CN103282503B - 用于细胞内递送核酸的小分子缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了化合物用于递送核酸的用途和这些化合物与核酸、特别是siRNA的缀合物。本文还公开了稳定的siRNA，其在与所述化合物共价连接并与递送聚合物组合施用来实现体内mRNA敲减时有用。具体而言，本发明提供了式(I)化合物用于递送核酸的用途，其中：Y是选自-(CH2)3-或-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-的连接基团；R1是-(C1-6)烷基；-(CH2)-萘基；或者-(CH2)m-苯基，其中苯基是未取代的或者被独立地选自下述的取代基取代最多四次：-NO2、-CN、卤素、-O-(CH2)-苯基、-O-(C1-6)烷基，或者-C(O)-NH2；R2是氢；-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或者独立地被–O-(C1-4)烷基取代；-(CH2)k-C(O)-NH2；-(CH2)k-苯基；-(C1-6)烷基，其是未取代的或者被–S-CH3取代一次；R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被独立地选自下述的取代基取代：-(CH2)-OH；或-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)；k是1、2、3、4、5或6；m是1、2、3或4；n是0或1；且p是1-20的整数。

Description

用于细胞内递送核酸的小分子缀合物
本发明涉及新的小分子缀合物用于递送核酸例如siRNA的用途。将核酸递送入活细胞内会受到细胞的复杂膜系统的高度限制。
一种用于体内递送核酸的方法是将核酸连接在小的靶向分子或疏水分子如脂质或甾醇上。然而在向啮齿类施用时观察了这些缀合物的递送和活性，所需的核酸的剂量有障碍地较大，常导致体内不期望的毒性作用以及在转换到人类时的高花费和难以实施的治疗方案。本文提供的是小分子缀合物用于递送核酸例如siRNA的用途，当小分子化合物与核酸缀合时，其成功介导所述核酸递送入细胞内。令人惊讶地是，已经发现，当使用本文所提供的新化合物时，足够用于成功递送的核酸剂量显著降低。因此，该化合物的用途提供了显著限制体内毒性的用于递送核酸的有力工具。
在一项实施方案中，本发明涉及式(I)化合物用于递送核酸的用途
其中
Y是选自-(CH2)3-或-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-的连接基团；
R1是-(C1-6)烷基；
-(CH2)-萘基；或者
-(CH2)m-苯基，其中苯基是未取代的或者被独立地选自下述的取代基取代最多四次：
-NO2、
-CN、
卤素、
-O-(CH2)-苯基、
-O-(C1-6)烷基，或者
-C(O)-NH2；
R2是氢；
-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或者独立地被–O-(C1-4)烷基取代；
-(CH2)k-C(O)-NH2；
-(CH2)k-苯基；
-(C1-6)烷基，其是未取代的或者被–S-CH3取代一次；
R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被独立地选自下述的取代基取代：
-(CH2)-OH；或
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)；
k是1、2、3、4、5、6；
m是1、2、3或4；
n是0或1；且
p是1-20的整数。
在另一项实施方案中，提供了具有如式(Ia)所示的特定构型的式(I)化合物在递送核酸中的用途
其中全部取代基R1、R2、R3和Y以及变量k、m、n和p具有上文所述的含义。
在另一项实施方案中，本发明涉及式(I)或(Ia)化合物在递送核酸中的用途，其中Y是-(CH2)3-；且所有剩余取代基基团具有上文所述的含义。
在另一项实施方案中，本发明涉及式(I)或(Ia)化合物在递送核酸中的用途，其中Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-；且全部取代基基团具有上文所述的含义。
在另一项实施方案中，提供了式(I)或(Ia)化合物在递送核酸中的用途，其中
Y是-(CH2)3-；
R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或独立地被–O-(C1-4)烷基取代；且
R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；
n是0；且
R1和k具有上文所述含义。
在另一项实施方案中，提供了式(I)或(Ia)化合物在递送核酸中的用途，其中
Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-；
R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或独立地被–O-(C1-4)烷基取代；且
R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；
n是0；且
R1、k和p具有上文所述含义。
如本文所用的术语“(C1-6)烷基”的含义是包含1-6个碳原子的直链或支链饱和烃。优选的C1-6烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、2-丁基等。
如本文所用的术语“卤素”的含义是氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。
一般而言，用于递送核酸的本发明的化合物可以使用有机或药物化学领域普通技术人员已知的方法获得。同样，应当理解，胆固醇部分可以被其它天然或化学合成化合物代替。式(A)化合物进一步在甾类(如胆甾烷酸、石胆酸等)或其它已知在核酸递送中有效的小分子(如维生素类)例如生育酚(MolecularTherapy,2008,16,734)中反应
为成功递送核酸，将式(I)或(Ia)化合物与核酸共价连接。优选地，该共价键是通过核酸中适合的官能团例如即伯胺基团与如上文所定义的R3的–O-C(O)-O-部分中活化的羰基基团反应产生。因此，本文提供的是包含式(I)或(Ia)化合物和核酸的缀合物。
如本文所用的术语“核酸”是指DNA的任何形式，包括cDNA或RNA或其片段、核苷酸、核苷、寡核苷酸(包括反义寡核苷酸类、LNA和siRNA)，其在动物(包括但不限于鸟类和哺乳动物，包括人类)体内施用时引发生物学作用。优选地，本文所用的核酸是siRNA。
包含与核酸共价连接的本发明化合物的缀合物与单独所述核酸相比较显示出提高的被细胞吸收的能力。当该缀合物递送入细胞并运送至溶酶体后，对应的核酸经酶裂解被释放。该裂解优选地当二肽基序(优选地包含如式(I)或(Ia)化合物中所存在的序列α-或β-(苯基)丙氨酸和赖氨酸)被引入该缀合物中时发生(参见流程1)。更加优选地是，该缀合物包含二肽基序和间隔体，例如对氨基苄基氨基甲酸酯间隔体(BioconjugateChem.2002,13,855)，其当二肽基序的C末端酰胺键裂解时自发地断裂，如流程2中siRNA所例证。因此，该包含式(I)或(Ia)化合物的缀合物还涉及包含胆固醇缀合物的二肽。核酸从本发明包含二肽的胆固醇缀合物中的酶裂解是由细胞固有的蛋白酶类催化。能够裂解存在于式(I)或(Ia)化合物中的二肽基序的固有蛋白酶的一个实例是组织蛋白酶B。组织蛋白酶B是已知在哺乳动物细胞的溶酶体中普遍存在的半胱氨酸蛋白酶(BioconjugateChem.2002,13,855；J.Med.Chem.2005,48,1344；Nat.Biotechnology2003,21,778)。因此，上文所述的二肽基序也称为组织蛋白酶可裂解的二肽基序。
因此，本发明还提供了将核酸递送入细胞内的方法，其中所述核酸可以随后从该缀合物中释放以呈现其治疗活性。
在本发明的其它实施方案中，其提供了与siRNA共价连接的式(I)或(Ia)化合物的缀合物用于细胞内递送用途。
与核酸共价连接的式(I)或(Ia)的缀合物在本文分别称为式(II)或(IIa)。
流程1
因此，在其它实施方案中，本发明提供了式(II)化合物
其中
Ra是–(CH2)k-NH2；
R1和k具有上文式(I)所述含义。
在更加特定的实施方案中，本发明提供了式(IIa)化合物
其中
Ra是–(CH2)k-NH2；
R1和k具有上文式(I)所述含义。
在优选的实施方案中，在式(II)或(IIa)中的核酸是siRNA。
在另一项优选的实施方案中，在式(II)或(IIa)中的生物活性物质是蛋白质或肽。
式(II)或(IIa)化合物可以具有治疗中有利的特性。因此，在其它实施方案中，提供了用作药物的式(II)或(IIa)化合物。
本发明的另一项实施方案是包含式(I)或(Ia)化合物与核酸共价连接的缀合物的药物组合物。
在本发明的另一项实施方案中，提供了包含式(IIa)化合物与可药用赋形剂一起的药物组合物。
以下实施方案举例说明与siRNA共价连接的式(I)或(Ia)化合物的缀合物。应当理解，这些实施方案也可以应用于其它类型的如上文所定义的核酸。
siRNA与式(I)或(Ia)化合物的共价连接是经siRNA中适合的亲核基团(即伯胺基团)与所述式(I)或(Ia)化合物的R3中活化的–C(O)-基团反应来实现。–C(O)-基团的活化是通过对硝基苯氧基碳酸酯获得，如下文流程2中所示。
(流程2)
对硝基苯基活化的碳酸酯可以例如与带有适合的亲核基团如己基氨基连接体的伯胺的siRNA反应形成氨基甲酸酯连接，从而得到siRNA缀合物。当siRNA吸收入细胞内并转移至溶酶体后，其中生物活性物质是siRNA的式(II)或(IIa)化合物被蛋白酶活性经1,6-消除反应裂解，释放siRNA，如流程3中所示。式(II)或(IIa)化合物的缀合物的胆固醇部分改变了siRNA的PK特性，由此全身给药使得体内基因沉默。
在一项实施方案中，其中核酸是siRNA的式(II)或(IIa)化合物是与递送聚合物组合施用。递送聚合物提供了破裂细胞膜并调节内体释放的手段。在另一项实施方案中，所述递送聚合物和本发明的siRNA缀合物非共价连接且分别合成，并且可以在分开的容器或单个容器中供给。用于寡核苷酸类如siRNA的递送聚合物是本领域熟知的。
例如，Rozema等人，在美国专利出版物20040162260中例证了膜活化聚胺的可逆调节膜破裂活性的方法。可逆调节提供了限制对靶细胞胞内体的活性的方法，因此限制毒性。他们的方法依赖于聚胺上的胺与2-丙酸-3甲基马来酸酐之间的反应。该修饰通过伯胺转化为包含羧基的基团而将聚阳离子转化为聚阴离子，并可逆地抑制聚胺的膜活性。
流程3
为了能够将核酸与递送载体组合递送，将核酸共价地连接在递送聚合物上。在美国临时专利申请61/307490中描述了新一代的递送聚合物。其中，提供了膜活性聚胺，其包含由包含胺的单体、较低疏水性的单体和较高疏水性的单体随机聚合形成的两亲性三元共聚物。该新一代的递送聚合物不需要多核苷酸和聚合物通过共价连接或通过电荷-电荷互相作用进行结合。
用于与本发明的siRNA缀合物组合施用的递送聚合物的非限定性的实例是膜活性聚胺和聚(乙烯基醚)(PBAVE)、动态聚缀合物(DPC；Rozema等人2007)和如美国临时专利申请61/307490中所公开的改进的DPC。
在其它实施方案中，提供了用于体内功能递送的新的化学siRNA修饰模式。该新的化学siRNA修饰模式与表现出相对较强的胞内体/溶酶体内保留的递送载体一起尤其有用。
已经发现，对抗由定位于胞内体/溶酶体内的核酸酶如DNAseII降解的siRNA的稳定化作用强烈地促进了靶点敲减(knockdown)。该稳定化可以直接影响siRNA释放到细胞RNAi机制所处的细胞质内的量。仅有细胞质内的siRNA部分能触发RNAi作用。
当没有保护性递送载体的siRNA直接施用进入循环系统时，除了较差的药代动力学特性以外，siRNA在生物环境下对核酸酶敏感。因此，许多siRNA在细胞外的组织和血流中或在细胞吸收(胞内体)后迅速降解。
人们熟知，位于胞内体/溶酶体区室内的核酸酶是DNaseII。该酶在pH低于6-6.5时有活性，且在4.5-5范围的pH下具有最强活性，反映了存在于胞内体/溶酶体区室内的酸性环境条件。随后的由DNaseII引发的RNA降解路径在体外已被鉴定，并在本发明中公开：
A.包含至少一个2’-OH核苷酸的RNA链经环状五价磷中间体迅速降解，产生在5’-裂解产物的2’-3’环状磷酸酯。该五价中间体的形成可以被缺少2’-OH基团的核苷酸类例如2’-脱氧、2’-O-甲基(2’-OMe)或2’-脱氧-2’-氟(2’-F)核苷酸类所抑制。
B.此外，RNA以不依赖于5’-末端核苷酸上2’-修饰的5’-核酸外切路径降解。该降解路径可以被5’-末端的非核苷酸部分，例如胆固醇、氨基烷基连接体或在第一个核苷酸之间的键处的硫代磷酸酯所抑制。
C.5’-磷酸酯还保护并减缓核酸外切裂解动力学，但不能够完全阻断该路径。这最可能是由于5’-磷酸酯被磷酸酶或稳定性试验中所用的DNaseII酶制剂所固有的磷酸酶活性造成的裂解。
D.最佳保护是用在链中缺少任何2’-OH核苷酸的寡核苷酸类来实现，用位于5’-端的2’-OMe核苷酸经硫代硫酸酯(PTO)连接与第二个核苷酸连接开始。其它末端缺少2’-OH基团的核苷酸也可防止5’-外切降解，但与2’-OMe修饰相比程度较低。
因此，本发明的发明者发现，当使用以下设计时，siRNA可以显著地被稳定，其中用具有修饰模式的反义链来提供寡核苷酸：5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’和具有修饰模式5’-(Z3)ns-3’的有义链，其中
w独立地是5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯或H，
Z1独立地是2’-修饰的核苷。
Z2独立地是2’-脱氧核苷或2’-氟-修饰的核苷，
Z3独立地是2’-修饰的核苷，
na是8-23且ns是8-25。
在一项优选的实施方案中，寡核苷酸是用具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-3’的有义链提供，其中Z1是2’-氟-修饰的核苷或2脱氧核苷，且全部其他取代基以及变量na和ns具有上文所述含义。
在一项优选的实施方案中，寡核苷酸是用具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-3’的有义链提供，其中Z3是2’-O-甲基修饰的核苷、2’-氟-修饰的核苷或2脱氧核苷，且全部其他取代基以及变量na和ns具有上文所述含义。
在一项优选的实施方案中，寡核苷酸是用具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-3’的有义链提供，其中Z1是2’-氟-修饰的核苷或2脱氧核苷，且Z3是2’-O-甲基修饰的核苷、2’-氟-修饰的核苷或2脱氧核苷，且全部其他取代基以及变量na和ns具有上文所述含义。
具有新的修饰模式的寡核苷酸类的核酸序列中的核苷可以通过5’-3’磷酸二酯或5’-3’硫代磷酸酯键连接。
如本文所用的"反义"链是与靶mRNA互补并且当siRNA展开时与该mRNA结合的siRNA链。
所述包含新的修饰模式的siRNA的有义链与反义链互补。
所述包含新的修饰模式的siRNA证明当与如Rozema等人所例证的递送聚合物(DynamicPolyConjugates(DPC；Rozema等人2007)共价连接时特别有利。使用本发明所述的siRNA修饰策略，作用的效能和持续时间可以显著提高。
在另一项实施方案中，当与改变siRNA药代动力学特性的小分子例如胆固醇或本文所提供的式(I)和(Ia)化合物缀合时，所述包含新的修饰模式的siRNA尤其有用。在一项实施方案中，提供了小分子和寡核苷酸的缀合物，其中寡核苷酸具有以下修饰模式：具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-的有义链，其中取代基以及变量na和ns具有上文所述含义。在一项实施方案中，所述小分子是胆固醇。在另一项实施方案中，所述小分子是式(I)或(Ia)化合物，得到式(II)或(IIa)化合物。
优选地，所述siRNA缀合物是与递送聚合物组合施用。适合的递送聚合物如上文所述。
在一项实施方案中，当与已知结合在能将缀合物内化到细胞中的特定受体上的配体缀合时，所述包含新的修饰模式的siRNA尤其有用。特别是，在肝细胞上表达的唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是熟知的能够从循环系统中清除(胞吞或溶酶体降解)脱唾液酸化的蛋白质的受体。已经显示，N-乙酰基-D-半乳糖胺对该受体具有高度的亲合力，尤其是当呈现多价和当半乳糖残基具有适合的间隔时(JBiolBhem,2001,276,37577)。为了利用该高能效受体进行受体介导的核酸的细胞吞噬，制备下文所示的合成配体以便与包含新的修饰模式的siRNA共价地连接。由于该类型的细胞吞噬导致内化物质的溶酶体降解，所述siRNA必须按照其在溶酶体内稳定的方式制备，而这个问题目前已由上文所概述的新的修饰模式解决。
同样，应当理解，与如式IV所示的核酸例如siRNA缀合的式III所示的靶向配体可以被表现出对细胞表面表达受体高亲和力的其它天然或化学合成化合物(拮抗剂或激动剂)代替。实例包括作为在多种癌细胞上表达的叶酸盐受体的配体的叶酸(Ann.N.Y.Acad.Sci.,2009,1175,32)或PSMA结合分子(NatureBiotech,2006,24,1005;MolPharm,2009,6,780)。
ASGPR的配体是经由酰胺键与核酸连接。该酰胺键的形成可以在N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)化学辅助下进行。在缀合反应中所用的配体如下文所示(式III)。为了与ASGPR相互作用，糖类残基上的O-乙酸酯基团需要去除，如siRNA中所示(式IV)。
在本发明的一项实施方案中，提供了式IV化合物和寡核苷酸的缀合物，其中该寡核苷酸具有以下修饰模式：具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-的有义链，其中取代基以及变量na和ns具有上文所述含义。所述缀合物也称为GalNAc棕榈酰缀合物。优选地，所述GalNAc棕榈酰缀合物是与递送聚合物组合施用。适合的递送聚合物如上文所述。
已经发现，对于这些修饰模式，可裂解的连接体与稳定连接的小分子配体相比证明是有利的。可能的可裂解连接体是如流程1中所举例的二肽基序或包含含有2’-OH的核苷酸类的可裂解RNA-连接体。该可裂解的RNA连接体在与具有如上文所述新的修饰模式(全部2’-修饰的siRNA)的siRNA组合时尤其有用。
一般而言，核酸酶裂解位点可以由在有义链或反义链上的包含至少一个2’-OH的核苷酸的3’-或5’-突出部分引入。最终的活性siRNA物质由细胞内核酸酶处理产生。并且，使用由2’-OH核苷酸在碱基对区域内实现的限定裂解位点是可能的。其可以使用至少一个与对应链互补的2’-OH核苷酸或者通过引入至少一个错配的2’-OH核苷酸或包含至少一个2’-OH的核苷酸的发卡/突环来完成。
与其它可裂解的连接体化学相反，通过引入2’-OH核苷酸的限定裂解位点的使用导致更加多方面的缀合方式。通过在siRNA的一条或两条链上在3’和/或5’-末端或在双链结构内引入选择性的裂解位点，可能产生多种缀合。
因此，在一项实施方案中，提供了小分子和寡核苷酸的缀合物，其中
a)小分子包括含有1-10个、优选1-5、最优选1-3个2’OH核苷酸的核苷酸连接体；
b)寡核苷酸具有以下修饰模式：具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链与具有修饰模式5’-(Z3)ns-的有义链，其中取代基以及变量na和ns具有上文所述含义；并且
c)该寡核苷酸通过核苷酸连接体与小分子共价连接。
核苷酸连接体在缀合物被内化到胞内体后，例如在胞内体中经细胞内核酸酶例如DNaseII裂解，因此释放siRNA。
优选地，所述缀合物是与递送聚合物组合施用。适合的递送聚合物如上文所述。
在本发明的另一项实施方案中，提供了式(V)化合物。该化合物包含胆固醇部分以及包含1-10个、优选1-5、最优选1-3个2’OH-核苷酸的核苷酸连接体。该核苷酸连接体是用于例如siRNA的寡核苷酸与式(V)化合物的共价连接。优选地，所述寡核苷酸具有如上文所概括的新的修饰模式。因此在另一项实施方案中，提供了式(V)化合物与寡核苷酸的缀合物，其中寡核苷酸与式(V)化合物的核苷酸连接体共价连接。
该核苷酸连接体在式(V)化合物和寡核苷酸的缀合物被内化入胞内体后被细胞内核酸酶例如DNaseII裂解，因此释放siRNA。
优选地，所述式(V)化合物和寡核苷酸的缀合物是与递送聚合体组合施用。适合的递送聚合物如上文所述。
在另一项实施方案中，所述递送聚合物与本发明的式(V)化合物和寡核苷酸的缀合物不是共价连接，而是单独合成并可以在分开的容器或单个容器中提供。
定义
如本文所用的术语“小分子”是指合成的或在自然界发现的有机或无机分子，一般而言，具有低于10,000克/摩尔的分子量，任选地低于5,000克/摩尔，且任选地低于2,000克/摩尔。
如本文所用的术语“肽”是指由一个D-或L-氨基酸的α-羧基基团与另一个D-或L-氨基酸的α-氨基基团之间形成酰胺键所产生的任何聚合体化合物。如本文所用的术语“蛋白质”是指超过约50个残基的特定序列的多肽类。
如本文所用的术语“二肽基序”是指包含由第一个D-或L-氨基酸的α或β氨基基团与第二个D-或L-氨基酸的α-羧基基团形成的酰胺键的任何基序。
如本文所用的术语“氨基酸”是指包含胺和羧基官能团的任何分子。因此，术语“氨基酸”是指天然、非天然和合成氨基酸。用于本发明的任何天然氨基酸以其常规缩写在本文表示。
如本文所用的术语“配体”是指能够共价地或以其它化学方式与核酸结合的部分。在本发明上下文中术语“配体”优选地是与核酸共价连接的式(I)或(Ia)化合物。
如本文所用的术语“核酸”的含义是由核苷酸构成的寡聚体或多聚体，例如脱氧核糖核苷酸类或核糖核苷酸类，或者经合成制备的化合物(例如如美国专利号5,948,902中所述的PNA和其中所引述的参考文献)，其可以与天然存在的核酸以与两个天然存在的核酸类似的序列特异性方式杂交，例如可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。非天然存在的核酸类是寡聚体或聚合物，其包含自然界没有出现的核酸碱基序列，或者包含天然存在的核酸碱基、糖类或糖间连接键的官能化等价物的物质，例如肽核酸类(PNA)、苏糖核酸类(TNA)、锁核酸类(LNA)或甘油核酸类(GNA)。该术语包括含有天然存在的核酸核酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的寡聚体，以及含有碱基类似物或修饰的核酸碱基的寡聚体。核酸可以衍生自许多天然来源，例如病毒、细菌和真核DNA和RNA。其它核酸可以衍生自合成途径，且包含制备用作研究试剂、诊断试剂或有效且明确的治疗剂的任何多种寡核苷酸类。该术语包括含有单链核酸或双链核酸的寡聚体。
如本文所用的术语“2’-修饰”是指β-D-核糖核苷或具有被H、F、O-CH3或本领域已知的其它取代基代替的2’-OH基团的包含天然存在核碱基的β-D-核糖核苷。
如本文所用的术语“2’-OH-核苷酸”是指包含具有2’-OH基团的天然存在的核酸碱基的β-D-核糖核苷。
如本文所用的术语“5’-磷酸酯”是指式-O-P(=O)(OH)OH。在另一方面，该磷酸酯被修饰，其中O或OH基团中的一个被S代替，在本文称作“5’-硫代磷酸酯”。
如本文所用的术语“硫代磷酸酯”是指核苷酸间的键，其中一个非桥联的氧被硫代替。
如本文所用的术语“递送聚合物”是指是用于核酸的功能递送的聚合物。在本文的上下文中，该递送聚合物是与缀合在本文所述化合物上的生物活性物质共价连接或组合施用，并在内化入细胞并吸收到胞内体后介导胞内体逃逸。本文的术语“聚合体”的含义是指由两个或多个彼此以共价键结合的单体单元构成的任何化合物，其中所述的单体单元可以是相同或不同的，因此该聚合物可以是同聚物或杂聚物。代表性的聚合物包括肽类、多糖、核酸等，其中所述聚合物可以是天然存在的或合成的。该递送聚合物非限定性的实例例如INTERNATIONALJOURNALOFPHARMACEUTICALRESEARCHANDDEVELOPMENT,2010年10月/第2卷/第8期/文章编号-2中所综述。用于递送核酸的递送聚合物的非限定性实例如EP申请10165502.5和10191030.5、PCT出版物WO2008/0022309和US临时申请61/307490和其引用的文献所公开；所述内容全部引入本文作为参考。
如本文所用的“药物组合物”包含本发明的缀合物、药学载体或稀释剂和制剂必需的任何其它介质或试剂。
如本文所用的“药学载体”包含任何以及全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸收延迟试剂，以及生理学相容的其它试剂。优选地，所述载体是适用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊椎或表皮施用(例如经注射或输注)。
本发明的缀合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员所理解，给药途径和/或模式根据所需结果而不同。通过某些给药途径施用本发明的缀合物时，必须将该缀合物用阻止其失活的物质包衣或者与其组合施用。例如，该缀合物可以在合适的载体或稀释剂中向个体施用。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药学载体包括无菌的水溶液或分散剂和用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。此类用于药物活性物质的介质和试剂的应用是本领域已知的。
如本文所用的短语“胃肠外施用”的含义是除了肠内和局部施用以外的给药模式，通常是经注射施用，且非限定性的包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
这些载体还包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌的方法(如上文所述)以及包含多种抗菌和抗真菌试剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的存在。该组合物中还期望包含等渗试剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物剂型的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶获得。
除了所选择的给药途径外，可以以合适的水合形式使用的本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物是按照本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平根据要获得的活性成分的量而不同，该活性成分的量是对特定患者、组合物和给药模式而言有效产生所期望的治疗反应且对患者无毒的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括本发明所用的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、患者年龄、性别、体重、病症、一般身体状况和以前的病史等医学领域内熟知的因素。
药物组合物必须是无菌的且具有一定程度的流动性，使得该组合物可以经注射进行递送。除了水以外，载体优选地是等渗的缓冲盐水溶液。
例如，可以通过使用例如卵磷脂的包衣、通过保持分散体系中所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗试剂，例如糖类、多元醇如甘露醇或山梨醇以及氯化钠。
附图简述
图1显示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA缀合物和递送聚合物的体内组合施用。
图2显示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA缀合物和递送聚合物的体内组合施用。
图3显示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA缀合物和递送聚合物的体内组合施用。
图4显示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA缀合物和递送聚合物的体内组合施用。
图5a显示了带有全部2’-修饰的反义链介导的siRNA的基因沉默。将COS7细胞用EGFP-定向的siRNA在3nM和psiCHECK2-AT进行共转染。通过从报告基因构建体检测花虫(renilla)相对于荧火虫荧光素酶的活性来评价siRNA的敲减活性。siRNA通过未修饰的(2-19-2)参照siRNA的敲减活性进行分类。
图5b显示了带有全部2’-修饰的有义链介导的siRNA的基因沉默。将COS7细胞用EGFP-定向的siRNA在3nM和psiCHECK2-AT进行共转染。通过从报告基因构建体检测荧光素酶表达来评价siRNA的敲减活性。siRNA通过未修饰的(2-19-2)参照siRNA的敲减活性进行分类。
图6a显示了在非人类的灵长类中静脉注射多种与递送聚合体共价连接的2’-修饰siRNA后血清FVII活性降低。
图6b显示了在非人类的灵长类中用与递送聚合体共价缀合的2’-修饰siRNA处理后凝血酶原时间的发展。
实施例
以下实施例仅作为参考实施例，目的是为了说明用于递送核酸的化合物的合成。不意味着它们形成本发明的一部分。
实施例1
步骤1:3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基胺
该标题胺是从其腈前体按照文献方法[Lollo等人,WO2001/070415]制备。
步骤2:N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(succinamicacid)
在一个2L的圆底烧瓶中，将3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙-1-胺(21.15g,47.7mmol,当量：1.00)和Huenig碱(12.3g,16.6ml,95.3mmol,当量：2.00)用AcOEt(845ml)合并，得到无色溶液。加入二氢呋喃-2,5-二酮(4.77g,47.7mmol,当量：1.00)在THF(42ml)中的溶液，并将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜=>白色混悬液。真空除去全部挥发物，将残余物溶于CH2Cl2，并将有机层用NH4Cl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。将粗的产物溶于CH3CN/H2O，并冻干，得到29.8g标题化合物，为松散粉末。
MS(ISP):(M-H)542.5。
步骤3:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-3-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺
在10mL圆底烧瓶中，将上文制备的4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酸(106mg,184μmol,当量：1.00)、(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺(132mg,184μmol,当量：1.00)、HOAt(25.0mg,184μmol,当量：1.00)和EDC盐酸化物(35.3mg,184μmol,当量：1.00)一起在CH2Cl2(1.8ml)中混合，得到黄色溶液。加入Huenig碱(47.5mg,64.2μl,368μmol,当量：2.00)，并将该反应物在环境温度下搅拌过夜。TLC指示起始原料消耗。真空除去全部挥发物，并将粗的产物经快速色谱SiO2/7%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液纯化，得到128mg标题化合物，为浅黄色固体。
MS:预期质量：1240.7552,实测质量：1240.7518。
步骤4:
在10mL圆底烧瓶中，将上文制备的N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-3-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺(126mg,101μmol,当量：1.00)和Huenig碱(39.3mg,53.2μl,304μmol,当量：3.00)用CH2Cl2(1.4ml)和DMF(1.0ml)合并，得到黄色混悬液；加入二(4-硝基苯基)碳酸酯(46.3mg,152μmol,当量：1.50)，并将该反应进行过夜。将该混合物倒在碎冰上，用AcOEt萃取两次，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。用～10ml乙醚研磨，得到99mg标题产物，为灰白色固体。
MS:预期质量：1405.7614,实测质量：1405.7518。
按照以下方法制备用于步骤3的必需的二肽结构单元：
步骤a:(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(4-硝基-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸
在25mL圆底烧瓶中该，将(S)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基-氨基)己酸(BioconjugateChem.2002,13,855-869,968mg,2.31mmol,当量：1.00)溶于CH2Cl2(20ml)中，得到浅黄色溶液。加入Huenig碱(897mg,1.21ml,6.94mmol,当量：3.00)和三甲基氯硅烷(528mg,621μl,4.86mmol,当量：2.10)，并将该反应混合物搅拌15分钟。
在第二个50mL圆底烧瓶中，将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸(1g,2.31mmol,当量：1.00)溶于DMF(20ml)中，得到无色溶液。加入Huenig碱(359mg,485μl,2.78mmol,当量：1.20)和TPTU[125700-71-2](687mg,2.31mmol,当量：1.00)，并将反应混合物搅拌20′。加入装有对应的甲硅烷基酯单甲硅烷基胺的第一个烧瓶中的溶液，并该反应物再另外搅拌3小时。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取两次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。快速色谱法SiO2/10%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到1.38g标题化合物，为褐色泡沫。
MS(ISP):(M+H)833.5,(M+Na)855.4。
步骤b:[(S)-1-((S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-2-(4-硝基-苯基)-乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
在250mL梨形烧瓶中，将上文合成的(S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酸(1.38g,1.66mmol,当量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(204mg,1.66mmol,当量：1.00)、HOAt(226mg,1.66mmol,当量：1.00)和EDC盐酸化物(318mg,1.66mmol,当量：1.00)溶于CH2Cl2(16.6ml)中，得到黄色溶液。加入Huenig碱(428mg,579μl,3.31mmol,当量：2.00)，并将该反应进行过夜。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。将粗的产物用乙醚(1x50mL)研磨；滤出所得固体，并干燥，得到1.214g标题化合物，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)938.7。
步骤c:(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-硝基-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺
在50mL圆底烧瓶中，将上文制备的[(S)-1-((S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-2-(4-硝基-苯基)-乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(1.214g,1.29mmol,当量：1.001)与THF(19ml)合并，得到褐色溶液。在0°，加入二乙胺(1.77g,2.49ml,24.2mmol,当量：18.70)。将反应物在环境温度下搅拌3h，直至MS指示起始原料消失。真空蒸发全部挥发物；接着进行快速色谱SiO2/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液=>10%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液，然后第二次快速色谱SiO2/5%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到502mg标题化合物，为浅褐色泡沫。
MS:预期质量：715.337,实测质量：715.3362。
实施例2
O-苄基-N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-酪氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-苄基氧基-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-(苄基氧基)苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1466.8182,实测质量：1466.8136。
实施例3
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-4-氰基-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-氰基-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-氰基苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1385.7716,实测质量：1385.7696。
实施例4
3,4-二氯-N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(3,4-二氯-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(3,4-二氯苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1428.6984,实测质量：1428.695。
实施例5
4-氯-N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-氯苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)-羰基氨基)-3-(4-氯苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1394.7373,实测质量：1394.7342。
实施例6
4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-[(4-{[3-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基}氧基)丙基]氨基}-4-氧代丁酰基)氨基]-3-(萘-1-基)丙酰基]氨基}-6-{[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]氨基}己酰基]氨基}苄基4-硝基苯基碳酸酯(非优选的命名)
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-萘-1-基-丙酰基氨基)-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-1-基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1410.792,实测质量：1410.7918。
实施例7
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-4-氟-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-氟-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1378.7669,实测质量：1378.7609。
实施例8
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-2-氟-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(2-氟-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(2-氟苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1378.7669,实测质量：1378.7689。
实施例9
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-3-氟-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(3-氟-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(3-氟苯基)丙酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1378.7669,实测质量：1378.7659。
实施例10
步骤1:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(4-氟苯基)-4-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-4-氧代丁-2-基)琥珀酰胺
在10mL圆底烧瓶中，将上文制备的4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酸(109mg,188μmol,当量：1.00)、(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺(132mg,188μmol,当量：1.00)、HOAt(25.6mg,188μmol,当量：1.00)和EDC盐酸化物(36.1mg,188μmol,当量：1.00)在CH2Cl2(2ml)中一起混合，得到黄色溶液。加入Huenig碱(48.7mg,64.1μl,377μmol,当量：2.00)，并将该反应物在环境温度下搅拌过夜。TLC指示起始原料消耗。真空除去全部挥发物，并将粗的产物经快速色谱法SiO2/5%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液纯化，得到197mg标题化合物，为灰白色固体。
MS:预期质量：1227.7763,实测质量：1227.7714。
步骤2:4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-(4-氟苯基)丁酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺基)-苄基4-硝基苯基碳酸酯
在10mL圆底烧瓶中，将上文制备的N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(4-氟苯基)-4-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-4-氧代丁-2-基)琥珀酰胺(196mg,160μmol,当量：1.00)和Huenig碱(61.9mg,81.4μl,479μmol,当量：3.00)用CH2Cl2(1.6ml)和DMF(0.8ml)合并，得到黄色混悬液；加入二(4-硝基苯基)碳酸酯(72.8mg,239μmol,当量：1.50)，并将该反应在环境温度下进行过夜。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～6)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。用AcOEt/庚烷研磨后，得到123mg标题化合物，为浅黄色固体。
MS:预期质量：1392.7825,实测质量：1392.7819。
用于步骤1的必需的二肽结构单元按照以下方法制备：
步骤a:(S)-2-[(S)-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸
在25mL圆底烧瓶中，将(S)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基-氨基)己酸(BioconjugateChem.2002,13,855-869,1040mg,2.48mmol,当量：1.00)溶于CH2Cl2(12.5ml)中，得到浅黄色溶液。加入Huenig碱(961mg,1.27ml,7.44mmol,当量：3.00)和三甲基氯硅烷(566mg,621μl,5.21mmol,当量：2.10)，并将该反应混合物在环境温度下搅拌20分钟。
在第二个50mL圆底烧瓶中，将(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基-氨基)-4-(4-氟苯基)丁酸(1040mg,2.48mmol,当量：1.00)溶于DMF(12.5ml)，得到无色溶液。加入Huenig碱(385mg,506μl,2.98mmol,当量：1.20)和TPTU[125700-71-2](737mg,2.48mmol,当量：1.00)，并将该反应混合物搅拌15分钟。加入装有对应的甲硅烷基酯单甲硅烷基胺的第一个烧瓶中的溶液，并将反应物在环境温度下再另外搅拌3小时。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取两次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。快速色谱法SiO2/5%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到2.10g标题化合物，为黄色泡沫。
MS(ISP):(M+H)820.6。
步骤b:{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
在250mL梨形烧瓶中，将上文合成的{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(2.10g,2.56mmol,当量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(315mg,2.55mmol,当量：1.00)、HOAt(349mg,2.56mmol,当量：1.00)和EDC盐酸化物(491mg,2.56mmol,当量：1.00)溶于CH2Cl2(12.5ml)中。加入Huenig碱(662mg,871μl,5.21mmol,当量：2.00)，并将该反应进行过夜。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。将粗的产物用乙醚(1x50mL)研磨；滤出所得固体，并干燥，得到0.796g标题化合物，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)925.6。
步骤c:(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺
在50mL圆底烧瓶中，将上文制备的{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(793mg,857　mol,当量：1.001)与THF(12ml)合并，得到褐色溶液。在0°，加入二乙胺(1.13g,1.59ml,15.4mmol,当量：18)。将反应物在环境温度下搅拌过夜。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。快速色谱SiO2/10%MeOH/0.1%NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到500mg标题化合物，为灰白色固体。
MS:预期质量：702.3581,实测质量：702.3578。
实施例11
4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯
按照与实施例10类似的方法制备，但是在步骤1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-苯基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-苯基丁酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1374.792,实测质量：1374.7877。
实施例12
4-({N～2～-[(3S)-4-(4-氯苯基)-3-{[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]氨基}丁酰基]-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-L-赖氨酰基}氨基)苄基4-硝基苯基碳酸酯
按照与实施例10类似的方法制备，但是在步骤1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(4-氯苯基)-丁酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS(ISP):(M+H)1409.9。
实施例13
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-O-甲基-L-酪氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-甲氧基苯基)丙酸如上文实施例1的步骤a]–c]中所述制备。
MS(ISP):(M+H)1391.9。
实施例14
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-D-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-D-赖氨酰胺
按照与实施例1类似的方法制备，但是在步骤3中用(R)-2-((R)-2-氨基-3-苯基-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作为偶联配体。该结构单元是从(R)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-氨基己酸和(R)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酸(参见BioconjugateChem.2002,13,885-869)按上文步骤a]–c]中所述方法合成。
MS:预期质量：1360.7763,实测质量：1360.7774。
实施例15
4-({N～2～-[(3S)-3-{[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]氨基}-4-(4-氰基苯基)丁酰基]-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-L-赖氨酰基}氨基)苄基4-硝基苯基碳酸酯
按照与实施例10类似的方法制备，但是在步骤1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺，作为偶联配体。前者是从(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(4-氰基苯基)丁酸按上文步骤a]–c]中所述制备。
MS:预期质量：1399.7872,实测质量：1399.7857。
实施例16
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
步骤1:
(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺
结构单元(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺是按照与BioconjugateChem.,Vol.13,No.4,2002,855-869中所述类似的方法制备。
MS(ISP):(M+H)671.5
步骤2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺
将TPTU[125700-71-2](233mg,784μmol,当量：1.00)加入N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(参见实施例1,步骤2)(426mg,0.784mmol,当量：1.00)和Huenig碱(304mg,411μl,2.35mmol,当量：3)在DMF(10ml)的溶液中。3分钟后，加入(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺(步骤1)，在t=1h时，TLC显示反应完全。减压除去溶剂。将剩余残余物溶于乙酸乙酯中，并用NaHCO3半饱和溶液(1X)、邻苯二甲酸氢钾溶液0.05M(2X)、水(1X)和盐水(1X)萃取。将有机萃取物用MgSO4干燥，并减压浓缩。将粗的物质经快速色谱法纯化，得到标题产物(682mg,513,μmol)，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)1196.8
步骤3:
将Huenig碱(465mg,629μl,3.6mmol,当量：6)加入前述的醇(718mg,600μmol,当量：1.00)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(548mg,1.8mmol,当量：3)在THF(20ml)的溶液中。将该黄色溶液在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂。将剩余残余物用乙醚研磨。经过滤收集固体，用乙醚洗涤并减压干燥，得到标题化合物(800mg,529μmol)，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)1361.9
实施例17
步骤1(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-苯基-丙酰基氨基]-己酸
将市场可获得的L-Fmoc-Phe-OSu(0.969g,2.00mmol,当量：1.00)悬浮于1,2-二甲氧基乙烷和水(17ml)的1:1v/v混合物中，并在0℃用L-正亮氨酸(0.275g,2.10mmoll,当量：1.05)和NaHCO3(0.185g,2.20mmol,当量：1.10)处理。移去冷却浴，并将反应在环境温度下进行14小时。将该混合物倒在碎冰/柠檬酸(pH～3)上，用乙酸乙酯萃取2次，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发至干。快速色谱法SiO2/AcOEt纯化，得到0.870mg标题化合物，为白色固体。
MS(ISP):(M+H)501.2。
步骤2:{(S)-1-[(S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-戊基氨甲酰基]-2-苯基-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
在梨形烧瓶中，将上文合成的(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基-羰基氨基)-3-苯基-丙酰基氨基]-己酸(10.72g,21mmol,当量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(2.717g,22mmol,当量：1.03)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)(7.994g,32mmol,当量：1.50)溶于CH2Cl2(320ml)中，并在氩气中搅拌过夜。将该混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取2次，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并将体积浓缩至～300ml。滤出沉淀，并干燥，得到5.25g标题化合物，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)606.3。
步骤3:(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-己酸(4-羟基甲基-苯基)-酰胺
在圆底烧瓶中,将上文制备的{(S)-1-[(S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-戊基氨甲酰基]-2-苯基-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(4.738g,7.822mmol,当量：1.0)溶于CH2Cl2(28ml)。在0°，加入二乙胺(28ml,19.80g,271mmol,当量：35)，并将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。真空蒸发除去全部挥发物；然后进行快速色谱SiO2/CH2Cl2/10%MeOH纯化，接着从AcOEt中结晶，得到2.116g标题化合物，为浅褐色晶体。
MS(ISP):(M+H)384.2。
步骤4
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例16中步骤2类似的方法制备。
MS(ISP):(M+H)909.7(M+Na)931.8。
步骤5
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-正赖氨酸酰胺
按照与实施例16中步骤3类似的方法制备。
MS预期质量：1073.6453,实测值1073.642
实施例18
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加入2-氯三苯甲基树脂中
将2-氯三苯甲基氯树脂(Novabiochem01-64-0114,100-200目)、1%DVB(18g,21.6mmol,当量：1.00)在DCM/DMF=1/1(300mL)中溶胀10分钟。将该树脂排干，并加入FMOC-4-氨基苄基醇(14.9g,43.2mmol,当量：2)和吡啶(6.83g,6.99ml,86.4mmol,当量：4)在DCM/DMF=1/1(300mL)中的溶液。将该混合物振摇过夜。将树脂排干，并用10%Huenig碱在甲醇中的溶液(300mL)封端。将该树脂用DMF和DCM洗涤，并用HV干燥过夜，得到21.7g树脂。载样量测定为0.41mmoL/g。
步骤2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺
将从步骤1中得到的树脂(1g,410μmol,当量：1.00)用DMF预洗涤(2X)，并用哌啶/DMF=1/4(10mL)处理5和10分钟。将该树脂用DMF和IPA(3X10mL)轮流洗涤。将Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,当量：4)、TPTU(487mg,1.64mmol,当量：4)和Huenig碱(636mg,859μl,4.92mmol,当量：12)在DMF(10mL)中的溶液搅拌5分钟，并随后用树脂振摇一小时。将该树脂用DMF和异丙基醇(3X)轮流洗涤。
然后进行以下Fmoc裂解和随后的Fmoc-Ala-OH(511mg,1.64mmol,当量：4)和N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(实施例1,步骤2)(892mg,1.64mmol,当量：4)的偶联。将干燥的肽树脂在TFA1%/DCM(2X20mL)中搅拌大约2X30分钟。将反应混合物过滤，并将树脂用DCM洗涤。将滤液合并，并在真空下蒸发溶剂。将粗的物质用乙醚研磨(2x)。经快速色谱法纯化后，得到产物(84mg,97.3μmol)，为白色固体。
MS预期质量：776.5452,实测值776.5455
步骤3:
在氩气中将上文制备的醇N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺[RO5545270](70mg,90.1μmol,当量：1.00)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(137mg,450μmol,当量：5)在室温下溶于DMF(4ml)，并用Huenig碱(34.9mg,47.2μl,270μmol,当量：3)处理，并将该混合物反应过夜。真空除去溶剂。将所得固体用乙醚研磨。经过滤收集固体，并用乙醚洗涤。将产物真空干燥，得到标题化合物(84mg,80.2μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：941.5514,实测值941.5518
实施例19
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-甲硫氨酸酰胺(methioninamide)
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-4-(甲硫基)-1-氧代丁-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Met-OH(609mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(208mg,210μmol)，为浅黄色固体。
MS(ISP):(M+H)893.6183
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备。在硅胶上纯化后，得到标题化合物(161mg,137μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：1057.6174,实测值1057.6184
实施例20
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨酰基-N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-甲基戊酰胺基)-N1-(4-(羟基甲基)苯基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(87mg,89.4μmol)，为浅黄色固体。
MS预期质量：875.6136,实测值875.6133
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶纯化后得到标题化合物(87mg,89.4μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：1040.6198,实测值1040.6188
实施例21
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-丙氨酰基-N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)丙酰胺基)-N1-(4-(羟基甲基)苯基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Ala-OH(511mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(140mg,159μmol)，为浅黄色固体。
MS(ISP):(M+H)834.8(M+Na)856.7
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶纯化后得到标题化合物(169mg,152μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：998.5729,实测值998.5739
实施例22
N～2～-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-天冬酰胺酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备
步骤2
(S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-N1-(2-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(140mg,162μmol)，为白色固体。
MS预期质量：819.551,实测值819.5503
步骤3:按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物(176mg,161μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：984.5572,实测值984.5489
实施例23
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(259mg,288μmol)，为白色固体。
MS预期质量：852.5765,实测值852.5754
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法获得标题化合物(280mg,247μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：1017.5827,实测值1017.5775
实施例24
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(240mg,278μmol)，为浅黄色固体。
MS预期质量：818.5921,实测值818.5921
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。硅胶纯化后得到产物(194mg,177μmol)，为浅黄色固体。
MS预期质量：983.5983实测值983.6004
实施例25
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-苯基丙氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，使用Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,当量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(153mg,151μmol)，为浅黄色固体。
MS预期质量：908.6391实测值908.637
步骤3:
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶上纯化后得到产物(117mg,98μmol)，为白色固体。
MS预期质量：1073.6453实测值1073.646
实施例26
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-苯基丙氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法制备。
步骤2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，用Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,当量：4)作为氨基酸。
得到产物(240mg,204μmol)，为浅黄色固体。
MS预期质量：942.6234实测值942.6218
步骤3:
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶上纯化后得到产物(190mg,154μmol)，为白色固体。
MS预期质量：1107.6296实测值1107.6287
实施例27
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-亮氨酰胺
步骤1:
将FMOC-4-氨基苄基醇加到2-氯三苯甲基树脂中
按照与实施例18中步骤1类似的方法进行。
步骤2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例18中步骤2类似的方法制备，用Fmoc-Leu-OH(1.59g,4.5mmol,当量：3)作为氨基酸。
得到产物(254mg,284μmol)，为白色固体。
MS预期质量：874.6547实测值874.6527
步骤3
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶上纯化后得到产物(178mg,168μmol)，为白色固体。
MS预期质量：1039.6609实测值1039.6588
实施例28
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺
步骤1
{(S)-1-[(S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-乙基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
将Fmoc-Ala-Ala-OH(1g,2.61mmol,当量：1.00)和(4-氨基苯基)甲醇(483mg,3.92mmol,当量：1.5)在THF(20ml)中的溶液用EEDQ(970mg,3.92mmol,当量：1.5)处理。将该溶液在室温下搅拌过夜。将该混合物用10%2-丙醇/乙酸乙酯(100mL)稀释，并将该溶液用KHSO45%/K2SO410%(2X)、水(1X)和盐水(1X)洗涤，用MgSO4干燥，并真空蒸发。将残余物在乙醚中超声处理几分钟，并经过滤收集固体，得到产物(1.27g,1.2mmol)，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)488.3
步骤2:
(S)-2-氨基-N-[(S)-1-(4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-乙基]-丙酰胺
按照与实施例1中步骤c类似的方法制备该化合物，得到产物(245mg,877μmol)，为浅黄色固体。
MS(ISP):(M+H)266.3,(M+Na)288.2(2M+H)531.3
步骤3:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺
按照与实施例16中步骤2类似的方法制备该化合物(165mg,198μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：790.5608,实测值790.5587
步骤4
按照与实施例18中步骤3类似的方法制备标题化合物。在硅胶上纯化后得到产物(99mg,98.4μmol)，为白色固体。
MS预期质量：955.567,实测值955.5651
实施例29
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-异亮氨酰基-N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺
步骤1
(S)-2-[(2S,3S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-戊酰基氨基]-琥珀酰胺酸
将2-氯三苯甲基氯树脂(5g,7.5mmol,当量：1.00)在DCM中溶胀，并随后用Fmoc-Asn(Trt)-OH(8.95g,15.0mmol,当量：2)和Huenig碱(3.88g,5.1ml,30.0mmol,当量：4)在DCM中的溶液处理过夜。将该树脂用DCM洗涤，并用10%Huenig碱的甲醇溶液封端。按照标准固相肽合成方法进行Fmoc-Ile-OH(5.3g,15.0mmol,当量：2)与TPTU(4.46g,15.0mmol,当量：2)和Huenig碱(3.88g,5.1ml,30.0mmol,当量：4)的偶联反应。室温下用TFA/水/三异丙基硅烷(95/2.5/2.5v/v/v)的组合试剂将产物从树脂上切割持续两小时。滤出树脂，并将滤液减压浓缩至少量体积。用乙醚研磨后，将产物过滤并真空干燥，得到产物(2.85g,5.79mmol)，为白色固体。
MS预期质量：467.2056,实测值467.2056
步骤2
{(1S,2S)-1-[2-氨甲酰基-1-((S)-4-羟基甲基-苯基氨甲酰基)-乙基氨甲酰基]-2-甲基-丁基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
按照与实施例28中步骤1类似的方法制备该化合物(620mg,336μmol)，为浅黄色固体。
步骤3
(S)-2-((2S,3S)-2-氨基-3-甲基-戊酰基氨基)-N*1*-(4-羟基甲基-苯基)-琥珀酰胺
按照与实施例1中步骤c类似的方法制备该化合物(100mg,228μmol)，为浅黄色固体。
步骤4
(S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-3-甲基戊酰胺基)-N1-(4-(羟基甲基)苯基)琥珀酰胺
按照与实施例16中步骤2类似的方法制备该化合物(89mg,91.4μmol)，为浅黄色固体。
步骤5
将上述步骤获得的化合物按照类似于实施例18中步骤3的反应得到标题化合物。在硅胶上纯化后得到产物(42mg,36.3μmol)，为浅褐色固体。
MS预期质量：1040.6198,实测值1040.6177
实施例30
N-[4-({3-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-D-赖氨酰胺
按照与实施例16中步骤1类似的方法从Fmoc-D-Lys(Boc)-OH开始制备该化合物(158mg,116μmol)，为浅褐色固体。
MS(ISP):(M+H)1362.8(M+Na)1383.8
实施例31
N-{15-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-4,15-二氧代-8,11-二氧杂-5,14-二氮杂十五烷-1-酰基}-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例16类似的方法制备标题化合物，在合成方法的步骤2中使用胆固醇-寡-PEG衍生物。
MS(ISP):(M+H)1479.8
步骤2中必需的胆固醇-PEG中间体N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-琥珀酰胺酸按照以下制备：
步骤a:{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯
将氯甲酸胆固醇基酯(1g,2.23mmol)在25mL二氯甲烷中的溶液在搅拌中逐滴加入2,2′-(亚乙二氧基)二-(乙基胺)(495mg,3.34mmol)在75mL二氯甲烷的溶液中。将该反应物在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷稀释，并用水萃取。将有机萃取物用无水MgSO4二水合物干燥，过滤并蒸发。在氨基修饰的硅胶(洗脱剂：MeCl2->MeCl2/MeOH=975:25v/v)上纯化后，得到产物(615mg)，为白色蜡质固体。
MS(ISP):(M+H)561.5
步骤b:N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-琥珀酰胺酸
将来自步骤a中的胺(480mg,0.856mmol)和三乙胺(0.13mL,0.94mmol)溶于5mL二氯甲烷。将琥珀酸酐(90mg,0.9mmol)加入该溶液后，在室温下搅拌过夜。TLC检测显示仍有部分起始原料。加入更多的琥珀酸酐(20mg,0.2mmol)。将该反应物在室温下再另外搅拌3小时后，将其用二氯甲烷稀释，并用5%KHSO4/10%K2SO4混合物洗涤。将有机萃取物用无水MgSO4二水合物干燥，过滤并真空蒸发，得到所需酸(490mg,0.667mmol)。
MS(ISP):(M+H)661.5
实施例32
N-{30-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-4,30-二氧代-8,11,14,17,20,23,26-七氧杂-5,29-二氮杂三十烷-1-酰基}-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例16类似的方法制备标题化合物，在合成方法的步骤2中使用胆固醇-PEG衍生物。
MS(ISP):(M+H)1699.9
步骤2中必需的胆固醇-PEG中间体1-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-1,27-二氧代-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2,26-二氮杂三十烷-30-酸按照以下步骤制备：
步骤a:[25-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基}氧基)-25-氧代-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂-24-氮杂二十五烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯
将氯甲酸胆固醇基酯(476mg,1.06mmol)和三乙胺(155uL,1.113mmol)溶于5mL二氯甲烷。随后加入α-氨基-ω-boc-氨基-八(乙二醇)(497mg,1.06mmol)溶于1mL二氯甲烷中的溶液。将该溶液在室温下搅拌过夜，并用二氯甲烷稀释，并用KHSO45%/K2SO410%水性混合物萃取。将有机萃取物用无水MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。在硅胶上(洗脱剂：MeCl2/MeOH=975:25->95:5v/v)纯化后得到产物(530mg,0.571mmol)，为无色油状物。
MS(ISP):(M+NH4)898.7
步骤b:1-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-1,27-二氧代-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2,26-二氮杂三十烷-30-酸
将上述Boc衍生物(450mg,0.511mmol)溶于HCl4M在二噁烷的溶液(10.2mL,40.9mmol)中。将该溶液在室温下搅拌40分钟。真空除去溶剂，并将剩余白色固体溶于5mL二氯甲烷中，并用三乙胺(32uL,0.229mmol)和琥珀酸酐(11.5mg,0.114mmol)处理过夜。加入更多的琥珀酸酐(11mg,0.11mmol,0.2当量)，并在60分钟后，将该反应物用二氯甲烷稀释，用KHSO45%/K2SO410%缓冲液洗涤。将有机萃取物用无水MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到390mg所需产物。
MS(ISP):(M+H)881.7
实施例33
N-{66-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-4,66-二氧代-8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62-十九氧杂-5,65-二氮杂六十六碳烷-1-酰基}-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-赖氨酰胺
按照与实施例16类似的方法制备标题化合物，在合成方法的步骤2中使用胆固醇-PEG衍生物。
MS(ISP):(M+H)2228.1
步骤2中必需的胆固醇-PEG中间体1-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-1,63-二氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-十九氧杂-2,62-二氮杂六十六烷-66-酸按照以下步骤制备：
步骤a:(59-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57十九氧杂五十九烷-1-基)氨基甲酸(3β)-胆甾-5-烯-3-基酯
将α,ω-二-氨基20(乙二醇)(538mg,0.6mmol)和三乙胺(92uL,0.66mmol)溶于15mL无水二氯甲烷中。室温下逐滴加入氯甲酸胆固醇基酯(270mg,0.6mmol)在2mL无水二氯甲烷中的溶液。将该溶液搅拌过夜，随后真空浓缩至少量体积，并直接在硅胶上纯化(洗脱剂：MeCl2/MeOH=95:5->9:4->4:1v/v)，得到产物(350mg,0.254mmol)，为蜡质固体。
MS(ISP):(M+H)1309.9
步骤b:1-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]-1,63-二氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-十九氧杂-2,62-二氮杂六十六烷-66-酸
将来自步骤a的胺(329mg,0.251mmol)、琥珀酸酐(26.4mg,0.264mmol)和三乙胺(40uL,0.286mmol)溶于5mL无水二氯甲烷中。加入更多的三乙胺(40uL,0.286mmol)后，将该溶液(pH>8)在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷稀释，并用KHSO45%/K2SO410%水性混合物洗涤两次。将有机萃取物用无水MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到产物(260mg,0.175mmol)，为无色蜡质固体。
MS(ISP):(M+NH4)1408.9
以下工作实施例用于举例说明本发明：
实施例34:制备RNA缀合物的一般方法
材料
二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和乙酸钠溶液(3M,pH5.2)购自SigmaAldrichChemieGmbH(Traufkirchen,德国)。
用于RP-HPLC的乙酸三乙铵(TEAA)(2.0M,pH7.0)和乙腈(ACN,HPLC质量)购自Biosolve(Valkenswaard,荷兰)。
乙醇(EtOH,分析纯)购自Merck(Darmstadt,德国)。纯水来自所使用的OptilabHF(MembraPure,德国)系统。
ResourceRPC3mL柱(10x0,64cm；15μm粒径)购自GEHealthcare(Freiburg,德国)。
HPLC纯化是使用Explorer100系统(GEHealthcare)完成。
氨基-修饰的RNA的合成
在有义链的5′-末端带有己基氨基连接体的RNA是按照标准亚磷酰胺固相合成方法，以1215μmol的规模，使用Oligopilot100(GEHealthcare,Freiburg,德国)和可控孔度玻璃作为固体载体(PrimeSynthesis,Aston,PA,USA)来制备。包含2′-O-甲基核苷酸类的RNA是使用对应的亚磷酰胺、2′-O-甲基亚磷酰胺和TFA-己基氨基连接体亚磷酰胺类(Sigma-Aldrich,SAFC,Hamburg,德国)来生成。切割和脱保护以及纯化是由本领域已知的方法完成(WincottF.,等人,NAR1995,23,14,2677-84)。
该氨基-修饰的RNA由阴离子交换HPLC(纯度：96.1%)鉴定，并由ESI-MS验证同一性([M+H]1+计算值:6937.4；[M+H]1+实测质量：6939.0。
序列：5′-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3′；u、c:对应RNA核苷酸的2′-O-甲基核苷酸，s:硫代磷酸酯。
一般的实验性缀合方法
将实施例1-33的标题化合物按照以下方法与氨基-修饰的RNA偶联：
将在5’-末端带有C-6氨基连接体的RNA(16.5mg,1当量)溶于500μLDMSO和150μL水中。加入对硝基苯基碳酸酯衍生物(10当量)溶于1mLDMSO中的溶液，然后加入8μLDIPEA。将反应混合物在35℃下在黑暗中振摇，并用RP-HPLC(ResourceRPC3mL,缓冲剂：A:0.1MTEAA的水溶液,B:0.1MTEAA在95%ACN中的溶液,梯度：历经20个柱体积从3%B到100%B)进行监控。反应完成时，用乙酸钠(3M)在EtOH中的溶液于–20℃下沉淀RNA缀合物。例如在二肽基序中缺少MMT保护基团，对应的缀合物使用上文所述的条件进行纯化。将纯化的流分合并，并将该物质用硫酸钠/EtOH沉淀，得到所需的RNA缀合物。
在二肽序列中包含MMT保护基团的RNA缀合物按照下文所述的方法进行进一步处理。
MMT裂解的一般方法
将粗的RNA缀合物沉淀溶于500μL水和1.5mL乙酸钠缓冲液(3M,pH5.2或0.1M,pH4.0)中。将该溶液在30℃振摇2天。该反应混合物用RP-HPLC(ResourceRPC3mL,缓冲剂：A:0.1MTEAA的水溶液,B:0.1MTEAA在95%ACN中的溶液,梯度：3%B-100%B，20个柱体积)进行监控。MMT保护基团完全裂解后，将RNA缀合物直接用上文所述的条件进行纯化。将纯化的流分合并，并用硫酸钠/EtOH将所需缀合物沉淀。
合成缺少二肽基序的RNA缀合物作为对照。为此目的，将胆固醇通过文献(NatureBiotech,2007,25,1149)中所述的连接体与5’-末端连接。该缀合物称作“非可裂解的”。
全部RNA缀合物都用RPHPLC进行纯度分析，并由ESIMS(负离子模式)进行验证。简言之，RP-HPLC是在装有XBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒径,Waters,Eschborn,德国)的DionexUltimate系统(Dionex,Idstein,德国)上在柱温为65℃下进行。用100mM六氟异丙醇(HFIP)和16mM的三乙胺在1%甲醇中的溶液作为洗脱剂A和其在95%甲醇中的溶液作为洗脱剂B(1%B至18%B，在30分钟内)进行梯度洗脱。UV检测在260nm下记录。用于质谱分析的是带有微喷射源的ThermoFinniganLCQDecaXPESI-MS系统和离子阱检测器在线与HPLC系统偶联。
具体的式(IIa)化合物的实例在表1中公开。所得化合物被称作“包含二肽的胆固醇siRNA缀合物”，其中具体的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物还被称为“标题化合物实施例X-(NHC6)-(siRNA序列)”和“带有实施例X的标题化合物的siRNA”。
siRNA制备
反义序列:5′-uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3′
u、c:对应RNA核苷酸的2′-O-甲基核苷酸，s:硫代磷酸酯
针对载脂蛋白BmRNA的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物是通过将互补链的等摩尔溶液在退火缓冲液(20mM磷酸钠,pH6.8；100mM氯化钠)中混合，在水浴中于80-85℃下加热3分钟，并历经3-4小时时间冷却至室温而生成。双链的形成通过非变性凝胶电泳来确认。
全部制备的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物在表2中列出。
表1:包含二肽的胆固醇siRNA缀合物(5’-3’)和分析数据。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。(NHC6)是在有义链的5’-末端引入的氨基己基连接体。
注：上表中的TitlecompoundEx是指标题化合物实施例号。
表2:包含二肽的胆固醇siRNA缀合物。最后一条(SEQIDNO对266/154)代表缺少二肽基序的siRNA缀合物。注意：小写字母a,c,g,u是2’-O-甲基核苷酸；硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。(NHC6)是在有义链的5’-末端引入的氨基己基连接体。
实施例35:体内试验
包含二肽的胆固醇siRNA缀合物与递送聚合物的体内组合施用
六至八周的老年小鼠(株系C57BL/6或ICR,～18-20g每只)获自HarlanSpragueDawley(IndianapolisIN)。在注射前将小鼠圈养至少2天。用HarlanTeklad啮齿类膳食(Harlan,MadisonWI)进行随意进食。
将小鼠(每组n=3)用0.2mL的递送聚合物和0.2ml包含二肽的胆固醇siRNA缀合物的溶液注射。除非另外说明，注射剂量是15mg/kg递送聚合物和0.1mg/kg包含二肽的胆固醇siRNA缀合物。溶液通过输注注射入尾部静脉。注射后48小时，检测ApoB水平，与按照下文方法用等渗葡萄糖处理的动物进行比较。
血清ApoB水平测定
在用下颚出血收集血清前将小鼠禁食4小时。通过标准三明治ELISA方法测定血清ApoB蛋白水平。简言之，分别用多克隆山羊抗小鼠ApoB抗体和兔抗小鼠ApoB抗体(BiodesignInternational)作为捕获抗体和检测抗体。然后使用HRP缀合的山羊抗兔IgG抗体(Sigma)来结合ApoB/抗体复合物。随后用TecanSafire2(奥地利,欧洲)全自动定量绘图酶标仪在450nm下检测四甲基-联苯胺(TMB,Sigma)色度法的吸收率的变化。
在图1中，多种包含二肽的胆固醇siRNA缀合物与之前准备的和胆固醇缀合但缺少可裂解基序的相同siRNA在本章节进行基准测试。将该siRNA缀合物(SEQIDNO266/154对,“非可裂解的对照物”)对血清ApoB水平的作用设为1，以评价相对于该非可裂解对照物的包含二肽的缀合物的影响。用对应的D-氨基酸(带有实施例14的标题化合物的siRNA)代替最初使用的Phe-Lys基序(带有实施例16的标题化合物的siRNA)或者用非天然的对映异构体(带有实施例30的标题化合物的siRNA)代替Lys，获得ApoB水平不显著地降低或相当于非可裂解的对照物siRNA。用Gly(带有实施例23的标题化合物的siRNA)代替Lys或者用对甲氧基苯基丙氨酸(带有实施例13的标题化合物的siRNA)代替Phe，与带有实施例16的标题化合物的siRNA相比效能降低。其它包含二肽基序的siRNA缀合物显示具有与原来包含Phe-Lys的缀合物相同的效能。
图2概括了与包含Phe-Lys基序的带有实施例16的标题化合物的siRNA相比效能相同或者效能提高的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物。全部这些缀合物与“非可裂解的”胆固醇siRNA缀合物SEQIDNO266/154对相比显著地更加有活性。效果最好的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物在Phy-Lys基序中具有氟修饰的苯环(带有实施例8的标题化合物的siRNA、带有实施例9的标题化合物的siRNA)或者具有被β-苯丙氨酸取代的苯基丙氨酸(带有实施例11的标题化合物的siRNA)或其衍生物(带有实施例10的标题化合物的siRNA)。
由于包含带有由D-氨基酸构成的二肽基序的胆固醇siRNA缀合物表现出与非可裂解的对照缀合物相同的效能，可以认为，其它二肽序列实际上被体内蛋白酶活性所裂解。但是，考虑到不同氨基酸及其类似衍生物的宽泛的接受性，如文献(BioconjugateChem.2002,13,855)中所提议，可能不止一种酶参与该裂解反应。
如图3中所示，在siRNA和小分子配体胆固醇之间引入组织蛋白酶可裂解的二肽基序(在此情况下是Phe-Lys,带有实施例16的标题化合物的siRNA)，与直接的胆固醇siRNA缀合物(SEQIDNO266/154对)相比，显著提高了siRNA缀合物的效能。将胆固醇配体与二肽基序通过基于PEG的连接体进一步间隔，随着PEG连接体的长度按比例地降低效能。
在图4中，聚合物的剂量保持恒定在15mg/kg。滴定siRNA的剂量并检测对血清ApoB含量的影响。含有Phe-Lys(F-K)基序的包含二肽的胆固醇siRNA缀合物与缺少二肽序列的对照缀合物相比显著地更有效。
实施例36:2’-修饰的寡核糖核苷酸合成
按照固相上的亚磷酰胺技术合成寡核糖核苷酸。根据规模，使用ABI394合成器(AppliedBiosystems)或AKTAoligopilot100(GEHealthcare,Freiburg,德国)。合成是在用可控孔度玻璃(CPG,载样量75μmol/g,获自PrimeSynthesis,Aston,PA,美国)制作的固体载体上进行。全部2’-修饰的RNA亚磷酰胺以及辅助试剂购自SAFC(Hamburg,德国)。具体而言，使用以下2’-O-甲基亚磷酰胺类：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2’-O-甲基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰基)-2’-O-甲基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2’-O-甲基-鸟苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2’-脱氧基-2’-氟-亚磷酰胺带有与2’-O-甲基RNA亚磷酰胺相同的保护基团。将全部亚磷酰胺类溶于无水乙腈(100mM)，并加入分子筛为了生成5’-磷酸酯，使用来自GlenResearch(Sterling,Virginia,USA)的2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基磺酰基]乙基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺。为了在寡聚体的5’-末端引入C-6氨基连接体，使用来自ThermoFisherScientific(Milwaukee,Wisconsin,美国)的6-(三氟乙酰基氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺。5’-修饰的引入不进行任何合成循环的修改。使用5-乙基硫代四唑(thiotetrazole)(ETT,500mM在乙腈中的溶液)作为活化剂溶液。偶联时间为6分钟。为了引入硫代磷酸酯连接，使用50mM的3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT,获自AMChemicals,Oceanside,CA,美国)在无水乙腈/吡啶(1:1v/v)中的溶液。
实施例37:结合于载体的寡聚体的切割与脱保护。
固相合成结束后，将干燥的固体载体转移至15mL试管中，并用浓氨水(Aldrich)在40℃下处理18小时。离心后，将上清转移至新的试管中，并将CPG用氨水洗涤。将合并的溶液蒸发，并将固体残余物在缓冲液A(见下文)中重构。
实施例38:寡核糖核苷酸的纯化
将粗的寡聚体通过阴离子交换HPLC用填充了SourceQ15(GEHelthcare)的柱子和AKTAExplorer系统(GEHelthcare)进行纯化。缓冲液A是10mM高氯酸钠、20mMTris、1mMEDTA、pH7.4(Fluka,Buchs,瑞士)且包含20%乙腈，而缓冲液B除包含500mM高氯酸钠以为与缓冲液A相同。使用22%B至42%B以32个柱体积(CV)梯度洗脱。记录在280nm下的UV示踪。将合适的流分合并，并用3MNaOAc、pH=5.2和70%乙醇沉淀。最后，用70%乙醇洗涤该沉淀。
实施例39:寡核糖核苷酸退火生成siRNA
通过合并等摩尔的RNA溶液来混合互补的链。将该混合物冻干，并用合适体积的退火缓冲液(100mMNaCl,20mM磷酸钠,pH6.8)重构以达到期望浓度。将该溶液置于85℃水浴中，将其在3小时内冷却至室温。
实施例40:缺少2’-OH残基的siRNA的体外活性
为了研究缺少任何2’-OH残基的siRNA在体外是否显示有效的敲减活性，我们检测了一组带有不同2’-修饰化学的靶向于EGFPmRNA的siRNA(SEQID对31/32至149/150，并参见例如表3)。使用psiCHECK2载体(Promega)在COS7细胞(DSMZ,Braunschweig,德国,目录号ACC-60)中用Dual-GloLuciferaseAssaySystem(Promega)筛选所述siRNA的有义和反义活性。为了满足有义链和反义链所赋予的沉默活性，我们将每个相应的19mer的靶位点序列作为不同的psiCHECK2构建体(psiCHECK2-AT用于反义活性，psiCHECK2-ST用于有义活性)克隆到位于合成的花虫荧光素酶的3’到翻译终止密码子的多克隆区域。通过使用Lipofectamine2000(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,德国,目录号11668-019)，将COS7细胞与载体构建体和3nM与克隆的靶位点互补的相应siRNA共转染。在转染后24小时，通过花虫荧光素酶活性测定成功的siRNA介导的沉默，所述花虫荧光素酶活性被标准化为萤火虫荧光素酶水平，以考察其转染效率(反义活性参见图5a，有义活性参见图5b)。
表3:用于确定依赖于2’-修饰的体外敲减活性的示例性siRNA序列和化学修饰。参考双链和选择对应的修饰变体的实例用于此项研究。Xf是指核苷酸X的2’-氟修饰，小写字母是指2’-O-甲基修饰，下划线的字母是指DNA核苷酸，全部其它大写字母是指核糖核苷酸类。字母“p”是指5’-磷酸酯。
已经发现，5个最有效的修饰的siRNA(≥60%敲减)是以选择的2’-氟/2’-O-甲基(2’F/2’-OMe)模式设计。在赋予反义链活性的同时，该化学修饰完全消除了对应有义链的活性，如全部检测的2’F/2’-OMe变体失去或最小化花虫荧光素酶活性所示。
我们总结出，该2’F/2’-OMe模式提高了siRNA的预期的反义链活性，而且完全抑制了来自有义链的不期望的对靶点外的作用。
实施例41:通过体外试验检测DNaseII敏感位点
建立基于离子对(IP)反相(RP)高效液相色谱(HPLC)与电喷射离子化(ESI)质谱(MS)或阴离子交换(AEX)-HPLC偶联的方法，检测所选的单链或双链RNA的体外稳定性。
方法描述：为了稳定性分析，将单链或双链RNA的10μM溶液在37℃下在包含0.8或8个单位的DNaseII(来自牛脾脏，V型，SigmaAldrich)的5mM乙酸钠缓冲溶液(PH4.5)中孵育。通过加入100mM乙酸三乙铵(TEAA)溶液来终止孵育反应，将pH调至7，并使DNaseII酶灭活。通过与UV检测器连接的LC/MS或通过带有UV检测器的AEX-HPLC完成分析。在260nm的UV检测示踪用于定量分析，MS数据用于确定RNA序列中的裂解位点。
A.在65℃柱温下使用WatersXBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒径)进行IP-RP-HPLC。梯度洗脱是使用100mM六氟异丙醇(HFIP)和16mM三乙胺在1%甲醇中的溶液作为洗脱剂A和组合物A在95%甲醇中的溶液作为洗脱剂B。所用梯度是从1%B至18%B，在30分钟内。
B.在50℃下在DionexDNAPac200柱(4x250mm)上使用含有10%ACN的pH=11的20mM磷酸盐缓冲液进行AEX-HPLC。洗脱剂B包含1MNaBr在洗脱剂A中的溶液。梯度从25至62%B，在18分钟内。
表4:双链以及其他的完整链对抗DNaseII的稳定性评价。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸类；后面跟“f”的大写字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小写字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脱氧胸苷(3’-3’-连接)。硫代磷酸酯连接用小写符号“s”表示。dT是脱氧胸苷。(NHC6)是在有义链5’末端引入的氨基己基连接体。
结论：
A.包含至少一个2’-OH核苷酸的RNA链(例如SEQIDNO对157/158的两条链)经环状五价中间体迅速降解，导致在5’-裂解产物的2’-3’环状磷酸酯。该五价中间体的形成可以通过使用缺少2’-OH基团(例如2’-脱氧基、2’-OMe或2’-F)的核苷酸来抑制。
B.此外，RNA是经5’-核酸外切途径降解，其不依赖5’-末端核苷酸的2’-修饰。该降解途径可以使用5’-末端非核苷酸部分来抑制，例如C6-氨基连接体(例如SEQIDNO对160/159中的SEQIDNO160或SEQIDNO对165/166中的SEQIDNO165)或者在第一个核苷酸间键的硫代磷酸酯(例如在SEQIDNO对160/159中的SEQIDNO160)。
C.5’-磷酸酯基团减缓了核酸外切的裂解动力学，但不能完全阻止由此末端开始的降解(例如在SEQIDNO对160/159中的SEQIDNO160)。这最有可能是由于经由磷酸酶或DNaseII酶的固有磷酸酶活性的5’-磷酸酯裂解。
D.对RNA链最好的保护是用不包含2’-OH核苷酸的寡核苷酸类进行，从在5’-末端的2’-OMe核苷酸经硫代磷酸酯键与第二个核苷酸连接开始(例如在SEQIDNO对173/174中的SEQIDNO173)。其它末端非2’-OH的核苷酸类还保护避免5’-外切降解，但相对于2’-OMe修饰而言程度较低(参见表9)。
实施例42:在体内试验中缺少2’-OH残基的siRNA的敲减活性
用注射了靶向于因子VII(FVII)的siRNA(SEQIDNO对179/166和180/168,见表5)且组合施用DPC-GalNac的小鼠来进行体内试验。
表5a:siRNA序列的体内试验。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大写字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小写字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脱氧胸苷(3’-3’-连接)。硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。dT是脱氧胸苷。(NHC6)是在有义链5’末端引入的氨基己基连接体。GalNAc是指式(IV)的结构。
在有义链和反义链上带有可选的2’-OMe/2’-F模式的FVIIsiRNA是用在反义链上的5’-末端2’-OMe核苷酸和在有义链上的5’-末端2’-F链生成。两个链均由inv(dT)在3’-末端突出位置进行保护。该反义链带有5’-磷酸酯基团以保留siRNA的活性。在有义链的5’末端与GalNAc-棕榈酰结构缀合，使其能够通过在这些细胞中表达的唾液酸基糖蛋白受体靶向肝细胞。将siRNA(2.5mg/kg)与GalNAc靶向的PBAVE递送聚合物(15mg/kg)一起向小鼠组合施用。
使用QuantiGene1.0branchedDNA(bDNA)AssayKit(Panomics,Fremont,Calif.,USA,目录号QG0004)来完成来自肝匀浆的FVIImRNA检测。
将尸体解剖中的1-2g肝脏组织在液氮中速冻。将冷冻组织用研磨粉末化，并在干冰上蒸发。将15-25mg的组织转移至冷却的1.5mL的反应试管中，加入1mL1:3预先在MilliQ水中稀释的裂解混合物和3.3μL蛋白酶K(50μg/μL)，并将组织在30-50%功率下超声处理(HD2070,Bandelin,柏林,德国)几秒钟进行裂解。将裂解物在-80℃下储存直至进行分析。为进行mRNA分析，将裂解物解冻，并用蛋白酶K在热搅拌器(Thermomixercomfort,Eppendorf,Hamburg,德国)中于65℃以1000rpm消化15分钟。用QuantiGene1.0bDNAAssayKit试剂根据生产商的推荐方法来测定FVII和GAPDHmRNA水平。用20μL裂解物和小鼠探针组来分析FVIImRNA表达。使用40μL裂解物和挪威鼠(rattusnorwegicus)的探针组分析GAPDHmRNA表达，显示与小鼠(探针组序列见上文)交叉反应。作为实验读数，在实验的结尾用Victor2Light发光计数器(PerkinElmer,Wiesbaden,德国)检测化学发光信号，作为相对光单位(RLU)。将来自相同裂解物的FVIImRNA信号除以GAPDHmRNA信号，数值以标准化为GAPDH的FVIImRNA表达进行报告。
结果表明，在SEQIDNO对179/166给药48小时后，79%FVIImRNA被敲减。相反，带有siRNASEQIDNO对180/168的2’-OH核苷酸不显示显著的敲减(<25%)，如表5中所示。
表5b:体内敲减研究的结果
SEQ ID NO对179/166 SEQ ID NO对180/168
时间[小时] 剩余mRNA[%] 剩余mRNA[%]
1 84 92
6 83 88
24 53 100
48 21 76
实施例43:缺少2’-OH残基的siRNA的组织分布
使用WO2010043512所述的专用寡核苷酸检测方法测定肝脏组织样品中siRNA的浓度。siRNA定量分析基于与siRNA双链的反义链互补的荧光(Atto-425)标记PNA探针(Atto425-OO-GCAAAGGCGTGCCAACT,获自Panagene公司,韩国)的杂交，随后经AEX-HPLC分离。通过参照用于体内试验的两种FVIIsiRNA的系列稀释液产生的外部标准曲线(参见实施例42)，经荧光检测来完成定量。对于血浆样品，将0.2-2μL注入HPLC系统，对于组织，将约1mg样品注入HPLC系统。
缺少2’-OH核苷酸的稳定化的siRNA的肝脏组织分析显示在肝脏中完整反义链为ug/g范围的高浓度，但是～95%是以5’-脱磷酸化的失活形式存在(见表6)。所得带有末端2’-OMe核苷酸的RNA不倾向于在细胞质中被磷酸激酶hClp1再次磷酸化(见下文)。相反，包含2’-OH的反义链的siRNA在组织中在给药后的前6个小时内完全降解。
表6:不包含2’-OH核苷酸的稳定化的siRNA的肝组织分析
*BDL=检测限以下
实施例44:带有优化5’-末端的siRNA的体外敲减活性
进行FVIIsiRNA的其它体外筛选是为了鉴别能够在细胞内在反义链的5’-末端(再次)磷酸化得到RNAi-有效物质的siRNA。此次筛选的全部siRNA如表7中所示。可选的2’-OMe/2’-F修饰模式除了在反义链的5’-末端的前两个核苷酸的多种修饰以外，与第一代设计(不含任何2’-OH残基)相同。生成两个反义链的5’-末端分别为2’-F或2’-脱氧基修饰的核苷酸与带有或不带有额外的5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯的不同组合的核苷酸。在转染原代小鼠肝细胞(每孔30000个细胞；96孔板方式)后，根据生产商的说明书使用Lipofectamine2000，以剂量-响应方式(24nM至0.00037nM，以4倍稀释)筛选所有的siRNA，用于敲减活性测定。根据IC50值，两个siRNA与亲代双螺旋(SEQIDNO对182/168)活性相当；活性相当的siRNA:SEQIDNO对181/186和181/185)，一个具有5’-末端的2’-F和磷酸酯基团，一个具有两个5’-末端的2’-脱氧核苷酸和5’-硫代磷酸酯(参见表7的IC50值)。它们都比在第一次动物实验中使用的具有末端2’-OMe核苷酸的siRNA(SEQIDNO对181/166)活性高约5-6倍。
实施例45:具有优化的5’末端的siRNA的体外5’-磷酸化
通过在HeLaS100细胞提取物中的hClp1评价所有在表7中列出的不具有5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯的siRNA的磷酸化。
按照Weitzer和Martinez(S.Weitzer和J.Martinez.hClp1:anovelkinaserevitalizesRNAmetabolism.CellCycle6(17):2133-2137,2007)所述，从S100HeLa提取物分析5’-磷酸化。在包含5mMATP的S100HeLa提取物中的1μMsiRNA孵育后，通过注入5μL样品溶液在变性条件下以IP-RP-HPLC或AEX-HPLC直接分析溶液。
A.使用WatersXBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒径)在65℃柱温下进行IP-RP-HPLC。梯度洗脱是使用100mM六氟异丙醇(HFIP)和16mM三乙胺在1%甲醇中的溶液作为洗脱剂A和组合物A在95%甲醇中的溶液作为洗脱剂B。使用梯度从1%B至18%B，在30分钟内。
B.AEX-HPLC是在DionexDNAPac200柱(4x250mm)在50℃下使用pH=11的包含10%ACN的20mM磷酸盐缓冲液进行。洗脱剂B包含了在洗脱剂A中的1MNaBr。使用梯度从25-62%B，在18分钟内。
表7:IC50值
注：其中的Sensestrandsequence是指有义链序列，Antisensestrandsequence是指反义链序列。
使用以下方程(PA是峰面积)，根据在260nm的UV示踪对siRNA的每条链计算5’-磷酸化的比率：
%(5’-磷酸化)=100*PA[5’-磷酸化的链]/(PA[5’-磷酸化的链]+PA[亲本链])
如表8所示，当2’-OMe核苷酸位于5’-末端(SEQIDNO对181/196和SEQIDNO对181/195)时，siRNA的反义链不能被5’-磷酸化。相反，当2’-F、2’-脱氧或2’-OH核苷酸掺入5’-末端(SEQIDNO对181/195、SEQIDNO对181/192、SEQIDNO对181/197、SEQIDNO对181/199和SEQIDNO对182/168)时，反义链容易5’-磷酸化。一旦通过合成引入的5’-磷酸酯/5’-PTO基团在体内例如通过磷酸酶切除后，在体外试验中具有与亲本SEQIDNO对182/168(SEQIDNO对181/186和181/185)类似活性的这两个siRNA容易发生5’-磷酸化。
表8:在S100HeLa细胞提取物中孵育4小时后的5’-磷酸化链的百分比。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸类；后面跟“f”的大写字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。(invdT)代表反向脱氧胸苷(3’-3’-连接)。硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。dT是脱氧胸苷。
实施例46:具有优化的5’末端的siRNA的体内DNAseII-稳定性
如实施例41所述，筛选所有的反义链的DNAseII稳定性。在siRNA中存在的与亲本双螺旋(SEQIDNO186和SEQIDNO对185)活性相当的两个反义链，一个具有5’-末端2’-F和磷酸酯基团，一个具有两个5’-末端2’-脱氧核苷酸和5’-硫代磷酸酯，对DNAseII切割稳定(在20小时孵育后>70%的完整链)。
表9:在20小时孵育后siRNA对DNAseII的体外稳定性
有义SEQ ID NO 反义SEQ ID NO 序列(5′-3′) 完整%
181 192 UfsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 11
181 197 dTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 0
181 199 dTsdGaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 0
181 193 psUfsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 106
181 187 psdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 96
181 194 psdTsdGaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 101
181 191 psUfGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 100
181 198 psdTGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 95
181 186 psdTdGaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 99
181 185 pUfsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 71
181 189 pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 74
181 188 pdTsdGaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfc(invdT) 64
实施例47:具有优化的5’末端的siRNA体内敲减活性
为了评价是否通过优化5’末端得到的改善能够转移到体内状态，我们用选择的siRNA的GalNAc-棕榈酰缀合物进行了进一步的小鼠实验(参见表10)。如第一个小鼠实验(实施例42，本专利申请)所述，在同样条件下施用siRNA。
为了检测FVII水平，按照标准程序，通过从下颌下取血到含有0.109mol/L柠檬酸钠抗凝血剂(1体积)的微量离心管来收集血液(9体积)，制备来自小鼠的血浆样品。使用BIOPHENVII试剂盒(HyphenBioMed/Aniara,Mason,OH)，按照生产商的推荐方法，用生色法检测血浆中的FVII活性。使用TecanSafire2微量板读数器在405nm检测色度法建立的吸光度。
所研究的siRNA显示了改善的体外活性，其与体外筛选结果非常相关。在给药后48小时，两个siRNA的血清FVII活性降低超过80%，与使用第一代siRNA设计所产生的降低49%进行比较(参见表10)。该结果清楚地表明了反义链的5’-末端核苷酸的重要性，其能够有效地被磷酸化，此时磷酸酶体内裂解所合成的5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯基团。当最初设计所用的或文献所描述的5’-末端2’-OMe核苷酸作为更有效的siRNA设计根据体外与标准siRNAs的比较时(Allersonetal.J.MedChem.2005,48,901-904)，合成的磷酸酯的体内裂解能够导致相应的siRNA的效能的显著下降。
表10：具有优化的5’末端的siRNA体内敲减活性。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大写字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小写字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脱氧胸苷(3’-3’-连接)。硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。(NHC6)是在有义链5’末端引入的氨基己基连接体。GalNAc是指式(IV)的结构。
实施例48：具有优化的3’末端的siRNA体外敲减活性
为了进一步增加对DNaseII稳定的siRNA的活性，进行了对3’-突出部的SAR研究。将不同组合的在有义链或反义链的3’-突出部的invdT、dTinvdT或dTsdT应用于Aha1-和EGFP-靶向的siRNA(分别参见表11和12)，配对比较在最有效的siRNA中3’末端的组成。在转染原代小鼠肝细胞(每孔30000个细胞；96孔板方式)后，根据生产商的说明书使用Lipofectamine2000，以剂量-响应方式(24nM至0.00037nM，以4倍稀释)筛选所有的siRNA，用于敲减活性测定。
表11：具有不同3’末端的EGFP-靶向的siRNA体外敲减活性。
注：其中的Sensestrandsequence是指有义链序列，Antisensestrandsequence是指反义链序列。
表12：具有不同3’末端的Aha1-靶向的siRNA体外敲减活性。
注：其中的Sensestrandsequence是指有义链序列，Antisensestrandsequence是指反义链序列。
发现在反义链上具有两个核苷酸dTsdT-突出部的siRNA比在反义链3’-端只有一个invdT突出部(而且有义链相同)的siRNA的效果更好。更有利的是与使用作为3’突出部的单个invdT-突出部修饰的有义链进行组合。
实施例49：在非人的灵长类中siRNA的体内敲减活性
制备DPC和给药
DPC的制备如下：通过将聚合物“149RAFT”与所示的靶向于凝血因子VII(siF7)的siRNA以4:1重量比(聚合物:siRNA)通过二硫键共价连接，随后用2:1重量比的CDM-PEG:CDM-NAG混合物以7x重量比(CDM:聚合物)修饰聚合物-siRNA缀合物。对猕猴施用1mg/kgDPC(聚合物重量)和0.25mg/kg的所示siRNA。一只动物接受包含siF7SEQIDNO对151/152的DPC，两只动物接受包含siF7SEQIDNO对253/254),#1和#2)的DPC，两只动物接受包含SEQIDNO对251/255,#1和#2)的DPC。将F7值根据两个给药前的值的平均值进行标准化。接受包含SEQIDNO对253/254或SEQIDNO对251/255的DPC的动物具有比接受SEQIDNO对251/252的动物更高的F7敲减水平和更长的PT。
DPC注射程序
对于每个注射程序，向动物给予包含氯胺酮(最多7mg/kg)和右美托咪定(最多0.03mg/kg)的组合的IM注射，并移至操作房。在操作房中，将动物置于水套加热板上，并对注射部位剃毛和消毒。将静脉导管(20-22号)插入体静脉(头部或小隐静脉)，历经1-2分钟缓慢注入DPC溶液(2ml/kg)。在注射程序期间和之后使用脉搏血氧计监测心率和氧饱和度。每个注射程序花费约20分钟完成。在注射后移去导管，并轻柔按压穿刺部位。将动物放回它们的笼子，给予IM注射逆转药物阿替美唑(0.10-0.15mg/kg)。监测动物直到它们恢复正常活动。
血液收集程序
获得血样(1-5ml)用于测定基因抑制(F7活性，凝血时间)、血液化学和肝损伤标记物(CBC、化学清单、ALT、细胞因子、补体)。对于每个注射程序，向动物给予包含氯胺酮(最多7mg/kg)和右美托咪定(最多0.03mg/kg)的组合的IM注射。在镇静后，将动物移到便携式操作台上，使用22号针头和注射器从股静脉收集血液。在收集血样后立即对穿刺部位按压，并将血液分到适宜的样品管中，用于各项血液测试。接着对动物给予IM注射逆转药物阿替美唑(0.10-0.15mg/kg)，并放回它们的笼子。在任何30天的时期内抽取不超过20%的总血液体积的量(估计的血液体积=60ml/kg)。每个血液收集程序花费约10分钟完成。
因子VII(F7)活性测定
通过将全血填充入血清分离管并使血液在室温下凝固至少20分钟来制备非人的灵长类的血样。在凝固后，血液管在9000rpm离心3分钟，等分到微量离心管中，储存在-20℃直到使用。血清中的F7活性用生色方法来测定，按照生产商的推荐使用BIOPHENVII试剂盒(HyphenBioMed/Aniara,Mason,OH)。使用TecanSafire2微量板读数器在405nm检测色度法建立的吸光度。
凝血实验(凝血酶原时间、部分凝血酶原时间和纤维蛋白原)
通过将全血完全充满柠檬酸钠管(BDVacutainer)并轻柔混合以防止凝块形成来制备非人的灵长类的血样。将管子在1小时内转移到临床实验室，并在收集时间后的4小时内进行凝血实验。
表13：用于NHP实验的FVIIdsRNA。注意：小写字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大写字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小写字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脱氧胸苷(3’-3’-连接)。硫代磷酸酯连接用小写“s”符号表示。dT是脱氧胸苷。NH2C6掺入有义链5’-末端的氨基己基连接体。
从两条链上都是单个核苷酸(invdT)-3’-突出部变为不对称的siRNA设计，其具有在有义链上的3’-(invdT)突出部和在反义链上的dTsdT突出部，但是恒定的修饰方式导致在非人灵长类中更有效的血清FVII下降和该效果的显著延长的持续时间(参见图6a)。该结果得到了预期的生物学后果的支持，即，对于相应于因子7的降低程度的凝血酶原时间产生了更显著的作用(参见图6b)。
实施例50：具有可裂解的RNA连接体的siRNA的体内敲减活性
在表14中，以相同的序列背景在小鼠中使用胆固醇或GalNAc-棕榈酰siRNA缀合物比较基于血清的FVII蛋白抑制的体内效能。该体内试验如实施例42所述进行。不包含2’-OH核苷酸的胆固醇缀合的siRNA相比GalNAc-棕榈酰缀合的产品(SEQIDNO对179/166对比179/190，SEQIDNO对257/264对比SEQIDNO对179/262，SEQIDNO对257/263对比SEQIDNO对179/163，和SEQIDNO对257/166对比SEQIDNO对179/166)的FVII抑制大幅度降低。与包含2’-OH的siRNA相反，所述胆固醇缀合物导致相对于GalNAc-棕榈酰衍生物更高的FVII抑制(SEQIDNO对180/168对比SEQIDNO对258/168)。
在所述体内试验中使用的小分子配体GalNAc-棕榈酰和胆固醇通过非可裂解的连接体连接到有义链的5’-末端。在有义链具有2’-OH核苷酸的情况下，配体仍然是可被核酸酶裂解的(例如，在胞内体或溶酶体区室中的DNaseII)。所述裂解反应释放出游离的siRNA，其接着通过递送聚合物干扰胞内体的活性而释放到细胞质中。
对于在有义链中缺乏2’-OH核苷酸的siRNA，配体稳定地连接在双链上，因为没有酶促(核酸酶/蛋白酶/酯酶等)或化学机制触发配体的裂解。因此，由于亲脂性胆固醇配体与膜的相互作用，非常稳定的胆固醇缀合的siRNA能够包埋在细胞膜中。甚至在组织中高浓度的siRNA都不足以有效地将siRNA释放到细胞质中。相反，亲脂性较低的GalNAc-棕榈酰缀合的siRNA能够释放到细胞质中，因为其与细胞膜的相互作用显著的较少。由于此原因，非可裂解的GalNAc-棕榈酰siRNA缀合物比胆固醇缀合的相同siRNA更为有效。
开发可裂解的连接体结构能够帮助防止膜包埋稳定缀合的胆固醇siRNA的问题。使用二硫键连接体化学被描述为有吸引力的引入限定裂解位点的方法，但是裂解限制在细胞的还原性细胞器中(PNAS,2006,103,13872)。由于预期在胞内体/溶酶体区室中裂解会减慢，大多数胆固醇-二硫键缀合的siRNA仍然能够被包埋在膜中，如对非可裂解的胆固醇缀合物所述。
表14
除了建立二硫键可裂解连接体化学外，另一种可能性是通过在某些位置使用2’-OH核苷酸产生限定的裂解位点。在所选的位置引入2’-OH核苷酸是实现从RNA链上切除缀合物的新方法。能够通过在RNA链的3’-或5’-端用至少一个2’-OH核苷酸加入单链突出部，或者在siRNA的双链区域内使用2’-OH核苷酸而实施2’-OH核苷酸。在胞内体/溶酶体中存在的核酸酶活性选择性地在所述位置进行裂解。在第一代设计中，胆固醇与有义链通过包含5’-端的3个2’-OH核苷酸(AUC)的单链突出部而连接。
胆固醇缀合的siRNA与多种可裂解的连接体化学的比较显示于表15。所有的siRNA具有相同的序列背景，仅仅是连接体改变了。将胆固醇与有义链通过由5’-端的3个2’-OH核苷酸(AUC)构成的单链突出部连接。当与递送聚合物组合施用时，该siRNA(SEQIDNO对260/263)导致小鼠血清的FVII下调77%，而具有稳定连接的胆固醇的相同siRNA(SEQIDNO对257/263)仅60%。具有通过根据式Ia的连接体连接到有义链(SEQIDNO对261/263)的5’-端的siRNA与胆固醇缀合物导致了血清的FVII活性下降93%。所有结果通过在小鼠中组合施用15mg/kg的递送聚合物和2.5mg/kg胆固醇缀合的siRNA而获得。
这些结果说明，使用可裂解的连接体改善了不包含2’-OH核苷酸的siRNA的体内效能。可裂解的连接体可以由包含2’-OH的核苷酸、二肽裂解基序或二硫键连接体构成。所有的可裂解连接体结构都在施用胆固醇缀合的siRNA与减缓胞内体释放的递送聚合物的组合中改善了体内效能。
表15：对于缀合胆固醇的siRNA的不同连接体化学的体内比较
实施例51：具有可裂解的连接体的siRNA的体外血清稳定性
在体外稳定性试验中评价可裂解的连接体的稳定性。将胆固醇缀合的有义链在90%小鼠血清中在37℃下孵育不同的时间点。通过加入蛋白酶K在包含十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中的溶液来中止孵育反应。该处理降解了所有的蛋白质和酶，但没有干扰RNA链的完整性。将25μL的该溶液直接注入连接了UV检测器(260nm)的AEX-HPLC系统。AEX-HPLC在DionexDNAPac200柱(4x250mm)上在75℃使用包含50%ACN的20mMTris缓冲液(pH=8)进行。800mMNaBr在洗脱剂B中的溶液用作洗脱盐。使用梯度25-62%B，在18分钟内。
包含胆固醇的单链RNA从HPLC柱上作为260nm下的最宽峰洗脱。在切掉胆固醇后，在较低的保留时间处观察到尖锐的对称峰。胆固醇的裂解速率按照下面的方程测定(PA=峰面积):
%(游离RNA)=100*PA[游离RNA]/(PA[游离RNA]+PA[胆固醇缀合的RNA])
体外显示，3个核苷酸(AUC)-突出部在少于1小时内在90%小鼠血清中被定量地裂解。所述裂解发生在突出部的3’到这两个嘧啶核苷酸处，导致两个不同的裂解代谢物(总结代谢物的峰面积，用于数据评价)。相反，包含根据式Ia的连接体、二硫键和稳定连接的胆固醇的二肽在小鼠血清中完全稳定。
实施例52：具有可裂解的连接体的siRNA的组织分布
这些结果说明，使用可裂解的连接体改善了不包含2’-OH核苷酸的siRNA的体内效能。可裂解的连接体可以由包含2’-OH的核苷酸、二肽裂解基序或二硫键连接体构成。所有的可裂解的连接体结构都在施用胆固醇缀合的siRNA与减缓胞内体释放的递送聚合物的组合中改善了体内效能。
简言之，siRNA定量分析基于与siRNA双链的有义链互补的荧光(Atto-425)标记的PNA探针(Atto425-OO-TGAGTTGGCACGCCTTT,获自Panagene公司,韩国)的杂交，随后经AEX-HPLC分离。通过参照用于体内试验的两种FVIIsiRNA的系列稀释液产生的外部标准曲线(参见实施例42)，经荧光检测来完成定量。对于血浆样品，将0.2-2μL注入HPLC系统，对于组织，将约1mg样品注入HPLC系统。
在表16中显示了肝组织分析的结果。在分析siRNA含量时，发现肝组织中存在有义链，当使用二肽连接体基序或在3个核苷酸的5’-突出部具有未修饰的连接体序列AUC时，有义链定量地从胆固醇脱离。相反，在肝中仅有15%的二硫键连接的siRNA在给药后最初48小时内从胆固醇上脱离，并且稳定连接的胆固醇没有从siRNA上脱离。
当比较不含胆固醇的siRNA在肝组织中的绝对量时，发现对于二硫键连接体和RNAAUC-连接体而言，该量是相似的，完全符合给药后48小时的相同的FVII血清活性。二肽连接的胆固醇siRNA得到较低的FVII活性，完全符合所释放的不含胆固醇的siRNA的较高的量.
递送到肝脏的在有义链上具有(AUC)-连接体的胆固醇siRNA缀合物的总量与稳定连接或二硫键连接的胆固醇相比低约6倍，与二肽缀合的胆固醇siRNA相比低约3倍。这种降低的组织存在可以归因于以下事实：AUC-连接体不仅是细胞内核酸酶的底物，而且是循环系统中存在的核酸酶的底物，如与小鼠血清体外孵育所显示的那样。当胆固醇配体已经在循环系统中从siRNA上切除后，所得siRNA倾向于肾清除并且被快速地排泄到尿液中，而不是递送到组织中。
表16：
实施例53:具有可裂解RNA连接体的siRNA的体内敲减活性
如实施例50所述进行体内实验，使用胆固醇siRNA缀合物。在实施例50中，将胆固醇与有义链经包含3个在5’-末端的2’-OH核苷酸(AUC)的单链突出部连接(SEQIDNO对260/263)，其显示如实施例51所述的低血清稳定性。这导致了与实施例52所述的血清稳定的连接体化学相比明显降低的组织浓度。仅一个或两个所选2’-OH核苷酸与2’-OMe核苷酸在连接体中的组合导致更高的血清稳定性，但是维持了对于胞内体/溶酶体内存在的核酸酶的敏感性。在胞内体/溶酶体内存在的核酸酶活性选择性地在2’-OH核苷酸处裂解。
胆固醇缀合的siRNA与不同的可裂解的核苷酸连接体基序的比较总结于表17。所有的siRNA具有相同的序列背景，仅仅是连接体改变了。将胆固醇与有义链通过由5’-端的3或4个具有不同数目的2’-OH和2’-OMe的核苷酸构成的单链突出部连接。当与递送聚合物组合施用时，所有siRNA都导致小鼠血清中的FVII下调。siRNA(SEQIDNO对276/282)导致48小时血清的FVII活性下调87%和给药后168小时下调95%。siRNA(SEQIDNO对277/282)导致48小时血清的FVII活性下调79%和给药后168小时下调97%。所有结果通过在小鼠中组合施用15mg/kg的递送聚合物和2.5mg/kg胆固醇缀合的siRNA而获得。
表17用于胆固醇缀合的siRNA的不同核苷酸连接体基序的体内比较
这些结果说明，使用血清中稳定的和在胞内体/溶酶体中可裂解的连接体与具有血清稳定的连接体的siRNA相比进一步改善了siRNA的体内效能。所有的可裂解的连接体结构都在胆固醇缀合的siRNA与减缓胞内体释放的递送聚合物的组合施用中改善了体内效能。
在下面的表中，总结了在实施例中使用的siRNA：
表18：核心序列
表19：核心序列和修饰序列的列表

Claims (10)

1.式(I)化合物用于递送核酸的用途
其中
Y是-(CH2)3-；
R1是-(C1-6)烷基；或者
-(CH2)m-苯基，其中苯基是未取代的或者被独立地选自下述的取代基取代最多四次：
-NO2、
-CN或
卤素；
R2是氢；
-(CH2)k-苯基；
-(C1-6)烷基；
-(CH2)k-C(O)-NH2；或
-(CH2)k-NH-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或者独立地被–O-(C1-4)烷基取代；
R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被独立地选自下述的取代基取代：
-(CH2)-OH；或
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)；
k是1、2、3、4、5或6；
m是1、2、3或4；且
n是0或1。
2.如权利要求1所述的用途，其中式(I)化合物具有如式(Ia)所示的构型
3.如权利要求1或2所述的用途，其中式(I)或(Ia)化合物的取代基
Y是-(CH2)3-；
R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯环是未取代的或独立地被–O-(C1-4)烷基取代；且
R3是-NH-苯基，其中苯基基团进一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；
n是0；且
R1和k具有上文所述含义。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物是与核酸共价连接。
5.式(II)化合物，
其中
Ra是–(CH2)k-NH2；
R1和k具有上文式(I)所述含义。
6.如权利要求5所述化合物，其具有式(IIa)所示的构型
其中
Ra是–(CH2)k-NH2；
R1和k具有上文式(I)所述含义。
7.如权利要求5或6所述化合物，其中核酸是寡核苷酸，其包含具有修饰模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反义链和具有修饰模式5’-(Z3)ns-3’的有义链，其中
w独立地是5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯或H，
Z1独立地是2’-修饰的核苷，
Z2独立地是2’-脱氧核苷或2’-氟-修饰的核苷，
Z3独立地是2’-修饰的核苷，
na是8-23且ns是8-25。
8.如权利要求5或6所述的化合物，其中核酸是siRNA。
9.如权利要求5或6所述的化合物，其中核酸是与递送聚合物一起施用。
10.包含如权利要求5-9中任一项所述的化合物的药物组合物。
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