KR101559642B1 - 생물학적 활성 화합물의 세포내 전달을 위한 소분자 접합체 - Google Patents

생물학적 활성 화합물의 세포내 전달을 위한 소분자 접합체 Download PDF

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데이비드 엘 루이스
페터 모어
한스 마르틴 뮐러
귄터 오트
잉고 뢸
데이비드 비 로제마
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Abstract

본 발명은 신규한 화합물 및 생물학적 활성 물질의 전달에 유용한 이러한 화합물의 접합체를 제공한다 또한 전달 중합체에 공유적으로 부착될 때 생체내 mRNA 녹 다운을 달성하기에 특히 유용한 화학적으로 안정화된 siRNA 에 대한 신규한 디자인 기준이 본원에 공개되어 있다.

Description

생물학적 활성 화합물의 세포내 전달을 위한 소분자 접합체 {SMALL MOLECULE CONJUGATES FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS}
본 발명은 생물학적 활성 물질, 예컨대 핵산, 펩티드 및 단백질의 전달에 유용한 신규한 소분자 접합체에 관한 것이다. 핵산 및 기타 실질적으로 세포 막 불투과성인 화합물의 살아있는 세포 내로의 전달은 세포의 복합적 막 시스템에 의해 매우 제한된다.
생물학적 활성 물질 예컨대 핵산을 생체내에 전달하는데 사용되어 온 하나의 수단은 생물학적 활성 물질을 작은 표적화 분자 또는 소수성 분자 예컨대 지질 또는 스테롤에 부착하는 것이었다. 일부 전달 및 활성이 이들 접합체와 함께 관찰되었지만, 이들 방법에 요구되는 생물학적 활성 물질 용량이 엄청나게 커서, 종종 원치 않는 독성 효과를 생체내에서 초래했다. 본원에서 제공되는 것은 생물학적 활성 물질에 접합되고 상기 생물학적 활성 물질의 세포 내로의 성공적 전달을 매개할 수 있는 소분자 화합물이다. 놀랍게도 본원에 제공된 신규한 화합물을 사용할 때 생물학적 활성 물질의 상당히 감소된 용량이 성공적 전달에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 신규한 화합물은 생체내 독성이 상당히 제한된, 생물학적 활성 물질의 전달을 위한 강력한 도구를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 하기 식 (I) 의 화합물에 관한 것이다
Figure 112013067790681-pct00001
[식 중,
Y 는 -(CH2)3- 또는 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 로부터 선택되는 링커 기이고;
R1 은 -(C1-6) 알킬;
-(CH2)-나프틸; 또는
-(CH2)m-페닐이고, 여기서 페닐은 치환되지 않거나 또는 하기로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 4 회 이하 치환됨
-NO2,
-CN,
할로겐,
-O-(CH2)-페닐,
-O-(C1-6) 알킬, 또는
-C(O)-NH2;
R2 는 수소;
-(CH2)k-N-C(Ph)3, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환됨;
-(CH2)k -C(O)-NH2;
-(CH2)k -페닐;
-(C1-6) 알킬이고, 이는 치환되지 않거나 또는 -S-CH3 로 1 회 치환됨;
R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는 하기로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 추가로 치환됨
-(CH2)-OH; 또는
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐);
k 는 1, 2, 3, 4, 5, 6 이고;
m 은 1, 2, 3 또는 4 이고;
n 은 0 또는 1 이고; 및
p 는 1 ~ 20 의 정수임].
또다른 구현예에서, 식 (I) 의 화합물은 하기 식 (Ia) 에 제시된 특정 입체구조를 가질 수 있다
Figure 112013067790681-pct00002
[식 중, 모든 치환기 R1, R2, R3 및 Y 뿐만 아니라 변수 k, m, n, 및 p 는 위에 제시된 의미를 가짐].
또다른 구현예에서, 본 발명은 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물로서, 식 중, Y 는 -(CH2)3- 이고; 모든 나머지 치환 기는 위에 제시된 의미를 갖는 화합물에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물로서, 식 중, Y 는 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 이고; 모든 치환 기는 위에 제시된 의미를 갖는 화합물에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물로서, 식 중,
Y 는 -(CH2)3- 이고;
R2 는 -(CH2)k-N-C(Ph)3 이고, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환됨; 및
R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐) 로 추가로 치환됨;
n 은 0 이고; 및
R1 및 k 는 위에 제시된 의미를 갖는, 화합물이 제공된다.
또다른 구현예에서, 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물로서, 식 중,
Y 는 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 이고;
R2 는 -(CH2)k-N-C(Ph)3 이고, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환됨; 및
R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐) 로 추가로 치환됨;
n 은 0 이고; 및
R1, k 및 p 는 위에 제시된 의미를 갖는, 화합물이 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "(C1-6) 알킬" 은" 탄소수가 1 ~ 6 인 선형 또는 분지형, 포화 탄화수소를 의미한다. 바람직한 C1-6 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 2-부틸 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐" 은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미하고, 불소 및 염소가 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 일반적으로 유기- 또는 의약 화학 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 더욱 특히 식 (Ia) 의 화합물로서, 식 중, Y 는 -(CH2)3- 이고, n = 0 인 화합물은, 하기 화합물 (A) 를 출발 물질로서 사용하여 수득될 수 있다.
Figure 112013067790681-pct00003
(A) 의 합성은 특히 WO2001/070415 에 기재되어 있다.
식 (A) 의 화합물은 휘니그 염기 (Huenig's base) 및 에틸 아세테이트 (AcOET) 의 존재 하에 추가로 반응된 후, THF 중 디히드로푸란-2,5-디온이 첨가되어, 하기 식 (B) 의 화합물이 수득된다
Figure 112013067790681-pct00004
.
식 (B) 의 화합물은 하기 식 (C) 의 아민과 추가로 반응되어,
Figure 112013067790681-pct00005
식 (Ia) 의 화합물이 수득된다.
식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물은 생물학적 활성 물질, 예컨대 핵산, 펩티드 또는 단백질에 대한 리간드로서 유용하며, 그들에게 공유적으로 부착된다. 바람직하게는, 공유 결합은 생물학적 활성 물질 중 적합한 기능기, 예컨대 즉, 일차 아민 기와 본원에서 앞서 정의된 R3 의 -O-C(O)-O- 모이어티 중 활성화된 카르보닐 기의 반응에 의해 생성된다. 이에 따라 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 접합체가 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 활성 물질" 은 동물, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 조류 및 포유류, 예컨대 인간에게 생체내 투여될 때 생물학적 효과를 야기하는, 무기 또는 유기 분자 예컨대 소분자, 펩티드 (예를 들어 세포 투과성 펩티드), 단백질, 탄수화물 (예컨대 단당, 올리고당, 및 다당), 핵단백질, 점액단백질, 지방단백질, 합성 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 단백질에 연결된 소분자, 당단백질, 스테로이드, 핵산 (임의의 형태의 DNA, 예컨대 cDNA, 또는 RNA, 또는 그의 조각), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 (예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, LNA 및 siRNA), 유전자, 지질, 호르몬, 또는 그들의 조합을 언급한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 활성 물질은 펩티드 또는 핵산이다. 본원에서 사용되는 바람직한 핵산은 siRNA 이다.
생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착된 본 화합물을 포함하는 접합체는 상기 생물학적 활성 물질 단독과 비교할 때 개선된, 세포에 의해 흡수되는 능력을 보인다. 일단 접합체가 세포 내로 전달되고 리소좀으로 수송 (trafficking) 되면, 해당하는 생물학적 활성 물질이 효소적 절단에 의해 방출된다. 바람직하게는 이러한 절단은, 바람직하게는 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물에 존재하는 서열 α- 또는 β-(페닐)알라닌 및 라이신으로 이루어지는, 디-펩티드 모티프가 접합체에 통합되어 있을 때 일어난다 (참고, 반응식 1). 가장 바람직하게는 접합체는 디-펩티드 모티프 및 스페이서 예컨대 반응식 2 에서 siRNA 에 대해 예시된 바와 같이 일단 디-펩티드 모티프의 아미드 결합 C-말단이 절단되면 자발적으로 조각나는 p-아미노벤질카르바메이트 스페이서 (Bioconjugate Chem. 2002,13,855) 를 함유한다. 그러므로 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물을 포함하는 접합체는 또한 디펩티드 함유 콜레스테롤 접합체로도 언급된다. 이러한 발명의 디펩티드 함유 콜레스테롤 접합체로부터의 생물학적 활성 물질의 효소적 절단은 세포의 선천적 프로테아제에 의해 촉매작용된다. 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물에 존재하는 디-펩티드 모티프를 절단할 수 있는 선천적 프로테아제의 하나의 예는 카텝신 B 이다. 카텝신 B 는 포유류 세포의 리소좀에 위치하는 알려진 편재하는 (ubiquitous) 시스테인 프로테아제이다 (Bioconjugate Chem. 2002,13,855; J.Med.Chem. 2005,48,1344; Nat. Biotechnology 2003,21,778). 따라서, 위에 기재된 디-펩티드 모티프는 또한 카텝신-절단성 디펩티드-모티프로도 언급된다.
본 발명은 그러므로 또한 생물학적 활성 물질의 세포 내로의 전달 방법을 제공하며, 세포 내에서 상기 생물학적 활성 물질은 그 뒤에 접합체로부터 절단되어 치료적 활성을 발휘할 수 있다.
Figure 112013067790681-pct00006
본 발명의 추가의 구현예에서, 생물학적 활성 물질, 바람직하게는 siRNA 또는 펩티드 모이어티에 공유적으로 부착된 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물의 접합체가 제공된다. 바람직하게는 상기 펩티드 모이어티는 막 동요 특성을 나타내는 펩티드 예컨대 세포 투과성 펩티드 또는 양쪽친매성 펩티드이다.
생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착된 식 (I) 또는 (Ia) 의 접합체는 본원에서 각각 식 (II) 또는 (IIa) 로 지명된다.
그러므로, 추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 식 (II) 의 화합물을 제공한다
Figure 112013067790681-pct00007
[식 중,
Ra 는 -(CH2)k-NH2 이고;
R1 및 k 는 상기 식 (I) 에서 제시된 의미를 갖고; 및
생물학적 활성 물질은 핵산, 단백질 또는 펩티드임].
더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 하기 식 (IIa) 의 화합물을 제공한다
Figure 112013067790681-pct00008
[식 중,
Ra 는 -(CH2)k-NH2 이고;
R1 및 k 는 상기 식 (I) 에서 제시된 의미를 갖고; 및
생물학적 활성 물질은 핵산, 단백질 또는 펩티드임].
바람직한 구현예에서, 식 (II) 또는 (IIa) 중 생물학적 활성 물질은 핵산, 가장 바람직하게는 siRNA 이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 식 (II) 또는 (IIa) 중 생물학적 활성 물질은 단백질 또는 펩티드이다.
식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물은 요법에 있어서 귀중한 특성을 가질 수 있다. 그러므로, 추가의 구현예에서, 약제로서의 용도를 위한 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물이 제공된다.
발명의 또다른 구현예는 생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착된 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물의 접합체를 포함하는 약학적 조성물이다.
발명의 또다른 구현예에서 식 (IIa) 의 화합물과 함께 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
하기 구현예는 siRNA 에 공유적으로 부착된 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물의 접합체, 따라서 생물학적 활성 물질이 siRNA 인 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물에 대해 예시된다. 이들 구현예는 또한 다른 생물학적 활성 물질 예컨대 펩티드 및 단백질에도 적용가능하다고 이해된다.
siRNA 의 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물에의 공유적 부착은 siRNA 중 적합한 친핵성 기, 즉, 일차 아민 기와 상기 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물의 R3 중 활성화된 -C(O)- 기의 반응을 통해 달성된다. -C(O)- 기의 활성화는 하기 반응식 2 에 제시된 바와 같이 p-니트로페녹시 카르보네이트에 의해 수득된다.
Figure 112013067790681-pct00009
p-니트로페닐 활성화된 카르보네이트는 예를 들어 헥실아미노-링커가 달린 siRNA 와 반응되어 카르바메이트 연결을 생성하여 siRNA 접합체를 산출할 수 있다. 일단 siRNA 가 세포내에 흡수되고 리소좀에 트랜스펙션되면 반응식 2 에 또한 제시된 바와 같이 생물학적 활성 물질이 siRNA 인 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물이 프로테아제 활성에 의해 절단되어 siRNA 를 방출한다. 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물의 접합체의 콜레스테롤 모이어티는 siRNA 의 PK 특성을 수정하며, 그런 식으로 전신 투여가 생체내에서 유전자 침묵을 가능하게 한다.
Figure 112013067790681-pct00010
하나의 구현예에서 생물학적 활성 물질이 siRNA 인 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물은 전달 중합체 (delivery polymer) 와 동시-투여된다. 전달 중합체는 세포 막을 파괴하는 수단을 제공하고 엔도솜 방출을 매개한다. 또다른 구현예에서, 상기 전달 중합체 및 발명의 siRNA 접합체는 공유적으로 부착되지 않고 별도로 합성되고 별도의 용기 또는 단일 용기 중에 공급될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 예컨대 siRNA 에 대한 전달 중합체는 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Rozema 등은, U.S. 특허 공개 20040162260 에서 막 활성 폴리아민의 막 파괴 활성을 가역적으로 조절하는 수단을 설명했다. 가역적 조절은 표적 세포의 엔도솜의 활성을 제한함으로써, 독성을 제한하는 수단을 제공했다. 그들의 방법은 폴리아민 상의 아민과 2-프로피오닉-3-메틸말레산 무수물의 반응에 의존했다. 이러한 수식은 일차 아민의 카르복실-함유 기로의 전환을 통해 다가양이온을 다가음이온으로 전환했고, 폴리아민의 막 활성을 가역적으로 저해했다. 핵산과 전달 비히클의 동시-전달을 가능하게 하기 위해, 핵산이 전달 중합체에 공유적으로 연결되었다. US 가 특허 출원 61/307490 에 전달 중합체의 신규한 생성이 기재되어 있다. 거기에, 아민-함유 단량체, 더 낮은 소수성 단량체, 및 더 높은 소수성 단량체의 랜덤 중합에 의해 형성되는 양친매성 삼량체를 포함하는 막 활성 폴리아민이 제공되어 있다. 전달 중합체의 이러한 신규한 생성은 폴리뉴클레오티드 및 중합체가 공유적 연결에 의해 또는 전하-전하 상호작용에 의해 연합되어야 하는 요건을 제거했다.
발명의 siRNA 접합체와의 동시-투여에 사용되는 전달 중합체의 비제한적 예는 막 활성 폴리아민 및 폴리(비닐 에테르) (PBAVE), 동적 다중접합체 (Dynamic Polyconjugate) (DPC; Rozema et al. 2007) 및 US 가 특허 출원 61/307490 에서 공개된 개선된 DPC 이다.
추가의 구현예에서, 기능적 생체내 전달을 위한 신규한 화학적 siRNA 수식 패턴이 제공된다. 이러한 신규한 화학적 siRNA 수식 패턴은 비교적 강한 엔도솜 / 리소좀 체류를 나타내는 전달 비히클과 함께할 때 특히 유용하다.
엔도솜 / 리소좀-국소화된 뉴클레아제 예컨대 DNAse II 에 의한 붕괴에 대항하는 siRNA 안정화는 표적 녹 다운 (knock down) 을 강하게 개선한다는 것이 밝혀졌다. 그러한 안정화는 세포성 RNAi 머시너리 (machinery) 가 위치하는 세포질 내로 방출되는 siRNA 의 양에 직접 영향을 미칠 수 있다. 오직 세포질에서 이용가능한 siRNA 부분이 RNAi 효과를 촉발할 것이다.
불량한 약동학적 특징에 더하여, siRNA 는 보호성 전달 비히클 없이 그대로 순환 내로 투여될 때 생물 환경 내의 뉴클레아제에 감수성이다. 따라서, 많은 siRNA 가 세포외에서 조직 및 혈류에서 또는 세포내 흡수 (엔도솜) 후에 신속히 붕괴된다.
엔도솜 / 리소좀 구획에 국소화된 하나의 잘 알려진 뉴클레아제는 DNase II 이다. 이러한 효소는 pH 6-6.5 미만에서 활성이고, 엔도솜/ 리소좀 구획의 산성화된 환경에 존재하는 조건을 반영하는 pH-범위 4.5-5 에서 최대 활성을 나타낸다. DNase II 에 의해 유도되는 하기 RNA 붕괴 경로가 시험관내에서 확인되었고 본 발명에서 공개된다:
A. 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 가닥은 시클릭 5가 인 중간체를 통해 신속히 붕괴되어, 5'-절단 산물에서 2'-3' 시클릭 포스페이트를 초래한다. 5가 중간체의 형성은 2'-OH 기를 결여하는 뉴클레오티드 예컨대 2'-데옥시, 2'-O-메틸 (2'-OMe) 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 뉴클레오티드에 의해 저해될 수 있다.
B. 부가적으로, RNA 는 5'-말단 뉴클레오티드 상의 2'-수식으로부터 독립적인 5'-핵산말단분해성 (exonucleolytic) 경로에서 붕괴된다. 이러한 붕괴 경로는 5'-말단 비-뉴클레오티드 모이어티, 예컨대 예를 들어 콜레스테롤, 아미노알킬-링커 또는 첫번째 뉴클레오티드간 연결에서의 포스포티오에이트에 의해 저해될 수 있다.
C. 5'-포스페이트는 또한 핵산말단분해성 절단 동역학을 보호하고 감속시키지만, 이러한 경로를 완전히 차단할 수는 없다. 이는 포스파타제 또는 안정성 검정에서 사용되는 DNase II 효소 제제의 고유의 포스파타제 활성에 의한 5'-포스페이트의 절단으로 인한 것일 가능성이 가장 높다.
D. 최선의 보호는 5'-말단에서 포스포로티오에이트 (PTO) 연결에 의해 두번째 뉴클레오티드에 연결된 2'-OMe 뉴클레오티드로 출발하는, 가닥 내에 임의의 2'-OH 뉴클레오티드를 결여하는 올리고뉴클레오티드로 달성되었다. 기타 말단 비-2'-OH 뉴클레오티드도 또한 5'-말단 (exo) 붕괴로부터 보호하지만, 2'-OMe 수식에 비해 더 적은 정도로이다.
그러므로 본 발명의 발명자들은 하기 디자인을 사용할 때 siRNA 가 유의하게 안정화될 수 있음을 발견했다: 올리고뉴클레오티드에 수식 패턴: 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3)na-3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3)ns-3' 을 갖는 센스 가닥이 제공되며, 식 중,
w 는 독립적으로 5'-포스페이트 또는 5'-포스포티오에이트 또는 H 이고,
Z1 은 독립적으로 2'-수식된 뉴클레오시드이고,
Z2 는 독립적으로 2'-데옥시 뉴클레오시드 또는 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드이고,
Z3 은 독립적으로 2'-수식된 뉴클레오시드이고,
na 는 8-23 이고, ns 는 8-25 이다.
하나의 바람직한 구현예에서 올리고뉴클레오티드에 수식 패턴: 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns -3' 을 갖는 센스 가닥이 제공되며, 식 중, Z1 은 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드 또는 2데옥시-뉴클레오시드이고, 모든 나머지 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 갖는다.
하나의 바람직한 구현예에서 올리고뉴클레오티드에 수식 패턴: 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns -3' 을 갖는 센스 가닥이 제공되며, 식 중, Z3 은 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오시드, 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드 또는 2데옥시-뉴클레오시드이고, 모든 나머지 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 갖는다.
하나의 바람직한 구현예에서 올리고뉴클레오티드에 수식 패턴: 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns -3' 을 갖는 센스 가닥이 제공되며, 식 중, Z1 은 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드 또는 2데옥시-뉴클레오시드이고, Z3 은 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오시드, 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드 또는 2데옥시-뉴클레오시드이고, 모든 나머지 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 갖는다.
신규한 수식 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열 중 뉴클레오시드는 5'-3' 포스포디에스테르 또는 5'-3' 포스포로티오에이트에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는, "안티-센스" 가닥은 표적 mRNA 에 상보적이고 일단 siRNA 가 풀리면 mRNA 에 결합될 siRNA 가닥이다.
신규한 수식 패턴을 포함하는 상기 siRNA 의 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적이다.
신규한 수식 패턴을 포함하는 상기 siRNA 는 Rozema 등, Dynamic PolyConjugates (DPC; Rozema et al. 2007) 에 의해 예시된 바와 같이 전달 중합체에 공유적으로 부착될 때 특히 유리한 것으로 증명되었다. 효능 및 효과의 지속시간은 본 발명에서 개설된 siRNA 수식 전략을 이용하여 유의하게 증강될 수 있다.
또다른 구현예에서, 신규한 수식 패턴을 포함하는 상기 siRNA 는 siRNA 의 약동학적 특성을 변경하는 소분자 예컨대 콜레스테롤 또는 본원에 제공된 식 (I) 및 (Ia) 의 화합물에 접합될 때 특히 유용하다. 하나의 구현예에서 올리고뉴클레오티드가 하기 수식 패턴을 갖는, 소분자 및 올리고뉴클레오티드의 접합체가 제공된다: 수식 패턴: 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns - 을 갖는 센스 가닥 [식 중, 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 가짐]. 하나의 구현예에서 상기 소분자는 콜레스테롤이다. 또다른 구현예에서 상기 소분자는 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물이며, 식 (II) 또는 (IIa) 의 화합물을 산출한다.
바람직하게는, 상기 siRNA 접합체는 전달 중합체와 동시-투여된다. 적합한 전달 중합체는 위에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 신규한 수식 패턴을 포함하는 상기 siRNA 는 접합체를 세포 내로 내부화하는 특이적 수용체에 결합하는 것으로 알려진 리간드에 접합될 때 특히 유용하다. 특히, 간세포 상에서 발현되는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 는 순환으로부터 탈시알화된 (desialylated) 단백질의 청소 (엔도사이토시스 및 리소좀 붕괴) 를 가능하게 하는 잘 알려진 수용체이다. N-아세틸-D-갈락토스아민은, 특히 다가로 제시될 때 및 갈락토스 잔기에 적절한 공간이 있을 때, 수용체에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (J Biol Bhem, 2001, 276, 37577). 생물학적 활성 물질의 수용체 매개되는 엔도사이토시스에 이러한 높은 능력 수용체를 이용하기 위해, 아래 제시된 합성 리간드가 제조되어 신규한 수식 패턴을 포함하는 siRNA 에 공유적으로 부착되었다. 이러한 유형의 엔도사이토시스는 내부화된 물질의 리소좀 붕괴를 초래하므로 siRNA 는 리소좀 내에서 안정적이도록 제조되어야 하는데, 이것은 이제 위에 개설된 신규한 수식 패턴에 의해 해결된다.
ASGPR 에 대한 리간드는 아미드 결합을 통해 생물학적 활성 물질에 부착된다. 아미드 결합 형성은 NHS 화학의 도움으로 확립될 수 있다. 접합 반응에 이용되는 리간드가 아래 제시되어 있다 (식 III). ASGPR 와의 상호작용을 위해 (식 IV) 에 제시된 바와 같이 O-아세테이트 기가 siRNA 를 위해 제거되어야 한다.
Figure 112013067790681-pct00011
Figure 112013067790681-pct00012
발명의 하나의 구현예에서, 올리고뉴클레오티드가 하기 수식 패턴을 갖는, 식 IV 의 화합물 및 올리고뉴클레오티드의 접합체가 제공된다: 수식 패턴 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns - 을 갖는 센스 가닥 [식 중, 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 가짐]. 상기 접합체는 또한 GalNAc 팔미토일 접합체로도 언급된다. 바람직하게는, 상기 GalNAc 팔미토일 접합체는 전달 중합체와 동시-투여된다. 적합한 전달 중합체는 위에 기재되어 있다.
이들 수식 패턴에 대해 안정적으로 연결된 소분자 리간드에 비해 절단성 링커가 유리한 것으로 증명되었다. 가능한 절단성 링커는 반응식 1 에 예시된 디-펩티드 모티프 또는 2'-OH 함유 뉴클레오티드를 포함하는 절단성 RNA-링커이다. 절단성 RNA-링커는 위에 기재된 신규한 수식 패턴을 갖는 siRNA (전부 2'-수식된 siRNA) 에 관해 특히 유용하다.
원칙적으로 뉴클레아제 절단 자리는 센스 또는 안티센스 가닥에서 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 3'- 또는 5'-오버행 (overhang) 에 의해 도입될 수 있다. 최종 활성 siRNA 종 (species) 은 세포내 뉴클레아제 가공에 의해 생성된다. 또한, 염기가 쌍을 이루는 영역 내에 2'-OH 뉴클레오티드에 의해 실현되는 규정된 절단 자리의 사용이 가능하다. 이는 반대 가닥에 상보적인 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 사용하여 또는 하나 이상의 부조화되는 (mismatched) 2'-OH 뉴클레오티드 또는 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 헤어핀/벌지 (bulge) 의 도입에 의해 실시될 수 있다.
다른 절단성 링커 화학과 대조적으로 2'-OH 뉴클레오티드의 도입에 의한 규정된 절단 자리의 사용은 더욱 범용성인 접합 접근을 초래한다. siRNA 의 한쪽 또는 양쪽 가닥에 3' 및 / 또는 5'-말단에 또는 듀플렉스 (duplex) 구조 내에 선별적 절단 자리를 도입함으로써, 다중 접합이 가능하다.
따라서, 하나의 구현예에서, 하기와 같은 소분자 및 올리고뉴클레오티드의 접합체가 제공된다
a) 소분자는 1-10 개, 바람직하게는 1-5 개, 가장 바람직하게는 1-3 개의 2'OH-뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 링커를 포함하고;
b) 올리고뉴클레오티드는 하기 수식 패턴을 갖고: 수식 패턴 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3) ns - 을 갖는 센스 가닥 [식 중, 치환기 뿐만 아니라 변수 na 및 ns 는 위에 제시된 의미를 가짐]; 및
c) 올리고뉴클레오티드는 소분자의 뉴클레오티드 링커에 공유적으로 부착되어 있다.
접합체의 엔도솜 내로의 내부화 후 뉴클레오티드 링커는 세포내 뉴클레아제 예컨대 DNAse II 에 의해 절단되어, siRNA 를 방출한다.
바람직하게는, 상기 접합체는 전달 중합체와 동시-투여된다. 적합한 전달 중합체는 위에 기재되어 있다.
발명의 또다른 구현예에서 식 (V) 의 화합물이 제공된다. 이러한 화합물은 콜레스테롤 모이어티, 및 1-10 개, 바람직하게는 1-5 개, 가장 바람직하게는 1-3 개의 2'OH-뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 링커를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드 예컨대 siRNA 를 식 (V) 의 화합물에 공유적으로 부착하는데 유용하다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 위에 개설된 신규한 수식 패턴을 갖는다. 그러므로 또다른 구현예에서 올리고뉴클레오티드가 식 (V) 의 화합물의 뉴클레오티드 링커에 공유적으로 부착되어 있는, 식 (V) 의 화합물 및 올리고뉴클레오티드의 접합체가 제공된다.
식 (V) 의 화합물 및 올리고뉴클레오티드의 접합체의 엔도솜 내로의 내부화 후 뉴클레오티드 링커가 세포내 뉴클레아제 예컨대 DNAse II 에 의해 절단되어, siRNA 를 방출한다.
Figure 112013067790681-pct00013
바람직하게는, 상기 식 (V) 의 화합물 및 올리고뉴클레오티드의 접합체는 전달 중합체와 동시-투여된다. 적합한 전달 중합체는 위에 기재되어 있다.
또다른 구현예에서, 상기 전달 중합체 및 발명의 식 (V) 의 화합물 및 올리고뉴클레오티드의 접합체는 공유적으로 부착되지 않고 별도로 합성되고 별도의 용기 또는 단일 용기 중에 공급될 수 있다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "소분자" 는, 일반적으로 분자량이 10,000 grams/mole 미만, 임의로 5,000 grams/mole 미만, 임의로 2,000 grams/mole 미만인, 합성된 또는 자연에서 발견되는 유기 또는 무기 분자를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드" 는 하나의 D- 또는 L-아미노산의 .알파.-카르복실 기 및 또다른 D- 또는 L-아미노산의 .알파.-아미노 기 사이에서의 아미드 결합 형성에 의해 생성된 임의의 중합체 화합물을 언급한다. 본원에서 사용되는 용어 "단백질" 은 약 50 개 초과 잔기의 특정 서열의 폴리펩티드를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "디-펩티드 모티프" 는 첫번째 아미노산의 D- 또는 L-알파 또는 베타 아미노 기와 두번째 D- 또는 L-아미노산의 알파-카르복실 기에 의해 형성된 아미드 결합을 포함하는 임의의 모티프를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산" 은 아민 및 카르복실 기능기 둘다를 함유하는 임의의 분자를 언급한다. 따라서 용어 "아미노산" 은 자연적, 비-자연적 및 합성 아미노산 모두를 언급한다. 본 발명에서 사용되는 임의의 자연적 아미노산은 본원에서 그들의 통상적 약어로 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드" 는 생물학적 활성 물질에 공유적으로 또는 그렇지 않으면 화학적으로 결합할 수 있는 모이어티를 언급한다. 발명의 맥락에서 용어 "리간드" 는 바람직하게는 생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착된 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물이다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 활성 물질" 은 동물, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 조류 및 포유류, 예컨대 인간에게 생체내 투여될 때 생물학적 효과를 야기하는, 무기 또는 유기 분자 예컨대 소분자, 펩티드 (예를 들어 세포 투과성 펩티드), 단백질, 탄수화물 (예컨대 단당, 올리고당, 및 다당), 핵단백질, 점액단백질, 지방단백질, 합성 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 단백질에 연결된 소분자, 당단백질, 스테로이드, 핵산 (임의의 형태의 DNA, 예컨대 cDNA, 또는 RNA, 또는 그의 조각), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 (예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, LNA 및 siRNA), 유전자, 지질, 호르몬, 또는 그들의 조합은 언급한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 활성 물질은 펩티드 또는 핵산이다. 본원에서 사용되는 바람직한 핵산은 siRNA 이다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산" 은 뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 올리고머 또는 중합체, 또는 2 개의 자연 발생적 핵산의 경우와 유사한 서열 특이적 방식으로 자연 발생적 핵산과 혼성화할 수 있는, 예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성 상호작용에 참여할 수 있는 합성적으로 생성된 화합물 화합물 (예를 들어, U.S. 특허 번호 5,948,902 및 거기에서 언급된 참고문헌에 기재된 PNA) 을 의미한다. 비-자연 발생적 핵산은 자연에서 발생하지 않는 핵염기 서열을 함유하는 올리고머 또는 중합체, 또는 자연 발생적 핵염기, 당, 또는 당-간 연결의 기능적 등가물을 함유하는 종, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 (locked) 핵산 (LNA), 또는 글리세롤 핵산 (GNA) 이다. 이 용어는 자연 발생적 핵산 핵염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U) 을 함유하는 올리고머, 뿐만 아니라 염기 유사체 또는 수식된 핵염기를 함유하는 올리고머를 포함한다. 핵산은 다양한 자연적 공급원 예컨대 바이러스, 박테리아 및 진핵 DNA 및 RNA 로부터 유래할 수 있다. 기타 핵산은 합성 공급원으로부터 유래될 수 있고, 연구 시약, 진단제 또는 잠재적 확실한 치료제로서의 용도를 위해 제조되고 있는 임의의 여러 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산으로 구성되는 올리고머를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "2'-수식된" 은 2'-OH 기가 H, F, O-CH3 또는 기술분야에서 알려진 기타 치환기로 대체된 자연 발생적 핵염기로 구성되는 β-D-리보뉴클레오시드 또는 β-D-리보뉴클레오티드를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "2-OH-뉴클레오티드" 는 2'-OH 기를 갖는 자연 발생적 핵염기로 구성되는 β-D-리보뉴클레오티드를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "5'-포스페이트" 는 식 -O-P(=O)(OH)OH 를 언급한다. 또다른 양상에서 포스페이트는 O 또는 OH 기 중 하나가 S 로 대체되도록 수식되고 본원에서 "5'-포스포티오에이트" 로 호칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "포스포티오에이트" 는 하나의 비-가교성 산소가 황으로 대체되어 있는 뉴클레오티드간 연결을 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "전달 중합체" 는 생물학적 활성 물질의 기능적 전달에 적합한 중합체를 언급한다. 본 발명의 맥락에서 전달 중합체는 본원에 기재된 화합물에 접합된 생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착되거나 또는 그것과 동시투여되고, 세포 내로의 내부화 및 엔도솜 내로의 흡수 후 엔도솜 탈출을 매개한다. 이러한 맥락에서 용어 "중합체" 는 서로 공유 결합된 2 개 이상의 단량체 단위로 구성된 임의의 화합물을 의미하며, 이 경우 단량체 단위는 동일 또는 상이할 수 있으므로, 중합체는 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있다. 대표적 중합체는 펩티드, 다당, 핵산 등을 포함하며, 이 경우 중합체는 자연 발생적 또는 합성일 수 있다. 전달 중합체의 비제한적 예는 예를 들어 INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, October - 2010 / Volume - 2 / Issue - 8 / Article No -2 에서 리뷰되어 있다. 핵산 전달에 유용한 전달 중합체의 비제한적 예는 EP 출원 10165502.5 및 10191030.5, PCT 공개 WO 2008/0022309 및 US 가 출원 61/307490 및 본원에 언급된 참고문헌에 개시되어 있다; 이들은 모두 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물" 은 발명의 접합체, 약학적 담체 또는 희석제 및 제형에 필수적인 임의의 기타 매질 또는 작용제를 포함한다.
본원에서 사용되는 "약학적 담체" 는 생리적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입에 의한) 에 적합하다.
본 발명의 접합체는 기술분야에 알려진 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 다를 것이다. 특정 투여 경로에 의해 발명의 접합체를 투여하기 위해, 접합체를 그것의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 접합체와 그 물질을 동시-투여하는 것이 필수적일 수 있다. 예를 들어, 접합체는 대상에게 적당한 담체 또는 희석제 중에 투여될 수 있다. 약학적으로 수용가능한 희석제는 식염수 및 수성 완충액을 포함한다. 약학적 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 및 멸균 수성 용액 또는 분산물을 포함한다. 약학적 활성 물질에 그러한 매질 및 작용제의 사용은 기술분야에 알려져 있다.
본원에서 사용되는 구절 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된다" 는, 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소적 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다.
이들 담체는 또한 보조제 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 절차에 의해, 그리고 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한 등장화제, 예컨대 당, 나트륨 클로라이드 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
선택된 투여 경로에 상관 없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는, 본 발명의 접합체, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은, 통상의 기술자에게 알려진 관습적 방법에 의해 약학적으로 수용가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준을 달리하여, 환자에게 독성이 아니면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 획득하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자 예컨대 이용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속시간, 이용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 등 의학 분야에서 잘 알려진 인자에 의존할 것이다.
약학적 조성물은 멸균이고 조성물이 주사기에 의해 전달가능할 정도로 유동적이어야 한다. 물에 더하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수이다.
적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 나트륨 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.
도 1 은 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물을 포함하는 siRNA-접합체 및 전달 중합체의 생체내 동시-투여를 보여준다.
도 2 는 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물을 포함하는 siRNA-접합체 및 전달 중합체의 생체내 동시-투여를 보여준다.
도 3 은 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물을 포함하는 siRNA-접합체 및 전달 중합체의 생체내 동시-투여를 보여준다.
도 4 는 식 (I) 또는 (Ia) 의 화합물을 포함하는 siRNA-접합체 및 전달 중합체의 생체내 동시-투여를 보여준다.
도 5a 는 전부 2'-수식된 siRNA 에 의한 안티센스 가닥 매개되는 유전자 침묵을 보여준다. COS7 세포가 psiCHECK2-AT 및 3 nM 의 EGFP-지시되는 (directed) siRNA 로 동시트랜스펙션되었다. siRNA 의 녹다운 활성이 리포터 구축물로부터 레닐라 (renilla) 대 반딧불이 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가되었다. siRNA 가 미수식된 (2-19-2) 레퍼런스 siRNA 의 녹다운 활성에 의해 분류되었다.
도 5b 는 전부 2'-수식된 siRNA 에 의한 센스 가닥 매개되는 유전자 침묵을 보여준다. COS7 세포가 psiCHECK2-ST 및 3 nM 의 EGFP-지시되는 siRNA 로 동시트랜스펙션되었다. siRNA 의 녹다운 활성이 리포터 구축물로부터 루시페라제 발현을 측정함으로써 평가되었다. siRNA 가 미수식된 (2-19-2) 레퍼런스 siRNA 의 녹다운 활성에 의해 분류되었다.
도 6a 는 비-인간 영장류에서 전달 중합체에 공유적으로 부착된 다양한 2'-수식된 siRNA 의 정맥내 주입시 혈청 FVII 활성의 감소를 보여준다.
도 6b 는 비-인간 영장류에서 전달 중합체에 공유적으로 접합된 2'-수식된 siRNA 로 처리시 프로트롬빈 시간의 전개를 보여준다.
발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나, 실시예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안된다.
실시예
실시예 1
단계 1: 3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시]-프로필아민
Figure 112013067790681-pct00014
표제 아민을 그것의 니트릴 전구체로부터 문헌 프로토콜 [Lollo et al , WO2001/070415] 에 따라 제조했다.
단계 2: N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시]-프로필}-숙시남산
Figure 112013067790681-pct00015
2 ℓ 둥근바닥 플라스크 내에서, 3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로판-1-아민 (21.15 g, 47.7 mmol, Eq: 1.00) 및 휘니그 염기 (12.3 g, 16.6 ㎖, 95.3 mmol, Eq: 2.00) 를 AcOEt (845 ㎖) 와 조합하여 무색 용액을 얻었다. THF (42 ㎖) 중 디히드로푸란-2,5-디온 (4.77 g, 47.7 mmol, Eq: 1.00) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반했다 => 백색 현탁액. 모든 휘발물을 i.v. 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2 에 용해시키고, 유기 층을 NH4Cl 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 미가공 생성물을 CH3CN / H2O 에 용해시키고, 동결건조시켜 29.8 g 의 표제 화합물 솜털같은 분말로서 얻었다.
MS (ISP): (M-H) 542.5.
단계 3: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-3-(4-니트로페닐)-1-옥소프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00016
10 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄산 (106 ㎎, 184 μmol, Eq: 1.00), (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)헥산아미드 (132 ㎎, 184 μmol, Eq: 1.00), HOAt (25.0 ㎎, 184 μmol, Eq: 1.00) 및 EDC 하이드로클로라이드 (35.3 ㎎, 184 μmol, Eq: 1.00) 를 CH2Cl2 (1.8 ㎖) 중 함께 혼합하여 황색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (47.5 ㎎, 64.2 ㎕, 368 μmol, Eq: 2.00) 를 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반했다. TLC 는 출발 물질의 소모를 나타냈다. 모든 휘발물을 i.v. 제거하고, 미가공 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 7% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 정제하여 128 ㎎ 의 표제 화합물을 연한 황색 고체로서 얻었다.
MS: 예상된 질량: 1240.7552, 관측된 질량: 1240.7518.
단계 4:
Figure 112013067790681-pct00017
10 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-3-(4-니트로페닐)-1-옥소프로판-2-일)숙신아미드 (126 ㎎, 101 μmol, Eq: 1.00) 및 휘니그 염기 (39.3 ㎎, 53.2 ㎕, 304 μmol, Eq: 3.00) 를 CH2Cl2 (1.4 ㎖) 및 DMF (1.0 ㎖) 와 조합하여 황색 현탁액을 얻었다; 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (46.3 ㎎, 152 μmol, Eq: 1.50) 를 첨가하고, 반응이 밤새 진행되게 놔두었다. 혼합물을 부순 얼음 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. ~10 ㎖ 의 디에틸 에테르로 배산 (trituration) 후, 99 ㎎ 의 표제 생성물이 황백색 고체로서 수득되었다.
MS: 예상된 질량: 1405.7614, 관측된 질량: 1405.7518.
단계 3 에 대한 필수적 디펩티드 빌딩 블록을 다음과 같이 제조했다:
단계 a: (S)-2-[(S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-(4-니트로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산
Figure 112013067790681-pct00018
25 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, (S)-2-아미노-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸-아미노)헥산산 (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, 968 ㎎, 2.31 mmol, Eq: 1.00) 을 CH2Cl2 (20 ㎖) 에 용해시켜 연한 황색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (897 ㎎, 1.21 ㎖, 6.94 mmol, Eq: 3.00) 및 트리메틸클로로실란 (528 ㎎, 621 ㎕, 4.86 mmol, Eq: 2.10) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 15 min 동안 교반했다.
두번째 50 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-니트로페닐)프로판산 (1 g, 2.31 mmol, Eq: 1.00) 을 DMF (20 ㎖) 에 용해시켜 무색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (359 ㎎, 485 ㎕, 2.78 mmol, Eq: 1.20) 및 TPTU [125700-71-2] (687 ㎎, 2.31 mmol, Eq: 1.00) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 20' 동안 교반했다. 상응하는 실릴 에스테르 모노실릴아민을 함유하는 첫번째 플라스크로부터의 용액을 첨가하고, 반응물을 또다른 3 시간 동안 교반했다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 10% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 1.38 g 의 표제 화합물을 갈색빛 거품으로서 얻었다.
MS (ISP): (M+H) 833.5, (M+Na) 855.4.
단계 b: [(S)-1-((S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-5-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-펜틸카르바모일)-2-(4-니트로-페닐)-에틸]-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르
Figure 112013067790681-pct00019
250 ㎖ 배-형상 플라스크 내에서, 앞서 합성된 (S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-니트로페닐)프로판아미도)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산산 (1.38 g, 1.66 mmol, Eq: 1.00), (4-아미노페닐)메탄올 (204 ㎎, 1.66 mmol, Eq: 1.00), HOAt (226 ㎎, 1.66 mmol, Eq: 1.00) 및 EDC 하이드로클로라이드 (318 ㎎, 1.66 mmol, Eq: 1.00) 를 CH2Cl2 (16.6 ㎖) 에 용해시켜 황색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (428 ㎎, 579 ㎕, 3.31 mmol, Eq: 2.00) 를 첨가하고, 반응이 밤새 진행되게 놔두었다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl (pH ~7) 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 미가공 생성물을 디에틸 에테르 (1 x 50 ㎖) 로 배산했다; 결과로서 얻은 고체를 여과해내고, 건조시켜 1.214 g 의 표제 화합물을 연한 갈색 고체로서 산출했다.
MS (ISP): (M+H) 938.7.
단계 c: (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(4-니트로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드
Figure 112013067790681-pct00020
50 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 [(S)-1-((S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-5-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-펜틸카르바모일)-2-(4-니트로-페닐)-에틸]-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (1.214 g, 1.29 mmol, Eq: 1.001) 를 THF (19 ㎖) 와 조합하여 갈색 용액을 얻었다. 0°에서, 디에틸아민 (1.77 g, 2.49 ㎖, 24.2 mmol, Eq: 18.70) 을 첨가했다. MS 가 출발 물질의 소멸을 나타냈을 때 반응물을 주위 온도에서 3h 동안 교반했다. 모든 휘발물을 i.v. 증발시켰다; 그 다음 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) => 10% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중), 이어서 두번째 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 5% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 502 ㎎ 의 표제 화합물을 연한 갈색 거품으로서 얻었다.
MS: 예상된 질량: 715.337, 관측된 질량: 715.3362.
실시예 2
O-벤질-N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-티로실-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00021
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(4-벤질옥시-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-(벤질옥시)페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1466.8182, 관측된 질량: 1466.8136.
실시예 3
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-4-시아노-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00022
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(4-시아노-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-시아노페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1385.7716, 관측된 질량: 1385.7696.
실시예 4
3,4-디클로로-N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00023
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(3,4-디클로로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(3,4-디클로로페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1428.6984, 관측된 질량: 1428.695.
실시예 5
4-클로로-N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00024
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)-카르보닐아미노)-3-(4-클로로페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1394.7373, 관측된 질량: 1394.7342.
실시예 6
4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-[(4-{[3-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일}옥시)프로필]아미노}-4-옥소부타노일)아미노]-3-(나프탈렌-1-일)프로파노일]아미노}-6-{[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]아미노}헥사노일]아미노}벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 (비-바람직한 명칭)
Figure 112013067790681-pct00025
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-((S)-2-아미노-3-나프탈렌-1-일-프로피오닐아미노)-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(나프탈렌-1-일)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1410.792, 관측된 질량: 1410.7918.
실시예 7
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-4-플루오로-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00026
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(4-플루오로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)-헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-플루오로페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1378.7669, 관측된 질량: 1378.7609.
실시예 8
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-2-플루오로-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00027
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(2-플루오로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)-헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(2-플루오로페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1378.7669, 관측된 질량: 1378.7689.
실시예 9
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-3-플루오로-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00028
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-[(S)-2-아미노-3-(3-플루오로-페닐)-프로피오닐아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)-헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(3-플루오로페닐)프로판산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1378.7669, 관측된 질량: 1378.7659.
실시예 10
단계 1: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(4-플루오로페닐)-4-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-4-옥소부탄-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00029
10 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄산 (109 ㎎, 188 μmol, Eq: 1.00), (S)-2-[(S)-3-아미노-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드 (132 ㎎, 188 μmol, Eq: 1.00), HOAt (25.6 ㎎, 188 μmol, Eq: 1.00) 및 EDC 하이드로클로라이드 (36.1 ㎎, 188 μmol, Eq: 1.00) 를 CH2Cl2 (2 ㎖) 중 함께 혼합하여 황색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (48.7 ㎎, 64.1 ㎕, 377 μmol, Eq: 2.00) 를 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반했다. TLC 는 출발 물질의 소모를 나타냈다. 모든 휘발물을 i.v. 제거하고, 미가공 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 5% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 정제하여 197 ㎎ 의 표제 화합물을 황백색 고체로서 산출했다.
MS: 예상된 질량: 1227.7763, 관측된 질량: 1227.7714.
단계 2: 4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)-4-(4-플루오로페닐)부탄아미도)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)헥산아미도)-벤질 4-니트로페닐 카르보네이트
Figure 112013067790681-pct00030
10 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(4-플루오로페닐)-4-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-4-옥소부탄-2-일)숙신아미드 (196 ㎎, 160 μmol, Eq: 1.00) 및 휘니그 염기 (61.9 ㎎, 81.4 ㎕, 479 μmol, Eq: 3.00) 를 CH2Cl2 (1.6 ㎖) 및 DMF (0.8 ㎖) 와 조합하여 황색 현탁액을 얻었다; 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (72.8 ㎎, 239 μmol, Eq: 1.50) 를 첨가하고, 반응이 주위 온도에서 밤새 진행되게 놔두었다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl (pH ~6) 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. AcOEt / 헵탄 으로 배산 후 123 ㎎ 의 표제 화합물을 연한 황색 고체로서 수득했다.
MS: 예상된 질량: 1392.7825, 관측된 질량: 1392.7819.
단계 1 에 대한 필수적 디펩티드 빌딩 블록을 다음과 같이 제조했다:
단계 a: (S)-2-[(S)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산
Figure 112013067790681-pct00031
25 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, (S)-2-아미노-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸-아미노)헥산산 (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, 1040 ㎎, 2.48 mmol, Eq: 1.00) 을 CH2Cl2 (12.5 ㎖) 에 용해시켜 엷은 황색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (961 ㎎, 1.27 ㎖, 7.44 mmol, Eq: 3.00) 및 트리메틸클로로실란 (566 ㎎, 621 ㎕, 5.21 mmol, Eq: 2.10) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 20 min 동안 교반했다.
두번째 50 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, (S)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐-아미노)-4-(4-플루오로페닐)부탄산 (1040 ㎎, 2.48 mmol, Eq: 1.00) 을 DMF (12.5 ㎖) 에 용해시켜 무색 용액을 얻었다. 휘니그 염기 (385 ㎎, 506 ㎕, 2.98 mmol, Eq: 1.20) 및 TPTU [125700-71-2] (737 ㎎, 2.48 mmol, Eq: 1.00) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 15 min 동안 교반했다. 상응하는 실릴 에스테르 모노실릴아민을 함유하는 첫번째 플라스크로부터의 용액을 첨가하고, 반응물을 또다른 3 시간 동안 주위 온도에서 교반했다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 5% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 2.10 g 의 표제 화합물을 황색 거품으로서 얻었다.
MS (ISP): (M+H) 820.6.
단계 b: {(S)-2-(4-플루오로-페닐)-1-[((S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-5-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-펜틸카르바모일)-메틸]-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르
Figure 112013067790681-pct00032
250 ㎖ 배-형상 플라스크 내에서, 앞서 합성된 {(S)-2-(4-플루오로-페닐)-1-[((S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-5-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-펜틸카르바모일)-메틸]-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (2.10 g, 2.56 mmol, Eq: 1.00), (4-아미노페닐)메탄올 (315 ㎎, 2.55 mmol, Eq: 1.00), HOAt (349 ㎎, 2.56 mmol, Eq: 1.00) 및 EDC 하이드로클로라이드 (491 ㎎, 2.56 mmol, Eq: 1.00) 를 CH2Cl2 (12.5 ㎖) 에 용해시켰다. 휘니그 염기 (662 ㎎, 871 ㎕, 5.21 mmol, Eq: 2.00) 를 첨가하고, 반응이 밤새 진행되게 놔두었다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl (pH ~7) 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 미가공 생성물을 디에틸 에테르 (1 x 50 ㎖) 로 배산했다; 결과로서 얻은 고체를 여과해내고, 건조시켜 0.796 g 의 표제 화합물을 연한 갈색 고체로서 산출했다.
MS (ISP): (M+H) 925.6.
단계 c: (S)-2-[(S)-3-아미노-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드
Figure 112013067790681-pct00033
50 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 {(S)-2-(4-플루오로-페닐)-1-[((S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-5-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-펜틸카르바모일)-메틸]-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (793 ㎎, 857 mol, Eq: 1.001) 를 THF (12 ㎖) 와 조합하여 갈색빛 용액을 얻었다. 0°에서, 디에틸아민 (1.13 g, 1.59 ㎖, 15.4 mmol, Eq: 18) 을 첨가했다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반했다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl (pH ~7) 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / 10% MeOH / 0.1% NEt3 (CH2Cl2 중) 로 500 ㎎ 의 표제 화합물을 황백색 고체로서 산출했다.
MS: 예상된 질량: 702.3581, 관측된 질량: 702.3578.
실시예 11
4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)-4-페닐부탄아미도)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)헥산아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트
Figure 112013067790681-pct00034
실시예 10 과 유사하게, 그러나 단계 1 에서 (S)-2-((S)-3-아미노-4-페닐부탄아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드를 (S)-2-[(S)-3-아미노-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-페닐부탄산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1374.792, 관측된 질량: 1374.7877.
실시예 12
4-({N~2~-[(3S)-4-(4-클로로페닐)-3-{[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]아미노}부타노일]-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-L-라이실}아미노)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트
Figure 112013067790681-pct00035
실시예 10 과 유사하게, 그러나 단계 1 에서 (S)-2-((S)-3-아미노-4-(4-클로로페닐)부탄아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)-디페닐메틸아미노)헥산아미드를 (S)-2-[(S)-3-아미노-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(4-클로로페닐)-부탄산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS (ISP): (M+H) 1409.9.
실시예 13
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-O-메틸-L-티로실-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00036
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-메톡시페닐)프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)-디페닐메틸아미노)헥산아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-(4-메톡시페닐)프로판산으로부터 앞서 실시예 1 의 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS (ISP): (M+H) 1391.9.
실시예 14
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-D-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-D-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00037
실시예 1 과 유사하게, 그러나 단계 3 에서 (R)-2-((R)-2-아미노-3-페닐-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-헥산아미드를 (S)-2-((S)-2-아미노-3-(4-니트로페닐)-프로판아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 이러한 빌딩 블록을 (R)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-6-아미노헥산산 및 (R)-2-아미노-6-((4-메톡시페닐)-디페닐메틸아미노)헥산산 (참고, Bioconjugate Chem. 2002, 13, 885-869) 으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 합성했다.
MS: 예상된 질량: 1360.7763, 관측된 질량: 1360.7774.
실시예 15
4-({N~2~-[(3S)-3-{[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]아미노}-4-(4-시아노페닐)부타노일]-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-L-라이실}아미노)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트
Figure 112013067790681-pct00038
실시예 10 과 유사하게, 그러나 단계 1 에서 (S)-2-((S)-3-아미노-4-(4-시아노페닐)부탄아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-((4-메톡시페닐)디페닐-메틸아미노)헥산아미드를 (S)-2-[(S)-3-아미노-4-(4-플루오로-페닐)-부티릴아미노]-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드 대신에 커플링 파트너로서 사용하여 제조했다. 전자를 (S)-3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-4-(4-시아노페닐)부탄산으로부터 앞서 단계 a] - c] 에서 기재된 바와 같이 제조했다.
MS: 예상된 질량: 1399.7872, 관측된 질량: 1399.7857.
실시예 16
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00039
단계 1:
(S)-2-((S)-2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드
Figure 112013067790681-pct00040
빌딩 블록 (S)-2-((S)-2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드를 Bioconjugate Chem., Vol. 13, No.4, 2002, 855-869 에 기재된 절차와 유사하게 제조했다
MS (ISP): (M+H) 671.5
단계 2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-6-((4-메톡시페닐)디페닐메틸아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00041
TPTU [125700-71-2](233 ㎎, 784 μmol, Eq: 1.00) 를 DMF (10 ㎖) 중 N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시]-프로필}-숙시남산 (참고, 실시예 1, 단계 2) (426 ㎎, 0.784 mmol, Eq: 1.00) 및 휘니그 염기 (304 ㎎, 411 ㎕, 2.35 mmol, Eq: 3) 의 용액에 첨가했다. 3 분 후 (S)-2-((S)-2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-6-{[(4-메톡시-페닐)-디페닐-메틸]-아미노}-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드 (단계 1) 를 첨가했다. t = 1 h 에서 TLC 는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거했다. 남은 잔류물을 에틸 아세테이트에 흡수시키고, NaHCO3 반포화 용액 (1 X), 칼륨 수소 프탈레이트 용액 0.05M (2 X), 물 (1 X) 및 브린 (1 X) 으로 추출했다. 유기 추출물을 MgSO4 위에서 건조시키고, 감압 하에 농축했다. 미가공 물질을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 (682 ㎎, 513 μmol) 을 연한 갈색 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+H) 1196.8
단계 3:
휘니그 염기 (465 ㎎, 629 ㎕, 3.6 mmol, Eq: 6) 를 THF (20 ㎖) 중 상기 알코올 (718 ㎎, 600 μmol, Eq: 1.00) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (548 ㎎, 1.8 mmol, Eq: 3) 의 용액에 첨가했다. 황색 용액을 밤새 실온에서 교반했다. 용매를 감압 하에 제거했다. 남은 잔류물을 디에틸 에테르로 배산했다. 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세정하고, 감압 하에 건조시켜 표제 화합물 (800 ㎎, 529 μmol) 을 연한 갈색 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+H) 1361.9
실시예 17
단계 1: (S)-2-[(S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-페닐-프로피오닐아미노]-헥산산
Figure 112013067790681-pct00042
상업적으로 입수가능한 L-Fmoc-Phe-OSu (0.969 g, 2.00 mmol, Eq: 1.00) 를 1,2-디메톡시에탄 및 물 (17 ㎖) 의 1:1 v/v 혼합물에 현탁시키고, 0℃ 에서 L-노르류신 (0.275 g, 2.10 mmol, Eq: 1.05) 및 NaHCO3 (0.185 g, 2.20 mmol, Eq: 1.10) 로 처리했다. 냉각 바쓰를 제거하고, 반응이 주위 온도에서 14 h 동안 진행하게 놔두었다. 혼합물을 부순 얼음 / 시트르산 (pH ~3) 위에 붓고, 에틸 아세테이트로 2x 추출하고, H2O 및 브린으로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / AcOEt 로 0.870 ㎎ 의 표제 화합물을 백색 고체로서 산출했다.
MS (ISP): (M+H) 501.2.
단계 2: {(S)-1-[(S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-펜틸카르바모일]-2-페닐-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르
Figure 112013067790681-pct00043
배-형상 플라스크 내에서, 앞서 합성된 (S)-2-[(S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시-카르보닐아미노)-3-페닐-프로피오닐아미노]-헥산산 (10.72 g, 21 mmol, Eq: 1.00), (4-아미노페닐)메탄올 (2.717 g, 22 mmol, Eq: 1.03), 및 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ) (7.994 g, 32 mmol, Eq: 1.50) 을 CH2Cl2 (320 ㎖) 에 용해시키고, 밤새 Ar 의 풍선 하에 교반했다. 혼합물을 부순 얼음 / NH4Cl 위에 붓고, AcOEt 로 2 x 추출하고, H2O 로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 부피를 ~ 300 ㎖ 로 감소시켰다. 침전물을 여과해내고, 건조시켜 5.25 g 의 표제 화합물을 연한 갈색 고체로서 얻었다.
MS (ISP): (M+H ) 606.3.
단계 3: (S)-2-((S)-2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-헥산산 (4-히드록시메틸-페닐)-아미드
Figure 112013067790681-pct00044
둥근바닥 플라스크 내에서, 앞서 제조된 {(S)-1-[(S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-펜틸카르바모일]-2-페닐-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (4.738 g, 7.822 mmol, Eq: 1.0) 를 CH2Cl2 (28 ㎖) 에 용해시켰다. 0°에서, 디에틸아민 (28 ㎖, 19.80 g, 271 mmol, Eq: 35) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반했다. 모든 휘발물을 i.v. 증발시켰다; 그 뒤 플래쉬 크로마토그래피 SiO2 / CH2Cl2 / 10% MeOH, 이어서 AcOEt 로부터의 결정화로, 2.116 g 의 표제 화합물을 연한 갈색 결정으로서 산출했다.
MS (ISP): (M+H ) 384.2.
단계 4
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소헥산-2-일아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00045
실시예 16, 단계 2 와 유사하게 제조했다
MS (ISP): (M+H) 909.7 (M+Na) 931.8.
단계 5
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-노르류신아미드
Figure 112013067790681-pct00046
실시예 16 단계 3 과 유사하게 제조했다
MS 예상된 질량: 1073.6453, 관측된 질량 1073.642
실시예 18
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-알라닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]글라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00047
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00048
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (Novabiochem 01-64-0114, 100-200 메쉬), 1%DVB (18 g, 21.6 mmol, Eq: 1.00) 를 DCM/DMF=1/1 (300 ㎖) 중에서 10 분 동안 팽윤시켰다. 수지를 따라내고, DCM/DMF=1/1 (300 ㎖) 중 FMOC-4-아미노벤질 알코올 (14.9 g, 43.2 mmol, Eq: 2) 및 피리딘 (6.83 g, 6.99 ㎖, 86.4 mmol, Eq: 4) 의 용액을 첨가했다. 혼합물을 밤새 진탕했다. 수지를 따라내고, 메탄올 (300 ㎖) 중 10% 휘니그 염기의 용액으로 캡 (cap) 했다. 수지를 DMF 및 DCM 으로 세정하고, 밤새 HV 와 함께 건조시켜 21.7 g 수지를 수득했다. 로드의 결정으로 0.41 mmoL/g 을 산출했다.
단계 2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(2-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)-1-옥소프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00049
단계 1 로부터의 수지 (1 g, 410 μmol, Eq: 1.00) 를 DMF (2 X) 로 예비세정하고 피페리딘/DMF=1/4 (10 ㎖) 으로 5 및 10 분 동안 처리했다. 수지를 DMF 및 IPA (3 X 10 ㎖) 로 번갈아 세정했다. DMF (10 ㎖) 중 Fmoc-Gly-OH (488 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4), TPTU (487 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 휘니그 염기 (636 ㎎, 859 ㎕, 4.92 mmol, Eq: 12) 의 용액을 5 분 동안 교반한 후, 수지와 함께 1 시간 동안 진탕했다. 수지를 DMF 및 이소프로필 알코올 (3X) 로 번갈아 세정했다.
하기 Fmoc 절단 및 Fmoc-Ala-OH (511 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시]-프로필}-숙시남산 (실시예 1, 단계 2) (892 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 의 후속 커플링을 그에 따라 실시했다. 건조된 펩티드 수지를 약 2 X 30 min 동안 TFA 1%/DCM (2 X 20 ㎖) 중에서 교반했다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 DCM 으로 세정했다. 여과물을 모으고, 용매를 진공 하에 증발시켰다. 미가공 물질을 디에틸 에테르로 배산했다 (2 x ). 플래쉬 크로마토그래피로 정제 후, 생성물 (84 ㎎, 97.3 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:776.5452, 관측된 질량 776.5455
단계 3:
앞서 제조된 알코올 N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(2-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)-1-옥소프로판-2-일)숙신아미드 [RO5545270] (70 ㎎, 90.1 μmol, Eq: 1.00) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (137 ㎎, 450 μmol, Eq: 5) 를 아르곤 하에 실온에서 DMF (4 ㎖) 에 용해시키고, 휘니그 염기 (34.9 ㎎, 47.2 ㎕, 270 μmol, Eq: 3) 로 처리하고, 혼합물이 밤새 반응하도록 놔두었다. 용매를 진공 중에서 제거했다. 결과로서 얻어지는 고체를 디에틸에테르로 배산했다. 고체를 여과로 수집하고, 디에틸 에테르로 세정했다. 생성물을 진공 중에 건조시켜 표제 화합물 (84 ㎎, 80.2 μmol) 을 연한 갈색 고체로서 수득했다.
MS 예상된 질량:941.5514, 관측된 질량 941.5518
실시예 19
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-류실-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-메티오닌아미드
Figure 112013067790681-pct00050
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00051
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 제조했다
단계 2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-4-(메틸티오)-1-옥소부탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00052
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Met-OH (609 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Leu-OH (580 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (208 ㎎, 210 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS (ISP): (M+H) 893.6183
단계 3
실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후, 표제 화합물 (161 ㎎, 137 μmol) 이 연한 갈색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:1057.6174, 관측된 질량 1057.6184
실시예 20
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-류실-N~1~-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-아스파르타미드
Figure 112013067790681-pct00053
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00054
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)-4-메틸펜탄아미도)-N1-(4-(히드록시메틸)페닐)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00055
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Asn-OH (581 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Leu-OH (580 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (87 ㎎, 89.4 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:875.6136, 관측된 질량 875.6133
단계 3
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후 (87 ㎎, 89.4 μmol) 표제 화합물이 연한 갈색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:1040.6198, 관측된 질량 1040.6188
실시예 21
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-알라닐-N~1~-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-아스파르타미드
Figure 112013067790681-pct00056
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00057
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)프로판아미도)-N1-(4-(히드록시메틸)페닐)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00058
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Asn-OH (581 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Ala-OH (511 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (140 ㎎, 159 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS (ISP): (M+H) 834.8 (M+Na) 856.7
단계 3
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후 (169 ㎎, 152 μmol) 그것은 연한 갈색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:998.5729, 관측된 질량 998.5739
실시예 22
N~2~-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-아스파라기닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]글라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00059
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00060
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
(S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)-N1-(2-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-2-옥소에틸)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00061
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Gly-OH (488 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Asn-OH (581 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (140 ㎎, 162 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:819.551, 관측된 질량 819.5503
단계 3: 표제 화합물이 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 연한 갈색 고체로서 수득되었다 (176 ㎎, 161 μmol).
MS 예상된 질량:984.5572, 관측된 질량 984.5489
실시예 23
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]글라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00062
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00063
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(2-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00064
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Gly-OH (488 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Phe-OH (635 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (259 ㎎, 288 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:852.5765, 관측된 질량 852.5754
단계 3
표제 화합물이 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 연한 갈색 고체로서 수득되었다 (280 ㎎, 247 μmol).
MS 예상된 질량:1017.5827, 관측된 질량 1017.5775
실시예 24
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-류실-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]글라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00065
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00066
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-(2-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00067
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Gly-OH (488 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Leu-OH (580 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (240 ㎎, 278 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:818.5921, 관측된 질량 818.5921
단계 3
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후, 그것 (194 ㎎, 177 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:983.5983 관측된 질량 983.6004
실시예 25
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-류실-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-페닐알라닌아미드
Figure 112013067790681-pct00068
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00069
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00070
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Phe-OH (635 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 및 Fmoc-Leu-OH (580 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (153 ㎎, 151 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:908.6391 관측된 질량 908.637
단계 3:
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후, 그것 (117 ㎎, 98 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:1073.6453 관측된 질량 1073.646
실시예 26
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-페닐알라닌아미드
Figure 112013067790681-pct00071
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00072
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다.
단계 2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00073
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Phe-OH (635 ㎎, 1.64 mmol, Eq: 4) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (240 ㎎, 204 μmol) 이 연한 황색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:942.6234 관측된 질량 942.6218
단계 3:
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후, 그것 (190 ㎎, 154 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량:1107.6296 관측된 질량 1107.6287
실시예 27
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-류실-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-류신아미드
Figure 112013067790681-pct00074
단계 1:
FMOC-4-아미노벤질알코올의 2-클로로트리틸 수지에의 첨가
Figure 112013067790681-pct00075
실시예 18, 단계 1 과 유사하게 실시했다
단계 2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00076
실시예 18, 단계 2 와 유사하게, Fmoc-Leu-OH (1.59 g, 4.5 mmol, Eq: 3) 를 아미노산으로서 사용하여 제조했다.
생성물 (254 ㎎, 284 μmol) 이 백색 고체로서 수득되었다
MS 예상된 질량:874.6547 관측된 질량 874.6527
단계 3
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후 그것은 백색 고체로서 수득되었다 (178 ㎎, 168 μmol).
MS 예상된 질량:1039.6609 관측된 질량 1039.6588
실시예 28
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-알라닐-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
Figure 112013067790681-pct00077
단계 1
{(S)-1-[(S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-에틸카르바모일]-에틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르
Figure 112013067790681-pct00078
THF (20 ㎖) 중 Fmoc-Ala-Ala-OH (1 g, 2.61 mmol, Eq: 1.00) 및 (4-아미노페닐)메탄올 (483 ㎎, 3.92 mmol, Eq: 1.5) 의 용액을 EEDQ (970 ㎎, 3.92 mmol, Eq: 1.5) 로 처리했다. 용액을 밤새 실온에서 교반했다. 혼합물을 10% 2-프로판올/에틸 아세테이트 (100 ㎖) 로 희석하고, 용액을 KHSO4 5%/K2SO4 10% (2 X), 물 (1X) 및 브린 (1X) 으로 세정하고, MgSO4 위에서 건조시키고, 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르 중에서 수 분 동안 초음파처리하고, 고체를 여과로 수집하여, 생성물 (1.27 g, 1.2 mmol) 을 연한 갈색 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+H) 488.3
단계 2:
(S)-2-아미노-N-[(S)-1-(4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-에틸]-프로피온아미드
Figure 112013067790681-pct00079
화합물을 실시예 1 단계 c 와 유사하게 제조하여 생성물 (245 ㎎, 877 μmol) 을 연한 황색 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+H) 266.3, (M+Na) 288.2 (2M+H) 531.3
단계 3:
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소프로판-2-일아미노)-1-옥소프로판-2-일)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00080
화합물을 실시예 16 단계 2 와 유사하게 연한 갈색 고체로서 제조했다 (165 ㎎, 198 μmol).
MS 예상된 질량: 790.5608, 관측된 질량 790.5587
단계 4
표제 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 제조했다. 실리카 겔 상에서 정제 후 그것은 백색 고체로서 수득되었다 (99 ㎎, 98.4 μmol).
MS 예상된 질량: 955.567, 관측된 질량 955.5651
실시예 29
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-이소류실-N~1~-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-아스파르타미드
Figure 112013067790681-pct00081
단계 1
(S)-2-[(2S,3S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-메틸-펜타노일아미노]-숙시남산
Figure 112013067790681-pct00082
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (5 g, 7.5 mmol, Eq: 1.00) 를 DCM 중에서 팽윤시킨 후 DCM 중 Fmoc-Asn(Trt)-OH (8.95 g, 15.0 mmol, Eq: 2) 및 휘니그 염기 (3.88 g, 5.1 ㎖, 30.0 mmol, Eq: 4) 의 용액으로 밤새 처리했다. 수지를 DCM 로 세정하고, 메탄올 중 10% 휘니그 염기의 용액으로 캡했다. Fmoc-Ile-OH (5.3 g, 15.0 mmol, Eq: 2) 와 TPTU (4.46 g, 15.0 mmol, Eq: 2) 및 휘니그 염기 (3.88 g, 5.1 ㎖, 30.0 mmol, Eq: 4) 의 커플링을 표준 고체상 펩티드 합성에 따라 실시했다. 생성물을 수지로부터 TFA/물/트리이소프로필실란 (95/2.5/2.5 v/v/v) 의 칵테일로 2 시간 동안 실온에서 절단했다. 수지를 여과하고, 여과물을 감압 하에 작은 부피로 농축했다. 디에틸 에테르로 배산 후, 생성물을 여과하고, 진공 중에서 건조시켜 생성물 (2.85 g, 5.79 mmol) 을 백색 고체로서 수득했다.
MS 예상된 질량: 467.2056, 관측된 질량 467.2056
단계 2
{(1S,2S)-1-[2-카르바모일-1-((S)-4-히드록시메틸-페닐카르바모일)-에틸카르바모일]-2-메틸-부틸}-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르
Figure 112013067790681-pct00083
화합물을 실시예 28 단계 1 과 유사하게 연한 황색 고체로서 제조했다 (620 ㎎, 336 μmol).
단계 3
(S)-2-((2S,3S)-2-아미노-3-메틸-펜타노일아미노)-N*1*-(4-히드록시메틸-페닐)-숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00084
화합물을 실시예 1 단계 c 와 유사하게 연한 황색 고체로서 제조했다 (100 ㎎, 228 μmol).
단계 4
(S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)프로필아미노)-4-옥소부탄아미도)-3-메틸펜탄아미도)-N1-(4-(히드록시메틸)페닐)숙신아미드
Figure 112013067790681-pct00085
화합물을 실시예 16 단계 2 과 유사하게 연한 황색 고체로서 제조했다 (89 ㎎, 91.4 μmol).
단계 5
이전 단계로부터의 화합물을 실시예 18, 단계 3 과 유사하게 표제 화합물과 반응시켰다. 실리카 겔 상에서 정제 후, 그것 (42 ㎎, 36.3 μmol) 이 연한 갈색 고체로서 수득되었다.
MS 예상된 질량: 1040.6198, 관측된 질량 1040.6177
실시예 30
N-[4-({3-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]프로필}아미노)-4-옥소부타노일]-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-D-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00086
화합물을 실시예 16 단계 1 과 유사하게, Fmoc-D-Lys(Boc)-OH 로 출발하여 연한 갈색 고체로서 제조했다 (158 ㎎, 116 μmol).
MS (ISP): (M+H ) 1362.8 (M+Na) 1383.8
실시예 31
N-{15-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-4,15-디옥소-8,11-디옥사-5,14-디아자펜타데칸-1-오일}-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00087
표제 화합물을 실시예 16 과 유사하게 콜레스테롤-올리고-PEG 유도체를 합성의 단계 2 에서 사용하여 제조했다.
MS (ISP): (M+H) 1479.8
단계 2 에 대한 필수적 콜레스테롤-PEG 중간체 N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카르보닐아미노]-에톡시}-에톡시)-에틸]-숙시남산을 다음과 같이 제조했다:
단계 a: {2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-에틸}-카르밤산 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 에스테르
Figure 112013067790681-pct00088
25 ㎖ 디클로로메탄 중 콜레스테릴 클로로포르메이트 (1 g, 2.23 mmol) 의 용액을 교반 하에 75 ㎖ 디클로로메탄 중 2,2'-(에틸렌디옥시)비스-(에틸아민) (495 ㎎, 3.34 mmol) 의 용액에 한방울씩 첨가했다. 반응물을 밤새 실온에서 교반했다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 추출했다. 유기 추출물을 무수 MgSO4 디하이드레이트 위에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 아미노-수식된 실리카 겔 (용리액: MeCl2 -> MeCl2/MeOH=975:25 v/v) 상에서 정제 후 생성물 (615 ㎎) 이 백색, 왁스 같은 (waxy) 고체로서 수득되었다.
MS (ISP): (M+H ) 561.5
단계 b: N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카르보닐아미노]-에톡시}-에톡시)-에틸]-숙시남산
Figure 112013067790681-pct00089
단계 a 로부터의 아민 (480 ㎎, 0.856 mmol) 및 트리에틸아민 (0.13 ㎖, 0.94 mmol) 을 5 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 숙신산 무수물 (90 ㎎, 0.9 mmol) 을 첨가 후 용액을 밤새 실온에서 교반했다. TLC 체크는 아직 약간의 출발 물질을 보였다. 더 많은 숙신산 무수물 (20 ㎎, 0.2 mmol) 을 첨가했다. 반응물을 또다른 3 시간 동안 실온에서 교반 후, 그것을 디클로로메탄으로 희석하고, 5%KHSO4/ 10%K2SO4 혼합물로 세정했다. 유기 추출물을 무수 MgSO4-디하드레이트 위에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 원하는 산 (490 ㎎, 0.667 mmol) 을 수득했다.
MS (ISP): (M+H ) 661.5
실시예 32
N-{30-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-4,30-디옥소-8,11,14,17,20,23,26-헵타옥사-5,29-디아자트리아콘탄-1-오일}-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00090
표제 화합물을 실시예 16 과 유사하게 콜레스테롤 -PEG 유도체를 합성의 단계 2 에서 사용하여 제조했다.
MS (ISP): (M+H) 1699.9
단계 2 에 대한 필수적 콜레스테롤-PEG 중간체 1-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-1,27-디옥소-5,8,11,14,17,20,23-헵타옥사-2,26-디아자트리아콘탄-30- 산을 다음과 같이 제조했다:
단계 a: tert-부틸 [25-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일}옥시)-25-옥소-3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사-24-아자펜타코스-1-일]카르바메이트
Figure 112013067790681-pct00091
콜레스테릴 클로로포르메이트 (476 ㎎, 1.06 mmol) 및 트리에틸아민 (155 uL, 1.113 mmol) 를 5 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 그 후 1 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 알파-아미노-오메가-boc-아미노-옥타(에틸렌 글리콜) (497 ㎎, 1.06 mmol) 의 용액을 첨가했다. 용액을 밤새 실온에서 교반하고, 디클로로메탄으로 희석하고, KHSO4 5%/K2SO4 10% 수성 혼합물로 추출했다. 유기 추출물을 무수 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. 실리카 겔 (용리액: MeCl2/MeOH=975:25 -> 95:5 v/v) 상에서 정제 후 생성물 (530 ㎎, 0.571 mmol) 이 무색 오일로서 수득되었다.
MS (ISP): (M+NH4 ) 898.7
단계 b: 1-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-1,27-디옥소-5,8,11,14,17,20,23-헵타옥사-2,26-디아자트리아콘탄-30- 산
Figure 112013067790681-pct00092
상기 Boc 유도체 (450 ㎎, 0.511 mmol) 를 디옥산 (10.2 ㎖, 40.9 mmol) 중 HCl 4M 에 용해시켰다. 용액을 실온에서 40 min 동안 교반했다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 남은 백색 고체를 5 ㎖ 디클로로메탄에 용해시키고, 트리에틸아민 (32 uL, 0.229 mmol) 및 숙신산 무수물 (11.5 ㎎, 0.114 mmol) 로 밤새 처리했다. 더 많은 숙신산 무수물 (11 ㎎, 0.11 mmol, 0.2 당량) 을 첨가하고, 60 min 후 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, KHSO4 5%/K2SO4 10% 완충액으로 세정했다. 유기 추출물을 무수 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 390 ㎎ 의 원하는 생성물을 수득했다.
MS (ISP): (M+H ) 881.7
실시예 33
N-{66-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-4,66-디옥소-8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62-노나데카옥사-5,65-디아자헥사헥사콘탄-1-오일}-L-페닐알라닐-N~6~-[(4-메톡시페닐)(디페닐)메틸]-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-라이신아미드
Figure 112013067790681-pct00093
표제 화합물을 실시예 16 과 유사하게 콜레스테롤- -PEG 유도체를 합성의 단계 2 에서 사용하여 제조했다.
MS (ISP): (M+H) 2228.1
단계 2 에 대한 필수적 콜레스테롤-PEG 중간체 1-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-1,63-디옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-노나데카옥사-2,62-디아자헥사헥사콘탄-66- 산을 다음과 같이 제조했다:
단계 a: (3베타)-콜레스트-5-엔-3-일 (59-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57 노나데카옥사노나펜타콘트-1-일)카르바메이트
Figure 112013067790681-pct00094
알파, 오메가-비스-아미노 20(에틸렌 글리콜) (538 ㎎, 0.6 mmol) 및 트리에틸아민 (92 uL, 0.66 mmol) 을 15 ㎖ 건조 디클로로메탄에 용해시켰다. 2 ㎖ 건조 디클로로메탄 중 콜레스테릴 클로로포르메이트 (270 ㎎, 0.6 mmol) 의 용액을 실온에서 한방울씩 첨가했다. 용액을 밤새 교반한 후, 진공 중에서 작은 부피로 농축하고 실리카 겔 (용리액: MeCl2/MeOH=95:5 -> 9:4 -> 4:1 v/v) 상에서 직접 정제하여 생성물 (350 ㎎, 0.254 mmol) 을 왁스 같은 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+H) 1309.9
단계 b: 1-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]-1,63-디옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-노나데카옥사-2,62-디아자헥사헥사콘탄-66- 산
Figure 112013067790681-pct00095
단계 a 로부터의 아민 (329 ㎎, 0.251 mmol), 숙신산 무수물 (26.4 ㎎, 0.264 mmol) 및 트리에틸아민 (40 uL, 0.286 mmol) 을 5 ㎖ 건조 디클로로메탄에 용해시켰다. 더 많은 트리에틸아민 (40 uL, 0.286 mmol) 을 첨가 후, 용액 (pH>8) 을 밤새 실온에서 교반했다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, KHSO4 5%/K2SO4 10% 수성 혼합물로 2 회 세정했다. 유기 추출물을 무수 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 생성물 (260 ㎎, 0.175 mmol) 을 무색, 왁스 같은 고체로서 수득했다.
MS (ISP): (M+NH4 ) 1408.9
실시예 34: RNA 접합체의 제조에 관한 일반적 절차
물질
디메틸 술폭시드 (DMSO), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 나트륨 아세테이트 용액 (3 M, pH 5.2) 을 Sigma Aldrich Chemie GmbH (Traufkirchen, Germany) 로부터 구매했다.
RP-HPLC 용 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA) (2.0 M, pH 7.0) 및 아세토니트릴 (ACN, HPLC 품질) 을 Biosolve (Valkenswaard, Netherlands) 로부터 구매했다.
에탄올 (EtOH, p.a.) 을 Merck (Darmstadt, Germany) 로부터 구매했다. Optilab HF (Membra Pure, Germany) 시스템으로부터 정제된 물을 사용했다.
Resource RPC 3 ㎖ 칼럼 (10 x 0,64 ㎝; 15 ㎛ 입자 크기) 을 GE Healthcare (Freiburg, Germany) 로부터 구매했다.
HPLC 정제를 AKTA Explorer 100 시스템 (GE Healthcare) 을 사용하여 실시했다.
아미노-수식된 RNA 의 합성
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 조절 공극 유리 (controlled pore glass) 를 고체 지지체 (Prime Synthesis, Aston, PA, USA) 로서 사용하여 1215 μmol 의 스케일에서 고체상에서 표준 포스포라미다이트 화학에 의해 센스 가닥의 5'-말단에 헥실아미노링커가 달린 RNA 를 생성했다. 상응하는 포스포라미다이트, 2'-O-메틸 포스포라미다이트 및 TFA-헥실아미노링커 아미다이트 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 이용하여 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 를 생성했다. 절단 및 탈보호 뿐만 아니라 정제를 기술분야에서 알려진 방법 (Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84) 에 의해 실시했다.
아미노-수식된 RNA 를 음이온 교환 HPLC (순도: 96.1%) 에 의해 특성분석하고, ESI-MS ([M+H]1+ 계산치: 6937.4; [M+H] 1+측정치: 6939.0) 에 의해 동일성 (identity) 을 확인했다.
서열: 5'-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3'; u, c: 상응하는 RNA 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 뉴클레오티드, s: 포스포르티오에이트.
일반적 실험적 접합 절차
실시예 1-33 의 표제 화합물을 하기 절차에 따라 아미노-수식된 RNA 를 통해 커플링했다:
5'-말단에 C-6 아미노링커가 달린 RNA (16.5 ㎎, 1 당량) 를 500 ㎕ DMSO 및 150 ㎕ 물에 용해시켰다. 1 ㎖ DMSO 에 용해된 p-니트로페닐카르보네이트 유도체 (10 당량) 를 첨가한 후 8 ㎕ DIPEA 를 첨가했다. 반응 혼합물을 35℃ 에서 어둠 속에서 진탕하고, RP-HPLC (Resource RPC 3 ㎖, 완충액: A: 물 중 0.1M TEAA, B: 95% ACN 중 0.1M TEAA, 기울기: 20 CV 중 3% B → 100% B) 를 사용하여 모니터링했다. 반응이 완료되면 -20℃ 에서 EtOH 중 나트륨 아세테이트 (3 M) 를 사용하여 RNA 접합체를 침전시킨다. 예를 들어 디펩티드 모티프 중 MMT 보호성 기를 결여하는 상응하는 접합체를 상기 조건을 사용하여 정제한다. 순수한 분획을 모으고, 물질을 나트륨 아세테이트/EtOH 를 사용하여 침전시켜 원하는 RNA 접합체를 얻는다.
디펩티드 서열 중 MMT 보호성 기를 함유하는 RNA 접합체를 하기 절차에 따라 추가로 가공한다.
MMT 절단에 대한 일반적 절차
미가공 RNA 접합체 펠렛을 500 ㎕ 물 및 1.5 ㎖ 나트륨 아세테이트 완충액 (3 M, pH 5.2 또는 0.1M, pH 4.0) 에 용해시킨다. 용액을 2 일 동안 30℃ 에서 진탕시킨다. 반응 혼합물을 RP-HPLC (Resource RPC 3 ㎖, 완충액: A: 물 중 0.1M TEAA, B: 95% ACN 중 0.1M TEAA, 기울기: 20 CV 중 3% B → 100% B) 를 사용하여 모니터링한다. MMT 보호성 기의 완전한 절단 후 RNA 접합체를 방금 앞서 언급된 조건을 사용하여 직접 정제한다. 순수한 분획을 모으고, 원하는 접합체를 나트륨 아세테이트/EtOH 를 사용하여 침전시킨다.
대조군으로서 디펩티드 모티프를 결여하는 RNA 접합체를 합성했다. 이러한 목적으로 콜레스테롤을 5'-말단에 문헌 (Nature Biotech, 2007, 25, 1149) 에 기재된 링커를 통해 부착했다. 이러한 접합체는 "비-절단성" 으로 언급된다.
모든 RNA 접합체를 RP HPLC 에 의해 순도에 대해 분석하고, 동일성을 ESI MS (네거티브 모드) 에 의해 확인했다. 간략히, RP-HPLC 를 65℃ 칼럼 온도에서 XBridge C18 칼럼 (2.5 x 50 ㎜, 2.5 ㎛ 입자 크기, Waters, Eschborn, Germany) 을 갖춘 Dionex Ultimate 시스템 (Dionex, Idstein, Germany) 에서 실시했다. 기울기 용리를 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP) 및 16 mM 트리에틸아민을 1% 메탄올 중 용리액 A 로서 및 95% 메탄올 중 용리액 B (1% B → 18%B, 30 분 이내) 로서 사용하여 실시했다. UV 탐지를 260 ㎚ 에서 기록했다. 질량 분광 분석을 위해 마이크로-스프레이 소스 (micro-spray source) 및 이온 트랩 탐지기 (ion trap detector) 가 있는 ThermoFinnigan LCQ DecaXP ESI-MS 시스템을 HPLC 시스템에 온라인으로 연결했다.
식 (IIa) 의 특정 화합물의 예가 표 1 에 개시되어 있다. 결과로서 얻어지는 화합물을 "디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체" 에 참조하고, 여기서 구체적 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체는 또한 "표제 화합물 Ex X- (NHC6)-(siRNA 서열)" 및 "실시예 X 의 표제 화합물 함유 siRNA" 로 언급된다.
siRNA 제조
안티센스 서열: 5'-uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3'
u, c: 상응하는 RNA 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 뉴클레오티드, s: 포스포르티오에이트
아포지방단백질 B mRNA 에 대해 지향되는 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체를 어닐링 완충액 (20 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8; 100 mM 나트륨 클로라이드) 중 상보적 가닥의 등몰 용액을 혼합하여 생성하고, 3 분 동안 80-85℃ 에서 수조에서 가열하고, 3 - 4 시간에 걸쳐 실온으로 냉각시켰다. 네이티브 (native) 겔 전기영동에 의해 듀플렉스 형성을 확인했다.
모든 제조된 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체가 표 2 에 열거되어 있다.
표 1: 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체 (5'-3') 및 분석적 데이타. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. (NHC6) 은 센스 가닥의 5'-말단에 통합된 아미노헥실 링커이다.
Figure 112013067790681-pct00096
표 2: 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체. 마지막 항목 (SEQ ID NO 쌍 266/154) 은 디-펩티드 모티프를 결여하는 siRNA 접합체를 나타낸다. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. (NHC6) 은 센스 가닥의 5'-말단에 통합된 아미노헥실 링커이다.
Figure 112013067790681-pct00097
Figure 112013067790681-pct00098
실시예 35: 생체내 실험
디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체 및 전달 중합체의 생체내 동시-투여
6 ~ 8 주령 마우스 (품종 C57BL/6 또는 ICR, 각각 ~18-20 g) 를 Harlan Sprague Dawley (Indianapolis IN) 로부터 수득했다. 마우스를 주사하기 2 일 이상 전에 수용했다. 급식을 Harlan Teklad Rodent Diet (Harlan, Madison WI) 로 무제한으로 실시했다.
마우스 (1 군 당 n=3) 에게 전달 중합체의 0.2 ㎖ 용액 및 0.2 ㎖ 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체의 혼합물을 주사했다. 주사한 용량은, 다르게 언급되지 않으면, 전달 중합체에 대해 15 ㎎/㎏ 및 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체에 대해 0.1 ㎎/㎏ 이었다. 용액을 꼬리 정맥 내로 주입하여 주사했다. 주사 48 시간 후 혈청 ApoB 수준을 하기 절차에 따라 등장성 글루코스 처리된 동물에 대해 측정했다.
혈청 ApoB 수준 측정.
마우스를 턱밑 출혈에 의한 혈청 수집 전 4 h 동안 단식시켰다. 혈청 ApoB 단백질 수준을 표준 샌드위치 ELISA 방법에 의해 측정했다. 간략히, 폴리클로날 염소 항-마우스 ApoB 항체 및 토끼 항-마우스 ApoB 항체 (Biodesign International) 를 각각 포획 및 탐지 항체로서 사용했다. HRP-접합된 염소 항-토끼 IgG 항체 (Sigma) 를 그후 적용하여 ApoB/항체 복합체에 결합시켰다. 테트라메틸-벤지딘 (TMB, Sigma) 비색 전개의 흡광도를 그후 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 판독기에 의해 450 ㎚ 에서 측정했다.
도 1 에서 다양한 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체가 이 절에서 앞서 합성된 콜레스테롤에 접합된 그러나 절단성 모티프를 결여하는 동일한 siRNA 에 대해 벤치마크 (benchmark) 되었다. 디-펩티드 함유 접합체의 영향을 비-절단성 대조군에 대해 평가하기 위해 혈청 ApoB 수준에 대한 이러한 siRNA 접합체 (SEQ ID NO 쌍 266/154, "비-절단성 대조군") 의 효과를 1 로 설정했다. 최초에 사용된 Phe-Lys 모티프 (실시예 16 의 표제 화합물 함유 siRNA) 를 상응하는 D-아미노산 (실시예 14 의 표제 화합물 함유 siRNA) 으로 치환하거나 단지 Lys 를 비자연적 거울상이성질체 (실시예 30 의 표제 화합물 함유 siRNA) 로 대체하는 것은 비-절단성 대조군 siRNA 보다 덜 현저한 또는 그와 동등한 ApoB 감소를 초래했다. Lys 를 Gly (실시예 23 의 표제 화합물 함유 siRNA) 으로 또는 Phe 를 p-메톡시페닐알라닌 (실시예 13 의 표제 화합물 함유 siRNA) 으로 대체하는 것은 실시예 16 의 표제 화합물 함유 siRNA 에 비해 효능을 감소시켰다. 기타 디-펩티드 모티프 함유 siRNA 접합체가 원래의 Phe-Lys 함유 접합체만큼 효과적인 것으로 밝혀졌다.
도 2 는 Phe-Lys 모티프로 이루어지는 실시예 16 의 표제 화합물 함유 siRNA 만큼 효과적이었거나 그보다 개선된 효능을 가졌던 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체를 요약한다. 모든 이들 접합체는 "비-절단성" 콜레스테롤 siRNA 접합체 SEQ ID NO 쌍 266/154 에 비해 유의하게 더욱 활성이었다. 가장 성능이 좋은 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체는 Phy-Lys 모티프 (실시예 8 의 표제 화합물 함유 siRNA, 실시예 9 의 표제 화합물 함유 siRNA) 중 불소 수식된 페닐 고리를 가졌거나 또는 페닐알라닌이 베타-페닐알라닌 (실시예 11 의 표제 화합물 함유 siRNA) 또는 그의 유도체 (실시예 10 의 표제 화합물 함유 siRNA) 로 치환되었었다.
D-아미노산으로 이루어지는 디-펩티드 모티프를 함유하는 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체는 비-절단성 대조군 접합체와 성능이 동등하므로, 기타 디-펩티드 서열이 실제로 생체내에서 프로테아제 활성에 의해 절단된다고 생각할 수 있다. 그러나, 상이한 아미노산 및 그의 유도체의 광범위한 수용을 고려해볼 때 문헌 (Bioconjugate Chem. 2002,13,855) 에서 시사된 바와 같이 1 개 초과의 효소가 절단 반응에 참여할 확률이 높다.
도 3 에서 나타나는 바와 같이, siRNA 와 소분자 리간드 콜레스테롤 사이의 카텝신 절단성 디-펩티드 모티프 (이 경우 Phe-Lys, 실시예 16 의 표제 화합물 함유 siRNA) 의 통합은 직선형 콜레스테롤 siRNA 접합체 (SEQ ID NO 쌍 266/154) 에 비해 siRNA 접합체의 효능을 증가시킨다. PEG 기반 링커를 이용한 디-펩티드 모티프로부터 콜레스테롤 리간드의 추가의 간격두기는 PEG 링커의 길이에 비례하여 효능을 감소시킨다.
도 4 에서 중합체 용량은 15 ㎎/㎏ 에서 일정하게 유지되었다. siRNA 용량을 적정하고, 혈청 ApoB 함량에 대한 효과를 측정했다. Phe-Lys (F-K) 모티프를 함유하는 디-펩티드 함유 콜레스테롤 siRNA 접합체는 디-펩티드 서열을 결여하는 대조군 접합체에 비해 유의하게 더욱 강력했다.
실시예 36: 2'-수식된 올리고리보뉴클레오티드 합성
올리고리보뉴클레오티드를 고체상에서 포스포라미다이트 기술에 따라 합성했다. 스케일에 따라 ABI 394 합성기 (Applied Biosystems) 또는 AKTA oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 을 사용했다. 합성을 조절 공극 유리 (CPG, 520Å, 75 μmol/g 의 로딩으로, Prime Synthesis, Aston, PA, USA 로부터 수득함) 로 만들어진 고체 지지체에서 실시했다. 모든 2'-수식된 RNA 포스포라미다이트 뿐만 아니라 보조 시약을 SAFC (Hamburg, Germany) 로부터 구매했다. 구체적으로, 하기 2'-O-메틸 포스포라미다이트를 사용했다: (5'-O-디메톡시트리틸-N 6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포라미다이트, 5'-O-디메톡시트리틸-N 4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포라미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N 2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포라미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포라미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포라미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호성 기를 보유했다. 모든 아미다이트를 무수 아세토니트릴 (100 mM) 에 용해시키고, 분자 체 (3Å) 를 첨가했다. 5'-포스페이트를 생성하기 위해 Glen Research (Sterling, Virginia, USA) 로부터의 2-[2-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)에틸술포닐]에틸-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포라미다이트를 사용했다. 올리고머의 5'-말단에 C-6 아미노링커를 도입하기 위해 Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, Wisconsin, USA) 으로부터의 6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포라미다이트를 이용했다. 합성 사이클의 임의의 수식 없이 5'-수식을 도입했다. 5-에틸 티오테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 500 mM) 을 활성제 용액으로서 사용했다. 커플링 시간은 6 분이었다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해 무수 아세토니트릴/피리딘 (1:1 v/v) 중 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온 (DDTT, AM Chemicals, Oceanside, CA, USA 로부터 수득함) 의 50 mM 용액을 이용했다.
실시예 37: 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호.
고체상 합성의 완료 후, 건조된 고체 지지체를 15 ㎖ 튜브로 이동시키고, 농축된 수성 암모니아 (Aldrich) 로 18 시간 동안 40℃ 에서 처리했다. 원심분리 후 상청액을 새로운 튜브로 이동시키고, CPG 를 수성 암모니아로 세정했다. 조합된 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 완충액 A 중에서 재구성했다 (참고, 이하).
실시예 38: 올리고리보뉴클레오티드의 정제
AKTA Explorer 시스템 (GE Helthcare) 및 Source Q15 (GE Helthcare) 로 충전된 칼럼을 사용하여 음이온 교환 HPLC 에 의해 미가공 올리고머를 정제했다. 완충액 A 는 10 mM 나트륨 퍼클로레이트, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4 (Fluka, Buchs, Switzerland) 이었고, 20% 아세토니트릴을 함유했고, 완충액 B 는 완충액 A 와 500 mM 나트륨 퍼클로레이트를 제외하고는 동일했다. 32 칼럼 부피 (CV) 내에서 22%B → 42%B 의 기울기를 이용했다. 280 ㎚ 에서 UV 트레이스 (trace) 를 기록했다. 적당한 분획을 모으고, 3M NaOAc, pH=5.2 및 70% 에탄올로 침전시켰다. 마지막으로, 펠렛을 70% 에탄올로 세정했다.
실시예 39: 올리고리보뉴클레오티드를 어닐링하여 siRNA 를 생성함
등몰 RNA 용액을 조합하여 상보적 가닥을 혼합했다. 혼합물을 동결건조시키고, 적당한 부피의 어닐링 완충액 (100 mM NaCl, 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8) 으로 재구성하여 원하는 농도를 달성했다. 이러한 용액을 95℃ 의 수조 내에 배치하고, 수조를 3 h 내에 실온으로 냉각시켰다.
실시예 40: 2'-OH 잔기가 없는 siRNA 의 시험관내 활성
임의의 2'-OH 잔기를 결여하는 siRNA 가 강력한 시험관내 녹 다운 활성을 보이는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 상이한 2'-수식 화학 (SEQ ID 쌍 31/32 ~ 149/150, 예를 들어 표 3 참고) 을 갖는 EGFP mRNA-표적화되는 siRNA 의 패널을 시험했다. COS7 세포 (DSMZ, Braunschweig, Germany, cat. No. ACC-60) 에서 psiCHECK2 벡터 (Promega) 를 사용하여 Dual-Glo® 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega) 으로 센스 및 안티센스 활성에 대해 siRNA 를 스크리닝했다. 센스 및 안티센스 가닥에 의해 부여되는 침묵 활성을 다루기 위해 우리는 각각의 상응하는 19mer 표적 자리 서열을 별도의 psiCHECK2 구축물 (안티센스 활성에 대해 psiCHECK2-AT, 센스 활성에 대해 psiCHECK2-ST) 로서 합성 레닐라 루시퍼라제의 번역 종결 코돈의 3' 에 위치하는 다중 클로닝 영역 내로 클로닝했다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019) 을 사용하여 COS7 세포를 벡터 구축물 및 클로닝된 표적 자리에 상보적인 3nM 의 상응하는 siRNA 로 동시 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 효율을 고려하여 반딧불이 루시퍼라제 수준으로 표준화된 레닐라 루시퍼라제의 활성을 통해 트랜스펙션한지 24 시간 후에 성공적인 siRNA-매개되는 침묵이 확인되었다 (참고, 안티센스 활성에 대해 도 5a 및 센스 활성에 대해 도 5b).
표 3: 2'-수식에 의존적인 시험관내 녹 다운 활성의 확인에 사용된 예시적 siRNA 서열 및 화학적 수식. 이러한 연구에 사용된 레퍼런스 듀플라이스 (duplices) 및 상응하는 수식 변이체의 선별된 예. Xf 는 뉴클레오티드 X 의 2'-플루오로 수식을 나타내고, 소문자는 2'-O-메틸 수식을 나타내고, 밑줄친 문자는 DNA 뉴클레오티드를 나타내고, 모든 기타 대문자는 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 문자 "p" 는 5'-포스페이트를 나타낸다.
Figure 112013067790681-pct00099
5 개의 가장 강력한 수식된 siRNA (≥ 60% 녹-다운) 가 교대 2'-플루오로/2'-O-메틸 (2'F/2'-OMe) 패턴으로 디자인되었음이 밝혀졌다. 모든 시험된 2'F/2'-OMe 변이체에 대한 결여 또는 최소 레닐라 루시퍼라제 활성으로 나타나는 바와 같이, 안티센스 활성을 부여하는 한편, 이러한 화학은 상응하는 센스 가닥의 활성을 완전히 제거했다.
우리는 그러한 2'F/2'-OMe 패턴이 siRNA 의 의도된 안티센스 가닥 활성을 촉진하는 한편 센스 가닥에서 비롯되는 원치않는 표적 이탈 효과 (off-target effect) 가 완전히 억제된다는 결론을 내렸다. 이러한 디자인은 2'O-지시되는 핵산분해 절단에 대한 보호가 필요한 siRNA 에 특히 바람직하다.
실시예 41: 시험관내 검정에 의한 DNAse II-민감성 자리의 탐지
단일 및 이중 가닥 RNA 의 시험관내 안정성을 시험하기 위해 전기분무 이온화 (ESI) 질량 분광분석 (MS) 또는 음이온 교환 (AEX)-HPLC 기반 방법과 연결된 이온 짝형성 (IP) 역상 (RP) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 확립했다.
방법 설명: 안정성 분석을 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 의 10 μM 용액을 37℃ 에서 0.8 또는 8 유닛 DNase II (소 비장으로부터, Type V, Sigma Aldrich) 를 함유하는 5mM 나트륨 아세테이트 완충 용액 (pH 4.5) 중에서 인큐베이션했다. 100 mM 트리에틸 암모늄 아세테이트 (TEAA) 용액을 첨가하고, pH 를 7 로 이동시키고, DNase II 효소를 불활성화시킴으로써 인큐베이션 반응을 중단시켰다. UV-탐지와 조합된 LC/MS 에 의해 또는 UV-탐지와 AEX-HPLC 에 의해 분석을 실시했다. 260 ㎚ 에서의 UV-탐지 트레이스를 정량적 분석에 사용했고, MS 데이타는 RNA 서열 내의 절단 자리 동정을 위해 역할을 했다.
A. IP-RP-HPLC 를 65℃ 칼럼 온도에서 Waters XBridge C18 칼럼 (2.5 x 50 ㎜, 2.5 ㎛ 입자 크기) 을 이용하여 실시했다. 용리액 A 로서 1% 메탄올 중 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP) 및 16 mM 트리에틸아민 및 용리액 B 로서 95% 메탄올 중 조성물 A 를 사용하여 기울기 용리를 실시했다. 30 분 이내 1% B → 18% B 의 기울기를 이용했다.
B. AEX-HPLC 를 50℃ 에서 Dionex DNA Pac200 칼럼 (4 x 250 ㎜) 상에서 pH=11 에서 10% ACN 을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액을 사용하여 실시했다. 용리액 B 는 용리액 A 중 1 M NaBr 을 함유했다. 18 분 이내 25 → 62% B 의 기울기를 이용했다.
표 4: DNase II 에 대한 안정성에 대해 평가된 듀플렉스 및 나머지 무손상 가닥. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 대문자 A, C, G, U 에 뒤이어 "f" 는 2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 소문자 "p" 는 5'-포스페이트를 나타낸다. (invdT) 는 역방위 (inverted) 데옥시티미딘 (3'-3'-연결됨) 을 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. dT 는 데옥시티미딘이다. (NHC6) 은 센스 가닥의 5'-말단에 통합된 아미노헥실 링커이다.
Figure 112013067790681-pct00100
결론:
A. 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 가닥 (예를 들어 SEQ ID NO 쌍 157/158 의 양쪽 가닥) 은 시클릭 5가 중간체를 통해 신속히 붕괴하여, 5'-절단 산물에서 2'-3' 시클릭 포스페이트를 초래한다. 5가 중간체의 형성은 2'-OH 기를 결여하는 뉴클레오티드, 예컨대 예를 들어 2'-데옥시, 2'-OMe 또는 2'-F 를 사용하여 저해될 수 있다.
B. 부가적으로, RNA 는 5'-말단 뉴클레오티드 상의 2'-수식으로부터 독립적인, 5'-핵산말단분해 경로를 통해 붕괴된다. 이러한 붕괴 경로는 5'-말단 비-뉴클레오티드 모이어티, 예컨대 예를 들어 C6-아미노링커 (예를 들어 SEQ ID NO 쌍 160/159 중 SEQ ID NO 160 또는 SEQ ID NO 쌍 165/166 중 SEQ ID NO 165) 또는 첫번째 뉴클레오티드간 연결에서 포스포로티오에이트 (예를 들어 SEQ ID NO 쌍 160/159 중 SEQ ID NO 160) 를 사용하여 저해될 수 있다.
C. 5'-포스페이트 기는 핵산말단분해성 절단 동역학을 감속시키지만, 이러한 말단 (예를 들어 SEQ ID NO 쌍 160/159 중 SEQ ID NO 160) 에서 출발하는 붕괴를 완전히 차단할 수는 없다. 이는 포스파타제에 의한 또는 DNase II 효소의 고유의 포스파타제 활성에 의한 5'-포스페이트의 절단으로 인한 것일 가능성이 가장 높다.
D. 최선의 보호는 두번째 뉴클레오티드 (예를 들어 SEQ ID NO 쌍 173/174 중 SEQ ID NO 173) 에 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 5'-말단에서 2'-OMe 뉴클레오티드로 출발하는, 가닥 내에 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드로 달성되었다. 기타 말단 비-2'-OH 뉴클레오티드도 또한 5'-말단 붕괴로부터 보호하지만, 2'-OMe 수식에 비해 더 적은 정도로이다 (표 9 참고).
실시예 42: 2'-OH 잔기가 없는 siRNA 의 생체내 녹 다운 활성
생체내 실험을 DPC-GalNac 와 동시-투여된 인자 VII (FVII)-표적화 siRNA (SEQ ID NO 쌍 179/166 및 180/168, 표 5 참고) 가 주사된 마우스로 실시했다.
표 5 a: 생체내 실험에 대한 siRNA 의 서열. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 대문자 A, C, G, U 에 뒤이어 "f" 는 2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 소문자 "p" 는 5'-포스페이트를 나타낸다. (invdT) 는 역방위 데옥시티미딘 (3'-3'-연결됨) 을 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. dT 는 데옥시티미딘이다. (NHC6) 은 센스 가닥의 5'-말단에 통합된 아미노헥실 링커이다. GalNAc 는 식 (IV) 중 구조를 나타낸다.
Figure 112013067790681-pct00101
센스 및 안티센스 가닥 상에 교대 2'-OMe/2'-F 패턴을 갖는 FVII siRNA 를 안티센스 상의 5'-말단 2'-OMe 뉴클레오티드 및 센스 가닥 상의 5'-말단 2'-F 가닥으로 생성했다. 양쪽 가닥을 3'-말단 오버행에서 inv(dT) 에 의해 보호한다. 안티센스 가닥은 5'-포스페이트 기를 보유하여 siRNA 의 활성을 유지한다. 센스 가닥은 아시알일로당단백질-수용체에 의한 간세포로의 표적화를 위해 그것의 5'말단에서 GalNAc-팔미토일 구축물에 접합되었다. siRNA (2.5 ㎎/㎏) 를 마우스에서 GalNAc-표적화되는 PBAVE (15 ㎎/㎏) 와 동시-투여했다.
FVII mRNA 측정을 간 균질액으로부터 QuantiGene 1.0 브랜치드 (branched) DNA (bDNA) 검정 키트 (Panomics, Fremont, Calif., USA,Cat-No: QG0004) 를 사용하여 실시했다.
부검시 1-2 g 간 조직을 액체 질소 중에서 급속 (sanp) 동결시켰다. 동결된 조직을 드라이 아이스 위에서 막자사발 및 피스틸 (pistil) 로 분말화했다. 15-25 ㎎ 의 조직을 차갑게한 1,5 ㎖ 반응 튜브에 옮기고, MilliQ 물에 미리희석된 1 ㎖ 1:3 용해 (Lysis) 혼합물 및 3,3 ㎕ 프로테이나제 K (Proteinase K) (50㎍/㎕) 를 첨가하고, 조직을 몇초 동안 30-50% 파워에서의 초음파처리 (HD2070, Bandelin, Berlin, Germany) 에 의해 용해시켰다. 용해물을 -80℃ 에서 분석 전까지 저장했다. mRNA 분석을 위해 용해물을 해동하고, 65℃ 에서 항온혼합기 (thermomixer) (Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany) 내에서 1000 rpm 으로 15 min 동안 프로테이나제 K 로 소화시켰다. FVII 및 GAPDH mRNA 수준을 QuantiGene 1.0 bDNA 검정 키트 시약을 제조사의 권고에 따라 사용하여 측정했다. FVII mRNA 발현을 20 ㎕ 용해물 및 마우스 FVII 프로브 세트를 사용하여 분석했다. GAPDH mRNA 발현을 40 ㎕ 용해물 및 마우스와 교차반응하는 것으로 밝혀진 랫트 (rattus norwegicus) 프로브 세트를 사용하여 분석했다 (프로브세트의 서열 상기 참조). 검정 판독으로서 검정의 마지막에 화학발광 신호를 Victor 2 광 발광 계수기 (Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany) 에서 상대 광 단위 (relative light unit) (RLU) 로서 측정했다. FVII mRNA 에 대한 신호를 동일한 용해물로부터의 GAPDH mRNA 에 대한 신호로 나누었다. 값은 GAPDH 로 표준화된 FVII mRNA 발현으로서 보고된다.
결과는 SEQ ID NO 쌍 179/166 을 투여한 후 투여후 48 시간에서 79% FVII mRNA 녹 다운을 입증한다. 대조적으로, 2'-OH 뉴클레오티드 보유 siRNA SEQ ID NO 쌍 180/168 은 유의한 녹 다운 (< 25 %) 을 보이지 않았으며, 이는 표 5 에 나타나 있다.
표 5 b: 생체내 녹다운 연구의 결과
Figure 112013067790681-pct00102
실시예 43: 2'-OH 잔기가 없는 siRNA 의 조직 분포
간 조직 샘플 중 siRNA 농도를 WO2010043512 에 기재된 사유 (proprietary) 올리고뉴클레오티드 탐지 방법을 사용하여 측정했다. 간략히, siRNA 정량화는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 형광 (Atto-425) 라벨링된 PNA-프로브 (Atto425-OO-GCAAAGGCGTGCCAACT, Panagene Inc, Korea 로부터 수득됨) 의 혼성화에 뒤이은, AEX-HPLC 기반 분리에 기초한다. 생체내 실험 (참고, 실시예 42) 에서 사용한 FVII siRNA 의 희석 시리즈로부터 생성된 외 보정 곡선 (external calibration curve) 에 대한 형광 탐지에 의해 정량화를 실시했다. 혈청 샘플에 대해 0.2 ~ 2 ㎕ 및 조직에 대해 ~ 1 ㎎ 분취량을 HPLC 시스템 상으로 주입했다.
2'-OH 뉴클레오티드를 결여하는 안정화된 siRNA 의 간 조직 분석은 간 중 ug/g 범위의 고농도의 무손상 안티센스 가닥을 나타냈으나, ~ 95% 는 5'-탈인산화된 불활성 형태로 존재했다 (참고, 표 IR.04). 결과로서 얻어지는 말단 2'-OMe 뉴클레오티드 함유 RNA 는 세포질에서 포스포키나제 hClp1 에 의해 재인산화되는 경향이 없다 (참고, 하기). 대조적으로, 2'-OH 함유 siRNA 의 안티센스 가닥은 조직에서 투약 후 최초 6 시간 내에 완전히 붕괴되었다.
표 6: 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하지 않는 안정화된 siRNA 의 간 조직 분석
Figure 112013067790681-pct00103
실시예 44: 최적화된 5'-말단을 갖는 siRNA 의 시험관내 녹 다운 활성
세포내에서 안티센스의 5'-말단에서 (재)인산화되어 RNAi-적격 종을 초래할 수 있는 siRNA 를 동정하기 위해 FVII siRNA 에 대한 부가적 시험관내 스크린을 실시했다. 상기 스크린으로부터의 모든 siRNA 가 표 7 에 나타나 있다. 교대 2'-OMe/2'F 수식 패턴은 제 1 세대 디자인 (어떠한 2'-OH 잔기도 없음) 과, 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 2 개의 뉴클레오티드에서의 다양한 수식을 제외하고는, 동일했다. 안티센스 가닥의 2 개의 5'-말단 뉴클레오티드를, 부가적 5'-포스페이트 또는 5'-포스포티오에이트와 다양하게 조합된 또는 이들이 없는 2'-F 또는 2'-데옥시 수식된 뉴클레오티드로서 생성했다. 모든 siRNA 를, Lipofectamine 2000 을 제조사의 지침에 따라 이용하여 1 차 마우스 간세포 (웰 당 30000 세포; 96 웰 플레이트 포르메이트) 의 트랜스펙션 후 녹 다운 활성에 대한 투여량 반응 (4배 희석으로 24 nM 내지 0.00037 nM) 으로 스크리닝했다. 2 개의 siRNA 가 부모 듀플렉스 (SEQ ID NO 쌍 182/168) 와 비슷하게 활성이었다; IC50 값의 면에서 비슷하게 활성인 siRNA (SEQ ID NO 쌍 181/186 및 181/185), 하나는 5'-말단 2'-F 및 포스페이트 기를 갖고, 하나는 2 개의 5'-말단 2'-데옥시 뉴클레오티드 및 5'-포스포로티오에이트를 가짐 (IC50 값에 대해 표 7 참조). 이들 둘다는, 말단 2'-OMe 뉴클레오티드를 갖는 첫번째 동물 실험에서 사용된 siRNA (SEQ ID NO 쌍 181/166) 와 비교시 ~5-6-배 더욱 활성이다.
표 7: IC 50 값
Figure 112013067790681-pct00104
실시예 45: 최적화된 5'-말단을 갖는 siRNA 의 시험관내 5'-인산화
표 7 에 열거된 5'-포스페이트 또는 5'-포스포로티오에이트가 없는 모든 siRNA 를 HeLa S100 세포 추출물 중 hClp1 에 의한 인산화에 대해 평가했다. 5'-인산화를 Weitzer 및 Martinez (S. Weitzer and J. Martinez. hClp1: a novel kinase revitalizes RNA metabolism. Cell Cycle 6 (17):2133-2137, 2007) 에 의해 기재된 바와 같이 S100 HeLa 추출물로부터 분석했다. 5mM ATP 를 함유하는 S100 HeLa 추출물 중 1 ｕM siRNA 의 인큐베이션 직후, 용액을 5 ㎕ 샘플 용액의 주입에 의한 변성 조건 하의 IP-RP-HPLC 또는 AEX-HPLC 에 의해 분석했다:
A. IP-RP-HPLC 를 Waters XBridge C18 칼럼 (2.5 x 50 ㎜, 2.5 ㎛ 입자 크기) 을 65℃ 칼럼 온도에서 이용하여 실시했다. 용리액 A 로서 1% 메탄올 중 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP) 및 16 mM 트리에틸아민 및 용리액 B 로서 95% 메탄올 중 조성물 A 를 사용하여 기울기 용리를 실시했다. 30 분 이내 1% B → 18% B 의 기울기를 이용했다.
B. AEX-HPLC 를 pH=11 에서 10% ACN 을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액을 사용하여 50℃ 에서 Dionex DNA Pac200 칼럼 (4 x 250 ㎜) 상에서 실시했다. 용리액 B 는 용리액 A 중 1M NaBr 을 함유했다. 18 분 이내 25 → 62% B 의 기울기를 이용했다.
5'-인산화의 비를 하기 등식을 사용하여 260 ㎚ 에서의 UV 트레이스로부터 siRNA 의 각 가닥에 대해 산출한다 (PA 는 피크 면적임):
% (5'-인산화) = 100 * PA [5'-인산화된 가닥] / (PA [5'-인산화된 가닥] + PA [부모 가닥])
표 8 에 나타난 바와 같이, 2'-OMe 뉴클레오티드가 5'-말단에 위치할 때 (SEQ ID NO 쌍 181/196 및 SEQ ID NO 쌍 181/195), siRNA 의 안티센스 가닥은 5'-인산화될 수 없다. 그와 대조적으로 2'-F, 2'-데옥시 또는 2'-OH 뉴클레오티드가 5'-말단에 통합되어 있을 때 (SEQ ID NO 쌍 181/195, SEQ ID NO 쌍 181/192, SEQ ID NO 쌍 181/197, SEQ ID NO 쌍 181/199 및 SEQ ID NO 쌍 182/168), 안티센스 가닥은 5'-인산화되기 쉽다. 시험관내 검정에서 부모 SEQ ID NO 쌍 182/168 과 비슷하게 활성이었던 2 개의 siRNA (SEQ ID NO 쌍 181/186 및 181/185) 는, 일단 합성적으로 도입된 5'-포스페이트 / 5'-PTO 기가 생체내에서 예를 들어 포스파타아제에 의해 절단되면 5'-인산화되기 쉽다.
표 8: S100 HeLa 세포 추출물 중 4 시간 인큐베이션 후 5'-인산화된 가닥의 백분율. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 대문자 A, C, G, U 에 뒤이어 "f" 는 2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. (invdT) 는 역방위 데옥시티미딘 (3'-3'-연결됨) 을 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. dT 는 데옥시티미딘이다.
Figure 112013067790681-pct00105
실시예 46: 최적화된 5'-말단을 갖는 siRNA 의 시험관내 DNAse II-안정성
모든 안티센스 가닥을 실시예 41 에 기재된 바와 같이 DNAse II 안정성에 대해 스크리닝했다. 부모 듀플렉스와 비슷하게 활성이었던 siRNA 에 존재하는 2 개의 안티센스 가닥 (SEQ ID NO 186 및 SEQ ID NO 쌍 185, 하나는 5'-말단 2'-F 및 포스페이트기를 갖고, 하나는 2 개의 5'-말단 2'-데옥시 뉴클레오티드 및 5'-포스포르티오에이트를 가짐) 은 DNAse II 절단 II 에 대해 안정적이다 (20 시간 인큐베이션 후 무손상 가닥 >70%).
표 9: 20 시간 인큐베이션 후 DNase II 에 대한 siRNA 의 시험관내 안정성
Figure 112013067790681-pct00106
실시예 47: 최적화된 5'-말단을 갖는 siRNA 의 생체내 녹 다운 활성
최적화된 5'-말단에 의한 시험관내 개선이 생체내 상황으로 이동하는지 여부를 평가하기 위해, 우리는 선별된 siRNA 의 GalNAc-팔미토일 접합체로 추가의 마우스 실험을 실시했다 (표 10 참조). SiRNA 를 첫번째 마우스 실험 (실시예 42, 본 특허 출원) 에 대해 기재된 바와 동일한 조건 하에 투여했다.
FVII 수준 측정을 위해, 마우스로부터의 혈장 샘플을 표준 절차에 따라 0.109 mol/ℓ 나트륨 시트레이트 항응고제 (1 부피) 를 함유하는 마이크로원심분리기 튜브 내로 턱밑 출혈에 의해 혈액을 수집 (9 부피) 함으로써 준비했다. 혈장 중 FVII 활성을 BIOPHEN VII 키트 (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH) 를 제조사의 권고에 따라 사용하여 발색 방법으로 측정했다. 비색 전개의 흡광도를 405 ㎚ 에서 Tecan Safire2 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했다.
조사 중인 siRNA 는 개선된 생체내 활성을 보였으며, 이는 시험관내 스크리닝 결과와 전적으로 상관관계가 있다. 혈청 중 FVII 활성은 제 1 세대 DNase II 안정성 siRNA 디자인을 이용할 때의 49% 에 비해, 투여한지 48 시간 후 siRNA 양자 모두에 대해 80% 초과 만큼 감소했다 (표 10 참조). 이 결과는, 만약에 합성적으로 생성된 5'-포스페이트 또는 5'-포스포티오에이트 기를 생체내에서 포스파타제가 절단할 경우, 효과적으로 인산화될 수 있는 안티센스 가닥 상의 5'-말단 뉴클레오티드의 중요성을 분명히 강조한다. 기준이 되는 siRNA 와의 시험관내 비교에 기초하는 더욱 강력한 siRNA 디자인으로서 문헌에 기재된 바와 같은 (Allerson et al. J. Med Chem. 2005, 48, 901-904) 또는 제 1 디자인에서 사용된 바와 같은 5'-말단 2'-OMe 뉴클레오티드의 경우, 생체내에서의 합성 포스페이트의 절단은 상응하는 siRNA 의 효능의 큰 감소를 초래할 것이다.
표 10: 최적화된 5'-말단을 갖는 siRNA 의 생체내 녹다운 활성. 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 대문자 A, C, G, U 에 뒤이어 "f" 는 2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 소문자 "p" 는 5'-포스페이트를 나타낸다. (invdT) 는 역방위 데옥시티미딘 (3'-3'-연결됨) 을 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. (NHC6) 은 센스 가닥의 5'-말단에 통합된 아미노헥실 링커이다. GalNAc 는 식 (IV) 중 구조를 나타낸다.
Figure 112013067790681-pct00107
실시예 48: 최적화된 3' 말단을 갖는 siRNA 의 시험관내 녹 다운 활성
DNase II 안정성 siRNA 의 활성을 추가로 증가시키기 위해, 3'-오버행의 SAR 연구를 실시했다. 센스 또는 안티센스 가닥 3'-오버행 상의 invdT, dTinvdT 또는 dTsdT 의 다양한 조합을 Aha1- 및 EGFP-표적화 siRNA (각각 표 11 및 12 참조) 에 적용하고, 가장 강력한 siRNA 중 양쪽 3'-말단의 조성에 대해 쌍비교했다. 모든 siRNA 를, Lipofectamine2000 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 1 차 마우스 간세포 (30000 세포/웰; 96 웰 플레이트 포르메이트) 의 트랜스펙션 후 녹다운 활성에 대한 투여량 반응 (4-배 희석으로 24 nM 내지 0.00037 nM) 으로 스크리닝했다.
표 11: 상이한 3'-말단을 갖는 EGFP-표적화 siRNA 의 시험관내 녹 다운 활성.
Figure 112013067790681-pct00108
표 12: 상이한 3'-말단을 갖는 Aha1-표적화 siRNA 의 시험관내 녹 다운 활성.
Figure 112013067790681-pct00109
안티센스 가닥 상에 2 개의 뉴클레오티드 dTsdT-오버행을 갖는 siRNA 는 안티센스의 3'-말단에 단일 invdT 오버행을 갖는 siRNA (센스 가닥은 동일했음) 보다 항상 성능이 더 양호했음이 밝혀졌다. 3'-오버행으로서 단일 invdT-오버행으로 수식된 센스 가닥과의 조합이 더 유익했다.
실시예 49: 비-인간 영장류에서 siRNA 의 생체내 녹 다운 활성
DPC 의 제조 및 투여
중합체 "149 RAFT" 를 명시된 siRNA 표적화 응고 인자 VII (siF7) 에 4:1 wt:wt 비 (중합체:siRNA) 로 다이설파이드 연결을 통해 공유적으로 부착한 후, 중합체-siRNA 접합체를 CDM-PEG:CDM-NAG 의 2:1 wt:wt 혼합물로 7x wt:wt 비 (CDM:중합체) 로 수식하여 DPC 를 제조했다. 사이노몰구스 원숭이 (Cynomolgous monkey) 에게 1 ㎎/㎏ DPC (중합체 중량) 및 0.25 ㎎/㎏ 의 명시된 siRNA 를 투여했다. 한 마리의 동물은 siF7 SEQ ID NO 쌍 151/152 를 함유하는 DPC 를 수령했고, 두 마리의 동물은 siF7 SEQ ID NO 쌍 253/254, #1 및 #2) 를 함유하는 DPC 를 수령했고, 두 마리의 동물은 SEQ ID NO 쌍 251/255, #1 및 #2) 를 함유하는 DPC 를 수령했다. F7 값을 2 개의 투여 전 값의 평균으로 표준화했다. SEQ ID NO 쌍 253/254 또는 SEQ ID NO 쌍 251/255 를 함유하는 DPC 를 수령한 동물은 SEQ ID NO 쌍 251/252 를 수령한 동물보다 더 높은 수준의 F7 녹다운 및 더 긴 PT 를 보였다.
DPC 주입 절차
각 주입 절차을 위해, 동물에게 케타민 (7 ㎎/㎏ 이하) 및 덱스메데토미딘 (0.03 ㎎/㎏ 이하) 의 조합을 함유하는 IM 주입을 실시했고, 이 동물을 절차실로 이동시켰다. 절차실에서, 동물을 물 자켓 가열 패드 위에 배치하고, 주입 자리를 면도하고 소독제로 준비시켰다. 정맥내 카테터 (20 ~ 22 게이지) 를 전신 정맥 (두부 또는 소복재 정맥) 내로 삽입하고, DPC 용액을 1 ~ 2 분에 걸쳐 서서히 주입했다 (2 ㎖/㎏). 펄스 옥시미터를 사용하여 주입 절차 동안 및 직후 심장 박동수 및 산소 포화도를 모니터링했다. 각 주입 절차를 수행하는데 약 20 분이 소요되었다. 주입 후, 카테터를 제거하고 약한 압력을 정맥천자 자리에 적용했다. 동물을 다시 그들의 케이지에 넣고, 전환 약물 (reversal drug) 아티파메졸 (안티세단) 의 IM 주입 (0.10 ~ 0.15 ㎎/㎏) 을 실시했다. 동물을 그들이 정상적 활성을 회복할 때까지 모니터링했다.
혈액 수집 절차
혈액 샘플 (1-5 ㎖) 을 유전자 저해 (F7 활성, 응고 시간), 혈액 화학, 및 간 손상의 마커 (CBC, 화학 패널, ALT, 사이토카인, 보체) 의 측정을 위해 수득했다. 이들 혈액 수집 절차를 위해, 동물에게 케타민 (7 ㎎/㎏ 이하) 및 덱스메데토미딘 (0.03 ㎎/㎏ 이하) 의 조합을 포함하는 IM 주입을 실시했다. 일단 진정제를 제공한 후, 동물을 이동식 절차 테이블로 이동시키고, 22 게이지 바늘 및 주사기를 사용하여 대퇴부 정맥으로부터 혈액을 수집했다. 혈액 수집 직후, 정맥천자 자리에 압력을 가하고, 혈액을 각 혈액 시험에 적당한 샘플 튜브 내로 나누었다. 그 후 동물에게 전환 약물 아티파메졸 (안티세단) (0.10 내지 0.15 ㎎/㎏) 의 IM 주입을 실시하고, 그들의 케이지로 돌려보냈다. 총 혈액 부피의 20% 이하를 임의의 30-일 기간 중에 수집했다 (추정된 혈액 부피 = 60 ㎖/㎏). 각 혈액 수집 절차를 실시하는데 약 10 분이 소요되었다.
인자 VII (F7) 활성 측정
비-인간 영장류로부터의 혈액 샘플을, 혈청 분리기 튜브에 전혈을 충전시키고 혈액을 실온에서 20 분 이상 동안 엉기게 놔두어 준비했다. 엉김 (clotting) 후, 혈액 튜브를 3 분 동안 9000 rpm 에서 원심분리하고, 에펜도르프 튜브 내로 분취하고, 검정 전까지 -20 ℃ 에서 저장했다. 혈청 중 F7 활성을, BIOPHEN VII 키트 (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH) 를 제조사의 권고에 따라 사용하여 발색 방법으로 측정했다. 비색 전개의 흡광도를 405 ㎚ 에서 Tecan Safire2 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했다.
응고 시험 (프로트롬빈 시간 (protime), 부분 프로트롬빈 시간 및 피브리노겐)
비-인간 영장류로부터의 혈액 샘플을, 나트륨 시트레이트 튜브 (BD Vacutainer) 에 전혈을 완전히 충전시키고 응괴 형성을 방지하기 위해 온화하게 혼합하여 준비했다. 튜브를 임상 시험 실험실로 1 시간 내에 수송하고, 응고 검정을 수집 시점으로부터 4 시간 내에 실시했다.
표 13: NHP 실험에 사용된 FVII SiRNA: 기호설명: 소문자 a, c, g, u 는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다; 대문자 A, C, G, U 에 뒤이어 "f" 는 2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 소문자 "p" 는 5'-포스페이트를 나타낸다. (invdT) 는 역방위 데옥시티미딘 (3'-3'-연결됨) 을 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결은 소문자 "s" 로 기호화되어 있다. dT 는 데옥시티미딘이다.
Figure 112013067790681-pct00110
양쪽 가닥 상의 단일 뉴클레오티드 (invdT)-3'-오버행으로부터, 센스 가닥 상의 3'-(invdT) 오버행 및 안티센스 가닥 상의 dTsdT 오버행을 갖는 비대칭적 siRNA 디자인으로 변화, 그러나 그렇지 않은 경우 일정한 수식 패턴은 비-인간 영장류에서 더욱 현저한 혈청 FVII 감소 및 이러한 효과의 유의하게 연장된 지속시간을 초래한다 (도 6a 참조). 이러한 관찰은 예상되는 생물학적 결과, 즉 인자 7 감소의 정도에 상응하는 프로트롬빈 시간에 대한 더욱 현저한 효과에 의해 지지된다 (도 6b 참조).
실시예 50: 절단성 RNA 링커를 갖는 siRNA 의 생체내 녹 다운 활성
표 14 에서, 마우스에서 동일한 서열 맥락에서 콜레스테롤 또는 GalNAc-팔미토일 siRNA 접합체를 사용하여 혈청 중 FVII 단백질 저해에 기초하는 생체내 효능이 비교되어 있다. 생체내 실험을 실시예 42 에서 기재된 바와 같이 실시했다. 2'-OH 뉴클레오티드를 전혀 함유하지 않는 콜레스테롤 접합된 siRNA 에서 GalNAc-팔미토일 접합된 대응물에 비해 FVII 저해가 크게 감소되었다 (SEQ ID NO 쌍 179/166 vs. 179/190, SEQ ID NO 쌍 257/264 vs. SEQ ID NO 쌍 179/262, SEQ ID NO 쌍 257/263 vs. SEQ ID NO 쌍 179/163 및 SEQ ID NO 쌍 257/166 vs. SEQ ID NO 쌍 179/166). 그와 대조적으로, 2'-OH 함유 siRNA 에 대한 콜레스테롤 접합체는 GalNAc-팔미토일 유도체에 비해 더 높은 FVII 저해를 초래했다 (SEQ ID NO 쌍 180/168 vs. SEQ ID NO 쌍 258/168).
기재된 생체내 실험에서 사용된 소분자 리간드 GalNAc-팔미토일 및 콜레스테롤은 siRNA 에 센스 가닥의 5'-말단에 대한 비-절단성 링커를 통해 연결되어 있다. 센스가닥이 2'-OH 뉴클레오티드를 나타내는 경우, 리간드는 뉴클레아제 (예, 엔도솜 또는 리소좀 구획 내의 DNase II) 에 의해 여전히 절단가능하다. 절단 반응은 자유 siRNA 를 방출시키고, 이는 그후 전달 중합체의 엔도솜 동요 활성에 의해 세포질 내로 방출된다.
센스 가닥에 2'-OH 뉴클레오티드를 결여하는 siRNA 에 있어서, 어떠한 효소적 (뉴클레아제/프로테아제/에스테라제 등) 또는 화학적 메카니즘도 리간드의 절단을 촉발하지 않으므로, 리간드는 듀플렉스에 안정적으로 연결되어 있다. 그러므로, 완전히 안정적인 콜레스테롤 접합된 siRNA 는 친유성 콜레스테롤 리간드의 막 상호작용으로 인해 세포벽에 포획될 수 있다. 심지어 조직 중 siRNA 의 높은 농도도 siRNA 의 세포질 내로의 효과적 방출에는 충분하지 않다. 그와 대조적으로, 덜 친유성인 GalNAc-팔미토일 접합된 siRNA 는 세포막과의 덜 현저한 상호작용으로 인해 세포질 내로 방출될 수 있다. 이런 이유로, 안정적, 비-절단성 GalNAc-팔미토일 siRNA 접합체는 동일한 siRNA 에 접합된 콜레스테롤에 비해 더욱 효과적이다.
절단성 링커 구축물의 개발은 안정적으로 접합된 콜레스테롤 siRNA 에 대한 막 포획 문제를 피하는 것을 도울 것이다. 다이설파이드 링커 화학의 사용이 규정된 절단 자리를 도입할 매력적인 가능성으로서 기재되어 있으나, 절단은 세포 내부 특정 세포소기관의 환원 환경으로 제한될 가능성이 가장 높다 (PNAS, 2006, 103, 13872). 절단은 엔도솜/리소좀 구획에서 느릴 것으로 예상되므로, 대부분의 콜레스테롤-다이설파이드 접합된 siRNA 는 여전히 비-절단성 콜레스테롤 접합체에 대해 기재된 바와 같이 막에 포획될 수 있다.
표 14
Figure 112013067790681-pct00111
잘 확립된 다이설파이드 절단성 링커 화학에 더하여, 또다른 가능성은 특정 위치에서 2'-OH 뉴클레오티드의 사용에 의하는 규정된 절단 자리의 생성이다. 선별적 위치에서 2'-OH 뉴클레오티드의 도입은 RNA 가닥으로부터 접합체의 절단을 달성하는 새로운 접근이다. 2'-OH 뉴클레오티드는 RNA 가닥의 3'- 또는 5'-말단에 하나 이상의 2'-OH-뉴클레오티드를 갖는 단일 가닥 오버행을 첨가함으로써 또는 siRNA 의 듀플렉스 영역 내에 2'-OH 뉴클레오티드를 사용함으로써 실현될 수 있다. 엔도솜 / 리소좀에 존재하는 뉴클레아제의 효소적 활성은 이러한 위치에서 선별적으로 절단한다. 제 1 디자인에서, 콜레스테롤은 5'-말단에서 3 개의 2'-OH 뉴클레오티드 (AUC) 를 함유하는 단일 가닥 오버행을 통해 센스 가닥에 연결되었다.
다양한의 절단성 링커 화학을 비교하는 콜레스테롤 접합된 siRNA 가 표 15 에 나타나 있다. 모든 siRNA 는 동일한 서열 맥락을 가지며, 단지 링커 화학이 변경되었다. 콜레스테롤은 센스 가닥에 3 개의 2'-OH 뉴클레오티드 (AUC) 로 구성된 단일 가닥 오버행을 통해 5'-말단에 연결되었다. 전달 중합체와 함께 동시-투여될 때 이러한 siRNA (SEQ ID NO 쌍 260/263) 는 마우스 혈청 중 77% FVII 하향 조정 (down modulation) 을 초래했고, 이는 안정적으로 부착된 콜레스테롤을 갖는 동일한 siRNA (SEQ ID NO 쌍 257/263) 를 사용할 때의 오직 60% 와 비교된다. 센스 가닥의 5'-말단에 식 Ia 에 따른 링커를 통해 접합된 콜레스테롤을 갖는 동일한 siRNA (SEQ ID NO 쌍 261/263) 는 혈청 중 93% FVII 활성 감소를 초래한다. 모든 결과는 마우스에서 15 ㎎/㎏ 의 전달 중합체와 2.5 ㎎/㎏ 의 콜레스테롤 접합된 siRNA 의 동시-투여에 의해 획득되었다.
표 15: 콜레스테롤 접합된 siRNA 에 대한 다양한 링커 화학의 생체내 비교
Figure 112013067790681-pct00112
이들 결과는 절단성 링커의 사용이 2'-OH 뉴클레오티드를 전혀 함유하지 않는 siRNA 의 생체내 효능을 개선한다는 것을 시사한다. 절단성 링커는 2'-OH 함유 뉴클레오티드, 디-펩티드 절단 모티브 또는 다이설파이드 링커 화학으로 구성될 수 있다. 모든 절단성 링커 구축물은 콜레스테롤 접합된 siRNA 와 느린 엔도솜 방출 전달 중합체의 동시-투여 설정에서 생체내 효능을 개선한다.
실시예 51: 절단성 링커를 갖는 siRNA 의 시험관내 혈청 안정성
절단성 링커의 안정성을 시험관내 안정성 검정에서 평가했다. 콜레스테롤 접합된 센스 가닥을 다양한 시점 동안 37℃ 에서 90% 마우스 혈청 중 인큐베이션했다. 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 함유 완충액 중 프로테이나제 K 를 첨가하여 인큐베이션 반응을 중단시켰다. 상기 처리는 RNA 가닥 완결성을 방해하지 않으면서 모든 단백질 및 효소를 붕괴시킨다. 25 ㎕ 의 이러한 용액을 260 ㎚ 에서 UV 탐지기에 연결된 AEX-HPLC 시스템에 직접 주입했다. AEX-HPLC 를 pH=8 에서 50% ACN 을 함유하는 20 mM Tris 완충액을 사용하여 75℃ 에서 Dionex DNA Pac200 칼럼 (4x250 ㎜) 상에서 실시했다. 용리액 B 중 800 mM NaBr 은 용리액 염으로서의 역할을 한다. 18 분 이내 25 → 62% B 의 기울기를 이용했다.
콜레스테롤 함유 단일 가닥 RNA 는 HPLC 칼럼으로부터 260 ㎚ 에서 넓은 피크로서 용리된다. 콜레스테롤의 절단 후, 급격한 대칭적 피크가 더 낮은 체류 시간에서 관찰된다. 콜레스테롤의 절단 속도를 하기 등식으로 결정했다 (PA = 피크 면적):
% (자유 RNA) = 100 * PA [자유 RNA] / (PA [자유 RNA] + PA [콜레스테롤 접합된 RNA])
시험관내에서 3nt 뉴클레오티드 (AUC)-오버행이 90% 마우스 혈청 중 1 시간 미만 이내에 정량적으로 절단된다는 것이 밝혀졌다. 절단은 오버행 중 2 개의 피리미딘 뉴클레오티드의 3' 에서 일어나서, 2 개의 구별되는 절단 대사산물을 초래한다 (대사산물의 피크 면적이 데이타 평가를 위해 요약되었음). 그와 대조적으로, 식 1a 에 따른 디-펩티드 함유 링커, 다이설파이드 및 안정적으로 연결된 콜레스테롤은 마우스 혈청에서 완전히 안정적이다.
실시예 52: 절단성 링커를 갖는 siRNA 의 조직 분포
간 조직 샘플 중 siRNA 농도를 WO2010043512 에 기재된 사유 올리고뉴클레오티드 탐지 방법을 사용하여 측정했다. 간략히, siRNA 정량화는 siRNA 듀플렉스의 센스 가닥에 상보적인 형광 (Atto-425) 라벨링된 PNA-프로브 (Atto425-OO-TGAGTTGGCACGCCTTT, Panagene Inc, Korea 로부터 수득됨) 의 혼성화에 뒤이은, AEX-HPLC 기반 분리에 기초한다. 생체내 실험 (참고, 실시예 42) 에서 사용한 FVII siRNA 의 희석 시리즈로부터 생성된 외 보정 곡선에 대한 형광 탐지에 의해 정량화를 실시했다. 혈청 샘플에 대해 0.2 ~ 2 ㎕ 및 조직에 대해 ~ 1 ㎎ 분취량을 HPLC 시스템 상으로 주입했다.
표 16 에 간 조직 분석으로부터의 결과가 나타나 있다. siRNA 함량을 분석할 때, 간 조직에 존재하는 센스 가닥이, 디-펩티드 링커 모티브 또는 미수식된 링커 서열 AUC 를 갖는 3 nt 5'-오버행을 사용할 때 콜레스테롤로부터 정량적으로 절단된다는 것이 밝혀졌다. 이와 대조적으로, 간에 존재하는 다이설파이드 연결된 siRNA 중 오직 15% 가 투여 후 처음 48 시간 내에 콜레스테롤로부터 절단되고, 안정적으로 부착된 콜레스테롤은 siRNA 로부터 전혀 절단되지 않는다.
간 조직 중 절대적 양의 콜레스테롤-없는 siRNA 를 비교할 때, 다이설파이드 링커 및 RNA AUC-링커에 대해서 유사한 양이 발견되었으며, 이는 투여한지 48 시간 후 동등한 FVII 혈청 활성과 정확하게 상관관계가 있다. 디-펩티드 연결된 콜레스테롤 siRNA 로 획득된 더 낮은 FVII 활성은 더 높은 절대적 양의 절단된 콜레스테롤-없는 siRNA 와 완전히 상관관계가 있다.
간 내로 전달된 센스 가닥 상에 (AUC)-링커가 달린 콜레스테롤 siRNA 접합체의 총량은 안정적으로 또는 다이설파이드 부착된 콜레스테롤에 비해 ~ 6-배 더 낮고, 디-펩티드 접합된 콜레스테롤 siRNA 에 비해 ~3-배 더 낮다. 감소된 조직 존재는 AUC-링커가 세포내 뉴클레아제에 대한 기질일 뿐만 아니라, 마우스 혈청과의 시험관내 인큐베이션에서 나타나 바와 같이 순환에 존재하는 뉴클레아제에 대한 기질인 사실 때문일 수 있다. 콜레스테롤 리간드가 순환시 이미 siRNA 로부터 절단될 경우, 결과로서 얻어지는 siRNA 는 신장 청소 (renal clearance) 되기 쉽고 조직으로 전달되지 않은 채 소변으로 빠르게 배출된다.
표 16:
Figure 112013067790681-pct00113
하기 표에 실시예에서 사용된 siRNA 가 요약되어 있다:
표 17: 핵심 서열
Figure 112013067790681-pct00114
표 18: 핵심 서열 및 수식된 서열의 맵핑 (mapping)
Figure 112013067790681-pct00115
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<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Small molecule conjugates for intracellular delivery of biologically active compounds <130> 27175 WO1 <150> US 61/427845 <151> 2010-12-29 <160> 282 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 1 acaugaagca gcacgacuu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 2 aagucgugcu gcuucaugu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 3 gcccgacaac cacuaccug 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 4 cagguagugg uugucgggc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 5 cgagaagcgc gaucacaug 19 <210> 6 <211> 19 <212> 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Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 18 acgccguagg ucagggugg 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 19 cgacuucaag gaggacggc 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 20 gccguccucc uugaagucg 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 21 uucaagaucc gccacaaca 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 22 uguuguggcg gaucuugaa 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 23 ggcaacuaca agacccgcg 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 24 cgcgggucuu guaguugcc 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 25 ccggcaagcu gcccgugcc 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 26 ggcacgggca gcuugccgg 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 27 ugcccauccu ggucgagcu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 28 agcucgacca ggaugggca 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 29 caaguucagc guguccggc 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 30 gccggacacg cugaacuug 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 31 acaugaagca gcacgacuut t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 32 aagucgugcu gcuucaugut t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 33 gcccgacaac cacuaccugt t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 34 cagguagugg uugucgggct t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 35 cgagaagcgc gaucacaugt t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> 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strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 39 acaagcugga guacaacuat t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 40 uaguuguacu ccagcuugut t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 41 gcagcucgcc gaccacuact t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 42 guaguggucg gcgagcugct t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 43 cguccaggag cgcaccauct t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 44 gauggugcgc uccuggacgt t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 45 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 46 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 47 ccacccugac cuacggcgut t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 48 acgccguagg ucaggguggt t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 49 cgacuucaag gaggacggct t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 50 gccguccucc uugaagucgt t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 51 uucaagaucc gccacaacat t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 52 uguuguggcg gaucuugaat t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 53 ggcaacuaca agacccgcgt t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 54 cgcgggucuu guaguugcct t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 55 ccggcaagcu gcccgugcct t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 56 ggcacgggca gcuugccggt t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 57 ugcccauccu ggucgagcut t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 58 agcucgacca ggaugggcat t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 59 caaguucagc guguccggct t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 60 gccggacacg cugaacuugt t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 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lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 65 cgagaagcgc gaucacaugt t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 66 caugugaucg cgcuucucgt t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 67 auaucauggc cgacaagcat t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 68 ugcuugucgg ccaugauaut t 21 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of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 76 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 77 ccacccugac cuacggcgut t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 78 acgccguagg ucaggguggt t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = 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Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 89 caaguucagc guguccggct t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 90 gccggacacg cugaacuugt t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 91 acaugaagca gcacgacutt t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 6, 8, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 92 aagtcgugct gcutcaugut t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 93 gcccgacaac cacuaccugt t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 10, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 94 cagguagtgg utgtcgggct t 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 95 cgagaagcgc gatcacaugt t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 96 caugugatcg cgctucucgt t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 97 auaucatggc cgacaagcat t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 6, 8, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 98 ugctugucgg ccatgauaut t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 99 acaagctgga guacaacuat t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 6, 8, 12, 14, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 100 uagtuguact ccagctugut t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 101 gcagcucgcc gaccactact t 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 102 gtaguggtcg gcgagcugct t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 103 cgtccaggag cgcaccauct t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 8, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 104 gauggtgcgc ucctggacgt t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 105 gctggagutc gugaccgcct t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 8, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 106 ggcggtcacg aactccagct t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 107 ccaccctgac cuacggcgtt t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 108 acgccguagg ucaggguggt t 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 109 cgactucaag gaggacggct t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 10, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 110 gccgucctcc utgaagucgt t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 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lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 113 ggcaactaca agacccgcgt t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 14, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 114 cgcgggucut gtagutgcct t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 115 ccggcaagcu gcccgugcct t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 116 ggcacgggca gcutgccggt t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 9, 11, 15, 17 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 117 tgcccatccu ggtcgagctt t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 6, 8, 10, 12, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 118 agctcgacca ggatgggcat t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 119 caagtucagc guguccggct t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 120 gccggacacg ctgaacutgt t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 121 acatgaagca gcacgactut t 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 11, 15 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 122 aagucgtgcu gctucatgtt t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 123 gcccgacaac cactacctgt t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 7, 9, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 124 caggtagugg tugucgggct t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 125 cgagaagcgc gaucacatgt t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 7, 9, 11, 13, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 126 catgtgaucg cgcutctcgt t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 127 atatcauggc cgacaagcat t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 9, 11, 13, 15 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 128 tgcutgtcgg ccaugatatt t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 129 acaagcugga gtacaactat t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 9, 11, 13, 15 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 130 tagutgtacu ccagcutgtt t 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 131 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corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 137 ccacccugac ctacggcgut t 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 9, 13, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 138 acgccgtagg tcagggtggt t 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> 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<222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 141 utcaagatcc gccacaacat t 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 142 tgtuguggcg gatctugaat t 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 143 ggcaacuaca agacccgcgt t 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 11, 13, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 144 cgcgggtctu guagtugcct t 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 12, 14, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 145 ccggcaagct gcccgtgcct t 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 146 ggcacgggca gctugccggt t 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 147 ugcccaucct ggucgagcut t 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 148 agcucgacca ggaugggcat t 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 8, 10, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 149 caagutcagc gtgtccggct t 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 150 gccggacacg cugaactugt t 21 <210> 151 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting apoB <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 151 ggaaucuuau auuugaucca a 21 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting apoB <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 152 uuggaucaaa uauaagauuc ccu 23 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting apoB <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 7, 8, 10, 12, 13, 14, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "corresponding base 5'-monophosphorothioate" <400> 153 ggaaucuuau auuugaucca a 21 <210> 154 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting apoB <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 7, 11, 13, 18, 21 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 23 <223> /mod_base = "corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 22 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <400> 154 uuggaucaaa uauaagauuc ccu 23 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 155 ggaugaagug gagauuagu 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 156 acuaaucucc acuucaucc 19 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 9, 15, 16, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 157 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 10, 15 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 158 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 159 acuaaucucc acuucaucct 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 160 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 161 gcaaaggcgu gccaacuca 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 162 ugaguuggca cgccuuugc 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 163 ggaucaucuc aagucuuac 19 <210> 164 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 164 guaagacuug agaugaucc 19 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 165 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 166 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 167 gcaaaggcgu gccaacucat t 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 9 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 168 ugaguuggca cgccuuugct t 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 4, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 3, 6, 11, 12, 13, 18 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 169 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 7, 8, 9, 14, 17, 18, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 15, 16 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 170 guaagacuug agaugaucct t 21 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting PTPN1 <400> 171 ugaccacagu cggauuaaa 19 <210> 172 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting PTPN1 <400> 172 uuuaauccga cugugguca 19 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting PTPN1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 173 ugaccacagu cggauuaaat 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting PTPN1 <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 174 uuuaauccga cuguggucat 20 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting PTPN1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 5, 7, 10, 11, 15, 16 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 2, 3, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 175 ugaccacagu cggauuaaat t 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting PTPN1 <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 176 uuuaauccga cuguggucat t 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting PTPN1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 177 uuuaauccga cuguggucat t 21 <210> 178 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 2..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 178 tgaguuggca cgccuuugc 19 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-N-Acetylgalactosamine (GalNac) attached via hexyl amino linker (NHC6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 179 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-N-Acetylgalactosamine (GalNac) attached via hexyl amino linker (NHC6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 180 gcaaaggcgu gccaacucat t 21 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 181 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 182 gcaaaggcgu gccaacucat t 21 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 183 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 184 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <400> 184 gcaaaggcgu gccaacuca 19 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 185 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 186 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 187 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "5'-thio 5'-deoxy" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 188 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 189 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 190 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 191 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 192 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 193 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "5'-thio 5'-deoxy" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 194 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 195 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 196 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 197 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 198 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "5'-thio 5'-deoxy" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 199 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 200 gcuggaguuc gugaccgcct 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 201 gcuggaguuc gugaccgcct 20 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 202 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 203 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 204 gcuggaguuc gugaccgcct 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 205 gcuggaguuc gugaccgcct 20 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 206 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 207 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 208 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 209 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 210 gcuggaguuc gugaccgcct t 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> 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modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 213 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 214 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 215 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 216 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 217 ggcggucacg aacuccagct 20 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 218 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 219 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 220 ggcggucacg aacuccagct 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 221 ggcggucacg aacuccagct 20 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 222 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 223 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 224 ggcggucacg aacuccagct 20 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting EGFP <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 7, 16 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 225 ggcggucacg aacuccagct t 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 226 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 227 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 228 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 229 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 230 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 231 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 232 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 233 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 234 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 235 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 236 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 237 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 238 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 239 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 240 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 241 acuaaucucc acuucaucct 20 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 242 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 243 acuaaucucc acuucaucct 20 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 244 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 245 acuaaucucc acuucaucct 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 246 acuaaucucc acuucaucct 20 <210> 247 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 247 guuggugaau ggagcucag 19 <210> 248 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 248 cugagcucca uucaccaac 19 <210> 249 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <400> 249 gguccuguug uuggugaau 19 <210> 250 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <400> 250 auucaccaac aacaggacc 19 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 251 guuggugaau ggagcucagt 20 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 252 cugagcucca uucaccaact 20 <210> 253 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "base with 5'-hexyl amino linker (NH2C6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 253 gguccuguug uuggugaaut 20 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 254 auucaccaac aacaggacct t 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 255 cugagcucca uucaccaact t 21 <210> 256 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 2..19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 256 tgaguuggca cgccuuugc 19 <210> 257 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 257 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 2, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 19 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 258 gcaaaggcgu gccaacucat t 21 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-cholesterol compound of formula II attached via C6SSC6" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 259 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 260 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 23 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 1..3 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 260 aucgcaaagg cgugccaacu cat 23 <210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cathepsin via cholesterol compound of formula II and hexyl amino linker (NHC6)" <220> <221> modified_base <222> 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 261 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 262 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 263 tgaguuggca cgccuuugct 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 20 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 264 ugaguuggca cgccuuugct 20 <210> 265 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting apoB <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 7, 8, 10, 12, 13, 14, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "corresponding base 5'-monophosphorothioate" <400> 265 ggaaucuuau auuugaucca a 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 266 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 267 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting aha1 <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <400> 268 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 269 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: PNA probe for detection of SEQ ID NO. 182 (sense strand) <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "Atto425-conjugated via dual serin linker (Panagen)" <400> 269 tgagttggca cgccttt 17 <210> 270 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: PNA probe for detection of SEQ ID NO. 168 (antisense strand) <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "Atto425-conjugated via dual serin linker (Panagen)" <400> 270 gcaaaggcgt gccaact 17 <210> 271 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 271 ugugcaaagg cgugccaacu ca 22 <210> 272 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 272 uauugcaaag gcgugccaac uca 23 <210> 273 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 273 uguugcaaag gcgugccaac uca 23 <210> 274 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 274 uuaggcaaag gcgugccaac uca 23 <210> 275 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: sense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <400> 275 uagugcaaag gcgugccaac uca 23 <210> 276 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 23 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 276 uaugcaaagg cgugccaacu cat 23 <210> 277 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 23 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 277 ugugcaaagg cgugccaacu cat 23 <210> 278 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 24 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 278 uauugcaaag gcgugccaac ucat 24 <210> 279 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 24 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 279 uguugcaaag gcgugccaac ucat 24 <210> 280 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 24 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 3..4 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 280 uuaggcaaag gcgugccaac ucat 24 <210> 281 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "nucleoside: lacks 5'-phosphate group" <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "5'-linked cholesterol compound of formula II" <220> <221> modified_base <222> 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 24 <223> /mod_base = "3'-3'-linked desoxythymidine" <220> <221> modified_base <222> 2..3 <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding nucleoside" <400> 281 uagugcaaag gcgugccaac ucat 24 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: antisense strand of dsRNA targeting FVII <220> <221> modified_base <222> 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 <223> /mod_base = "2'-O-methyl corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding nucleoside" <220> <221> modified_base <222> 2 <223> /mod_base = "2'-deoxy-2'-fluoro corresponding base 5'-monophosphorothioate" <220> <221> modified_base <222> 21 <223> /mod_base = "5'-phosphorothioate thymidine" <400> 282 tgaguuggca cgccuuugct t 21

Claims (29)

  1. 하기 식 (I) 의 화합물:
    Figure 112015031692988-pct00139

    [식 중,
    Y 는 -(CH2)3- 또는 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 로부터 선택되는 링커 기이고;
    R1 은 -(C1-6) 알킬;
    -(CH2)-나프틸; 또는
    -(CH2)m-페닐이고, 여기서 페닐은 치환되지 않거나 또는 하기로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 4 회 이하 치환됨
    -NO2,
    -CN,
    할로겐,
    -O-(CH2)-페닐,
    -O-(C1-6) 알킬, 또는
    -C(O)-NH2;
    R2 는 수소;
    -(CH2)k-N-C(Ph)3, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환됨;
    -(CH2)k -C(O)-NH2;
    -(CH2)k -페닐;
    -(C1-6) 알킬이고, 이는 치환되지 않거나 또는 -S-CH3 로 1 회 치환됨;
    R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는 하기로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 추가로 치환됨
    -(CH2)-OH; 또는
    -(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐);
    k 는 1, 2, 3, 4, 5, 6 이고;
    m 은 1, 2, 3 또는 4 이고;
    n 은 0 또는 1 이고; 및
    p 는 1 ~ 20 의 정수임].
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 식 (Ia) 에 나타낸 입체구조를 갖는 화합물:
    Figure 112013067790681-pct00126
    .
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Y 가 -(CH2)3- 인 화합물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    Y 는 -(CH2)3- 이고;
    R2 는 -(CH2)k-N-C(Ph)3 이고, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환되고;
    R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는
    -(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐) 로 추가로 치환되고;
    n 은 0 이고; 및
    R1 및 k 는 위에 제시된 의미를 갖는 화합물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Y 가 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 인 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    Y 는 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- 이고;
    R2 는 -(CH2)k-N-C(Ph)3 이고, 여기서 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 -O-(C1-4)알킬로 독립적으로 치환되고;
    R3 은 -NH-페닐이고, 여기서 페닐 기는
    -(CH2)-O-C(O)-O-(4-니트로-페닐) 로 추가로 치환되고;
    n 은 0 이고;
    R1, k 및 p 는 위에 제시된 의미를 갖는 화합물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생물학적 활성 물질의 리간드로서 사용되는 화합물로서, 상기 리간드는 생물학적 활성 물질에 공유적으로 부착되어 있는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질이 펩티드인 화합물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질이 핵산인 화합물.
  10. 하기 식 (II) 의 접합체:
    Figure 112015031692988-pct00140

    [식 중,
    Ra 는 -(CH2)k-NH2 이고;
    R1 및 k 는 상기 식 (I) 에서 제시된 의미를 갖고; 및
    생물학적 활성 물질은 핵산, 단백질 또는 펩티드임].
  11. 제 10 항에 있어서, 하기 식 (IIa) 에 나타낸 입체구조를 갖는 접합체:
    Figure 112015031692988-pct00128

    [식 중,
    Ra 는 -(CH2)k-NH2 이고;
    R1 및 k 는 상기 식 (I) 에서 제시된 의미를 갖고;
    생물학적 활성 물질은 핵산, 단백질 또는 펩티드임].
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 단백질 또는 펩티드인 접합체.
  13. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 핵산인 접합체.
  14. 제 13 항에 있어서, 핵산이 수식 패턴 5'-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3)na-3' 을 갖는 안티센스 가닥 및 수식 패턴 5'- (Z3)ns-3' 을 갖는 센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드인 접합체 [식 중,
    w 는 독립적으로 5'-포스페이트 또는 5'-포스포티오에이트 또는 H 이고,
    Z1 은 독립적으로 2'-수식된 뉴클레오시드이고,
    Z2 는 독립적으로 2'-데옥시 뉴클레오시드 또는 2'-플루오로-수식된 뉴클레오시드이고,
    Z3 은 독립적으로 2'-수식된 뉴클레오시드이고,
    na 는 8-23 이고, ns 는 8-25 임].
  15. 제 13 항에 있어서, 핵산이 siRNA 인 접합체.
  16. 제 13 항에 있어서, 핵산이 전달 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 접합체.
  17. 삭제
  18. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 생물학적 활성 물질의 생체내 전달에 사용되는 접합체.
  19. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 생물학적 활성 물질의 생체내 전달에 사용되는 접합체로서, 접합체가 전달 중합체와 동시투여되는 접합체.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
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