por exemplo, um composto compreende um oligonucleotídeo divulgado no documento WO 2004/078922 conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato e tem a seguinte estrutura química:
Figure img0008
[00274] Por exemplo, um composto compreende um oligonucleotídeo divulgado no documento WO 2004/078922 para GalNAc conjugado e em que cada ligação internucleosídica do composto de oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato ou uma ligação de fosfodiéster e tem a seguinte estrutura química:
Figure img0009
[00275] Certas modalidades fornecem uma composição compreendendo o composto de qualquer uma das modalidades supramencionadas ou um sal deste e pelo menos um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em determinados aspectos, a composição tem uma viscosidade de menos de cerca de 40 centipoise (cP), menos do que cerca de 30 centipoise (cP), menos do que cerca de 20 centipoise (cP), menos do que cerca de 15 centipoise (cP) ou menos do que cerca de 10 centipoise (cP). Em certos aspectos, a composição possuindo qualquer uma das viscosidades supramencionadas compreende um composto fornecido aqui a uma concentração de cerca de 100 mg/mL, cerca de 125 mg/ml, cerca de 150 mg/mL, cerca de 175 mg/ml, cerca de 200 mg/mL, cerca de 225 mg/ml, cerca de 250 mg/mL, cerca de 275 mg/ml ou cerca de 300 mg/mL. Em certos aspectos, a composição possuindo qualquer das viscosidades e/ou concentrações do composto mencionadas acima tem uma temperatura ambiente ou uma temperatura de cerca de 20 °C, cerca de 21 °C, cerca de 22 °C, cerca de 23 °C, cerca de 24 °C, cerca de 25 °C, cerca de 26 °C, cerca de 27 °C, cerca de 28 °C, cerca de 29 °C ou cerca de 30 °C.
[00276] Certas modalidades fornecem um método para tratar uma doença associada ao excesso de hormônio do crescimento em um ser humano, o qual compreende a administração ao ser humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto ou composição de qualquer uma das modalidades supramencionadas, tratando, assim, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento. Em certos aspectos, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento é acromegalia. Em certos aspectos, o tratamento reduz os níveis de IGF-1.
[00277] Certas modalidades fornecem um método para prevenir uma doença associada ao excesso de hormônio do crescimento em um ser humano, o qual compreende a administração ao ser humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto ou composição de qualquer uma das modalidades supramencionadas, prevenindo, assim, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento. Em certas modalidades, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento é acromegalia.
[00278] Determinadas modalidades fornecem um método para reduzir o crescimento dos níveis do receptor do hormônio do crescimento (GHR) em um ser humano, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto ou composição de qualquer uma das modalidades supramencionadas, reduzindo, assim, os níveis de GHR no humano. Em certos aspectos, o ser humano tem uma doença associada ao excesso do hormônio do crescimento. Em certos aspectos, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento é acromegalia.
[00279] Em certos aspectos, os métodos anteriores compreendem a coadministração do composto ou da composição e um segundo agente. Em certos aspectos, o composto ou composição e o segundo agente são administrados concomitantemente.
Compostos antissenso
[00280] Compostos oligoméricos incluem, mas não estão limitados a oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonucleotídeo, miméticos de oligonucleotídeo, compostos antissenso, oligonucleotídeos antissenso e siRNAs. Um composto oligomérico pode ser "antissenso" para um ácido nucleico alvo, significando que um composto oligomérico é capaz de sofrer hibridização de um ácido nucleico alvo através da ligação de hidrogênio.
[00281] Em certas modalidades, um composto antissenso tem uma sequência de nucleobase que, quando escrita na direção 5' para 3', compreende o complemento inverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo ao qual este é direcionado. Em algumas dessas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso tem uma sequência de nucleobase que, quando escrita na direção 5' para 3', compreende o complemento inverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo ao qual este é direcionado.
[00282] Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 10 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 12 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 12 a 22 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 14 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 14 a 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 15 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 15 a 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 16 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 16 a 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 17 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 17 a 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 18 a 30 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 18 a 21 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 18 a 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem de 20 a 30 subunidades de comprimento. Em outras palavras, estes compostos antissenso são de 12 a 30 subunidades ligadas, de 14 a 30 subunidades ligadas, de 14 a 20 subunidades, de 15 a 30 subunidades, de 15 a 20 subunidades, de 16 a 30 subunidades, de 16 a 20 subunidades, de 17 a 30 subunidades , 17 a 20 subunidades, de 18 a 30 subunidades, de 18 a 20 subunidades, de 18 a 21 subunidades, de 20 a 30 subunidades ou de 12 a 22 subunidades ligadas, respectivamente. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 14 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 16 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 17 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 18 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 19 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, um composto antissenso tem 20 subunidades de comprimento. Em certas modalidades, o composto antissenso é de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17-50, 18 a 30, de 18 a 50, 19 a 30, de 19 a 50 ou de 20 a 30 subunidades ligadas. Em algumas dessas modalidades, os compostos antissenso têm 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 subunidades ligadas de comprimento ou um intervalo definido por quaisquer dentre dois valores definidos acima. Em certas modalidades, o composto antissenso é um oligonucleotídeo antissenso e as subunidades ligadas são nucleotídeos.
[00283] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso podem ser encurtados ou truncados. Por exemplo, uma única subunidade pode ser excluída da extremidade 5' (5' truncamento), ou, alternativamente, a partir da extremidade 3' (3' truncamento). Um composto antissenso encurtado ou truncado direcionado a um ácido nucleico de GHR pode ter duas subunidades eliminadas da terminação 5' ou alternativamente pode ter duas subunidades eliminadas da terminação 3' do composto antissenso. Alternativamente, os nucleosídeos eliminados podem ser dispersos por todo o composto antissenso, por exemplo, em um composto antissenso possuindo um nucleosídeo excluído da extremidade 5' e um nucleosídeo excluído da extremidade 3'.
[00284] Quando uma única subunidade adicional está presente em um composto antissenso alongado, a subunidade adicional pode estar localizada na extremidade 5' ou 3' do composto antissenso. Quando duas ou mais subunidades adicionais estão presentes, as subunidades adicionadas podem ser adjacentes uns aos outros, por exemplo, em um composto antissenso possuindo duas subunidades adicionadas à extremidade 5' (5 adição), ou em alternativa, a extremidade 3' (3' adição), do composto antissenso. Alternativamente, as subunidades podem ser adicionadas dispersas por todo o composto antissenso, por exemplo, em um composto antissenso possuindo uma subunidade adicionada à 5' extremidade e uma subunidade adicionada a 3' extremidade.
[00285] É possível aumentar ou diminuir o comprimento de um composto antissenso, tal como um oligonucleotídeo antissenso, e/ou apresentar bases incompatíveis sem eliminar a atividade. Por exemplo, em Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), uma série de oligonucleotídeos antissenso de 13 a 25 nucleobases de comprimento foi testada quanto à sua capacidade de induzir a clivagem de um RNA alvo em um modelo de injeção de oócito. Os oligonucleotídeos antissenso de 25 nucleobases de comprimento com 8 ou 11 bases de incompatibilidade perto das extremidades dos oligonucleotídeos antissenso foram capazes de direcionar a clivagem específica do mRNA alvo, ainda que em uma menor extensão do que os oligonucleotídeos antissenso que não continham nenhuma incompatibilidade. De forma similar, a clivagem específica alvo foi obtida usando 13 oligonucleotídeos antissenso de nucleobase, incluindo aqueles com 1 ou 3 incompatibilidades.
[00286] Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) demonstrou a capacidade do oligonucleotídeo ter 100% de complementaridade com o mRNA de bcl-2 e ter 3 incompatibilidades com o mRNA de bcl-xL para reduzir a expressão de ambos bcl-2 e bcl- xLin vitro e in vivo. Além disso, este oligonucleotídeo demonstrou atividade antitumor potente in vivo.
[00287] Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358.1988) testou uma série de oligonucleotídeos antissenso de 14 nucleobases em tandem e oligonucleotídeos antissenso de 28 e 42 nucleobases compostos da sequência de dois ou três dos oligonucleotídeos antissenso em tandem, respectivamente, quanto à sua capacidade de suspender a tradução de DHFR humana em um ensaio com reticulócitos de coelho. Cada um dos três oligonucleotídeos antissenso de 14 nucleobases sozinho foi capaz de inibir a tradução, embora a um nível mais baixo do que os oligonucleotídeos antissenso de 28 ou 42 nucleobases.
Determinados motivos e mecanismos do composto antissenso
[00288] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso têm subunidades quimicamente modificadas dispostas em padrões, ou motivos, para conferir às propriedades dos compostos antissenso, como atividade inibitória intensificada, afinidade de ligação aumentada para um ácido nucleico alvo, ou resistência à degradação por nucleases in vivo.
[00289] Compostos antissenso quiméricos normalmente contêm pelo menos uma região modificada com a finalidade de conferir resistência aumentada à degradação da nuclease, absorção celular aumentada, afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo, e/ou atividade inibitória aumentada. Uma segunda região de um composto antissenso quimérico pode conferir outra propriedade desejada, por exemplo, servir como um substrato para a RNase H da endonuclease celular, que cliva a fita do RNA de um RNA:DNA dúplex.
[00290] A atividade antissenso pode resultar de qualquer mecanismo envolvendo a hibridização do composto antissenso (por exemplo, oligonucleotídeos) com um ácido nucleico alvo, em que a hibridização resulta, em última análise, em um efeito biológico. Em certas modalidades, a quantidade e/ou a atividade do ácido nucleico alvo é modulada. Em certas modalidades, a quantidade e/ou a atividade do ácido nucleico alvo é reduzida. Em certas modalidades, a hibridização do composto antissenso para o ácido nucleico alvo resulta, em última análise, em uma degradação do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a hibridização do composto antissenso para o ácido nucleico não resulta na degradação do ácido nucleico alvo. Em algumas dessas modalidades, a presença do composto antissenso hibridizado com o ácido nucleico alvo (ocupação) resulta em uma modulação da atividade antissenso. Em certas modalidades, os compostos antissenso com um motivo ou padrão químico particular de modificações químicas são particularmente adequados para explorar um ou mais mecanismos. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso funcionam através de mais de um mecanismo e/ou através de mecanismos que não foram elucidados. Por conseguinte, os compostos antissenso descritos aqui não são limitados por um mecanismo particular.
[00291] Os mecanismos antissenso incluem, sem limitação, antissenso mediado por RNase H; mecanismos de RNAi, que utilizam vias de RISC e incluem, sem limitação, mecanismos de siRNA, ssRNA e microRNA; e mecanismos baseados em ocupação. Certos compostos antissenso podem atuar através de mais de um mecanismo desses e/ou através de mecanismos adicionais.
Antissenso mediado por RNase H
[00292] Em certas modalidades, os resultados da atividade antissenso, pelo menos em parte, a partir da degradação do RNA alvo por RNase H. RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um dúplex de RNA :DNA. É conhecido na técnica que os compostos antissenso de fita única que são "similares ao DNA" eliciam atividade de RNase H nas células de mamíferos. Por conseguinte, os compostos antissenso compreendendo pelo menos uma porção dos nucleosídeos de DNA ou semelhantes a DNA podem ativar a RNAse H, resultando na clivagem do ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso que utilizam RNAse H compreendem um ou mais nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, esses compostos antissenso compreendem pelo menos um bloco de 1-8 nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados não sustentam a atividade da RNAse H. Em certas modalidades, tais compostos antissenso são meros de lacuna, conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o intervalo do mero de lacuna compreende nucleosídeos de DNA. Em certas modalidades, o intervalo do mero de lacuna compreende nucleosídeos semelhantes a DNA. Em certas modalidades, o intervalo do mero de lacuna compreende nucleosídeos de DNA e nucleosídeos semelhantes a DNA.
[00293] Determinados compostos antissenso com um motivo de mero de lacuna são considerados compostos antissenso quiméricos. Em um mero de lacuna uma região interna que tem uma pluralidade de nucleotídeos que suporta a clivagem de RNaseH está posicionada entre as regiões externas que têm uma pluralidade de nucleotídeos que são quimicamente diferentes dos nucleosídeos da região interna. No caso de um oligonucleotídeo antissenso que tem um motivo de mero de lacuna, o segmento de lacuna geralmente serve como o substrato para a clivagem da endonuclease, enquanto os segmentos de asa compreendem nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, as regiões de um mero de lacuna são diferenciadas pelos tipos de frações de açúcar compreendendo cada região distinta. Os tipos de frações de açúcar que são usados para diferenciar as regiões de um mero de lacuna podem em algumas modalidades incluir β-D-ribonucleosideos, β-D-desoximbonucleosideos, nucleosídeos modificados em 2' (tais nucleosídeos modificados em 2' podem incluir 2'-MOE e 2'-O-CH3, entre outros) e nucleosídeos modificados pelo açúcar bicíclico (tais nucleosídeos modificados pelo açúcar bicíclico podem incluir aqueles que têm uma etila restrita). Em certas modalidades, os nucleosídeos nas asas podem incluir diversas frações de açúcar modificado, incluindo, por exemplo, frações de açúcar bicíclico e 2'-MOE, como etil limitado ou LNA. Em determinadas modalidades, as asas podem incluir várias frações de açúcar modificado e não modificado. Em certas modalidades, as asas podem incluir várias combinações de nucleosídeos de 2'-MOE, porções de açúcar bicíclico, como nucleosídeos de etil limitado ou nucleosídeos de LNA, e 2'-deoxinucleosídeos.
[00294] Cada região distinta pode compreender frações de açúcar uniformes, variantes, ou frações de açúcar alternadas. O motivo de asa- lacuna-asa é frequentemente descrito como "X-Y-Z", em que "X" representa o comprimento de 5'-asa, "Y" representa o comprimento da lacuna, e "Z" representa o comprimento de 3'-asa. "X" e "Z" podem incluir frações de açúcar uniformes, variantes, ou alternadas. Em determinadas modalidades, "X" e "Y" podem incluir um ou mais 2'- desoxinucleosídeos. "Y" pode compreender 2'-desoxinucleosídeos. Como usado neste documento, um mero de lacuna descrito como "X-Y- Z" tem uma configuração de modo que a lacuna esteja posicionada imediatamente adjacente a cada 5'-asa e 3'-asa. Desse modo, não há nenhuma intervenção de nucleotídeos entre 5'-asa e a lacuna, ou a lacuna e 3'-asa. Qualquer um dos compostos antissenso descritos neste documento pode ter um motivo de mero de lacuna. Em determinadas modalidades, "X" e "Z" são iguais; em outras modalidades, eles são diferentes. Em determinadas modalidades, "Y" tem entre 8 e 15 nucleosídeos. X, Y ou Z podem ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou mais nucleosídeos.
[00295] Em certas modalidades, o composto antissenso direcionado a um ácido nucleico de GHR tem um motivo de mero de lacuna em que o intervalo consiste em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 nucleosídeos ligados.
[00296] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso tem um motivo de açúcar descrito pela Fórmula A, conforme segue:(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
[00297] em que:
[00298] cada A é independentemente um nucleosídeo substituído em 2';
[00299] cada B é independentemente um nucleosídeo bicíclico;
[00300] cada J representa, independentemente, um nucleosídeo substituído em 2' ou um 2'-desoxinucleosídeo;
[00301] cada D é um 2'-desoxinucleosídeo;
[00302] m é 0-4; n é 0-2; p é 0-2; r é 0-2; t é 0-2; v é 0-2; w é 0-4; x é 0-2; y é 0-2; Z é 0-4; g é 6-14;
[00303] contanto que:
[00304] pelo menos um de m, n, e r é outro que não 0;
[00305] pelo menos um de W e Y é diferente de 0;
[00306] a soma de m, n, p, r, e t é 2 a 5; e
[00307] a soma de v, w, x, y, e z é de 2 a 5.
Compostos de RNAi
[00308] Em certas modalidades, os compostos antissenso são compostos de RNA de intervenção (RNAi), que incluem compostos de RNA de fita supla (também referidos como RNA de interferência breve ou siRNA) e compostos de RNAi de fira simples (ou ssRNA). Esses compostos funcionam, pelo menos em parte, através da via de RISC para degradar e/ou sequestrar um ácido nucleico alvo (e, assim, incluir compostos de microRNA/mímicos de microRNA). Em certas modalidades, os compostos antissenso compreendem modificações que os tornam particularmente apropriados para tais mecanismos.
i. Compostos de ssRNA
[00309] Em certas modalidades, os compostos antissenso, incluindo aqueles particularmente apropriados para uso como compostos de RNAi de fita simples (ssRNA), compreendem uma terminação modificada 5'-terminal. Em algumas dessas modalidades, a extremidade do terminal 5' compreende uma porção de fosfato modificado. Em certas modalidades, tal fosfato modificado é estabilizado (por exemplo, resistente à degradação/clivagem em comparação ao 5'-fosfato não-modificado). Em certas modalidades, esses nucleosídeos 5'-terminais estabilizam a porção de 5'-fosforosa. Certos nucleosídeos 5'-terminais podem ser encontrados na técnica, por exemplo, no documento WO/2011/139702.
[00310] Em certas modalidades, o 5'-nucleosídeo de um composto de ssRNA tem a fórmula IIc:
Figure img0010
[00311] em que:
[00312] Ti é uma porção de fósforo opcionalmente protegido;
[00313] T2 é um grupo de ligação de internucleosídeos que liga o composto de Fórmula IIc ao composto oligomérico;
[00314] A tem uma das fórmulas:
Figure img0011
[00315] Q1 e Q2 são cada um, independentemente, H, halogênio, C1C6 alquila, C1-C6 alquila substituída, C1-C6 alcóxi, C1-C6 alcóxi substituído, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinila, C2-C6 alquinila substituída ou N (R3) (R4);
[00316] Q3 é O, S, N(R5) ou C(R6)(R7);
[00317] cada R3, R4 R5, R6 e R7 é, independentemente, H, C1-C6 alquila, C1-C6 alquila substituída ou C1-C6 alcóxi;
[00318] M3 é O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18),C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) ou OC(R15)(Bx2);
[00319] R14 é H, C1-C6 alquila , C1-C6 alquila substituída, C1-C6alcóxi, C1-C6alcóxi substituído, C2-C6alquenila, C2-C6alquenila substituída, C2- C6alquinila substituída ou C2-C6alquinila;
[00320] R15, R16, R17 e R18 são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C6alquila, C1-C6alquila substituída, C1-C6alcóxi, C1- C6alcóxi substituída, C2-C6alquenila, C2-C6 alquenila substituída, C2- C6alquinila ou C2-C6alquinila substituída;
[00321] Bx1 é uma porção de base heterocíclica;
[00322] ou se Bx2 está presente, em seguida, Bx2 é um radical de base heterocíclica e Bx1 é H, halogênio, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituída, C1-C6alcóxi, C1-C6alcóxi substituído, C2-C6alquenila, C2- C6alquenila substituída, C2-C6alquinila, ou C2-C6alquinila substituída;
[00323] J4, J5, J6 e J7 são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituída, C1-C6alcóxi C1-C6, C1- C6alcóxi substituído, C2-C6alquenila, C2-C6 alquenila substituída, C2- C6alquinila ou C2-C6alquinila substituída;
[00324] ou J4 forma uma ponte com um dos J5 ou J7 em que a dita ponte compreende desde 1 a 3 grupos selecionados ligados birradical a partir de O, S, NR19, C (R20) (R21), C (R20) = C (R21), C [= C (R20) (R21)] e C (= O) e os outros dois de J5, J6 e J7 são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituída , C1-C6alcóxi, C1-C6alcóxi substituído, C2-C6alquenila, C2- C6alquenila substituída, C2-C6alquinila, ou C2-C6alquinila substituída;
[00325] cada R19, R20 e R21 é, independentemente, H, C1-C6alquila C1-C6, C1-C6 alquila substituída, C1-C6alcóxi, C1-C6alcóxi substituído, C2-C6alquenila, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6alquinila ou C2- C6alquinila substituída;
[00326] G é H, OH, halogênio ou O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;
[00327] cada R8 e R9 é, independentemente, H, halogênio, C1- C6alquila ou C1-C6alquila substituída;
[00328] X1 é O, S ou N (E1);
[00329] Z é H, halogênio, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituída, C2- C6alquenila, C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila, C2-C6alquinila substituída ou N (E2) (E3);
[00330] E1, E2 and E3 são, cada um, independentemente, H, C1- C6alquila C1-C6 ou C1-C6 alquila substituída;
[00331] n é de 1 a cerca de 6;/
[00332] m é 0 ou 1;
[00333] j é 0 ou 1;
[00334] cada grupo substituído compreende um ou mais grupos substituintes opcionalmente protegidos independentemente selecionados a partir de halogênio, JO1, N (J1) (J2), = NJ1, SJ1, N3, CN, OC (= X2) J1, OC (= X2) N (J1) (J2) e C (= X2) N (J1) (J2);
[00335] x2 é O, S ou NJ3;
[00336] cada J1, J2 e J3 is, independentemente, H ou alquil C1-C6 ;
[00337] quando j é 1, então Z é diferente de halogênio ou N (E2) (E3);e
[00338] em que o referido composto oligomérico compreende de 8 a 40 subunidades monoméricas e for hibridizável em pelo menos uma porção de um ácido nucleico alvo.
[00339] Em certas modalidades, M3 é O, CH = CH, OCH2 ou OC (H) (Bx2). Em certas modalidades, M3 é O.
[00340] Em certas modalidades, J4, J5, J6 e J7 são cada um H. Em certas modalidades, J4 forma uma ponte com um dos J5 ou J7.
[00341] Em certas modalidades, A tem uma das fórmulas:
Figure img0012
[00342] em que:
[00343] Q1 e Q2 são cada um, independentemente, H, halogênio, C1- C6alquila , C1-C6 alquila substituída , C1-C6alcoxi ou C1-C6alcóxi. Em certas modalidades, Q1 e Q2 são cada um H. Em certas modalidades, Q1 e Q2 são cada um, independentemente, H ou halogênio. Em certas modalidades, Q1 e Q2 é H e o outro de Q1 e Q2 é F, CH3 ou OCH3.
[00344] Em certas modalidades, T1 tem a fórmula:
Figure img0013
[00345] em que:
[00346] Ra e Rc são cada um, independentemente, hidroxil protegido, tiol protegido, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituída, C1-C6alcóxi, C1- C6alcoxi substituído, amino protegido ou amino substituído; e
[00347] Rb é O ou S. Em certas modalidades, Rb é O e Ra e Rc são cada um, independentemente, OCH3, OCH2CH3 ou CH (CH3)2.
[00348] Em determinadas modalidades, G é halogênio, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R10)(R11), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2- N(R10)(R11) ou O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(R11)] em que R10, R11, R12 e R13 são cada um independentemente, H ou C1-C6alquila. Em certas modalidades, G é halogênio, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH = CH2, O (CH2)2-OCH3, O (CH2)2-O (CH2)2-N (CH3)2, OCH2C (= O) -N (H) CH3, OCH2C (= O) -N (H) - (CH2)2-N (CH3)2 ou OCH2-N (H) -C (= NH) NH2. Em certas modalidades, G é F, OCH3 ou O (CH2)2-OCH3. Em certas modalidades, G é O(CH2)2-OCH3.
[00349] Em certas modalidades, o nucleosídeo 5'-terminal tem a Fórmula IIe:
Figure img0014
[00350] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso, incluindo aqueles particularmente apropriados para o ssRNA, compreendem um ou mais tipos de frações de açúcar modificadas e/ou frações de açúcar de ocorrência natural dispostas ao longo do oligonucleotídeo ou da sua região em um padrão definido ou motivo de modificação do açúcar. Esses motivos podem incluir qualquer uma das modificações de açúcar discutidas neste documento e/ou outras modificações de açúcar conhecidas.
[00351] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem ou consistem em uma região com modificações de açúcar uniforme. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região compreende a mesma modificação de açúcar semelhante a RNA. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região é um nucleosídeo 2'-F. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região é um nucleosídeo 2'-OMe. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região é um nucleosídeo 2'-MOE. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região é um nucleosídeo cEt. Em certas modalidades, cada nucleosídeo da região é um nucleosídeo de LNA. Em certas modalidades, a região uniforme constitui todos ou essencialmente todos os oligonucleotídeos. Em certas modalidades, a região constitui todos os oligonucleotídeos, exceto os nucleosídeos terminais 1-4.
[00352] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais regiões de modificações de açúcar alternadas, em que os nucleotídeos alternam entre os nucleotídeos com uma modificação de açúcar de um primeiro tipo e nucleotídeos com uma modificação de açúcar de um segundo tipo. Em certas modalidades, os nucleotídeos de ambos os tipos são nucleosídeos semelhantes a RNA. Em certas modalidades, os nucleosídeos alternados são selecionados a partir de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA e cEt. Em certas modalidades, as modificações alternadas são 2'-F e 2'-OMe. Essas regiões podem ser contíguas ou podem ser interrompidas por nucleosídeos modificados de maneira diferente ou por nucleosídeos conjugados.
[00353] Em certas modalidades, a região alternada das modificações alternadas consistem em um único nucleosídeo (isto é, o padrão é (AB)xAy em que A é um nucleosídeo com uma modificação de açúcar de um primeiro tipo e B é um nucleosídeo com uma modificação de açúcar de um segundo tipo; x é 1-20 e y é 0 ou 1). Em certas modalidades, uma ou mais regiões alternadas em um motivo alternado incluem mais de um único nucleosídeo de um tipo. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem incluir uma ou mais regiões de qualquer um dos seguintes motivos de nucleosídeos:
[00354] AABBAA;
[00355] ABBABB;
[00356] AABAAB;
[00357] ABBABAABB;
[00358] ABABAA;
[00359] AABABAB;
[00360] ABABAA;
[00361] ABBAABBABABAA;
[00362] BABBAABBABABAA; ou
[00363] ABABBAABBABABAA;
[00364] em que A é um nucleosídeo de um primeiro tipo e B é um nucleosídeo de um segundo tipo. Em certas modalidades, A e B são, cada um, selecionados a partir de 2'-F, 2'-OMe, BNA e MOE.
[00365] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos com esse motivo alternado compreendem ainda um nucleosídeo terminal 5' modificado, como aqueles da fórmula IIc ou IIe.
[00366] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região com um motivo 2-2-3. Essas regiões compreendem o seguinte motivo:-(A)2- (B)x-(A)2- (C)y-(A)3-
[00367] em que: A é um primeiro tipo de nucleosídeo modificado;
[00368] B e C, são nucleosídeos que são modificados de maneira diferente do que A, no entanto, B e C podem ter a mesma ou diferentes modificações;
[00369] x e y são de 1 a 15.
[00370] Em certas modalidades, A é um nucleotídeo modificado em 2'-OMe. Em certas modalidades, B e C são, ambos, nucleosídeos modificados em 2'-F. Em certas modalidades, A é um nucleosídeo modificado em 2'OMe e B e C são, ambos, nucleosídeos modificados em 2'-F.
[00371] Em certas modalidades, os oligonucleosídeos têm o seguinte motivo de açúcar:5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
[00372] em que:
[00373] Q é um nucleosídeo que compreende uma porção de fosfato estabilizada. Em certas modalidade, Q é um nucleosídeo tendo uma Fórmula IIc ou IIe;
[00374] A é um primeiro tipo de nucleosídeo modificado;
[00375] B é um segundo tipo de nucleosídeo modificado;
[00376] D é um nucleosídeo modificado compreendendo uma modificação diferente do nucleosídeo adjacente a ela. Assim, se y for 0, então D deve ser modificado de forma diferente de B e, se y for 1, então D deve ser modificado de forma diferente de A. Em certas modalidades, D difere de ambos A e B.
[00377] X é 5-15;
[00378] y é 0 ou 1;
[00379] Z é 0-4.
[00380] Em certas modalidades, os oligonucleosídeos têm o seguintemotivo de açúcar:5'- (Q)- (A)x-(D)z
[00381] em que:
[00382] Q é um nucleosídeo que compreende uma porção de fosfato estabilizada. Em certas modalidades, Q é um nucleosídeo tendo uma Fórmula IIc ou IIe;
[00383] A é um primeiro tipo de nucleosídeo modificado;
[00384] D é um nucleosídeo modificado que compreende uma modificação diferente de A.
[00385] X é 11-30;
[00386] Z é 0-4.
[00387] Em certas modalidades, A, B, C e D nos motivos acima são selecionados a partir de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA e cEt. Em certas modalidades, D representa nucleosídeos terminais. Em certas modalidades, tais nucleosídeos terminais não são concebidos para hibridizar para o ácido nucleico alvo (embora um ou mais possam hibridizar por acaso). Em certas modalidades, a nucleobase de cada nucleosídeo D é adenina, independentemente da identidade da nucleobase na posição correspondente do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a nucleobase de cada nucleosídeo D é timina.
[00388] Em certas modalidades, os compostos antissenso, incluindo aqueles particularmente apropriados para uso como ssRNA, compreendem ligações de internucleosídeos modificadas juntamente com oligonucleotídeos ou uma região sua em um padrão definido ou um motivo de ligação de internucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região com um motivo de ligação de internucleosídeo alternado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região de ligações de internucleosídeo uniformemente modificadas. Em algumas dessas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma região que é uniformemente ligada por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é uniformemente ligado por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é selecionado de fosfodiéster e fosforotioato e pelo menos uma ligação de internucleosídeo é fosforotioato.
[00389] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 6 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 8 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 10 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 6 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 8 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 10 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 12 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Nestas determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado em 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[00390] Os oligonucleotídeos com um de vários motivos de açúcar descritos aqui podem ter qualquer motivo de ligação. Por exemplo, os oligonucleotídeos, incluindo mas não se limitando aos descritos acima, podem ter um motivo de ligação selecionado a partir da tabela não limitativa abaixo:
Figure img0015
ii. Compostos de siRNA
[00391] Em certas modalidades, os compostos antissenso são compostos de RNAi de fita dupla (siRNA). Nessas modalidades, uma ou ambas as fitas podem compreender qualquer motivo de modificação descrito acima para o ssRNA. Em certas modalidades, os compostos de ssRNA podem ser RNA não modificado. Em certas modalidades, os compostos de siRNA podem compreender nucleosídeos de RNA não modificado, mas ligações de internucleosídeos modificados.
[00392] Várias modalidades se relacionam a composições de fita dupla, em que cada fita compreende um motivo definido pelo local de um ou mais nucleosídeos modificados ou não modificados. Em certas modalidades, composições são fornecida compreendendo um primeiro e um segundo composto oligomérico que são completamente ou pelo menos parcialmente hibridizados de modo a formar uma região dúplex e compreendendo ainda uma região que é complementar ao e hibridiza um alvo de ácido nucleico. É apropriado que essa composição compreende um primeiro composto oligomérico que seja uma fita antissenso com complementaridade total ou parcial a um alvo de ácido nucleico e um segundo composto oligomérico que seja uma fita senso com uma ou mais regiões de complementaridade a e que forme pelo menos uma região dúplex com o primeiro composto oligomérico.
[00393] As composições de várias modalidades modulam a expressão do gene hibridizando a um alvo de ácido nucleico que resulta na perda de sua função normal. Em algumas modalidades, o alvo de ácido nucleico é GHR. Em certas modalidades, a degradação do GHR alvo é facilitada por um complexo de RISC ativado que é formado com as composições da invenção.
[00394] Diversas modalidades são direcionadas a composições de fita dupla, em que uma das fitas é útila, por exemplo, influenciando o carregamento preferencial da fita oposta no complexo de RISC (ou clivagem). As composições são úteis para direcionar a moléculas de ácido nucleico selecionadas e para modular a expressão de um ou mais genes. Em algumas modalidades, as composições da presente invenção hibridizam para uma porção de um RNA alvo, resultando na perda da função normal do RNA alvo.
[00395] Certas modalidades são atraídas a composições de fita dupla, em que ambas as fitas compreendem um motivo de hemímero, um motivo completamente modificado, um motivo modificado posicionalmente ou um motivo alternado. Cada fita das composições da presente invenção pode ser modificada para preencher uma função particular, por exemplo, na via de siRNA. O uso de um motivo diferente em cada fita ou o mesmo motivo com diferentes modificações químicas em cada fita permite direcionar a fita antissenso para o complexo de RISC, ao mesmo tempo em que inibe a incorporação da fita senso. Neste modelo, cada fita pode ser modificada de maneira independente, de modo que seja potencializada para essa função particular. A fita antissenso pode ser modificada na terminação 5' para potencializar sua função em uma região do RISC, enquanto 3' pode ser modificado de maneira diferente, de modo a potencializar sua função em uma região diferente do RISC.
[00396] As moléculas de fita dupla de oligonucleotídeos podem ser uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla que compreende regiões antissenso e senso autocomplementar, em que a região antissenso compreende a sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo ou uma porção sua e a região senso com uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de ácido nucleico alvo ou uma porção sua. As moléculas de fita dupla do oligonucleotídeo podem ser montadas de dois oligonucleotídeos separados, em que uma fita é a fita de senso e o outro é a fita antissenso, em que as fitas antissensos e senso são auto- complementares (ou seja, cada fita é composta pela sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos em outra fita; tais como em que a fita antissenso e fita senso formam uma estrutura dúplex ou fita dupla, por exemplo no qual a região de fita dupla é cerca de 15 a 30, por exemplo, cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de base; a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo ou uma porção e a fita senso compreende sequência nucleotídica correspondente para a sequência do ácido nucleico alvo ou uma porção (por exemplo, cerca de 15 a com 25 ou mais nucleotídeos da molécula de fita dupla do oligonucleotídeo são complementares para o ácido nucleico alvo ou uma parte dele). Alternativamente, o oligonucleotídeo de fita dupla é montado a partir de um único oligonucleotídeo, em que as regiões antsense e autocomplementar do siRNA estão ligados por meio de um ácido nucleico com base ou ligante(s) à base de ácido não nucleico.
[00397] O oligonucleotídeo de fita dupla pode ser um polinucleotídeo com um dúplex, dúplex assimétrica,grampo de cabelo ou uma estrutura secundária em grampo de cabelo assimétrica, tendo regiões de senso e antissenso de auto-complementar, em que a região antissenso compreende a sequência de nucleotídeos que é complementar a sequência de nucleotídeos na molécula do ácido nucleico alvo separado ou uma porção da mesma e a sequência de nucleotídeos possuindo região senso corresponde à sequência de ácido nucleico alvo ou uma sua porção. O oligonucleotídeo de fita dupla pode ser um polinucletídeo de fita única circular tendo duas ou mais estrutura em alça e uma haste compreendendo as regiões autocomplementares senso e antissenso, em que a região antissenso compreende uma sequência nucleotídica que é complementar à sequência nucleotídica em uma molécula de ácido nucleico alvo ou uma porção desta e a região senso tendo uma sequência nucleotídica correspondente à sequência do ácido nucleico alvo ou uma porção desta, e em que o polinucleotídeo circular pode ser processado in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de siRNA ativa capaz de mediar o RNAi.
[00398] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo de fita dupla compreende sequências ou regiões senso e antissenso separadas, em que as regiões senso e antissenso são covalentemente ligadas por moléculas ligantes nucleotídicas ou não nucleotídicas conforme conhecido na técnica, ou são, alternativamente, ligadas não covalentemente por interações iônicas, ligação de hidrogênio, interações de van der Waals, interações hidrofóbicas e/ou interações por empilhamento. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo de fita dupla compreende a sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de um gene-alvo. Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo de fita dupla interage com a sequência de um gene- alvo de um modo que faz com que a inibição da expressão do gene- alvo.
[00399] Tal como aqui utilizado, os oligonucleotídeos de fita dupla não necessitam ser limitados a essas moléculas contendo apenas RNA, mas englobam ainda nucleotídeos quimicamente modificados e não nucleotídeos. Em certas modalidades, a curta interferência das moléculas de ácido nucleico sem 2'-hidroxi (2'-OH) contendo nucleotídeos. Em certas modalidades de curta interferência dos ácidos nucleicos opcionalmente não incluem quaisquer ribonucleotídeos (por exemplo, tendo um grupo 2'-OH). Tais oligonucleotídeos de fita dupla que não requerem a presença de ribonucleotídeos no interior da molécula para suportar RNAi pode, contudo, ter um ligante ou ligantes anexado ou outros grupos ligados ou associados, unidades, cadeias ou contendo um ou mais nucleotídeos com grupos 2'-OH. Opcionalmente, os oligonucleotídeos de fita dupla podem compreender ribonucleotídeos a cerca de 5, 10, 20, 30, 40, ou 50% das posições de nucleotídeos. Tal como aqui utilizado, o termo de siRNA pretende ser equivalente a outros termos utilizados para descrever moléculas de ácido nucleico que são capazes de mediar a sequência de RNAi específico, por exemplo interferência curta de RNA (siRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), micro- RNA (miRNA), RNA de grampo de cabelo curto (shRNA), oligonucleotídeo de interferência curta, ácido nucleico de interferência curta, oligonucleotídeo modificado de interferência curta, quimicamente modificados siRNA, gene silenciamento pós-transcricional RNA (ptgsRNA), e outros. Além disso, tal como aqui utilizado, o termo RNAi pretende ser equivalente a outros termos utilizados para descrever a sequência de RNA de interferência específica, tal como o silenciamento pós-transcricional de genes, a inibição de translação, ou epigenética. Por exemplo, os oligonucleotídeos de fita dupla podem ser utilizados para silenciar genes epigeneticamente tanto ao nível pós-transcricional e o nível pré-transcricional. Num exemplo não limitativo, a regulação da expressão do gene epigenética por moléculas de siRNA da invenção pode resultar a partir de modificação siRNA mediada da estrutura da cromatina ou padrão de metilação para alterar a expressão de genes (ver, por exemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal- Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; and Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
[00400] Está contemplado que os compostos e as composições de diversas modalidades aqui proporcionadas podem alvejar GHR por um silenciamento de genes mediado por dsRNA ou mecanismo de RNAi, incluindo, por exemplo, "grampo de cabelo" ou alça pendulada de moléculas de fita dupla de RNA efetoras em que uma única fita de RNA com sequências de autocomplementar é capaz de assumir uma conformação de fita dupla, ou moléculas efetoras dsRNA dúplex compreendendo duas fitas separadas de RNA. Em várias modalidades, o dsRNA consiste inteiramente de ribonucleotídeos ou é constituído por uma mistura de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, tais como as de RNA/DNA híbridos descritos, por exemplo, pelo documento WO 00/63364, depositado em abril 19, 2000, ou N° de Série US 60/130.377, depositado em 21 de abril de 1999. A molécula efetora de dsRNA ou dsRNA pode ser uma única molécula com uma região de auto- complementaridade tal que nucleotídeos de um segmento da molécula de pares de bases com nucleotídeos num outro segmento da molécula. Em várias modalidades, um dsRNA que consiste de uma única molécula consiste inteiramente de ribonucleotídeos ou inclui uma região de ribonucleotídeos que é complementar a uma região de desoxirribonucleotídeos. Alternativamente, o dsRNA pode incluir dois fios diferentes que têm uma região de complementaridade para o outro.
[00401] Em várias modalidades, ambas as fitas são inteiramente constituídas por ribonucleotídeos, uma fita consiste inteiramente de ribonucleotídeos e uma fita de desoxirribonucleotídeos consiste inteiramente, ou uma ou ambas as fitas contêm uma mistura de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Em certas modalidades, as regiões de complementaridade são, pelo menos, 70, 80, 90, 95, 98, ou 100% complementares um ao outro e a uma sequência de ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a região do dsRNA que está presente em uma conformação de fita dupla inclui, pelo menos, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou 5000 nucleotídeos ou inclui todos os nucleotídeos de um cDNA ou sequência de ácido nucleico alvo a ser representada outra no dsRNA. Em algumas modalidades, o dsRNA não contém quaisquer regiões de fita simples, tais como as extremidades de fita simples, ou o dsRNA é um grampo de cabelo. Em outras modalidades, o dsRNA tem uma ou mais regiões de fita simples ou saliências. Em certas modalidades, o RNA/DNA híbridos incluem uma fita ou região de DNA que é uma fita ou da região antissenso (por exemplo, tem, pelo menos, 70, 80, 90, 95, 98, ou 100% de complementaridade de um ácido nucleico alvo) e uma fita de RNA ou região que é uma fita ou região senso (por exemplo, tem, pelo menos, 70, 80, 90, 95, 98, ou 100% de identidade com um ácido nucleico alvo), e vice-versa.
[00402] Em várias modalidades, o RNA/DNA híbrido é feito in vitro utilizando métodos de síntese químicas ou enzimáticas, tais como os aqui descritos ou os descritos no documento WO 00/63364, depositado em 19 de abril de 2000, ou N° de Série US 60/130.377, depositado em 21 de abril de 1999. Em outras modalidades, uma fita de DNA sintetizada in vitro é complexado com uma fita de RNA feito in vivo ou in vitro antes, depois, ou em simultâneo com a transformação da fita de DNA na célula. Em ainda outras modalidades, o dsRNA é um único ácido nucleico circular contendo um senso e uma região antissenso, ou o dsRNA inclui um ácido nucleico circular e quer um segundo ácido nucleico circular ou um ácido nucleico linear (ver, por exemplo, o documento WO 00/63364, apresentado em 19 de abril de 2000, ou US n° de série 60/130.377, depositado em 21 de abril de 1999.) Ácidos nucleicos circulares exemplares incluem estruturas lariat em que o grupo fosforil 5' livre de um nucleotídeo torna-se ligados ao 2' grupo hidroxil de outro nucleotídeo em um loop de volta fashion.
[00403] Em outras modalidades, o dsRNA inclui um ou mais nucleotídeos modificados no qual a posição 2' no açúcar contém um átomo de halogênio (tal como um grupo flúor) ou contém um grupo alcoxi (tal como um grupo metoxi), que aumenta a semivida do dsRNA in vivo ou in vitro em comparação com o dsRNA correspondente no qual a posição correspondente 2' contém um átomo de hidrogênio ou um grupo hidroxila. Em ainda outras modalidades, o dsRNA inclui uma ou mais ligações entre outros do que uma ligação fosfodiéster de ocorrência natural de nucleotídeos adjacentes. Exemplos de tais ligações incluem ligações fosforamida, fosforotioato e fosforoditioato. O dsRNA pode também ser moléculas do ácido nucleico modificadas quimicamente, como ensinado em US Pat. No. 6.673.661. Em outras modalidades, o dsRNA contém uma ou duas fitas tampadas, como divulgado, por exemplo, pelo documento WO 00/63364, depositado em 19 de abril de 2000, ou N° de Série US 60/130.377, depositado em 21 de abril de 1999.
[00404] Em outras modalidades, o dsRNA pode ser qualquer uma das moléculas de dsRNA, pelo menos, parcialmente divulgados no documento WO 00/63364, bem como qualquer uma das moléculas de dsRNA descritos em Pedido Provisório US 60/399.998; e US Pedido Provisório 60/419.532, e PCT/US2003/033466, cujo ensinamento é aqui incorporado por referência. Qualquer um dos dsRNA podem ser expressos in vitro ou in vivo utilizando os métodos aqui descritos ou métodos padrão, tais como os descritos no documento WO 00/63364.
Ocupantes
[00405] Em certas modalidades, os compostos antissenso não são esperados para resultar na clivagem ou o ácido nucleico alvo através de RNase H ou para resultar na clivagem ou sequestro através da via RISC. Em algumas destas modalidades, a atividade antissenso pode resultar de ocupação, em que a presença do composto antissenso hibridizado interrompe a atividade do ácido nucleico alvo. Em algumas destas modalidades, o composto antissenso pode ser modificado de modo uniforme ou podem compreender uma mistura de modificações e/ou nucleosídeos modificados e não modificados.
Ácidos Nucleicos Alvo, Regiões Alvo e Sequências Nucleotídicas
[00406] As sequências de nucleotídeos que codificam o receptor do hormônio de crescimento (GHR) direcionável com os compostos aqui proporcionados incluem, sem limitação, as seguintes: No de Adesão GENBANK NM_000163.4 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 1), N° de Acesso GENBANK NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000 (aqui incorporados como SEQ ID NO: 2) N° de Acesso GENBANK X06562.1 (incorporado aqui como a SEQ ID NO: 3), No de Acesso GENBANK: DR006395.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 4) ou N° de Acesso GENBANK DB052048.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 5), N° de Acesso GENBANK AF230800.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 6), o complemento de número de acesso GenBank No. AA398260.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 7), No de Acesso GENBANK BC136496.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 8), N° de Acesso GENBANK NM_001242399.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 9), N° de Acesso GENBANK NM_001242400.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 10). N° de Acesso GENBANK NM_001242401.3 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 11), N° de Acesso GENBANK NM_001242402.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 12), N° de Acesso GENBANK NM_001242403.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 13), N° de Acesso GENBANK NM_001242404.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 14), N° de Acesso GENBANK NM_001242405.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 15), N° de Acesso GENBANK NM_001242406.2 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 16), N° de Acesso GENBANK NM_001242460.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 17), N° de Acesso GENBANK NM_001242461.1 (incorporado aqui como a SEQ ID NO: 18), N° de Acesso GenBank NM_001242462.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 19) ou N° de Acesso GenBank NW_001120958.1 truncado de nucleotídeos 4410000-4720000 (aqui incorporado como SEQ ID NO:2332).
Hibridização
[00407] Em algumas modalidades, a hibridização ocorre entre um composto antissenso divulgado neste documento e um ácido nucleico de GHR. O mecanismo mais comum de hibridação envolve a ligação de hidrogênio (por exemplo, De Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen invertida da ligação de hidrogênio) entre nucleobases complementares das moléculas de ácido nucleico.
[00408] A hibridização pode ocorrer sob condições variáveis. As condições rigorosas são dependentes da sequência e são determinadas pela natureza e composição das moléculas de ácido nucleico a serem hibridizadas.
[00409] Os métodos para determinar se uma sequência é especificamente hibridizável para um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso fornecidos neste documento são especificamente hibridizáveis com um ácido nucleico de GHR.
Complementariedade
[00410] Um composto antissenso e um ácido nucleico alvo são complementares uns aos outros quando um número suficiente de nucleobases do composto antissenso pode fazer uma ligação de hidrogênio com as nucleobases correspondentes do ácido nucleico alvo, de modo que ocorra um efeito desejado (por exemplo, inibição antissenso de um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de GHR).
[00411] Nucleobases não complementares entre um composto antissenso e um ácido nucleico de GHR podem ser toleradas desde que o composto antissenso permaneça capaz de hibridizar especificamente para um ácido nucleico alvo. Além disso, um composto antissenso pode hibridizar em um ou mais segmentos de ácido nucleico de GHR de modo que os segmentos adjacentes ou intermediários não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de loop, estrutura de incompatibilidade ou grampo de cabelo).
[00412] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso fornecidos neste documento, ou uma porção especificada um dos mesmos, são, são pelo menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% complementares a um ácido nucleico de GHR, uma região alvo, segmento alvo, ou porção especificada um dos mesmos. A complementaridade percentual de um composto antissenso com um ácido nucleico alvo pode ser determinada usando os métodos de rotina.
[00413] Por exemplo, um composto antissenso, no qual 18 de 20 nucleobases do composto antissenso são complementares para uma região alvo e, portanto, se hibridizaria especificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, as nucleobases não complementares restantes podem ser agrupadas ou intercaladas com nucleobases complementares e não precisam ser contíguas umas às outras ou às nucleobases complementares. Como tal, um composto antissenso o qual tem 18 nucleobases de comprimento, com quatro nucleobases não complementares que são flanqueadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo teria 77,8% de complementaridade geral com o ácido nucleico alvo e, assim, estaria dentro do escopo da presente invenção. A complementaridade percentual de um composto antissenso com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente, usando os programas BLAST (ferramentas de busca de alinhamento local básico) e os programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang e Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). A homologia percentual, a identidade de sequência ou a complementaridade podem ser determinadas, por exemplo, pelo programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando as configurações padrão, que usa o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[00414] Em certas modalidades, os compostos antissenso aqui proporcionados, ou porções dos mesmos especificado, são completamente complementares (isto é, 100% complementares) a um ácido nucleico alvo, ou porção especificada um do mesmo. Por exemplo, um composto antissenso pode ser totalmente complementar a um ácido nucleico de GHR, ou a uma região-alvo, ou a um segmento- alvo ou a uma sequência-alvo deste. Conforme usado neste documento, "totalmente complementar" significa que cada nucleobase de um composto antissenso é capaz de parear a base precisamente com as nucleobases correspondentes de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, um composto antissenso 20 de nucleobases é totalmente complementar para uma sequência-alvo que é de 400 nucleobases de comprimento, desde que haja uma parte 20 de nucleobases correspondente do ácido nucleico alvo que é totalmente complementar ao composto antissenso. Totalmente complementar também pode ser usado em referência a uma porção especificada um do primeiro e/ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma porção de 20 nucleobases de um composto antissenso de 30 nucleobases pode ser "totalmente complementar" a uma sequência-alvo que tem 400 nucleobases de comprimento. A porção de 20 nucleobases do oligonucleotídeo de 30 nucleobases é totalmente complementar à sequência-alvo, se a sequência-alvo tiver uma porção correspondente de 20 nucleobases, em que cada nucleobase é complementar à porção de 20 nucleobases do composto antissenso. Ao mesmo tempo, o composto antissenso de 30 nucleobases inteiro pode ou não ser totalmente complementar à sequência-alvo, dependendo de se as 10 nucleobases restantes do composto antissenso também forem complementares à sequência-alvo.
[00415] A localização de uma nucleobase não complementar pode estar na extremidade 5' ou na extremidade 3' do composto antissenso. Alternativamente, a nucleobase ou nucleobases não complementar pode estar em uma posição interna do composto antisenso. Quando duas ou mais nucleobases não complementares estão presentes, elas podem ser contíguas (isto é. ligada) ou não contíguas. Em uma modalidade, uma nucleobase não complementar está localizada no segmento de asa de um oligonucleotídeo antissenso de mero de lacuna.
[00416] Em certas modalidades, os compostos antissenso que têm, ou têm até 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que 1 nucleobase(s) não complementar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, como um ácido nucleico de GHR ou sua porção especificada.
[00417] Em certas modalidades, os compostos antissenso que têm, ou têm até 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2, ou não mais do que 1 nucleobase(s) não complementar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de GHR, ou porção especificada um do mesmo.
[00418] Os compostos antissenso fornecidos também incluem aqueles que são complementares a uma porção de um ácido nucleico alvo. Conforme usado neste documento, "porção" se refere a um número definido de nucleobases contíguas (ou seja, ligadas) dentro de uma região ou segmento de um ácido nucleico alvo. Uma "porção" também pode se referir a um número definido de nucleobases contíguas de um composto antissenso. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 8 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 9 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 10 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 11 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 12 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 13 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 14 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares a pelo menos uma porção de 15 nucleobases de um segmento alvo. Também são contemplados os compostos antissenso que são complementares a pelo menos uma porção de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleobases de um segmento-alvo, ou uma faixa definida por quaisquer dois desses valores.
Identidade
[00419] Os compostos antissenso fornecidos neste documento também podem ter uma identidade percentual definida para uma sequência nucleotídica particular, SEQ ID NO, ou composto representado por um número de Isis específico, ou porção dele. Conforme usado neste documento, um composto antissenso é idêntico à sequência divulgada neste documento se tiver a mesma capacidade de pareamento de nucleobase. Por exemplo, um RNA que contém uracil no lugar de timidina em uma sequência de DNA divulgada seria considerado idêntico à sequência de DNA, uma vez que ambos, uracila e timidina, pareiam com a adenina. Versões encurtadas e alongadas dos compostos antissenso descritos neste documento, bem como compostos tendo bases não idênticas em relação aos compostos antissenso fornecidos neste documento, também são contempladas. As bases não idênticas podem ser adjacentes umas às outras ou dispersas por todo o composto antissenso. A identidade percentual de um composto antissenso é calculada de acordo com o número de bases que têm pareamento de bases idêntico em relação à sequência a qual está sendo comparado.
[00420] Em certas modalidades, os compostos antissenso, ou porções dos mesmos, são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos a um ou mais dos compostos antissenso ou SEQ ID NOs, ou uma porção dos mesmos, divulgados neste documento.
[00421] Em certas modalidades, uma porção do composto antissenso é comparada com uma porção de igual comprimento do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleobases é comparada a uma porção de comprimento igual do ácido nucleico alvo.
[00422] Em certas modalidades, uma porção do oligonucleotídeo antissenso é comparada a porção de comprimento igual do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleobases é comparada a uma porção de comprimento igual do ácido nucleico alvo.
Modificações
[00423] Um nucleosídeo é uma combinação de base-açúcar. A porção de nucleobase (também conhecida como base) do nucleosídeo é normalmente uma porção de base heterocíclica. Os nucleotídeos são nucleosídeos que incluem adicionalmente um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo. Para os nucleosídeos que incluem um açúcar de pentofuranosila, o grupo fosfato pode ser ligado à porção de hidroxila em 2', 3' ou 5' do açúcar. Os oligonucleotídeos são formados através da ligação covalente dos nucleosídeos adjacentes um ao outro, para formar um oligonucleotídeo polimérico linear. Dentro da estrutura do oligonucleotídeo, os grupos fosfato são comumente referidos como formadores das ligações internucleosídeos do oligonucleotídeo.
[00424] As modificações dos compostos antissenso englobam substituições ou mudanças das ligações internucleosídeos, frações de açúcar, ou nucleobases. Os compostos antissenso modificados são frequentemente preferidos sobre as formas nativas devido a propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, maior absorção celular, maior afinidade para o ácido nucleico alvo, maior estabilidade na presença de nucleases, ou maior atividade inibitória.
[00425] Os nucleosídeos quimicamente modificados também podem ser empregados para aumentar a afinidade de ligação de um oligonucleotídeo anisense encurtado ou truncado a seu ácido nucleico alvo. Consequentemente, resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com compostos antissenso menores que possuem esses nucleosídeos quimicamente modificados.
Ligações Internucleosídeos Modificadas
[00426] A ligação internucleosídeos de ocorrência natural de RNA e DNA é uma ligação de fosfodiéster 3' para 5'. Compostos antissenso possuindo um ou mais modificado, isto é, de ocorrência não natural, são frequentemente selecionados sobre os compostos antissenso que têm ligações internucleosídeos de ocorrência natural, devido às propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, maior absorção celular, maior afinidade para os ácidos nucleicos alvos, e maior estabilidade na presença de nucleases.
[00427] Os oligonucleotídeos tendo ligações internucleosídeos modificadas incluem ligações internucleosídeos que mantêm um átomo de fósforo, bem como as ligações internucleosídeos que não têm um átomo de fósforo. As ligações internucleosídeos representativas contendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato, e fosforotioatos. Os métodos de preparação das ligações contendo fósforo e não contendo fósforo são bem conhecidos.
[00428] Em certas modalidades, os compostos antissenso direcionados para um ácido nucleico de GHR compreendem uma ou mais ligações internucleosídeos modificadas. Em certas modalidades, as ligações internucleosídeos modificadas são ligações de fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação internucleosídeos de um composto antissenso é uma ligação internucleosídeos de fosforotioato.
[00429] Em determinadas modalidades, oligonucleotídeos compõem ligações de internucleosídeo modificado dispostas ao longo do oligonucleotídeo, ou região do mesmo, em um padrão definido ou motivo de ligação de internucleosídeo modificado. Em certas modalidades, as ligações internucleosídicas são dispostas em um motivo incompleto. Nessas modalidades, as ligações de internucleosídeo em cada uma das duas regiões de asa são diferentes das ligações de internucleosídeo na região da lacuna. Em certas modalidades, as ligações de internucleosídeo nas asas são fosfodiéster e as ligações de internucleosídeo na lacuna são fosforotioato. O motivo nucleosídeo é selecionado, independentemente, de modo que esses oligonucleotídeos que têm uma ligação de internucleosídeo incompleta possam ou não possam ter um motivo de modificação nucleosídeo incompleto e, se ele tiver um motivo nucleosídeo incompleto, os comprimentos da asa e da lacuna podem ou não ser os mesmos.
[00430] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região com um motivo de ligação de internucleosídeo alternado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos da presente invenção compreendem uma região de ligações de internucleosídeo uniformemente modificadas. Em algumas dessas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma região que é uniformemente ligada por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é uniformemente ligado por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada liagação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é selecionado de fosfodiéster e fosforotioato e pelo menos uma ligação de internucleosídeo é fosforotioato.
[00431] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 6 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 8 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 10 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 6 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 8 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 10 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 12 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Nestas determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado em 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[00432] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais ligações de metilfosfonato. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos tendo um mero de lacuna motivo nucleosídeo compreende um motivo de ligação compreendendo todas as ligações fosforotioato, exceto por uma ou duas ligações metilfosfonato. Em certas modalidades, uma ligação metilfosfonato está na abertura central de um oligonucleotídeo possuindo um mero de lacuna motivo nucleosídeo.
[00433] Em certas modalidades, é desejável providenciar o número de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídeos fosfodiéster para manter a resistência à nuclease. Em certas modalidades, é desejável providenciar o número e posição de ligações internucleosídicas de fosforotioato e número e posição das ligações de internucleosídeos fosfodiéster para manter a resistência à nuclease. Em certas modalidades, o número de ligações de internucleosídeos de fosforotioato pode ser diminuído e o número de ligações de internucleosídeos de fosfodiéster pode ser aumentado. Em certas modalidades, o número de ligações de internucleosídeos de fosforotioato pode ser diminuído e o número de ligações de internucleosídeos de fosfodiéster pode ser aumentado enquanto ainda mantém a resistência nuclease. Em certas modalidades, é desejável diminuir o número de ligações de internucleosídeos fosforotioato, mantendo a resistência a nucleases. Em certas modalidades, é desejável aumentar o número de ligações de internucleosídeos fosfodiéster, mantendo a resistência a nucleases.
Frações de Açúcar Modificadas
[00434] Os compostos antissenso podem opcionalmente conter um ou mais nucleosídeos, em que o grupo de açúcar foi modificado. Esses nucleosídeos de açúcar modificado podem conferir maior estabilidade à nuclease, maior afinidade de ligação, ou alguma outra propriedade biológica benéfica para os compostos antissenso. Em certas modalidades, os nucleosídeos compreendem frações de anel de ribofuranose quimicamente modificado. Exemplos de anéis de ribofuranose quimicamente modificados incluem, sem limitação, a adição de grupos substituintes (incluindo grupos substituintes em 5' e 2', ligações em ponte de átomos de aneis não geminais para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), a substituição do átomo de oxigênio do anel de ribosil por S, N(R), ou C(R1)(R2) (R, R1 e R2 são cada um independentemente H, alquil C1-C12 ou um grupo protetor) e suas combinações. Exemplos de açúcares modificados incluem 2'-F 5'-metil- nucleosídeo substituído (ver Pedido PCT Internacional WO 2008/101157 publicado em 8/21/08 para outros descritos nucleosídicos 5 ', 2'-bis substituído) ou a substituição do ribosilo átomo de oxigénio do anel com S com substituição adicional na posição 2' (ver publicação US Pedido de Patente US2005-0130923, publicado em 16 de Junho, 2005) ou, alternativamente, 5'-substituição de um BNA (ver Pedido PCT Internacional WO 2007/134181 publicado em 11/22/07, em que o LNA é substituído com, por exemplo, um grupo 5'-metila ou 5'-vinila).
[00435] Os exemplos de nucleosídeos que têm frações de açúcar modificadas incluem, sem limitação de nucleosídeos compreendendo grupos substituintes 5'-vinila, 5'-metil (R ou S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'- OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F e 2'-O (CH2)2OCH3 . O substituinte na posição 2' pode também ser selecionado a partir de alila, amino, azido, tio, O- alila, alquil O-C1-C10 , OCF3, OCH2F, O (CH2)2SCH3, O (CH2)2-ON (Rm) (Rn), O-CH2-C (= O) -N (Rm) (Rn), e O-CH2-C (= O) -N (Rl)-(CH2)2-N (Rm) (Rn), em que cada Rl, Rm e Rn é, independentemente, H ou alquil substituído ou não substituído C1-C10 .
[00436] Conforme usado neste documento, os "nucleosídeos bicíclicos" se referem aos nucleosídeos modificados que compreendem uma porção de açúcar bicíclico. Exemplos de nucleosídeos bicíclicos incluem, sem limitação, os nucleosídeos que compreendem uma ponte entre os átomos 4' e 2' do anel de ribosil. Em certas modalidades, os compostos antissenso fornecidos neste documento incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte em 4' para 2'. Exemplos desses nucleosídeos bicíclicos em ponte 4' para 2' incluem, mas não estão limitados a, um das fórmulas: 4'-(CH2) -O-2'(LNA); 4'- (CH2) -S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH (CH3) -O-2' (também referida como acetato restringido ou CET) e 4'-CH (CH2OCH3) -O-2' (e seus análogos ver US Patente 7.399.845, emitido em 15 de julho de 2008); 4'-C (CH3)(CH3) -O-2' (e seus análogos ver Pedido de Patente Internacional Publicado WO 2009/006478, publicado 08 de janeiro de 2009); 4'-CH2-N (OCH3) -2' (E seus análogos ver Pedido de Patente Internacional Publicado WO/2008/150729, publicado 11 de dezembro, 2008); 4'-CH2-ON (CH3) -2' (Ver Pedido de Patente Publicado US US2004-0171570, publicado 02 de setembro de 2004); 4'-CH2-N (R) - O-2', em que R é H, alquil C1-C12 , ou um grupo de proteção (ver US Patente 7.427.672, emitido em 23 de setembro de 2008); 4'-CH2-C (H) (CH3) -2' (Ver Zhou et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); and 4'- CH2-C(=CH2)-2' (e seus análogos ver, Pedido Internacional PCT WO 2008/154401, publicado em 8 de dezembro de 2008).
[00437] Relatórios adicionais relacionados aos nucleosídeos bicíclicos podem também ser encontrados na literatura publicada (vide, por exemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 83628379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; e Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes U.S. Nos. 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; e 7,696,345; Publicação de Patente No. US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes U.S. Nos. de Série 61/026,995 e 61/097,787; pedidos internacionais publicados PCT WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; WO 2009/006478; WO 2010/036698; WO 2011/017521; WO 2009/067647; WO 20009/100320. Cada um dos nucleosídeos bicíclicos anteriores pode ser preparado tendo uma ou mais configurações de açúcar estereoquímico, incluindo, por exemplo, α-L-nbofuranose e β-D-ribofuranose (vide pedido internacional PCT PCT/DK98/00393, publicado em 25 de março de 1999 como WO 99/14226).
[00438] Em certas modalidades, frações de açúcar bicíclicos de nucleosídeos BNA incluem, mas não estão limitados aos compostos possuindo pelo menos uma ponte entre o 4' e da posição 2' da porção de açúcar pentofuranosila em que essas pontes compreendem, independentemente, 1 ou de 2 a 4 grupos ligados selecionados independentemente a partir de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N- , -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-e N(Ra)-;
[00439] em que:
[00440] x é 0, 1, ou 2;
[00441] n é 1, 2, 3 ou 4;
[00442] cada Ra e Rb é, independentemente, H, um grupo protetor,hidroxila, C1-C12alquila, C1-C12alquila substituída, C2-C12alquenila, C2- C12alquenila substituída, C2-C12alquinila, C2-C12alquinila substituída, C5- C20arila, C5-C20arila substituída, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, heteroarila, heteroarila substituída, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico substituído C5-C7, halogênio, JO1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C (= O) -H), acila substituída, CN, sulfonil (S (= O)2-J1), ou sulfoxil (S (= O) -J1); e
[00443] cada J1 e J2 é, independentemente, H, C1-C12alquila, C1- C12alquila substituída, C2-C12alquenila, C2-C12alquenila substituída, C2- C12alquinila, C2-C12alquinila substituída, C5-C20arila, C5-C20arila substituída, acil (C(=O)-H), acila substituída, um radical heterocíclico, um radical heterociclo substituído, C1-C12aminoalquila, C1- C12aminoalquila substituída ou um grupo protetor.
[00444] Em certas modalidades, a ponte de uma porção de açúcar bicíclica é -[C(Ra)(Rb)]n-, - [C(Ra)(Rb)]n-O-, -C (RaRb)-N(R)-O- ou - C(RaRb)-ON(R)-. Em certas modalidades, a ponte é 4'-CH2-2', 4' - (CH2)2-2', 4' - (CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4' -(CH2)2-O-2', 4'-CH2-ON (R)-2' e 4'-CH2-N(R)-O-2' em que cada R é, independentemente, H, um grupo protetor ou C1-C12alquila.
[00445] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são definidos ainda pela configuração isomérica. Por exemplo, um nucleosídeo compreendendo uma ponte de 4'-2'-metileno-oxi, pode estar na configuração a-L ou na configuração β-D. Anteriormente, o BNA de a-L-metileno-óxi (4'-CH2-O-2‘) foram incorporados aos oligonucleotídeos antissenso que mostraram atividade antissenso (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[00446] Em certas modalidades, nucleosídeos bicíclicos incluem, mas não estão limitados a, (a) a-L-metileno-oxi (4'-CH2-O-2')BNA, (B) D-β-metileno-oxi (4'-CH2-O-2')BNA, (C) etileno-oxi(4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) amino-oxi (4'-CH2-ON (R) -2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N (R) -O- 2') BNA, e (F) metil (metileno-oxi) (4'-CH (CH3)-O-2') BNA, (G) metileno- tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metileno-amino (4'-CH2-N (R)-2') BNA, (I) carbocíclico metil (4'-CH2-CH (CH3) -2') BNA, (J) carbocíclico propileno (4' - (CH2)3-2') BNA e (K) vinil BNA como representado abaixo:
Figure img0016
[00447] em que Bx é a porção base e o símbolo R representa, independentemente, H, um grupo protetor, C1-C12alquila ou C1- C12alcóxi.
[00448] Em certas modalidades, nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula I:
Figure img0017
[00449] em que:
[00450] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00451] -Qa-Qb-Qc- is -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- ou -N(Rc)-O-CH2;
[00452] Rc é C1-C12alquila ou um grupo protetor de amino; e
[00453] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00454] Em certas modalidades, nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula II:
Figure img0018
[00455] em que:
[00456] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00457] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte;
[00458] Za é C1-C6alquila, C2-C6alquenila, C2-C6alquinila, C1- C6alquila substituída, C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila substituída, acila, acila substituída, amida substituída, tiol ou tio substituído.
[00459] Em uma modalidade, cada um dos grupos substituídos é, independentemente, mono ou poli substituído com grupos substituintes independentemente selecionados a partir de halogênio, oxo, hidroxila, JOc, NJcJd, SJc, N3, OC (= X) Jc, e NJeC (= X) NJcJd, em que cada símbolo Jc, Jd e Je é, independentemente, H, C1-C6alquila, ou C1- C6alquila substituída e X é O ou NJc.
[00460] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula III:
Figure img0019
em que:
[00461] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00462] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte;
[00463] Zb é C1-C6alquila, C2-C6alquenila, C2-C6alquinila, C1- C6alquila substituída, C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila substituída ou acil substituído (C(=O)-).
[00464] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula IV:
Figure img0020
[00465] em que:
[00466] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00467] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte;
[00468] Rd é C1-C6alquila, C1-C6alquila substituída, C2-C6alquenila , C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila ou C2-C6alquinila substituída;
[00469] cada qa, qb, qc e qd é, independentemente, H, halogênio, C1- C6alquila , C1-C6alquila substituída, C2-C6alquenila, C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila ou C2-C6alquinila substituída, C1-C6alcoxila, C1-C6alcoxila substituída, acila, C1-C6acila substituída C1-C6 aminoalquila substituída ou C1-C6aminoalquila;
[00470] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula V:
Figure img0021
[00471] em que:
[00472] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00473] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte;
[00474] qa, qb, qe e Qf são cada um, independentemente, hidrogênio, halogênio, C1-C12alquila, C1-C12alquila substituída, C2-C12alquenila, C2- C12alquenila substituída, C2-C12alquinila, C2-C12alquinila substituída, C1- C12alcóxi, C1-C12alcóxi substituído, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk ou N(H)C(=S)NJjJk;
[00475] ou qe e qf em conjunto são = C(Qg)(qh);
[00476] qg e qh são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C12alquila ou C1-C12alquila substituída.
[00477] A síntese e a preparação de monômeros de adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina e uracila de BNA de metileno- óxi (4'-CH2-O-2'), juntamente com sua oligomerização, e propriedades de reconhecimento de ácido nucleico têm sido descritos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Os BNAs e a preparação dos mesmos também são descritos no WO 98/39352 e WO 99/14226.
[00478] Os análogos do BNA de metileno-oxi (4'-CH2-O-2') e BNAs de 2'-tio, também foram preparados (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). A preparação de análogos de nucleosídeos bloqueados compreendendo duplexes de oligodesoxirribonucleotídeo como substratos para as polimerases de ácido nucleico também foi descrita (Wengel et al., WO 99/14226). Além disso, a síntese de 2'- amino-BNA, um novo análogo de oligonucleotídeo de alta afinidade conformacionalmente restrito, foi descrita na técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Além disso, 2'-amino e 2'-metilamino- BNA's foram preparados e a estabilidade térmica dos seus duplexes com fitas de RNA e DNA complementares foi relatada anteriormente.
[00479] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos tendo a Fórmula VI:
Figure img0022
em que:
[00480] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00481] Ta e Tb são, cada um, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte;
[00482] cada qi, qj, qk e ql é, independentemente, Hidrogênio, halogênio, C1-C12alquila, C1-C12alquila substituída, C2-C12alquenila, C2- C12alquenila substituída, C2-C12alquinila, C2-C12alquinila substituída, C1- C12alcóxi, C1-C12alcóxi substituído, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk ou N(H)C(=S)NJjJk; e
[00483] qi e qj ou ql e qk em conjunto são = C(qg)(qh), em que qg e qh são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C12alquila ou C1- C12alquila substituída.
[00484] Um nucleosídeo carbocíclico bicíclico tendo uma ponte 4'- (CH2)3-2' e o alquenil analógico da ponte 4'-CH = CH-CH2-2' foram descritos (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 44294443 and Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). A síntese e a preparação dos nucleosídeos bicíclicos carbocíclicos juntamente com seus estudos bioquímicos e de oligomerização também foram descritos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 83628379).
[00485] Conforme usado neste documento, "nucleosídeo bicíclico 4'2'" ou "nucleosídeo bicíclico 4' para 2'" se refere a um nucleosídeo bicíclico compreendendo um anel de furanose compreendendo uma ponte que conecta dois átomos de carbono do anel de furanose conecta o átomo de carbono 2' e o átomo de carbono 4' do anel de açúcar.
[00486] Conforme usado neste documento, "nucleosídeos monocíclicos" se refere aos nucleosídeos que compreendem frações de açúcar modificado que não sejam frações de açúcar bicíclico. Em certas modalidades, a porção de açúcar, ou análogo da porção de açúcar, de um nucleosídeo pode ser modificado ou substituído em qualquer posição.
[00487] Conforme usado neste documento, "açúcar modificado 2'" significa um açúcar de furanosila modificado na posição 2'. Em certas modalidades, tais modificações incluem substituintes selecionados a partir de: um haleto, incluindo, mas não se limitando a alcóxi substituído e e não substituído, tioalquila substituída e não substituída, amino alquila substituída e não substituída, alquila substituída e não substituída, alila substituída e não substituída, e alquinila substituída e não substituída. Em certas modalidades, as modificações 2' são selecionadas a partir de substituintes incluindo, mas não se limitando a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, em que n e m são de 1 a cerca de 10. Outros grupos de substituinte 2' também podem ser selecionados a partir de: alquila, alquila substituída, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcaril ou C1-C12O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituído, um grupo clivagem do RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um composto antissenso, e outros substituintes tendo propriedades semelhantes. Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados compreendem uma cadeia lateral 2'-MOE ((Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Essa substituição de 2'-MOE foi descrita como tendo melhor afinidade de ligação em comparação com os nucleosídeos não modificados e com outros nucleosídeos modificados, tais como 2'-O-metila, O-propila, e O- aminopropila. Os oligonucleotídeos tendo o substituinte 2'-MOE também foram mostrados como sendo inibidores antissenso da expressão do gene com características promissoras para uso in vivo use (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; and Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[00488] Conforme usado neste documento, um "nucleosídeo de tetra-hidropirano modificado" ou "nucleosídeo de THP modificado" significa um nucleosídeo tendo um "açúcar" de tetra-hidropirano de seis membros substituído pelo resíduo de pentofuranosila nos nucleosídeos normais (um substituto do açúcar). Os nucleosídeos de THP modificados incluem, mas não estão limitados a, o que é referido na técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (vide Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) ou flúor HNA (F-HNA) possuindo um sistema de anel de tetra-hidropirano, como ilustrado abaixo:
Figure img0023
[00489] Em certas modalidades, substitutos de açúcar são selecionados com a Fórmula VII:
Figure img0024
[00490] em que independentemente para cada um do referido pelo menos um análogo de nucleosídeo de tetra-hidropirano de Fórmula VII:
[00491] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00492] Ta e Tb são, independentemente, um grupo de ligação internucleosídica que liga o análogo de nucleosídeo de tetra-hidropirano ao composto antissenso ou Ta e Tb são um grupo de ligação internucleosídica que liga o análogo de nucleosídeo de tetra-hidropirano ao composto antissenso e outros Ta e Tb são H, um grupo protetor de hidroxila, um grupo conjugado ligado, ou um grupo terminal 5' ou 3';
[00493] q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um, independentemente,H, C1-C6alquila, C1-C6alquila substituída, C2-C6alquenila, C2-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila, ou C2-C6alquinila substituída; e cada um de R1 e R2 é selecionado a partir de hidrogênio, hidroxila, halogênio, alcóxi substituído ou não substituído, NJ1J2, SJ1, N3, OC (= X) J1, OC (= X) NJ1J2, NJ3C (= X) NJ1J2 e CN, em que X é O, S ou NJ1 e cada símbolo J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou C1-C6alquila.
[00494] Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados THP de fórmula VII em que q são fornecidos1, q2, q3, q4, q5, q6e q7 são cada um H. Em certas modalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é diferente de H. Em certas modalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6e q7 é metil. Em certas modalidades, nucleosídeos THP da Fórmula VII são proporcionados em que um de R1 e R2é flúor. Em certas modalidades, R1 é flúor e R2é H; R1 é metóxi e R2é H, e R1 é metoxietóxi e R2 é H.
[00495] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem anéis com mais de 5 átomos e mais de um heteroátomo. Por exemplo, os nucleosídeos que compreendem frações de açúcar de morfolino e seu uso em compostos oligoméricos foram mencionados (ver, por exemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; e Patentes U.S. 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; e 5.034.506). Como usado neste documento, o termo "morfolino" se refere a um substituto de açúcar com a seguinte fórmula:
Figure img0025
[00496] Em determinadas modalidades, os morfolinos podem ser modificados, por exemplo, pelo acréscimo ou alteração de vários grupos substituintes da estrutura do morfolino acima. Esses substitutos do açúcar são mencionados neste documento como "morfolinos modificados".
[00497] Combinações de modificações também são fornecidas sem limitação, tais como nucleosídeos de metil substituído 2'-F-5' (ver Pedido PCT Internacional WO 2008/101157 publicado em 8/21/08 para outros descritos nucleosídeos 5', 2'-bis substituído) e substituição do anel de ribosil átomo de oxigênio com S e outra substituição na posição 2' (ver Pedido de Patente Publicado US US2005-0130923, publicado em 16 de junho, 2005) ou, alternativamente, 5'-substituição de um ácido nucleico bicíclico (ver Pedido PCT Internacional WO 2007/134181, publicado em 11/22/07, em que um 4'-CH2-O-2 'nucleosídeo bicíclico é ainda substituído na posição 5' com um grupo 5'-metila ou 5'-vinila). A síntese e preparação de nucleosídeos bicíclicos carbocíclicos juntamente com seus estudos bioquímicos e de oligomerização também foram descritos (ver, por exemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
[00498] Em certas modalidades, os compostos antissensos compreendem um ou mais nucleosídeos ciclo-hexenila modificados, que é um nucleosídeo possuindo uma ciclo-hexenila seis membros no lugar do resíduo pentofuranosil em nucleosídeos que ocorrem naturalmente. Nucleosídeos ciclo-hexenil modificados incluem, mas não estão limitados aos descritos na técnica (ver, por exemplo, de propriedade comum, pedido PCT publicado WO 2010/036696, publicado em de abril, 10, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 93409348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(57), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Pedido PCT publicado, documento WO 06/047842; e Pedido PCT publicado WO 01/049687; o texto de cada um é aqui incorporado por referência, na sua totalidade). Nucleosídeos de ciclo-hexenila modificados têm a Fórmula X.
Figure img0026
[00499] em que, independentemente, para cada um dentre dito pelo menos um análogo de nucleosídeo de ciclo-hexenila da Fórmula X:
[00500] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00501] T3 e T4 são cada um, independentemente, um grupo de ligação de internucleosídeo ligando o análogo de nucleosídeo de ciclo- hexenil a um composto antissenso ou um dentre T3 e T4 é um grupo de ligação de internucleosídeo ligando o análogo de nucleosídeo de tetra- hidropirano a um composto antissenso e o outro deentre T3 e T4 é H, um grupo protetor de hidroxila, um grupo conjugado ligado, ou um grupo 5'- ou 3'-terminal; e
[00502] q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 e q9 são cada um, independentemente, H, C1-C6alquila, C1-C6alquila substituída, C2- C6alquenila, C1-C6alquenila substituída, C2-C6alquinila, C2-C6alquinila substituída ou outro grupo substituinte de açúcar.
[00503] Conforme usado neste documento, "modificado em 2'" ou "substituído em 2'" se refere a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um substituinte na posição 2' diferente de H ou OH. nucleosídeos 2'-modificados, incluem, mas não estão limitados aos nucleosídeos bicíclicos em que a ponte de ligação entre dois átomos de carbono do anel de açúcar conecta o carbono 2' e do outro carbono do anel de açúcar; e nucleosídeos com 2' substituíntes sem ponte, como aliIa, amino, azido, tio, O-alila, alquil O-C1-C10 , -OCF3, O- (CH2)2-O-CH3, 2'-O (CH2)2SCH3, O- (CH2)2-ON (Rm) (Rn), Ou O-CH2-C (= O) -N (Rm) (Rn), em que cada Rm e Rn é, independentemente, H ou alquil substituído ou não substituído C1-C10 . Os nucleosídeos modificados em 2' podem compreender ainda outras modificações, por exemplo, em outras posições do açúcar e/ou na nucleobase.
[00504] Conforme usado neste documento, "2'-F" se refere a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um grupo flúor na posição 2' do anel de açúcar.
[00505] Conforme usado neste documento, "2'-OMe" ou "2'-OCH3" ou 2'-O-metil", cada um se refere a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um grupo -OCH3 na posição 2' do anel de açúcar.
[00506] Como usado neste documento, "MOE" ou "2'- MOE " ou "2'- OCH2CH2OCH3" ou " 2'-O-metoxietila", cada um, refere-se a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um grupo - OCH2CH2OCH3 na posição 2' do anel de açúcar.
[00507] Como usado neste documento, "oligonucleotídeo" se refere a um composto compreendendo uma pluralidade de nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, um ou mais da pluralidade de nucleosídeos são modificados. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um ou mais ribonucleosídeos (RNA) e/ou desoxirribonucleosídeos (DNA).
[00508] Muitos outros sistemas de anel de substituto de açúcar biciclo e triciclo também são conhecidos na técnica que podem ser usados para modificar os nucleosídeos para a incorporação nos compostos antissenso (vide, por exemplo, artigo de revisão: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tais sistemas de anel podem se submeter a várias substituições adicionais para intensificar a atividade.
[00509] Os métodos para as preparações de açúcares modificados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Algumas patentes U.S. representantes que ensinam a preparação de tais açúcares modificados incluem, sem limitação, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 e 6.600.032 e Pedido Internacional PCT/US2005/019219, depositado em 2 de junho de 2005 e publicado como WO 2005/121371 em 22 de dezembro de 2005, e cada uma das quais é neste documento incorporada por referência na sua totalidade.
[00510] Nos nucleotídeos tendo frações de açúcar modificado, as frações de nucleobase (natural, modificada ou uma combinação destas) são mantidas para a hibridização com um alvo de ácido nucleico apropriado.
[00511] Em certas modalidades, os compostos antissenso compreendem um ou mais nucleosídeos tendo frações de açúcar modificado. Em certas modalidades, a porção de açúcar modificado é 2'-MOE. Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados em 2'- MOE são dispostos em um motivo de mero de lacuna. Em certas modalidades, a porção de açúcar modificado é um nucleosídeo bicíclico tendo um grupo ponte (4'-CH(CH3)-O-2'). Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados de (4'-CH(CH3)-O-2') são dispostos ao longo das asas de um motivo de mero de lacuna.
Nucleobases Modificadas
[00512] As modificações ou substituições de nucleobase (ou base) são estruturalmente distinguíveis, e funcionalmente permutáveis com, nucleobases não modificadas sintéticas ou de ocorrência natural. As nucleobases naturais e modificadas são capazes de participar da ligação de hidrogênio. Essas modificações de nucleobase podem conferir estabilidade à nuclease, afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica para os compostos antissenso. As nucleobases modificadas incluem nucleobases sintéticas e naturais, tal como, por exemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas substituições de nucleobase, incluindo substituições de 5-metilcitosina, são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação de um composto antissenso por um ácido nucleico alvo. Por exemplo, as substituições de 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucleico por 0,6-1,2°C (Sanghvi, YS, Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[00513] As nucleobases modificadas adicionais incluem 5- hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracila e citosina e outros derivados de alquinila de bases de pirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracil(pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8- amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo, particularmente, 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2- F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7- deazaguanina e 7-deaza-adenina e 3-deazaguanina e 3-deaza- adenina.
[00514] As frações de base heterocíclicas também podem incluir aquelas em que a base purina ou pirimidina é substituída por outros heterocíclicos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2- aminopiridina e 2-piridona. As nucleobases que são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos antissenso incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas substituídas N-2, N-6 e 6-O, incluindo 2 aminopropiladenina, 5- propiniluracila e 5-propinilcitosina.
[00515] Em certas modalidades, os compostos antissenso direcionados para um ácido nucleico de GHR compreendem uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso de lacuna ampliada ou encurtada ou direcionados para um ácido nucleico de GHR compreendem uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma 5-metilcitosina.
Compostos Antissenso Conjugados
[00516] Em determinadas modalidades, a presente descrição fornece compostos antissenso conjugados. Em determinadas modalidades, a presente descrição fornece compostos antissenso conjugados, compreendendo o oligonucleotídeo antissenso complementar a um transcrito de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, a presente descrição fornece métodos que compreendem o contato de uma célula com um composto antissenso conjugado compreendendo um oligonucleotídeo antissenso complementar a um transcrito de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, a presente descrição fornece métodos que compreendem o contato de uma célula com um composto antissenso conjugado compreendendo um oligonucleotídeo antissenso e reduzindo a quantidade ou a atividade de um transcrito de ácido nucleico em uma célula.
[00517] O receptor da asialoglicoproteína (ASGP-R) foi descrito anteriormente. Consulte, por exemplo, Park et al., PNAS vol. 102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). Esses receptores são expressos em células do fígado, particularmente hepatócitos. Além disso, verificou-se que compostos compreendendo aglomerados de três ligantes de N- acetilgalactosamina (GalNAc) são capazes de ligação ao ASGP-R, resultando em absorção do composto para a célula. Consulte, por exemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, pp. 5216-5231 (May 2008). Nesse sentido, os conjugados compreendendo esses agrupamentos de GalNAc têm sido utilizados para facilitar a absorção de certos compostos nas células do fígado, especificamente nos hepatócitos. Por exemplo, foi mostrado que certos conjugados contendo GalNAc aumentam a atividade de compostos de siRNA dúplex nas células do fígado in vivo. Em tais casos, o conjugado contendo GalNAc está normalmente ligado à fita senso do siRNA dúplex. Uma vez que a fita senso é descartada antes que a fita antissenso se hibridize, enfim, no ácido nucleico alvo, há pouca preocupação de que o conjugado interfira na atividade. Normalmente, o conjugado é ligado à extremidade 3' da fita senso do siRNA. Consulte, por exemplo, Patente No. US 8.106.022. Certos grupos de conjugados descritos neste documento são mais ativos e/ou mais fáceis de sintetizar do que os grupos de conjugados descritos anteriormente.
[00518] Em determinadas modalidades da presente invenção, os conjugados são ligados aos compostos antissenso de fita única, incluindo, mas não se limitando a compostos antissenso baseados em RNase H e compostos antissensos que alteram o splicing de um ácido nucleico alvo de pré-mRNA. Em tais modalidades, o conjugado deve permanecer ligado ao composto antissenso tempo suficiente para fornecer o benefício (absorção melhorada nas células) mas em seguida deve ser clivado, ou de outra forma para não interferir nas etapas subsequentes necessárias para a atividade, tais como a hibridização de um ácido nucleico alvo e a interação com a RNase H ou com enzimas associadas ao splicing ou à modulação por splice. Esse equilíbrio de propriedades é mais importante na configuração dos compostos antissenso de fiar única do que nos compostos de siRNA, em que o conjugado pode simplesmente estar ligado à fita senso. Divulgados neste documento estão os compostos antissenso de fita única conjugados tendo potência melhorada nas células do fígado in vivo em comparação com o mesmo composto antissenso em que falta o conjugado. Dado o equilíbrio necessário das propriedades para esses compostos, tal potência melhorada é surpreendente.
[00519] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem neste documento uma porção clivável. Como observado, sem querer estar vinculado pelo mecanismo, é lógico que o conjugado deve permanecer no composto tempo suficiente para proporcionar melhoria na absorção, mas após isso, é desejável que uma alguma parte ou, idealmente, a totalidade do conjugado seja clivada, liberando o composto de origem (por exemplo, composto antissenso) em sua forma mais ativa. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleosídeo clivável. Tais modalidades tiram proveito de nucleases endógenas na célula, ligando o resto do conjugado (o grupo) ao oligonucleotídeo antissenso através de um nucleosídeo através de uma ou mais ligações cliváveis, tais como aquelas de uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo está ligado ao nucleosídeo clivável através de uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o nucleosídeo clivável está ligado ao oligonucleotídeo antissenso (composto antissenso) por uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo conjugado pode compreender dois ou três nucleosídeos cliváveis. Em tais modalidades, tais nucleosídeos cliváveis estão ligados um ao outro, ao composto antissenso e/ou ao grupo por meio de ligações cliváveis (tais como aquelas de uma ligação fosfodiéster). Certos conjugados neste documento não compreendem um nucleosídeo clivável e, em vez disso, compreendem uma ligação clivável. É mostrado que a clivagem suficiente do conjugado a partir do oligonucleotídeo é proporcionada por pelo menos uma ligação que é vulnerável à clivagem na célula (uma ligação clivável).
[00520] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são profármacos. Tais profármacos são administrados a um animal e são, enfim, metabolizados em uma forma mais ativa. Por exemplo, os compostos antissenso conjugados são clivados para remover a totalidade ou parte do conjugado resultando na forma ativa (ou mais ativa) do composto antissenso em que falta a totalidade ou uma parte do conjugado.
[00521] Em determinadas modalidades, os conjugados são ligados na extremidade 5' de um oligonucleotídeo. Alguns desses conjugados 5' são clivados mais eficientemente do que as contrapartes tendo um grupo conjugado semelhante ligado à extremidade 3'. Em determinadas modalidades, a atividade melhorada pode se correlacionar com a clivagem melhorada. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado na extremidade 5' tem maior eficácia do que os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado na extremidade 3' (ver, por exemplo, Exemplos, 56, 81, 83 e 84). Além disso, a ligação em 5' permite uma síntese mais simples do oligonucleotídeo. Normalmente, os oligonucleotídeos são sintetizados em um suporte sólido na direção 3' para 5'. Para fazer o oligonucleotídeo conjugado em 3', normalmente, liga-se um nucleosídeo pré-conjugado 3' ao suporte sólido e então monta-se o oligonucleotídeo como de costume. No entanto, a ligação desse nucleosídeo conjugado ao suporte sólido adiciona uma complicação à síntese. Além disso, usando essa abordagem, o conjugado está então presente em toda a síntese do oligonucleotídeo e pode tornar-se degradado durante as etapas subsequentes ou pode limitar os tipos de reações e reagentes que podem ser usados. Usando as estruturas e as técnicas descritas neste documento para oligonucleotídeos conjugados em 5', pode-se sintetizar o oligonucleotídeo usando técnicas padrão automatizadas e introduzir o conjugado com o nucleosídeo (mais extremo em 5') final ou depois do oligonucleotídeo ter sido clivado do suporte sólido.
[00522] Tendo em vista a técnica e a presente descrição, um versado na técnica pode facilmente fabricar qualquer um dos conjugados e oligonucleotídeos conjugados neste documento. Além disso, a síntese de tais conjugados e oligonucleotídeos conjugados divulgados neste documento é mais fácil e/ou requer algumas etapas, e é, portanto, menos caro do que a dos conjugados anteriormente divulgados, oferecendo vantagens na fabricação. Por exemplo, a síntese de certos grupos de conjugado consiste em menos etapas sintéticas, resultando em aumento de rendimento, em relação aos grupos de conjugado descritos anteriormente. Grupos conjugados tais como GalNAc3-10 no Exemplo 46 e no Exemplo 48 GalNAc3-7 são muito mais simples do que os conjugados anteriormente descritos, tais como os descritos em US 8106022 ou US 7262177 que requerem montagem de mais produtos químicos intermediários. Por conseguinte, esses e outros conjugados descritos neste documento têm vantagens sobre os compostos descritos anteriormente para uso com qualquer oligonucleotídeo, incluindo oligonucleotídeos de fita única e qualquer fita de oligonucleotídeos de fita dupla (por exemplo, siRNA).
[00523] De forma semelhante, são divulgados neste documento grupos de conjugado tendo apenas um ou dois ligantes de GalNAc. Como mostrado, tais grupos de conjugados melhoram a atividade dos compostos antissenso. Tais compostos são mais fáceis de preparar do que os conjugados compreendendo três ligantes de GalNAc. Os grupos de conjugado que compreendem um ou dois ligantes de GalNAc podem estar ligados a quaisquer compostos antissenso, incluindo oligonucleotídeos de fita única e qualquer fita de oligonucleotídeos de fita dupla (por exemplo, siRNA).
[00524] Em determinadas modalidades, os conjugados neste documento não alteram substancialmente certas medidas de tolerabilidade. Por exemplo, é mostrado neste documento que os compostos antissenso conjugados não são mais imunogênicos do que os compostos de origem não conjugados. Uma vez que a potência é melhorada, as modalidades, em que a tolerabilidade permanece a mesma (ou de fato, mesmo se a tolerabilidade piorar apenas ligeiramente em comparação com os ganhos de potência), têm propriedades melhoradas para a terapia.
[00525] Em determinadas modalidades, a conjugação permite alterar os compostos antissenso de formas a ter consequências menos atraentes na ausência de conjugação. Por exemplo, em determinadas modalidades, a substituição de uma ou mais ligações de fosforotioato de um composto antissenso totalmente de fosforotioato com ligações fosfodiéster resulta na melhoria de algumas medidas de tolerabilidade. Por exemplo, em certos casos, tais compostos antissenso, que têm um ou mais fosfodiéster, são menos imunogênicos do que o mesmo composto, em que cada ligação é um fosforotioato. No entanto, em certos casos, conforme mostrado no Exemplo 26, essa mesma substituição de uma ou mais ligações fosforotioato com ligações fosfodiéster também resulta em uma absorção celular reduzida e/ou perda de potência. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados descritos neste documento toleram tal mudança em ligações com pouca ou nenhuma perda na absorção e potência quando comparados com a contraparte de fosforotioato inteira conjugada. Na verdade, em determinadas modalidades, por exemplo, nos Exemplos 44, 57, 59 e 86, os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado e, pelo menos, uma ligação internuclesídica de fosfodiéster, na verdade, exibem um aumento de potência in vivo, até mesmo em relação a uma contraparte de fosforotioato completo compreendendo também o mesmo conjugado. Além disso, uma vez que conjugação resulta em aumentos substanciais na absorção/potência uma pequena perda em que o ganho substancial pode ser aceitável para alcançar tolerância melhorada. Por conseguinte, em determinadas modalidades, compostos antissenso conjugados compreendem pelo menos uma ligação fosfodiéster.
[00526] Em determinadas modalidades, a conjugação de compostos antissenso resulta, neste documento, em maior distribuição, absorção e atividade nos hepatócitos. Assim, mais composto é distribuído para o tecido hepático. No entanto, em determinadas modalidades, a distribuição aumentada sozinha não explica o aumento todo na atividade. Em algumas dessas modalidades, mais compostos entram nos hepatócitos. Em determinadas modalidades, mesmo que o aumento da absorção de hepatócitos não explique o aumento total na atividade. Em tais modalidades, a absorção produtiva do composto conjugado é aumentada. Por exemplo, como mostrado no Exemplo 102, determinadas modalidades dos conjugados contendo GalNAc aumentam o enriquecimento dos oligonucleotídeos antissenso em hepatócitos versus células não parenquimatosas. Este enriquecimento é benéfico para os oligonucleotídeos que se direcionam aos genes que são expressos nos hepatócitos.
[00527] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados neste documento resultam na exposição reduzida do rim. Por exemplo, como mostrado no Exemplo 20, as concentrações dos oligonucleotídeos antissenso compreendendo determinadas modalidades de conjugados contendo GalNAc são inferiores no rim do que a dos oligonucleotídeos antissenso sem um conjugado contendo GalNAc. Há várias implicações terapêuticas benéficas. Para indicações terapêuticas em que não se busca a atividade no rim, a exposição do rim arrisca a toxicidade renal, sem benefício correspondente. Além disso, a alta concentração no rim geralmente resulta na perda do composto na urina resultando em uma depuração mais rápida. Nesse sentido, para alvos não renais, o acúmulo renal é indesejado.
[00528] Em determinadas modalidades, a presente descrição fornece compostos antissenso conjugados representados pela fórmula:
Figure img0027
[00529] em que
[00530] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00531] B é a porção clivável
[00532] C é o ligante do conjugado
[00533] D é o grupo de ramificação
[00534] cada E é uma corrente;
[00535] cada F é um ligante; e
[00536] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00537] No diagrama acima e nos diagramas similares neste documento, o grupo de ramificação "D" ramifica-se tantas vezes quanto for necessário para acomodar o número dos grupos (E-F), conforme indicado pelo "q". Assim, em que q=1, a fórmula é:
Figure img0028
[00538] em que q = 2, a fórmula é:
Figure img0029
[00539] em que q = 3, a fórmula é:
Figure img0030
[00540] em que q = 4, a fórmula é:
Figure img0031
[00541] em que q = 5, a fórmula é:
Figure img0032
[00542] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:
Figure img0033
[00543] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:
Figure img0034
[00544] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:
Figure img0035
[00545] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:
Figure img0036
[00546] A presente descrição apresenta as seguintes modalidades não limitantes numeradas:
[00547] Modalidade 1. O composto antissenso conjugado de qualquer uma das modalidades 1179 a 1182, em que a corrente tem uma estrutura selecionada dentre:
Figure img0037
[00548] em que cada n é, independentemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.
[00549] Modalidade 2. O composto antissenso conjugado de qualquer uma das modalidades 1179 a 1182, em que a corrente tem a estrutura:
Figure img0038
[00550] Modalidade 3. O composto antissenso conjugado de qualquer uma das modalidades 1179 a 1182 ou 1688 a 1689, em que o ligante tem uma estrutura selecionada dentre:
Figure img0039
[00551] Modalidade 4. O composto antissenso conjugado de qualquer uma das modalidades 1179 a 1182 ou 1688 a 1689, em que o ligante tem uma estrutura selecionada dentre:
Figure img0040
[00552] em que cada n é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.
[00553] Modalidade 5. O composto antissenso conjugado de qualquer uma das modalidades 1179 a 1182 ou 1688 a 1689, em que o ligante tem a estrutura:
Figure img0041
[00554] Em modalidades que têm mais de uma variável específica (por exemplo, mais de um "m" ou "n"), salvo indicação em contrário, cada uma dessa variável específica é selecionada independentemente. Assim, para uma estrutura que tem mais de um n, cada n é selecionado de forma independente assim, eles podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.
i. Determinadas Frações Cliváveis
[00555] Em determinadas modalidades, uma porção clivável é uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, uma porção clivável compreende uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, o grupo conjugado compreende uma porção clivável. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada ao oligonucleotídeo antissenso. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada diretamente a porção de direcionamento de célula. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada ao ligante conjugado. Em determinadas modalidades, a porção compreende um fosfato ou fosfodiéster. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleosídeo clivável ou nucleosídeo análogo. Em determinadas modalidades, o nucleosídeo ou nucleosídeo análogo compreende uma base heterocíclica opcionalmente protegida, selecionada a partir de uma purina, purina substituída, pirimidina ou pirimidina substituída. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleosídeo que compreende uma base heterocíclica opcionalmente protegida selecionada de uracila, timina, citosina, 4-N- benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6- N-benzoiladenina, guanina e 2-N-isobutirilguanina. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-deoxinucleosídeo que é afixado à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster ou fosforotioato. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-deoxi adenosina que é afixada à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixada ao ligante por uma ligação fosfodiéster ou fosforotioato. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-deoxi adenosina que é afixado à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster.
[00556] Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixada à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada à posição 5' do oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixada à posição 2' do oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, a porção clivável é anexado ao oligonucleotídeo antissenso por uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixada ao ligante por uma ligação fosforotioato ou um fosfodiéster. Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo conjugado não inclui uma porção clivável.
[00557] Em determinadas modalidades, a porção clivável é clivada depois que o complexo foi administrado a um animal somente após ser interiorizado por uma célula alvo. Dentro da célula a porção clivável é clivada liberando, desta forma, o oligonucleotídeo antissenso ativo. Embora não seja destinado a ser limitado pela teoria, acredita-se que a porção clivável é clivada por uma ou mais nucleases dentro da célula. Em determinadas modalidades, a uma ou mais nucleases clivam a ligação de fosfodiéster entre a porção clivável e o ligante. Em determinadas modalidades, a porção clivável tem uma estrutura selecionada dentre os seguintes:
Figure img0042
em que cada um dos Bx, Bx1, Bx2, e Bx3 é independentemente uma porção de heterocíclica. Em determinadas modalidades, a porção clivável tem uma estrutura selecionada dentre os seguintes:
Figure img0043
ii. Determinados Ligantes
[00558] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem um ligante. Em algumas dessas modalidades, o ligante está covalentemente ligado à porção clivável. Em algumas dessas modalidades, o ligante está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o ligante está covalentemente ligado a uma porção da célula-alvo. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ligação covalente com um suporte sólido. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ligação covalente com uma porção de ligação de proteínas. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ligação covalente com um suporte sólido e compreende ainda uma porção de ligação de proteínas. Em determinadas modalidades, o ligante inclui várias posições para anexação dos ligantes fixados. Em determinadas modalidades, o ligante inclui várias posições para anexação dos ligantes fixados e não está anexado a um grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ou mais ligação clivável. Em determinadas modalidades, o grupo conjugado não inclui um ligante.
[00559] Em determinadas modalidades, o ligante inclui pelo menos um grupo linear compreendendo grupos selecionados de alquila, amida, bissulfeto, polietilenoglicol, éter, tioéter (-S-) e hidroxilamina (grupos-O- N(H)-). Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende pelo menos um grupo de ligação fósforo. Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende pelo menos um grupo fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui pelo menos um grupo ligante neutro. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado à porção de célula-alvo e à porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado à porção de célula-alvo e ao oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado à porção de célula-alvo, à porção clivável e a um suporte sólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado à porção de célula-alvo, à porção clivável, a um suporte sólido a uma porção ligante de proteína. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui uma ou mais ligações cliváveis.
[00560] Em determinadas modalidades, o ligante inclui o grupo linear covalentemente anexado a um grupo andaime (scaffold). Em determinadas modalidades, o andaime inclui um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados de alquil amida, bissulfeto, polietilenoglicol, éter, grupos tioéter e hidroxilamina. Em determinadas modalidades, o andaime inclui um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determinadas modalidades, o andaime inclui pelo menos um sistema de anéis mono- ou policíclico. Em determinadas modalidades, o andaime inclui pelo menos dois sistemas de anel monoou policíclico. Em determinadas modalidades, o grupo linear é covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime é covalentemente anexado à porção clivável e ao ligante. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexado à porção clivável, ao ligante e ao suporte sólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexado à porção e a um grupo ligante de proteína. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente ligado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexado à porção clivável, ao ligante, à porção ligante de proteína e a um suporte sólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui uma ou mais ligações cliváveis.
[00561] Em determinadas modalidades, o ligante inclui uma porção ligante de proteínas. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é um lipídio como, por exemplo, incluindo, entre outros, colesterol, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3- (oleoil)litocólico , ácido O3-(oleoil) colênico, dimetoxitritil ou fenoxazina), uma vitamina (por exemplo, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal), um peptídeo, um carboidrato (por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, polissacarídeo), um componente endossomolítico, um esteroide (por exemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), um terpeno (por exemplo, triterpeno, por exemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado de epifriedelanol) ou um lipídio catiônico. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é um ácido graxo saturado ou insaturado de cadeia longa de C16 a C22, colesterol, ácido cólico, vitamina E, adamantano ou 1-pentafluoropropila.
[00562] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0044
[00563] em que cada n é, independentemente, de 1 a 20; e p é de 1 a 6.
[00564] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0045
[00565] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00566] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0046
[00567] em que n é de 1 a 20.
[00568] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0047
[00569] em que cada L é, de forma independente, um grupo ligante fósforo ou um grupo ligante neutro; e
[00570] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00571] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0048
Figure img0049
[00572] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0050
[00573] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0051
[00574] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0052
[00575] em que n é de 1 a 20.
[00576] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0053
[00577] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0054
[00578] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0055
[00579] Em determinadas modalidades, o ligante conjugado tem a estrutura:
Figure img0056
[00580] Em determinadas modalidades, o ligante conjugado tem a estrutura:
Figure img0057
[00581] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0058
[00582] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0059
[00583] em que cada n é independente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.
iii. Determinadas Frações de Célula-Alvo
[00584] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem frações de célula-alvo. Determinadas frações de célula-alvo aumentam a absorção celular de compostos antissenso. Em determinadas modalidades, as frações de célula-alvo compreendem um grupo de ramificação, um ou mais fixador e um ou mais ligante. Em determinadas modalidades, frações de célula-alvo compreendem um grupo de ramificação, um ou mais ligantes e uma ou mais ligação clivável.
1. Determinados Grupos de Ramificação
[00585] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem uma porção-alvo compreendendo um grupo de ramificação e pelo menos dois ligantes fixados. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação anexa o ligante conjugado. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação anexa a porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação anexa o oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação está covalentemente anexado ao vinculador e aos ligantes fixados. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados de alquil amida, bissulfeto, polietilenoglicol, éter, grupos tioéter e hidroxilamina. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende um sistema de anéis mono- ou policíclicos. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende uma ou mais ligação clivável. Em determinadas modalidades, o grupo conjugado não inclui um grupo de ramificação.
[00586] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0060
[00587] em quen é, independentemente, de 1 a 20.
[00588] j é de 1 a 3; e
[00589] m é de 2 a 6.
[00590] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0061
[00591] em quen é, independentemente, de 1 a 20; e
[00592] m é de 2 a 6.
[00593] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0062
[00594] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0063
[00595] em que A1 é independente, O, S, C=O ou NH; e
[00596] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00597] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0064
[00598] em que A1 é, independentemente, O, S, C=O ou NH; e
[00599] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00600] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0065
[00601] em que A1 é O, S, C=O ou NH; e
[00602] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00603] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0066
[00604] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0067
[00605] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0068
2. Determinados Fixadores
[00606] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem um ou mais fixadores covalentemente anexados ao grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem um ou mais fixadores covalentemente anexados ao grupo de ligação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter, tioéter, bissulfeto, amida e grupos de polietilenoglicol em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter, tioéter, bissulfeto, amida, fosfodiéster e grupos de polietilenoglicol em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter e amida em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, fosfodiéster, éter e grupos amida em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila e fosfodiéster em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador compreende pelo menos um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro.
[00607] Em determinadas modalidades, o fixador inclui uma ou mais ligações cliváveis. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao grupo de ramificação através de ou uma Amida ou um grupo éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo ramificação por meio de um grupo fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo de ramificação por meio de um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo ramificação por meio de um um grupo éter. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao ligante por meio de um um grupo amida ou éter. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao ligante por meio de um grupo éter. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao ligante por meio de um um grupo amida ou éter. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao ligante por meio de um grupo éter.
[00608] Em determinadas modalidades, cada fixador compreende de cerca de 8 a cerca de 20 átomos no comprimento da cadeia entre o ligante e o grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, cada grupo fixador compreende de cerca de 10 a cerca de 18 átomos no comprimento da cadeia entre o ligante e o grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, cada grupo fixador compreende de cerca de 13 átomos no comprimento da cadeia.
[00609] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0069
[00610] em que n é, independentemente, de 1 a 20; e
[00611] e p é de 1 a 6.
[00612] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0070
[00613] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0071
[00614] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00615] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0072
[00616] em que L é um grupo de ligação fósforo ou um grupo de ligação neutro;
[00617] Z1 é C(=O)O-R2;
[00618] Z2 é H, C1-C6 alquila ou C1-C6 alquila substituída;
[00619] R2 é H, C1-C6 alquila ou C1-C6 alquila substituída; e
[00620] m1 é, independentemente, de 0 a 20 em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada fixador.
[00621] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0073
[00622] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
Figure img0074
[00623] em que Z2 é H ou CH3; e
[00624] m1 é, independentemente, de 0 a 20 em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada fixador.
[00625] Em determinadas modalidades, uma corrente tem uma estrutura selecionada entre:
[00626]
Figure img0075
em que n é, independentemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7.
[00627] Em determinadas modalidades, uma corrente compreende um grupo de ligação de fósforo. Em determinadas modalidades, uma corrente não compreende nenhuma ligação amida. Em determinadas modalidades, uma corrente compreende um grupo de ligação de fósforo e não compreende nenhuma ligação amida.
3. Certos Ligantes
[00628] Em determinadas modalidades, a presente descrição provê ligantes em que cada ligante é anexado covalentemente a uma corrente. Em determinadas modalidades, cada ligante é selecionado para ter uma afinidade para pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em determinadas modalidades, os ligantes são selecionados para que tenham afinidade para pelo menos um tipo de receptor na superfície de uma célula hepática de mamífero. Em determinadas modalidades, os ligantes são selecionados para que tenham afinidade para pelo menos um receptor hepático de asialoglicoproteína. Em determinadas modalidades, cada ligante é um carboidrato. Em determinadas modalidades, cada ligante é, selecionados independentemente da galactose, N-acetil galactosamina, manose, glicose, glicosamina e fucose. Em determinadas modalidades, cada ligante é N-acetil galactosamina (GalNAc). Em determinadas modalidades, a porção-alvo compreende 2 a 6 ligantes. Em determinadas modalidades, a porção- alvo compreende 3 ligantes. Em determinadas modalidades, a porção- alvo compreende 3 ligantes N-acetil galactosamina.
[00629] Em determinadas modalidades, o ligante é um carboidrato, derivado de carboidrato, carboidrato modificado, aglomerado de carboidrato multivalente, polissacarídeo, polissacarídeo modificado ou derivado de polissacarídeo. Em determinadas modalidades, o ligante é um açúcar aminado ou açúcar tio. Por exemplo, açúcares aminados podem ser selecionados de qualquer número de compostos conhecidos na técnica, por exemplo glicosamina, ácido siálico, a-D-galactosamina, N-acetilgalactosamina, 2-acetamido-2-deóxi-D-galactopiranose (GalNAc), 2-Amina-3-O-[(R)-1-carboxietil]-2-deóxi-p-D-glicopiranose (β- ácido murâmico), 2-Deóxi-2-metilamina-L-glicopiranose, 4,6-Dideóxi-4- formamida-2,3-di-O-metil-D-manopiranose, 2-Deóxi-2-sulfoamina-D- glicopiranose e N- sulfo-D-glicosamina e N- Glicoloil-a-ácido neuramínico. Por exemplo, açúcares tiolados podem ser selecionados do grupo que consiste em 5-Tio-β-D-glicopiranose, Metil 2, 3,4-tri-O- acetil-1-tio-6-O- tritil-α-D-glicopiranosida, 4-Tio-β-D-galactopiranose e etil 3,4,6,7-tetra-O-acetil-2-deóxi-1,5-ditio-a-D-gl/co- heptopiranosida.
[00630] Em determinadas modalidades, "GalNac" ou "Gal-NAc" se refere a 2-(Acetilamina)-2-deóxi-D-galactopiranose, comumente referido na literatura como N-acetil galactosamina . Em determinadas modalidades, "N-acetil galactosamina" se refere a 2-(Acetilamina)-2- deóxi-D-galactopiranose. Em determinadas modalidades, "GalNac" ou "Gal-NAc" se refere a 2-(Acetilamina)-2-deóxi-D-galactopiranose. Em determinadas modalidades, "GalNac" ou "Gal-NAc" se refere a 2- (Acetilamina)-2-deóxi-D-galactopiranose, que inclui a forma β: 2- (Acetilamina)-2-Deóxi-p-D-galactopiranose e forma a: 2-(Acetilamina)- 2-Deóxi-D-galactopiranose. Em determinadas modalidades, a forma β: 2-(Acetilamina)-2-De0xi-β-D-galactopiranose e forma α: 2- (Acetilamina)-2-deóxi-D-galactopiranose pode ser usado de forma intercambiável. Portanto, nas estruturas em que uma forma é retratada, essas estruturas destinam-se a incluir a outra forma também. Por exemplo, se a estrutura para a forma α: 2-(Acetilamina)-2-Deóxi-D- galactopiranose é mostrado, esta estrutura destina-se a incluir a outra forma também. Em determinadas modalidades, em determinadas modalidades preferenciais, a forma β 2-(Acetilamina)-2-deóxi-D- galactopiranose é a modalidade preferencial.
Figure img0076
2-(Acetilamina)-2-deóxi-D-galactopiranose.
Figure img0077
2-(AcetHamina)-2-de0xi-β-D-galactopiranose.
Figure img0078
2-(Acetilamina)-2-deóxi-a-D-galactopiranose.
[00631] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:
Figure img0079
[00632] em que R1 é selecionado de OH e NHCOOH.
[00633] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:
Figure img0080
[00634] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:
Figure img0081
[00635] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:
Figure img0082
i. Certos Conjugados
[00636] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem as características estruturais acima. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0083
[00637] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00638] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0084
[00639] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0085
[00640] em que n é, independentemente, de 1 a 20.
[00641] Z é H ou um suporte sólido ligado;
[00642] Q é um composto antissenso;
[00643] X é O ou S; e
[00644] BX é uma porção de base heterocíclica.
[00645] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0086
[00646] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura :
Figure img0087
[00647] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0088
[00648] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0089
[00649] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0090
[00650] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0091
[00651] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0092
[00652] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0093
[00653] Em determinadas modalidades, os conjugados não compreendem uma pirrolidina.
[00654] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0094
[00655] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0095
[00656] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0096
[00657] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0097
[00658] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0098
[00659] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0099
[00660] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0100
[00661] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0101
[00662] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0102
[00663] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0103
[00664] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados têm a seguinte estrutura:
Figure img0104
[00665] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0105
[00666] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de seis a onze átomos consecutivamente ligados.
[00667] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0106
[00668] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de dez átomos consecutivamente ligados.
[00669] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0107
[00670] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a onze átomos consecutivamente ligados e em que a corrente compreende exatamente uma ligação amida.
[00671] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0108
[00672] em que Y e Z são independentemente selecionados de grupo C1-C12 alquila, alquenila ou alquinila ou um grupo compreendendo um éter, uma cetona, uma amida, um éster, um carbamato, uma amina, uma piperidina, um fosfato, uma fosfodiéster, um fosforotioato, um triazol, uma pirrolidina, um dissulfeto ou um tioéter.
[00673] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0109
[00674] em que Y e Z são independentemente selecionados de grupo C1-C12 alquila substituído ou não substituído, ou um grupo compreendendo exatamente um éter ou exatamente dois éteres, uma amida, uma amina, uma piperidina, um fosfato, um fosfodiéster ou um fosforotioato.
[00675] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0110
[00676] em que Y e Z são selecionados independentemente de um grupo C1-C12 alquila substituído ou não substituído .
[00677] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0111
[00678] em que m e n são selecionados independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12.
[00679] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0112
[00680] em que m é 4, 5, 6, 7 ou 8, e n é 1, 2, 3 ou 4.
[00681] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0113
[00682] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos ligados consecutivamente, e em que X não compreende um grupo éter.
[00683] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0114
[00684] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de oito átomos consecutivamente ligados, e em que X não compreende um grupo éter.
[00685] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0115
[00686] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos consecutivamente ligados e em que a corrente compreende exatamente uma ligação amida, e em que X não compreende um grupo éter.
[00687] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0116
[00688] em que X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos ligados consecutivamente e em que a corrente consiste em uma ligação amida e um grupo alquil C2-C11 substituído ou não substituído.
[00689] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0117
[00690] em que Y e Z são independentemente selecionados do grupo C1-C12 alquila, alquenila ou alquinila substituído ou não substituído ou um grupo compreendendo um éter, uma cetona, uma amida, um éster, um carbamato, uma amina, uma piperidina, um fosfato, uma fosfodiéster, um fosforotioato, um triazol, uma pirrolidina, um dissulfeto ou um tioéter.
[00691] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0118
[00692] em que Y é selecionado a partir de um grupo C1-C12 alquila substituído ou não substituído, ou um grupo compreendendo um éter, uma amina, uma piperidina, um fosfato, um fosfodiéster ou um fosforotioato.
[00693] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0119
[00694] em que Y é selecionado de um grupo C1-C12 alquila substituído ou não substituído.
[00695] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0120
[00696] em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
[00697] Em determinadas modalidades, a porção de célula-alvo do grupo conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0121
[00698] em que n é 4, 5, 6, 7 ou 8.
a. Certos compostos antissenso conjugados
[00699] Em determinadas modalidades, os conjugados estão ligados a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0122
[00700] em que
[00701] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00702] B é a porção clivável
[00703] C é o ligante conjugado
[00704] D é o grupo de ramificação
[00705] E é uma corrente;
[00706] F é um ligante; e
[00707] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00708] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0123
[00709] em que
[00710] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00711] C é o ligante conjugado
[00712] D é o grupo de ramificação
[00713] E é uma corrente;
[00714] F é um ligante; e
[00715] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00716] Em determinadas modalidades, o ligante conjugado compreende pelo menos uma ligação clivável.
[00717] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende pelo menos uma ligação clivável.
[00718] Em determinadas modalidades, cada corrente compreende pelo menos uma ligação clivável.
[00719] Em determinadas modalidades, os conjugados estão ligados a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo.
[00720] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0124
[00721] em que
[00722] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00723] B é a porção clivável
[00724] C é o ligante conjugado
[00725] E é uma corrente;
[00726] F é um ligante; e
[00727] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00728] Em determinadas modalidades, os conjugados estão ligados a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0125
[00729] em que
[00730] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00731] C é o ligante conjugado
[00732] E é uma corrente;
[00733] F é um ligante; e
[00734] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00735] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0126
[00736] em que
[00737] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00738] B é a porção clivável
[00739] D é o grupo de ramificação
[00740] E é uma corrente;
[00741] F é um ligante; e
[00742] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00743] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:
Figure img0127
[00744] em que
[00745] A é o oligonucleotídeo antissenso;
[00746] D é o grupo de ramificação
[00747] E é uma corrente;
[00748] F é um ligante; e
[00749] q é um número inteiro entre 1 e 5.
[00750] Em determinadas modalidades, o ligante conjugado compreende pelo menos uma ligação clivável.
[00751] Em determinadas modalidades, cada corrente compreende pelo menos uma ligação clivável.
[00752] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:
Figure img0128
[00753] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:
Figure img0129
[00754] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:
Figure img0130
[00755] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura: Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc na extremidade 5'. Por exemplo em certas modalidades, um composto compreende ISIS 532401 conjugado com GalNAc na extremidade 5'. Em outras modalidades, o composto tem a seguinte estrutura química compreendendo ou consistindo de ISIS 532401 com 5'-X em que X é um grupo conjugado compreendendo GalNAc, tal como aqui descrito:
Figure img0131
[00756] em que X é um grupo conjugado que compreende GalNAc.
[00757] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato. Em outras modalidades, o composto compreende a sequência de ISIS 532401 conjugada com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é com uma ligação de fosforotioato. Em tais modalidades, a estrutura química é a seguinte:
Figure img0132
[00758] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do composto de oligonucleotídeo é uma ligação de fosforotioato ou de uma ligação de fosfodiéster. Em outras modalidades, o composto compreende a sequência de ISIS 532401 conjugada com GalNAc e em que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é com uma ligação de fosforotioato ou ligação de fosfodiéster. Em tais modalidades, a estrutura química é a seguinte:
Figure img0133
[00759] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo ISIS direcionado a GHR conjugado com GalNAc. Em outras dessas modalidades, o composto compreende a sequência de ISIS 532401 conjugado com GalNAc e é representado pela seguinte estrutura química:
Figure img0134
[00760] em que ou R1 é -OCH2CH2OCH3 (MOE) e R2 é H; ou R1 e R2 em conjunto, formam uma ponte em que R1 é -O- e R2 é -CH2-, -CH (CH3) - ou -CH2CH2- e R1 e R2 estão diretamente ligados de tal modo que a ponte resultante é selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH (CH3) - e -O-CH2CH2-;
[00761] E para cada par de R3 e R4 no mesmo anel, independentemente para cada anel: ou R3 é selecionado a partir de H e -OCH2CH2OCH3 e R4 é H; ou R3 e R4 em conjunto, formam uma ponte em que R3 é -O- e R4 é -CH2-, -CH (CH3) - ou -CH2CH2-e R3 e R4 estão diretamente ligados de tal modo que a ponte resultante é selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH (CH3) - e -O-CH2CH2-;
[00762] e R5 é selecionado a partir de H e -CH3;
[00763] E Z é selecionado a partir de S- e O-.
[00764] As patentes dos Estados Unidos representativas, as publicações do pedido de patente dos Estados Unidos e publicações do pedido de patente internacional que ensinam a preparação de certos conjugados observados acima, compostos antissenso conjugados, fixadores, grupos de ramificação, ligantes, frações cliváveis, bem como outras modificações incluem, sem limitação, U.S. N° 5.994.517, U.S. N° 6.300.319, U.S. N° 6.660.720, U.S. N° 6.906.182, U.S. N° 7.262.177, U.S. N° 7.491.805, U.S. N° 8.106.022, U.S. N° 7.723.509, U.S. N° 2006/0148740, U.S. N° 2011/0123520, WO 2013/033230 e WO 2012/037254, sendo que cada um é incorporado por referência a este documento na íntegra.
[00765] Publicações representativas que ensinam a preparação de certos conjugados observados acima, compostos antissenso conjugados, correntes, ligantes, grupos de ramificação, ligantes, frações cliváveis, bem como outras modificações incluem, sem limitação, BIESSEN et al, "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577- 37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N- Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, and Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine- based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, sendo que cada um desses itens é incorporado por referência a este documento em sua integralidade.
[00766] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados compreendem um oligonucleotídeo baseado em RNase H (como mero de lacuna) ou um oligonucleotídeo modulador de união (como oligonucleotídeo totalmente modificado) e qualquer grupo conjugado compreendendo pelo menos um, dois ou três grupos GalNAc. Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado compreende qualquer grupo conjugado encontrado em qualquer uma das seguintes referências: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31,2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798- 5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175;van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J AmChem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al. Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol2000 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29 Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al. Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem 2013, 21, 5275-5281; Pedidos internacionais WO1998/013381 8.435.491; 8.404.862; 7.851.615; Publicações de Pedido de Patente US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; e US2009/0203132; cada um dos quais é incorporado em sua totalidade ao presente pedido por referência.
Testes in vitro de oligonucleotídeos antissenso
[00767] São descritos neste documento os métodos para o tratamento de células com oligonucleotídeos antissenso que podem ser modificados apropriadamente para o tratamento com outros compostos antissenso.
[00768] As células podem ser tratadas com oligonucleotídeos antissenso quando as células atingem aproximadamente 60-80% de confluência na cultura.
[00769] Um reagente comumente usado para introduzir os oligonucleotídeos antissenso nas células cultivadas inclui o reagente de transfecção lipídica catiônica LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleotídeos antissenso podem ser misturados com LIPOFECTIN in OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada de oligonucleotídeo antissenso uma concentração de LIPOFECTIN que pode variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleotídeo antissenso.
[00770] Outro reagente usado para introduzir os oligonucleotídeos antissenso nas células cultivadas inclui LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleotídeo antissenso é misturado com LIPOFECTAMINE em meio de soro reduzido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada de oligonucleotídeo antissenso uma concentração de LIPOFECTAMINE que pode variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleotídeo antissenso.
[00771] Outra técnica usada para introduzir os oligonucleotídeos antissenso nas células cultivadas inclui a eletroporação.
[00772] Ainda outra técnica usada para introduzir oligonucleotídeos antissenso em células cultivadas inclui a livre absorção dos oligonucleotídeos pelas células.
[00773] As células são tratadas com os oligonucleotídeos antissenso por métodos de rotina. As células são normalmente colhidas 16-24 horas após o tratamento de oligonucleotídeo antissenso, no momento em que o RNA ou os níveis de proteína de ácidos nucleicos alvo são medidos por métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento. Em geral, quando os tratamentos são executados em múltiplas réplicas, os dados são apresentados como a média dos tratamentos replicados.
[00774] A concentração do oligonucleotídeo antissenso usada varia de linhagem celular para linhagem celular. Os métodos para determinar a concentração de oligonucleotídeo antissenso ideal para uma linhagem celular particular são bem conhecidos na técnica. Oligonucleotídeos antissenso são normalmente usados em concentrações variando de 1 nM a 300 nM quando transfectados com LIPOFECTAMINE. Os oligonucleotídeos antissenso são usados em concentrações superiores variando de 625 a 20.000 nM, quando transfectados usando eletroporação.
Isolamento de RNA
[00775] A análise de RNA pode ser executada no RNA celular total ou poli(A) + mRNA. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. O RNA é preparado usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando o Reagente TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante.
Certas Indicações
[00776] Certas modalidades aqui proporcionadas referem-se aos métodos de tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença associada com o excesso de hormônio de crescimento num indivíduo por administração de um inibidor específico de GHR, tal como um composto antissenso ou oligonucleotídeo direcionado para GHR. Em certos aspectos, a doença associada ao excesso de hormônio do crescimento é acromegalia. Em certos aspectos, a doença associada com o excesso do hormônio de crescimento é gigantismo.
[00777] Certas modalidades proporcionam um método de tratamento, prevenção ou melhoramento de acromegalia num indivíduo por administração de um inibidor específico de GHR, tal como um composto antissenso ou oligonucleotídeo direcionado para GHR. A acromegalia é uma doença associada com um excesso de hormônio de crescimento (GH). Em mais de 90 por cento dos doentes com acromegalia excesso de produção de hormônios de crescimento é causado por um tumor benigno da glândula pituitária, chamada adenoma, que produz o hormônio de crescimento em excesso e comprime os tecidos cerebrais circundantes. Expansão do adenoma pode causar dores de cabeça e deficiência visual que muitas vezes acompanham a acromegalia. Em alguns casos, a acromegalia é causada por tumores do pâncreas, pulmões ou glândulas suprarrenais que conduzem a um excesso de GH, quer através da produção de GH ou por produção de Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH), o hormônio que estimula a pituitária para fazer GH.
[00778] Acromegalia mais comumente afeta adultos de meia-idade e pode resultar em desfiguração grave, condições de complicação e morte prematura. Por causa de sua patogênese e progressão lenta, a acromegalia muitas vezes não é diagnosticada até que as mudanças em recursos externos se tornam visíveis, tais como mudanças no rosto. A acromegalia é frequentemente associada com gigantismo.
[00779] Características de acromegalia incluem inchaço dos tecidos moles, resultando em aumento das mãos, pés, nariz, lábios e orelhas e um espessamento geral da pele; inchaço dos tecidos moles de órgãos internos, tais como o coração e os rins; inchaço das cordas vocais, resultando em uma voz baixa e fala lenta; expansão do crânio; pronunciada protrusão da sobrancelha, muitas vezes com distensão ocular; pronunciada protrusão do maxilar inferior e alargamento da língua; dentes gapping; e síndrome do túnel do carpo. Em certos enquadramentos, qualquer uma ou a combinação destas características de acromegalia podem ser tratadas, prevenidas ou melhoradas através da administração de um composto ou composição alvo a GHR aqui proporcionada.
EXEMPLOS Descrição não limitante e incorporação por referência
[00780] Enquanto certos compostos, composições e métodos descritos neste documento foram descritos com especificidade em conformidade com certas modalidades, os seguintes exemplos servem apenas para ilustrar os compostos descritos neste documento e não se destinam a limitar o mesmo. Cada uma das referências relatadas no presente pedido está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00781] Entende-se que a sequência estabelecida em cada SEQ ID NO nos Exemplos contidos neste documento é independente de qualquer modificação de uma porção de açúcar, uma ligação internucleosídeos ou uma nucleobase. Como tal, os compostos antissenso definidos por uma SEQ ID NO podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção de açúcar, uma ligação internucleosídeos ou uma nucleobase. Os compostos antissenso descritos pelo Número de Isis (N° de Isis) indicam uma combinação da sequência de nucleobase e motivo.
[00782] Os exemplos a seguir ilustram determinadas modalidades da presente descrição e não são limitantes. Além disso, se modalidades específicas forem providas, os inventores contemplaram um pedido genérico dessas modalidades específicas. Por exemplo, a descrição de um oligonucleotídeo que tem um motivo específico provê suporte razoável para oligonucleotídeos adicionais que têm o mesmo motivo ou motivo semelhante. E, por exemplo, se uma modificação específica de alta afinidade surgir em uma posição específica, outras modificações de alta afinidade na mesma posição são consideradas adequadas, salvo indicação contrária.
Exemplo 1: Método Geral para a Preparação de Fosforamiditos, Compostos 1, 1a e 2
[00783] Os compostos 1, 1a e 2 foram preparados de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica, descritos na especificação aqui contida (ver Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 11221125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); e também publicado nos Pedidos Internacionais PCT (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 e WO 2007/090071) e patente US N° 7569686).
Figure img0135
Exemplo 2: Preparação do Composto 7
[00784] Os compostos 3 (2-acetamida-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2- desóxi-P-Dgalactopiranose ou galactosamina pentaacetato) estão comercialmente disponíveis. O composto 5 foi preparado de acordo com procedimentos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34,2692).
Figure img0136
Exemplo 3: Preparação do Composto 11
[00785] Os compostos 8 e 9 estão comercialmente disponíveis.
Figure img0137
Exemplo 4: Preparação do Composto 18
[00786] O composto 11 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 3. O composto 14 está comercialmente disponível. O composto 17 foi preparado usando procedimentos similares relatados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Figure img0138
Exemplo 5: Preparação do Composto 23
[00787] Os compostos 19 e 21 estão comercialmente disponíveis.
Figure img0139
Exemplo 6: Preparação do Composto 24
[00788] Os compostos 18 e 23 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 4 e 5.
Figure img0140
Exemplo 7: Preparação do Composto 25
[00789] O composto 11 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 6.
Figure img0141
Exemplo 8: Preparação do Composto 26
[00790] O composto 24 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 6.
Figure img0142
Exemplo 9: Preparação geral de ASOs conjugados compreendendo GalNAc3-1 no terminal 3', Composto 29
Figure img0143
Figure img0144
[00791] Onde GalNAc3-1 protegido tem a estrutura:
Figure img0145
[00792] A parte do grupo de GalNAc3 do grupo conjugado GalNAc3- 1 (GalNAc3-1a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para prover uma variedade de grupos conjugados. Onde GalNAc3-1a tem a fórmula:
Figure img0146
[00793] O suporte sólido ligou GalNAc3-1 protegido, Composto 25, foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 7. Composto 29 oligomérico compreendendo GalNAc3-1 no terminal 3' foi preparado utilizando procedimentos-padrão em síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 36233627). Blocos de construção de fosforamidita, Compostos 1 e 1a foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 1. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamidita podem ser utilizados para preparar compostos oligoméricos com uma sequência e composição predeterminada. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos com lacunas como descrito neste instrumento. Esses compostos oligoméricos lacunados podem ter uma composição predeterminada e uma sequência de base mencionada por um determinado alvo.Exemplo 10: ASOs conjugados de preparação geral compreendendo GalNAc3-1 no terminal 5', Composto 34
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[00794] O UnylinkerTM 30 está comercialmente disponível. Composto 34 oligomérico compreendendo um aglomerado deGalNAc3-1 no terminal 5' é preparado utilizando procedimentos-padrão em síntese automatizada de DNA/RNA (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Blocos de construção de fosforamidita, Compostos 1 e 1a foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 1. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamidita podem ser utilizados para preparar compostos oligoméricos com uma sequência e composição predeterminada. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos com lacunas como descrito neste instrumento. Esses compostos oligoméricos lacunados podem ter uma composição predeterminada e uma sequência de base mencionada por um determinado alvo.Exemplo 11: Preparação do Composto 39
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[00795] Os compostos 4, 13 e 23 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 2, 4 e 5. Composto 35 é preparado utilizando processos semelhantes publicados em Rouchaud et al., Eur. J. Org. Chem., 2011, 12, 2346-2353.
Exemplo 12: Preparação do Composto 40
[00796] O composto 38 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 11.
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Exemplo 13: Preparação do Composto 44
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[00797] Os compostos 23 e 36 são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos exemplos 5 e 11. Composto 41 é preparado utilizando processos semelhantes publicados no WO 2009082607.
Exemplo 14: Preparação do Composto 45
[00798] O composto 43 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 13.
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Exemplo 15: Preparação do Composto 47
[00799] O composto 46 está comercialmente disponível.
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Exemplo 16: Preparação do Composto 53
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[00800] Compostos 48 e 49 estão comercialmente disponíveis. Os compostos 17 e 47 são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 4 e 15.Exemplo 17: Preparação do Composto 54
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[00801] O composto 53 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 16.
Exemplo 18: Preparação do Composto 55
[00802] O composto 53 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 16.
[00803]
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Exemplo 19: Método geral para a preparação de ASOs conjugados compreendendo GalNAc3-1 na posição 3' por meio de técnicas em fase sólida (preparação de ISIS 647535, 647536 e 651900)
[00804] Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e soluções utilizadas para a síntese dos compostos oligoméricos são adquiridas de fontes comerciais. Blocos de construção de fosforamidita padrão e suporte sólido são usados para a incorporação de resíduos de nucleosídeos que incluem, por exemplo, T, A, G, e mResíduos C. Uma solução de fosforamidita a 0,1 M em anidro acetonitrila foi utilizada para β-D-2-desoximbonucleosideo e 2'-MOE.
[00805] As sínteses ASO foram realizadas em sintetizador ABI 394 (escala de 1-2 nmol) ou em sintetizador oligopiloto GE Healthcare Bioscience ÃKTA (escala de 40-200 mmol) pelo método de acoplamento de fosforamidita em GalNAc3-1 suporte sólido VIMAD carregado (110 mmol/g, Guzaev et al., 2003) empacotada na coluna. Para a etapa de acoplamento, as fosforamiditas foram entregues 4 vezes em excesso sobre a carga sobre o suporte sólido e a condensação de fosforamidita foi realizada por 10 min. Todas as outras etapas seguiram os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Uma solução de ácido dicloroacético a 6% em tolueno foi utilizada para remover o grupo dimetoxitritila (DMT) do grupo 5'-hidroxila do nucleotídeo. 4,5-Dicianoimidazol (0,7 M) em anidro CH3CN foi usado como ativador passo durante a etapa de acoplamento. As ligações de fosforotioato foram introduzidas por sulfurização com solução a 0,1 M de hidreto de xantano em piridina/CH3CN 1:1 para um tempo de contato de 3 minutos. Uma solução de 20% terc-butilhidroperóxido em CH3CN contendo 6% de água foi utilizada como um agente oxidante para prover ligações internucleosídeas de fosfodiéster com um tempo de contato de 12 minutos.
[00806] Depois da sequência desejada foi montada, os grupos protetores de cianoetil fosfato foram desprotegidos utilizando uma mistura 1: 1 (v/v) de uma mistura de trietilamina e acetonitrila, com um tempo de contato de 45 minutos. ASOs de ligação de suporte sólido foram suspensos em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecidos a a 55 oC por 6 h.
[00807] Os ASO não ligados foram então filtrada e a amônia foi fervida. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida de alta pressão em uma coluna de troca aniônica forte (GE Healthcare Bioscience, Fonte 30Q, 30 μm, com 2,54 x 8 cm, A = 100 mM acetato de amônia em 30% de CH 3CN aquoso, B = 1,5 M de NaBr, em A, 040% de B em 60 min, fluxo 14 mL min-1, A = 260 nm). O resíduo foi dessalinizado por HPLC em uma coluna de fase inversa para produzir ASOs desejados com um rendimento isolado de 15-30% com base na carga inicial sobre o suporte sólido. ASOs foram caracterizados pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD.
[00808] Os oligonucleotídeos antissenso que não compreendem um conjugado foram sintetizados utilizando procedimentos de síntese de oligonucleotídeos convencionais bem conhecidos na técnica.
[00809] Usando esses métodos, três compostos antissenso distintos direcionados à ApoC III estavam preparados. Como resumido na Tabela 17, abaixo, três compostos antissenso que direcionam a ApoC III tinham a mesma sequência de nucleobases; ISIS 304801 é um gamper 5-10-5 MOE com todas as ligações de fósforotioato; ISIS 647535 é o mesmo que ISIS 304.801, salvo se tinha GalNAc3-1 conjugado na extremidade 3'; e ISIS 647536 é o mesmo que ISIS 647535 salvo se determinadas ligações internucleosídeas desse composto forem ligações fosfodiéster. Como resumido ainda na Tabela 17, dois compostos antissenso separados que direcionam SRB-1 foram sintetizados. ISIS 440762 foi um mero de lacuna 2-10-2 CET com todas as ligações internucleosídeas fósforotioato; ISIS 651900 é o mesmo que ISIS 440762, exceto se incluiu um GalNAc3-1 na sua extremidade 3'.Tabela 17 ASO modificado direcionando ApoC III e SRB-1
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[00810] Subscritos: "e" indicam nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2'-desoximbonucleosídeo; "k" indica 6'(S)CH3 nucleosídeo bicíclico (por exemplo, cEt); "s" indica ligações internucleosídeas de fosforotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídeas de fosfodiéster (PO); e "o" indica -O-P (=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5- metilcitosinas. "GalNAc3-1" indica um grupo conjugado com a estrutura mostrada anteriormente no Exemplo 9. Observe que GalNAc3-1 compreende uma adenosina clivável que liga o ASO ao restante do conjugado, que é designado "GalNAc3-1a. " Esta nomenclatura é usada na tabela acima, para mostrar a sequência de nucleobases completo, incluindo a adenosina, que faz parte do conjugado. Assim, na tabela acima, as sequências também poderiam ser listadas com uma terminação "GalNAc3-1 " com "Ado" omitido. Esta convenção de uso do subscrito "a" para indicar a parte de um grupo conjugado desprovido de nucleosídeo clivável ou porção clivável é usada nesses Exemplos. Esta parte de um grupo conjugado desprovido de porção clivável é denominada "grupo" ou "grupo conjugado" ou grupo "GalNAc3". Em determinados casos, é conveniente descrever um grupo conjugado apresentando, separadamente, seu grupo e sua porção clivável.
Exemplo 20: Inibição antissenso dependente de dose de ApoC III humana em camundongos transgênicos huApoC III
[00811] ISIS 304801 e ISIS 647535, cada um direcionando ApoC III humana e descrita acima, foram testados separadamente e avaliados em um estudo dependente da dose para sua capacidade de inibir ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana.
Tratamento
[00812] Camundongos transgênicos APOCIII humana foram mantidos num ciclo de luz/escuro de 12 horas e foram alimentados ad libitum Teklad lab Chow. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias no centro de investigação antes do início do experimento. ASOs foram preparados em PBS e esterilizados pela filtração através de um filtro de 0,2 mícron. ASOs foram dissolvidos em PBS 0,9% para injeção.
[00813] Camundongos transgênicos ApoC III humana foi injetada por via intraperitoneal uma vez por semana por duas semanas com ISIS 304801 ou 647535 em 0,08, 0,25. 0,75, 2,25 ou 6,75 μmol/kg ou com PBS como controle. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Quarenta e oito horas após a administração da última dose, foi retirado sangue de cada camundongo e os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram coletados.
Análise de ApoC III mRNA
[00814] Os níveis de mRNA de ApoC III nos fígados dos camundongos foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação RIBOGREEN® RNA (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de ApoC III foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de ApoC III para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". A metade da dosagem máxima eficaz (ED50) de cada ASO é também apresentada na Tabela 18, abaixo.
[00815] Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram o RNA da ApoC III em relação ao controle com PBS. Além disso, o composto antissenso conjugado aGalNAc3-1 (ISIS 647535) era substancialmente mais potentes do que o composto antissenso desprovido do conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304.801). Tabela 18 Efeito do tratamento de ASO nos níveis de mRNA de ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana
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Análise da Proteína ApoC III (Ensaio Turbidométrico)
[00816] Análise da proteína ApoC III do plasma foi determinada usando procedimentos relatados por Graham et al, Circulation Research, publicado online antes da impressão em 29 de março de 2013.
[00817] Cerca de 100 μl de plasma isolado de camundongos foram analisados sem diluição, usando um Analisador Clínico Olympus e um ensaio de ApoC III turbidométrico comercialmente disponível (Kamiya, Cat N° KAI-006, Kamiya biomédica, Seattle, WA). O protocolo do ensaio foi realizado como descrito pelo fornecedor.
[00818] Como mostrado na Tabela 19 abaixo, ambos os compostos antissenso reduziram a proteína ApoC III em relação ao controle com PBS. Além disso, o composto antissenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) era substancialmente mais potentes do que o composto antissenso desprovido do conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801).Tabela 19 Efeito do tratamento de ASO nos níveis da proteína do plasma ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana
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[00819] Triglicerídeos e colesterol do plasma foram extraídos pelo método de Bligh e Dyer (Bligh, E.G. e Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959) e medidos pelo uso do analisador clínico Beckmann Coulter e reagentes comercialmente disponíveis.
[00820] Os níveis de triglicerídeo foram medidos em relação aos camundongos injetados com PBS e são indicadas como "% PBS". Os resultados são apresentados na Tabela 20. Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram os níveis de triglicerídeo. Além disso, o composto antissenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) era substancialmente mais potente do que o composto antissenso desprovido do conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Tabela 20 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de triglicerídeo em camundongos transgênicos
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[00821] As amostras de plasma foram analisadas por HPLC para determinar a quantidade de colesterol total e as diferentes frações de colesterol (HDL e LDL). Os resultados são apresentados nas Tabelas 21 e 22. Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram os níveis de colesterol total; ambos reduziram o LDL; e ambos aumentaram o HDL. Além disso, o composto antissenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) era substancialmente mais potente do que o composto antissenso desprovido do conjugado the GalNAc3-1 (ISIS 304801). Um aumento nos níveis de HDL e uma diminuição nos níveis de LDL é um efeito benéfico cardiovascular de inibição antissenso de ApoC III. Tabela 21 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de colesterol total em camundongos transgênicos
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Tabela 22 Efeito do tratamento de ASO em níveis de colesterol HDL e LDL em camundongos transgênicos
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Análise Farmacocinética (PK)
[00822] A PK do ASO também foi avaliada. As amostras de fígado e de rim foram picadas e extraídas utilizando protocolos convencionais. As amostras foram analisadas em MSD1 utilizando IP-HPLC-MS. O nível do tecido (μg/g) de comprimento total e ISIS 304801 e 647535 foi medido e os resultados estão apresentados na Tabela 23. Como ilustrado, as concentrações do fígado dos compostos antissenso totais de comprimento completo eram semelhantes para os dois compostos antissenso. Assim, mesmo que o composto antissenso conjugado de GalNAc3-1 seja mais ativo no fígado (como demonstrado pelos dados do RNA e da proteína acima), ele não está presente em concentrações substancialmente elevadas no fígado. De fato, o EC50 calculado (apresentado na Tabela 23) confirma que o aumento observado na potência do composto conjugado não pode ser inteiramente atribuído ao aumento do acúmulo. Este resultado sugere que o conjugado melhorou a potência por um mecanismo diferente da acumulação no fígado sozinho, possivelmente pela melhoria da absorção produtiva do composto antissenso nas células.
[00823] Os resultados também mostram que a concentração do composto antissenso conjugado GalNAc3-1 no rim é menor do que o do composto antissenso desprovido do conjugado de GalNAc. Há várias implicações terapêuticas benéficas. Para indicações terapêuticas em que a atividade no rim não é pedida, a exposição aos riscos de toxicidade renal, sem benefício correspondente. Além disso, a alta concentração no rim geralmente resulta na perda do compostos na urina resultando em uma depuração mais rápida Portanto, para alvos não renais, o acúmulo no rim não é desejado. Estes dados sugerem que a conjugação de GalNAc3-1 reduz o acúmulo no rim. Tabela 23 Análise PK do tratamento com ASO em camundongos transgênicos
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[00824] Os metabólitos d e ISIS 647535 também foram identificados e suas massas foram confirmadas pela análise de espectrometria de massa de alta resolução. Os locais de clivagem e as estruturas dos metabólitos observados são mostrados abaixo. % relativa de ASO de comprimento completo foi calculado utilizando procedimentos convencionais e os resultados são apresentados na Tabela 23a. O metabólito principal de ISIS 647535 foi ASO de comprimento completo desprovido do conjugado inteiro (ou seja, ISIS 304.801), que resulta da clivagem no sítio de clivagem A, mostrado abaixo. Além disso, metabólitos adicionais resultantes de outros sítios de clivagem também foram observados. Estes resultados sugerem que a introdução de outras ligações cliváveis como ésteres, peptídeos, dissulfuretos, fosforamidatos ou acil-hidrazonas entre o açúcar GalNAc3-1 e ASO, que podem ser clivados pelas enzimas dentro da célula, ou que podem clivar no ambiente redutivo do citosol, ou que são lábeis ao pH ácido no interior dos endossomos e lisossomos também pode ser úteis. Tabela 23a Metabólitos de comprimento completo de ISIS 647535
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Exemplo 21: Inibição antissenso da ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana em estudo de administração única
[00825] ISIS 304801, 647535 e 647536 cada direcionando ApoC III humana e descrito na Tabela 17, foram ainda avaliados num estudo de administração única pela sua capacidade de inibir a ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana.
Tratamento
[00826] Camundongos transgênicos APOCIII humana foram mantidos num ciclo de luz/escuro de 12 horas e foram alimentados ad libitum Teklad lab Chow. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias no centro de investigação antes do início do experimento. ASOs foram preparados em PBS e esterilizados pela filtração através de um filtro de 0,2 mícron. ASOs foram dissolvidos em PBS 0,9% para injeção.
[00827] Camundongos transgênicos ApoC III humana foram injetados por via intraperitoneal em uma dosagem mostrada abaixo com ISIS 304801, 647535 ou 647536 ou com controle tratado com PBS. O grupo de tratamento consistiu em 3 animais e o grupo controle consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camundongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a última administração.
[00828] As amostras foram coletadas e analisadas para determinar o mRNA da ApoC III e os níveis proteicos no fígado; triglicerídeos plasmáticos; e colesterol, incluindo as frações HDL e LDL foram avaliadas como descrito acima (Exemplo 20). Os dados dessas análises são apresentados nas Tabelas 24-28 abaixo. Os níveis de transaminase hepática, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), no soro, foram medidos em relação aos camundongos injetados com solução salina usando protocolos padrão. A níveis de ALT e AST mostrou que os compostos antissenso foram bem tolerados em todas as doses administradas.
[00829] Estes resultados mostram a melhoria da potência para os compostos antissenso compreendendo um conjugadoGalNAc3-1no terminal 3' (ISIS 647535 e 647536) em comparação com o composto antissenso desprovido do conjugadoGalNAc3-1 (ISIS 304.801). Além disso, o ISIS 647536, que compreende um conjugado GalNAc3-1 e algumas ligações fosfodiéster eram tão potentes quanto ISIS 647535, as quais compreendem o mesmo conjugado e todas as ligações internucleosídeas no ASO são fósforotioato. Tabela 24 Efeito do tratamento de ASO nos níveis de mRNA de ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana
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Tabela 25 Efeito do tratamento de ASO nos níveis da proteína do plasma ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana
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Tabela 26 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de triglicerídeo em camundongos transgênicos
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Tabela 27 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de colesterol total em camundongos transgênicos
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Tabela 28 Efeito do tratamento de ASO em níveis de colesterol HDL e LDL em camundongos transgênicos
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[00830] Estes resultados confirmam que o conjugadoGalNAc3- 1aumenta a potência de um composto antissenso. Os resultados também mostram uma potência igual de compostos antissenso conjugadosGalNAc3-1onde os oligonucleotídeos antissenso misturaram ligações (ISIS 647536 que tem seis ligações fosfodiéster) e uma versão completa de fósforotioato versão do mesmo composto antissenso (ISIS 647535).
[00831] As ligações fosforotioato proveem várias propriedades para compostos antissenso. Por exemplo, elas resistem à digestão da nuclease e ligam proteínas resultando no acúmulo do composto no fígado, em vez de no rim/urina. Estas são as propriedades desejáveis, especialmente quando tratam de uma indicação no fígado. No entanto, as ligações de fósforotioato também foram associadas a uma resposta inflamatória. Por conseguinte, a redução do número de ligações fósforotioato em um composto é esperada para reduzir o risco de inflamação, mas também para diminuir a concentração do composto no fígado, aumentar a concentração na urina e rim, diminuir a estabilidade na presença de nucleases, e reduzir a potência global. Os presentes resultados mostram que um composto antissenso conjugadoGalNAc3- 1 em que determinadas ligações de fósforotioato foram substituídas por ligações fosfodiéster são tão potentes contra um alvo no fígado como um homólogo tendo ligações completas de fósforotioato. Espera-se que esses sejam menos pró-inflamatórios (ver Exemplo 24 que descreve uma experiência que mostra a redução de resultados PS no efeito inflamatório reduzido).
Exemplo 22: Efeito do ASO modificado do conjugado GalNAc3-1 direcionando SRB-1 in vivo
[00832] ISIS 440762 e 651900, cada um direcionando SRB-1 e descritos na Tabela 17, foram avaliados num estudo dependente da dose quanto à sua capacidade de inibir a SRB-1 em camundongos Balb/c.
Tratamento
[00833] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Laboratório Jackson, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB- 1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS".
[00834] Como ilustrado na Tabela 29, ambos os compostos antissenso reduziram os níveis de mRNA do SRB-1. Além disso, o composto antissenso compreendendo conjugado GalNAc3-1 (ISIS 651900) era substancialmente mais potente do que o composto antissenso desprovido do conjugado GalNAc3-1 (ISIS 440762). Estes resultados demonstram que o benefício da potência dos conjugdos de GalNAc3-1 é observado utilizando oligonucleotídeos antissenso complementares a um alvo diferente e com nucleosídeos quimicamente diferentes, neste caso nucleosídeos modificados compreendem frações de açúcar etílico (uma porção de açúcar bicíclico).Tabela 29Efeito do tratamento com ASO sobre os níveis de mRNA de SRB-1 em camundongos Balb/c
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Exemplo 23: Protocolo do Ensaio de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano (hPBMC)
[00835] O ensaio de hPBMC foi realizado utilizando o método do BD Vautainer CPT. Uma amostra de todo o sangue de doadores voluntários com consentimento informado na clínica US HealthWorks (Faraday & El Camino Real, Carlsbad) foi obtida e recolhidos em tubos 4-15 BD Vacutainer CPT 8 ml (VWR Cat. N° BD362753). O volume de sangue total inicial aproximado de sangue total nos tubos CPT para cada um doador foi registrado utilizando a ficha de dados de ensaio PBMC.
[00836] A amostra de sangue foi misturada novamente imediatamente antes da centrifugação, invertendo suavemente os tubos de 8-10 vezes. Tubos CPT foram centrifugados à temperatura ambiente (18-25 oC) em um rotor horizontal (swing-out) por 30 min. em 1500-1800 RCF com pausa (2700 RPM Beckman Allegra 6R). As células foram recuperadas a partir da interface buffy coat (entre Ficoll e camadas de gel de polímero); transferidas para um tubo cônico estéril de 50 ml e reunidos em tubos 5 CPT/50 ml tubo/doador cônico. As células foram então lavadas duas vezes com PBS (Ca++, Mg++ livre; GIBCO). Os tubos foram enchidos até 50 ml e misturados pela inversão diversas vezes. A amostra foi então centrifugada em 330 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente (1215 rpm, em Beckman Allegra 6R) e foram aspirados sobrenadantes tanto quanto possíveis, sem perturbar o sedimento. O sedimento celular foi desalojado por agitação suave do tubo e as células foram ressuspensas em RPMI+10% FBS+pen/strep (~1 ml/10 ml volume de sangue total inicial). Uma amostra de 60 μl foi pipetada em um frasco de amostras (Beckman Coulter) com 600 μl de reagente VersaLyse (Beckman Coulter N° A09777) e foi suavemente agitada por 10-15 seg. Foi permitido que a amostra fosse incubada por 10 min. à temperatura ambiente, sendo novamente misturada antes da contagem. A suspensão de células foi contada no analisador de viabilidade da célula Vicell XR (Beckman Coulter), utilizando o tipo de célula PBMC (fator de diluição de 1:11 foi armazenado com outros parâmetros). Foi registrada a célula viva/ml e a viabilidade. A suspensão de células foi diluída para 1 x 107 PBMC vivo/ml em RPMI+10% FBS+pen/strep.
[00837] As células foram plaqueadas a 5 x 105 em 50 uL / poço placa de cultura do tecido de 96 poços (Falcon Microtest). 50 μl/poço de 2x concentração de oligos/controles diluídos em RPMI+10% FBS+pen/strep foram adicionados conforme modelo experimental (100 μl/poço total). As placas foram colocadas no agitador e foram deixadas para misturar por aprox. 1 min. Após serem incubadas por 24 horas a 37 oC; 5% de CO2, as placas foram centrifugadas a 400 x g por 10 minutos antes da remoção do sobrenadante para o ensaio de citocina MSD (ou seja, IL-6, IL-10, IL-8 e MCP-1 humana).
Exemplo 24: Avaliação dos Efeitos Pró-inflamatórios no Ensaio de hPBMC para ASOs conjugados GalNAc3-1
[00838] Os oligonucleotídeos antissenso (ASOs) listados na Tabela 30 foram avaliados quanto ao efeito pró-inflamatório no ensaio de hPBMC utilizando o protocolo descrito no Exemplo 23. ISIS 353512 é um padrão interno conhecido por ser um respondedor elevado para liberação de IL-6 no ensaio. Os hPBMCs foram isolados de doadores novos e voluntários e foram tratados com ASO em concentrações de 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 e 200 μM. Após um tratamento de 24 horas, os níveis de citocinas foram medidos.
[00839] Os níveis de IL-6 foram utilizados como leitura primária. A EC50 e Emáx foram calculados utilizando procedimentos padrão. Os resultados são expressos como a razão média de Emáx/EC50 de dois doadores e são denotados como "Emáx/EC50." A razão mais baixa indica uma diminuição relativa na resposta pró-inflamatória e a razão mais elevada indica um aumento relativo na resposta pró-inflamatória.
[00840] No que diz respeito aos compostos de teste, o composto menos pró-inflamatório foi o ASO ligado ao PS/PO (ISIS 616468). O ASO conjugado GalNAc3-1 ISIS 647535 era ligeiramente menos pró- inflamatório do que sua contraparte não-conjugada ISIS 304801. Estes resultados indicam que a incorporação de algumas ligações PO reduz a reação pró-inflamatória e adição de um conjugadoGalNAc3-1 não torna um composto mais pró-inflamatório e pode reduzir a resposta pró- inflamatória. Por conseguinte, seria de esperar que um composto antissenso compreendendo ligações PS/PO mistas e um conjugadoGalNAc3-1 produziria respostas pró-inflamatórias mais baixas em relação ao composto antissenso ligado ao PS completo, com ou sem um conjugadoGalNAc3-1. Estes resultados demonstram que compotos antissenso conjugadosGalNAc3-1 , particularmente aqueles conjugados com teor reduzido de PS são menos pró-inflamatórios.
[00841] Juntos, estes resultados sugerem que um composto conjugadoGalNAc3-1, particularmente um com teor reduzido de PS, pode ser administrado a uma dose mais elevada do que um composto antissenso do PS completo da contraparte desprovido do conjugado GalNAc3-1. Uma vez que não se espera que a meia-vida seja substancialmente diferente para estes compostos, essa administração resultaria em uma dosagem menos frequente. Na verdade essa administração poderia ser ainda menos frequente, porque os compostos conjgados GalNAc3-1 são mais potentes (Ver Exemplos 20-22) e a nova dosagem é necessária uma vez que a concentração de um composto ficou abaixo de um nível desejado, em que esse nível desejado se baseia na potência.Tabela 30 ASOs Modificados
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[00842] Subscritos: "e" indicam nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2'-desoximbonucleosídeo; "k" indica 6'(S)CH3 nucleosídeo bicíclico (por exemplo, cEt); "s" indica ligações internucleosídeas de fosforotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídeas de fosfodiéster (PO); e "o" indica -O-P (=O)(OH)-. O subscrito m" indica 5-metilcitosinas. "Ado'-GalNAc3-1a" indica um conjugado com a estrutura GalNAc3-1 mostrada no Exemplo 9 anexado à extremidade 3'do oligonucleotídoe antissenso, como indicado. Tabela 31 Efeito de Pró-inflamatório dos ASOs direcionando ApoC III no ensaio de hPBMC
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Exemplo 25: Efeito do ASO modificado do conjugado GalNAc3-1 direcionando ApoC III humana in vitro
[00843] ISIS 304801 e 647535 descritos acima foram testados in vitro. As células de hepatócitos primários de camundongos transgênicos em uma densidade de 25.000 células por poço, foram tratados com concentrações de 0,03,0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 e 20 μM de oligonucleotídeos modificados. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA foram medidos por PCR em tempo real e os níveis de mRNA de hApoC III foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA total, conforme medido por RIBOGREEN®.
[00844] A IC50 foi calculada usando métodos padrão e os resultados são apresentados na Tabela 32. Como ilustrado, uma potência comparável foi observada em células tratadas com ISIS 647535 em comparação com o controle, ISIS 304801.Tabela 32 ASO Modificado direcionando ApoC III humano em hepatócitos primaries
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[00845] Neste experimento, os grandes benefícios d e potência da conjugação GalNAc3-1 que são observados in vivo não foram observados in vitro. Experimentos de absorção livres subsequentes em hepatócitos primários in vitro mostraram aumento da potência de oligonucletoídeos compreendendo vários conjugados GalNAc relativos aos oligonucleotídeos desprovidos do conjugado GalNAc. (ver Exemplos 60, 82 e 92)
Exemplo 26: Efeito das ligações PO/PS na Atividade do ASO da ApoC III
[00846] Camundongos transgênicos ApoC III humana foram injetados por via intraperitoneal uma vez em 25 mg/kg de ISIS 304801 ou 616468 (descritos acima) ou com controle tratado com PBS uma vez por semana por duas semanas. O grupo tratamento consistiu em 3 animais e o grupo controle consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camundongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a última administração.
[00847] As amostras foram coletadas e analisadas para determinar os níveis da proteína ApoC III no fígado descritos acima (Exemplo 20). Os dados dessas análises são apresentados na Tabela 33 abaixo.
[00848] Estes resultados mostram redução na potência de compostos antissenso com PO/PS (ISIS 616468) nas asas relativas ao PS completo (ISIS 304801).Tabela 33 Efeito do tratamento com ASO nos níveis da proteína ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana
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Exemplo 27: Composto 56
[00849] Composto 56 está comercialmente disponível de Glen Research, ou pode ser preparados de acordo com procedimentos publicados relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
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Exemplo 28: Preparação do Composto 60
[00850] O composto 4 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 2. O composto 57 está comercialmente disponível. Composto 60 foi confirmado por análise estrutural.
[00851] Composto 57 destina-se a ser representativo e não se destina a ser limitante como outro monoalquil diol protegido substituído ou não substituído, incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados para preparar fosforamiditas com uma composição predeterminada.
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Exemplo 29: Preparação do Composto 63
[00852] Os compostos 61 e 62 são preparados utilizando procedimentos semelhantes aos relatados por Tober et al., Eur. J. Org.Chem., 2013, 3, 566-577; e Jiang et al., Tetrahedron, 2007, 63(19),3982-3988.
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[00853] Alternativamente, o Composto 63 é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados na literatura científica e de patentes por Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; e Kim et al., Pedido Internacional PCT publicado, WO 2004063208.
Exemplo 30: Preparação do Composto 63b
[00854] Composto 63a é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados por Hanessian et al., Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74 (9), 1731-1737.
Figure img0185
Exemplo 31: Preparação de Composto 63d
[00855] Composto 63d é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados por Chen et al., Chinese Chemical Letters, 1998, 9 (5), 451-453.
Figure img0186
Exemplo 32: Preparação do Composto 67
[00856] O composto 64 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 2. Composto 65 é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados por Or et al., Pedido Internacional PCT publicado, WO 2009003009. Os grupos protetores utilizados para o Composto 65 são destinados a serem representativos e não pretendem ser limitantes como outros grupos protetores, incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados.
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Exemplo 33: Preparação do Composto 70
[00857] O composto 64 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 2. O composto 68 está comercialmente disponível. Os grupos protetores utilizados para o Composto 68 são destinados a serem representativos e não pretendem ser limitantes como outros grupos protetores, incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados.
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Exemplo 34: Preparação do Composto 75a
[00858] Composto 75 é preparado de acordo com os procedimentos publicados relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research,1997, 25 (22), 4447-4454.
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Exemplo 35: Preparação do Composto 79
[00859] Composto 76 foi preparado de acordo com os procedimentos publicados relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
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Exemplo 36: Preparação do Composto 79a
[00860] O composto 77 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 35.
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Exemplo 37: Método geral para a preparação do composto oligomérico conjugado 82 compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5 ' via suporte sólido (Método I)
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em que GalNAc3-2 tem a estrutura:
Figure img0193
[00861] A parte do grupo de GalNAc3 do grupo conjugado GalNAc3- 2 (GalNAc3-2a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para prover uma variedade de grupos conjugados. Onde GalNAc3-2a tem a fórmula:
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[00862] Composto oligomérico ligado ao VIMAD 79B foi preparado utilizando procedimentos-padrão para síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 36233627). Os compostos de fosforamidita 56 e 60 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 27 e 28, respectivamente. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamiditas, incluindo, entre outros, aquelas apresentadas na especificação aqui contida podem ser usadas para preparar compostos oligoméricos com um grupo conjugado ligado do fosfodiéster no terminal 5'. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos neste instrumento com qualquer sequência ou composição predeterminada.Exemplo 38: Método alternativo para a preparação do composto oligomérico conjugado 82 compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5' (Método II)
Figure img0195
[00863] Composto oligomérico ligado ao VIMAD 79B foi preparado utilizando procedimentos padrão para síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 36233627). Fosforamidita do grupo GalNAc3-2 , Composto 79 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 35. Este método alternativo permite uma instalação de uma etapa do do conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster para o composto oligomérico na etapa final da síntese. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamiditas, incluindo, entre outros, aquelas apresentadas na especificação aqui contida podem ser usadas para preparar compostos oligoméricos com um grupo conjugado ligado do fosfodiéster no terminal 5'. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos neste instrumento com qualquer sequência ou composição predeterminada.Exemplo 39: Método geral para a preparação de composto oligomérico de 83h compreendendo Conjugado GalNAc3-3 no terminal 5' (GalNAc3-1 modificado para anexação da extremidade 5') via Suporte Sólido
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[00864] O composto 18 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 4. Os compostos 83a e 83b estão disponíveis comercialmente. O composto oligomérico 83e, compreendendo uma hexilamina ligada ao fosfodiéster foi preparada usando procedimentos de síntese de oligonucleotídeo padrão. O tratamento do composto oligomérico protegido com amônia aquosa forneceu composto oligomérico conjugado 5'-GalNAc3(83h).
[00865] Onde GalNAc3-3 tem a estrutura:
Figure img0197
[00866] A parte do grupo de GalNAc3 do grupo conjugado GalNAc3- 3 (GalNAc3-3a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para prover uma variedade de grupos conjugados. Onde GalNAc3-3a tem a fórmula:
Figure img0198
Exemplo 40: Método alternativo para a preparação do composto oligomérico conjugado 89 compreendendo um conjugado GalNAc3-4 ligado ao fosfodiéster no terminal 3' via suporte sólido
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[00867] Em que GalNAc3-4 tem a estrutura:
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[00868] Em que CM é uma porção clivável. Em determinadas modalidades, a porção clivável é:
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[00869] A parte do grupo de GalNAc3 do grupo conjugado GalNAc3- 4 (GalNAc3-4a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para prover uma variedade de grupos conjugados. Onde GalNAc3-4a tem a fórmula:
Figure img0203
[00870] O Composto 30 do suporte sólido funcionalizado do Unylinker 30 protegido está comercialmente disponível. Composto 84 é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados na literatura (ver Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4447-4454; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 30353041; e Hornet et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4842-4849).
[00871] Os blocos de construção de fosforamidita, Compostos 60 e 79a são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 28 e 36. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamiditas podem ser utilizados para preparar compostos oligoméricos com um conjugado ligado ao fosfodiéster no terminal 3' com uma sequência e composição predeterminadas. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos neste instrumento com qualquer sequência ou composição predeterminada.
Exemplo 41: Método geral para a preparação de ASOs compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster (Ver Exemplo 37, Bx é adenina) na posição 5' via técnicas de fase sólida (preparação do ISIS 661134)
[00872] Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e soluções utilizadas para a síntese dos compostos oligoméricos são adquiridas de fontes comerciais. Blocos de construção de fosforamidita padrão e suporte sólido são usados para a incorporação de resíduos de nucleosídeos que incluem, por exemplo, T, A, G, e mResíduos C. Compostos de fosforamidita 56 e 60 foram utilizados para sintetizar o conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5'. Uma solução de fosforamidita a 0,1 M em anidro acetonitrila foi utilizada para β -D-2'- desoxirribonucleosídeo e 2'-MOE.
[00873] As sínteses ASO foram realizadas em sintetizador ABI 394 (escala de 1-2 μmol) ou em sintetizador oligopiloto GE Healthcare Bioscience ÃKTA (escala de 40-200 μmol) pelo método de acoplamento de fosforamidita em suporte sólido VIMAD (110 μmol/g, Guzaev et al., 2003) empacotada na coluna. Para a etapa de acoplamento, as fosforamiditas foram entregues 4 vezes em excesso sobre a carga sobre a carga inicial do suporte sólido e acoplamento da fosforamidita foi realizada por 10 min. Todas as outras etapas seguiram os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Uma solução de ácido dicloroacético a 6% em tolueno foi utilizada para remover o grupo dimetoxitritila (DMT) dos grupos 5'-hidroxila do nucleotídeo. 4,5-Dicianoimidazol (0,7 M) em anidro CH3CN foi usado como ativador durante a etapa de acoplamento. As ligações de fosforotioato foram introduzidas por sulfurização com solução a 0,1 M de hidreto de xantano em piridina/CH3CN 1:1 para um tempo de contato de 3 minutos. Uma solução de 20% terc- butilhidroperóxido em CH3CN contendo 6% de água foi utilizada como um agente oxidante para prover ligações internucleosídeas de fosfodiéster com um tempo de contato de 12 minutos.
[00874] Depois da sequência desejada ter sido montada, os grupos protetores de cianoetil fosfato foram desprotegidos usando uma dietilamina a 20% em tolueno (v/v) com um tempo de contato de 45 minutos. ASOs de ligação de suporte sólido foram suspensos em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecidos a a 55 oC por 6 h.
[00875] Os ASO não ligados foram então filtrada e a amônia foi fervida. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida de alta pressão em uma coluna de troca aniônica forte (GE Healthcare Bioscience, Fonte 30Q, 30 μm, com 2,54 x 8 cm, A = 100 mM acetato de amônia em 30% de CH 3CN aquoso, B = 1,5 M de NaBr, em A, 040% de B em 60 min, fluxo 14 mL min-1, A = 260 nm). O resíduo foi dessalinizado por HPLC em uma coluna de fase inversa para produzir ASOs desejados com um rendimento isolado de 15-30% com base na carga inicial sobre o suporte sólido. ASOs foram caracterizados pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD.Tabela 34 ASO compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster na posição 5' direcionando SRB-1
Figure img0204
[00876] Subscritos: "e" indicam nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica β-D-2'-desoximbonucleosideo; "k" indica 6'(S)CH3 nucleosídeo bicíclico (por exemplo, cEt); "s" indica ligações internucleosídeas de fosforotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídeas de fosfodiéster (PO); e "o" indica -O-P (=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5- metilcitosinas. A estrutura de GalNAc3-2aé apresentada no Exemplo 37.
Exemplo 42: Método geral para a preparação de ASO compreendendo conjugado GalNAc3-3 na posição 5' via técnicas em fase sólida (preparação do ISIS 661166)
[00877] A síntese para ISIS 661.166 foi realizada usando procedimentos semelhantes ilustrados nos Exemplos 39 e 41.
[00878] ISIS 661166 é um mero de lacuna 5-10-5 MOE, em que a posição 5'compreende um conjugado GalNAc3-3. ASO foi caracterizado pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD.Tabela 34a ASO compreendendo um conjugado GalNAc3-3 na posição 5' via ligação de fosfodiéster hexilamina direcionando Malat-1
Figure img0205
[00879] Subscritos: "e" indica o nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica o β-D-2'-desoximbonucleosideo; "s" indica as ligações internucleosídeos de fosforotioato (PS); "o" indica as ligações internucleosídeos de fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5-metilcitosinas. A estrutura de "5'-GalNAc3-3a " é mostrada no Exemplo 39.
Exemplo 43: Estudo dependente de dose de GalNAc3-2 ligado a fosfodiéster (ver os exemplos 37 e 41, Bx é adenina) no terminal 5' direcionado ao SRB-1 in vivo
[00880] ISIS 661134 (ver o Exemplo 41) que compreende um conjugado GalNAc3-2 ligado a fosfodiéster no terminal 5' fio testado em um estudo dependente de dose para a inbição antissenso de SRB-1 em camundongos. O ISIS 440762 e 651900 não conjugados (GalNAc3-1 conjugado no terminal 3', ver o Exemplo 9) foram incluídos no estudo para comparação e são descritos anteriormente na Tabela 17.
Tratamento
[00881] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900, 661134 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". Os ED50s foram medidos usando métodos semelhantes, conforme descrito anteriormente e são apresentados a seguir.
[00882] Conforme ilustrado na Tabela 35, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso reduziu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem o conjugado de GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5' (ISIS 661134) ou o conjugado de GalNAc3-1 ligado no teminal 3' (ISIS 651900) mostraram melhora substancial de potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 440762). Além disso, ISIS 661134, que compreende o conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5' foi equipotente em comparação ao ISIS 651900, que compreende o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3'.Tabela 35 ASOs contendo GalNAc3-1 ou GalNAc3-2 direcionado ao SRB-1
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[00883] As estruturas para o 3' GalNAc3-1 e 5' GalNAc3-2 foram descritas anteriormente nos Exemplos 9 e 37.
Análise farmacocinética (PK)
[00884] A PK dos ASOs do grupo dose alta (7 mg/kg) foi examinada e avaliada da mesma forma como ilustrado no Exemplo 20. A amostra de fígado foi cortada e extraída usando protocolos padrão. Os metabólitos de comprimento total de 661134 (5' GalNAc3-2) e ISIS 651900 (3' GalNAc3-1) foram identificados e suas massas foram confirmadas por análise de espectrometria de massa de alta resolução. Os resultados mostraram que o maior metabólito detectado para o ASO compreendendo um conjugado de GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5' (ISIS 661134) foi ISIS 440762 (dados não mostrados). Nenhum metabólito adicional, num nível detectável, foi observado. Ao contrário de sua contraparte, os metabólitos adicionais semelhantes àqueles relatados anteriormente na Tabela 23a foram observados para o ASO tendo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3' (ISIS 651900). Esses resultados sugerem que ter o conjugado de GalNAc3-1 ou GalNAc3-2 pode melhorar o perfil da PK dos ASOs sem comprometer sua potência.
Exemplo 44: Efeito de ligações de PO/PS na inibição antissenso de ASOs compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 (ver o Exemplo 9) no terminal 3' direcionado ao SRB-1
[00885] ISIS 655861 e 655862 compreendendo um conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3', cada um se direcionando ao SRB-1, foram testados num estudo de administração única para sua capacidade em inibir o SRB-1 em camundongos. O composto não conjugado de origem, ISIS 353382 foi incluído no estudo para comparação.
[00886] Os ASOs são gapmeros 5-10-5 MOE, em que a região de lacuna compreende dez 2'-desoxirribonucleosídeos e cada região de asa compreende cinco nucleosídeos 2'-MOE modificados. Os ASOs foram preparados usando métodos semelhantes conforme ilustrado anteriormente no Exemplo 19 e são descritos na Tabela 36 abaixo.Tabela 36 Os ASOs modificados compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3' se direcionando ao SRB-1
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[00887] Subscritos: "e" indica o nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica o p-D-2'-desoximbonucleosídeo; "s" indica as ligações internucleosídeos de fosforotioato (PS); "o" indica as ligações internucleosídeos de fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. O sobrescrito "m" indica 5-metilcitosinas. A estrutura de "GalNAc3-1" é mostrada no Exemplo 9.
Tratamento
[00888] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 655862 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camundongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". Os ED50s foram medidos usando métodos semelhantes, conforme descrito anteriormente e são apresentados a seguir.
[00889] Conforme ilustrado na Tabela 37, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso reduziu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose em comparação ao controle tratado com PBS. De fato, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3' (ISIS 655861 e 655862) mostraram melhora substancial de potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Além disso, o ISIS 655862 com ligações de PS/PO mistas mostrou uma melhora na potência em relação ao PS completo (ISIS 655861).Tabela 37 Efeito de ligações de PO/PS na inibição antissenso de ASOs compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3' se direcionando ao SRB-1
Figure img0209
[00890] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidosem relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Os pesos dos órgãos também foram avaliados. Os resultados demonstraram que não foi observada nenhuma elevação nos níveis de transaminase (Tabela 38) ou pesos dos órgãos (dados não mostrados) em camundongos tratados com ASOs em comparação ao controle com PBS. Além disso, o ASO com ligações de PS/PO mistas (ISIS 655862) mostraram níveis de transaminase semelhantes em comparação ao P completo (ISIS 655861).Tabela 38 Efeito de ligações de PO/PS sobre os níveis de transaminase de ASOs compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3' se direcionando ao SRB-1
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Exemplo 45: Preparação de Éster de PFP, Composto 110a
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Figure img0212
[00891] O composto 4 (9,5 g, 28,8 mmol) foi tratado com o composto 103a ou 103b (38 mmol), individualmente, e TMSOTf (0,5 eq.) e peneiras moleculares em diclorometano (200 mL), e agitado por 16 horas à temperatura ambiente. Nesse tempo, a camada orgânica foi filtrada através de celite, em seguida lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida sob pressão reduzida. O óleo resultando foi purificado por cromatografia em gel de sílica (2%-->10% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 104a e 104b em >80% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00892] Os compostos 104a e 104b foram tratados nas mesmas condições como para os compostos 100a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 105a e 105b em >90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00893] Os compostos 105a e 105b foram tratados, individualmente, com o composto 90 sob as mesmas condições que os compostos 901a- d, para gerar os compostos 106a (80%) e 106b (20%). LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00894] Os compostos 106a e 106b foram tratados nas mesmas condições que os compostos 96a-d (Exemplo 47), para gerar o 107a (60%) e 107b (20%). LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00895] Os compostos 107a e 107b foram tratados nas mesmas condições que os compostos 97a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 108a e 108b em 40-60% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00896] Os compostos 108a (60%) e 108b (40%) foram tratados nas mesmas condições para os compostos 100a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 109a e 109b em >80% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00897] O composto 109a foi tratado nas mesmas condições que os compostos 101a-d (Exemplo 47), para gerar o Composto 110a em 3060% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura. Alternativamente, o Composto 110b pode ser preparado de forma semelhante, começando com o Composto 109b.
Exemplo 46: Procedimento Geral para Conjugação com Ésteres de PFP (Oligonucleotídeo 111); Preparação de ISIS 666881 (GalNAc3- 10)
[00898] Um oligonucleotídeo modificado 5'-hexilamino foi sintetizado e purificado usando procedimentos de oligonucleotídeo de fase sólida padrão. O oligonucleotídeo modificado 5'-hexilamino foi dissolvido em tetraborato de sódio 0,1 M, pH 8,5 (200 μL) e 3 equivalentes de um cluster de GalNAc3 esterificado com PFP selecionado dissolvido em DMSO (50 μL) foi adicionado. Se o éster de PFP precipitou após a adição na solução de ASO, DMSO foi adicionado até que todo o éster de PFP estivesse na solução. A reação foi concluída após cerca de 16 h de mistura à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com água a 12 mL e, em seguida, rotacionada em 3000 rpm em um filtro de rotação com um limite de massa de 3000 Da. Este processo foi repetido duas vezes para remover as impurezas de pequenas moléculas. A solução foi então liofilizada à secura e redissolvida em amônia aquosa concentrada e misturada à temperatura ambiente por 2,5 h seguido por concentração in vacuo para remover a maior parte da amônia. O oligonucleotídeo conjugado foi purificado e dessalinizado por RP-HPLC e liofilizado para fornecer o oligonucleotídeo conjugado a GalNAc3.
Figure img0213
[00899] O oligonucleotídeo 111 é conjugado com o GalNAc3-10. A parte de cluster de GalNAc3 do GalNAc3-10 de grupo do conjugado (GalNAc3-10a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)- como mostrado no oligonucleotídeo (ISIS 666881) sintetizado com o GalNAc3- 10 abaixo. A estrutura de GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0214
[00900] Após este procedimento geral, o ISIS 666881 foi preparado. O oligonucleotídeo modificado 5'-hexilamino, ISIS 660254, foi sintetizado e purificado usando procedimentos de oligonucleotídeo de fase sólida padrão. O ISIS 660254 (40 mg, 5,2 μmol) foi dissolvido em tetraborato de sódio 0,1 M, pH 8,5 (200 μL) e 3 equivalentes, foi adicionado éster de PFP (Composto 110a) dissolvido em DMSO (50 μL). O éster de PFP precipitou após a adição na solução de ASO, exigindo DMSO adicional (600 μL) para dissolver completamente o éster de PFP. A reação foi concluída após cerca de 16 h de mistura à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com água a 12 mL de volume total e rotacionada em 3000 rpm em um filtro de rotação com um limite de massa de 3000 Da. Este processo foi repetido duas vezes para remover as impurezas de pequenas moléculas. A solução foi liofilizada à secura e redissolvido em amônia aquosa concentrada com mistura à temperatura ambiente por 2,5 h seguido por concentração in vacuo para remover a maior parte da amônia. O oligonucleotídeo conjugado foi purificado e dessalinizado por RP-HPLC e liofilizado para gerar o ISIS 666881 em 90% de rendimento em peso (42 mg, 4,7 μmol). Oligonucleotídeo conjugado a GalNAc3-10
Figure img0215
Figure img0216
[00901] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.Exemplo 47: Preparação do Oligonucleotídeo 102 Compreendendo GalNAc3-8
Figure img0217
Figure img0218
[00902] O triácido 90 (4 g, 14,43 mmol) foi dissolvido em DMF (120 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (12,35 mL, 72 mmol). Trifluoroacetato de pentafluorofenil (8,9 mL, 52 mmol) foi adicionado em gotas, sob argônio, e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 30 minutos. Boc-diamina 91a ou 91b (68,87 mmol) foi adicionada, juntamente com N,N-Di-isopropiletilamina (12,35 mL, 72 mmol), e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica (2%-->10% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 92a e 92b em um rendimento de aproximadamente 80%. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00903] O composto 92a ou 92b (6,7 mmol) foi tratado com 20 mL de diclorometano e 20 mL de ácido trifluoroacético à temperatura ambiente por 16 horas. A solução resultante foi evaporada e, em seguida, dissolvida em metanol e tratada com resina DOWEX-OH por 30 minutos. A solução resultante foi filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida para gerar 85-90% de rendimento dos compostos 93a e 93b.
[00904] O composto 7 ou 64 (9,6 mmol) foram tratados com HBTU (3,7 g, 9,6 mmol) e N,N-Di-isopropiletilamina (5 mL) em DMF (20 mL) por 15 minutos. A isto foi adicionado qualquer um do composto 93a ou 93b (3 mmol), e deixado agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica (5%-->20% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 96a-d em 20-40% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00905] Os compostos 96a-d (0,75 mmol), individualmente, foram hidrogenados com Níquel de Raney por 3 horam em Etanol (75 mL). Nesse tempo, o catalisador foi removido por filtração através de celite, e o etanol removido sob pressão reduzida para gerar os compostos 97a- d em 80-90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00906] O composto 23 (0,32 g, 0,53 mmol) foi tratado com HBTU (0,2 g, 0,53 mmol) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,19 mL, 1,14 mmol) em DMF (30mL) por 15 minutos. A isto foram adicionados os compostos 97a-d (0,38 mmol), individualmente, e deixados agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica (2%-- >20% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 98a-d em 3040% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00907] O composto 99 (0,17 g, 0,76 mmol) foi tratado com HBTU (0,29 g, 0,76 mmol) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,35 mL, 2,0 mmol) em DMF (50mL) por 15 minutos. A isto foram adicionados os compostos 97a-d (0,51 mmol), individualmente, e deixados agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica (5%-- >20% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 100a-d em 4060% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00908] Os compostos 100a-d (0,16 mmol), individualmente, foram hidrogenados com 10% Pd(OH)2/C por 3 horas em metanol/acetato de etil (1:1, 50 mL). Nesse tempo, o catalisador foi removido por filtração através de celite, e os compostos orgânicos removidos sob pressão reduzida para gerar os compostos 101a-d em 80-90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
[00909] Os compostos 101a-d (0,15 mmol), individualmente, foram dissolvidos em DMF (15 mL) e piridina (0,016 mL, 0,2 mmol). Trifluoroacetato de pentafluorofenil (0,034 mL, 0,2 mmol) foi adicionado em gotas, sob argônio, e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 30 minutos. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica (2%-- >5% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 102a-d num rendimento aproximado de 80%. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.
Figure img0219
[00910] O composto oligomérico 102, compreendendo um grupo conjugado de GalNAc3-8, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo do conjugado de GalNAc3-8 (GalNAc3-8a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em uma modalidade preferencial, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[00911] A estrutura de GalNAc3-8 (GalNAc3-8a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0220
Exemplo 48: Preparação do Oligonucleotídeo 119 Compreendendo GalNAc3-7
Figure img0221
[00912] O composto 112 foi sintetizado após o procedimento descrito na literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
[00913] O composto 112 (5 g, 8,6 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etil (22 mL/22 mL). Foi adicionado hidróxido de paládio em carbono (0,5 g). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma camada de celite e lavada a camada com 1:1 de metanol/acetato de etil. O filtrado e as lavagens foram combinadas e concentradas à secura para produzir o Compostos 105a (quantitativo). A estrutura foi confirmada por LCMS.
[00914] O composto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) e DIEA (2,8 mL, 16,2 mmol) foram dissolvidos em DMF (17 mL) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 min. A isto, uma solução do Composto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) em DMF anidro (20 mL) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 6 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida para obter um óleo. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com solução de NaHCO aquoso saturada3 (100 mL) e salmoura (100 mL). A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com MeOH 10 a 20 % em diclorometano para produzir o Composto 114 (1,45 g, 30%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.
[00915] O composto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etil (4 mL/4 mL). Foi adicionado paládio em carbono (úmido, 0,14 g). A mistura de reação foi carregada com hidrogênio e agitada à temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma camada de celite. A camada de celite foi lavada com metanol/acetato de etil (1:1). O filtrado e as lavagens foram combinadas e evaporadas sob pressão reduzida para produzir o Composto 115 (quantitativo). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.
[00916] O composto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) e DIEA (0,26 mL, 1,5 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (5 mL) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 min. A isto, uma solução do Composto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) em DMF anidro foi adicionada e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 6 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em CH2Cl2. A camada orgânica foi lavada com solução de NaHCO3 aquosa saturada e salmoura e seca com Na2SO4 anidro e filtrada. A camada orgânica foi concentrada à secura e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com MeOH 3 a 15% em diclorometano para produzir o Composto 116 (0,84 g, 61%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.
Figure img0222
[00917] O composto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etil (5 mL/5 mL). Foi adicionado paládio em carbono (úmido, 0,074 g). A mistura de reação foi carregada com hidrogênio e agitada à temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma camada de celite. A camada de celite foi lavada com metanol/acetato de etil (1:1). O filtrado e as lavagens foram combinadas e evaporadas sob pressão reduzida para produzir o composto 117 (0,73 g, 98%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.
[00918] O composto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (3 mL). A esta solução, N,N-Di-isopropiletilamina (70 μL, 0,4 mmol) e trifluoroacetato de pentafluorofenil (72 μL, 0,42 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 12 h e vertida em uma solução de NaHCO3 aquosa saturada. A mistura foi extraída com diclorometano, lavada com salmoura e seca com Na2SO4anidro. A solução de diclorometano foi concentrada à secura e purificada com cromatografia de coluna em gel de sílica e eluída com MeOH 5 a 10% em diclorometano para produzir o composto 118 (0,51 g, 79%). A estrutura foi confirmada por LCMS e 1H e 1H e 19F RMN.
Figure img0223
[00919] O Composto Oligomérico 119, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-7, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[00920] A estrutura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0224
Exemplo 49: Preparação do Oligonucleotídeo 132 Compreendendo GalNAc3-5
Figure img0225
[00921] O composto 120 (14,01 g, 40 mmol) e HBTU (14,06 g, 37 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (80 mL). Trietilamina (11,2 mL, 80,35 mmol) foi adicionada e agitada por 5 min. A mistura de reação foi resfriada em banho gelado e uma solução do composto 121 (10 g, mmol) em DMF anidro (20 mL) foi adicionada. Trietilamina adicional (4,5 mL, 32,28 mmol) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada por 18 h sob atmosfera de argônio. A reação foi monitorada por TLC (acetato de etil:hexano; 1:1; Rf = 0,47). O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi absorvido em EtOAc (300 mL) e lavado com 1M NaHSO4 (3 x 150 mL), solução de NaHCO3 aquosa saturada (3 x 150 mL) e salmoura (2 x 100 mL). Camada orgânica foi seca com Na2SO4. O agente de secagem foi removido por filtração e a camada orgânica foi concentrada por evaporação giratória. A mistura crua foi purificada por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluída, usando-se EtOAc 35 - 50% em hexano para produzir um composto 122 (15,50 g, 78,13%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN. Massa m/z 589,3 [M + H]+.
[00922] Uma solução de LiOH (92,15 mmol) em água (20 mL) e THF (10 mL) foi adicionada a uma solução resfriada do Composto 122 (7,75 g, 13,16 mmol) dissolvido em metanol (15 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 45 min e monitorada por TLC (EtOAc:hexano; 1:1). A mistura de reação foi concentrada à metade do volume sob pressão reduzida. A solução restante foi resfriada em banho gelado e neutralizado, adicionando-se HCl concentrado. A mistura de reação foi diluída, extraída com EtOAc (120 mL) e lavada com salmoura (100 mL). Uma emulsão foi formada e limpa durante a noite. A camada orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada para produzir o Composto 123 (8,42 g). O sal residual é a causa provável de excesso de massa. LCMS é consistente com a estrutura. O produto foi usado sem nenhuma purificação adicional. M.W.cal:574,36; M.W.fd:575,3 [M + H]+.
Figure img0226
[00923] O composto 126 foi sintetizado após o procedimento descrito a literatura (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 958-963).
Figure img0227
Figure img0228
[00924] O composto 123 (7,419 g, 12,91 mmol), HOBt (3,49 g, 25,82 mmol) e o composto 126 (6,33 g, 16,14 mmol) foram dissolvidos em DMF (40 mL) e a mistura de reação resultante foi resfriada em banho gelado. A isto, N,N-Di-isopropiletilamina (4,42 mL, 25,82 mmol), PyBop (8,7 g, 16,7 mmol) seguido por agente de acoplamento Bop (1,17 g, 2,66 mmol) foram adicionados sob uma atmosfera de argônio. O banho gelado foi removido e a solução foi deixada aquecer à temperatura ambiente. A reação foi concluída 1 h como determinado por TLC (DCM:MeOH:AA; 89:10:1). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (200 mL) e lavado com 1 M NaHSO4 (3x100 mL), NaHCO3aquoso saturado (3x100 mL) e salmoura (2x100 mL). A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica com um gradiente de 50% hexanos/EtOAC a 100% EtOAc para produzir o Composto 127 (9,4 g) como uma espuma branca. LCMS e 1H RMN foram consistentes com a estrutura. Massa m/z 778,4 [M + H] +.
[00925] Ácido trifluoroacético (12 mL) foi adicionado a uma solução do composto 127 (1,57 g, 2,02 mmol) em diclorometano (12 mL) e agitado à temperatura ambiente por 1 h. A mistura de reação foi coevaporada com tolueno (30 mL) sob pressão reduzida à secura. O resíduo obtido foi coevaporado duas vezes com acetonitrila (30 mL) e tolueno (40 mL) para produzir o Composto 128 (1,67 g) como sal de trifluoro acetato para a etapa seguinte sem purificação adicional. LCMS e 1H RMN foram consistentes com a estrutura. Massa m/z 478,2 [M + H] + .
[00926] O composto 7 (0,43 g, 0,963 mmol), HATU (0,35 g, 0,91 mmol), e HOAt (0,035 g, 0,26 mmol) foram combinados e secos por 4 h com P2O5 sob pressão reduzida em um frasco de fundo redondo e, em seguida, dissolvidos em DMF anidro (1 mL) e agitados por 5 min. A isto, uma solução do composto 128 (0,20 g, 0,26 mmol) em DMF anidro (0,2 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,2 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de argônio. A reação foi concluída após 30 min como determinado por LCMS e TLC (7% MeOH/DCM). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DCM (30 mL) e lavado com 1 M NaHSO4 (3x20 mL), NaHCO3 aquoso saturado (3 x 20 mL) e salmoura (3x20 mL). A fase orgânica foi separada, seca com Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica usando 5-15% de MeOH em diclorometano para produzir o Composto 129 (96,6 mg). LCMS e1H RMN são consistentes com a estrutura. Massa m/z 883,4 [M + 2H]+.
[00927] O composto 129 (0,09 g, 0,051 mmol) foi dissolvido em metanol (5 mL) em 20 mL de frasco de cintilação. A isto, foi adicionada uma pequena quantidade de 10% Pd/C (0,015 mg) e o recipiente de reação foi carregado com gás H2. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de H2 por 18 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma camada de Celite e a camada de Celite foi lavada com metanol. As lavagens do filtrado foram agrupadas e concentradas sob pressão reduzida para produzir o Composto 130 (0,08 g). LCMS e 1H RMN foram consistentes com a estrutura. O produto foi usado sem nenhuma purificação adicional. Massa m/z 838,3 [M + 2H]+.
[00928] A um frasco de fundo redondo pontudo de 10 mL foram adicionados o composto 130 (75,8 mg, 0,046 mmol), 0,37 M de piridina/DMF (200 μL) e uma barra de agitação. A esta solução, foi adicionada 0,7 M de trifluoroacetato de pentafluorofenil/DMF (100 μL) em gotas com agitação. A reação foi concluída após 1 hora, como determinado por LCMS. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em CHCl3 (~10 mL). A camada orgânica foi particionada contra NaHSO4 (1 M, 10 mL), NaHCO3 aquosa saturada (10 mL) e salmoura (10 mL) três vezes cada. A fase orgânica foi separada e seca com Na2SO4, filtrada e concentrada para produzir o Composto 131 (77,7 mg). LCMS é consistente com a estrutura. Usado sem purificação adicional. Massa m/z 921,3 [M + 2H]+.
Figure img0229
[00929] O composto oligomérico 132, compreendendo um grupo conjugado de GalNAc3-5, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo conjugado de GalNAc3-5 (GalNAc3-5a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade dos grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[00930] A estrutura de GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0230
Exemplo 50: Preparação do Oligonucleotídeo 144 Compreendendo GalNAc4-11
Figure img0231
Figure img0232
[00931] Síntese do Composto 134: A um frasco de Merrifield foi adicionada resina de aminometil VIMAD (2,5 g, 450 μmol/g) que foi lavada com acetonitrila, dimetilformamida, diclorometano e acetonitrila. A resina foi inchada em acetonitrila (4 mL). O composto 133 foi pré- ativado em um frasco de fundo redondo de 100 mL, adicionando-se 20 (1,0 mmol, 0,747 g), TBTU (1,0 mmol, 0,321 g), acetonitrila (5 mL) e DIEA (3,0 mmol, 0,5 mL). Esta solução foi deixada agitar por 5 min e foi então adicionada ao frasco de Merrifield com agitação. A suspensão foi deixada agitar por 3 h. A mistura de reação foi drenada e a resina foi lavada com acetonitrila, DMF e DCM. Um novo carregamento de resina foi quantificado, medindo-se a absorbância do cátion de DMT em 500 nm (coeficiente de extinção = 76000) em DCM e determinado para ser 238 μmol/g. A resina foi revestida, suspendendo-se em uma solução de anidrido acético por dez minutos três vezes.
[00932] O composto ligado ao suporte sólido 141 foi sintetizado usando métodos iterativos de síntese de peptídeo de fase sólida à base de Fmoc. Uma pequena quantidade de suporte sólido foi retirada e suspensa em amônia aquosa (28-30% em peso) por 6 h. O composto clivado foi analisado por LC-MS e a massa observada foi consistente com a estrutura. Massa m/z 1063,8 [M + 2H]+.
[00933] O composto ligado ao suporte sólido 142 foi sintetizado usando os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida.
Figure img0233
[00934] O composto ligado ao suporte sólido 143 foi sintetizado usando síntese de fase sólida padrão em um sintetizador de DNA.
[00935] O composto ligado ao suporte sólido 143 foi suspenso em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecido a 55 oC por 16 h. A solução foi resfriada e o suporte sólido foi filtrado. O filtrado foi concentrado e o resíduo dissolvido em água e purificado por HPLC em uma coluna de troca de ânion forte. As frações contendo o composto de comprimento total 144 foram agrupadas e dessalinizadas. O composto oligomérico conjugado a GalNAc4-11 foi analisado por LC-MS e a massa observada foi consistente com a estrutura.
[00936] A parte de cluster de GalNAc4 do grupo do conjugado de GalNAc4-11 (GalNAc4-11a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é-P(=O)(OH)-Ad- P(=O)(OH)-.
[00937] A estrutura de GalNAc4-11 (GalNAc4-11a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0234
Exemplo 51: Preparação do Oligonucleotídeo 155 Compreendendo GalNAc3-6
Figure img0235
[00938] O composto 146 foi sintetizado como descrito na literatura (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
Figure img0236
[00939] O composto 4 (15 g, 45,55 mmol) e o composto 35b (14,3 gramas, 57 mmol) foram dissolvidos em CH2Cl2 (200 ml). Peneiras moleculares ativadas (4 Â. 2 g, em pó) foram adicionadas, e a reação foi deixada agitar por 30 minutos sob atmosfera de nitrogênio. TMS-OTf foi adicionado (4,1 ml, 22,77 mmol) e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante a noite. Após conclusão, a reação foi extinta vertendo-se em uma solução de NaHCO 3aquoso saturado (500 ml) e gelo esmagado (~150 g). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca com MgSO4, filtrada, e foi concentrada em um óleo laranja sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com 2-10 % MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 112 (16,53 g, 63%). LCMS e 1H RMN foram consistentes com o composto esperado.
[00940] O composto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (40 ml). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono, 400 mg) foi adicionado, e o gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em CH2Cl2, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração através de uma camada de celite. O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 105a (3,28 g). LCMS e 1H RMN foram consistentes com o produto desejado.
[00941] O composto 147 (2,31 g, 11 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (100 mL). N,N-Di-isopropiletilamina (DIEA, 3,9 mL, 22 mmol) foi adicionada, seguido por HBTU (4 g, 10,5 mmol). A mistura de reação foi deixada agitar por ~15 minutos sob nitrogênio. A isto, uma solução do composto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) em DMF seco foi adicionada e agitada por 2 h sob atmosfera de nitrogênio. A ração foi diluída com EtOAc e lavada com NaHCO aquoso saturado3 e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada e concentrada em um xarope laranja. O material bruto foi purificado por cromatografia de coluna 2-5 % MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 148 (3,44 g, 73 %). LCMS e1H RMN foram consistentes com o produto esperado.
[00942] O composto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (75 ml). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono) foi adicionado (350 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração através de uma camada de celite. O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 149 (2,6 g). A LCMS foi consistente com o produto desejado. O resíduo foi dissolvido em DMF seco (10 ml) e foi usado imediatamente na etapa seguinte.
Figure img0237
[00943] O composto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) foi dissolvido em DMF seco (20 ml). A isto, DIEA (450 μL, 2,6 mmol, 1,5 eq.) e HBTU (1,96 g, 0.5.2 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi deixada agitar por 15 minutos à temperatura ambiente sob nitrogênio. Uma solução do composto 149 (2,6 g) em DMF anidro (10 mL) foi adicionada. O pH da reação foi ajustado para pH = 9-10 pela adição de DIEA (se necessário). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente sob nitrogênio por 2 h. Após a conclusão, a reação foi diluída com EtOAc (100 mL), e lavada com NaHCO3aquoso saturado, seguido por salmoura. A fase orgânica foi separada, seca com MgSO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluída com 210 % de MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 150 (0,62 g, 20%). LCMS e1H RMN foram consistentes com o produto desejado.
[00944] O composto 150 (0,62 g) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (5 L). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono) foi adicionado (60 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração (filtro de Teflon na ponta da seringa, 0,45 μm). O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 151 (0,57 g). A LCMS foi consistente com o produto desejado. O produto foi dissolvido em 4 mL
Figure img0238
[00945] O composto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (5 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (75 μL, 1 mmol) e PFP-TFA (90 μL, 0,76 mmol) foram adicionados. A mistura de reação se tornou magenta após o contato, e se torou gradualmente laranja durante os próximos 30 minutos. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão (formação de éster de PFP), uma solução do composto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) em DMF foi adicionada. O pH da reação foi ajustado para pH = 9-10 pela adição de N,N-Di- isopropiletilamina (se necessário). A mistura de reação foi agitada sob nitrogênio por ~30 min. Após a conclusão, a maior parte do solvente foi removida sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com CH2Cl2 e lavado com NaHCO3aquoso saturado, seguido por salmoura. A fase orgânica foi separada, seca com MgSO4, filtrada e concentrada num xarope laranja. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica (2-10 % de MeOH em CH2Cl2) para produzir o Composto 152 (0,35 g, 55%). LCMS e1H RMN foram consistentes com o produto desejado.
[00946] O composto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (10 mL). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono) foi adicionado (35 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração (filtro de Teflon na ponta da seringa, 0,45 μm). O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 153 (0,33 g, quantitativo). A LCMS foi consistente com o produto desejado.
[00947] O composto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (5 mL) com agitação sob nitrogênio. A isto, N,N-Di- isopropiletilamina (65 μL, 0,37 mmol) e PFP-TFA (35 μL, 0,28 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada sob nitrogênio por ~30 min. A mistura de reação se tornou magenta após o contato, e gradualmente se tornou laranja. O pH da mistura de reação foi mantida em pH = 9-10, adicionando-se mais N,-Di-isopropiletilamina. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a maior parte do solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com CH2Cl2 (50 mL), e lavado com NaHCO3aquoso saturado, seguido por salmoura. A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e concentrada num xarope laranja. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna e eluído com 2-10% MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 154 (0,29 g, 79%). LCMS e1H RMN foram consistentes com o produto desejado.
Figure img0239
[00948] O composto oligomérico 155, compreendendo um grupo do conjugado de GalNAc3-6, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo do conjugado de GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é-P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[00949] A estrutura de GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0240
Exemplo 52: Preparação do Oligonucleotídeo 160 Compreendendo GalNAc3-9
Figure img0241
[00950] O composto 156 foi sintetizado após o procedimento descrito na literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
[00951] O composto 156, (18,60 g, 29,28 mmol) foi dissolvido em metanol (200 mL). Paládio em carbono (6,15 g, 10% em peso, carregamento (base seca), pó de carbono de matriz, úmido) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob hidrogênio por 18 h. A mistura de reação foi enchida através de uma camada de celite e a camada de celite foi lavada completamente com metanol. O filtrado combinado foi lavado e concentrado à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com 5-10% de metanol em diclorometano para produzir o Composto 157 (14,26 g, 89%). Massa m/z 544,1 [M-H]-.
[00952] O composto 157 (5 g, 9,17 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (30 mL). HBTU (3,65 g, 9,61 mmol) e N,N-Di-isopropiletilamina (13,73 mL, 78,81 mmol) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 minutos. A isto, foi adicionada uma solução do composto 47 (2,96 g, 7,04 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 8 h. A mistura de reação foi vertida em uma solução aquosa de NaHCO3 saturado. A mistura foi extraída com acetato de etil e a camada orgânica foi lavada com salmoura e seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com 50% de acetato de etil em hexano para produzir o Composto 158 (8,25 g, 73,3%). A estrutura foi confirmada por MS e análise 1H RMN.
[00953] O composto 158 (7,2 g, 7,61 mmol) foi seco com P2O5 sob pressão reduzida. O composto seco foi dissolvido em DMF anidro (50 mL). A isto, 1H-tetrazol (0,43 g, 6,09 mmol) e N-metilimidazol (0,3 mL, 3,81 mmol) e fosforodiamidita de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropil (3,65 mL, 11,50 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada sob atmosfera de argônio por 4 h. A mistura de reação foi diluída com acetato de etil (200 mL). A mistura de reação foi lavada com NaHCO3 saturado e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica e eluído com 50-90% e acetato de etil em hexano para produzir o Composto 159 (7,82 g, 80,5%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise31P RMN.
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[00954] O composto oligomérico 160, compreendendo um grupo do conjugado de GalNAc3-9, foi preparado usando procedimentos de síntese de oligonucleotídeo padrão. Três unidades do composto 159 foram acopladas ao suporte sólido, seguido por fosforamiditas nucleotídicas. O tratamento do composto oligomérico protegido com amônia aquosa produziu o composto 160. A parte de cluster de GalNAc3do grupo do conjugado de GalNAc3-9 (GalNAc3-9a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é-P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-9 (GalNAc3-9a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0243
Exemplo 53: Procedimento alternativo para preparação do Composto 18 (GalNAc3-1a e GalNAc3-3a)
[00955] A lactona 161 foi reagida com diamino propano (3-5 eq) ou diamino propano protegido por Mono-Boc (1 eq) para fornecer o álcool 162a ou 162b. Quando a propanodiamina não protegida foi usada para a reação acima, o excesso de diamina foi removido por evaporação sob alto vácuo e o grupo amino livre em 162a foi protegido usando CbzCl para fornecer o 162b como um sólido branco após a purificação por cromatografia de coluna. O álcool 162b foi ainda reagido com o composto 4 na presença de TMSOTf para fornecer o 163a que foi convertido em 163b pela remoção do grupo Cbz usando hidrogenação catalítica. O éster de pentafluorofenil (PFP) 164 foi preparado, reagindo- se o triácido 113 (ver o Exemplo 48) com PFPTFA (3,5 eq) e piridina (3,5 eq) em DMF (0,1 a 0,5 M). O triéster 164 foi diretamente reagido com a amina 163b (3—4 eq) e DIPEA (3-4 eq) para fornecer o Composto 18. O método acima facilita grandemente a purificação dos intermediários e minimiza a formação de subprodutos que são formados usando o procedimento descrito no Exemplo 4.
Figure img0244
Exemplo 54: Procedimento alternativo para preparação do Composto 18 (GalNAc3-1a e GalNAc3-3a)
[00956] O éster triPFP 164 foi preparado a partir do ácido 113 usando o procedimento delineado no exemplo 53 acima e reagido com diamina protegida por mono-Boc para fornecer o 165 num rendimento essencialmente quantitativo. Os grupos Boc foram removidos com ácido clorídrico ou ácido trifluoroacético para fornecer a triamina que foi reagida com o ácido ativado por PFP 166 na presença de uma base adequada, tal como DIPEA para fornecer o Composto 18.
[00957] O ácido de Gal-NAc protegido por PFP 166 foi preparado a partir do ácido correspondente pelo tratamento com PFPTFA (1-1,2 eq) e piridina (1-1,2 eq) em DMF. O ácido precursor, por sua vez, foi preparado a partir do álcool correspondente por oxidação usando TEMPO (0,2 eq) e BAIB em acetonitrila e água. O álcool precursor foi preparado a partir do intermediário de açúcar 4 pela reação com 1,6- hexanodiol (ou 1,5-pentanodiol ou outro diol para outros n valores) (2-4 eq) e TMSOTf usando as condições descritas anteriormente no exemplo 47.
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Exemplo 55: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo tanto um grupo de conjugado em 3' quanto em 5' (comparação de GalNAc3-1, 3, 8 e 9) direcionados ao SRB-1 in vivo
[00958] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos diversos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado tanto ao terminal 3' quanto ao 5' do oligonucleotídeos respectivo por um nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivável). Tabela 39 ASO modificado direcionado ao SRB-1
Figure img0246
[00959] Letras maiúsculas indicam a nucleo base para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00960] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-9 foi mostrada anteriormente no Exemplo 52. A estrutura de GalNAc3-3 foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-8 foi mostrada anteriormente no Exemplo 47.
Tratamento
[00961] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB- 1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[00962] Conforme ilustrado na Tabela 40, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos que compreendem os conjugados de GalNAc3-1 e GalNAc3-9 ligados a fosfodiéster no terminal 3' (ISIS 655861 e ISIS 664078) e os conjugados de GalNAc3-3 e GalNAc3-8 ligados no terminal 5' (ISIS 661161 e ISIS 665001) mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Além disso, o ISIS 664078, que compreende um conjugado de GalNAc3-9 no terminal 3' foi essencialmente equipotente comparado ao ISIS 655861, que compreende um conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3'. Os oligonucleotídeos antissenso conjugados em 5', ISIS 661161 e ISIS 665001, que compreendem um GalNAc3-3 ou GalNAc3-9, respectivamente, tiveram maior potência em comparação aos oligonucleotídeos antissenso conjugados em 3' (ISIS 655861 e ISIS 664078). Tabela 40 ASOs contendo GalNAc3-1, 3, 8 ou 9 direcionado ao SRB-1
Figure img0247
[00963] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos- padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na tabela abaixo. Tabela 41
Figure img0248
Exemplo 56: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo tanto um grupo de conjugado em 3' quanto em 5' (comparação de GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 e 10) direcionados ao SRB- 1 in vivo
[00964] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos diversos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado ao terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo por um nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivável), exceto pelo ISIS 655861 que teve o grupo de conjugado de GalNAc3 ligado no terminal 3'. Tabela 42 ASO modificado direcionado ao SRB-1
Figure img0249
Figure img0250
[00965] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00966] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-2a foi mostrado anteriormente no Exemplo 37. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-5a foi mostrada anteriormente no Exemplo 49. A estrutura de GalNAc3-6a foi mostrada anteriormente no Exemplo 51. A estrutura de GalNAc3-7afoi mostrada anteriormente no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada anteriormente no Exemplo 46.
Tratamento
[00967] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB- 1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[00968] Conforme ilustrado na Tabela 43, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos antissenso mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Os oligonucleotídeos antissenso conjugados em 5' mostraram um ligeiro aumento na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso conjugado em 3'.Tabela 43
Figure img0251
Figure img0252
[00969] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 44 abaixo. Tabela 44
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Exemplo 57: Duração do estudo de ação de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado em 3' direcionado à ApoC III in vivo
[00970] Camundongos foram injetados uma vez que as doses indicadas abaixo e monitorados durante o curso de 42 dias para os níveis de ApoC-III e de triglicérides plasmáticos (TG plasmático). O estudo foi realizado usando 3 camundongos transgênicos que expressam a APOC-III humana em cada grupo. Tabela 45 ASO modificado direcionado à ApoC III
Figure img0255
[00971] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00972] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. Tabela 46 Níveis de mRNA de ApoC III (% de Salina no Dia 1) e TG Plasmático (% de Salina no Dia 1)
Figure img0256
[00973] Como pode ser visto na tabela acima, a duração da ação aumentou com a adição do grupo de conjugado em 3' em comparação ao oligonucleotídeo não conjugado. Houver um aumento adicional na duração da ação para o oligonucleotídeo de PO/PS misto conjugado 647536 em comparação ao oligonucleotídeo PS completo conjugado 647535.
Exemplo 58: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado em 3' (comparação de GalNAc3-1 e GalNAc4-11) direcionados ao SRB-1 in vivo
[00974] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 440762 não conjugado foi incluído como um padrão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável do nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster.
[00975] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-11a foi mostrada anteriormente no Exemplo 50.
Tratamento
[00976] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900, 663748 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[00977] Conforme ilustrado na Tabela 47, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antissenso que compreendem os conjugados de GalNAc3-1 ligado a fosfodiéster e GalNAc4-11 no terminal 3' (ISIS 651900 e ISIS 663748) mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 440762). Os dois oligonucleotídeos conjugados, GalNAc3-1 e GalNAc4-11, foram equipotentes.Tabela 47 ASO modificado direcionado ao SRB-1
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[00978] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "k" indica o nucleosídeo bicíclico 6'-(S)- CHa; "d" indica um β-D-2'-desoximbonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster(PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00979] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 48 abaixo.Tabela 48
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Exemplo 59: Efeitos de ASOs conjugados com GalNAc3-1 direcionados ao FXI in vivo
[00980] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo de doses múltiplas para a inibição antissenso de FXI em camundongos. ISIS 404071 foi incluído como um padrão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster.Tabela 49 ASOs modificados direcionados ao FXI
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[00981] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00982] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9.
Tratamento
[00983] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana por 3 semanas na dosagem mostrada abaixo com ISIS 404071, 656172, 656173 ou controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de FXI no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos-padrão. Os níveis da proteína FXI plasmáticos também foram medidos usando ELISA. Os níveis de mRNA de FXI foram determinados em relação ao RNA total (usando RIBOGREEN®), antes da normalização para controles tratados com PBS. Os resultados são apresentados a seguir como a porcentagem média dos níveis de mRNA de FXI para cada grupo de tratamento. Os dados foram normalizados para os controles tratados com PBS e é denotado como "% de PBS". As ED50s foram medidas usando métodos semelhantes conforme descrito anteriormente e são apresentadas abaixo.Tabela 50 mRNA do Fator XI (% de Salina)
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[00984] Conforme ilustrado na Tabela 50, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de FXI de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de 3'-GalNAc3-1 mostrou melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 404071). Entre os dois oligonucleotídeos conjugados, uma melhora na potência foi ainda fornecida, substituindo-se algumas das ligações PS por PO (ISIS 656173).
[00985] Conforme ilustrado na Tabela 50a, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de da proteína FXI de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de 3'-GalNAc3-1 mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 404071). Entre os dois oligonucleotídeos conjugados, uma melhora na potência foi ainda fornecida, substituindo-se algumas das ligações PS por PO (ISIS 656173).Tabela 50a Proteína Fator XI (% de Salina)
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[00986] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Bilirrubina total, albumina total, CRE e BUN também foram avaliados. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na tabela abaixo.Tabela 51
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Exemplo 60: Efeitos de ASOs conjugados direcionados ao SRB-1 in vitro
[00987] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo de doses múltiplas para inibição antissenso de SRB-1 em hepatócitos de camundongo primários. ISIS 353382 foi incluído como um padrão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' ou 5' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster.Tabela 52 ASO modificado direcionado ao SRB-1
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[00988] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00989] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-8a foi mostrada anteriormente no Exemplo 47. A estrutura de GalNAc3-9a foi mostrada anteriormente no Exemplo 52. A estrutura de GalNAc3-6a foi mostrada anteriormente no Exemplo 51. A estrutura de GalNAc3-2a foi mostrada anteriormente no Exemplo 37. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada anteriormente no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-5a foi mostrada anteriormente no Exemplo 49. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.
Tratamento
[00990] Os oligonucleotídeos listados acima foram testados in vitro em células hepatócitos primários de camundongo colocadas em uma densidade de 25.000 células por poço e tratadas com 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 ou 20 nM de oligonucleotídeo modificado. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA foram medidos por PCR em tempo real e os níveis de mRNA de SRB-1 foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, conforme medido por RIBOGREEN®.
[00991] A IC50 foi calculada usando métodos padrão e os resultados são apresentados na Tabela 53. Os resultados mostram que, sob condições de absorção livre nas quais nenhum reagente ou nenhuma técnica de eletroporação são usados para promover artificialmente a entrada dos oligonucleotídeos nas células, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes nos hepatócitos do que o oligonucleotídeo de origem (ISIS 353382) que não compreende um conjugado de GalNAc.Tabela 53
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Exemplo 61: Preparação do composto oligomérico 175 compreendendo GalNAc3-12
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[00992] O composto 169 está disponível comercialmente. O composto 172 foi preparado pela adição de benzil (perfluorofenil) glutarato ao composto 171. O benzil (perfluorofenil) glutarato foi preparado, adicionando-se PFP-TFA e DIEA ao ácido 5-(benzilóxi)-5- oxopentanoico em DMF. O composto oligomérico 175, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-12, foi preparado a partir do composto 174 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado de GalNAc3- 12 (GalNAc3-12a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-12 (GalNAc3-12a-CM-) é mostrada abaixo:
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Exemplo 62: Preparação do composto oligomérico 180 compreendendo GalNAc3-13
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[00993] O composto 176 foi preparado usando o procedimento geral mostrado no Exemplo 2. O composto oligomérico 180, que compreende um grupo de conjugado de GalNAc3-13, foi preparado a partir do composto 177 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 49. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-13 (GalNAc3-13a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-) é mostrada abaixo:
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Exemplo 63: Preparação do composto oligomérico 188 compreendendo GalNAc.3-14
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[00994] Os compostos 181 e 185 estão disponíveis comercialmente.O composto oligomérico 188, que compreende um grupo de conjugado de GalNAc3-14, foi preparado a partir do composto 187 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-14 (GalNAc3-14a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-) é mostrada abaixo:
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Exemplo 64: Preparação do composto oligomérico 197 compreendendo GalNAc3-15
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[00995] O composto 189 está disponível comercialmente. O composto 195 foi preparado usando o procedimento geral mostrado no Exemplo 31. O composto oligomérico 197, que compreende um grupo de conjugado de GalNAc3-15, foi preparado a partir dos compostos 194 e 195 usando procedimentos de síntese de oligonucleotídeo padrão. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-15 (GalNAc3-15a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-15 (GalNAc3-15a-CM-) é mostrada abaixo:
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Exemplo 65: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado em 5' (comparação de GalNAc3-3, 12, 13, 14 e 15) direcionados ao SRB-1 in vivo
[00996] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo por um nucleosídeo de 2'- desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivável). Tabela 54 ASOs modificados direcionados a SRB-1
Figure img0279
[00997] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[00998] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-12a foi mostrada anteriormente no Exemplo 61. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-14a foi mostrada anteriormente no Exemplo 63. A estrutura de GalNAc3-15a foi mostrada anteriormente no Exemplo 64.
Tratamento
[00999] Camundongos C57bl6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma ou duas vezes na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262, ou com salina. Os camundongos que foram dosados duas vezes receberam a segunda dose três dias após a primeira dose. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[001000] Conforme ilustrado na Tabela 55, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Nenhuma diferença significativa no knockdown alvo foi observada entre os animais que receberam uma dose única e os animais que receberam duas doses (ver ISIS 353382, dosagens 30 e 2 x 15 mg/kg; e ISIS 661161 dosagens 5 e 2 x 2,5 mg/kg). Os oligonucleotídeos que compreendem os conjugados de GalNAc3-3, 12, 13, 14 e 15 ligados a fosfodiéster mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 335382).Tabela 55 mRNA de SRB-1 (% de Salina)
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[001001] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. As alterações dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 56 abaixo.Tabela 56
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Exemplo 66: Efeito de diversas frações cliváveis sobre a inibição antissenso in vivo pelos oligonucleotídeos direcionados ao SRB-1 compreendendo um cluster de 5'-GalNAc3
[001002] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. Cada um dos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo por um nucleosídeo ligado a fosfodiéster (porção clivável (CM)).Tabela 57 ASOs modificados direcionados a SRB-1
Figure img0282
[001003] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo emC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'- desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[001004] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62.
Tratamento
[001005] Camundongos C57bl6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 661161, 670699, 670700, 670701, 671165, ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB- 1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[001006] Conforme ilustrado na Tabela 58, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antissenso compreendendo diversas frações cliváveis todos mostraram potências semelhantes.Tabela 58 mRNA de SRB-1 (% de Salina)
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[001007] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. As alterações dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 59 abaixo.Tabela 59
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Exemplo 67: Preparação do composto oligomérico 199 compreendendo GalNAc3-16
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[001008] O composto oligomérico 199, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-16, é preparado usando os procedimentos gerais ilustrados nos Exemplos 7 e 9. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-16 (GalNAc3-16a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-16 (GalNAc3-16a- CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0286
Exemplo 68: Preparação do composto oligomérico 200compreendendo GalNAc3-17
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[001009] O composto oligomérico 200, compreendendo um grupo do conjugado de GalNAc3-17, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-17 (GalNAc3-17a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é-P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-17 (GalNAc3-17a- CM-) é mostrada abaixo:
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Exemplo 69: Preparação do composto oligomérico 201
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[001010] O composto oligomérico 201, compreendendo um grupo do conjugado de GalNAc3-18, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-18 (GalNAc3-18a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-18 (GalNAc3-18a- CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0290
Exemplo 70: Preparação do composto oligomérico 204 compreendendo GalNAc3-19
Figure img0291
[001011] O composto oligomérico 204, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-19, foi preparado a partir do composto 64 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-19 (GalNAc3-19a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é-P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-19 (GalNAc3-19a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0292
Exemplo 71: Preparação do composto oligomérico 210 compreendendo GalNAc3-20
Figure img0293
[001012] O composto 205 foi preparado, adicionando-se PFP-TFA e DIEA ao ácido 6-(2,2,2-trifluoroacetamido)hexanoico em acetonitrila, que foi preparada pela adição de anidrido tríflico ao ácido 6- aminohexanoico. A mistura de ração foi aquecida a 80 oC, em seguida abaixada para rt (temperatura ambiente). O composto oligomérico 210, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-20, foi preparado a partir do composto 208 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte de cluster GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-20 (GalNAc3-20a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-20 (GalNAc3-20a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0294
Exemplo 72: Preparação do composto oligomérico 215 compreendendo GalNAc3-21
Figure img0295
[001013] O composto 211 está disponível comercialmente. O composto oligomérico 215, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-21, foi preparado a partir do composto 213 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-21 (GalNAc3-21a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-21 (GalNAc3-21a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0296
Exemplo 73: Preparação do composto oligomérico 221 compreendendo GalNAc3-22
Figure img0297
[001014] O composto 220 foi preparado a partir do composto 219 usando tetrazolida de di-isopropilamônio. O composto oligomérico 221, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-21, é preparado a partir do composto 220 usando o procedimento geral ilustrado no Exemplo 52. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-22 (GalNAc3-22a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-) é mostrada abaixo:
Figure img0298
Exemplo 74: Efeito de diversas frações cliváveis sobre a inibição antissenso in vivo pelos oligonucleotídeos direcionados ao SRB-1 compreendendo um conjugado de 5'-GalNAc3
[001015] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. cada um dos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo.Tabela 60 ASOs modificados direcionados a SRB-1
Figure img0299
Figure img0300
[001016] Em todas as tabelas, as letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleosídeo e mC indica uma 5-metil citosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica um β-D-2'-desoximbonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o'" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos de conjugado estão em negrito.
[001017] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-17a foi mostrada anteriormente no Exemplo 68, e a estrutura de GalNAc3-18a foi mostrada no Exemplo 69.
Tratamento
[001018] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por vis subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com um oligonucleotídeo listado na Tabela 60 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos-padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[001019] Conforme ilustrado na Tabela 61, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antissenso que compreendem um conjugado de GalNAc mostraram potências semelhantes e foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que faltava um conjugado de GalNAc.Tabela 61 mRNA de SRB-1 (% de Salina)
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[001020] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 62 abaixo.Tabela 62
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Exemplo 75: Análise farmacocinética de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado em 5'
[001021] A PK dos ASOs nas Tabelas 54, 57 e 60 acima foi avaliada usando amostras de fígado que foram obtidas após os procedimentos de tratamento descritos nos Exemplos 65, 66 e 74. As amostras de fígado foram cortadas e extraídas usando protocolos-padrão e analisadas por IP-HPLC-MS juntamente com um padrão interno. O nível de tecido combinado (μg/g) de todos os metabolites foi medido pela integração dos picos de UV apropriados, e o nível de tecido do ASO de comprimento total em que faltava o conjugado ("de origem", que tem N° Isis 353382 neste caso) foi medido usando os cromatogramas de íon extraído apropriados (EIC).Tabela 63 Análise PK no Fígado
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[001022] Os resu tados na Tabela 63 acima mostram que houve maiores níveis de tecido hepático dos oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3 do que do oligonucleotídeo de origem que não compreende um grupo de conjugado de GalNAc3 (ISIS 353382) 72 horas após a administração do oligonucleotídeo, particularmente ao levar em consideração as diferenças na dosagem entre os oligonucleotídeos com e sem um grupo de conjugado de GalNAc3. Além disso, em 72 horas, 40-98% de cada oligonucleotídeo compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3 foram metabolizados no composto de origem, indicando que os grupos de conjugado de GalNAc3 foram clivados a partir dos oligonucleotídeos. Exemplo 76: Preparação do composto oligomérico 230 compreendendo GalNAc3-23
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[001023] O composto 222 está disponível comercialmente. 44,48 ml (0,33 mol) do composto 222 foram tratados com cloreto de tosil (25,39 g, 0,13 mol) em piridina (500mL) por 16 horas. A reação foi então evaporada para um óleo, dissolvida em EtOAc e lavada com água, NaHCO3saturado, salmoura e seca com Na2SO4. O acetato de etil foi concentrado à secura e purificado por cromatografia de coluna, eluído com EtOAc/hexanos (1:1) seguido por metanol 10% em CH2Cl2 para gerar o composto 223 como um óleo incolor. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. 10 g (32,86 mmol) de 1-Tosiltrietileno glicol (composto 223) foi tratado com azida sódica (10,68 g, 164,28 mmol) em DMSO (100 mL) à temperatura ambiente por 17 horas. A mistura de reação foi então vertida em água, e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água três vezes e seca com Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada à secura para gerar 5,3 g do composto 224 (92%). LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. 1-Azidotrietileno glicol (composto 224, 5,53 g, 23,69 mmol) e o composto 4 (6 g, 18,22 mmol) foram tratados com peneiras moleculares 4A (5 g), e TMSOTf (1,65 ml, 9,11 mmol) em diclorometano (100 mL) sob uma atmosfera inerte. Após 14 horas, a reação foi filtrada para remover as peneiras, e a camada orgânica foi lavada com NaHCO3saturado, água, salmoura e seca com Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada à secura e purificada por cromatografia de coluna, eluída com um gradiente de metanol 2 a 4% em diclorometano para gerar o composto 225. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 225 (11,9 g, 23,59 mmol) foi hidrogenado em EtOAc/Metanol (4:1, 250 mL) com catalisador de Pearlman. Após 8 horas, o catalisador foi removido por filtração e os solventes removidos à secura para gerar o composto 226. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura.
[001024] A fim de gerar o composto 227, uma solução de ácido nitrometanotrispropiônico (4,17 g, 15,04 mmol) e base de Hunig (10,3 ml, 60,17 mmol) em DMF (100 mL) foram tratados em gotas com acetato de pentaflourotrifluoro (9,05 ml, 52,65 mmol). Após 30 minutos, a reação foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, salmoura e seca com Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada à secura e então recristalizada a partir de heptano para gerar o composto 227 como um sólido branco. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 227 (1,5 g, 1,93 mmol) e o composto 226 (3,7 g, 7,74 mmol) foram agitados à temperatura ambiente em acetonitrila (15 mL) por 2 horas. A reação foi então evaporada à secura e purificada por cromatografia de coluna, eluindo- se com um gradiente de metanol 2 a 10% em diclorometano para gerar o composto 228. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 228 (1,7 g, 1,02 mmol) foi tratado com níquel de Raney (cerca de 2 g úmido) em etanol (100mL) em uma atmosfera de hidrogênio. Após 12 horas, o catalisador foi removido por filtração e a camada orgânica foi evaporada a um sólido que foi usado diretamente na etapa seguinte. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. Este sólido (0,87 g, 0,53 mmol) foi tratado com ácido benzilglutárico (0,18 g, 0,8 mmol), HBTU (0,3 g, 0,8 mmol) e DIEA (273,7 μl, 1,6 mmol) em DMF (5 mL). Após 16 horas, o DMF foi removido sob pressão reduzida a 65°C a um óleo, e o óleo foi dissolvido em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com solução de NaHCO3saturado, salmoura, e seca com Na2SO4. Após a evaporação da camada orgânica, o composto foi purificado por cromatografia de coluna e eluído com um gradiente de metanol 2 a 20% em diclorometano para gerar o produto acoplado. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O éster benzílico foi desprotegido com catalisador de Pearlman sob uma atmosfera de hidrogênio por 1 hora. O catalisador foi então removido por filtração e os solventes removidos à secura para gerar o ácido. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O ácido (486 mg, 0,27 mmol) foi dissolvido em DMF seco (3 mL). Piridina (53,61 μl, 0,66 mmol) foi adicionada e a reação foi purgada com argônio. Acetato de pentaflourotriflouro (46,39 μl, 0,4 mmol) foi lentamente adicionado à mistura de reação. A cor da reação mudou de amarelo pálido para vinho, e gerou uma fumaça clara que foi dissipada com um fluxo de argônio. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por uma hora (a conclusão da reação foi confirmada por LCMS). O solvente foi removido sob pressão reduzida (rotovap (evaporador rotativo)) a 70°C. O resíduo foi diluído com DCM e lavado com 1N NaHSO4, salmoura, bicarbonato de sódio saturado e salmoura novamente. Os produtos orgânicos foram secos com Na2SO4, filtrados, e foram concentrados à secura para gerar 225 mg do composto 229 como uma espuma amarela frágil. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura.
[001025] O composto oligomérico 230, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-23, foi preparado a partir do composto 229 usando o procedimento geral ilustrado no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAc3 do grupo de conjugado de GalNAc3-23 (GalNAc3-23a) pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAc3-23 (GalNAc3-23a-CM) é mostrada abaixo:
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Exemplo 77: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados ao SRB-1 compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001026] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos.Tabela 64 ASOs modificados direcionados a SRB-1
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[001027] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-9a foi mostrado no Exemplo 52, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, GalNAc3-19a foi mostrado no Exemplo 70, GalNAc3-20a foi mostrado no Exemplo 71, e GalNAc3-23a foi mostrado no Exemplo 76.
Tratamento
[001028] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez em uma dosagem mostrada abaixo com um oligonucleotídeo listado na Tabela 64 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[001029] Conforme ilustrado na Tabela 65, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose.Tabela 65 mRNA de SRB-1 (% de Salina)
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[001030] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro também foram medidos usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. As alterações dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 66 abaixo.Tabela 66
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Exemplo 78: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados ao angiotensinogênio compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001031] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para inibição antissenso do Angiotensinogênio (AGT) em ratos Sprague Dawley normotensos.Tabela 67 ASOs modificados direcionados a AGT
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[001032] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9.
Tratamento
[001033] Ratos Sprague Dawley machos de seis semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana em uma dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 67 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os ratos foram sacrificados 72 horas após a dose final. Os níveis de mRNA hepáticos de AGT foram medidos usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis plasmáticos da proteína AGT foram medidos usando o ELISA de Angiotensinogênio Total (Catálogo # JP27412, IBL International, Toronto, ON) com plasma diluído 1:20.000. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de AGT no fígado ou níveis da proteína AGT no plasma para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.
[001034] Conforme ilustrado na Tabela 68, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de AGT de uma forma dependente da dose, e o oligonucleotídeo compreendendo um conjugado de GalNAc foi significativamente mais potente do que o oligonucleotídeo de origem em que faltava um conjugado de GalNAc.Tabela 68 Níveis da proteína plasmáticos e do mRNA hepático de AGT
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[001035] Os níveis da transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas, no plasma e os pesos corporais também foram medidos no momento do sacrifício usando protocolos padrão. Os resultados são mostrados na Tabela 69 abaixo. Tabela 69 Níveis de transaminase hepática e pesos corporais dos ratos
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Exemplo 79: Duração da ação in vivo de oligonucleotídeos direcionados à APOC-III compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001036] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 70 abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em camundongos.Tabela 70 ASOs modificados direcionados a APOC-III
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[001037] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrado no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, e GalNAc3-13a foi mostrado no Exemplo 62.
Tratamento
[001038] Camundongos transgênicos de seis a oito semanas de idade que expressam APOC-III humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 70 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado antes da dosagem para determinar a base de referência e em 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas e 6 semanas após a dose. Os níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III foram medidos conforme descrito no Exemplo 20. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de triglicérides plasmáticos e de APOC-III para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência, mostrando que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiam uma duração mais longa de ação do que o oligonucleotídeo de origem sem um grupo de conjugado (ISIS 304801), mesmo com a dosagem do original sendo três vezes a dosagem dos oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc.Tabela 71 Níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III em camundongos transgênicos
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Exemplo 80: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados à Alfa-1 Antitripsina (A1AT) compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001039] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 72 abaixo foram testados em um estudo para a inibição dependente de dose de A1AT em camundongos. Tabela 72 ASOs modificados direcionados à A1AT
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[001040] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrado no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, e GalNAc3-13a foi mostrado no Exemplo 62.
Tratamento
[001041] Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana em uma dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 72 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis de mRNA hepáticos de A1AT foram medidos usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis da proteína plasmática A1AT foram determinados usando o ELISA de Alfa-1 Antitripsina de Camundongo (catálogo # 41-A1AMS- E01, Alpco, Salem, NH). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de A1AT para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.
[001042] Conforme ilustrado na Tabela 73, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis da proteína plasmática A1AT e do mRNA hepático de A1AT de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes do que o original (ISIS 476366).Tabela 73 Níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de A1AT
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[001043] Os níveis de BUN e transaminase hepática no plasma foram medidos no momento de sacrifício usando protocolos padrão. Os pesos corporais e os pesos dos órgãos também foram medidos. Os resultados são mostrados na Tabela 74 abaixo. O peso corporal é mostrado como % em relação à base de referência. Os pesos dos órgãos são mostrados como % de peso corporal em relação ao grupo controle com PBS. Tabela 74
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Exemplo 81: Duração da ação in vivo de oligonucleotídeos direcionados à A1AT compreendendo um cluster de GalNAc3
[001044] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 72 foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.
Tratamento
[001045] Os camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 72 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. O sangue foi retirado o dia antes da dosagem para determinar a base de referência e em 5, 12, 19 e 25 dias após a dose. Os níveis da proteína A1AT plasmática foram medidos através de ELISA (ver o Exemplo 80). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína A1AT plasmática para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc eram mais potentes e tinham maior duração de ação do que o original em que faltava um conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 e 678384) eram geralmente ainda mais potentes com maior duração de ação do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656326).Tabela 75 Níveis da proteína A1AT plasmática em camundongos
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Exemplo 82: Inibição antissenso in vitro por oligonucleotídeos direcionados ao SRB-1 compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001046] Os hepatócitos primários de fígado de camundongo foram semeados em placas de 96 poços em 15.000 células/poço 2 horas antes do tratamento. Os oligonucleotídeos listados na Tabela 76 foram adicionados em 2, 10, 50, ou 250 nM em meio E de Williams e as células foram incubadas durante a noite a 37 oC em 5% de CO2. As células foram lisadas 16 horas após a adição do oligonucleotídeo, e o RNA total foi purificado usando RNeasy 3000 BioRobot (Qiagen). Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os valores de IC50 foram determinados usando o software Prism 4 (GraphPad). Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem uma variedade de diferentes grupos de conjugado de GalNAc e uma variedade de diferentes frações cliváveis são significativamente mais potentes em um experimento de absorção livre in vitro do que os oligonucleotídeos de origem em que faltam um grupo conjugado de GalNAc (ISIS 353382 e 666841).Tabela 76 Inibição da expressão de SRB-1 in vitro
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[001047] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-5a foi mostrado no Exemplo 49, GalNAc3-6a foi mostrado no Exemplo 51, GalNAc3-7a foi mostrado no Exemplo 48, GalNAc3-8a foi mostrado no Exemplo 47, GalNAc3-9a foi mostrado no Exemplo 52, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, GalNAc3-12a foi mostrado no Exemplo 61, GalNAc3-13a foi mostrado no Exemplo 62, GalNAc3-14a foi mostrado no Exemplo 63, GalNAc3-15a foi mostrado no Exemplo 64, GalNAc3-17a foi mostrado no Exemplo 68, GalNAc3-18a foi mostrado no Exemplo 69, GalNAc3-19a foi mostrado no Exemplo 70, GalNAc3-20a foi mostrado no Exemplo 71, e GalNAc3-23a foi mostrado no Exemplo 76.
Exemplo 83: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados ao Fator XI compreendendo um cluster de GalNAc3
[001048] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 77 abaixo foram testados em um estudo para inibição dependente de dose do Fator XI em camundongos.Tabela 77 Oligonucleotídeos modificados direcionados ao Fator XI
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[001049] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrado no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, e GalNAc3-13a foi mostrado no Exemplo 62.
Tratamento
[001050] Camundongos de seis a oito semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana em uma dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado abaixo ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a dose final. Os níveis de mRNA hepático do Fator XI foram medidos usando PCR em tempo real e normalizados para ciclofilina de acordo com protocolos padrão. Transaminases hepáticas, BUN e bilirrubina também foram medidos. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.
[001051] Conforme ilustrado na Tabela 78, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu o mRNA hepático do Fator XI de uma forma dependente de dose. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foi mais potente do que o original em que falta um conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Além disso, os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 e 678349) foram ainda mais potentes do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).Tabela 78 Níveis de mRNA hepático do Fator XI, transaminase hepática, BUN e bilirrubina
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Exemplo 84: D luração da ação in vivo d e oligonucleotídeos direcionados ao Fator XI compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001052] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 77 foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.
Tratamento
[001053] Camundongos de seis a oito semanas foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 77 ou com PBS. Cada grupo tratamento consistiu em 4 animais. O sangue foi retirado por sangramentos da cauda no dia antes da dosagem para determinar a base de referência e em 3, 10 e 17 dias após a dose. Os níveis da proteína Fator XI plasmático foram medidos por ELISA usando anticorpos de captura do Fator XI e de detecção biotinilados da R & D Systems, Minneapolis, MN (catálogo # AF2460 e # BAF2460, respectivamente) e o Conjunto B do Reagente OptEIA (Catálogo # 550534, BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína Fator XI plasmático para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc eram mais potentes com maior duração de ação do que o original em que faltava um conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de 5'- GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 e 678349) foram ainda mais potentes com uma maior duração de ação do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).Tabela 79 Níveis da proteína Fator XI plasmático em camundongos
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Exemplo 85: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados ao SRB-1 compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001054] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 76 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos.
Tratamento
[001055] Camundongos de seis a oito semanas de idade C57BL/6 foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana em uma dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 76 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 hepáticos para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.
[001056] Conforme ilustrado nas Tabelas 80 e 81, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Tabela 80 mRNA de SRB-1 no fígado
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Tabela 81 mRNA de SRB-1 no fígado
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[001057] Os níveis de transaminases hepáticas, bilirrubina tol al, BUN,e pesos corporais também foram medidos usando protocolos padrão. Os valores médios para cada grupo de tratamento são mostrados na Tabela 82 abaixo.Tabela 82
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Exemplo 86: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a TTR compreendendo um cluster de GalNAc3
[001058] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 83 abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso da transtirretina humana (TTR) em camundongos transgênicos que expressam o gene da TTR humano.
Tratamento
[001059] Camundongos transgênicos para TTR de oito semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana por três semanas, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo e dosagem listados nas tabelas abaixo ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os sangramentos da cauda foram realizados em vários momentos por todo o experimento, e os níveis plasmáticos de proteína TTR, ALT e AST foram medidos e relatados nas Tabelas 84-87. Após os animais serem sacrificados, os níveis plasmáticos de ALT, AST e TTR humana foram medidos, assim como os pesos corporais, pesos dos órgãos, e níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os níveis da proteína TTR foram medidos usando um analisador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) Foram usados de acordo com protocolos padrão para determinar os níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os resultados apresentados nas Tabelas 84-87 são os valores médios para cada grupo de tratamento. Os níveis de mRNA são os valores médios relativos à média para o grupo com PBS. Os níveis plasmáticos da proteína são os valores médios relativos ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência. Os pesos corporais são a mudança de peso percentual média da base de referência até o sacrifício para cada grupo de tratamento individual. Os pesos dos órgãos mostrados são normalizados para o peso do corpo do animal, e o peso do órgão normalizado médio para cada grupo de tratamento é então apresentado em relação ao peso do órgão normalizado médio para o grupo com PBS.
[001060] Nas Tabelas 84-87, "BL" indica base de referência, as medições que foram tomadas imediatamente antes da primeira dose. Conforme ilustrado nas Tabelas 84 e 85, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu o nível de expressão de TTR de uma forma dependente de dose. Os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foram mais potentes que o de origem em que faltava o conjugado de GalNAc (ISIS 420915). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc e ligações internucleosídicas PS/PO mistas foram ainda mais potentes que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc e ligações PS totais.Tabela 83 Oligonucleotídeos direcionados à TTR humana
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[001061] A legenda para a Tabela 85 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-1 foi mostrada no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70. Tabela 84 Inibição antissenso de TTR humana in vivo
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Tabela 85 Inibição antissenso de TTR humana in vivo
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Exemplo 87: Duração da ação in vivo por doses únicas de oligonucleotídeos direcionados à TTR compreendendo um cluster de GalNAc3
[001062] Os números ISIS 420915 e 660261 (ver a Tabela 83) foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em camundongos. Os números ISIS 420915, 682883 e 682885 (ver a Tabela 83) também foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.
Tratamento
[001063] Camundongos transgênicos machos de oito semanas de idade que expressam TTR humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com 100 mg/kg de N°. ISIS 420915 ou 13,5 mg/kg de N°. ISIS 660261. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados antes da dosagem para determinar a base de referência e nos dias 3, 7, 10, 17, 24 e 39 após a dose. Os níveis plasmáticos da proteína TTR foram medidos conforme descrito o Exemplo 86. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis plasmáticos da proteína TTR para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Tabela 88 Níveis plasmáticos da proteína TTR
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Tratamento
[001064] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a TTR humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com 100 mg/kg de N°. ISIS 420915, 10,0 mg/kg de N°. ISIS 682883, ou 10,0 mg/kg de 682885. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados antes da dosagem para determinar a base de referência e nos dias 3, 7, 10, 17, 24 e 39 após a dose. Os níveis plasmáticos da proteína TTR foram medidos conforme descrito o Exemplo 86. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis plasmáticos da proteína TTR para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Tabela 89 Níveis plasmáticos da proteína TTR
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[001065] Os resultados na Tabela 88 e 89 mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc são mais potentes com uma duração de ação maior que o oligonucleotídeo de origem e que falta um conjugado (ISIS 420915).
Exemplo 88: Modulação por splicing in vivo por oligonucleotídeos direcionados a SMN compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001066] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 90 foram testados para a modulação por splicing da Sobrevivência do Neurônio Motor humana (SMN) em camundongos.Tabela 90 ASOs modificados direcionados a SMN
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[001067] A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48. "X" indica uma amina primária em 5' gerada por Gene Tools (Philomath, OR), e GalNAc3-7b indica a estrutura de GalNAc3-7a em que falta a porção -NH-C6-O do ligante como mostrado abaixo:
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[001068] Os números ISIS 703421 e 703422 são oligonucleotídeos de morfolino, em que cada nucleotídeo dos dois oligonucleotídeos é um nucleotídeo de morfolino.
Tratamento
[001069] Camundongos transgênicos de seis semanas de idade que expressam SMN humana foram injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 91 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 2 machos e 2 fêmeas. Os camundongos foram sacrificados 3 dias após a dose para determinar os níveis hepáticos de mRNA de SMN humana com e sem o éxon 7 usando PCR em tempo real, de acordo com protocolos padrão. O RNA total foi medido usando o reagente Ribogreen. Os níveis de mRNA da SMN foram normalizados para mRNA total, e normalizados ainda para as médias para o grupo tratado com salina. As razões médias resultantes entre mRNA de SMN incluindo o éxon 7 e mRNA de SMN faltando o éxon 7 são mostradas na Tabela 91. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos totalmente modificados que modulam o splicing e compreendem um conjugado de GalNAc são significativamente mais potentes em alterar o splicing no fígado do que os oligonucleotídeos de origem em que falta o conjugado de GalNAc. Além disso, esta tendência é mantida para várias químicas de modificação, incluindo 2'-MOE e oligonucleotídeos modificados por morfolino.Tabela 91 Efeito de oligonucleotídeos direcionados à SMN humana in vivo
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Exemplo 89: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados à Apolipoproteína A (Apo(A)) compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001070] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 92 abaixo foram testados em um estudo para a inibição dependente de dose de Apo(a) em camundongos transgênicos.Tabela 92 ASOs modificados direcionados à Apo(a)
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[001071 A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.
Tratamento
[001072] Camundongos C57BL/6 fêmeas de oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana em uma dosagem mostrada abaixo, para um total de seis doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 92 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3-4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados no dia anterior à primeira dose e semanalmente após cada um dose para determinar os níveis plasmáticos da proteína Apo(a). Os camundongos foram sacrificados dois dias após a administração final. Os níveis de mRNA hepáticos de Apo(a) foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos-padrão. Os níveis plasmáticos da proteína Apo(a) foram determinados usando ELISA, e os níveis hepáticos da transaminase foram determinados. Os resultados da proteína plasmática e do mRNA na Tabela 93 são apresentados como a porcentagem média do grupo de tratamento em relação ao grupo tratado com PBS. Os níveis da proteína plasmática foram ainda normalizados para o valor de base de referência (BL) para o grupo com PBS. Os níveis de transaminase absolutos médios e os pesos corporais (% em relação às médias de base de referência) são relatados na Tabela 94.
[001073] Como ilustrado na Tabela 93, o tratamento com os oligonucleotídeos diminuiu os níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático da Apo(a) de uma forma dependente de dose. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende o conjugado de GalNAc foi significativamente mais potente com uma duração maior de ação do que o oligonucleotídeo de origem em que falta o conjugado de GalNAc. Como ilustrado na Tabela 94, os níveis de transaminase e os pesos corporais não foram afetados pelo oligonucleotídeos, indicando que os oligonucleotídeos foram bem tolerados. Tabela 93 Níveis de proteína plasmática e de mRNA hepático de Apo(a)
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Tabela 94
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Exemplo 90: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a TTR compreendendo um cluster de GalNAc3
[001074] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 95 abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso da transtirretina humana (TTR) em camundongos transgênicos que expressam o gene da TTR humano.
Tratamento
[001075] Camundongos transgênicos para TTR foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana por três semanas, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo e dosagem listados na Tabela 96 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Antes da primeira dose, um sangramento da cauda foi realizado para determinar os níveis plasmáticos da proteína TTR na base de referência (BL). Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis da proteína TTR foram medidos usando um analisador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) Foram usados de acordo com protocolos padrão para determinar os níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os resultados apresentados na Tabela 96 são os valores médios para cada grupo de tratamento. Os níveis de mRNA são os valores médios relativos à média para o grupo com PBS. Os níveis plasmáticos da proteína são os valores médios relativos ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência. "BL" indica base de referência, as medições que foram tomadas imediatamente antes da primeira dose. Conforme ilustrado na Tabela 96, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de FXI de uma forma dependente da dose.de expressão de TTR de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram mais potentes do que o de origem em que falta um conjugado de GalNAc (ISIS 420915), e os oligonucleotídeos que compreendem uma porção clivável de fosfodiéster ou desoxiadenosina mostraram melhoras significativas na potência em comparação ao de origem em que falta um conjugado (ver os números ISIS 682883 e 666943 vs 420915 e ver os Exemplo 86 e 87).Tabela 95 Oligonucleotídeos direcionados à TTR humana
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[001076] A legenda para a Tabela 95 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62.Tabela 96 Inibição antissenso de TTR humana in vivo
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Exemplo 91: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados ao Fator VII compreendendo um conjugado de GalNAc3 em primatas não humanos
[001077] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 97 abaixo foram testados em um estudo de aumento de dose não terminal para a inibição antissenso do Fator VII em macacos.
Tratamento
[001078] Macacos expostos (não virgens) foram, cada um, injetados por via subcutânea nos dias 0, 15 e 29 com doses crescentes de um oligonucleotídeo listado na Tabela 97 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 machos e 1 fêmea. Antes da primeira dose e em vários momentos após isso, as retiradas de sangue foram realizadas para determinar os níveis plasmáticos da proteína Fator VII. Os níveis da proteína Fator VII foram medidos por ELISA. Os resultados apresentados na Tabela 98 são os valores médios para cada grupo de tratamento em relação ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência (BL), as medidas tomadas imediatamente antes da primeira dose. Como ilustrado na Tabela 98, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de expressão do Fator VII de uma forma dependente de dose, e o oligonucleotídeo compreendendo o conjugado de GalNAc foi significativamente mais potente em macacos em comparação ao oligonucleotídeo em que falta um conjugado de GalNAcTabela 97 Oligonucleotídeos direcionados ao Fator VII
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[001079] A legenda para a Tabela 97 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. Tabela 98 Níveis plasmáticos da proteína Fator VII
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Exemplo 92: Inibição antissenso em hepatócitos primários por oligonucleotídeos antissenso direcionados à Apo-CIII compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001080] Os hepatócitos primários de camundongo foram semeados em placas de 96 poços em 15.000 células por poço, e os oligonucleotídeos listados na Tabela 99, direcionados à ApoC-III, foram adicionados em 0,46, 1,37, 4,12, ou 12,35, 37,04, 111,11, ou 333,33 nM ou 1,00 μM. Após a incubação com os oligonucleotídeos por 24 horas, as células foram lisadas e o RNA total foi purificado usando RNeasy (Qiagen). Os níveis de mRNA da ApoC-III foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os valores de IC50 foram determinados usando o software Prism 4 (GraphPad). Os resultados mostram que independentemente de se a porção clivável era um fosfodiéster ou uma adenosina ligada a fosfodiéster, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado.Tabela 99 Inibição da expressão de APOC-III de camundongo em hepatócitos primários de camundongo
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[001081] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrado no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrado no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrado no Exemplo 46, GalNAc3-13a foi mostrado no Exemplo 62, e GalNAc3-19a foi mostrado no Exemplo 70.
Exemplo 93: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a SRB-1 compreendendo asas mistas e um conjugado de 5'-GalNAc3
[001082] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 100 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos.Tabela 100 ASOs modificados direcionados a SRB-1
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[001083] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48. Subscritos: "e" indica o nucleosídeo modificado por 2'- MOE; "d" indica β-D-2'-desoximbonucleosideo; "k" indica nucleosídeo bicíclico 6'-(S)-CH3 (cEt); "s" indica ligações internucleosídicas de fosforotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídicas de fosfodiéster (PO). O sobrescrito "m" indica 5-metilcitosinas.
Tratamento
[001084] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com um oligonucleotídeo listado na Tabela 100 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis hepáticos de mRNA de SRB-1 foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram normalizados para os níveis de mRNA de ciclofilina, de acordo com protocolos padrão. Os resultados são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle com salina. Como ilustrado na Tabela 101, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose, e os oligonucleotídeos do mero de lacuna que compreendem um conjugado de GalNAc e têm asas que eram modificações de cEt total ou de açúcar misto foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado e que compreende asas modificadas por cEt total.
[001085] Os pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN também foram medidos, e os valores médios para cada grupo de tratamento são mostrados na Tabela 101. O peso corporal é mostrado como o peso corporal percentual médio relativo ao peso do corpo de base de referência (% BL) medido imediatamente antes da dose de oligonucleotídeo.Tabela 101 Níveis de mRNA de SRB-1, ALT, AST, BUN e bilirrubina total e pesos corporais
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Exemplo 94: inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a SRB-1 compreendendo modificações por 2'-açúcar e um conjugado de 5'-GalNAc3
[001086] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 102 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos.Tabela 102 ASOs modificados direcionados a SRB-1
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[001087] O subscrito "m" indica um nuc eosídeo modificado por 2'-O-metil. Ver o Exemplo 74 para a legenda completa da tabela. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.
Tratamento
[001088] O estudo foi completado usando o protocolo descrito no Exemplo 93. Os resultados são mostrados na Tabela 103 abaixo e mostram que os oligonucleotídeos modificados por 2'-MOE e 2'-OMe compreendendo um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes do que os respectivos oligonucleotídeos de origem em que faltam um conjugado. Os resultados das medições de pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN indicam que os compostos foram todos bem tolerados.Tabela 103 mRNA de SRB-1
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Exemplo 95: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeo direcionados a SRB-1 compreendendo nucleosídeos bicíclicos e um conjugado de 5'-GalNAc3
[001089] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 104 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos. Tabela 104 ASOs modificados direcionados a SRB-1
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[001090] O subscrito "g" indica um nucleosídeo de fluoro-HNA, o subscrito "l" indica um nucleosídeo bloqueado compreendendo uma ponte de 2'-O-CH2-4'. Veja a legenda da tabela do Exemplo 74 para outras abreviações. A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, a estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.
Tratamento
[001091] O estudo foi completado usando o protocolo descrito no Exemplo 93. Os resultados são mostrados na Tabela 105 abaixo e mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc e várias modificações de nucleosídeo bicíclico foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado e que compreende modificações de nucleosídeo bicíclico. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc e modificações de fluoro-HNA foi significativamente mais potente do que o de origem em que falta um conjugado e que compreende modificações de fluoro-HNA. Os resultados das medições de pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN indicam que os compostos foram todos bem tolerados.Tabela 105 Níveis de mRNA de SRB-1, ALT, AST, BUN e bilirrubina total e pesos corporais
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Exemplo 96: Ligação de proteína plasmática de oligonucleotídeos antissenso que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc3
[001092] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 70 direcionados à ApoC-III e os oligonucleotídeos na Tabela 106 direcionados à Apo(a) foram testados em um ensaio de ultra-filtração a fim de avaliar a ligação da proteína plasmática.Tabela 106 Oligonucleotídeos modificados direcionados à Apo(a)
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[001093] Veja o Exemplo 74 para a legenda da tabela. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.
[001094] Unidades de ultrafiltração Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulose regenerada de baixa ligação, Millipore, Bedford, MA) foram pré-condicionadas com 300 μL de 0,5% de Tween 80 e centrifugadas a 2000 g por 10 minutos, em seguida com 300μL de uma solução de 300 μg/mL de um oligonucleotídeo controle em H2O e centrifugadas em 2000 g por 16 minutos. A fim de avaliar a ligação não específica aos filtros de cada oligonucleotídeo de teste das Tabelas 70 e 106 a serem usados nos estudos, 300 μL de uma solução de 250 ng/mL de oligonucleotídeo em H2O em pH 7,4 foram colocados nos filtros pré-condicionados e centrifugados a 2000 g por 16 minutos. As amostras não filtradas e filtradas foram analisadas por um ensaio ELISA para determinar as concentrações do oligonucleotídeo. Três réplicas foram usadas para se obter uma concentração média para cada amostra. A concentração da amostra filtrada em relação à amostra não filtrada é usada para determinar a porcentagem de oligonucleotídeo que é recuperada através do filtro na ausência de plasma (% de recuperação).
[001095] Amostras de plasma inteiras congeladas coletadas em K3- EDTA de voluntários humanos sem fármacos normais, macacos cynomolgus e camundongos CD-1 foram compradas da Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Os oligonucleotídeos de teste foram adicionados a alíquotas de 1,2 mL de plasma em duas concentrações (5 e 150 μg/mL). Uma alíquota (300 μL) de cada amostra de plasma enriquecida foi colocada em uma unidade de filtro pré-condicionada e incubada a 37C por 30 minutos, imediatamente após por centrifugação a 2000 g por 16 minutos. As alíquotas das amostras de plasma enriquecidas filtrada e não filtrada foram analisadas por ELISA para determinar a concentração de oligonucleotídeo em cada amostra. Três replicatas por concentração foram usadas para determinar a porcentagem média de oligonucleotídeo ligado e não ligado em cada amostra. A concentração média da amostra filtrada em relação à concentração da amostra não filtrada é usada é usada para determinar a porcentagem de oligonucleotídeo no plasma que não tá ligada às proteínas plasmáticas (% não ligado). Os valores de oligonucleotídeo não ligado final são corrigidos para a ligação não específica, dividindo-se o % não ligado pelo % de recuperação para cada oligonucleotídeo. Os valores de % de oligonucleotídeo ligado final são determinados, subtraindo-se os valores de % não ligado de 100. Os resultados são mostrados na Tabela 107 para as duas concentrações de oligonucleotídeo testadas (5 e 150 μg/mL) em cada espécie de plasma. Os resultados mostram que os grupos de conjugados de GalNAc não têm um impacto significativo sobre a ligação às proteínas plasmáticas. Além disso, os oligonucleotídeos com ligações internucleosídicas PS totais e ligações PO/PS mistas ligam proteínas plasmáticas, e aqueles com ligações PS totais ligam proteínas plasmáticas em um grau um pouco maior do que aqueles com ligações PO/PS mistas.Tabela 107 Porcentagem de oligonucleotídeo modificado ligado às proteínas plasmáticas
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Exemplo 97: Oligonucleotídeos modificados direcionados à TTR compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3
[001096] Os oligonucleotídeos mostrados na Tabela 108 que compreendem um conjugado de GalNAc foram projetados para se direcionar à TTR. Tabela 108 Oligonucleotídeos modificados direcionados à TTR
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[001097] A legenda para a Tabela 108 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-1 foi mostrada no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70. Exemplo 98: Avaliação dos efeitos pró-inflamatórios de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc no ensaio hPMBC
[001098] Os oligonucleotídeos são listados na Tabela 109 e foram testados para os efeitos pró-inflamatórios em um ensaio hPMBC conforme descrito nos Exemplos 23 e 24. (Veja as Tabelas 30, 83, 95 e 108 para descrições dos oligonucleotídeos.) ISIS 353512 é um alto respondedor usado como um controle positivo, e os outros oligonucleotídeos são descritos nas Tabelas 83, 95 e 108. Os resultados mostrados na Tabela 109 foram obtidos usando sangue de um doador voluntário. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleosídicas PO/PS mistas produziram respostas pró-inflamatórias significativamente menores em comparação aos mesmos oligonucleotídeos com ligações PS totais. Além disso, o grupo de conjugado de GalNAc não teve um efeito significativo neste ensaio. Tabela 109
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Exemplo 99: Afinidades de ligação dos oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc para o receptor de asialoglicoproteína
[001099] As afinidades de ligação dos oligonucleotídeos listados na Tabela 110 (ver a Tabela 76 para as descrições dos oligonucleotídeos) para o receptor de asialoglicoproteína foram testadas em um ensaio de ligação de receptor competitivo. O ligante competidor, al-glicoproteína ácida (AGP), foi incubada em 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5) com 1 U de neuraminidase-agarose por 16 horas em 37°C, e > 90% de desialilação foram confirmados pelo ensaio de ácido siálico ou cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Monocloreto de iodo foi usado para iodar o AGP de acordo com o mesmo procedimento por Atsma et al. (ver J Lipid Res. 1991 Jan; 32(1):173-81.) Neste método, a al-glicoproteína ácida desialilatada (de-AGP) foi adicionada a 10 mM de cloreto de iodo, Na125I, e 1 M de glicina em NaOH 0,25 M. Após a incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, de-AGP marcado com125I foi separado de 125I livre, concentrando-se a mistura duas vezes utilizando uma coluna de giro 3 KDMWCO. A proteína foi testada para eficiência de marcação e pureza em um sistema de HPLC equipado com uma coluna Agilent SEC-3 (7,8x300mm) e um contador β-RAM. Experimentos de competição utilizando de-AGP marcado com 125I e vários clusters de GalNAc contendo ASOs foram realizados conforme se segue. Células HepG2 humanas (106 células/ml) foram colocadas em placas de 6 poços em 2 ml de meio de crescimento apropriado. Foram usados o meio MEM complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM de L-Glutamina e 10mM de HEPES. As células foram incubadas 16-20 horas em 37°C com 5% e 10% de CO2 respectivamente. As células foram lavadas com meio sem FBS antes do experimento. As células foram incubadas por 30 min em 37°C com 1 ml de mix de competição contendo meio de crescimento apropriado com 2% de FBS, 10-8 M de de-AGP marcado com125I e cluster de GalNAc contendo ASOs em concentrações variando de 10-11 a 10-5 M. Ligações não específicas foram determinadas na presença de 10-2 M de açúcar de GalNAc. As células foram lavadas duas vezes com meio sem FBS para remover o de-AGP marcado com 125I não ligado e o competidor ASO de GalNAc. As células foram lisadas usando um tampão RLT da Qiagen contendo 1% de β-mercaptoetanol. Os lisados foram transferidos para tubos de ensaio de fundo redondo após um breve ciclo de congelamento/descongelamento de 10 min e analisados em um contador y. As ligações não específicas foram subtraídas antes de dividir as contagens de proteína com 125I pelo valor das contagens de concentração mais baixas de GalNAc-ASO. As curvas de inibição foram ajustadas para uma única equação de ligação de competição de sítio usando um algoritmo de regressão não linear para calcular as afinidades de ligação (KD's).
[001100] Os resultados na Tabela 110 foram obtidos a partir de experimentos realizados em cinco dias diferentes. Os resultados para os oligonucleotídeos marcados com sobrescrito "a" são a média dos experimentos realizados em dois dias diferentes. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc na extremidade 5' ligavam-se ao receptor de asialoglicoproteína nas células HepG2 humanas com afinidade 1,5 a 16 vezes maior do que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc na extremidade 3'. Tabela 110 Resultados do ensaio de ligação ao receptor de asialoglicoproteína
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Exemplo 100: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos compreendendo um grupo conjugado de GalNAc direcionados à Apo(a) in vivo
[001101] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 111a abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em camundongos.Tabela 111a ASOs modificados direcionados à APO(a)
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[001102] A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemp o 48.
Tratamento
[001103] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a Apo(a) humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana, por um total de 6 doses, com um oligonucleotídeo e a dosagem listada na Tabela 111b ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado no dia antes da dosagem para determinar os níveis de base de referência da proteína Apo(a) no plasma e em 72 horas, 1 semana e 2 semanas após a primeira dose. Retiradas adicionais de sangue ocorrerão em 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas e 6 semanas após a primeira dose. Os níveis da proteína Apo(a) foram medidos usando um ELISA. Os resultados na Tabela 111b são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína Apo(a) no plasma para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência (% BL). Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiam potente redução na expressão de Apo(a). Este potente efeito foi observado para o oligonucleotídeo que compreende ligações internucleosídicas PS totais e para o oligonucleotídeo que compreende ligações PO e PS mistas. Tabela 111b Níveis plasmáticos da proteína Apo(a)
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Exemplo 101: Inibição antissenso por oligonucleotídeos compreendendo um cluster de GalNAc ligado através de uma porção estável
[001104] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 112 foram testados para a inibição da expressão de APOC-III de camundongos in vivo. Camundongos C57Bl/6 foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 112 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Cada camundongo tratado com ISIS 440670 recebeu uma dose de 2, 6, 20, ou 60 mg/kg. Cada camundongo tratado com ISIS 680772 ou 696847 recebeu 0,6, 2, 6, ou 20 mg/kg. O grupo de conjugado de GalNAc de ISIS 696847 é ligado através de uma porção estável, uma ligação fosforotioato em vez de uma ligação contendo fosfodiéster facilmente clivável. Os animais foram sacrificados 72 horas após a dose. Os níveis hepáticos de mRNA de APOC-III foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de APOC-III foram normalizados para os níveis de mRNA de ciclofilina, de acordo com protocolos padrão. Os resultados são apresentados na Tabela 112 como a porcentagem média dos níveis de mRNA de APOC-III para cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle com salina. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAC foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo em que falta um grupo de conjugado. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um grupo de conjugado de GalNAc ligado ao oligonucleotídeo através de uma porção clivável(ISIS 680772) foi até mais potente do que o oligonucleotídeo que compreende um grupo de conjugado de GalNAc ligado ao oligonucleotídeo através de uma porção estável (ISIS 696847).Tabela 112 Oligonucleotídeos modificados direcionados à APOC-III de camundongo
Figure img0379
[001105] A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.
Exemplo 102: Distribuição no fígado de oligonucleotídeos antissenso compreendendo um conjugado de GalNAc
[001106] A distribuição no fígado de ISIS 353382 (ver a Tabela 36) que não compreende um conjugado de GalNAc e ISIS 655861 (ver a Tabela 36) que compreende um conjugado de GalNAc foi avaliada. Camundongos balb/c machos foram injetados por via subcutânea uma vez com ISIS 353382 ou 655861 em uma dosagem listada na Tabela 113. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais, exceto para o grupo de 18 mg/kg para ISIS 655861, que consistiu em 2 animais. Os animais foram sacrificados 48 horas após a dose para determinar a distribuição no fígado dos oligonucleotídeos. A fim de medir o número de moléculas de oligonucleotídeo antissenso por célula, um marcador de tris-bipiridina de rutênio(II) (MSD TAG, Meso Scale Discovery) foi conjugado a uma sonda de oligonucleotídeo usada para detectar os oligonucleotídeos antissenso. Os resultados apresentados na Tabela 113 são as concentrações médias de oligonucleotídeo para cada grupo de tratamento em unidades de milhões de moléculas de oligonucleotídeo por célula. Os resultados mostram que, em doses equivalentes, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc esteve presente em concentrações maiores o fígado total e em hepatócitos do que o oligonucleotídeo que não compreende um conjugado de GalNAc. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc esteve presente em concentrações mais baixas em células hepáticas não-parenquimatosas do que o oligonucleotídeo que não compreende um conjugado de GalNAc. E, embora as concentrações de ISIS 655861 em hepatócitos e em células hepáticas não parenquimatosas sejam semelhantes por célula, o fígado é aproximadamente 80% de hepatócitos em volume. Assim, a maioria do oligonucleotídeo ISIS 655861 que esteve presente no fígado foi encontrada nos hepatócitos, considerando que a maioria do oligonucleotídeo ISIS 353382 que esteve presente no fígado foi encontrada em células hepáticas não parenquimatosas.Tabela 113
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Exemplo 103: Duração da ação in vivo de oligonucleotídeos direcionados à APOC-III compreendendo um conjugado de GalNAc3
[001107] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 114 abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em camundongos.Tabela 114 ASOs modificados direcionados a APOC-III
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[001108] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, e GalNAc3-19a foi mostrado no Exemplo 70.
Tratamento
[001109] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a APOC-III humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 114 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado antes da dosagem para determinar a base de referência e em 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a dose. Os níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III foram medidos conforme descrito no Exemplo 20. Os resultados na Tabela 115 são apresentados como a percentagem média dos níveis de triglicérides plasmáticos e APOC-III para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Uma comparação dos resultados na Tabela 71 do Exemplo 79 com os resultados na Tabela 115 abaixo mostra que os oligonucleotídeos que compreendem uma mistura de ligações internucleosídicas de fosfodiéster e fosforotioato exibiram maior duração de ação do que os oligonucleotídeos equivalentes que compreendem apenas ligações internucleosídicas de fosforotioato.Tabela 115 Níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III em camundongos transgênicos
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Exemplo 104: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de 5'-GalNAC2
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[001110] O composto 120 está disponível comercialmente, e a síntese do composto 126 é descrita no Exemplo 49. O composto 120 (1 g, 2,89 mmol), HBTU (0,39 g, 2,89 mmol), e HOBt (1,64 g, 4,33 mmol) foram dissolvidos em DMF (10 mL) e N,N-di-isopropiletilamina (1,75 mL, 10,1 mmol) foi adicionada. Após cerca de 5 min, éster benzílico de ácido aminohexanoico (1,36 g, 3,46 mmol) foi adicionado à reação. Após 3 h, a mistura de reação foi vertida em 100 mL de 1 M de NaHSO4 e extraída com 2 x 50 mL de acetato de etil. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 3 x 40 mL de NaHCO3 saturado e 2 x de salmoura, secas com Na2SO4, filtradas e concentradas. O produto foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica (DCM:EA:Hex, 1:1:1) para produzir o composto 231. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 231 (1,34 g, 2,438 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL) e ácido trifluoracético (10 mL) foi adicionado. Após agitação em temperatura ambiente por 2 h, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e co-evaporada com tolueno (3 x 10 mL). O resíduo foi seco sob pressão reduzida para produzir o composto 232 como sal de trifluoroacetato. A síntese do composto 166 é descrita no Exemplo 54. O composto 166 (3,39 g, 5,40 mmol) foi dissolvido em DMF (3 mL). Uma solução do composto 232 (1,3 g, 2,25 mmol) foi dissolvida em DMF (3 mL) e N,N-di-isopropiletilamina (1,55 mL) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, em seguida, vertida em água (80 mL) e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2x100 mL). A fase orgânica foi separada e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (3 x 80 mL), 1 M de NaHSO4 (3 x 80 mL) e salmoura (2 x 80 mL), em seguida, seca (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílica para produzir o composto 233. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 233 (0,59 g, 0,48 mmol) foi dissolvido em metanol (2,2 mL) e acetato de etil (2,2 mL). Paládio em carbono (10% em peso de Pd/C, úmido, 0,07 g) foi adicionado, e a mistura de reação foi agitada sob atmosfera de hidrogênio por 3 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma camada de Celite e concentrada para produzir o ácido carboxílico. O ácido carboxílico (1,32 g, 1,15 mmol, ácido sem cluster) foi dissolvido em DMF (3,2 mL). A isto, N,N-di-isopropiletilamina (0,3 mL, 1,73 mmol) e PFPTFA (0,30 mL, 1,73 mmol) foram adicionados. Após 30 min de agitação à temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em água (40 mL) e extraída com EtOAc (2 x 50 mL). Um acompanhamento padrão foi concluído conforme descrito acima para produzir o composto 234. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O oligonucleotídeo 235 foi preparado usando o procedimento geral descrito no Exemplo 46. A parte de cluster de GalNAC2 (GalNAC2-24a) do grupo de conjugado GalNAC2- 24 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC2-24 (GalNAC2-24a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0386
Exemplo 105: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAC1-25
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[001111] A síntese do composto 166 é descrita no Exemplo 54. O oligonucleotídeo 236 foi preparado usando o procedimento geral descrito no Exemplo 46. Alternativamente, o oligonucleotídeo 236 foi sintetizado usando o esquema abaixo, e o composto 238 foi usado para formar o oligonucleotídeo 236 usando os procedimentos descritos no Exemplo 10.
Figure img0388
[001112] A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-25a) do grupo de conjugado GalNAC1-25 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC1-25 (GalNAC1-25a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0389
Exemplo 106: inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a SRB-1 compreendendo um conjugado de 5'- GalNAC2 ou de 5'-GalNAc3
[001113] Os oligonucleotídeos listados nas Tabelas 116 e 117 foram testados em estudos dependentes de dose para uma inibição antissenso de SRB-1 em camundongos.
Tratamento
[001114] Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez com 2, 7, ou 20 mg/kg de N°. ISIS 440762; ou com 0,2, 0,6, 2, 6, ou 20 mg/kg de N°. ISIS 686221, 686222, ou 708561; ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis hepáticos de mRNA de SRB-1 foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram normalizados para os níveis de mRNA de ciclofilina, de acordo com protocolos padrão. Os oligonucleotídeos antissenso diminuíram os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose, e os resultados de ED50 são apresentados nas Tabelas 116 e 117. Embora estudos anteriores mostrem que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc trivalentes foram significativamente mais potentes do que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc, que foram, por sua vez, significativamente mais potentes do que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc monovalentes (ver, por exemplo, Khorev et al., Bioorg. & Med. Chem., Vol. 16, 5216-5231 (2008)), o tratamento com oligonucleotídeos antissenso compreendendo clusters de GalNAc monovalentes, divalentes e trivalentes diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 com potências semelhantes, como mostrado nas Tabelas 116 e 117.Tabela 116 Oligonucleotídeos modificados direcionados a SRB-1
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[001115] Veja o Exemplo 93 para a egenda da tabela. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62, e a estrutura de GalNAC2- 24a foi mostrada no Exemplo 104.Tabela 117 Oligonucleotídeos modificados direcionados a SRB-1
Figure img0391
[001116] Veja o Exemplo 93 para a legenda da tabela. A estrutura de GalNAC1-25a foi mostrada no Exemplo 105.
[001117] As concentrações dos oligonucleotídeos nas Tabelas 116 e 117 no fígado também foram avaliadas, usando os procedimentos descritos no Exemplo 75. Os resultados mostrados nas Tabelas 117a e 117b abaixo são os níveis médios totais teciduais do oligonucleotídeo antissenso para cada grupo de tratamento, conforme medido por UV em unidades de μg de oligonucleotídeo por grama de tecido hepático. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc acumulado no fígado em níveis significativamente mais altos do que a mesma dose do oligonucleotídeo em que falta um grupo de conjugado de GalNAc. Além disso, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem um, dois ou três ligantes de GalNAc em seus respectivos grupos de conjugado todos se acumularam o fígado em níveis semelhantes. Este resultado é surpreendente em vista da referência da literatura de Khorev et al. citada acima e é consistente com os dados de atividade mostrados nas Tabelas 116 e 117 acima.Tabela 117a Concentrações hepáticas de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAC2 ou de GalNAc3
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Tabela 117b Concentrações hepáticas de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAC1
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Exemplo 107: síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAci-26 ou de GalNAci-27
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[001118] O oligonucleotídeo 239 é sintetizado através do acoplamento do composto 47 (ver o Exemplo 15) ao ácido 64 (ver o Exemplo 32) usando HBTU e DIEA em DMF. O composto contendo amida resultante é fosfitilado, em seguida, adicionado à extremidade 5' de um oligonucleotídeo usando os procedimentos descritos no Exemplo 10. A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-26a) do grupo de conjugado GalNAC1-26 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC1-26 (GalNAC1-26a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0395
[001119] A fim de adicionar o grupo de conjugado de GalNAC1 à extremidade 3' de um oligonucleotídeo, a amida formada a partir da reação dos compostos 47 e 64 é adicionada a um suporte sólido usando os procedimentos descritos no Exemplo 7. A síntese do oligonucleotídeo é então concluída usando os procedimentos descritos no Exemplo 9 a fim de formar o oligonucleotídeo 240.
Figure img0396
[001120] A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-27a) do grupo de conjugado GalNAC1-27 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC1-27 (GalNAC1-27a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0397
Exemplo 108: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc direcionados à Apo(a) in vivo
[001121] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 118 abaixo foram testados em um estudo de dose única em camundongos.Tabela 118 ASOs modificados direcionados à APO(a)
Figure img0398
Figure img0399
[001122] A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.
Tratamento
[001123] Camundongos transgênicos machos que expressam a Apo(a) humana foram, cada um injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo e dosagem listados na Tabela 119 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. O sangue foi retirado no dia antes da dosagem para determinar os níveis de base de referência da proteína Apo(a) no plasma e em 1 semana após a primeira dose. Retiradas adicionais de sangue ocorrerão semanalmente por aproximadamente 8 semanas. Os níveis da proteína Apo(a) foram medidos usando um ELISA. Os resultados na Tabela 119 são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína Apo(a) plasmática para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência (% BL). Os resultados mostram que os oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão da proteína Apo(a). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiram uma redução até mais potente da expressão de Apo(a) do que os oligonucleotídeos que não compreendem um grupo de conjugado.Tabela 119 Níveis plasmáticos da proteína Apo(a)
Figure img0400
Exemplo 109: Síntese de oligonucleol tídeos compreendendo um conjugado de GalNAci-28 ou de GalNAci-29
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[001124] O oligonucleotídeo 241 é sintetizado usando procedimentos semelhantes àqueles descritos no Exemplo 71 para formar o intermediário fosforamidita, seguido pelos procedimentos descritos no Exemplo 10 para sintetizar o oligonucleotídeo. A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-28a) do grupo de conjugado GalNAC1-28 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC1-28 (GalNAC1-28a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0402
[001125] A fim de adicionar o grupo de conjugado de GalNAC1 à extremidade 3' de um oligonucleotídeo, procedimentos semelhantes àqueles descritos no Exemplo 71 são usados para formar o intermediário hidroxila, que é então adicionado ao suporte sólido usando os procedimentos descritos no Exemplo 7. A síntese do oligonucleotídeo é então concluída usando os procedimentos descritos no Exemplo 9 a fim de formar o oligonucleotídeo 242.
Figure img0403
[001126] A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-29a) do grupo de conjugado GalNAC1-29 pode ser combinada com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. A estrutura de GalNAC1-29 (GalNAC1-29a-CM) é mostrada abaixo:
Figure img0404
Exemplo 110: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAci-30
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[001127] O oligonucleotídeo 246 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAC1-30, em que Y é selecionado de O, S, um alquil C1-C10 substituído ou não substituído, amino, amino substituído, azido, alquenil ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte de cluster de GalNAC1 (GalNAC1-30a) do grupo de conjugado de GalNAC1- 30 pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, o símbolo Y é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, Y é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAC1-30a é mostrada abaixo:
Figure img0406
Exemplo 111: A síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc2-31 ou de GalNAc2-32
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[001128] O oligonucleotídeo 250 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAC2-31, em que Y é selecionado de O, S, um alquil C1-C10 substituído ou não substituído, amino, amino substituído, azido, alquenil ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte de cluster de GalNAC2 (GalNAC2-31a) do grupo de conjugado GalNAC2-31 pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonucleotídeo é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonucleotídeo é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAC2-31a é mostrada abaixo:
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[001129] A síntese de um oligonucleotídeo compreendendo um conjugado de GalNAC2-32 é mostrada abaixo.
Figure img0409
[001130] O oligonucleotídeo 252 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAC2-32, em que Y é selecionado de O, S, um alquil C1-C10 substituído ou não substituído, amino, amino substituído, azido, alquenil ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte de cluster de GalNAC2 (GalNAC2-32a) do grupo de conjugado GalNAC2-32 pode ser combinada com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos de conjugado. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonucleotídeo é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonucleotídeo é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAC2-32a é mostrada abaixo:
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Exemplo 112: Oligonucleotídeo modificados compreendendo um conjugado de GalNAci
[001131] Os oligonucleotídeos na Tabela 120 direcionados a SRB-1 foram sintetizados com um grupo de conjugado de GalNAC1 a fim de testar ainda mais a potência dos oligonucleotídeos que compreendem grupos de conjugado que contêm um ligante de GalNAc.Tabela 120
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Exemplo 113: Oligonucleotídeos antissenso que se d irecionam a receptor de hormônio do crescimento humano e compreendem um grupo GalNAc
[001132] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 121 foram concebidos para direcionar receptor de hormônio do crescimento humano (GHR).Tabela 121
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Exemplo 114: Inibição antissenso do receptor do hormônio de crescimento humano em células Hep3B por meros de lacuna MOE
[001133] Oligonucleotídeos antissenso foram concebidos como alvo um receptor de hormônio de crescimento (GHR) de ácido nucleico e foram testados quanto aos seus efeitos sobre o mRNA de GHR in vitro. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células Hep3B cultivadas em uma densidade de 20.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com 4.500 nM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. Sonda iniciador humano definido RTS3437_MGB (sequência para a frente CGAGTTCAGTGAGGTGCTCTATGT, aqui designado como SEQ ID NO: 2329; sequência inversa AAGAGCCATGGAAAGTAGAAATCTTC, aqui designado como SEQ ID NO: 2330; sequência da sonda TTCCTCAGATGAGCCAATT, aqui designado como SEQ ID NO: 2331) foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001134] Os oligonucleotídeos antissenso quiméricos designados recentemente nas Tabelas abaixo foram concebidos como 5-10-5 MOE ou 3-10-4 MOE meros de lacuna. Os meros de lacuna 5-10-5 MOE têm 20 nucleosídeos de comprimento, nos quais o segmento de lacuna central compreende dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa na direção 5' e a direção 3' compreendendo cinco nucleosídeos cada. Os meros de lacuna 3-10-4 MOE têm 17 nucleosídeos de comprimento, nos quais o segmento de de lacuna central compreende dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa na direção 5' e na direção 3' compreendendo três e quatro nucleosídeos, respectivamente. Cada nucleosídeo no segmento 5' de asa e cada nucleosídeo no segmento 3' de asa tem uma modificação em 2'-MOE. As ligações internucleosídicas ao longo de cada mero de lacuna são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada mero de lacuna são 5- metilcitosinas. "Sítio de iniciação" indica o nucleosídeo mais extremo em 5' para o qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. "Sítio de parada" indica o 3'- nucleosídeos a mais ao qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. Cada mero de lacuna listado nas tabelas abaixo é direcionado ou para mRNA de GHR humano, designado neste documento como SEQ ID NO: 1, (N° de Acesso GENBANK NM_000163.4) ou a sequência genômica humana do GHR, designada aqui como SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.00142.714.000). 'n/a' indica que o oligonucleotídeo antissenso não tem como alvo aquela determinada sequência genética com 100% de complementaridade. No caso do alinhamento da sequência de um gene- alvo em uma tabela em particular não é mostrado entende-se que nenhum dos oligonucleotídeos apresentados na tabela que se alinham com 100% de complementaridade com o gene-alvo.
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Exemplo 115: Inibição antissenso dependente da dose de GHR humano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE
[001135] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram banhadas em uma densidade de 20,000 por poço e transfectadas com eletroporação 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5.00 μM e 10.00 μM concentrações do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado nas tabelas abaixo. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001136] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 116: Inibição antissenso dependente da dose de GHR humano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE
[001137] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram banhadas em uma densidade de 20,000 por poço e transfectadas com eletroporação 0.3125 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5.00 μM e 10.00 μM concentrações do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado nas tabelas abaixo. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001138] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 117: Inibição antissenso dependente da dose de GHRhumano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE
[001139] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram banhadas em uma densidade de 20,000 por poço e transfectadas com eletroporação 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5.00 μM e 10.00 μM concentrações do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado nas tabelas abaixo. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001140] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 118: Inibição antissenso dependente da dose de GHR humano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE
[001141] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram banhadas em uma densidade de 20,000 por poço e transfectadas com eletroporação 0.3125 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5.00 μM e 10.00 μM concentrações do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado nas tabelas abaixo. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustados de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001142] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 119: Inibição antissenso do receptor do hormônio de crescimento humano em células Hep3B por meros de lacuna MOE, desóxi e (S)-cEt
[001143] Oligonucleotídeos antissenso adicionais foram concebidos como alvo um receptor de hormônio de crescimento (GHR) de ácido nucleico e foram testados quanto aos seus efeitos sobre o mRNA de GHR in vitro. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células Hep3B cultivadas em uma densidade de 20.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com 5,000 nM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001144] Os oligonucleotídeos antissensos quiméricos designados recentemente nas Tabelas abaixo foram concebidos como meros de lacuna desóxi, MOE e (S)-cEt. Os oligonucleotídeos (S)-cEt, MOE e desóxi são 16 nucleosídeos de comprimento, nos quais o nucleosídeo tem uma modificação de açúcar MOE, uma modificação de açúcar (S)- cEt ou uma modificação desóxi. A coluna de "Química" descreve as modificações de açúcar de cada oligonucleotídeo. "k" indica uma modificação de açúcar (S)-cEt; "d" indica desoxirribose; e "e" indica uma modificação MOE. As ligações internucleosídicas ao longo de cada mero de lacuna são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada mero de lacuna são 5-metilcitosinas. "Sítio de iniciação" indica o nucleosídeo mais extremo em 5' para o qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. "Sítio de parada" indica o 3'- nucleosídeos a mais ao qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. Cada mero de lacuna listado nas tabelas abaixo é direcionado ou para mRNA de GHR humano, designado neste documento como SEQ ID NO: 1, (N° de Acesso GENBANK NM_000163.4) ou a sequência genômica humana do GHR, designada aqui como SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000). 'n/a' indica que o oligonucleotídeo antissenso não tem como alvo aquela determinada sequência genética com 100% de complementaridade. No caso do alinhamento da sequência de um gene-alvo em uma tabela em particular não é mostrado entende-se que nenhum dos oligonucleotídeos apresentados na tabela que se alinham com 100% de complementaridade com o gene-alvo.
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Exemplo 120: Inibição antissenso do receptor do hormônio de crescimento humano em células Hep3B por meros de lacuna MOE, desóxi e (S)-cEt
[001145] Oligonucleotídeos antissenso adicionais foram concebidos como alvo um receptor de hormônio de crescimento (GHR) de ácido nucleico e foram testados quanto aos seus efeitos sobre o mRNA de GHR in vitro. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células Hep3B cultivadas em uma densidade de 20.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com 4.500 nM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001146] Os oligonucleotídeos antissensos quiméricos designados recentemente nas Tabelas abaixo foram concebidos como meros de lacuna desóxi, MOE e (S)-cEt. Os oligonucleotídeos (S)-cEt, MOE e desóxi são 16 nucleosídeos de comprimento, nos quais o nucleosídeo tem uma modificação de açúcar MOE, uma modificação de açúcar (S)- cEt ou uma modificação de açúcar desóxi. A coluna de "Química" descreve as modificações de açúcar de cada oligonucleotídeo. "k" indica uma modificação de açúcar (S)-cEt; "d" indica desoxirribose; e "e" indica uma modificação MOE. As ligações internucleosídicas ao longo de cada mero de lacuna são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada mero de lacuna são 5-metilcitosinas. "Sítio de iniciação" indica o nucleosídeo mais extremo em 5' para o qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. "Sítio de parada" indica o 3'- nucleosídeos a mais ao qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. Cada mero de lacuna listado nas tabelas abaixo é direcionado ou para mRNA de GHR humano, designado neste documento como SEQ ID NO: 1, (N° de Acesso GENBANK NM_000163.4) ou a sequência genômica humana do GHR, designada aqui como SEQ ID NO: 2 (N° de Acesso GenBank NT_006576.16 truncado de nucleotídeos 42.411.001-42.714.000). 'n/a' indica que o oligonucleotídeo antissenso não tem como alvo aquela determinada sequência genética com 100% de complementaridade. No caso do alinhamento da sequência de um gene-alvo em uma tabela em particular não é mostrado entende-se que nenhum dos oligonucleotídeos apresentados na tabela que se alinham com 100% de complementaridade com o gene-alvo. Os oligonucleotídeos da Tabela 175 não têm como alvo SEQ ID NOs: 1 ou 2, mas em vez disso têm como alvo sequências de gene variante de SEQ ID NO: 4 (N° de Acesso GENBANK DR006395.1) ou SEQ ID NO: 7 (complemento do número de acesso GenBank AA398260.1).
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Exemplo 121: Inibição antissenso dependente da dose de GHR humano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE, desóxi e (S)- cET
[001147] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram banhadas em uma densidade de 20,000 por poço e transfectadas com eletroporação 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5.00 μM e 10.00 μM concentrações do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001148] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 122: Inibição antissenso dependente da dose de GHR humano nas células Hep3B por meros de lacuna MOE, desóxi e (S)- cET
[001149] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos antissenso foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes. Os resultados para cada experimento são apresentados em tabelas separadas mostradas abaixo. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas utilizando eletroporação com concentrações de 0,04 μM, 0,11 μM, 0,33 μM, 1,00 μM e 3,00 μM de oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001150] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 123: Inibição antissenso dependente da dose de GHR de macaco rhesus em células LLC-MK2
[001151] Meros de lacuna de estudos descritos acima exibindo significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados quanto à sua potência para o mRNA de GHR de rhesus em células LLC-MK2. As células foram postas em placas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de 0,12 μM, 0,37 μM, 1,11 μM, 3,33 μM e 10,00 μM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001152] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 124: Inibição antissenso dependente da dose de GHR em hepatócitos primários de cinomolgo
[001153] Meros de lacuna de estudos descritos acima exibindo significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados quanto à sua potência para o mRNA de GHR em hepatócitos primários de macacos cinomolgo. As células foram postas em placas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de 0,12 μM, 0,37 μM, 1,11 μM, 3,33 μM e 10,00 μM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustados de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001154] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 125: Inibição de antissenso dependente da dose de GHR nas células Hep3B
[001155] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em por sua potência para mRNA de GHR em diversas doses em células Hep3B. As células foram postas em placas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de 0,12 μM, 0,37 μM, 1,11 μM, 3,33 μM e 10,00 μM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustados de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001156] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 126: Inibição antissenso dependente da dose de GHR em hepatócitos primários de cinomolgo
[001157] Meros de lacuna a partir dos estudos descritos acima apresentam significativa inibição in vitro de mRNA de GHR foram selecionados e testados em diversas doses em hepatócitos primários de macaco cinomolgo. As células foram postas em placas em uma densidade de 35.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de 0,04 μM, 0,12 μM, 0,37 μM, 1,11 μM, 3,33 μM e 10,00 μM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustados de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001158] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os níveis de mRNA de GHR foram significativamente reduzidos de maneira dependente de dose em células tratadas com o oligonucleotídeo antissenso.
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Exemplo 127: A análise comparativa da inibição antissenso dependente da dose de GHR em células Hep3B
[001159] ISIS 532401 foi comparado com oligonucleotídeos antissenso específicos divulgados na US 2006/0178325, testando a várias doses em células Hep3B. Os oligonucleotídeos foram selecionados com base na potência demonstrada em estudos descritos no presente pedido. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas utilizando eletroporação com concentrações de 0,11 μM, 0,33 μM, 1,00 μM, 1,11 μM, 3,00 μM e 9,00 μM de oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de GHR foram medidos por PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda de iniciador humano RTS3437_MGB foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de GHR foram ajustadas de acordo com o teor total de RNA, tal como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição do GHR em relação às células de controle não tratadas.
[001160] A concentração inibitória máxima média (IC50) de cada um do oligonucleotídeo também é apresentada. Os resultados indicam que o ISIS 532401 foi marcadamente mais potente do que os oligonucleotídeos mais potentes de US 2006/0178325.
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Exemplo 128: A tolerabilidade de 5-10-5 meros de lacuna MOE direcionados a GHR humano em camundongos CD1
[001161] Os camundongos CD1® (Charles River, MA) são um modelo de camundongos para múltiplas finalidades, frequentemente utilizado para testes de segurança e eficácia. Os camundongos foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001162] Injetou-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 50 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (100 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001163] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 213. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 213 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001164] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e plaquetas e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 214. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 214 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 129: A tolerabilidade de 5-10-5 meros de lacuna MOE direcionados a GHR humano em camundongos CD1
[001165] Os camundongos CD1® foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001166] Injetaram-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 50 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (100 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo de camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001167] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 215. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 215 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001168] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WB), RBC e plaquetas e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 216. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 216 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 130: A tolera bilidade de 3-10-4 meros de lacuna MOE direcionados a GHR humano em camundongos CD1
[001169] Os camundongos CD1® foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001170] Injetaram-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 50 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (100 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo de camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001171] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 217. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 217 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001172] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e plaquetas e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 218. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 218 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 131: Tolerabilidade dos meros de lacuna desóxi, MOE e (S)-cET de direcionamento a GHR humano nos camundongos CD1
[001173] Os camundongos CD1® foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001174] Injetaram-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 25 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (50 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo de camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001175] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 219. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 219 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001176] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e plaquetas e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 220. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 220 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 132: Tolerabilidade dos meros de lacuna desóxi, MOE e (S)-cET de direcionamento a GHR humano nos camundongos CD1
[001177] Os camundongos CD1® foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma. 3-10-4 mero de lacuna MOE ISIS 539376 também foi incluído no estudo.
Tratamento
[001178] Injetou-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 25 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (50 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo de camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001179] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 221. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 221 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001180] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 222. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 222 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 133: Tolerabilidade dos meros de lacuna desóxi, MOE e (S)-cET de direcionamento a GHR humano nos camundongos CD1
[001181] Os camundongos CD1® foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS, selecionados a partir dos estudos descritos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001182] Injetou-se, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em grupos de camundongos CD1 machos com oito a dez semanas de idade, 25 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (50 mg/kg/semana de dose). Injetou-se PBS, por via subcutânea duas vezes por semana durante 6 semanas em um grupo de camundongos CD1 machos. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001183] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 223. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 223 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Ensaios de Hematologia
[001184] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 224. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 224 Marcadores hematológicos no plasma de camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 134: Tolerabilidade de meros de lacuna MOE direcionados a GHR humano nos ratos Sprague-Dawley
[001185] Os ratos Sprague-Dawley são um modelo para múltiplas finalidades usado para avaliações de segurança e eficácia. Os camundongos foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS a partir dos estudos descritos nos Exemplos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores plasmáticos químicos.
Tratamento
[001186] Os camundongos Sprague-Dawley machos foram mantidos em um ciclo de claro/escuro de 12 horas e alimentados ad libitum com Purina chow de camundongo normal, dieta 5001. Grupos de 4 camundongos Sprague-Dawley foram injetados subcutaneamente cada um duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (100 mg/kg de dose semanal). Quarenta e oito horas após a última dose, realizou-se a eutanásia dos camundongos e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Função hepática
[001187] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, os níveis plasmáticos das transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os níveis plasmáticos de ALT (alanina transaminase) e AST (aspartato transaminase) foram medidos e os resultados são apresentados na Tabela 225 expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos utilizando o mesmo analisador da química clínica e os resultados também estão apresentados na Tabela 225 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 225 Marcadores de função hepática em camundongos Sprague-Dawley
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Função renal
[001188] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função renal, os níveis plasmáticos do nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina foram medidos usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 226 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 226 Marcadores de função renal (mg/dL) em camundongos Sprague Dawley
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Ensaios de Hematologia
[001189] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 227. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 227 Marcadores de Hematologia em camundongos Sprague-Dawley
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Pesos dos órgãos
[001190] Os pesos do fígado, baço, coração e rins foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 228. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram quaisquer alterações nos pesos dos órgãos fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 228 Peso dos órgãos (g)
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Exemplo 135: A tolerabilidade de meros de lacuna MOE, desóxi e (S)-cEt direcionados a GHR humano nos camundongos Sprague- Dawley
[001191] Os camundongos em sua função do rim foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS a partir dos estudos descritos nos Exemplos acima e avaliados para alterações nos níveis de diversos marcadores químicos do plasma.
Tratamento
[001192] Os camundongos Sprague-Dawley machos foram mantidos em um ciclo de claro/escuro de 12 horas e alimentados ad libitum com Purina chow de camundongo normal, dieta 5001. Grupos de 4 camundongos Sprague-Dawley foram injetados subcutaneamente uma veze por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de oligonucleotídeo ISIS (50 mg/kg de dose semanal). Dois grupos de camundongos foram injetados por via subcutânea uma vez por semana durante 6 semanas com PBS. Quarenta e oito horas após a última dose, realizou-se a eutanásia dos camundongos e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Função hepática
[001193] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, os níveis plasmáticos das transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os níveis plasmáticos de ALT e AST foram medidos e os resultados são apresentados na Tabela 229 expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos utilizando o mesmo analisador da química clínica e os resultados também estão apresentados na Tabela 229 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 229 Marcadores de função hepática em camundongos Sprague-Dawley
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Função renal
[001194] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função renal, os níveis plasmáticos do nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina foram medidos usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 230 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 230 Marcadores de função renal (mg/dL) em camundongos Sprague Dawley
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Ensaios de Hematologia
[001195] O sangue obtido a partir de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para hematócrito (HCT) e análise, bem como medições das várias células sanguíneas, tais como WBC, RBC e o teor de hemoglobina total. Os resultados são apresentados na Tabela 231. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de hematologia fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores. Tabela 231 Marcadores de Hematologia em camundongos Sprague-Dawley
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Pesos dos órgãos
[001196] Os pesos do fígado, baço, coração e rins foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 232. Os oligonucleotídeos ISIS que provocaram quaisquer alterações nos pesos dos órgãos fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos posteriores.Tabela 232 Peso dos órgãos (g)
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Exemplo 136: Efeito dos o igonucleotídeos antissenso ISIS que se direcionam ao GHR humano em macacos cinomolgo
[001197] Os macacos cinomolgo foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS selecionados dos estudos descritos nos Exemplos acima. A eficácia e a tolerabilidade do oligonucleotídeo antissenso, bem como seu perfil farmacocinético no fígado e rins, foram avaliados.
[001198] Este estudo foi realizado no momento em que, a sequência genômica de macaco cinomolgo não estava disponível no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI); portanto, a reatividade cruzada com a sequência de gene de macaco cinomolgo não poderia ser confirmada. Em vez disso, as sequências dos oligonucleotídeos antissenso ISIS usadas em macacos cinomolgo foram comparadas com uma sequência de macaco rhesus para a homologia. Espera-se que os oligonucleotídeos ISIS com homologia para a sequência de macaco rhesus sejam totalmente reativos de forma cruzada com a sequência de macaco cinomolgo também. Os oligonucleotídeos antissenso humanos testados são reativos cruzadamente com a sequência genômica de rhesus (n° de acesso GENBANK NW_001120958.1 truncado de nucleotídeos 4.410.000 a 4.720.000, aqui designados como SEQ ID NO: 2332). Quanto maior for a complementaridade entre o oligonucleotídeo humano e a sequência do macaco Rhesus, mais provável que o oligonucleotídeo humano possa reagir de forma cruzada com a sequência do macaco Rhesus. Os sítios de partida e de parada de cada oligonucleotídeo para a SEQ ID NO: 2332 é apresentado na Tabela 233. "Sítio de iniciação" indica o nucleosídeo mais extremo em 5' para o qual o mero de lacuna é direcionado na sequência gênica de macaco rhesus.Tabela 233 Oligonucleotídeos antissenso complementares à sequência genômica de GHR de Rhesus (SEQ ID NO: 2332).
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Tratamento
[001199] Antes do estudo, os macacos foram mantidos em quarentena por um período durante o qual os animais foram observados diariamente quanto à saúde geral. Os macacos tinham 2-4 anos de idade e pesavam entre 2 e 4 kg. Nove grupos de 5 macacos cinomolgo machos aleatoriamente distribuídos cada foram injetados por via subcutânea com o oligonucleotídeo ISIS ou PBS, usando uma agulha de dosagem de aço inoxidável e uma seringa de tamanho apropriado na região intracapsular e coxa externa dos macacos. Os macacos foram doseados três vezes (dias 1, 4 e 7) para a primeira semana e em seguida subsequentemente uma vez por semana, durante 12 semanas com 40 mg/kg de ISIS oligonucleotídeo. Um grupo de controle de 5 macacos cinomolgo foram injetados com PBS de um modo semelhante e serviu como grupo de controle.
[001200] Durante o período do estudo, os macacos foram observados duas vezes ao dia para sinais de doença ou sofrimento. Qualquer animal experimentando mais que momentâneo ou ligeira dor ou sofrimento devido ao tratamento, à lesão ou à doença foi tratado pela equipe de veterinários com analgésicos ou agentes aprovados para aliviar a dor, após consulta com o Diretor do estudo. Qualquer animal com saúde frágil ou em uma possível condição moribunda era identificado para monitoramento posterior e possível eutanásia. O sacrifício programado dos animais foi realizado no dia 86 por exsanguinação após anestesia induzida por cetamina/xilazina e administração de pentobarbital de sódio. Os protocolos descritos no Exemplo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC - Comitê Institucional de Uso e Cuidados Animais).
Redução no Alvo Hepático Análise de RNA
[001201] No dia 86, o RNA foi extraído a partir de fígado, tecido adiposo branco (WAT) e rim para análise em tempo real de PCR de medição da expressão de mRNA de GHR. Os resultados são apresentados como percentagem de mudança de mRNA em relação ao controle de PBS, normalizado com RiboGreen®. "ND" indica que os dados para esse oligonucleotídeo particular não foram medidos. Como mostrado na Tabela 234, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso ISIS resultou na redução significativa do mRNA de GHR em comparação com o controle de PBS. Especificamente, o tratamento com ISIS 532401 resultou em uma redução significativa da expressão de mRNA em todos os tecidos. Tabela 234 Inibição percentual do mRNA de GHR no fígado de macacos cinomolgos em relação ao controle de PBS
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Análise de proteínas
[001202] Aproximadamente 1 mL de sangue foi coletado de todos os animais disponíveis no dia 85 e colocado em tubos contendo o sal de potássio de EDTA. Os tubos foram centrifugados (3000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente) para obter o plasma. Os níveis plasmáticos de IGF-1 e GH foram medidos no plasma. Os resultados são apresentados na Tabela 235. Os resultados indicam que o tratamento com oligonucleotídeo ISIS resultou na diminuição dos níveis de proteína IGF-1.Tabela 235 Níveis de proteína no plasma nos macacos cinomolgo
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Estudos de tolerabilidade Medições de peso corporal e dos órgãos
[001203] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS sobre a saúde geral dos animais, os pesos corporais e dos órgãos foram medidos. Os pesos corporais foram medidos no dia 84 e são apresentados na Tabela 236. Os pesos dos órgãos foram medidos no dia 86 e os dados também são apresentados na Tabela 236. Os resultados indicam que o efeito do tratamento com os oligonucleotídeos antissenso nos pesos corporais e dos órgãos estava dentro do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso. Especificamente, o tratamento com ISIS 532401 foi bem tolerado em termos dos pesos corporais e dos órgãos dos macacos.Tabela 236 Corpo e peso dos órgãos finais no macaco cinomolgo
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Função hepática
[001204] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, amostras de sangue foram coletadas de todos os grupos de estudo. As amostras de sangue foram coletadas através de punção venosa femoral, 48 horas após a dosagem. Os macacos foram deixados em jejum durante a noite antes da coleta de sangue. O sangue foi coletado em tubos contendo o anticoagulante K2-EDTA, que foram centrifugados para obter o plasma. Os níveis de diversos marcadores de função hepática foram medidos, usando um analisador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão). Os níveis plasmáticos de ALT e AST e bilirrubina foram medidos. Os resultados indicam que os oligonucleotídeos antissenso não tiveram efeito na função hepática fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso. Especificamente, o tratamento com ISIS 532401 foi bem tolerado em termos da função hepática nos macacos.
Função renal
[001205] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função renal, amostras de sangue foram coletadas de todos os grupos de estudo. As amostras de sangue foram coletadas através de punção venosa femoral, 48 horas após a dosagem. Os macacos foram deixados em jejum durante a noite antes da coleta de sangue. O sangue foi coletado em tubos contendo o anticoagulante K2-EDTA, que foram centrifugados para obter o plasma. Os níveis de BUN e creatinina foram medidos usando um analisador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão).
[001206] Os dados químicos do plasma indicam que a maioria dos oligonucleotídeos ISIS não tem qualquer efeito sobre a função renal fora do intervalo esperado para oligonucleotídeos antissenso. Especificamente, o tratamento com ISIS 532401 foi bem tolerado em termos da função renal dos macacos.
Hematologia
[001207] Para avaliar qualquer efeito dos oligonucleotídeos ISIS nos macacos cinomolgo sobre os parâmetros hematológicos, amostras de sangue de aproximadamente 1,3 mL de sangue foram coletadas de cada um dos animais do estudo disponíveis em tubos contendo K2- EDTA. As amostras foram analisadas para a contagem de células vermelhas sanguíneas (RBC), contagem de células brancas sanguíneas (WBC), contagens de células brancas sanguíneas individuais, tais como de monócitos, neutrófilos, linfócitos, bem como a contagem de plaquetas, conteúdo de hemoglobina e hematócrito, usando um analisador hematológico ADVIA120 (Bayer EUA).
[001208] Os dados indicam que os oligonucleotídeos não provocaram quaisquer alterações nos parâmetros hematológicos fora do intervalo esperado para os oligonucleotídeos antissenso nesta dose. Especificamente, o tratamento com ISIS 532401 foi bem tolerado em termos dos parâmetros hematológicos dos macacos.
Análise do nível de proteína C-reativa
[001209] Para avaliar qualquer efeito inflamatório dos oligonucleotídeos ISIS em macacos cinomolgo, amostras de sangue foram coletadas para análise. Os macacos foram deixados em jejum durante a noite antes da coleta de sangue. Cerca de 1,5 mL de sangue foi coletado de cada animal e colocado nos tubos sem anticoagulante para separação do soro. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente por um período mínimo de 90 min e então centrifugados a 3.000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente para obter o soro. Proteína C-reativa (CRP), que é sintetizada no fígado e que serve como um marcador de inflamação, também foi medida usando um analisador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão). Os resultados indicam que o tratamento com ISIS 532401 não causou qualquer inflamação em macacos.
Exemplo 137: Medição da viscosidade dos oligonucleotídeos antissenso ISIS que se direcionam para o GHR humano
[001210] A viscosidade dos oligonucleotídeos antissenso selecionados a partir dos estudos descritos nos Exemplos acima foi medida com o objetivo de filtrar os oligonucleotídeos antissenso que têm uma viscosidade maior do que 40 cP. Os oligonucleotídeos com uma viscosidade maior que 40 cP seriam demasiado viscosos para serem administrados a qualquer indivíduo.
[001211] Oligonucleotídeos ISIS (32-35 mg) foram pesados para um frasco de vidro, 120 μL de água foi adicionado e o oligonucleotídeo antissenso foi dissolvido em solução aquecendo o frasco a 50°C. Parte (75 μL) a amostra preaquecida foi pipetada para um micro-viscosímetro (Cambridge). A temperatura do micro-viscosímetro foi definida como 25°C e a viscosidade da amostra foi medida. Outra parte (20 μL) da amostra preaquecida foi pipetada em 10 mL de água para leitura em UV em 260 nM a 85°C (instrumento Cary UV). Os resultados são apresentados na Tabela 237 e indicam que todas as soluções dos oligonucleotídeos antissenso são ideais em sua viscosidade sob o critério indicado acima.Tabela 237 Viscosidade dos oligonucleotídeos antissenso ISIS que se direcionam para o GHR humano
Figure img0638
Figure img0639
Exemplo 138: Efeito de oligonucleotídeos ISIS conjugados com GalNAc3-7 vs. não conjugados em um modelo de camundongo.
[001212] Oligonucleotídeos ISIS direcionados a GHR murino e que foram ou não conjugados com GalNAc3-7 foram testados em camundongos BALB/c em eficácia e tolerabilidade. Camundongos BALB/c são um modelo de camundongo multiuso, frequentemente utilizado para testes de segurança e eficácia.
[001213] Todos os oligonucleotídeos são meros de lacuna 5-10-5 MOE, que têm 20 nucleosídeos de comprimento, nos quais o segmento de de lacuna central compreende dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa na direção 5' e a direção 3' compreendendo cinco nucleosídeos cada. Cada nucleosídeo no segmento 5' de asa e cada nucleosídeo no segmento 3' de asa tem uma modificação em 2'-MOE. As ligações internucleosídicas ao longo de cada mero de lacuna são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada mero de lacuna são 5- metilcitosinas. "Sítio de partida" indica o nucleosídeo mais extremo em 5' para o qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene murino. "Sítio de parada" indica o 3'- nucleosídeos a mais ao qual o mero de lacuna é direcionado na sequência do gene humano. Cada mero de lacuna listado nas tabelas abaixo é direcionado para mRNA de GHR murino, designado neste documento como SEQ ID NO: 2333 (número de adesão GenBank NM_010284.2). Os oligonucleotídeos são descritos em detalhe na Tabela seguinte. Tabela 238 Oligonucleotídeos ISIS antissenso de direcionamento a GHR murino e conjugados ou não conjugados com GalNAc3-7
Figure img0640
Tratamento
[001214] Dois grupos de camundongos BALB/c de sete semanas de idade do sexo feminino foram injetados por via subcutânea durante 4 semanas com 10 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana ou 50 mg/kg/semana de ISIS 563223 ou ISIS 563179. Dois grupos de camundongos BALB/c de sete semanas de idade do sexo feminino foram injetados por via subcutânea durante 4 semanas com 1 mg/kg/semana, 5 mg/kg/semana ou de 10 mg/kg/semana de ISIS 706937 ou ISIS 739949. Um grupo de camundongos fêmeas BALB/c foi injetado por via subcutânea durante 4 semanas com PBS. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Redução Alvo
[001215] Para avaliar a eficácia dos oligonucleotídeos ISIS, níveis de IGF-1 no plasma e níveis de expressão de mRNA de IGF-1 e de GHR no fígado, bem como os níveis de expressão de mRNA de GHR em gordura e tecidos de rim, foram medidos. Os resultados são apresentados nas Tabelas abaixo.
[001216] Os resultados indicam que os oligonucleotídeos GalNAc3-7 -conjugados, ISIS 706937 e ISIS 739949, são 7-8 vezes mais potentes do que os oligonucleotídeos de origem com a mesma sequência, ISIS 563223 e ISIS 563179, na redução dos níveis de mRNA de fígado de GHR e foram 6- a 8 vezes mais potentes na redução dos níveis de fígado e de plasma de IGF-1. Expressão dos níveis de GHR nos tecidos do rim e gordura não foram reduzidos com oligonucleotídeos GalNAc3- 7-conjugados, já que o grupo conjugado com GalNAc3-7 direcionou o oligonucleotídeo especificamente para o fígado. Esta perda de gordura e redução do rim com oligonucleotídeos GalNAc3-7-conjugados não afetou a redução de IGF-1. Tabela 239 Os níveis de expressão de mRNA de fígado (% de inibição) na Semana 4
Figure img0641
Tabela 240 Níveis de IGF-1 de plasma (% de inibição) na semana 4
Figure img0642
Figure img0643
Tabela 241 Níveis de expressão de mRNA de GHR (% de inibição) na gordura e rim na semana 4
Figure img0644
Marcadores plasmáticos químicos
[001217] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, glucose, colesterol e triglicerídeos foram medidos utilizando um analisador de química clínica automatizada (Beckman Coulter AU480, Brea, CA). Os resultados são apresentados na Tabela abaixo. Nenhum dos oligonucleotídeos ISIS provocaram as alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores de função hepática ou renal fora da faixa esperada para os oligonucleotídeos antissenso. Os oligonucleotídeos GalNAc3-7 conjugados tiveram um perfil ligeiramente melhorado comparado aos oligonucleotídeos de origem.Tabela 242 Marcadores químicos plasmáticos em plasma BALB/c na semana 4
Figure img0645
[001218] Os resultados em conjunto indicam que oligonucleotídeos direcionados a expressão de mRNA GHR quando conjugados com GalNAc3-7 tinham dez vezes maior potência e perfis de tolerabilidade semelhantes ou melhores em comparação com os oligonucleotídeos de origem.
Exemplo 139: Estudo de tolerabilidade de um oligonucleotídeo ISIS conjugado com GalNAc3-7 e direcionamento a GHR humano em camundongos.
[001219] ISIS 766720 foi projetado com a mesma sequência que ISIS 532401, um oligonucleotídeo potente e tolerável direcionado a GHR humano e descrito nos estudos acima. ISIS 766720 é um 5-10-5 mero de lacuna MOE com a química de estrutura principal mista e conjugado com GalNAc3-7. A estrutura química do ISIS 766720 sem o grupo conjugado GalNAc3-7 é denotada como mCes mCes Aeo mCeo mCes Tds Tds Tds Gds Gds Gds Tds Gds Ads Ads Teo Aeo Ges mCes Ae (SEQ ID NO: 703) e está totalmente denotada por:
Figure img0646
Tratamento
[001220] Grupos de camundongos CD-1 machos de seis semanas de idade foram injetados subcutaneamente durante 6 semanas com 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana ou 100 mg/kg/semana de ISIS 766720. Um grupo camundongos foi injetado por via subcutânea durante 6 semanas (dias 1, 5, 15, 22, 29, 36 e 43) com PBS. Os camundongos sofreram eutanásia 48 horas após a última dose e os órgãos e o plasma foram colhidos para análise posterior.
Marcadores plasmáticos químicos
[001221] Para avaliar o efeito de ISIS 766720 na função hepática e renal, os níveis plasmáticos de transaminases, bilirrubina, creatinina e BUN foram medidos, usando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela abaixo. ISIS 766720 não provocou alterações nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora do intervalo esperado para oligonucleotídeos antissenso e foi considerado muito tolerável. Tabela 243 Marcadores plasmáticos químicos no plasma de camundongos CD-1 na semana 6
Figure img0647
Os pesos corporais e de órgãos
[001222] Os pesos corporais e dos órgãos foram medidos no final do estudo. Os resultados são apresentados na Tabela abaixo. ISIS 766720 não causou alterações nos pesos fora do intervalo previsto para oligonucleotídeos antissenso e foi considerado muito tolerável.Tabela 244 Pesos de camundongos CD-1 na semana 6
Figure img0648

Claims (3)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a seguinte estrutura química:
Figure img0649
2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido na reivindicação 1, ou sal do mesmo e pelo menos um de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
3. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1, ou da composição, como definida na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença associada com o excesso do hormônio de crescimento em um humano, opcionalmente, sendo que (a) doença associada com o excesso do hormônio de crescimento é acromegalia; e/ou (b) o tratamento reduz os níveis de IGF-1.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3336189A1 (en) * 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
EP3828275A1 (en) 2013-05-01 2021-06-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ttr expression
KR20200102553A (ko) 2014-05-01 2020-08-31 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 성장 호르몬 수용체 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
MX2017004039A (es) 2014-10-10 2017-07-24 Hoffmann La Roche Fosforamiditas de n-acetilgalactosamina (galnac), conjugados de acido nucleico de las mismas y su uso.
AU2016381174A1 (en) * 2015-12-31 2018-05-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing Ataxin-2 expression
TWI783434B (zh) 2016-03-07 2022-11-11 美商愛羅海德製藥公司 治療性化合物之標靶性配體
EP3484908A4 (en) 2016-07-15 2020-04-08 AM Chemicals Llc NON-NUCLEOSIDIC SOLID CARRIERS AND PHOSPHORAMIDITE BUILDING BLOCKS FOR OLIGONUCLEOTID SYNTHESIS
KR102557906B1 (ko) 2016-09-02 2023-07-20 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 표적화 리간드
CN109661233A (zh) 2016-10-06 2019-04-19 Ionis 制药公司 缀合低聚化合物的方法
SG11202001783YA (en) * 2017-10-12 2020-03-30 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods thereof
WO2019126641A2 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
US20220288214A1 (en) * 2019-10-24 2022-09-15 Genevant Sciences Gmbh Conjugates and methods for treating acromegaly
WO2022246195A1 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Olix Us, Inc. Functional moieties and their uses and synthetic preparation
EP4380576A2 (en) * 2021-08-03 2024-06-12 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
EP4396193A1 (en) 2021-08-30 2024-07-10 Hongene Biotech Corporation Functionalized n-acetylgalactosamine analogs
CN118401539A (zh) 2021-12-15 2024-07-26 兆维生物科技公司 官能化的n-乙酰半乳糖胺类似物
WO2024001172A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Ractigen Therapeutics Oligonucleotide modulators activating complement factor h expression

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
DE69033495T2 (de) 1989-10-24 2000-07-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modifizierte nukleotide
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
WO1993010820A1 (en) 1991-11-26 1993-06-10 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
JPH08508492A (ja) 1993-03-30 1996-09-10 スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド 非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
CA2238379A1 (en) 1995-11-22 1997-06-12 The Johns-Hopkins University Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
CN1231675A (zh) 1996-09-26 1999-10-13 味之素株式会社 修饰的生理活性蛋白及含有该蛋白的药物组合物
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
ATE293123T1 (de) 1997-09-12 2005-04-15 Exiqon As Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
RU2243231C2 (ru) * 1997-09-12 2004-12-27 Эксикон А/С Бициклические аналоги нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
IL145778A0 (en) 1999-04-21 2002-07-25 American Home Prod Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US9029523B2 (en) 2000-04-26 2015-05-12 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US8877916B2 (en) 2000-04-26 2014-11-04 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
WO2001023616A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Genetic Vectors, Inc. Method of identifying pathogenic cryptococci
US20050112118A1 (en) * 1999-12-02 2005-05-26 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating inflammatory disorders
ES2261270T3 (es) 1999-12-30 2006-11-16 K.U. LEUVEN RESEARCH & DEVELOPMENT Acidos nucleicos que contienen ciclohexeno.
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6602857B1 (en) 2000-01-18 2003-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US7179796B2 (en) 2000-01-18 2007-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2001250572A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
CA2431839A1 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Paul O. P. Ts'o Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
JP2005504020A (ja) 2001-07-03 2005-02-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド
US20040215006A1 (en) * 2003-04-25 2004-10-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of tyrosinase expression
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP1539689A2 (en) * 2002-07-19 2005-06-15 Pharmacia Corporation Antisense modulation of endothelial lipase expression
US20050239728A1 (en) 2002-07-31 2005-10-27 Pachuk Catherine J Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
CA2498772A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
EP1572964A4 (en) 2002-10-18 2007-08-08 Nucleonics Inc STRUCTURES AND CONSTRUCTIONS OF DOUBLE STRANDED RNA AND METHODS FOR THEIR GENERATION AND USE
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP1578765A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS CONTAINING SUGAR SUBSTITUTE AND COMPOSITIONS FOR USE IN GENE MODULATION
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
US7314750B2 (en) * 2002-11-20 2008-01-01 Affymetrix, Inc. Addressable oligonucleotide array of the rat genome
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
JP4152955B2 (ja) 2003-01-09 2008-09-17 ポステック・ファウンデーション 新規フォスフォアミダイト化合物
US7803781B2 (en) * 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US7846906B2 (en) 2003-02-28 2010-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
WO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Shionogi Co., Ltd. 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
CA2538252C (en) 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
WO2005065686A1 (en) 2004-01-07 2005-07-21 Adipogen Pharmaceuticals Pty Limited Differentiation modulating agents and uses therefor
WO2005071080A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucocorticoid receptor expression
WO2005121372A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
WO2006020768A2 (en) 2004-08-10 2006-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
US20090203132A1 (en) 2004-09-09 2009-08-13 Swayze Eric E Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
US20060089325A1 (en) 2004-10-13 2006-04-27 Sanjay Bhanot Antisense modulation of PTP1B expression
WO2006047842A2 (en) 2004-11-08 2006-05-11 K.U. Leuven Research And Development Modified nucleosides for rna interference
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
WO2006078217A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Avaris Ab COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
EA200800868A1 (ru) 2005-09-19 2008-10-30 ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. Модуляция экспрессии глюкокортикоидного рецептора
EP2388326A1 (en) 2005-09-19 2011-11-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
US8178503B2 (en) 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
CN103554205A (zh) 2006-05-05 2014-02-05 Isis制药公司 调节gccr的表达的化合物和方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2651453C (en) 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2008022309A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2609934A1 (en) 2007-02-16 2013-07-03 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
WO2008131419A2 (en) 2007-04-23 2008-10-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of rna interference agents
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
WO2009003009A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Substituted pyrrolidine as anti-infectives
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
CN101883777B (zh) 2007-10-01 2015-03-25 Isis制药公司 成纤维细胞生长因子受体4表达的反义调节
US9029337B2 (en) 2007-11-09 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 7 expression
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
CA2713379A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2009120878A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009143369A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing nucleosides and analogs thereof without using chromatography
WO2010039548A2 (en) 2008-09-23 2010-04-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
WO2010036696A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cyclohexenyl nucleic acid analogs
NZ603603A (en) 2008-10-15 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of factor 11 expression
CN105152939A (zh) 2008-11-10 2015-12-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送治疗剂的脂质和组合物
WO2010088537A2 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved lipid formulation
EP2419146A4 (en) 2009-04-15 2013-11-27 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF INFLAMMATORY RESPONSES BY FACTOR XI
US8883202B2 (en) 2009-05-05 2014-11-11 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid compositions
SG10201912450XA (en) 2009-06-10 2020-03-30 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
CN104651408A (zh) 2009-06-15 2015-05-27 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
WO2011008995A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 7 expression
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011038356A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Johns Hopkins University Novel liver-targeting agents and their synthesis
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011097641A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful in treatment of diseases or conditions related to repeat expansion
EA024534B1 (ru) 2010-02-24 2016-09-30 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн КОНЪЮГИРОВАННАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК (миРНК) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ
US9193752B2 (en) 2010-03-17 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
WO2011120053A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
US9102938B2 (en) * 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
CN103154014B (zh) 2010-04-28 2015-03-25 Isis制药公司 修饰核苷、其类似物以及由它们制备的寡聚化合物
WO2011163121A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
WO2012037254A1 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
EP2640400A4 (en) 2010-11-19 2016-01-20 Sirna Therapeutics Inc POLYMERIC POLYMERS (AMIDE) FOR THE ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
SG189474A1 (en) 2010-12-17 2013-05-31 Arrowhead Res Corp Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
CN103282503B (zh) * 2010-12-29 2015-12-02 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于细胞内递送核酸的小分子缀合物
PE20181518A1 (es) 2011-04-01 2018-09-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacion de la expresion del transductor de senales y activador de la transcripcion 3 (stat3)
WO2012142458A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of ptp1b expression
WO2012174476A2 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
KR102369777B1 (ko) 2011-06-21 2022-03-03 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법
JP2014531476A (ja) 2011-08-26 2014-11-27 アローヘッド リサーチ コーポレイション インビボ核酸送達のためのポリ（ビニルエステル）ポリマー
EP3453761A1 (en) * 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US8865674B2 (en) 2011-09-20 2014-10-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
RU2014119787A (ru) 2011-10-25 2015-12-10 Айсис Фармасьютикалс, Инк. Антисмысловая регуляция экспрессии gccr
IL293434B2 (en) 2011-11-18 2024-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNAI factors, preparations and methods of using them for the treatment of transthyretin-related diseases
US9717778B2 (en) * 2012-02-03 2017-08-01 Antisense Therapeutics Ltd. Combination therapy
US20150031747A1 (en) 2012-02-08 2015-01-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating factor vii expression
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
WO2013165816A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
EP2849801A4 (en) 2012-05-16 2016-05-25 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF APOA1 AND ABCA1
US20150232836A1 (en) 2012-05-16 2015-08-20 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
US10058623B2 (en) 2012-05-16 2018-08-28 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating UTRN expression
WO2014076196A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 Santaris Pharma A/S Anti apob antisense conjugate compounds
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
EP3828275A1 (en) 2013-05-01 2021-06-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ttr expression
AU2014284152B2 (en) 2013-06-21 2020-01-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
UA119643C2 (uk) 2013-06-27 2019-07-25 Рош Інновейшен Сентер Копенгаген А/С Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9)
RU2700244C2 (ru) 2013-07-02 2019-09-13 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Модуляторы рецептора гормона роста
WO2015042447A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
MX2016005855A (es) 2013-11-14 2016-07-13 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compuestos de conjugados antisentido de apolipoproteina b (apob).
KR20200102553A (ko) 2014-05-01 2020-08-31 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 성장 호르몬 수용체 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
PL3137605T3 (pl) 2014-05-01 2021-04-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby modulowania ekspresji białka angiopoetynopodobnego 3
EP3137115B1 (en) 2014-05-01 2020-10-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
BR112016022593B1 (pt) 2014-05-01 2022-04-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos oligoméricos, composições que os compreendem, e usos dos mesmos
BR112016022855B1 (pt) 2014-05-01 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos e composições para modular a expressão de pkk e seus usos
US10570169B2 (en) * 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
EP3151839A4 (en) * 2014-06-06 2018-02-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

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