KR20120050429A - Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ - Google Patents

Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ Download PDF

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KR20120050429A
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그레고리 힌클
아킨 아킨크
스튜어트 밀스테인
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 조성물, 및 PCSK9 유전자로 표적화된, 지질 제형된 siRNA를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＣＳＫ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ＤＳＲＮＡ{LIPID FORMULATED DSRNA TARGETING THE PCSK9 GENE}
본 발명은 PCSK9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 dsRNA를 포함하는 조성물 및 PCSK9 유전자 발현에 의해 야기된 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
관련 출원의 상호 참조
본원은 미국 가출원 일련 번호　61/187,169(2009년 6월 15일 출원); 및 미국 가출원 일련 번호　61/218,350(2009년 6월 18일 출원); 및 미국 가출원 일련 번호　61/244,790(2009년 9월 22일 출원); 및 미국 가출원 일련 번호　61/285,598(2009년 12월 11일 출원); 및 미국 가출원 일련 번호　61/293,474(2010년 1월 8일 출원); 및 미국 가출원 일련 번호　61/313,578(2010년 3월 12일 출원)의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 다목적으로 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있다.
서열 목록에 대한 참조
본원은 XXX,XXX 바이트의 크기로 16733US_sequencelisting.txt (2010년 3월 XX일 생성)로 명명된 텍스트 파일로서 전자 제출된 서열목록을 포함하고, 서열 목록은 참고로 통합되어 있다.
전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 9 (Proprotein convertase subtilisin kexin; PCSK9)는 섭틸리신 세린 프로테아제 패밀리의 한 일원이다. 다른 8개의 포유동물 섭틸리신 프로테아제, PCSK1-PCSK8 (PC1/3, PC2, 퓨린, PC4, PC5/6, PACE4, PC7, 및 S1P/SKI-1이라 칭함)는 분비 경로에서 다양한 단백질을 처리하는 전구단백질 전환효소이고, 다양한 생물학적 프로세스에서 역할을 한다 (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J. 17, 1215-1227, 및 Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748). PCSK9는 콜레스테롤 대사에서 역할을 하는 것으로 제안되었다. PCSK9 mRNA 발현은 마우스에서 식이 콜레스테롤 공급에 의해 하향조절된다 (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), HepG2 세포에서 스타틴에 의해 상향조절되고 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459), 콜레스테롤 생합성 효소 및 저밀도 지질단백질 수용체 (LDLR)과 유사한 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBP) 이식유전자 마우스에서 상향조절된다 (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032). 더욱이, PCSK9 미스센스(missense) 돌연변이는 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증 (Hchola3)의 형태와 연관된 것으로 발견되었다 (Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). PCSK9가 또한, 일반 대중에서 LDL 콜레스테롤 수준을 결정하는 역할을 할 수 있는 것은, 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNPs)이 일본 인구에서 콜레스테롤 수준과 연관되었기 때문이다 (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).
상염색체 우성 고콜레스테롤혈증 (ADH)는 단일유전 질환이고, 여기서, 환자는 상승된 총 및 LDL 콜레스테롤 수준, 건 황색종(tendon xanthomas), 및 미성숙 죽상동맥경화증을 나타낸다 (Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). ADHs 및 열성 형태, 상염색체 열성 고콜레스테롤혈증 (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127)의 발병기전은 간에 의한 LDL 섭취에서의 결점에 기인한다. ADH는 LDL 섭취를 방지하는 LDLR 돌연변이에 의해, 또는 LDLR에 결합하는 아포지질단백질 B인 LDL 상의 단백질에서의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. ARH는 클라스린(clathrin)과 상호작용을 통해 LDLR-LDL 복합체의 세포내이입에 필요한 ARH 단백질에서 돌연변이에 의해 야기된다. 따라서, PCSK9 돌연변이가 Hchola3 패밀리에서 원인이 되면, PCSK9는 수용체 매개된 LDL 섭취에 역할을 하는 것으로 보인다.
과발현 연구는 LDLR 수준의 제어시 PCSK9, 및 이에 따른 간에 의한 LDL 섭취 에 대한 역할을 지적한다 (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). 마우스에서 3일 또는 4일 동안 마우스 또는 인간 PCSK9의 아데노바이러스 매개된 과발현은 상승된 총 및 LDL 콜레스테롤 수준으로 귀결되고; 이 효과는 LDLR 녹아웃(knockout) 동물에서 보이지 않는다 (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). 또한, PCSK9 과발현은 LDLR mRNA 수준, SREBP 단백질 수준, 또는 SREBP 단백질 핵 대 세포질 비에 영향을 주지 않으면서 간 LDLR 단백질에서 심각한 감소로 귀결된다.
PCSK9에서의 기능 돌연변이의 소실은 마우스 모델에서 설계되었고 (Rashid et al., (2005) PNAS, 102, 5374-5379), 인간 개체에서 확인되었다 (Cohen et al. (2005) NatureGenetics 37:161-165). 둘 경우에서, PCSK9 기능의 소실은 총 및 LDLc 콜레스테롤의 저하로 된다. 15년에 걸친 후향성 결과 연구에서, PCSK9의 하나의 카피(copy)의 소실은 LDLc 수준을 낮게 이동시키고 심혈관계 심장 질환의 발병으로부터 증가된 위험성-유익성 보호로 되는 것으로 보인다 (Cohen et al., (2006) N. Engl. J. Med., 354:1264-1272).
최근에, 이중가닥 RNA 분자 (dsRNA)는 RNA 간섭 (RNAi)으로 공지된 고보존 조절 기전에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 보여졌다. WO 99/32619 (Fire et al.)는 선충(C. elegans)에서 유전자의 발현을 억제하기 위한 길이가 적어도 25개인 뉴클레오티드의 dsRNA의 사용을 개시한다. dsRNA는 또한, 식물 (예를 들어, 예를 들어, WO 99/53050, Waterhouse et al.; 및 WO　99/61631, Heifetz et al.), 초라피속(Drosophila) (예를 들어, 예를 들어, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), 및 포유동물 (참고 WO 00/44895, Limmer; 및 DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.)을 포함하는 다른 유기체에서 표적 RNA를 분해하는 것으로 보여졌다. 이러한 천연 기전은 유전자의 비정상 또는 원하지 않는 조절에 의해 야기된 장애의 치료를 위한 약제의 신규 부류의 개발에 대한 초점이 되었다.
PCSK9를 표적으로 하는 siRNA의 기재가 미국 특허 번호 7,605,251 및 WO 2007/134161에서 발견될 수 있다. 추가 기재는 미국 특허공보 번호 2010/0010066 및 WO 2009/134487에서 발견될 수 있다.
발명의 요약
이하에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 PCSK9를 표적으로 하는 지질 제형된 siRNA, 예를 들어, PCSK9를 표적으로 하는 MC3 제형된 siRNA를 포함하는 조성물을 개시한다. PCSK9 발현의 억제 및 PCSK9 발현과 관련된 병상, 예를 들어, 고지혈증의 치료를 위한 조성물을 사용하는 방법을 또한 개시한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 세포에서 인간 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한, 이중가닥 리보핵산 (dsRNA)을 포함하는 핵산 지질 입자를 포함하는 조성물이고, 여기서, 상기 핵산 지질 입자는 45-65 mol %의 양이온성 지질, 5 mol % 내지 약 10 mol %의 비-양이온성 지질, 25-40 mol %의 스테롤, 및 0.5-5 mol %의 PEG 또는 PEG 변형된 지질을 포함하는 지질 제형을 포함하고, 상기 dsRNA 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호:1523 (5'- UUCUAGACCUGUUUUGCUU -3')의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 서열을 포함하고, 여기서, 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 상보적이고, 여기서, 상기 dsRNA는 그 길이가 15 내지 30개의 염기쌍이다.
본원에 기재된 바와 같이, 상기 조성물은 양이온성 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 양이온성 지질은 MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트를 포함한다. 예를 들어, 지질 제형은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00001
다른 구현예에서, 양이온성 지질은 식 A를 포함하고, 여기서, 식 A는 하기이다:
Figure pct00002
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이고, 또는 R3 및 R4는 함께 임의 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 식 A를 포함하고, XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 지질 제형은 양이온성 지질 XTC, 비-양이온성 지질 DSPC, 스테롤 콜레스테롤 및 PEG 지질 PEG-DMG를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 양이온성 지질은 XTC를 포함하고, 상기 제형은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00003
추가 구현예에서, 양이온성 지질은 ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민))을 포함한다. 예를 들어, 양이온성 지질은 ALNY-100를 포함하고, 제형은 50/10/38.5/1.5의 비로 ALNY-100/DSPC/콜레스테롤/PEG-DMG으로 이루어진다.
조성물은 PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호:1227를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호:1228을 포함한다. 다른 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호:1227로 이루어지고, 안티센스 가닥은 서열번호:1228로 이루어진다. 하나 또는 2개의 가닥은 변형될 수 있고, 예를 들어, 각 가닥은 소문자 "c" 또는 "u"로 표시되는 바와 같은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 소문자 "s"로 표시되는 바와 같은 포스포로티오에이트를 포함하도록 하기와 같이 변형된다: dsRNA는 하기로 이루어진다:
서열번호:1229 (5'- uucuAGAccuGuuuuGcuuTsT -3')로 이루어진 센스 가닥, 및
서열번호:1230 (5'- AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT-3')로 이루어진 안티센스 가닥.
다른 구현예에서, dsRNA는 하기의 예와 같은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 그룹에 결합된 말단 뉴클레오티드의 그룹으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오티드, 및/또는, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오티드, 락킹된(locked) 뉴클레오티드, 어베이직(abasic) 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 및 뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 염기의 그룹으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오티드. 일 구현예에서, dsRNA는 적어도 하나의 2'-O-메틸 변형된 리보뉴클레오티드 및 적어도 하나의 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다.
조성물은 그 길이가 15 내지 30개의 염기쌍인 dsRNA를 포함한다. 일 구현예에서, 각각의 dsRNA 가닥은 19-23개 길이의 염기, 또는 예를 들어, 21-23개 길이의 염기, 또는 예를 들어, 21개 길이의 염기이다.
일 양태에서, 조성물은 지질단백질, 예를 들어, 아포지질단백질 E (ApoE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 지질단백질을 포함하고, dsRNA는 친지질체, 예를 들어, 콜레스테롤에 콘쥬게이트된다. ApoE는 적어도 하나의 양친매제, 예를 들어, 인지질, 예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜 콜린 (DMPC), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 에그 포스파티딜콜린 (EPC), 스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), -포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-말), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인지질과 함께 재구성될 수 있다. 일부 구현예에서, ApoE는 재구성된 고밀도 지질단백질 (rHDL)이다.
조성물, 예를 들어, PCSK9를 표적으로 하는 지질 제형된 dsRNA는 세포 또는 대상체, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 조성물의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 적어도 40%까지 PCSK9의 발현을 억제하고/하거나 대조군의 투여와 비교하여 포유동물에서 PCSK9 단백질 수준을 감소시키고/거나 대조군의 투여와 비교하여 포유동물에서 LDLc 수준을 감소시키고/거나 대조군의 투여와 비교하여 0.1 mg/kg 미만의 복용량으로 PCSK9 간 mRNA와 총 혈청 콜레스테롤 둘 모두를 감소시키고/거나 PCSK9 간 mRNA를 약 0.2 mg/kg의 ED50으로 감소시키고 대조군의 투여와 비교하여 총 혈청 콜레스테롤을 약 0.08 mg/kg의 ED50으로 감소시키고/거나 혈청 LDL 입자 수를 90% 초과까지 감소시키거나 대조군의 투여와 비교하여 혈청 HDL 입자 수를 75% 초과까지 감소시킨다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 지질 제형된 PCSK9 표적화된 dsRNA 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 세포에서 PCSK9의 발현을 억제하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 포유동물에서 LDLc 수준을 감소시키는 방법을 포함한다.
이하에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 상기 방법은 임의의 적절한 복용량, 예를 들어, 0.25 mg/kg 내지 4 mg/kg dsRNA, 또는 예를 들어, 약 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 또는 5.0 mg/kg dsRNA를 포함할 수 있다.
본원은 대상체에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법을 또한 개시하고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 지질 제형된 PCSK9 표적화된 dsRNA 조성물을 약 3 mg/kg의 첫 번째 복용량으로 투여하고, 그 다음, 적어도 하나의 차후의 복용량을 주당 1회 투여하는 것을 포함하고, 상기 차후의 복용량은 상기 첫 번째 복용량 미만이다. 대상체는 예를 들어, 랫트 또는 비-인간 영장류 또는 인간일 수 있다. 차후의 복용량은 약 1.0　mg/kg 또는 약 0.3　mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 차후의 복용량은 4주 동안 주당 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 첫 번째 복용량의 투여는 총 콜레스테롤 수준을 약 15-60%까지 감소시킨다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 수반되는 도면 및 하기의 설명에 나타나 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명확할 것이다.
접두어 "AD-" "DP-" 및 "AL-DP-"는 예를 들어, AL-DP-9327 및 AD-9237와 상호교환적으로 사용된다.
도 1는 ND-98 지질의 구조를 보여준다.
도 2는 C57/BL6마우스 (5 동물/그룹)에서 (그래프 상에 나타낸 ORF 위치에 상응하는 제1 뉴클레오티드를 갖는) PCSK9 mRNA의 상이한 ORF 영역에 대해 인도된 16마리 마우스 특이적 (AL-DP-9327 내지 AL-DP-9342) PCSK9 siRNA의 생체내 스크린의 결과를 보여준다. 간(liver) 용해물 중 PCSK9 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비는 각 처리 그룹에 대해 평균을 내고, PBS로 처리된 대조군 그룹 또는 무관련 siRNA (혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군 그룹과 비교되었다.
도 3는 C57/BL6 마우스 (5 동물/그룹)에서 (그래프 상에 나타낸 ORF 위치에 상응하는 제1 뉴클레오티드를 갖는) PCSK9 mRNA의 상이한 ORF 영역에 대해 인도된 16 인간/마우스/랫트 교차반응성 (AL-DP-9311 내지 AL-DP-9326) PCSK9 siRNA의 생체내 스크린의 결과를 보여준다. 간 용해물 중 PCSK9 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비는 각 처리 그룹에 대해 평균을 내고, PBS로 처리된 대조군 그룹 또는 무관련 siRNA (혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군 그룹과 비교되었다.
도 4는 C57/BL6 마우스 (5 동물/그룹)에서 16 마우스 특이적 (AL-DP-9327 내지 AL-DP-9342) PCSK9 siRNA의 생체내 스크린의 결과를 보여준다. 총 혈청 콜레스테롤 수준는 각 처리 그룹에 대해 평균을 내고 PBS로 처리된 대조군 그룹 또는 무관련 siRNA (혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군 그룹과 비교되었다.
도 5는 C57/BL6 마우스 (5 동물/그룹)에서 16 인간/마우스/랫트 교차반응성 (AL-DP-9311 내지 AL-DP-9326) PCSK9 siRNA의 생체내 스크린의 결과를 보여준다. 총 혈청 콜레스테롤 수준는 각 처리 그룹에 대해 평균을 내고 PBS로 처리된 대조군 그룹 또는 무관련 siRNA (혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군 그룹과 비교되었다.
도 6a 및 6b는 PCSK9을 발현억제에 대한, 실험실내 및 생체내 결과 각각을 비교한다.
도 7a 및 도 7b는 원숭이 원발성 간세포를 사용하여 PCSK9을 발현억제에 대한 실험실내 결과의 예이다.
도 7c는 AL-DP-9680 및 AL-DP-9680의 화학적 변형된 버전을 사용하여 원숭이 원발성 간세포에서 PCSK9의 발현억제에 대한 결과를 보여준다.
도 8는 LNP-01 제형된 siRNA 대 pcsk-9의 생체내 활성을 보여준다.
도 9a 및 9b는 마우스에서 단일 복용량 후 상이한 시간에서 LNP-01 제형된 화학적 변형된 9314 및 화학 변형을 갖는 유도체, 예컨대 AD-10792, AD-12382, AD-12384, AD-12341의 생체내 활성을 보여준다.
도 10a는 제형된 AD-10792의 단일 복용량 후 랫트에서 PCSK9 전사체 수준 및 총 혈청 콜레스테롤 수준에 대한 PCSK9 siRNA의 효과를 보여준다. 도 10b는 도 10a와 같은 실험에서 혈청 총 콜레스테롤 수준에 대한 PCSK9 siRNA의 효과를 보여준다. 제형된 AD-10792의 단일 복용량은 ~3-4주까지 기준선으로 되돌아 가는 랫트에서 총 콜레스테롤의 ~60% 저하로 귀결된다. 도 10c는 도 10a와 동일한 실험에서 간 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준에 대한 PCSK9 siRNA의 효과를 보여준다.
도 11은, 간 LDL 수용체 수준이 랫트에서 PCSK9 siRNA의 투여 후에 상향조절되었다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯(Western blot)이다.
도 12a-12d는 제형된 AD-10792 또는 AD-9680의 단일 복용량 후에 비-인간 영장류에서 LDLc에 대한 PCSK9 siRNA의 효과 및 ApoB 단백질 수준, 총 콜레스테롤/HDLc 비, 및 PCSK9 단백질 수준 각각의 효과를 보여준다.
도 13a는, 비-변형된 siRNA-AD-A1A (AD-9314)이자만 2'OMe 변형된 siRNA-AD-1A2 (AD-10792)는 아닌 것은 인간 원발성 혈액 단핵구에서 IFN-알파를 유도한다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 13b는, 비-변형된 siRNA-AD-A1A (AD-9314)이지만 2'OMe 변형된 siRNA-AD-1A2 (AD-10792)는 아닌 것은 또한 인간 원발성 혈액 단핵구에서 TNF-알파를 유도했다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 14a는, PCSK9 siRNA siRNA-AD-1A2 (a.k.a. LNP-PCS-A2 또는 a.k.a. "제형된 AD-10792")가 복용 의존 방식으로 마우스 간에서 PCSK9 mRNA 수준를 감소시켰다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 14b는, 5 mg/kg siRNA-AD-1A2의 단일 투여가 48시간 내에 마우스에서 혈청 총 콜레스테롤 수준을 감소시켰다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 15a는, 인간 및 원숭이 PCSK9 (LNP-PCS-C2) (a.k.a. "제형된 AD-9736")를 표적으로 하는 PCSK9 siRNA, 및 마우스 PCSK9 (LNP-PCS-A2) (a.k.a. "제형된 AD-10792")를 표적으로 하는 PCSK9 siRNA가 인간 PCSK9를 발현시키는 이식유전자 마우스에서 간 PCSK9 수준을 감소시켰다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 15b는, LNP-PCS-C2 및 LNP-PCS-A2가 동일한 이식유전자 마우스에서 혈청 PCSK9 수준을 감소시켰다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 16는 3' 말단에서 포스페이트 결합을 통해 Chol-p-(GalNAc)3에 콘쥬게이트된 siRNA의 구조를 보여준다.
도 17는 LCO(GalNAc)3 ((GalNAc)3 - 3'-리토콜릭-올레오일 siRNA 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 siRNA의 구조를 보여준다.
도 18는 마우스에서 PCSK9 전사체 수준 및 총 혈청 콜레스테롤에 대한 콘쥬게이션 siRNA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 랫트에서 PCSK9 전사체 수준 및 총 혈청 콜레스테롤에 대한 지질 제형된 siRNA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20는 표 6에서 기재된 바와 같이 AD-9680 및 AD-9680의 변이를 사용하는 HeL세포에서 PCSK9 전사체 수준에 대한 siRNA 형질주입의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 21는 표 6에서 기재된 바와 같이 AD-14676 및 AD-14676의 변이를 사용하는 HeL세포에서 PCSK9 전사체 수준에 대한 siRNA 형질주입의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 Hep3B 세포의 PCSK9 표적화된 siRNA 형질주입의 결과 및 PCSK9 및 표적외(off-target) 유전자 수준에 대한 효과를 보여주는 그래프이다.
도 23는 PCSK9 표적화된 siRNA의 유지 복용량에 의한 랫트에서 처리의 결과를 보여준다.
도 24는 변형된 siRNA에 의한 HeL세포의 처리의 복용 반응 곡선이다.
도 25는 인간 PCSK9 전사체에서 siRNA의 평균 IC50 대 표적 위치의 그래프이다. 큰 청색 점은 IC50, 및 AD-9680의 위치를 나타낸다.
도 26는 rEHDL 제형된 콜레스테롤 콘쥬게이트된 siRNA의 투여의 결과는 보여주는 그래프이다.
도 27a는 제2 생성 LNP 제형된 PCSK9 표적화된 siRNA (LNP11 중 AD-9680)의 비-인간 영장류에의 투여의 결과를 나타내는 그래프이고, 이는 PCSK9 단백질 및 LDLc 수준 모두의 감소를 설명한다. LDLc: 저밀도 지질단백질 콜레스테롤; mpk: mg/kg.
도 27b는 PCSK9를 표적으로 하는 LNP 제형된 siRNA에 의한 처리 후, 비-인간 영장류에서 복용 의존 PCSK mRNA 발현억제를 보여주는 막대 그래프이다.
도 27c는 제2 생성 LNP 제형된 PCSK9 표적화된 siRNA (AD-9680)의 비-인간 영장류에의 투여의 결과를 보여주는 그래프이고, 이는 HDLc 수준에서 무변화를 설명한다.
도 28은 양이온성 지질 MC3 및 ALNY-100의 화학 구조를 설명한다.
도 29는 LNP-09 제형된 AD-10792, 설치류 PCSK9를 표적으로 하는 siRNA의 투여 후, 랫트에서 PCSK9 mRNA에 대한 효과 및 혈청 콜레스테롤 수준의 그래프이다.
도 30은 LNP-09 제형된 AD-10792, 설치류 PCSK9를 표적으로 하는 siRNA 의 투여 후, CETP/ApoB tg 마우스에서 PCSK9 mRNA에 대한 효과 및 LDL/HDL 입자 수의 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 PCSK9 유전자를 발현억제하기 위해 이중가닥 리보핵산 (dsRNA)를 사용하여 PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 조정될 수 있는 질환, 예컨대 고지혈증의 치료 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명은 dsRNA를 사용하여 대상체에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, PCSK9 유전자의 발현을 하향 조절하여 조정될 수 있는 병리적 상태 및 질환, 예컨대 고지혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. dsRNA는 RNA 간섭 (RNAi)로서 공지된 프로세스를 통해 mRNA의 서열 특이적 분해를 인도한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 dsRNA는 30개 미만 길이의 뉴클레오티드, 일반적으로 19-24개 길이의 뉴클레오티드인 영역을 갖는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함하고 PCSK9 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적이다. 이들 dsRNA의 사용은 LDL 수용체의 조절 및 순환 콜레스테롤 수준과 연관된 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 세포 기반 및 동물 검정을 사용하여, 본 발명자들은, 이들 dsRNA의 초저 복용량이 RNAi를 명확하고 효과적으로 조정할 수 있는 것을 설명했고, 이는 PCSK9 유전자의 발현의 유의한 억제로 귀결된다. 따라서, 이들 dsRNA를 포함하는 방법 및 조성물은 PCSK9의 하향 조절에 의해 조정될 수 있는 병리적 프로세스의 치료에, 예컨대 고지혈증의 치료에 유용하다.
하기 상세한 설명은 dsRNA, 및 표적 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위해 dsRNA를 함유하는 조성물, 뿐만 아니라 PCSK9의 발현의 하향 조절에 의해 조정될 수 있는 질환, 예컨대 고지혈증의 치료를 위한 조성물 및 방법을 어떻게 만들고 사용하는 지를 개시한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 30개 미만 길이의 뉴클레오티드, 일반적으로 19-24개 길이의 뉴클레오티드이고 PCSK9 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적인 상보성의 영역을 갖는 안티센스 가락을 갖는 dsRNA를, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한다.
따라서, 본 발명의 어떤 양태는 PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA를 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물, PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위해 조성물을 사용하는 방법, 및 PCSK9의 발현을 하향 조절하여 질환을 치료하기 위해 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
정의
편의상 명세서, 실시예, 및 첨부된 특허청구범위에서 이용하는 특정 용어 및 어구의 의미를 아래에 나타낸다. 본 명세서의 다른 부분에서의 용어 사용과 본 부분에서 제공하는 그 정의 간에 명백한 불일치가 존재하는 경우, 본 부분의 정의가 우선하게 된다.
각각의 "G," "C," "A" 및 "U"는 일반적으로 각각 염기인 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다. "T" 및 "dT"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 뉴클레오염기가 티민인 데옥시리보뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보티민을 나타낸다. 그러나 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드" 또는 "데옥시리보뉴클레오티드"라는 용어가 하기에서 더 상세히 다루어질 개질 뉴클레오티드 또는 대용 치환부를 또한 나타낼 수 있다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실이 이러한 치환부를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않으면서 다른 부분으로 치환될 수 있다는 것을 잘 인지하고 있다. 비제한적으로 예를 들어, 그 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 예를 들어 이노신을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 치환될 수 있다. 이러한 치환부를 포함하는 서열도 본 발명의 구현예에 속한다.
본원에서 사용되는 "PCSK9"는 프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신(kexin) 9의 유전자 또는 단백질(FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1로도 알려져 있음)을 나타낸다. PCSK9의 mRNA 서열의 예에는 비제한적으로 다음 것들이 포함된다: 인간: NM_174936; 마우스: NM_153565, 및 래트: NM_199253. PCSK9 mRNA 서열의 추가예는 예컨대 GenBank를 이용하여 쉽게 입수할 수 있다.
본원에서 사용되는 "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 프로세싱 산물인 mRNA를 포함하는, PCSK9 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 인접 부분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 이용하여 부르는 서열로 기재되는 뉴클레오티드쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에서 사용되며 달리 나타내지 않는 한, "상보적인"이라는 용어는 제 2 뉴클레오티드 서열에 대해 제 1 뉴클레오티드 서열을 설명할 때 사용되는 경우에, 당업자가 이해하는 바와 같이, 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건 하에서 혼성화하여 이중체 구조를 형성하는 능력을 나타낸다. 이러한 조건은, 예를 들어 다음을 포함하는 엄격한 조건일 수 있다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA로 50℃ 또는 70℃에서 12~16시간 처리 후 세척. 유기체 내에서 겪을 수 있는 생리학적 연관 조건과 같은 다른 조건도 적용할 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종 용도에 따라 두 서열의 상보성 평가에 가장 적절한 조건 세트를 결정할 수 있을 것이다.
여기에는 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제 1 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 제 2 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 염기쌍 형성이 포함된다. 이러한 서열은 서로에 대해 "완전 상보적인" 것으로 부를 수 있다. 그러나 두 서열이 완전 상보적일 수도 있고, 혹은 혼성화 시 이들이 1개 이상의, 그러나 일반적으로는 4, 3, 또는 2개 이하의 불일치 염기쌍을 형성하여도 이들의 궁극적 용도에 가장 연관된 조건 하에서 혼성화하는 능력을 보유하는 경우에도, 본원에서 제 1 서열은 제 2 서열에 대해 "실질적으로 상보적인" 것으로 불린다. 그러나 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에 1개 이상의 단일쇄 돌출서열(overhang)을 형성하도록 고안되는 경우, 이러한 돌출서열은 상보성 결정에 관해 불일치로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 21개 뉴클레오티드 길이인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 23개 뉴클레오티드 길이인 또 다른 올리고뉴클레오티드를 갖는 dsRNA에 있어서, 더 긴 올리고뉴클레오티드는 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대해 완전 상보적인 21개 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우, 여전히 "완전 상보적인" 것으로 부를 수 있다.
본원에서 사용되는 "상보적인" 서열은 또한 혼성화 능력에 대한 상기 요건이 충족되는 한 비-Watson-Crick형 염기쌍 및/또는 비천연 및 개질 뉴클레오티드로 형성되는 염기쌍을 포함하거나 또는 이것으로 완전히 형성될 수 있다. 이와 같은 비-Watson-Crick형 염기쌍에는 비제한적으로 G:U Wobble 또는 Hoogstein 염기쌍 형성이 포함된다.
본원에서 "상보적인", "완전 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인"이라는 용어는 이들이 사용되는 문맥에서 이해되는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 간, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열 간의 염기 매칭에 대해 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는 5' UTR, 개방 해독틀(ORF), 또는 3' UTR을 포함하여, 관심 mRNA(예컨대 PCSK9를 암호화하는 mRNA)의 인접부에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 PCSK9를 암호화하는 mRNA의 비단속부에 실질적으로 상보적인 경우, PCSK9 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 것이다.
본원에서 사용되는 "이중쇄 RNA" 또는 "dsRNA"라는 용어는 2개의 역평행하며 상기에서 정의된 바와 같은 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 이중체 구조를 나타낸다. 일반적으로 각 가닥에서 대부분의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세히 기재되는 바와 같이 각 가닥 또는 두 가닥이 모두 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 개질 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "dsRNA"에는 다중 뉴클레오티드에서의 실질적 개질을 포함하며, 본원에 개시되거나 당분야에 공지된 모든 유형의 개질을 포함하는 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 개질이 포함될 수 있다. siRNA 유형 분자에서 사용되는 바와 같은 모든 이러한 개질이 본 명세서와 특허청구범위의 목적을 위해 "dsRNA"에 포함된다.
이중체 구조를 형성하는 2개 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있고, 또는 이들이 별도의 RNA 분자일 수도 있다. 개별 RNA 분자인 경우, 이러한 dsRNA는 종종 문헌에서 siRNA(짧은 간섭 RNA, short interfering RNA)로 불린다. 두 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고 따라서 이중체 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단 및 다른 가닥의 5'-말단 간의 뉴클레오티드의 비단속 사슬에 의해 연결되는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프", "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"로 불린다. 두 가닥이 이중체 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단 및 다른 가닥의 5'-말단 간의 뉴클레오티드의 비단속 사슬 이외의 수단에 의해 공유 결합된 경우, 그 연결 구조는 "링커"로 불린다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 최대 염기쌍수는 가장 짧은 가닥의 dsRNA 내 뉴클레오티드의 수 - 이중체에 존재하는 임의 돌출서열이다. 또한 이중체 구조에 더하여, dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌출서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 각 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세히 기재되는 바와 같이 각 가닥 또는 두 가닥이 모두 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 개질 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "dsRNA"에는 다중 뉴클레오티드에서의 실질적 개질을 포함하며, 본원에 개시되거나 당분야에 공지된 모든 유형의 개질을 포함하는 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 개질이 포함될 수 있다. siRNA 유형 분자에서 사용되는 바와 같은 모든 이러한 개질이 본 명세서와 특허청구범위의 목적을 위해 "dsRNA"에 포함된다.
본원에서 사용되는 "뉴클레오티드 돌출서열"이란 dsRNA에서 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서서 연장되는 경우 또는 반대의 경우에, dsRNA의 이중체 구조로부터 돌출하는 비결합 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 나타낸다. "블런트(blunt)" 또는 "블런트 말단"이란 dsRNA의 말단에 비결합 뉴클레오티드가 없다는, 즉 뉴클레오티드 돌출서열이 없다는 것을 의미한다. "블런트 말단" dsRNA는 그 전체 길이가 이중 가닥인, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오티드 돌출서열이 없는 dsRNA이다. 명확히 하기 위해, siRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합된 화학적 캡 또는 비-뉴클레오티드 화학적 부분은 siRNA가 돌출서열을 갖는지나 블런트 말단으로 되어 있는지 여부를 결정하는데 있어 고려되지 않는다.
"안티센스 가닥"이라는 용어는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA 가닥을 나타낸다. 본원에서 사용되는 "상보성 영역"이라는 용어는 해당 서열, 예를 들어 본원에서 정의되는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 나타낸다. 상보성 영역이 표적 서열에 대해 완전 상보적이지 않은 경우, 분자의 내부 또는 말단 영역에 불일치가 존재할 수 있다. 일반적으로 가장 잘 관용되는 불일치는 말단 영역, 예컨대 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2개 뉴클레오티드 내에 존재한다.
본원에서 사용되는 "센스 가닥"이라는 용어는 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA 가닥을 나타낸다.
dsRNA에 대해 말할 때 "세포 내로의 도입"이란 당업자에게 이해되는 바와 같이 세포 내로의 섭취 또는 흡수의 촉진을 의미한다. dsRNA의 흡수 또는 섭취는 도움받지 않는 확산성 또는 능동성 세포 절차를 통해, 또는 보조 제제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. 본 용어의 의미는 시험관 내 세포에만 제한되지 않는다; dsRNA는 또한 살아있는 유기체의 일부인 "세포 내로 도입"될 수 있다. 이러한 경우, 세포 내로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어 생체 내 전달을 위해, dsRNA를 조직 부위로 주사하거나 또는 전신 투여할 수 있다. 시험관 내 세포 내로의 도입에는 일렉트로포레이션 및 리포펙션과 같은 당분야에 공지된 방법이 포함된다.
"비발현", "의 발현을 저해하는", "의 발현을 하향 조절하는", "의 발현을 억제하는" 등의 용어는 이들이 PCSK9 유전자에 관해 언급되는 한, 본원에서는 PCSK9 유전자 발현의 적어도 일부 억제를 나타내며, PCSK9 유전자가 전사되고 PCSK9 유전자의 발현이 저해되도록 처리된 제 1 세포 또는 세포군으로부터 단리할 수 있는 PCSK9 mRNA량이 그렇게 처리되지 않은 것을 제외하고는 제 1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일한 제 2 세포 또는 세포군(대조군 세포)에 비해 감소한 것으로 확인된다. 저해 정도는 보통 다음과 같이 표현된다:
{[(대조군 세포에서의 mRNA) - (처리 세포에서의 mRNA)]/(대조군 세포에서의 mRNA)}*100%
이와는 달리, 저해 정도는 PCSK9 유전자 발현에 기능적으로 연관된 매개변수, 예컨대 세포에 의해 생성되는 PCSK9 유전자가 암호화하는 단백질의 양 또는 특정 표현형을 나타내는 세포의 수의 감소로 주어질 수 있다. 원칙적으로 표적 유전자의 비발현은 지속적으로 또는 게놈 조작에 의해, 그리고 임의의 적절한 분석에 의해 표적을 발현하는 임의 세포에서 결정할 수 있다. 그러나 주어진 dsRNA가 PCSK9 유전자의 발현을 일정 정도로 저해하는지 그리하여 본 발명에 포함되는지 여부를 결정하기 위해 참조가 필요한 경우, 하기 예에 제공되는 분석이 그러한 참조로 쓰이게 된다.
PCSK9 발현의 문맥에서 본원에서 사용하는 "처리하다", "처리" 등의 용어는 PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 나타낸다. 본 발명의 문맥에서 이것이 본원에 언급되는 임의의 다른 상태에 관한(PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정 이외의) 것인 한, "처리하다", "처리" 등의 용어는 해당 상태과 관련된 하나 이상의 증상을 경감 또는 완화, 또는 그러한 상태의 진행을 지연 또는 역전시키는 것을 의미한다. 예를 들어 고지혈증과 관련하여, 치료에는 혈청 지질 수준의 감소가 관여될 것이다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"이라는 어구는 PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정 또는 PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 명백한 과잉 징후의 치료, 예방 또는 관리에 치료적 효용을 제공하는 양을 나타낸다. 구체적인 치료적 유효량은 일반적 의학 종사자가 쉽게 결정할 수 있고, 당분야에 공지된 요인, 예컨대 PCSK9 유전자의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 유형, 환자의 병력 및 연령, PCSK9 유전자 발현의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 단계 및 PCSK9 유전자 발현의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 기타 저해제의 투여 등에 따라 다를 수 있다.
본원에서 사용되는 "약제학적 조성물"에는 약리학적 유효량의 dsRNA 및 약제학적으로 허용 가능한 담체가 포함된다. 본원에서 사용되는 "약학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 의도된 약학적, 치료적 또는 예방적 결과를 만드는데 효과적인 RNA의 양을 나타낸다. 예를 들어 질환 또는 장애에 연관된 측정 가능한 매개변수에 25% 이상의 감소가 있는 경우에 주어진 임상 치료가 효과적인 것으로 간주된다면, 그 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료적 유효량은 그 매개변수를 25% 이상 감소시키는데 필요한 양이다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 치료제의 투여를 위한 담체를 나타낸다. 이러한 담체에는 비제한적으로 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합이 포함되며, 아래에 보다 상세히 기재된다. 이 용어에는 특히 세포 배양 배지는 배제된다.
본원에서 사용되는 "형질전환된 세포"는 dsRNA 분자를 발현할 수 있는 벡터가 도입된 세포이다.
이중 가닥 리보핵산(dsRNA)
아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명은 세포 또는 포유류에서 PCSK9 유전자의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 갖는 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 dsRNA에는 PCSK9 유전자의 발현으로 형성되는 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥이 포함되며, 상보성 영역은 30개 미만 뉴클레오티드 길이, 일반적으로는 19-24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에 있어서, dsRNA는 PCSK9 유전자를 발현하는 세포와 접촉 시, 예컨대 본원에 기재되는 분석으로 측정되는 바와 같이 상기 PCSK9 유전자를 저해한다. 예를 들어, HepB3 세포와 같은 세포 배양 시 PCSK9 유전자의 발현은 예컨대 bDNA 또는 TaqMan 분석에 의해 PCSK9 mRNA 수준을 측정함으로써, 또는 예컨대 ELISA 분석에 의해 단백질 수준을 측정함으로써 분석할 수 있다. 본 발명의 dsRNA에는 또한 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드 돌출서열이 포함될 수 있다.
dsRNA는 예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.에서 시판하는 자동화 DNA 합성기를 사용하여, 하기에서 추가 논의되는 바와 같은 당분야에 공지된 표준 방법으로 합성할 수 있다. dsRNA에는 혼성화하여 이중체 구조를 형성하기에 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 포함된다. 한 가닥의 dsRNA(안티센스 가닥)는 PCSK9 유전자의 발현 동안 형성되는 mRNA 서열에서 유래하는 표적 서열에 실질적으로 상보적인, 그리고 일반적으로는 완전 상보적인 상보성 영역을 가질 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)에는 안티센스 가닥에 상보적이어서 두 가닥이 적합한 조건 하에서 조합되는 경우에 혼성화하여 이중체 구조를 형성하도록 하는 영역이 포함된다. 일반적으로 이중체 구조는 15 내지 30, 또는 25 내지 30, 또는 18 내지 25, 또는 19 내지 24, 또는 19 내지 21, 또는 19, 20, 또는 21개 염기쌍 길이이다. 한 구현예에 있어서, 이중체는 19개 염기쌍 길이이다. 또 다른 구현예에 있어서, 이중체는 21개 염기쌍 길이이다. 두 개의 상이한 siRNA를 병용하는 경우, 이중체 길이는 동일할 수도 있고 혹은 상이할 수도 있다.
본 발명의 dsRNA의 각 가닥은 일반적으로 15 내지 30, 또는 18 내지 25, 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오티드 길이이다. 다른 구현예에 있어서, 각 가닥은 25-30개 뉴클레오티드 길이이다. 이중체의 각 가닥은 동일한 길이일 수도 있고 혹은 상이한 길이일 수도 있다. 두 개의 상이한 siRNA를 병용하는 경우, 각각의 siRNA의 각 가닥 길이는 동일할 수도 있고 혹은 상이할 수도 있다.
본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 하나 이상의 단일 가닥 돌출서열(들)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, dsRNA의 적어도 하나의 말단은 1 내지 4, 일반적으로 1 또는 2개 뉴클레오티드를 갖는 단일 가닥 뉴클레오티드 돌출서열을 갖는다. 또 다른 구현예에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 센스 가닥에 걸쳐 3' 말단 및 5' 말단에서 각각 1-10개 뉴클레오티드를 갖는 돌출서열을 갖는다. 추가 구현예에 있어서, dsRNA의 센스 가닥은 안티센스 가닥에 걸쳐 3' 말단 및 5' 말단에서 각각 1-10개 뉴클레오티드를 갖는 돌출서열을 갖는다.
적어도 하나의 뉴클레오티드 돌출서열을 갖는 dsRNA는 블런트-말단 대응물에 비해 예기치 못하게 우수한 저해 특성을 가질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단 한 개의 뉴클레오티드 돌출서열의 존재는 그 전체 안정성에는 영향을 미치지 않으면서 dsRNA의 간섭 활성을 강화시킨다. 단 하나의 돌출서열을 갖는 dsRNA는 생체 내뿐만 아니라 다양한 세포, 세포 배양 배지, 혈액 및 혈청 중에서 특히 안정하고 효과적인 것으로 드러났다. 일반적으로 단일 가닥 돌출서열은 안티센스 가닥의 3'-말단에 또는 이와는 달리 센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. dsRNA는 또한 일반적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 위치하는 블런트 말단을 가질 수 있다. 이러한 dsRNA는 개선된 안정성 및 저해 활성을 가져서 저용량에서, 즉 1일 5 mg/수용자 체중 kg 미만으로 투여할 수 있다. 일반적으로 dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오티드 돌출서열을 가지며, 5'-말단은 블런트이다. 또 다른 구현예에 있어서, 돌출서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 치환된다.
dsRNA는 예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.에서 시판하는 자동화 DNA 합성기를 사용하여, 하기에서 추가 논의되는 바와 같은 당분야에 공지된 표준 방법으로 합성할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, PCSK9 유전자는 인간 PCSK9 유전자이다. 다른 구현예에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥에는 표 1a, 표 2a, 및 표 5a 의 센스 서열에서 선택되는 제 1 가닥 및 표 1a, 표 2a, 및 표 5a의 안티센스 서열에서 선택되는 제 2 가닥을 포함한다. 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에서 제공하는 표적 서열에서 다른 부위를 표적화하는 대안적인 안티센스 제제는 PCSK9 서열에 인접한 표적 서열을 이용하여 쉽게 결정할 수 있다.
예를 들어, dsRNA AD-9680(표 1a)은 PCSK 9 유전자를 3530-3548에서 표적화한다; 따라서 표적 서열은 다음과 같다: 5' UUCUAGACCUGUUUUGCUU 3'(서열 번호 1523). dsRNA AD-10792(표 1a)는 PCSK9 유전자를 1091-1109에서 표적화한다; 따라서 표적 서열은 다음과 같다: 5' GCCUGGAGUUUAUUCGGAA 3'(서열 번호 1524). 본 발명에는 서열 번호 1523 및 서열 번호 1524에 대한 상보성 영역을 갖는 dsRNA가 포함된다.
추가 구현예에 있어서, dsRNA에는 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공하는 서열군에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 다른 구현예에 있어서, dsRNA에는 이 군에서 선택되는 2개 이상의 서열이 포함되며, 여기서 2개 이상의 서열 중 하나는 두 개 이상의 서열 중 또 다른 것에 상보적이며, 2개 이상의 서열 중 하나는 PCSK9 유전자의 발현 시 생성되는 mRNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 일반적으로 dsRNA에는 2개의 올리고뉴클레오티드가 포함되며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에서 센스 가닥으로 기재되고, 제 2 올리고뉴클레오티드는 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에서 안티센스 가닥으로 기재된다.
당업자는 20 내지 23, 특히 21개 염기쌍의 이중체 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀진 것을 잘 인지하고 있다(Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 이들이 더 짧거나 더 긴 dsRNA도 역시 효과적일 수 있다는 것을 발견하였다. 상술된 구현예에 있어서, 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공하는 올리고뉴클레오티드 서열의 특성 상, 본 발명의 dsRNA에는 최소한 21개 뉴클레오티드 길이의 가닥이 하나 이상 포함될 수 있다. 표 1a, 표 2a, 및 표 5a의 서열 중 하나의 한쪽 또는 양쪽 말단에 몇개의 뉴클레오티드만을 뺀 더 짧은 dsRNA도 상술된 dsRNA에 비견할 만큼 유사하게 효과적일 수 있음을 합리적으로 예측할 수 있다. 따라서 표 1a, 표 2a, 및 표 5a의 서열 중 하나로부터 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 인접 뉴클레오티드의 일부 서열을 가지며, 본원에서 하기에 기재되는 바와 같은 FACS 분석에서 PCSK9 유전자의 발현을 저해하는 능력이 전체 서열을 포함하는 dsRNA의 저해 대비 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하로 상이한 dsRNA가 본 발명에 포함된다. 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공하는 표적 서열 내에서 절단되는 추가적 dsRNA는 제공하는 PCSK9 서열 및 표적 서열을 이용하여 쉽게 제조할 수 있다.
또한, 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공하는 RNAi 제제는 RNAi에 기반해 절단되기 쉬운 PCSK9 mRNA 내 부위를 동정한다. 이와 같이 본 발명에는 본 발명의 한 제제에 의해 표적화되는 서열 내를 표적화하는 RNAi 제제가 추가로 포함된다. 본원에서 사용되는 제 2 RNAi 제제는 제 2 RNAi 제제가 제 1 RNAi 제제의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA 내 어느 곳에서든 메시지를 절단하는 경우, 제 1 RNAi 제제의 서열 내를 표적화한다고 말한다. 이러한 제 2 제제는 일반적으로 PCSK9 유전자의 선택된 서열에 인접한 영역에서 취하는 추가적 뉴클레오티드 서열에 연결된 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공되는 하나의 서열에서 15개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어질 것이다. 예를 들어 서열 번호 1의 마지막 15개 뉴클레오티드(첨가된 AA 서열 제외)와 조합된 표적 PCSK9 유전자 유래의 다음 6개 뉴클레오티드로 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에 제공되는 하나의 서열에 기반한 21개 뉴클레오티드의 단일 가닥 제제가 얻어진다.
본 발명의 dsDNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 1개 이하, 2개 이하, 또는 3개 이하의 불일치를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 표적 서열에 대한 불일치를 포함하며, 불일치 영역은 상보성 영역의 중앙에 위치하지 않는다. 또 다른 구현예에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 어느 한 말단에서부터 5개 뉴클레오티드 이내로, 예를 들어 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단에서 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드로 제한된다. 예를 들어, PCSK9유전자 영역에 상보적인 23개 뉴클레오티드 dsRNA 가닥에 있어서, dsRNA는 중심의 13개 뉴클레오티드 내에는 불일치를 포함하지 않는다. 본 발명에서 기재되는 방법을 이용하여 표적 서열에 대한 불일치를 포함하는 dsRNA가 PCSK9유전자의 발현을 저해하는데 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. PCSK9 유전자의 발현을 저해하는데 있어서 불일치를 갖는 dsRNA의 효능에 대한 고려는, 특히 PCSK9유전자의 특정 상보성 영역이 모집단 내에 다형성 서열 변이를 갖는 경우에 중요하다.
하나의 구현예에 있어서, dsRNA의 적어도 한 말단은 1 내지 4, 일반적으로 1 또는 2개 뉴클레오티드의 단일 가닥 뉴클레오티드 돌출서열을 갖는다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌출서열을 갖는 dsRNA는 블런트 말단의 대응물에 비해 예기치 못하게 우수한 저해 특성을 갖는다. 또한, 본 발명자들은 단 1개의 뉴클레오티드 돌출서열의 존재가 그 전체적 안정성에 영향을 미치지 않으면서 dsRNA의 간섭 활성을 강화시킨다는 것을 발견하였다. 단 1개의 돌출서열을 갖는 dsRNA는 생체 내뿐만 아니라 다양한 세포, 세포 배양 배지, 혈액, 및 혈청에서도 특히 안정하고 효과적인 것으로 입증되었다. 일반적으로 단일 가닥 돌출서열은 안티센스 가닥의 3'-말단에 또는 이와는 달리센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. dsRNA는 또한 일반적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 위치하는 블런트 말단을 가질 수 있다. 이러한 dsRNA는 개선된 안정성 및 저해 활성을 가져서 저용량, 즉 1일 5 mg/수용자 체중 kg 미만으로 투여할 수 있다. 일반적으로 dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오티드 돌출서열을 가지며, 5'-말단은 블런트이다. 또 다른 구현예에 있어서, 돌출서열 내 1개 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 치환된다.
화학적 개질 및 콘쥬게이트
또 다른 구현예에 있어서, dsRNA를 화학적으로 개질하여 안정성을 증강시킨다. 본 발명의 핵산은 당분야에 널리 확립된 방법으로, 예컨대 본원에 참조함으로써 통합되는 ["Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. 등 (Edrs.), John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 바와 같이 합성 및/또는 개질할 수 있다. 화학적 개질에는 비제한적으로 2' 개질, 올리고뉴클레오티드의 다른 부위의 당 또는 염기 개질, 올리고뉴클레오티드 사슬 내로의 비천연 염기의 도입, 리간드 또는 화학적 부분으로의 공유 부착, 및 뉴클레오티드 내부 포스페이트 연결의 티오포스페이트와 같은 대안적 연결로의 치환이 포함될 수 있다. 둘 이상의 상기 개질을 채용할 수 있다.
두 개별 dsRNA 가닥의 화학적 연결은 여러 널리 공지된 기법, 예를 들어 공유, 이온 또는 수소 결합의 도입; 소수성 상호작용, 반 데르 발스 또는 적층 상호작용의 도입에 의해; 금속 이온 배위에 의해 또는 퓨린 유사체의 사용을 통해 달성할 수 있다. 일반적으로, dsRNA를 개질하는데 사용할 수 있는 화학기에는 비제한적으로 메틸렌 블루; 2관능기, 일반적으로 비스-(2-클로로에틸)아민; N-아세틸-N'-(p-글리옥실벤조일)시스타민; 4-티오우라실; 및 프소랄렌이 포함된다. 하나의 구현예에 있어서, 링커는 헥사-에틸렌 글리콜 링커이다. 이 경우, dsRNA는 고상 합성으로 제조되며, 헥사-에틸렌 글리콜 링커는 표준 방법에 따라 도입된다(예컨대, Williams, D.J., 및 K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). 특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 헥사에틸렌 글리콜 링커를 통해 화학적으로 연결된다. 또 다른 구현예에 있어서, dsRNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트기를 포함한다. dsRNA 말단의 화학적 결합은 일반적으로 3중 나선 결합으로 형성된다. 표 1a, 표 2a, 및 표 5a에서는 본 발명의 RNAi 제제의 개질예를 제공한다.
또 다른 구현예에 있어서, 두 단일 가닥의 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오티드를 개질하여 세포 효소, 비제한적으로 예를 들어 특정 핵산분해효소의 분해 활성을 방지하거나 저해할 수 있다. 핵산에 대한 세포 효소의 분해 활성 저해 기법은 2'-아미노 개질, 2'-아미노당 개질, 2'-F 당 개질, 2'-F 개질, 2'-알킬 당 개질, 비하전 골격 개질, 모르폴리노 개질, 2'-O-메틸 개질, 및 포스포르아미데이트를 비제한적으로 포함하여 당분야에 공지되어 있다(예컨대, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8 참고). 따라서 dsRNA 상 뉴클레오티드의 적어도 하나의 2'-히드록실기를 화학기, 일반적으로 2'-아미노기 또는 2'-메틸기로 치환한다. 또한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 개질하여 잠긴 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 이처럼 잠긴 뉴클레오티드는 리보오스의 2'-산소와 리보오스의 4'-탄소를 연결하는 메틸렌 가교를 포함한다. 잠긴 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 [Koshkin, A.A., 등, Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630 및 Obika, S. 등, Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404)]에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드 내로의 잠긴 뉴클레오티드의 도입은 상보적인 서열에 대한 친화도를 개선시키고 용융 온도를 여러 온도 증가시킨다(Braasch, D.A. 및 D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).
dsRNA로의 리간드 콘쥬게이션은 그 세포 흡수뿐만 아니라 특정 유형의 세포, 예컨대 간세포에 의한 특정 조직으로의 표적화 또는 섭취를 증강시킬 수 있다. 특정 예에 있어서, 소수성 리간드를 dsRNA에 콘쥬게이션하여 세포막의 직접 투과 및/또는 간 세포를 통한 섭취를 촉진한다. 이와는 달리, dsRNA에 콘쥬게이트된 리간드는 수용체 매개 세포내 이입을 위한 기질이다. 이러한 접근을 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 dsRNA 제제의 세포 투과를 촉진시킨다. 예를 들어 콜레스테롤을 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이션시켜 이들의 비콘쥬게이션 유사체에 비해 실질적으로 더 활성이 높은 화합물을 얻었다. [M. Manoharan Antisense ＆ Nucleic acid Drug Development 2002, 12, 103]를 참고하라. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된 다른 친유성 화합물에는 1-피렌 부티르산, 1,3-비스-O-(헥사데실)글리세롤 및 멘톨이 포함된다. 수용체 매개 세포내 이입을 위한 리간드의 한 예로는 엽산이 있다. 엽산은 폴레이트-수용체 매개 세포내 이입에 의해 세포에 들어간다. 엽산을 포함하는 dsRNA 화합물은 폴레이트-수용체 매개 세포내 이입을 통해 세포 내로 효율적으로 수송되게 된다. Li 및 공동 연구자들은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단으로의 엽산 부착이 올리고뉴클레오티드의 세포 섭취를 8배 증가시켰다고 보고했다[Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540]. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된 다른 리간드에는 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 클러스터, 가교제, 포르피린 콘쥬게이트, 전달 펩티드 및 지질, 예컨대 콜레스테롤 및 콜레스테릴아민이 포함된다. 탄수화물 클러스터의 예에는 Chol-p-(GalNAc)3 (N-아세틸 갈락토사민 콜레스테롤) 및 LCO(GalNAc)3 (N-아세틸 갈락토사민-3'-리토콜릭-올레일)이 포함된다.
특정 예에 있어서, 양이온성 리간드의 올리고뉴클레오티드로의 콘쥬게이션으로 핵산분해효소에 대한 내성이 개선된다. 양이온성 리간드의 대표예로는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄이 있다. 흥미롭게도, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양이온성 리간드가 올리고뉴클레오티드 전반에 분산된 경우 mRNA에 대한 높은 결합 친화도를 보유하는 것으로 보고되었다. [M. Manoharan Antisense ＆ Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103] 및 그 참고문헌을 참조하라.
일부 경우에 있어서, 리간드가 다관능성이고/이거나 dsRNA가 둘 이상의 리간드에 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, dsRNA를 섭취 개선을 위해 하나의 리간드로, 그리고 방출 개선을 위해 제 2 리간드로 콘쥬게이트할 수 있다.
본 발명의 리간드 콘쥬게이트된 dsRNA는 매달린 반응성 관능기, 예컨대 dsRNA 상으로 연결 분자의 부착에서 유래하는 관능기를 갖는 dsRNA를 사용하여 합성할 수 있다. 이 반응성 올리고뉴클레오티드를 시판 리간드, 다양한 보호기를 갖도록 합성된 리간드, 또는 그에 부착된 연결 부분을 갖는 리간드와 직접 반응시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 일부 구현예에 있어서 리간드로 적절히 콘쥬게이트된, 그리고 고상 지지체 재료에 추가 부착될 수 있는 뉴클레오시드 단량체를 사용하여 리간드 콘쥬게이트된 dsRNA의 합성을 촉진한다. 선택적으로 고상 지지체 재료에 부착된 이러한 리간드-뉴클레오시드 콘쥬게이트는 선택된 혈청-결합 리간드와 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 존재하는 연결 부분의 반응에 의해 본원에 기재되는 방법의 특정 구현예에 따라 제조된다. 특정 예에 있어서, dsRNA의 3'-말단에 부착된 아랄킬 리간드를 갖는 dsRNA는 단량체 구성 단위를 장쇄 아미노알킬기를 통해 제어되는 포어를 갖는 유리 지지체에 먼저 공유 부착하여 제조된다. 이어서 뉴클레오티드를 표준 고상 합성 기법을 통해 고체 지지체에 결합된 단량체 구성 단위로 결합시킨다. 단량체 구성 단위는 뉴클레오시드 또는 고상 합성에 상용성인 기타 유기 화합물일 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트에 사용되는 dsRNA는 널리 공지된 고상 합성 방법을 통해 편리하게 일상적으로 제조할 수 있다. 그러한 합성 장비는 예를 들어 Applied Biosystems(Foster City, CA)를 포함하는 일부 공급업체에서 판매된다. 이와 같은 당분야에 공지된 합성을 위한 임의의 다른 방법을 추가적으로 또는 대안적으로 채용할 수 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체를 제조하기 위한 유사 기법을 사용하는 것도 공지되어 있다.
합성
특정 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성에 관한 지침은 다음 미국 특허들에서 발견될 수 있다: 미국 특허 번호 5,138,045 및 5,218,105, 이는 폴리아민 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,212,295, 이는 키랄 인(포스포르us) 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 모노머을 묘사함; 미국 특허 번호 5,378,825 및 5,541,307, 이는 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,386,023, 이는 주쇄 변형된 올리고뉴클레오티드 및 반응성 커플링을 통한 이의 제조 을 묘사함; 미국 특허 번호 5,457,191, 이는 3-데아자퓨린 고리계를 기반으로 하는 변형된 핵염기 및 그의 합성 방법을 묘사함; 미국 특허 번호 5,459,255, 이는 N-2 치환된 퓨린을 기반으로 하는 변형된 핵염기을 묘사함; 미국 특허 번호 5,521,302, 이는 키랄 인 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 묘사함; 미국 특허 번호 5,539,082, 이는 펩타이드 핵산을 묘사함; 미국 특허 번호 5,554,746, 이는 β-락탐 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,571,902, 이는 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 방법 및 물질을 묘사함; 미국 특허 번호 5,578,718, 이는 알킬티오 그룹을 갖는 뉴클레오시드을 묘사함, 여기서 그와 같은 그룹은 뉴클레오시드의 임의의 다양한 위치에서 부착된 다른 모이어티에 대한 링커로서 사용될 수 있음; 미국 특허 번호 5,587,361 및 5,599,797, 이는 높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,506,351, 이는 2'-O-알킬 구아노신, 및 2,6-디아미노퓨린 화합물 포함 관련 화합물의 제조 방법 을 묘사함; 미국 특허 번호 5,587,469, 이는 N-2 치환된 퓨린을 갖는 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,587,470, 이는 3-데아자퓨린을 갖는 올리고뉴클레오티드을 묘사함; 미국 특허 번호 5,223,168, 및 미국 특허 번호 5,608,046, 이들 모두는 콘쥬게이트된 4'-데스메틸 뉴클레오시드 유사체을 묘사함; 미국 특허 번호 5,602,240, 및 5,610,289, 이는 주쇄 변형된 올리고뉴클레오티드 유사체을 묘사함; 미국 특허 번호 6,262,241, 및 5,459,255, 이는 특히, 2'-플루오로-올리고뉴클레오티드의 합성 방법을 묘사함.
본 발명의 서열 특이적 연결된 뉴클레오시드를 보유하는 리간드 콘쥬게이트된 dsRNA 및 리간드-분자에서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체, 또는 연결 모이어티를 이미 보유하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 콘쥬케이트 전구체, 리간드 분자를 이미 보유하는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-콘쥬케이트 전구체, 또는 비-뉴클레오시드 리간드 보유 빌딩 블록(building block)를 이용하는 적당한 DNA 합성장치 상에서 모일 수 있다.
결합 모이어티를 이미 보유하는 뉴클레오티드-콘쥬케이트 전구체를 사용할 때, 서열 특이적 연결된 뉴클레오시드의 합성은 전형적으로 경쟁되고, 그 다음, 리간드 분자는 연결 모이어티와 반응하여 리간드 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 다양한 분자, 예컨대 스테로이드, 비타민, 지질 및 리포터(reporter) 분자를 보유하는 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 이미 기재되어 있었다 (참고 Manoharan et al., PCT 출원 WO　93/07883). 일 구현예에서, 본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 또는 연결된 뉴클레오시드는 상업적으로 이용가능하고 올리고뉴클레오티드 합성에서 일상적으로 사용되는 표준 포스포르아미다이트 및 비-표준 포스포르아미다이트 외에 리간드-뉴클레오시드 콘쥬게이트로부터 유도된 포스포르아미다이트를 사용하여 자동 합성장치에 의해 합성된다.
올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드에서 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-알릴, 2'-O-아미노알킬 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹의 혼입은 올리고뉴클레오티드에 대한 향상된 혼성화 특성을 부여한다. 또한, 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 향상된 뉴클레아제 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 관능화된, 연결된 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 주쇄 또는 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-아미노알킬, 2'-O-알릴 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹 중 하나 또는 모두를 포함하도록 증대될 수 있다. 당해 분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 변형의 일부의 요약 목록은, 예를 들어, PCT 공개 WO 200370918에서 발견된다.
일부 구현예에서, 5'-말단에서 아미노 그룹을 보유하는 본 발명의 관능화된 뉴클레오시드 서열은 DNA 합성장치를 사용하여 제조되고, 그 다음, 선택된 리간드의 활성 에스테르 유도체와 반응한다. 활성 에스테르 유도체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 대표적인 활성 에스테르는 N-히드로석신이미드 에스테르, 테트라플루오로페놀 에스테르, 펜타플루오로페놀 에스테르 및 펜타클로로페놀 에스테르를 포함한다. 아미노 그룹 및 활성 에스테르의 반응은 선택된 리간드가 결합 그룹을 통해 5'-위치에 부착되는 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 5'-말단에서의 아미노 그룹은 5'-아미노-변경자 C6 시약을 시용하여 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 리간드 분자는 리간드-뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 사용에 의해 5'-위치에서 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트될 수 있고, 여기서, 상기 리간드는 링커를 통해 5'-히드록시 그룹에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 그와 같은 리간드-뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 자동 합성 절차의 말기에 전형적으로 사용되어 5'-말단에서 리간드를 보유하는 리간드 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 주쇄의 예는 예를 들어 하기를 포함한다: 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트 포함 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보통 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 역극성을 갖는 것, 여기서, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 연결된 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'이다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다.
상기 인 원자 함유 결합의 제조에 관한 대표적인 미국 특허는 비제한적으로 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 및 5,697,248, 이들 각각은 참고로 본원에 통합되어 있다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 주쇄의 예 (즉, 올리고뉴클레오시드)는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간(intersugar) 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 결합에 의해 형성된 주새를 갖는다. 이들은 하기를 포함한다: 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 일부 형성된) 모폴리노 결합을 갖는 것들; 실록산 주쇄; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 주쇄; 형태아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 형태아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 주쇄를 갖는 알켄; 설파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 파분를 갖는 것들.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조에 관한 대표적인 미국 특허는 비제한적으로 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439, 이들 각각은 참고로 본원에 통합되어 있다.
어떤 예에서, 올리고뉴클레오티드는 비-리간드 그룹에 의해 변형될 수 있다. 수많은 비-리간드 분자는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트되었고, 그와 같은 콘쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용가능하다. 그와 같은 비-리간드 모이어티는 하기를 포함했다: 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides ＆ 뉴클레오티드, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). 그와 같은 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 상기에 열거되었다. 전형적인 콘쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 보유하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 수반한다. 그 다음, 아미노 그룹은 적합한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 콘쥬게이트된 분자와 반응한다. 콘쥬게이션 반응은 고형 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드로 또는 용액 상에서 올리고뉴클레오티드의 절단에 따라 수행될 수 있다. HPLC에 의한 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 정제는 전형적으로 순수한 콘쥬게이트를 제공한다. 콜레스테롤 콘쥬게이트의 사용이 특히 바람직한 것은, 그와 같은 모이어티가 PCSK9 발현의 부위인 표적 간 세포를 증가시킬 수 있기 때문이다.
벡터 암호화된 RNAi 제제
본 발명의 또 다른 양태에서, PCSK9 유전자 발현 활성을 조절하는 PCSK9 특이적 dsRNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현된다 (참조, 예를 들어, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., PCT 국제공개번호 WO 00/22113, Conrad, PCT 국제공개번호 WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허 번호 6,054,299). 이들 전이유전자는 숙주 게놈에 통합된 전이유전자로서 혼입되고 물려받을 수 있는 선형 구성체, 환형 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있다. 전이유전자는 또한, 염색체외 플라스미드로서 물려받는 것을 허용하도록 구성될 수 있다 (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
dsRNA의 개별 가닥은 2개의 별도의 발현 벡터 상의 프로모터에 의해 전사될 수 있고 표적 세포에 형질감염될 수 있다. 대안적으로 dsRNA의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드 상에 위치한 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 일 구현예에서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의햐 연결된 역반복으로서 발현되고, 이로써 dsRNA는 줄기 및 루프(loop) 구조를 갖는다.
재조합 dsRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터를 발현시키는 dsRNA는 비제한적으로, 하기를 기반으로 구성될 수 있다: 아데노 연관 바이러스 (리뷰용, 참조, Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); 아데노바이러스 (참조, 예를 들어, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), 및 Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); 또는 알파바이러스뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 것들. 레트르바이러스는 상피세포를 포함하는 많은 상이한 세포 유형에 다양한 유전자를, 실험실내 및/또는 생체내에서 도입하도록 사용되었다 (참조, 예를 들어, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos 및 Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 번호 4,868,116; 미국 특허 번호 4,980,286; PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출원 WO 92/07573). 세포의 게놈에 삽입된 유전자를 전달 및 발현시킬 수 있는 재조합 레트로바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 게놈을 적당한 패키징 세포주, 예컨대 PA317 및 Psi-CRIP에 형질감염시켜 생성될 수 있다 (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). 재조합 아데노바이러스 벡터는 민감한 숙주 (예를 들어, 랫트, 햄스터, 개, 및 침팬지)에서 다양한 세포 및 조직을 감염시키기 위해 사용될 수 있고 (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), 또한, 감염을 위한 유사분열적 활성 세포를 필요로 하지 않는 이점을 갖는다.
발현될 dsRNA 분자(들)에 대해 코딩을 허용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있고, 그 예는 아데노바이러스 (AV); 아데노 연관 바이러스 (AAV); 레트로바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스 (LV), 라브도바이러스(Rhabdoviruse), 뮤린 백혈병 바이러스); 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터이다. 바이러스 벡터의 친화성은 벡터를 다른 바이러스로부터의 엔빌로프(envelope) 단백질 또는 다른 표면 항원으로 슈도타이핑(pseudotyping)하거나, 적합한 것으로서 상이한 바이러스 캡시드 단백질을 치환하여 변형될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 렌티바이러스 벡터들은 소수포성 구내염 바이러스 (VSV), 광견병, 에볼라(Ebola), 모코라(Mokola), 및 기타 같은 종류의 표면 단백질과 함께 슈도타이핑(pseudotype)될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터들은 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 벡터들을 공작함으로써 상이한 세포들을 표적하도록 만들 수 있다. 예를 들면, 혈청형 2 게놈에서 혈청형 2 캡시드를 발현시키는 AAV 벡터는 AAV 2/2라고 한다. AAV 2/2 벡터안에 이러한 혈청형 2 캡시드 유전자를 혈청형 5 캡시드 유전자로 대체시켜 AAV 2/5 벡터를 만들 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현시키는 AAV 벡터들을 작제하는 기술은 당업계에 기술 범위내에 있다; Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801를 참조하며, 이는 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
본 발명의 용도에 적합한 재조합 바이러스 벡터들의 선별, 이 벡터안으로 dsRNA를 발현시키는 핵산 서열을 삽입시키는 방법들, 그리고 관심 세포로 이러한 바이러스 벡터를 전달하는 방법들은 당업계에 기술 범위내에 있다. 예를 들면, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406를 참조하며, 이들은 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
바람직한 바이러스 벡터들은 AV 및 AAV로부터 유도된 벡터들이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 dsRNA는 예를 들면, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 보유하는 재조합 AAV 벡터로부터 2개의 별도 상보적인 단일-스트랜드 RNA 분자로 발현된다.
본 발명의 dsRNA를 발현시키기 위한 적합한 AV 벡터, 이러한 재조합 AV 벡터를 작제하는 방법, 그리고 이 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010에서 설명하고 있다.
본 발명의 dsRNA를 발현시키기 위한 적합한 AAV 벡터, 이러한 재조합 AV 벡터를 작제하는 방법, 그리고 이 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 미국 특허 제5,252,479호; 미국 특허 제5,139,941호; 국제 특허 출원 WO 94/13788; 그리고 국제 특허 출원 WO 93/24641에서 설명하고 있으며, 이들 내용 전문은 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
DNA 플라스미드 또는 본 발명의 바이러스 벡터안에서 dsRNA 발현을 구동시키는 프로모터는 진핵 RNA 중합효소 I (가령 리보좀 RNA 프로모터), RNA 중합효소 II (가령 CMV 초기 프로모터 또는 악틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로 RNA 중합효소 III 프로모터 (가령 U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터) 또는 예를 들면, T7 프로모터로부터 전사에 필요한 T7 RNA 중합효소를 인코드한다면 T7 프로모터와 같은 원핵 프로모터가 될 수 있다. 또한 이 프로모터는 췌장으로 전이유전자 발현을 지시할 수 있다(가령, 췌장의 인슐린 조절 서열(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515 참조)).
또한, 전이유전자의 발현은 예를 들면, 순환 포도당 수준 또는 호르몬과 같은 특정 생리학적 조절물질에 민감한 조절 서열과 같은 유도성 조절 서열 및 발현 시스템을 이용하여 정확하게 조절될 수 있다(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 또는 포유동물에서 전이유전자 발현의 제어에 적합한 이러한 유도성 발현 시스템은 엑디손(ecdysone), 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이량체화 화학적 유도물질들, 그리고 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드 (EPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업계 숙련자는 dsRNA 전이유전자의 의도된 용도에 근거하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있다.
일반적으로, dsRNA 분자들을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터들은 하기에서 설명되는 것과 같이 전달되며, 그리고 표적 세포들안에서 지속된다. 대안으로, 바이러스 벡터들은 dsRNA 분자들의 일시적 발현을 제공하는데 이용될 수 있다. 이러한 벡터들은 필요할 때 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면, dsRNAs는 표적 RNA에 결합하고, 이의 기능 또는 발현을 조절한다. dsRNA를 발현시키는 벡터들의 운반은 정맥 또는 근육내 투여와 같은 전신(systemic) 투여, 환자로부터 외식(ex-plant)된 표적 세포에 투여하고, 이어서 환자에게로 재도입시키거나 또는 원하는 표적 세포안으로 도입을 허용하는 임의의 기타 수단에 의해 투여될 수 있다.
dsRNA 발현 DNA 플라스미드들은 전형적으로 양이온성 지질 운반체들 (가령 Oligofectamine) 또는 비-양이온성 지질-기반 운반체들 (가령, Transit-TKOTM)과 함께 복합체 형태로 표적 세포로 형질감염된다. 1주일 또는 그 이상의 기간 동안 단일 PCSK9 유전자 또는 다중 PCSK9 유전자의 상이한 부분들을 표적으로 하는 dsRNA-중개된 녹다운을 위한 다중 지질 형질감염도 본 발명에서 고려된다. 본 발명의 벡터 도입의 성공여부는 공지된 다양한 방법들을 이용하여 모니터할 수 있다. 예를 들면, 일시적 형질감염은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 표식의 리포터로 알 수 있다. 체외(ex vivo) 세포들의 안정적인 형질감염은 하이그로마이신 B 저항성과 같이 특정 환경 인자(가령, 항생제 및 약물)에 대한 저항성을 형질감염된 세포에 제공하는 표식들을 이용하여 담보할 수 있다.
PCSK9 특이적 dsRNA 분자들은 벡터안에 삽입될 수 있고, 인간 환자들을 위한 유전자 치료 벡터들로 이용될 수 있다. 유전자 치료 벡터들은 예를 들면, 정맥내 주사, 국소 투여 (미국 특허 제5,328,470호) 또는 3차원 공간(stereotactic) 주사 (가령, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)에 의해 개체로 운반될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 약제학적 조합약(preparation)은 허용되는 희석제 내에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비이클이 박혀있는 서방 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전한 유전자 전달 벡터는 재조합 세포들로부터 고유한 상태, 가령, 레트로바이러스 벡터들로 만들어질 수 있을 경우, 약제학적 조합약은 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포들을 포함할 수 있다.
dsRNA를 함유하는 약제학적 조성물
한 구현예에서, 본 발명은 여기에서 설명된 dsRNA, 그리고 약제학적으로 허용되는 운반체를 함유하는 약제학적 조성물들과 이를 투여하는 방법들을 제공한다. dsRNA를 포함하는 약제학적 조성물은 PCSK9 유전자의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애, 가령, PCSK9 발현에 의해 중개된 병인학적 과정들, 가령, 과지질혈증을 치료하는데 유용하다. 이러한 약제학적 조성물들은 전달 방식에 근거하여 조제된다.
복용량
여기에서 특징화된 약제학적 조성물들은 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 복용량으로 투여된다. 일반적으로, dsRNA의 적합한 일일 용량은 령자 체중 ㎏당 0.01 내지 200.0 ㎎의 범위가 될 것이며, 일반적으로 체중 ㎏당 일일 1 내지 50 mg 범위가 된다. 예를 들면, dsRNA는 1회 투여당 0.01 mg/kg, 0.05/kg, 0.5/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg으로 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 복용량은 0.01 내지 0.2 mg/kg이다. 예를 들면, dsRNA는 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg 0.08 mg/kg 0.09 mg/kg, 0.10 mg/kg, 0.11 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.13 mg/kg, 0.14 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.16 mg/kg, 0.17 mg/kg, 0.18 mg/kg, 0.19 mg/kg, 또는 0.20 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
한 구현예에서, 복용량은 0.2 mg/kg 내지 1.5 mg/kg이다. 예를 들면, dsRNA는 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 또는 1.5 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
dsRNA는 0.03, 0.1, 0.3, 또는 1.3, 또는 3.0 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 일일 1회 투여될 수 있거나, 또는 하루 동안 적절한 간격으로 2회, 3회 또는 그 이상 복용량으로 투여될 수 있다. PCSK9 수준에 있어서 단일 복용량의 효과는 오래 지속되며, 후속 용량은 많아야 7일 간격 또는 1, 2, 3, 또는 4 주 간격으로 투여된다.
한 구현예에서, PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA로 조제된 지질은 약 3 mg/kg의 첫 복용량으로 투여한 후, 1주일에 최소한 한 번의 후속 용량으로 투여되며, 이때 후속 복용량은 첫 복용량보다 적으며, 가령, 후속 용량은 약 1.0/kg 또는 약 0.3/kg이다. 후속 용량은 4주간 주당 1회 투여될 수 있다.
일부 구현예들에서, dsRNA는 연속 주입 또는 조절된 방출 제형을 통한 전달을 이용하여 투여한다. 이러한 경우, 각 준-용량에 포함된 dsRNA는 일일 총 복용량을 달성하도록 상응하게 더 적어야 한다. 복용량 단위는 수일간 전달용으로 혼합될 수 있고, 가령, 수일간 dsRNA의 지속적인 방출을 제공하는 통상적인 지속 방출 제형을 이용할 수 있다. 지속 방출 제형은 당업계에 공지되어 있고, 특정 부위에서 물질 전달에 특이 유용하여, 본 발명의 물질과 함께 이용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 복용량 단위는 상응하는 일일 용량 다수를 포함한다.
당업계 숙련자는 질환 또는 장애의 중증도, 정확한 치료, 개체의 전반적인 건강상태 및/또는 나이, 그리고 개체가 가지는 기타 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 인자들이 개체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 복용량 및 시간에 영향을 끼칠 수 있다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 조성물의 치료 유효량으로 개체를 치료하는 것에는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개별 dsRNA의 생체내 반감기 및 유효한 복용량 예측은 통상적인 방법들 또는 여기에서 설명된 것과 같이, 적절한 동물 모델을 이용한 생체 테스트에 근거하여 이루어질 수 있다.
마우스 유전학의 진보로 인하여 PCSK9 발현에 의해 중개되는 병리학적 과정과 같은 다양한 인간 질환의 연구를 위한 다수의 마우스 모델을 만들었다. 이러한 모델은 dsRNA의 생체내 테스트 뿐만 아니라 치료 유효량을 결정하는데 이용한다. 적합한 마우스 모델은 예를 들면, 인간 PCSK9를 발현시키는 플라스미드를 가지는 마우스다. 또 다른 적합한 마우스 모델은 인간 PCSK9를 발현시키는 전이유전자를 가지고 있는 유전자전이 마우스다.
이러한 화합물들의 독성 및 치료 효과는 예를 들면 LD50 (집단내 50%를 사망하게 하는 용량) 및 ED50 (집단내 50%에서 치료 효과가 있는 용량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물들이 바람직하다.
세포 배양 분석 및 동물 연구들로부터 얻은 데이터는 인간에 사용할 수 있는 복용량의 범위를 정하는데 이용할 수 있다. 본 발명에서 특징화된 조성물들의 복용량은 독성이 없거나 또는 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 일반적으로 속한다. 복용량은 이용되는 투약형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 안에서 변화될 수 있다. 본 발명에서 특징화된 방법들에서 사용되는 임의의 화합물들의 경우, 치료 유효한 용량은 세포 배양물 분석에서 우선 예측할 수 있다. 화합물의 순환 혈장 농도 범위를 얻기 위해 동물 모델에서 용량을 공식화하거나, 또는 적합할 경우, 세포 배양물에서 측정한 것과 같이 IC50(가령, 증상의 최대 억제의 절반을 얻기 위한 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 산물(가령, 감소된 농도의 폴리펩티드를 얻기 위하여)을 얻도록 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 좀더 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 이들의 투여에 추가하여, 본 발명에서 특징화된 dsRNA는 표적 유전자 발현에 의해 중개된 병리학적 과정의 치료에 유효한 기타 공지의 물질과 복합하여 투여할 수 있다. 임의의 경우에서, 투여 의사는 당업계에 공지되어 있는 또는 여기에서 설명된 효과의 표준 측정을 이용하여 관찰된 결과에 근거하여 dsRNA 복용량과 투여 시기를 조정할 수 있다.
투여
본 발명의 약제학적 조성물들은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지, 투여 부위에 따라 다양한 방식으로 투여할 수 있다. 투여는 국소, 폐, 가령, 네블리라이져를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 살포; 기관내(intratracheal), 비강내, 상피 및 경피, 그리고 피부아래(subdermal), 경구 또는 장관외, 가령, 피하 투여일 수 있다.
전형적으로, 고지질혈증이 있는 포유동물을 치료할 때, dsRNA 분자들은 장관외 수단을 통하여 전신으로 투여된다. 장관외(Parenteral) 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입; 두개골내, 가령, 실질조직내(intraparenchymal), 척수내(intrathecal) 또는 심실내(intraventricular) 투여를 포함한다. 예를 들면, 콘쥬게이트된 또는 콘쥬게이트안된 또는 리포좀으로 또는 리포좀 없이 조제된 dsRNA는 환자의 정맥으로 투여될 수 있다. 이러한 경우, dsRNA 분자는 알코올과 같은 통상적인 용매내 멸균된 그리고 비-멸균된 수성 용액, 비-수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스내 용액으로 조제될 수 있다. 이러한 용액들은 또한 완충액, 희석제, 그리고 기타 적합한 첨가제들을 포함할 수 있다. 장관외, 척수내, 또는 심실내 투여의 경우, dsRNA 분자는 멸균 수성 용액과 같은 조성물로 조제될 수 있고, 이 조성물들은 완충액, 희석제, 그리고 기타 적합한 첨가제(가령, 침투 증강제, 운반체 화합물들, 및 기타 약제학적으로 허용되는 운반체들)를 또한 포함할 수 있다. 조제물은 더욱 상세하게 설명된다.
dsRNA는 간과 같은 특정 조직(가령, 간의 간세포)을 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.
제형
본 발명의 약제학적 제형은 편의상 단위 투약형으로 제공될 수 있으며, 약제학적 산업에 잘 공지된 통상적인 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 기술들은 활성 성분들을 약제학적 운반체(들) 또는 부형제(들)과 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성성분들을 액체 운반체들 또는 미세하게 분할된 고체 운반체들 또는 이 둘 모두와 균질하고 친밀하게 연합시키고, 그 다음 필요에 따라 제품의 모양을 만들어서 제조된다.
본 발명의 조성물들은 태블릿, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 가능한 많은 투약형으로 조제될 수 있다. 본 발명의 조성물들은 수성, 비-수성 또는 혼합형 매질내 현탁액으로 조제될 수 있다. 수성 현탁액은 또한 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물들은 용액, 에멸젼 및 리포좀-함유 제형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 조성물들은 사전형성된 액체, 자가-유상화되는 고체 그리고 자가-유상화되는 반고체를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 성분들로부터 만들어질 수 있다. 한 측면에서 과지질혈증과 같은 간 질환을 치료할 때 간을 표적으로 하는 제형다.
또한, PCSK9 유전자를 표적으로 하는 dsRNA는 기타 분자들, 분자 구조들 또는 핵산 혼합물과 혼합된, 캡슐화된, 콘쥬게이트된, 또는 연합된 dsRNA를 포함하는 조성물로 조제될 수 있다. 예를 들면, PCSK9 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 dsRNA 물질을 함유하는 조성물은 기타 치료제, 가령, 기타 암 치료제 또는 비-PCSK9 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 dsRNA 화합물을 포함할 수 있다.
경구, 장관외, 국소 및 생물학적 제형
경구 투여용 조성물들 및 제형은 분말, 과립, 미소입자들, 나노입자들, 물 또는 비수성 매질내 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셋, 테블릿 또는 미니태블릿을 포함한다. 농후제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 구현예들에서, 경구 제형은 본 발명에서 특징화된 dsRNA와 하나 이상의 침투 증강제, 계면활성제 및 킬레이트와 복합하여 투여된다. 적합한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염은 케노데옥시콜린산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜린산(UDCA), 콜린산, 데하이드로콜린산, 데옥시콜린산, 글루콜린산, 글리콜린산, 글리코데옥시콜린산, 타우로콜린산, 타우로데옥시콜린산, 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 나트륨 및 글리코디하이드로후시데이트 나트륨을 포함한다. 적합한 지방산은 아라키돈산, 운데카논산, 올레산, 라우린산, 카프릴산, 카프르산, 미리스틱산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카르페이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(가령, 나트륨)을 포함한다. 일부 구현예들에서, 침투 증강제 조합을 이용하는데, 예를 들면, 지방산/염과 담즙산/염의 조합을 이용한다. 한 가지 예시적인 조합은 라우린산의 나트륨 염, 카프르산 및 UDCA이다. 추가 침투 증강제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특징화된 dsRNA는 분무된 건조 입자들을 포함하는 과립형으로, 또는 미소 또는 나노입자를 만들기 위해 복합되어, 경구로 운반될 수 있다. dsRNA 복합 물질은 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도화된 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오즈 및 전분을 포함한다. 적합한 복합체형성 물질은 치토산, N-트리메틸치토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(가령, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 그리고 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-유산), 폴리(DL-락트-co-글리콜산 (PLGA), 알긴산, 그리고 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 포함한다. dsRNAs 및 이들의 조합약의 경구 제형은 미국 특허 제6,887,906호, 미국 특허 공개 20030027780, 및 미국 특허 제6,747,014호에서 상세하게 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
장관외, 실질조직내(뇌안으로), 기관내, 심실내 또는 간내 투여를 위한 조성물들 및 제형은 멸균 수성 용액을 포함할 수 있는데, 이때 용액은 또한 완충액, 희석제 및 침투 증강제를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 적합한 첨가제, 운반체 화합물 그리고 기타 약제학적으로 허용되는 운반체들 또는 부형제를 포함할 수 있다.
국소 투여용 약제학적 조성물들 및 제형은 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 운반체들, 수성, 분말 또는 오일성 베이스, 농후제 및 기타 같은 종류는 필수적일 수도 있고, 또는 바람직할 수도 있다. 적합한 국소 제형은 본 발명에서 특징화된 dsRNA가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 그리고 계면활성제와 같은 국소 전달물질과 혼합된 것들을 포함한다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성(가령, 디올레일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린) 음성(가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤DMPG) 그리고 양이온성 (가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 그리고 디올레일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 발명에서 특징화된 dsRNAs는 리포좀내 캡슐화될 수 있거나 또는 특히 양이온성 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, dsRNAs는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 운데카논산, 올레산, 에이코사논산, 라우린산, 카프릴산, 카프르산, 미리스틱산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카르페이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, C1-10 알킬 에스테르(가령, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(가령, 나트륨)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 국소 제형은 미국 특허 제6,747,014호에서 상세하게 설명되며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다. 또한, dsRNA 분자들은 예를 들면, 미국 특허 제6,271,359호에서 설명되는 것과 같이, 생물학적 또는 비-생물학적 수단으로 포유동물로 투여될 수 있다. 비생물학적 전달은 (1) 리포좀에 여기에서 제공되는 dsRNA 핵산 분자를 적하시키고, 그리고 (2) dsRNA 분자와 지질 또는 리포좀을 복합시켜, 핵산-지질 또는 핵산-리포좀 복합체를 형성하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 리포좀은 시험관내에서 세포의 형질감염에 통상적으로 이용되는 양이온 및 중성 지질로 구성될 수 있다. 양이온성 지질은 리포좀을 형성하기 위하여 음전하를 띈 핵산과 복합체(가령, 전하-연합)를 형성할 수 있다. 양이온성 리포좀의 예는 리포펙틴, 리포펙타민, 리포펙타이스, 및 DOTAP을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리포좀을 만드는 과정은 당업계에 공지되어 있다. 리포좀 조성물들은 예를 들면, 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 또는 디올레일 포스파티딜에탄올아민으로부터 만들어질 수 있다. 리포펙틴™ (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) 및 Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 다수의 친지성 물질들이 있다. 또한, 전신 전달 방법들은 DDAB 또는 DOTAP와 같은 시판되는 이용가능한 양이온 지질을 이용하여 최적화시킬 수 있으며, 이들 각각의 지질은 중성 지질 가령, DOPE 또는 콜레스테롤과 함께 혼합될 수 있다. 일부 경우들에서, Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997))에서 설명하는 것과 같은 리포좀을 이용할 수 있다. 다른 구현예들에서, 폴리에틸렌이민과 같은 다가양이온을 이용하여 생체내 및 생체외 전달을 실시할 수 있다(Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996)). 핵산 전달용 리포좀에 관한 추가 정보는 미국 특허 제6,271,359호, PCT 공개 WO 96/40964 및 Morrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7에서 찾아볼 수 있을 것이다.
생물학적 전달은 바이러스 벡터들의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터들 (가령, 아데노바이러스 및 포진 바이러스 벡터들)을 이용하여 간 세포로 dsRNA 분자들을 전달할 수 있다. 핵산을 세포로 전달하기 위하여, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 여기에서 제공하는 하나 이상의 dsRNA를 기존에 개발된 상이한 많은 바이러스 벡터들중 하나로 도입시킬 수 있다. 이렇게 생성된 바이러스 벡터들을 이용하여 하나 이상의 dsRNAs를 예를 들면, 형질감염에 의해 세포로 전달할 수 있다.
리포좀 제형물
마이크로에멀션뿐만 아니라 약물 제형화를 위해 연구 및 사용해온 여러 정리된 계면활성제 구조가 존재한다. 여기에는 단층, 마이셀, 이중층, 및 운반체가 포함된다. 리포좀과 같은 운반체는 약물 전달 관점에서 이들이 제공하는 특이성 및 작용 기간으로 인해 상당한 관심을 끌고 있다. 본 발명에서 사용되는 "리포좀"이라는 용어는 구형 이중층 또는 이중층들로 배열된 양친매성 지질로 이루어진 운반체를 의미한다.
리포좀은 친유성 물질 및 수성 내부 물질로 형성된 막을 갖는 단층 또는 다층 운반체이다. 수성 부분은 전달될 조성물을 포함한다. 양이온성 리포좀은 세포벽에 융합할 수 있다는 장점을 보유한다. 비양이온성 리포좀은 세포벽과 효율적으로 융합할 수는 없지만 생체 내에서 대식세포에 의해 도입된다.
온전한 포유류 피부를 통과하기 위해서는 지질 운반체가 적합한 경피 구배의 영향 하에 있는 각각 직경 50nm미만인 일련의 미세 구멍을 통과해야 한다. 따라서 형태 변경이 매우 쉽고 이러한 미세 구멍을 통과할 수 있는 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다.
리포좀의 추가 장점에는 다음이 포함된다: 천연 인지질에서 수득하는 리포좀은 생체적합성이며 생분해성이다; 리포좀은 광범위한 수용성 및 지용성 약물을 포함할 수 있다; 그리고 리포좀은 내부 구획 내에 캡슐화된 약물을 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포좀 제형물 제조에 있어서 중요한 고려 사항은 리포좀의 지질 표면 전하, 운반체 크기 및 수성물 부피이다.
리포좀은 활성 성분의 작용 부위로 활성 성분을 수송 및 전달하는데 유용하다. 리포좀 막은 생물학적 말도 구조적으로 유사하므로, 리포좀을 조직에 적용하는 경우 리포좀이 세포막과 융합하기 시작하며, 리포좀과 세포의 융합이 진행됨에 따라 리포좀 내용물은 활성제가 작용하게 될 세포막 내로 들어가게 된다.
리포좀 제형물은 여러 약물에 대한 전달 모드로서 집중적으로 광범위하게 조사되어 왔다. 국소 투여에 있어서, 리포좀이 다른 제형물에 비해 여러 장점을 제공한다는 증거가 점점 더 많아지고 있다. 이러한 장점에는 투여 약물의 높은 전신 흡수에 관련된 부작용 감소, 목적 표적에서의 투여 약물 축적 증가, 및 친수성 및 소수성인 다양한 약물을 피부로 투여 가능하다는 것이 포함된다.
일부 보고서는 고분자량 DNA를 포함하는 제제를 피부 내로 전달하는 리포좀의 능력을 상세히 알리고 있다. 진통제, 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함하는 화합물이 피부로 투여되었다. 대다수의 적용은 상부 표피의 표적화로 귀결되었다.
리포좀은 2개군으로 나뉜다. 양이온성 리포좀은 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양으로 하전된 리포좀이다. 양으로 하전된 DNA/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하여 엔도솜에 내면화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해 리포좀이 파열하여 이들의 내용물을 세포질 내로 방출한다(Wang 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성이거나 음으로 하전된 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기 보다는 DNA를 트랩핑한다. DNA 및 지질은 모두 유사하게 하전되어 있으므로, 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고 일부 DNA는 이들 리포좀의 수성 내부 내에 트랩핑된다. pH-민감성 리포좀을 이용하여 티미딘 키나아제 유전자를 암호화하는 DNA를 배양 중인 단층 세포로 전달하였다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 관측되었다(Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
주요 유형 중 하나의 리포좀 조성물에는 천연-유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질이 포함된다. 중성 리포좀 조성물은, 예를 들어 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면 음이온성 용원성 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린(PC), 예를 들어 대두 PC, 및 난(egg) PC로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
일부 연구에서는 리포좀 약물 제형물의 피부로의 국소 전달을 평가하였다. 다른 수단에 의한(예컨대 용액으로 또는 에멀션으로) 인터페론의 전달이 비효과적이었던 반면 인터페론을 포함하는 리포좀의 기니아픽 피부로의 적용은 피부의 헤르페스 궤양을 감소시켰다(Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). 또한 추가 연구에서는 수성 시스템을 이용한 인터페론의 투여 대비 리포좀 제형물의 일부로 투여되는 인터페론의 효능을 평가하여, 리포좀 제형물이 수성 투여에 비해 우수하다고 결론지었다(du Plessis 등, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
비이온성 리포좀 시스템을 또한 조사하여 약물, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템의 피부에 대한 전달 효용성을 결정하였다. NovasomeTM I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형물을 이용하여 시클로스포린-A를 마우스 피부의 진피 내로 전달하였다. 결과로부터 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 상이한 피부층 내로 시클로스포린-A의 침적을 촉진하는데 효과적인 것으로 나타났다(Hu 등, S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포좀에는 또한 본원에서 사용되며 리포좀 내에 도입되는 경우 특화된 지질이 없는 리포좀에 비해 순환 수명을 증강시키는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 나타내는 "구조적으로 안정화된"리포좀이 포함된다. 구조적으로 안정화된 리포좀의 예에는 리포좀의 운반체 형성 지질부의 일부가 (A) 하나 이상의 당지질, 예컨대 모노시알로갱글리오시드 GM1을 포함하는 것, 또는 (B) 하나 이상의 친수성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분으로 유도체화된 것이 포함된다. 특정 이론에 구애받지 않으면서, 당 분야에서는 적어도 갱글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유래 지질을 포함하는 구조적으로 안정화된 리포좀에 있어서는 이들 구조적으로 안정화된 리포좀의 증강된 순환 반감기가 망상내피 시스템(RES) 세포 내로의 섭취 감소에서 유래한다고 여겨진다(Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀이 당분야에 공지되어 있다. Papahadjopoulos 등(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)은 모노시알로갱글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜이노시톨이 리포좀의 혈액 반감기를 개선시키는 능력을 보고하였다. 이러한 발견은 Gabizon 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)에 의해 상세히 설명되었다. Allen 등의 미국 특허 번호 4,837,028 및 WO 88/04924에서는 모두 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 갱글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시한다. 미국 특허 번호 5,543,152(Webb 등)에서는 스핑고미엘린을 포함하는 리포좀을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀이 WO 97/13499(Lim 등)에 개시된다.
하나 이상의 친수성 폴리머로 유도체화된 지질을 포함하는 여러 리포좀 및 그 제조 방법이 당분야에 공지되어 있다. Sunamoto 등(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)은 PEG 부분을 포함하는 비이온성 세제 2C1215G를 포함하는 리포좀을 기재한다. Illum 등(FEBS Lett., 1984, 167, 79)은 폴리머성 글리콜의 친수성 코팅을 갖는 폴리스티렌 입자가 혈액 반감기를 현저히 증강시킴을 주지하였다. 폴리알킬렌 글리콜(예컨대, PEG)의 카르복실기 부착에 의해 개질된 합성 인지질은 Sears가 기재하였다(미국 Pat. Nos. 4,426,330 및 4,534,899). Klibanov 등(FEBS Lett., 1990, 268, 235)은 PEG 또는 PEG 스테아레이트로 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함하는 리포좀이 현저히 증가된 혈액 순환 반감기를 갖는다는 것을 나타내는 실험을 기재하였다. Blume 등(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)은 이러한 관찰을 다른 PEG-유도체화 인지질, 예컨대 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 및 PEG의 조합으로 형성되는 DSPE-PEG로 확장시켰다. 외부 표면 상에 공유 결합된 PEG 부분을 갖는 리포좀은 Fisher의 유럽 특허 번호 EP 0 445 131 B1 및 WO 90/04384에 기재되어 있다. PEG로 유도체화된 1-20몰%의 PE를 포함하는 리포좀 조성물 및 그 사용 방법은 Woodle 등(미국 특허 번호 5,013,556 및 5,356,633) 및 Martin 등(미국 특허 번호 5,213,804 및 유럽 특허 번호 EP 0 496 813 B1)이 기재하였다. 여러 다른 지질-폴리머 콘쥬게이트를 포함하는 리포좀은 WO 91/05545 및 미국 특허 번호 5,225,212(둘 다 Martin 등) 및 WO 94/20073(Zalipsky 등)에 개시되어 있다. PEG-개질 세라마이드 지질을 포함하는 리포좀은 WO 96/10391(Choi 등)에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 5,540,935(Miyazaki 등) 및 미국 특허 번호 5,556,948(Tagawa 등)은 표면 상에서 기능성 부분으로 추가 유도체화될 수 있는 PEG-포함 리포좀을 기재한다.
핵산을 포함하는 여러 리포좀이 당분야에 공지되어 있다. Thierry 등의 WO 96/40062는 고분자량 핵산을 리포좀 내에 캡슐화하는 방법을 개시한다. Tagawa 등의 미국 특허 번호 5,264,221은 단백질-결합 리포좀을 개시하며, 이러한 리포좀의 내용물이 dsRNA를 포함할 수 있다고 주장한다. Rahman 등의 미국 특허 번호 5,665,710은 올리고데옥시뉴클레오티드를 리포좀 내에 캡슐화하는 특정 방법을 기재한다. Love 등의 WO 97/04787은 raf 유전자에 표적화된 dsRNA를 포함하는 리포좀을 개시한다.
트랜스페로솜은 또 다른 유형의 리포좀으로, 약물 전달 운반체를 위해 매력적인 후보체인 형태 변형이 매우 자유로운 지질 응집물이다. 트랜스페로솜은 형태 변형이 매우 자유로워서 액적보다 작은 구멍을 통해 쉽게 투과할 수 있는 지질 액적으로 설명할 수 있다. 트랜스페로솜은 사용되는 환경에 순응할 수 있다, 예컨대 이들은 자가 최적화(피부의 구멍 형태에 순응), 자가 보수성을 나타내며, 자주 절단화 없이 표적에 도달하고 종종 자가 로딩된다. 트랜스페로솜을 제조하려면, 표면 가장자리 활성화제, 보통 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가할 수 있다. 트랜스페로솜을 사용하여 혈청 알부민을 피부에 전달할 수 있다. 혈청 알부민의 트랜스페로솜-매개 전달은 혈청 알부민을 포함하는 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
계면활성제는 에멀션(마이크로에멀션 포함) 및 리포좀과 같은 제형물에 널리 적용할 수 있다. 여러 상이한 유형의 천연 및 합성 계면활성제의 가장 일반적인 분류 및 특성 순위는 친수성/친유성 균형(HLB)을 이용하여 정해진다. 친수성기("헤드"로도 알려져 있음)의 성질은 제형물에 사용되는 상이한 계면활성제를 분류하기 위한 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않은 경우, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약제학적 및 화장 제품에 널리 적용할 수 있고, 다양한 pH값 범위에 걸쳐 이용 가능하다. 일반적으로 이들의 HLB값은 이들의 구조에 따라 2 내지 약 18 범위이다. 비이온성 계면활성제에는 비이온성 에스테르, 예컨대 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로오스 에스테르, 및 에톡실화 에스테르가 포함된다. 비이온성 알칸올아미드 및 에테르, 예컨대 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올 및 에톡실화/프로폭실화 블록 폴리머도 이 군에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제가 비이온성 계면활성제군의 가장 유명한 일원이다.
계면활성제 분자가 수중 용해 또는 분산되었을 때 음의 전하를 운반하면, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제에는 카르복실레이트, 예컨대 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예컨대 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트, 설포네이트, 예컨대 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트 및 포스페이트가 포함된다. 음이온성 계면활성제군의 가장 중요한 일원은 알킬 설페이트 및 비누이다.
계면활성제 분자가 수중 용해 또는 분산되었을 때 양의 전하를 운반하면, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제에는 4급 암모늄염 및 에톡실화 아민이 포함된다. 4급 암모늄이 이 군의 가장 많이 사용되는 일원이다.
계면활성제 분자가 양 또는 음의 전하를 운반할 수 있는 능력이 있으면 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제에는 아크릴산 유도체, 치환 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드가 포함된다.
약물 제품, 제형물 및 에멀션 중 계면활성제의 사용이 검토되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
핵산 지질 입자
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에서 특징적인 dsRNA는 지질 제형물 중에서 완전 캡슐화되어 예컨대 핵산-지질 입자를 형성한다. 핵산-지질 입자는 전형적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예컨대, PEG-지질 콘쥬게이트)을 포함한다. 핵산-지질 입자는 이들이 정맥 내(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위(예컨대 투여 부위와 물리적으로 떨어진 부위)에 축적되므로, 전신 적용에 있어 극히 유용하다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 중에 존재하는 경우 이들은 수용액 중에서 핵산분해효소로의 분해에 내성을 띈다. 핵산-지질 입자 및 이들의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 번호 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964에 개시되어 있다.
핵산-지질 입자는 또한 하나 이상의 추가 지질 및/또는 기타 성분, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 기타 지질은 다양한 목적, 예컨대 지질 산화를 방지하거나 또는 리포좀 표면 상에 리간드를 부착하기 위해 리포좀 조성물 중에 포함될 수 있다. 양친매성, 중성, 양이온성, 및 음이온성 지질을 포함하여 임의 수의 지질이 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 존재할 수 있는 추가 지질 성분의 구현예는 본원에 기재된다.
핵산-지질 입자 중에 존재할 수 있는 추가 성분에는 이중층 안정화 성분, 예컨대 폴리아미드 올리고머(예컨대 미국 특허 번호　6,320,017 참고), 펩티드, 단백질, 세제, 지질-유도체, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 콘쥬게이트된 PEG 및 세라마이드에 콘쥬게이트된 PEG(미국 특허 번호　5,885,613 참고)가 포함된다.
핵산-지질 입자는 하나 이상의 제 2 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 형성 동안 하전 유도 응집을 방지하는 입자의 구조적 안정화에서 기인할 수 있는, 형성 동안 지질 입자의 응집을 감소시키기 위해 선택되는 지질을 포함할 수 있다.
핵산-지질 입자에는 예컨대 SPLP, pSPLP, 및 SNALP가 포함된다. "SNALP"라는 용어는 SPLP를 포함하는 안정한 핵산-지질 입자를 나타낸다. "SPLP"라는 용어는 지질 운반체 내에 캡슐화된 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산-지질 입자를 나타낸다. SPLP에는 "pSPLP"가 포함되며, 여기에는 PCT 공개 번호 WO　00/03683에 설정된 바와 같은 캡슐화된 응축제-핵산 복합체가 포함된다.
본 발명의 입자는 전형적으로 평균 직경이 약 50nm 내지 약 150nm, 보다 전형적으로 약 60nm 내지 약 130nm, 더욱 전형적으로 약 70nm 내지 약 110nm, 가장 전형적으로 약 70nm 내지 약 90nm이며, 실질적으로 무독성이다.
하나의 구현예에 있어서, 지질 대 약물비(질량/질량 비)(예컨대, 지질 대 dsRNA비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약　4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 또는 33:1의 범위일 것이다.
양이온성 지질
본 발명의 핵산-지질 입자는 전형적으로 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 예를 들어 하기일 수 있다: N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(I -(2,3- 디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), N-(I -(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디리놀레일카바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리노레일시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리노레일시-3-모폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민 (ALNY-100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (MC3), 또는 그의 혼합물.
상기에서 명확하게 기재된 것 외에, 순양전하를 보유하는 약 생리적 pH에서 순수 양성 다른 양이온성 지질은 또한 본 발명의 지질 입자 내에 포함될 수 있다. 그와 같은 양이온성 지질은 비제한적으로 하기를 포함한다: N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 ("DODAC"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N-N-트리에틸암모늄 클로라이드 ("DOTMA"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 ("DDAB"); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 ("DOTAP"); 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 ("DOTAP.Cl"); 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤 ("DC-Chol"), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-2-(스페르민카복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트 ("DOSPA"), 디옥타데실아미도글리실 카복시스페르민 ("DOGS"), 1,2-디레오일-sn-3-포스포에탄올아민 ("DOPE"), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 ("DODAP"), N, N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 ("DODMA"), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 ("DMRIE"). 추가로, 양이온성 지질의 수많은 시판 제제는 사용될 수 있고, 그 예는 리포펙틴 (DOTMA 및 DOPE 포함, GIBCO/BRL로부터 이용가능), 및 리포펙타민 (DOSPA 및 DOPE, GIBCO/BRL로부터 이용가능)이다. 특히 구현예, 양이온성 지질은 아미노 지질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 지질"는 생리적 pH에서 양이온성 지질을 형성하기 위해 양성자화될 수 있는, 1개 또는 2개의 지방산 또는 지방산 알킬 사슬 및 아미노 헤드(head) 그룹 (알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹 포함)을 갖는 지질을 포함하는 것을 의미한다.
다른 아미노 지질은 알킬 치환기가 상이한 것 (예를 들어, N-에틸-N-메틸아미노-, N-프로필-N-에틸아미노- 등)을 포함하는 다른 디알킬아미노 그룹 및 대안적인 지방산 그룹을 갖는 것을 포함한다. R11 및 R12 모두가 장쇄 알킬 또는 아실 그룹인 구현예에 대해, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다. 일반적으로, 덜 포화된 아실 사슬을 갖는 아미노 지질은, 특히 필터 살균을 위해 착체가 약 0.3 마이크론 미만의 크기이어야 할 때, 더 쉽게 크기에 따라 분류된다. C14 내지 C22범위의 탄소 사슬 길이를 갖는 불포화 지방산을 함유하는 아미노 지질이 바람직하다. 다른 스캐폴드(scaffold)는 또한, 아미노 그룹, 및 아미노 지질의 지방산 또는 지방산 알킬 부분을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 적당한 스캐폴드는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 아미노 또는 양이온성 지질은 적어도 하나의 양성자첨가성 또는 탈양성자첨가성 그룹을 가지며, 이로써, 상기 지질은 생리적 pH 이하 (예를 들어 pH 7.4)에서 양전하를 띄고, 제2 pH, 바람직하게는 생리적 pH 이상에서 중성이다. 물론, pH의 기능으로서 양성자의 첨가 또는 제거는 평형 과정이고, 전하를 띤 또는 중성 지질에 대한 언급은 주도적인 종의 본성을 의미하고, 모든 지질은 전하를 띤 또는 중성 형태로 존재할 필요는 없다는 것이 이해될 것이다. 하나 초과의 양성자첨가성 또는 탈양성자첨가성 그룹가지거나 쯔비터이온성인 지질은 본 발명에서의 사용으로부터 제외된다.
어떤 구현예에서, 본 발명에 따른 양성자첨가성 지질은 약 4 내지 약 11 범위의 양성자첨가성 그룹의 pKa를 갖는다. 가장 바람직한 것이 약 4 내지 약 7의 pKa인 것은, 이들 지질이 낮은 pH 제형 단계에서 양이온성일 것이기 때문이고, 한편, 입자는 약 pH 7.4의 생리적 pH에서 (완전하지는 않을지라도) 크게 표면 중화될 것이다. 이 pKa의 이점 중의 하나는, 입자의 외부 표면과 연관된 적어도 일부 핵산이 생리적 pH에서 정전 상호작용을 잃고 단일 전기영동에 의해 제거될 것이라는 것이고; 따라서 제거에 대한 입자의 민감성을 크기 감소시킨다.
양이온성 지질의 하나의 예는 l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA)이다. DLinDMA를 포함하는 핵산-지질 입자의 합성 및 제조는 국제 출원 번호 PCT/CA2009/00496 (2009년 4월 15일 출원)에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 양이온성 지질 XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)는 핵산-지질 입자를 제조하기 위해 사용된다. XTC의 합성은 미국 가특허출원 번호 61/107,998 (2008년 10월 23일 출원)에 기재되어 있고, 이는 참고로 본원에 통합되어 있다.
일 양태에서, 양이온성 지질은 하기 구조로 표시되며 그의 염 또는 이성질체를 갖는다:
Figure pct00004

상기 식에서, R1 및 R2 각각은 독립적으로 각 경우에 대해, 임의 치환된 C10-C30 알킬, 임의 치환된 C10-C30 알케닐, 임의 치환된 C10-C30 알키닐, 임의 치환된 C10-C30 아실, 또는 -링커-리간드이고; R3는 H, 임의 치환된 C1-C10 알킬, 임의 치환된 C2-C10 알케닐, 임의 치환된 C2-C10 알키닐, 알킬헤트로사이클, 알킬포스페이트, 알킬포스포로티오에이트, 알킬포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬아민, 히드록시알킬, ω-아미노알킬, ω-(치환된)아미노알킬, ω-포스포알킬, ω-티오포스포알킬, 임의 치환된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, mw 100-40K), 임의 치환된 mPEG (mw 120-40K), 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 링커-리간드이고; E는 C(O)O 또는 OC(O)이다. 이 지질 패밀리의 합성 및 용도는 WO 2010/054401 (PCTUS2009/063927 (2009년 11월 10일 출원)에 기재되어 있다. 양이온성 지질 MC3는 양이온성 지질의 이 패밀리의 하나의 구현예이다.
다른 구현예에서, 양이온성 지질 MC3 ((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트), (예를 들어, DLin-M-C3-DMA)는 핵산-지질 입자를 제조하기 위해 사용된다. 제형을 포함하는 MC3 및 MC3의 합성은, 예를 들어, 미국 가출원 일련 번호　61/244,834(2009년 9월 22일 출원), 및 미국 가출원 일련 번호 61/185,800 (2009년 6월 10일 출원), 및 미국 특허 출원 일련 번호 12/813/448(2010년 6월 10일 출원)에 기재되어 있고, 이는 참고로 본원에 통합되어 있다.
다른 구현예에서, 양이온성 지질 ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민)는 핵산-지질 입자를 제조하기 위해 사용된다. ALNY-100의 합성은 국제특허출원 번호 PCT/US09/63933 (2009년 11월 10일 출원)에 기재되어 있고, 이는 참고로 본원에 통합되어 있다.
도 28은 ALNY-100 및 MC3의 구조를 설명한다.
양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 20　몰 % 내지 약 70 몰 % 또는 약 45-65 몰 % 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 70 몰 %를 포함할 수 있다.
비-양이온성 지질
본 발명의 핵산-지질 입자는 비-양이온성 지질를 포함할 수 있다. 비-양이온성 지질은 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일- 포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카복실레이트 (DOPE-말), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일- 포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 그의 혼합물.
본 발명의 지질 입자에 사용하는데 적당한 음이온성 지질은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올로아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 그룹.
중성 지질은, 지질 입자에 존재할 때, 생리적 pH에서 비전하 또는 중성 쯔비터이온성 형태로 존재하는 임의의 수많은 지질 종일 수 있다. 그와 같은 지질은 예를 들어 하기를 포함한다: 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디히드로스핑고미엘린, 세팔린(cephalin), 및 세레브로사이드(cerebroside). 본원에 기재된 입자에 사용하기 위한 중성 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들어, 리포좀 크기 및 혈류에서 리포좀의 안정성을 고려하여 안내된다. 바람직하게는, 중성 지질 성분은 2개의 아실 그룹, (즉, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)을 갖는 지질이다. 가변 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 그룹을 갖는 지질이 이용가능하거나, 공지 기술에 의해 분리 또는 합성될 수 있다. 구현예의 하나의 그룹에서, C14 내지 C22범위 탄소 사슬 길이를 갖는 포화 지방산 함유 지질이 바람직하다. 구현예의 다른 그룹에서, C14 내지 C22범위의 탄소 사슬 길이를 갖는 모노- 또는 디-불포화 지방산 함유 지질이 사용된다. 추가로, 혼합물 of 포화 및 불포화 지방산 사슬의 혼합물을 갖는 지질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 중성 지질은 DOPE, DSPC, POPC, 또는 임의의 관련 포스파티딜콜린이다. 본 발명에서 유용한 중성 지질은 또한 스핑고미엘린, 디히드로스핑고미엘린, 또는 다른 헤드 그룹, 예컨대 세린 및 이노시톨을 갖는 인지질로 구성될 수 있다.
일 구현예에서, 비-양이온성 지질은 스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC)이다. 다른 구현예에서, 비-양이온성 지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC)이다.
비-양이온성 지질은, 콜레스테롤이 포함된다면, 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 몰 % 내지 약 90 몰 %, 약 5 몰 % 내지 약 10 몰 %, 약 10 몰 %, 또는 약 58 몰 %일 수 있다.
콘쥬게이트된 지질
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 지질, 모노시알로강글리오시드 Gm1, 그리고 폴리아미드 올리고머 (“PAO”)(미국 특허제 6,320,017호에서 설명된 것과 같은)를 포함하는 콘쥬게이트된 지질은 응집(aggregation)을 막기 위하여 핵산-지질 입자에 이용할 수 있다. 형성 과정 동안 응집을 막기 위하여 하전을 띄지 않은, 친지성, 공간-방벽 모이어티를 가진 PEG, Gm1 또는 ATTA와 같은 기타 화합물들은 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하는 지질에 또한 결합될 수 있다. 미국 특허 제6,320,017호에서는 ATTA-지질을 설명하며, 그리고 가령, 미국 특허 제5,820,873호, 제5,534,499호 및 제5,885,613호에서 PEG-지질 콘쥬게이트를 설명한다. 일반적으로, 응집을 감소시키기 위하여 선택된 지질 성분의 농도는 지질의 몰비에 대해 약 1 내지 15%이다.
본 발명에 유용한 PEG-변형된 지질 (또는 지질-폴리옥시에틸렌 콘쥬게이트)의 특정 예는 지질 소포의 표면에 PEG 부분을 고정시키기 위하여 다양한 “고정(anchoring)”지질을 가질 수 있다. 적합한 PEG-변형된 지질의 예로는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딘산, PEG-세라미드 콘쥬게이트(가령, PEGCerC14 또는 PEG-CerC20)(공동-계류 USSN 08/486,214에서 설명됨, 전문이 참조함으로써 본원에 통합됨), PEG-변형된 디알킬아민 그리고 PEG-변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. PEG-변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤이 특히 바람직하다.
PEG 또는 ATTA와 같은 공간적으로 큰 모이어티가 지질 고정물(anchor)에 콘쥬게이트된 구현예들에서, 지질 고정물의 선택은 콘쥬게이트가 지질 입자와 가지는 연합 유형에 따라 달라진다. mePEG (mw2000)-디아스테로일포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE)은 입자가 순환계로부터 제거될 때까지, 대략 수일간 리포좀과의 연합을 유지할 수 있을 것이라고 잘 알고 있다. PEG-CerC20와 같은 다른 콘쥬게이트는 유사한 체류(staying) 능력을 가진다. 그러나, PEG-CerC14는 혈청에 노출시 제형로부터 신속하게 빠져나오는데, 일부 분석의 경우 T½ 은 60분 미만이다. 미국 특허 출원 SN 08/486,214에서 설명하는 것과 같이, 최소한 세 가지 특징이 교환율에 영향을 준다: 아실 쇄의 길이, 아실 쇄의 포화도 그리고 공각적-장벽 머리기의 크기. 본 발명에는 이러한 특징들의 적합한 변화를 가질 수 있는 화합물들이 유용할 수 있다. 일부 치료 용도의 경우, 생체내 핵산-지질 입자로부터 PEG-변형된 지질이 신속하게 제거되는 것이 바람직할 수 있고, 따라서, PEG-변형된 지질은 상대적으로 짧은 지질 고정물을 가질 것이다. 다른 치료 용도에서, 핵산-지질 입자는 더 긴 혈장 순환 반감기를 나타내는 것이 바람직할 수 있고, 따라서, PEG-변형된 지질은 상대적으로 긴 지질 고정물을 가질 것이다. 예시적인 지질 고정물은 약 C14 내지 약 C22, 바람직하게는 약 C14 내지 약 C16의 길이를 가지는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, PEG 모이어티, 예를 들면 mPEG-NH2는 약 1000, 2000, 5000, 10,000, 15,000 또는 20,000 Daltons의 크기를 가진다.
응집을 방해하는 화합물들은 기능을 적절하게 발휘하기 위하여 반드시 지질 콘쥬게이트를 필요로 하는 것은 아니다. 용액내 유리(free) PEG 또는 유리 ATTA로도 응집을 충분히 막을 수 있다. 제형을 만든 후 입자들이 안정적인 경우, 개체에 투여하기 전, PEG 또는 ATTA를 투석으로 여과시켜 제거할 수 있다.
입자들의 응집을 막는 콘쥬게이트된 지질은 PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드 (Cer), 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 콘쥬게이트는 예를 들면, PEG-디라우릴옥시프로필 (Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필 (Ci4), PEG-디팔미토일옥시프로필 (Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필 (Ci8)일 수 있다. 추가 콘쥬게이트된 지질은 폴리에틸렌 글리콜-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG 또는 PEG-C14, 이때 PEG는 2000 Da의 평균 분자량을 가진다) (PEG-DMG); (R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필-(메타옥시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카르바메이트)(PEG-DSG); PEG-카르바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(이때 PEG는 2000 Da의 평균 분자량을 가진다)(PEG-cDMA); N-아세틸갈락토사민-((R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필-(메타옥시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카르바메이트)) (GalNAc-PEG-DSG); 그리고 폴리에틸렌 글리콜-디팔미토일글리세롤(PEG-DPG)을 포함한다.
한 구현예에서, 콘쥬게이트된 지질은 PEG-DMG이다. 또 다른 구현예에서, 콘쥬게이트된 지질은 PEG-cDMA이다. 또 다른 구현예에서, 콘쥬게이트된 지질은 PEG-DPG이다. 대안으로 콘쥬게이트된 지질은 GalNAc-PEG-DSG이다.
입자들의 응집을 막는 콘쥬게이트된 지질은 입자내 존재하는 총 지질의 0 mol % 내지 약 20 mol % 또는 약 0.5 내지 약 5.0 mol % 또는 약 2 mol %일 수 있다.
지질 혼합물내 스테롤 성분(존재한다면)은 리포좀, 지질 소포 또는 지질 입자 조합약 분야에 통상적으로 이용되는 임의의 스테롤일 수 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
일부 구현예들에서, 핵산-지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 가령, 약 10 mol % 내지 약 60 mol % 또는 약 25 내지 약 40 mol % 또는 약 48 mol %의 스테롤, 가령, 콜레스테롤을 더 포함한다.
지질단백질
한 구현예에서, 본 발명의 제형은 아포리포단백질을 더 포함한다. 여기에서 설명된, “아포리포단백질(apolipoprotein)” 또는 “지질단백질(lipoprotein)”은 당분야의 숙련자에게 공지된 아포리포단백질, 이의 변이체 및 단편들, 하기에서 설명하는 아포리포단백질 항진제, 유사체 또는 이의 단편을 말한다.
적합한 아포리포단백질은 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V 및 ApoE, 그리고 활성이 있는 다형태(polymorphic forms), 이소폼(isoforms), 변이체 그리고 돌연변이 뿐만 아니라 이의 단편들 또는 절두형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 아포리포단백질은 티올 함유 아포리포단백질이다. “티올 함유 아포리포단백질”은 최소 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 아포리포단백질, 변이체, 단편 또는 이소폼을 지칭한다. 가장 통상적인 티올 함유 아포리포단백질은 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 ApoA-I Milano (ApoA-IM) 및 ApoA-I Paris (ApoA-IP)이다(Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 및 ApoE3은 또한 티올 함유 아포리포단백질이다. 단리된 ApoE 및/또는 활성단편, 그리고 재조합에 의해 생산된 형태를 포함하는 이의 폴리펩티드 유사체들은 미국 특허 제5,672,685호; 제5,525,472호; 제5,473,039호; 제5,182,364호; 제5,177,189호; 제,168,045호; 제5,116,739호에 설명되어 있으며; 이들 내용은 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다. ApoE3은 Weisgraber, et al., "Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms," J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; and Rall, et al., "Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects," Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700 (GenBank accession number K00396.참조)에 개시되어 있다.
특정 구현예들에서, 아포리포단백질은 이의 성숙형, 이의 프레프로아포리포단백질 형 또는 이의 프로아포리포단백질 형일 수 있다. 프로(pro-) 및 성숙 ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29), ApoA-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)1679-87; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35), ApoA-I Paris (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83), 그리고 ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000)의 동종 및 이종이량체(있는 경우)도 본 발명의 범위내에서 또한 이용될 수 있다.
특정 구현예들에서, 아포리포단백질은 아포리포단백질의 단편, 변이체 또는 이소폼일 수 있다. “단편”이란 용어는 고유의 아포리포단백질보다는 아미노산 서열이 짧은 임의의 아포리포단백질을 말하며, 이 단편은 지질 결합 성질들을 포함하는 고유의 아포리포단백질의 활성을 보유한다. “변이체”는 아포리포단백질의 아미노산 서열내 치환 또는 변형이 있고, 이러한 아미노산 잔기의 치환 또는 변형 가령, 추가 및 결손으로 고유 아포리포단백질의 지질 결합 성질들을 포함하는 활성이 제거되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 변이체는 여기에서 제공되는 고유 아포리포단백질에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 하나 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산으로 구성적으로 대체된 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 구성적 치환의 예는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌과 같은 최소 하나의 소수성 잔기의 치환을 포함한다. 유사하게, 본 발명은 예를 들면, 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라진 사이, 그리고 글리신과 세린 사이와 같이 최소한 하나의 친수성 잔기의 치환을 고려한다(미국 특허 제6,004,925호, 제6,037,323호 및 제6,046,166호). “이소폼”은 동일한, 더 큰 또는 부분적인 기능과 유사한 동일한 또는 부분적인 서열을 가지는 단백질을 지칭하며, 동일한 유전자의 산물이거나 아닐 수 있고, 통상적인 조직 특이성을 가지거나 가지지 않을 수도 있다(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3):181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23):14888-93 및 미국 특허 제6,372,886호).
특정 구현예들에서, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 아포리포단백질의 키메라 구조의 사용을 포함한다. 예를 들면, 아포리포단백질의 키메라 구조는 허혈 재관류 보호 성질을 포함하는 아포리포단백질 도메인과 연합되는 지질 결합 능력이 큰 아포리포단백질 도메인으로 구성될 수 있다. 아포리포단백질의 키메라 구조는 아포리포단백질내에 별도 부분들을 포함하는 구조 (가령, 상동성 구조)이거나 또는 키메라 구조는 상이한 아포리포단백질 사이의 별도 부분들을 포함하는 구조(가령, 이형성 구조)일 수 있다. 키메라 구조를 포함하는 조성물들은 아포리포단백질 변이체인 분절(segments) 또는 특이적 성질(가령, 지질 결합, 수용체 결합, 효소적, 효소 활성화, 항산화 또는 환원-산화 성질)을 가지도록 기획된 분절을 포함할 수 있다(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84 참조).
본 발명에서 이용되는 아포리포단백질은 재조합, 합성, 반-합성 또는 정제된 아포리포단백질들을 또한 포함한다. 본 발명에 의해 이용되는 아포리포단백질 또는 이의 등가체를 수득하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 아포리포단백질들은 혈장 또는 천연 산물로부터 예를 들면, 밀도 구배 원심분리 또는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분리되거나, 또는 합성에 의해, 반합성에 의해 또는 당업계에 공지되어 있는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다(가령, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; 미국 특허 제5,059,528호, 제5,834,596호, 제5,876,968호 그리고 제5,721,114호; 그리고 PCT 공개 WO 86/04920 및 WO 87/02062 참조).
본 발명에 이용되는 아포리포단백질은 ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-IM), ApoA-I Paris (ApoA-IP), ApoA-II, ApoA-IV, 및 ApoE의 활성을 모방하는 펩티드 및 펩티드 유사체들에 대해 아포리포단백질 항진제를 더 포함한다. 예를 들면, 아포리포단백질은 미국 특허 제6,004,925호, 제6,037,323호, 제6,046,166호, 그리고 제5,840,688호에서 설명된 임의의 것이 될 수 있으며, 이들 내용은 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
아포리포단백질 항진제 펩티드 또는 펩티드 유사체들은 당업계에 공지되어 있는 미국 특허 제6,004,925호, 제6,037,323호 및 제6,046,166호에 설명된 기술을 포함한 펩티드 합성을 위한 임의의 기술을 이용하여 합성되거나 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩티드들은 Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)에서 처음으로 설명된 고체-상 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 기타 펩티드 합성 기술은 Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley ＆ Sons, 2d Ed., (1976) 및 당업 숙련자들이 용이하게 이용할 수 있는 기타 자료들에서 찾아볼 수 있을 것이다. 폴리펩티드 합성 기술의 요약은 Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, III., (1984)에서 찾아볼 수 있다. 펩티드들은 또한 The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976)에서 설명된 용액 방법들에 의해 합성될 수도 있다. 상이한 펩티드 합성에 이용되는 적절한 보호기는 상기 언급된 도서들과 McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973)에서 설명하고 있다. 본 발명의 펩티드들은 또한 예를 들면, 아포리포단백질 A-I의 더 큰 부분으로부터 화학적 또는 효소적 절단에 의해 준비될 수 있다.
특정 구현예들에서, 아포리포단백질은 아포리포단백질의 혼합물일 수 있다. 한 구현예에서, 아포리포단백질은 동질성 혼합물, 즉, 단일 유형의 아포리포단백질일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 아포리포단백질은 이질성 아포리포단백질의 혼합물, 즉, 2개 이상의 상이한 아포리포단백질의 혼합물일 수 있다. 아포리포단백질의 이질성 혼합물의 구현예는 예를 들면, 동물 원천의 아포리포단백질의 혼합물과반-합성 원천의 아포리포단백질의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 이질성 혼합물은 예를 들면, ApoA-I 및 ApoA-I Milano의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 이질성 혼합물은 예를 들면, ApoA-I Milano 및 ApoA-I Paris의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법들 및 조성물에 이용할 수 있는 적합한 혼합물은 당업계 숙련자에게는 자명할 것이다.
아포리포단백질을 천연 원천으로부터 수득한다면, 식물 또는 동물 원천으로부터 수득할 수 있다. 아포리포단백질을 동물 원천으로부터 수득한다면, 임의의 동물 종으로부터 수득한 아포리포단백질일 것이다. 특정 구현예들에서, 아포리포단백질은 동물 원천으로부터 수득할 수 있다. 특정 구현예들에서, 아포리포단백질은 인간 원천으로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 아포리포단백질은 아포리포단백질이 투여되는 개체와 동일한 종으로부터 유도된다.
기타 성분들
다양한 구현예들에서, 양친매성(amphipathic) 지질은 본 발명의 지질 입자에 포함된다. “양친매성 지질”은 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상으로 향하고, 친수성 부분은 수성 상으로 향해있는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 이러한 화합물들은 인지질, 아미노지질, 그리고 스핑고지질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대표적인 인지질은 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 팔미토일올레일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 또는 디리놀레일포스파티딜콜린을 포함한다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤, 그리고 β-아실옥시산과 같은 기타 인이 결핍된 화합물들도 또한 이용할 수 있다. 추가적으로, 이러한 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤과 같은 기타 지질과도 혼합될 수 있다.
프로그램가능한 융합 지질은 또한 본 발명의 지질 입자에 포함시키는데 적합하다. 이러한 지질 입자들은 세포 막과 융합되고, 주어진 신호 사건이 일어날 때 까지 이들의 탑재물을 운반하는 경향이 거의 없다. 이는 유기체 또는 질병 부위로 주사후 세포와 융합을 시작하기 전, 지질 입자들을 더 고르게 분포되도록 한다. 신호 사건은 예를 들면, pH, 온도, 이온 환경 또는 시간의 변화일 수 있다. 후자의 경우, ATTA-지질 콘쥬게이트 또는 PEG-지질 콘쥬게이트와 같은 융합 지연 또는 “은폐(cloaking)”성분은 시간이 경과함에 따라 지질 입자 막으로부터 단순하게 교환되어 나올 수 있다. 예시적인 지질 고정물은 약 C14 내지 약 C22, 바람직하게는 약 C14 내지 약 C16의 길이를 가지는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티, 예를 들면 mPEG-NH2는 약 1000, 2000, 5000, 10,000, 15,000 또는 20,000 Daltons의 크기를 가진다.
핵산 물질에 콘쥬게이트된 지질 입자는 표적화 모이어티, 가령, 세포 유형 또는 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 표적화 모이어티, 가령, 리간드, 세포 표면 수용체, 당단백질, 비타민(가령, 리보플라빈) 및 단클론 항체를 이용한 지질 입자들의 표적화는 이미 설명되었다. (가령, 미국 특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호). 표적화 모이어티는 또는 이의 전체 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 기전은 일반적으로 표적화 모이어티가 세포 표면 수용체와 같은 표적과 상호작용에 이용가능하도록 지질 입자의 표면에 표적화 물질이 위치해있도록 요구한다. 상이한 다양한 표적화 물질들과 방법들은 가령, Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); and Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002)에서 설명된 것들을 포함하여 당업계에 공지되어 있고 그리고 이용할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄와 같은 친수성 폴리머 쇄의 표면 피복을 가진 지질 입자, 가령, 리포좀의 사용이 제안되었다(Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); 미국 특허 제5,013556호; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposome Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995). 한 가지 방법에서, 지질 입자의 표적화를 위한 항체와 같은 리간드는 지질 입자를 형성하는 지질의 극성 머리기에 연결된다. 또 다른 방법에서 표적화 리간드는 친수성 폴리머 피복을 형성하는 PEG 쇄의 말단에 부착된다(Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).
표적 물질에 결합을 위한 표준 방법들이 이용된다. 표적 물질의 부착을 위하여 활성화될 수 있는 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민, 또는 지질-유도화된 블레오마이신과 같은 유도화된 친지성 화합물들을 이용할 수 있다. 항체-표적화된 리포좀은 단백질 A를 통합하는 리포좀을 이용하여 작제할 수 있다(Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:1633716342 (1990) and Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990). 항체 콘쥬게이트의 기타 예는 미국 특허 제6,027,726호에 설명되어 있고, 이의 교시는 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다. 표적화 모이어티의 예는 신생물 또는 종양에 연합되는 항원들을 포함하는 세포 성분에 특이적인 기타 단백질을 또한 포함할 수 있다. 표적화 모이어티로 이용되는 단백질들은 공유 결합을 통하여 리포좀에 부착될 수 있다(Heath, Covalent Attachment of proteins to liposome, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). 기타 표적화 방법들은 바이오틴-아비딘 시스템을 포함한다.
핵산-지질 입자들의 생성
한 구현예에서, 본 발명의 핵산-지질 입자는 압출 방법 또는 인-라인 혼합 방법을 통하여 만든다.
압출 방법(또는 미리형성된 방법 또는 배취(batch) 공정이라고도 함)은 비어있는 리포좀(가령, 핵산이 없는)을 먼저 만들고, 빈 리포좀에 핵산을 추가하는 방법이다. 작은 구멍의 폴리카르보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통하여 리포좀 조성물들을 압출시키면 상대적으로 잘 한정된 크기 분포를 가진다. 전형적으로, 원하는 리포좀 복합체 크기 분포를 얻을 때까지 현탁액은 1회 이상 막을 통하여 순환된다. 리포좀은 리포좀 크기를 점진적으로 감소시키기 위하여 연속적으로 더 작은 구멍의 막을 통하여 압출시킬 수 있다. 일부 경우, 형성된 지질-핵산 조성물들은 임의의 크기 조절없이(sizing) 이용할 수 있다. 이러한 방법들은 미국 특허 제5,008,050호; 제4,927,637허; 제4,737,323호; Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19; 557(1):9-23; Biochim Biophys Acta. 1980 Oct 2; 601(3):559-7; Biochim Biophys Acta. 1986 Jun 13; 858(1):161-8; and Biochim. Biophys. Acta 1985 812, 55-65에 설명되어 있으며, 이들은 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
인라인(in-line) 혼합 방법은 지질 및 핵산을 나란하게 혼합 쳄버에 추가하는 방법이다. 혼합 쳄버는 단순한 T-커넥터이거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 기타 혼합 쳄버일 수 있다. 이러한 방법들은 미국 특허 제6,534,018호 및 미국 특허 제6,855,277호; US 공개 2007/0042031 및 Pharmaceuticals Research, Vol. 22, No. 3, Mar. 2005, p. 362-372에 공개되어 있으며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
본 발명의 제형은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다는 것도 추가적으로 이해해야 한다.
핵산-지질 입자들의 특징
표준 또는 압출-없는 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방법으로 특징화될 수 있다. 예를 들면, 제형은 일반적으로 시각적 관찰에 의해 특징화된다. 응집 또는 침강이 없는 약간 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 예를 들면, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA)을 이용한 광 분산으로 측정될 수 있다. 입자는 약 20-300 nm, 가량 크기가 40-100 nm일 수 있다. 입자 크기 분포는 단일해야 한다. 제형내 그리고 캡슐화된 분획물내 총 siRNA 농도는 염료 압출 분석을 이용하여 측정한다. 조제된 siRNA 시료를 가령, 0.5% Triton-X100과 같은 제형 붕괴 계면활성제 존부하에 Ribogreen (Molecular Probes)과 같은 RNA-결합 염료와 함께 항온처리할 수 있다. 제형내 총 siRNA는 표준 곡선에 대해 계면활성제를 함유하는 시료의 신호로부터 결정할 수 있다. 캡슐화된 분획물은 총 siRNA 함량으로부터“자유” siRNA 성분 (계면활성제 없이 신호에 의해 측정하였을 때)을 차감하여 결정한다. 캡슐화된 siRNA 비율은 일반적으로 >85%이다. 한 구현예에서, 본 발명의 제형은 최소 75%, 최소 80% 또는 최소 90%에 의해 캡슐화된다.
핵산-지질 입자 제형의 경우, 입자 크기는 최소 30 nm, 최소 40 nm, 최소 50 nm, 최소 60 nm, 최소 70 nm, 최소 80 nm, 최소 90 nm, 최소 100 nm, 최소 110 nm, 그리고 최소 120 nm이다. 적합한 범위는 일반적으로 약 최소 50 nm 내지 약 최소 110 nm, 약 최소 60 nm 내지 약 최소 100 nm, 또는 약 최소 80내지 약 최소 90 nm이다.
핵산-지질 입자들의 제형
LNP01
핵산-지질 입자의 합성에 대한 한 가지 예는 다음과 같다. 핵산-지질 입자들은 지방성물질(lipidoid) ND984HCl (MW 1487) (Formula 1), 콜레스테롤 (Sigma-Aldrich), 및 PEG-Ceramide C16 (Avanti Polar Lipid)를 이용하여 합성된다. 이러한 핵산-지질 입자는 종종 LNP01 입자로 불리기도 한다. 에탄올내 각 비축 용액은 다음과 같이 준비될 수 있다: ND98, 133 mg/ml; 콜레스테롤, 25 mg/ml, PEG-Cer아미드 C16, 100 mg/ml. ND98, 콜레스테롤, 그리고 PEG-Ceramide C16 비축 용액은 가령, 42:48:10 몰 비율로 복합될 수 있다. 복합된 지질 용액은 최종 에탄올 농도가 약 35-45%이며, 그리고 최종 아세테이트 나트륨의 농도가 약 100-300 mM이 되도록 수성 siRNA(가령, pH 5의 아세테이트 나트륨내)과 혼합될 수 있다. 지질-siRNA 나노입자들은 일반적으로 혼합시 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들면, Lipex Extruder (Northern Lipid, Inc)와 같은 열통(thermobarrel) 압출기를 이용하여 폴리카르보네이트 막(가령, 100 nm 컷-오프)을 통하여 압출될 수 있다. 일부 경우에, 압출 단계가 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시 완충액 교환은 투석 또는 접선 흐름 여과 방식(tangential flow filtration)에 의해 이루어질 수 있다. 완충액은 약 pH 7, 가령, 약 pH 6.9, 약 pH, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서 인산염 완충된 염(PBS)으로 교체될 수 있다.
Figure pct00005

LNP01 제형은 가령, 국제 출원 공개/042973에서 설명되며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
다음의 표에서 추가 예시적인 핵산-지질 입자 제형을 서명한다. 표에 있는 핵산-지질 입자의 이름에 한정된다는 것이 아님을 이해해야 한다. 예를 들면, 여기에서 사용된 것과 같이, SNALP는 양이온성 지질 DLinDMA를 포함하는 제형을 지칭한다.
Figure pct00006

XTC를 포함하는 제형은 2009년 9월 3일 제출된 미국 가출원/239,686에서 설명하고 있으며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
MC3을 포함하는 제형은 2009년 9월 22일자 제출된 미국 가출원 61/244,834 및 2009년 6월 10일자 제출된 미국 가출원 61/185,800에 설명되고 있으며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
ALNY-100을 포함하는 제형은 2009년 11월 10일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US09/63933에 설명되고 있으며, 전문이 참조함으로써 본원에 통합되어 있다.
추가의 대표적 제형은 표 11과 12에서 제시한다. 지질은 양이온성 지질을 말한다.
표 11: 압출 방법을 통하여 제조한 예시적인 핵산-지질 입자 (mole %) 조성물.
Figure pct00007

Figure pct00008

Figure pct00009

Figure pct00010

Figure pct00011

Figure pct00012

Figure pct00013

표 12: 인라인 혼합에 의해 준비된 예시적인 핵산-지질 입자 조성물.
Figure pct00014

Figure pct00015

양이온성 지질의 합성.
본 발명의 핵산-지질 입자에 사용된 임의의 화합물, 예를 들어, 양이온성 지질 등은 실시예에서 상세히 기재된 방법을 포함하는 공지된 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 모든 치환기는 달리 지시되지 않으면 이하에 정의된다.
"알킬"이란 1 내지 24개의 탄소원자를 갖는, 곧은 사슬 또는 분지된, 비(non)-시클릭 또는 시클릭, 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화 곧은 사슬 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하고; 한편, 포화 분지된 알킬은 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 시클릭 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하고; 한편, 불포화 시클릭 알킬은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐 등을 포함한다.
"알케닐"이란 인접 탄소원자 사이의 적어도 하나의 이중결합을 갖는 상기에서 정의된 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 모두를 포함한다. 대표적인 곧은 사슬 및 분지된 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함한다.
"알키닐"이란 인접 탄소들 사이의 적어도 하나의 삼중결합을 갖는 상기에서 정의된 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적인 곧은 사슬 및 분지된 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.
"아실"이란 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 의미하고, 여기서, 부착점에서의 탄소는 이하에 정의된 바와 같은 옥소 그룹으로 치환된다. 예를 들어, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐은 아실 그룹이다.
"헤테로사이클"란, 포화, 불포화, 또는 방향족이고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 헤테로원자를 가지는 5- 내지 7-원 모노시클릭, 또는 7- 내지 10-원 바이시클릭, 헤테로시클릭 고리를 의미하고, 여기서, 상기 질소 및 황 헤테로원자는 임의 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의 4원화될 수 있고, 임의의 상기 헤테로사이클이 벤젠 고리에 융합된 바이시클릭 고리를 포함한다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 이하에 정의된 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로사이클은 모폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐 등을 포함한다.
용어 "임의 치환된 알킬", "임의 치환된 알케닐", "임의 치환된 알키닐", "임의 치환된 아실", 및 "임의 치환된 헤테로사이클"란, 치환될 때, 적어도 하나의 수소 원자는 치환기로 대체된다는 것을 의미한다. 옥소 치환기 (=O)의 경우에, 2개의 수소 원자들이 대체된다. 이와 관련하여, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry , -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy을 포함하고, 여기서, n는 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로사이클이고, 각각의 상기 알킬 및 헤테로사이클 치환기는 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로사이클, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry , -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중 하나 이상의 추가 치환될 수 있다.
"할로겐"란 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 보호 그룹의 사용이 필요할 수 있다. 보호 그룹 방법론은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). 간단히, 본 발명의 문맥 내의 보호 그룹은 관능 그룹의 원하지 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 그룹이다. 보호 그룹은 어떤 반응 동안에 반응성을 차단하기 위해 관능 그룹에 첨가되고, 그 다음, 원래의 관능 그룹을 드러내기 위해 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, "알콜 보호 그룹"이 사용된다. "알콜 보호 그룹"는 알콜 관능 그룹의 원하지 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 그룹이다. 보호 그룹은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 첨가 및 제거될 수 있다.
MC3의 합성
DLin-M-C3-DMA (즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조는 하기와 같다. 디클로로메탄 (5 mL) 중 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올 (0.53 g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 히드로클로라이드 (0.51 g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘 (0.61g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드 (0.53 g)의 용액을 실온에서 밤새 교반했다. 용액을 희석 염산으로, 그 다음 희석 수성 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기 분획을 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 로토바프(rotovap) 상에서 제거했다. 잔여물을, 1-5% 메탄올/디클로로메탄 용리 구배를 사용하는 실리카겔 칼럼 (20 g)을 통과시켰다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 용매를 제거하여, 무색 오일 (0.54 g)을 얻었다. 추가 기재는 WO 2010/054401 (PCTUS2009/063927 (2009년 11월 10일 출원) 및 미국 특허 출원 일련 번호 12/813/448(2010년 6월 10일 출원)에서 제공된다.
식 A의 합성
일 구현예에서, 본 발명의 핵산-지질 입자는 식 A의 양이온성 지질을 사용하여 제형된다:
Figure pct00016

상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이고, 또는 R3 및 R4는 함께 임의 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 일반적으로, 상기 식 A의 지질은 다음 반응 반응식 1 또는 2에 의해 제조될 수 있고, 여기서 모든 치환기는 달리 지적하지 않으면 상기에서 정의된 바와 같다.
반응식 1
Figure pct00017

R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이고, 또는 R3 및 R4는 함께 임의 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있는 지질 A는 반응식 1에 따라 제조될 수 있다. 케톤 1 및 브로마이드 2는 구매할 수 있거나, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 1 및 2의 반응은 케탈 3을 산출한다. 케탈 3의 아민 4에 의한 처리는 식 A의 지질을 산출한다. 식 A의 지질은 식 5(여기서, X는 할로겐, 히드록시드, 포스페이트, 설페이트 등으로부터 선택된 음이온 반대이온이다)의 유기 염으로, 상응하는 암모늄 염으로 전환될 수 있다.
반응식 2
Figure pct00018

대안적으로, 케톤 1 개시 물질은 반응식 2에 따라 제조될 수 있다. 그리냐드(Grignard) 시약 6 및 시아나이드 7은 구매할 수 있거나, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 6 및 7의 반응은 케톤 1을 산출한다. 케톤 1의 식 A의 상응하는 지질로의 전환은 반응식 1에서 기재된 바와 같다.
ALNY-100의 합성
케탈 519 [ALNY-100]의 합성을 다음 반응식 3을 사용하여 수행했다:
반응식 3
Figure pct00019

515의 합성:
200 ml 무수 THF 중 LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 mol)의 교반된 서스펜션에 2목 RBF (1L)에서 70 ml의 THF 중 514 (10g, 0.04926mol)의 용액을 0 ℃에서 질소 분위기 하에서 서서히 첨가했다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 실온으로 따뜻하게 하고, 그 다음, 4시간 동안 가열 환류했다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링했다. 반응 (TLC에 의한) 반응의 완료 후, 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 포화 Na2SO4 용액의 주의깊은 첨가로 켄칭했다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하고, 여과 제거했다. 잔여물을 THF로 잘 세정했다. 여과물 및 세정물을 혼합하고, 400 mL 디옥산 및 26 mL 농축 HCl로 희석하고, 20분 동안 실온에서 교반했다. 휘발성물질을 진공 하에서 제거하여 515의 히드로클로라이드 염을 백색 고형물로서 얻었다. 산출: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (br, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
516의 합성:
100 mL 건조 DCM 중 화합물 515의 교반된 용액에 250 mL 2목 RBF에서 NEt3 (37.2 mL, 0.2669 mol)을 첨가하고, 0 ℃로 질소 분위기 하에서 냉각시켰다. 50 mL 건조 DCM 중 N-(벤질옥시-카보닐옥시)-석신이미드 (20 g, 0.08007 mol)의 느린 첨가 후, 반응 혼합물을 실온으로 따뜻하게 했다. 반응의 완료 (TLC에 의해 2-3시간) 후, 혼합물을 1N HCl 용액 (1 x 100 mL) 및 포화 NaHCO3 용액 (1 x 50 mL)로 연속해서 세정했다. 그 다음, 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 조 물질을 얻고, 이를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 516을 점착성 덩어리로서 얻었다. 산출: 11g (89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
517A 및 517B의 합성:
사이클로펜텐 516 (5 g, 0.02164 mol)을 220 mL 아세톤 및 물 (10:1)의 용액에서 1목 500 mL RBF에서 용해시키고, 이에 N-메틸 모폴린-N-옥사이드 (7.6 g, 0.06492 mol), 그 다음 tert-부탄올 중 OsO4 (0.275 g, 0.00108 mol)의 4.2 ml의 7.6% 용액을 실온에서 첨가했다. 반응의 완료 (~ 3시간) 후, 혼합물을 고형 Na2SO3의 첨가로 켄칭하고, 수득한 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반했다. 반응 혼합물을 DCM (300 mL)로 희석하고, 물 (2 x 100 mL), 그 다음 포화 NaHCO3 (1 x 50 mL) 용액, 물 (1 x 30 mL) 및 마지막으로 염수 (1x 50 mL)로 세정했다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 제거했다. 조 물질의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 정제로 부분입체이성질체의 혼합물을 얻고, 이를 분취 HPLC로 분리했다. 산출: - 6 g 미정제
517A - 피크-1 (백색 고형물), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 존재, HPLC-97.86%. X-선으로 입체화학 확인.
518의 합성:
화합물 505의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 화합물 518 (1.2 g, 41%)을 무색 오일로서 얻었다. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
화합물 519의 합성에 대한 일반적인 절차:
헥산 (15 mL) 중 화합물 518 (1 eq)의 용액을 THF (1 M, 2 당량) 중 LAH의 빙냉 용액에 적가했다. 첨가 완료 후, 혼합물을 40 ℃에서 0.5시간에 걸쳐 가열하고, 그 다음, 얼음 배쓰 상에서 다시 냉각했다. 혼합물을 포화 수성 Na2SO4으로 주의깊게 가수분해하고, 그 다음, 셀라이트를 통해 여과하고, 오일로 감소시켰다. 칼럼 크로마토그래피로 순수한 519 (1.3 g, 68%)를 무색 오일로서 얻었다. 13C NMR δ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 전기분무 MS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+에 대한 분자량 계산치 654.6, 실측치 654.6.
치료 물질-지질 입자 조성물들과 제형
본 발명은 본 발명의 지질 입자와 활성 물질을 포함하는 조성물들을 포함한다. 특정 구현예들에서, 활성 물질은 치료제다. 특정 구현예들에서, 활성 물질은 지질 입자의 수성 내부에 캡슐화된다. 기타 구현예들에서, 활성 물질은 지질 입자의 하나 이상의 지질 층내에 존재한다. 다른 구현예들에서, 활성 물질은 지질 입자의 외부 또는 내부 지질 표면에 결합된다.
여기에서 사용된“충분히 캡슐화된”이란 입자내 핵산이 자유 DNA를 유의적으로 분해하는 혈청 또는 뉴클라제 분석에 노출된 후 유의적으로 분해되지 않는다는 것을 의미한다. 충분히 캡슐화된 시스템에서, 자유 핵산 100%를 보통 분해하는 치료에서 바람직하게는 25% 미만의 입자 핵산이 분해되고, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 미만의 입자 핵산이 분해된다. 대안으로, 충분한 캡슐화는 Oligreen분석에 의해 결정될 수 있다. Oligreen은 용액내 올리고뉴클레오티드 및 단일-스트랜드 DNA 정량화를 위한 초-감응성 형광 핵산 착색이다(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). 충분히 캡슐화된 것은 입자가 혈청 안정성, 즉, 생체 투여시 이들 성분을 신속하게 분해하지 않는다는 것을 암시한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 활성물질은 세포, 조직, 장기 또는 개체에 바람직한 효과를 나타낼 수 있는 임의 분자 또는 화합물을 포함한다. 이러한 효과는 예를 들면 생물학적, 생리학적 또는 미용적일 수 있다. 활성 물질은 가령, 다클론 항체, 단클론 항체, 항체 단편; 인화 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, 그리고 Primatized™ 항체와 같은 항체들, 사이토킨, 성장 인자들, 아팝토시스 인자들, 분화 유도 인자들, 세포 표면 수용체들 그리고 이들의 리간드; 호르몬; 그리고 작은 유기 분자들 또는 화합물을 포함하는 소분자를 포함하는 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 임의의 유형의 분자 또는 화합물일 수 있다.
한 구현예에서, 활성 물질은 치료제 또는 이의 염 또는 유도체다. 치료제는 자체가 치료 활성을 가지거나 또는 추가 변성시 활성을 가지는 프로드럭(prodrug)일 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 치료제 유도제는 변형안된 물질과 비교하여 치료 활성의 일부 또는 전부를 보유하며, 또 다른 구현예에서, 치료제 유도체는 치료 활성이 부족하다.
다양한 구현예에서, 치료제는 항-염증 화합물, 항-진정제, 자극제, 진통제, 항생제, 산아제한 약물, 해열제, 혈관확장제, 항-혈관생성제, 심혈관제, 신호 변환 억제형, 심혈관 약물, 가령, 항-부정맥제, 혈관수축제, 호르몬 및 스테로이드와 같은 임의의 치료 효과 물질 또는 약물을 포함한다.
특정 구현예들에서, 치료제는 항-종양 약물, 항암제, 종양 약물, 항신형성 물질 또는 이와 유사한 것으로도 지칭될 수 있는 종양학 약물이다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 종양학 약물의 예는 안드리아마이신, 알케란, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 아라C, 삼산화물 비소, 아자티오프린, 벡사로텐, biCNU, 블레오마이신, 정맥용 부설판, 경구용 부설판, 카페시타빈(Xeloda), 카르보플라틴, 카르무스틴 CCNU, 셀레콕시브, 클로람부칠, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이클로스포린 A, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 다우노루비신, 시토산, 다우노루비신, 덱사메타손, 덱스라조산, 도데탁셀, 독소루비신, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포시드 포스페이트, 에토포시드 및 VP-16, 엑세메스탄, FK506, 플루다라빈, 플루러우라실, 5-FU, 겜시타빈(Gemzar), 젬투주마브-오조가미신, 고세레린 아세테이트, 하이드레아, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브 메실레이트, 인터페론, 이리노테칸(Camptostar, CPT-111), 레프라졸, 루코보린, 루스타틴, 루프로리드, 레바미졸, 리트레티노인, 메가스트롤, 멜파란, L-PAM, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡사렌, 미트라마이신, 미토마이신, 미토산트론, 질소 무스타드, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마즈(Pegademase), 펜토스타틴, 포르피메르 나트륨, 프레드니존, 리투산, 스트렙토조신, STI-571, 탐옥시펜, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, VM-26, 토포테칸(Hycamtin), 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 벨반, 빈블라스틴, 빈크리스틴, VP16, 그리고 비노렐빈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 기타 종양학 약물의 예는 엘리피티신과 엘리피티신 유사체 또는 유도체, 에포티론, 세포내 키나제 억제형 및 캄포테이신이다.
추가 제형물
에멀션
본 발명의 조성물은 에멀션으로 제조 및 제형화할 수 있다. 에멀션은 전형적으로 보통 직경 0.1㎛ 초과인 또 다른 액적 형태 중에 분산된 한 액체의 이종성 시스템이다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 등, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀션은 종종 서로 밀접하게 혼합 및 분산된 2개의 비혼화성 액상을 포함하는 2상 시스템이다. 일반적으로 에멀션은 다양한 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 형태일 수 있다. 수성상을 벌크 오일상 내로 미분하고 미세 액적으로 분산하는 경우, 생성 조성물은 유중수(w/o) 에멀션으로 불린다. 이와는 달리, 오일상을 벌크 수성상 내로 미분하고 미세 액적으로 분산하는 경우, 생성 조성물은 수중유(o/w) 에멀션으로 불린다. 에멀션은 분산상에 부가하여 추가 성분 및 수성상 또는 오일상 중에 용액으로 존재할 수 있거나 자체가 개별상인 활성 약물을 포함할 수 있다. 필요한 경우 약제학적 부형제, 예컨대 유화제, 안정화제, 염료, 및 항산화제가 에멀션 중에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀션은 또한 3개 이상의 상으로 구성된, 예를 들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀션의 경우와 같은 다중 에멀션일 수 있다. 이러한 복합체 제형물은 종종 단순한 2원성 에멀션이 제공하지 못하는 특정 장점을 제공한다. o/w 에멀션의 개별 오일 액적이 작은 물 액적을 밀봉하는 다중 에멀션이 w/o/w 에멀션을 구성한다. 마찬가지로 오일 연속상 중에 안정화된 물의 소구에 밀봉된 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀션을 제공한다.
에멀션은 열역학적 안정성이 거의 또는 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 종종 분산상 또는 불연속상 에멀션은 외부 또는 연속상 중에 잘 분산되어 유화제 또는 제형물의 점도를 통해 이 형태로 유지된다. 에멀션 스타일의 연고 기재 및 크림의 경우에서와 같이 어느 에멀션상도 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀션을 안정화시키는 다른 수단에는 에멀션의 어느 상 내라도 도입될 수 있는 유화제의 사용이 포함된다. 유화제는 크게 4개 카테고리로 분류할 수 있다: 합성 계면활성제, 천연 생성 유화제, 흡수 염기, 및 미세 분산 고체(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
표면 활성제로도 알려져 있는 합성 계면활성제는 에멀션 제형물에 다양한 적용성을 가지는 것으로 나타났으며, 문헌들에서 검토되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 전형적으로 양친매성이며 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 성질의 비는 친수성/친유성 균형(HLB)으로 불리며, 제형물의 제조에 있어서 계면활성제를 분류 및 선택하는데 있어 중요한 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 성질에 따라 상이한 군으로 분류할 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
에멀션 제형물에 사용되는 천연 생성 유화제에는 라놀린, 밀랍, 포스파티드, 레시틴 및 아카시아가 포함된다. 흡수 염기는 물을 흡수하여 w/o 에멀션을 형성하지만 무수 라놀린 및 친수성 바셀린과 같은 이들의 반고체 점도를 유지하는 정도의 친수성 특성을 보유한다. 또한 미분된 고체는 계면활성제와 함께 다양한 제조물에서 특히 우수한 유화제로 사용되었다. 이들에는 극성 무기 고체, 예컨대 중금속 히드록시드, 비팽창성 클레이, 예컨대 벤토나이트, 아타풀가이트, 헥토라이트, 카올린, 몬트모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 염료 및 비극성 고체, 예컨대 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트가 포함된다.
비유화성 재료의 다양한 변형예들도 에멀션 제형물 중에 포함되어 에멀션의 특성에 기여한다. 이들에는 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 습윤제, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제가 포함된다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 히드로콜로이드에는 천연 생성 고무 및 합성 폴리머, 예컨대 다당류(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 고무, 카라야 고무 및 트래거캔스), 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 및 카르복시프로필셀룰로오스), 및 합성 폴리머(예를 들어, 카르보머, 셀룰로오스 에테르, 및 카르복시비닐 폴리머)가 포함된다. 이들은 수중에서 분산 또는 팽창하여 분산상 액적 주위에 강한 계면막을 형성하고 외부상의 점도를 증가시켜 에멀션을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀션은 종종 미생물의 성장을 쉽게 지지할 수 있는 여러 성분, 예컨대 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파티드를 포함하며, 이들 제형물은 종종 방부제를 포함한다. 에멀션 제형물 중에 포함되는 일반적으로 사용되는 방부제에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄염, 벤잘코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산이 포함된다. 항산화제는 또한 에멀션 제형물에 일반적으로 첨가되어 제형물의 열화를 방지한다. 사용되는 항산화제는 유리 라디컬 스캐빈저, 예컨대 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔 또는 환원제, 예컨대 아스코르브산 및 나트륨 메타비설파이트 및 항산화제 상승제, 예컨대 시트르산, 타르타르산 및 레시틴일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀션 제형물의 적용 및 이들의 제조 방법은 문헌에서 검토되었다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 경구 전달용 에멀션 제형물은 제형화의 용이성뿐만 아니라 흡수 및 생체이용률의 관점에서의 효능으로 인해 매우 널리 사용되어 왔다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 미네랄 오일 기재 완화제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제조물은 o/w 에멀션으로 일반적으로 경구 투여되어 온 재료들이다.
본 발명의 하나의 구현예에 있어서, dsRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀션으로 제형화된다. 마이크로에멀션은 하나의 광학적 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 양친매성 시스템으로 정의할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 전형적으로 마이크로에멀션은 오일을 수성 계면활성제 용액 중에 먼저 분산시킨 후 충분한 양의 제 4 성분, 일반적으로 중간 사슬 길이의 알코올을 첨가하여 투명 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀션은 또한 표면-활성 분자의 계면막으로 안정화되는 두 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방적으로 투명한 분산액으로 설명되었다(Leung 및 Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀션은 보통 오일, 물, 계면활성제, 조계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀션이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지 여부는 사용되는 오일 및 계면활성제의 특성 및 계면활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적 패킹에 근거한다(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상 다이어그램을 이용하는 현상학적 접근이 널리 연구되어 마이크로에멀션을 제조하는 방식에 대해 당업자에게 포괄적인 지식을 제공하였다(Rosoff, in Pharmaceutical DosageForms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical DosageForms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 종래 에멀션에 비해, 마이크로에멀션은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 액적 제형물 중에서 수불용성 약물을 가용화시키는 장점을 제공한다.
마이크로에멀션의 제조에 사용되는 계면활성제에는 비제한적으로 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)가 단독으로 또는 조계면활성제와 함께 포함된다. 조계면활성제, 보통 단사슬 알코올, 예컨대 에탄올, 1-프로판올, 및 1-부탄올은 계면활성제막 내로 침투하여 계면활성제 분자 사이에서 생성되는 빈 공간으로 인한 불규칙막을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 기능을 한다. 그러나 마이크로에멀션은 조계면활성제를 사용하지 않고 제조할 수 있으며, 무알코올 자가 유화 마이크로에멀션 시스템은 당분야에 공지되어 있다. 수성상으로는 전형적으로 그러나 비제한적으로 물, 약물 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체를 들 수 있다. 오일상에는 비제한적으로 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬(C8-C12) 모노, 디 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일과 같은 물질이 포함될 수 있다.
약물 가용화 및 약물의 흡수 증강이라는 관점에서 마이크로에멀션이 특히 관심의 대상이 된다. 지질 기재 마이크로에멀션(o/w 및 w/o 둘 다)은 펩티드를 포함하는 약물의 생체이용률을 증강시키는 것으로 제안되었다(Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀션은 개선된 약물 가용화, 효소 가수분해로부터 약물 보호, 막 유동성 및 투과성에 있어서의 계면활성제 유도 변화에 따른 약물 흡수의 증강 가능성, 제조 용이성, 고체 투여형 대비 경구 투여 용이성, 개선된 임상적 효능 및 감소된 독성이라는 장점을 제공한다(Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). 종종 마이크로에멀션은 이들의 성분을 실온에서 함께 놓았을 때 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 열민감성 약물, 펩티드 또는 dsRNA를 제형화할 때 특히 유리할 수 있다. 마이크로에멀션은 또한 화장품 및 약제학적 적용 모두에 있어서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀션 조성물 및 제형물은 위장관에서 dsRNA 및 핵산의 전신 흡수 증가를 촉진할 뿐만 아니라 dsRNA 및 핵산의 국소적 세포 섭취를 개선시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀션은 또한 제형물의 특성을 개선시키고 본 발명의 dsRNA 및 핵산의 흡수를 증강시키기 위한 추가적 성분 및 첨가제, 예컨대 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라졸, 및 침투 증강제를 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀션에 사용되는 침투 증강제는 5가지 넓은 범위 중 하나의 카테고리로 분류할 수 있다-계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제, 및 비킬레이트성 비계면활성제(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 각 군은 위에서 논의되었다.
침투 증강제
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 다양한 침투 증강제를 채용하여 핵산, 특히 dsRNA를 동물의 피부로 효율적으로 전달한다. 대부분의 약물은 용액 중에서 이온화 및 비이온화된 형태 모두로 존재한다. 그러나 보통 지용성 또는 친유성만을 지닌 약물은 세포막을 쉽게 통과한다. 투과할 막을 침투 증강제로 처리하는 경우 비친유성 약물도 세포막을 투과할 수 있는 것으로 발견되었다. 또한 비친유성 약물의 세포를 통한 확산을 보조하는 것에 덧붙여서, 침투 증강제는 또한 친유성 약물의 투과도를 증강시킨다.
침투 증강제는 5가지 넓은 분류, 즉 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제, 및 비킬레이트성 비계면활성제 중 하나의 카테고리로 분류할 수 있다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). 상기 언급된 각 군의 침투 증강제를 아래에서 더 상세히 설명한다.
계면활성제: 본 발명에 관련하여, 계면활성제(또는 "표면-활성제")는 수용액 중에 용해되는 경우 용액의 표면 장력 또는 수용액 및 또 다른 액체 간 계면 장력을 감소시켜 점막을 통한 dsRNA의 흡수를 증강시키는 화학적 제제이다. 담즙산염 및 지방산에 부가하여, 이들 침투 증강제에는 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); 및 퍼플루오로화학적 에멀션, 예컨대 FC-43(Takahashi 등, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)이 포함된다.
지방산: 침투 증강제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체에는, 예를 들어 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데칸산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프르산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이들의 C1-10 알킬 에스테르(예컨대, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이들의 모노- 및 디-글리세리드(즉 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)가 포함된다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri 등, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
담즙산염: 담즙의 생리학적 역할에는 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수 촉진이 포함된다(Brunton, Chapter 38 in: Goodman ＆ Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 등 Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 다양한 천연 담즙산염, 및 이들의 합성 유도체는 침투 증강제로 작용한다. 따라서 "담즙산염"이라는 용어에는 담즙의 임의 천연 생성 성분뿐만 아니라 이들의 합성 유도체가 포함된다. 적합한 담즙산염에는, 예를 들어 콜산(또는 그 약제학적으로 허용 가능한 나트륨염, 나트륨 콜레이트), 데히드로콜산(나트륨 데히드로콜레이트), 데옥시콜산(나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산(나트륨 글루콜레이트), 글리콜산(나트륨 글리콜레이트), 글리코데옥시콜산(나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우르콜산(나트륨 타우르콜레이트), 타우로데옥시콜산(나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산(나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디히드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)가 포함된다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto 등, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
킬레이트제: 본 발명에 관해 사용되는 킬레이트제는 금속 이온과 복합체를 형성하여 용액으로부터 이를 제거함으로써 점막을 통한 dsRNA의 흡수를 증강시키는 화합물로 정의할 수 있다. 본 발명에서 침투 증강제로서의 이들의 사용에 관해, 킬레이트제는 대부분의 특징분석된 DNA 핵산분해효소가 촉매를 위해 2가 금속 이온을 필요로 하여 킬레이트제에 의해 저해되므로, DNase 저해제로도 작용할 수 있는 추가적 장점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적합한 킬레이트제에는 비제한적으로 디나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예컨대, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(엔아민) 및 라우레트-9가 포함된다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur 등, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
비킬레이트성 비계면활성제: 본원에서 사용되는 비킬레이트성 비계면활성제 침투 증강 화합물은 킬레이트제 또는 계면활성제로서는 크지 않은 활성을 나타내지만, 그럼에도 불구하고 소화 점막을 통해 dsRNA의 흡수를 증강시키는 화합물로 정의할 수 있다(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 이러한 침투 증강제군에는, 예를 들어 불포화 시클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 비스테로이드성 소염제, 예컨대 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존(Yamashita 등, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)이 포함된다.
세포 수준에서 dsRNA의 섭취를 증강시키는 제제를 또한 본 발명의 약제학적 및 기타 조성물에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 리포펙틴(Junichi et al, 미국 특허 번호 5,705,188), 양이온성 글리세롤 유도체, 및 폴리양이온성 분자, 예컨대 폴리라이신(Lollo 등, PCT 적용 WO 97/30731)이 또한 dsRNA의 섭취를 증강시키는 것으로 공지되어 있다.
글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 피롤, 예컨대 2-피롤, 아존 및 테르펜, 예컨대 리모넨 및 멘톤을 포함하는 다른 제제를 사용하여 투여하는 핵산의 침투를 증강시킬 수 있다.
담체
본 발명의 dsRNA는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 중에 제형화할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"(또한 본원에서 "부형제"로 불림)는 약제학적으로 허용 가능한 용매, 현탁화제, 또는 임의의 다른 약리학적으로 불활성인 운반체이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 의도하는 벌크, 점도 및 기타 관련 수송 및 화학적 특성을 제공하기 위해 고려하는 계획된 투여 방식에 따라 선택할 수 있다. 전형적인 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 비제한적으로 물; 식염수 용액; 결합제(예컨대, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예컨대, 락토오스 및 기타 당, 젤라틴, 또는 칼슘 설페이트); 윤활제(예컨대, 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 나트륨 아세테이트); 붕해제(예컨대, 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 및 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트)가 포함된다.
본 발명의 특정 조성물은 또한 제형물 중에 담체 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "담체 화합물" 또는 "담체"는 불활성이지만(즉, 자체로는 생물학적 활성을 보유하지 않지만), 생체 내 절차에 의해 핵산으로 인지되어, 예를 들어 생물학적으로 활성을 갖는 핵산을 분해시키거나 순환으로부터 그의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용률을 감소시키는 핵산, 또는 그의 유사체를 나타낼 수 있다. 핵산 및 담체 화합물을 전형적으로 후자를 과량으로 하여 공동 투여하면 아마도 공통 수용체에 대한 담체 화합물 및 핵산 간 경쟁으로 인해 간, 신장 또는 기타 순환외 저장소에서 회수되는 핵산의 양이 실질적으로 감소될 수 있다. 예를 들어, 간 조직에서 부분적으로 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 이를 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 공동 투여하는 경우 감소될 수 있다(Miyao 등, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura 등, DsRNA ＆ Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
부형제
담체 화합물과는 대조적으로, "약제학적 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용 가능한 용매, 현탁화제 또는 임의의 다른 약리학적으로 불활성인 운반체이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고, 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합되었을 때 의도하는 벌크, 점도 등을 제공하기 위해 고려하는 계획된 투여 방식에 따라 선택할 수 있다. 전형적인 약제학적 담체에는 비제한적으로 결합제(예컨대, 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충전제(예컨대, 락토오스 및 기타 당, 미세결정성 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예컨대, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트 등)가 포함된다.
핵산과 해로운 방식으로 반응하지 않는 비경구 투여용으로 적합한 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제를 또한 사용하여 본 발명의 조성물을 제형화할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 비제한적으로 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.
핵산의 국소 투여용 제형물에는 멸균 및 비멸균 수용액, 일반 용매, 예컨대 알코올 중의 비수용액, 또는 액체 또는 고체 오일 기재 중의 핵산 용액이 포함될 수 있다. 용액은 또한 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 포함할 수 있다. 핵산과 해로운 방식으로 반응하지 않는 비경구 투여용으로 적합한 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제를 사용할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제에는 비제한적으로 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.
기타 성분
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상 발견되는 기타 보조 성분을 이들의 당분야에 확립된 사용 수준으로 추가 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 조성물은 추가적인 상용성 약제학적 활성 물질, 예컨대 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제를, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 투여형을 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가적인 물질, 예컨대 염료, 풍미제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 포함할 수 있다. 그러나 이러한 물질을 첨가할 때에는 본 발명의 조성 성분의 생물학적 활성을 부적절하게 방해해서는 안된다. 제형물을 멸균할 수 있고, 필요한 경우에는 제형물의 핵산(들)과 유해한 상호작용을 하지 않는 보조제, 예컨대, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충액, 착색제, 풍미 및/또는 방향 물질 등과 혼합할 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다.
병용 치료법
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 조성물은 병용 치료법에 사용할 수 있다. "병용 치료법"이라는 용어에는 다른 생물학적 활성 성분(예컨대 비제한적으로 제 2 및 상이한 항종양 제제) 및 비약물 치료법(예컨대 비제한적으로 수술 또는 방사선 치료)과 추가 조합되는 대상 화합물의 투여가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 다른 약제학적 활성 화합물, 바람직하게는 본 발명의 화합물의 효과를 증강시킬 수 있는 화합물과 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 다른 약물 치료법과 동시에(단일 제조물 또는 개별 제조물로) 또는 순서대로 투여할 수 있다. 일반적으로 병용 치료법에는 1회 또는 치료법 경과 동안 2 이상의 약물 투여가 포함된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 대상 화합물을 다양한 질환 상태에 관여하는 단백질 키나아제를 조정하는 하나 이상의 개별 제제와 함께 투여할 수 있다. 그러한 키나아제의 예에는 비제한적으로 다음이 포함될 수 있다: 세린/트레오닌 특이적 키나아제, 수용체 티로신 특이적 키나아제 및 비수용체 티로신 특이적 키나아제. 세린/트레오닌 키나아제에는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 감수분열 특이적 키나아제(MEK), RAF 및 오로라 키나아제가 포함된다. 수용체 키나아제군의 예에는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)(예컨대, HER2/neu, HER3, HER4, ErbB, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Xmrk, DER, Let23); 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체(예컨대 FGF-R1, GFF-R2/BEK/CEK3, FGF-R3/CEK2, FGF-R4/TKF, KGF-R); 간세포 성장/산란 인자 수용체(HGFR)(예컨대, MET, RON, SEA, SEX); 인슐린 수용체(예컨대 IGFI-R); Eph(예컨대 CEK5, CEK8, EBK, ECK, EEK, EHK-1, EHK-2, ELK, EPH, ERK, HEK, MDK2, MDK5, SEK); AxI(예컨대 Mer/Nyk, Rse); RET; 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR)(예컨대 PDGFα-R, PDGβ-R, CSF1-R/FMS, SCF-R/C-KIT, VEGF-R/FLT, NEK/FLK1, FLT3/FLK2/STK-1)가 포함된다. 비수용체 티로신 키나아제군에는 비제한적으로 BCR-ABL(예컨대 p43abl, ARG); BTK(예컨대 ITK/EMT, TEC); CSK, FAK, FPS, JAK, SRC, BMX, FER, CDK 및 SYK가 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 대상 화합물을 비키나아제 생물학적 표적 또는 절차를 조정하는 하나 이상의 제제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 표적에는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC), DNA 메틸트랜스퍼라아제(DNMT), 열 충격 단백질(예컨대, HSP90), 및 프로테오솜이 포함된다.
하나의 구현예에 있어서, 대상 화합물은 하나 이상의 생물학적 표적을 저해하는 항종양제(예컨대 소분자, 모노클로날 항체, 안티센스 RNA, 및 융합 단백질), 예컨대 졸린자, 타르세바, 이레사, 티케르브, 글리벡, 수텐트, 스프리셀, 넥사바, 소라페니브, CNF2024, RG108, BMS387032, 아피택, 아바스틴, 허셉틴, 데르비툭스, AG24322, PD325901, ZD6474, PD 184322, 오바토댁스, ABT737 및 AEE788과 조합할 수 있다. 이러한 조합은 임의 제제 단독으로 달성되는 효능에 비해 치료적 효능을 증강시킬 수 있고, 내성 돌연변이 변형체의 출현을 방지 또는 지연시킬 수 있다.
특정 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학요법제와 병용 투여된다. 화학요법제에는 종양학 분야의 광범위한 치료적 처치가 포함된다. 이들 제제는 종양 수축, 수술 후 남아 있는 잔여 암세포의 파괴, 경감 유도, 암 또는 그 치료에 관련된 증상의 경감 유지 및/또는 완화의 목적으로 다양한 질환 단계에 투여된다. 이러한 제제의 예에는 비제한적으로 알킬화제, 예컨대 겨자 가스 유도체(메클로르에타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 이포스파미드), 에틸렌이민(티오테파, 헥사메틸멜라닌), 알킬설포네이트(부설판), 히드라진 및 트리아진(알트레타민, 프로카르바진, 다카르바진 및 메토졸로미드), 니트로소우레아(카르무스틴, 로무스틴 및 스트렙토조신) 이포스파미드 및 금속염(카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴); 식물 알칼로이드, 예컨대 포도필로톡신(에토포시드 및 테니소피드), 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀), 빈카속(Vinca) 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈덴신 및 빈오렐빈), 및 캄프토테칸 유사체(이리노테칸 및 토포테칸); 항종양 항생제, 예컨대 크로모마이신(닥티노마이신 및 플리카마이신), 안트라사이클린(독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 발루비신 및 이다루비신), 및 기타 항생제, 예컨대 미토마이신, 액티노마이신 및 블레오마이신; 항대사제, 예컨대 엽산 길항제(메토트렉세이트, 페메트렉시드, 랄티트렉시드, 아미노프테린), 피리미딘 길항제(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 카페시타빈, 및 젬시타빈), 퓨린 길항제(6-머캅토퓨린 및 6-티오구아닌) 및 아데노신 데아미나아제 저해제(클라드리빈, 플루다라빈, 머캅토퓨린, 클로파라빈, 티오구아닌, 넬라라빈 및 펜토스타틴); 토포이소머라아제 저해제, 예컨대 토포이소머라아제 I 저해제(이로노테칸, 토포테칸) 및 토포이소머라아제 II 저해제(암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드); 모노클로날 항체(알레투주맵, 젬투주맵 오조가미신, 리툭시맵, 트라추주맵, 이브리투모맵 티옥세탄, 세툭시맵, 파니투무맵, 토시투모맵, 베바시주맵); 및 기타 항종양제, 예컨대 리보뉴클레오티드 환원효소 저해제(히드록시우레아); 부신피질 스테로이드 저해제(미토탄); 효소(아스파라기나아제 및 페그아스파르가아제); 항미세관 제제(에스트라무스틴); 및 레티노이드(벡사로텐, 이소트레티노인, 트레티노인(ATRA)이 포함된다. 바람직한 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학보호제와 병용 투여된다. 화학보호제는 신체를 보호하거나 화학요법의 부작용을 최소화하는 작용을 한다. 이러한 제제의 예에는 비제한적으로 암포스틴, 메스나 및 덱스라족산이 포함된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 대상 화합물은 방사선 치료법과 함께 투여된다. 방사선은 보통 내부적으로(암 부위 근처로의 방사활성 재료의 이식) 또는 양성자(x-선 또는 감마-선) 또는 입자 방사선을 채용하는 기계로부터 외부적으로 전달된다. 병용 치료법에 방사선 치료가 더 추가되는 경우, 방사선 치료는 치료제와 방사선 치료 조합의 공동 작용에서 효용적 효과가 얻어지는 한 임의의 적합한 시점에 수행할 수 있다. 예를 들어 적절한 경우에 있어서, 방사선 치료를 수일 또는 수주간 치료제의 투여에서 일시적으로 배제하는 경우에도 효용적 효과가 여전히 얻어진다.
본 발명의 화합물을 면역치료제와 병용하여 사용할 수 있다는 것도 이해될 것이다. 면역치료법의 한 형태는 백신 조성물을 종양에서 먼 거리에 투여함으로써 숙주 유래의 활성이 있는 전신성 종양 특이적 면역 반응을 생성하는 것이다. 단리된 종양 항원 백신 및 항유전형 백신을 포함하는 다양한 유형의 백신이 제안되어 있다. 또 다른 접근법은 치료할 대상체 유래의 종양 세포 또는 그러한 세포의 유도체를 사용하는 것이다(Schirrmacher 등 (1995) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 121:487에서 검토되었음). 미국 특허 번호 5,484,596에서, Hanna Jr. 등은 종양을 수술적으로 제거하고 세포를 콜라게나아제로 분산시키고 세포에 조사하여 환자에게 약 107 세포의 적어도 3개 연속 용량을 예방접종하는 것을 포함하는 재발 또는 전이를 예방하기 위한 각각의 육종의 치료 방법을 청구한다.
본 발명의 화합물을 하나 이상의 보조 치료제와 함께 유리하게 사용할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 보조 치료법을 위해 적합한 제제의 예에는 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드(암시노니드, 베타메타손, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타솔 아세테이트, 클로베타솔 부티레이트, 클로베타솔 17-프로피오네이트, 코르티손, 데플라자코트, 덱속시메타손, 디플루코르톨론 발레레이트, 덱사메타손, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 데소니드, 푸로에이트, 플루시노니드, 플루시노니드 아세토니드, 할시노니드, 히드로코르티손, 히드로코르티손 부티레이트, 히드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 히드로코르티손 발레레이트, 메틸 프레드니솔론, 모메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드 및 할로베타솔 프로피오네이트); 5HTi 작동제, 예컨대 트립탄(예컨대 수마트립탄 또는 나라트립탄); 아데노신 A1 작동제; EP 리간드; NMDA 조정제, 예컨대 글리신 길항제; 나트륨 채널 차단제(예컨대 라모트리긴); 물질 P 길항제(예컨대 NKi 길항제); 칸나비노이드; 아세트아미노펜 또는 페나세틴; 5-리폭시게나아제 저해제; 류코트리엔 수용체 길항제; DMARD(예컨대 메토트렉세이트); 가바펜틴 및 관련 화합물; 트리시클릭 항우울제(예컨대 아미트립틸린); 뉴론 안정화 항간질 약물; 모노아민성 섭취 저해제(예컨대 벤라팍신); 기질 메탈로프로티나아제 저해제; 산화질소 합성효소(NOS) 저해제, 예컨대 iNOS 또는 nNOS 저해제; 종양 괴사 인자 α의 방출 또는 작용 저해제; 항체 치료법, 예컨대 모노클로날 항체 치료법; 항바이러스제, 예컨대 뉴클레오시드 저해제(예컨대 라미부딘) 또는 면역계 조정제(예컨대 인터페론); 오피오이드 진통제; 국소 마취제; 카페인을 포함하는 자극제; H2-길항제(예컨대 라니티딘); 프로톤 펌프 저해제(예컨대 오메프라졸); 제산제(예컨대 알루미늄 또는 마그네슘 히드록시드); 항팽만제(예컨대 시메티콘); 충혈제거제(예컨대 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 슈도에페드린, 옥시메타졸린, 나파졸린, 자일로메타졸린, 프로필헥세드린 또는 레보-데스옥시에페드린); 진해제(예컨대 코데인, 히드로코돈, 카르미펜, 카르베타펜탄 또는 덱스트라메토판); 이뇨제; 또는 진정제 또는 비진정성 항히스타민제가 포함된다.
본 발명의 화합물은 다른 유전자를 표적으로 삼는 siRNA와 공동 투여할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 화합물을 c-Myc 유전자를 표적으로 하는 siRNA와 공동 투여할 수 있다. 하나의 예에 있어서, AD-12115를 c-Myc siRNA와 공동 투여할 수 있다. c-Myc을 표적으로 삼는 siRNA의 예는 본원에 참조함으로써 통합되는 미국 특허 출원 번호 12/373,039에 개시된다.
지질 입자의 제조 방법
본 발명의 방법 및 조성물은 하기 및 동반 실시예에 기재되는 특정 양이온성 지질, 합성, 제조 및 특징분석을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명은 치료제, 예컨대 핵산에 연관되는 것들을 포함하는 지질 입자의 제조 방법을 제공한다. 본원에 기재되는 방법에 있어서, 지질 혼합물은 핵산의 완충 수용액과 조합되어 지질 입자 중에 캡슐화된 핵산을 포함하는 중간체 혼합물을 제조하며, 여기서 캡슐화된 핵산은 약 3wt% 내지 약 25wt%, 바람직하게는 5 내지 15wt%의 핵산/지질비로 존재한다. 중간체 혼합물을 선택적으로 체질하여 지질-캡슐화 핵산 입자를 수득할 수 있으며, 여기서 지질 부분은 바람직하게는 직경 30 내지 150nm, 보다 바람직하게는 약 40 내지 90nm의 단층 운반체이다. 이어서 pH를 높여 지질-핵산 입자 상의 표면 전하의 적어도 일부를 중화시킴으로써 적어도 부분적으로 표면이 중화된 지질 캡슐화 핵산 조성물을 제공한다.
상술된 바와 같이 이러한 여러 양이온성 지질은 아미노기의 pKa 미만의 pH에서 하전되며 pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성인 아미노 지질이다. 이들 양이온성 지질을 적정가능 양이온성 지질이라고 명명하며, 2단계 절차를 이용하여 본 발명의 제형물에 사용할 수 있다. 먼저 지질 운반체를 핵산의 존재 하에 적정가능 양이온성 지질 및 다른 운반체 성분과 함께 더 낮은 pH에서 형성할 수 있다. 이러한 방식으로 운반체는 핵산을 캡슐화 및 트랩핑할 것이다. 두번째로 새로 형성된 운반체의 표면 전하를 배지의 pH를 존재하는 적정가능 양이온성 지질의 pKa를 초과하는 수준으로, 즉 생리학적 pH 이상으로 증가시킴으로써 중화시킬 수 있다. 본 절차의 특히 유리한 측면에는 핵산을 흡수한 임의 표면 및 중성 표면을 갖는 생성 핵산 전달 운반체 모두의 용이한 제거가 포함된다. 중성 표면을 갖는 리포좀 또는 지질 입자는 순환으로부터의 빠른 제거를 피하고 양이온성 리포좀 제조와 연관되는 특정 독성을 피할 것으로 예측된다. 핵산-지질 입자 제형물 중 이러한 적정가능 양이온성 지질의 사용에 관한 추가 상세사항은 본원에 참조함으로써 통합되는 US 특허 6,287,591 및 US 특허 6,858,225에 갖추어져 있다.
또한 이러한 방식으로 형성되는 운반체는 고함량 핵산을 가지며 균일한 운반체 크기의 제형물을 제형물을 제공하는 것으로 주지된다. 추가적으로 운반체의 크기 범위는 약 30 내지 약 150nm, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 90nm이다.
특정 이론에 구애되지 않으면서, 매우 높은 핵산 캡슐화 효율은 낮은 pH에서의 정전기적 상호작용의 결과로 여겨진다. 산성 pH(예컨대 pH 4.0)에서 운반체 표면이 하전되어 정전기적 상호작용을 통해 핵산 부분에 결합된다. 외부 산성 완충액을 보다 중성인 완충액(예컨대 pH 7.5)으로 교환하면, 지질 입자 또는 리포좀의 표면이 중화되어 외부 핵산을 제거할 수 있다. 제형화 절차에 대한 보다 상세한 정보는 다양한 문헌(예컨대, US 특허 6,287,591 및 US 특허 6,858,225)에 갖추어져 있다.
위의 관점에서, 본 발명은 지질/핵산 제형물의 제조 방법을 제공한다. 본원에 기재되는 방법에 있어서, 지질 혼합물을 핵산의 완충 수용액과 조합하여 지질 입자 중에 캡슐화된 핵산을 포함하는 중간체 혼합물을 제조하며, 예컨대 캡슐화된 핵산은 약 10wt% 내지 약 20wt%의 핵산/지질 비로 존재한다. 중간체 혼합물을 선택적으로 체질하여 지질 캡슐화 핵산 입자를 수득할 수 있으며, 여기서 지질 부분은 바람직하게는 직경이 30 내지 150nm, 보다 바람직하게는 약 40 내지 90nm인 단층 운반체이다. 이어서 pH를 높여서 지질-핵산 입자 상의 표면 전하의 적어도 일부를 중화시킴으로써 적어도 부분적으로 표면이 중화된 지질 캡슐화 핵산 조성물을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 지질 혼합물에는 다음의 2개 이상의 지질 성분이 포함된다: 지질이 pKa 미만 pH에서 양이온성이고 pKa 초과 pH에서 중성이 되는 pKa를 갖는 지질 중에서 선택되는 본 발명의 제 1 아미노 지질 성분, 및 지질-핵산 입자의 형성 동안 입자 응집을 방지하는 지질 중에서 선택되는 제 2 지질 성분. 특정 구현예에 있어서, 아미노 지질은 본 발명의 신규한 양이온성 지질이다.
본 발명의 핵산-지질 입자의 제조에 있어서, 지질 혼합물은 전형적으로 유기 용매 중의 지질 용액이다. 이어서 이 지질 혼합물을 건조하여 박막을 형성하거나 동결건조하여 리포좀을 형성하기 위해 수성 완충액으로 수화하기 전 분말을 형성할 수 있다. 이와는 달리 바람직한 방법에 있어서는, 지질 혼합물을 수혼화성 알코올, 예컨대 에탄올 중에 가용화시키고 이 에탄올계 용액을 수성 완충액에 첨가하여 자발적 리포좀 형성을 일으킬 수 있다. 대부분의 구현예에 있어서, 알코올은 시판되는 형태로 사용된다. 예를 들어, 에탄올을 절대 에탄올(100%)로, 또는 95% 에탄올과 나머지 물로 사용할 수 있다. 이 방법은 US 특허 5,976,567에 보다 상세히 설명되어 있다.
본 발명에 따라, 지질 혼합물을 핵산을 포함할 수 있는 완충 수용액과 조합한다. 그 완충 수용액은 전형적으로 완충액이 지질 혼합물 중 양성자를 부가할 수 있는 지질의 pKa 보다 낮은 pH를 갖는 용액이다. 적합한 완충액의 예에는 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 MES가 포함된다. 특히 바람직한 완충액은 시트레이트 완충액이다. 바람직한 완충액은 캡슐화되는 핵산의 화학성질에 따라 1-1000mM범위의 음이온이고, 완충액 농도의 최적화가 높은 로딩 수준을 얻는데 중요할 수 있다(예컨대 US 특허 6,287,591 및 US 특허 6,858,225를 참고). 이와는 달리, 클로라이드, 설페이트 등을 이용하여 pH 5-6으로 산성화된 순수한 물이 유용할 수 있다. 이러한 경우, 5% 글루코오스, 또는 입자를 투석하여 에탄올을 제거하거나 pH를 증가시키거나 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 일반 식염수와 혼합했을 때 입자막을 거쳐 삼투압 전위의 균형을 맞춰줄 또 다른 비이온성 용질을 첨가하는 것이 적합할 수 있다. 완충액 중 핵산의 양은 다를 수 있지만, 전형적으로 약 0.01mg/mL 내지 약 200mg/mL, 보다 바람직하게는 약 0.5mg/mL 내지 약 50mg/mL이다.
치료 핵산의 지질 및 완충 수용액의 혼합물을 조합하여 중간체 혼합물을 제공한다. 중간체 혼합물은 전형적으로 캡슐화된 핵산을 갖는 지질 입자의 혼합물이다. 추가적으로, 중간체 혼합물은 또한 지질 입자 표면 상의 음으로 하전된 핵산 및 양으로 하전된 지질의 이온성 인력으로 인해 지질 입자(리포좀 또는 지질 운반체)의 표면에 부착되는 일부 핵산 부분을 포함할 수 있다(양성자를 부가할 수 있는 제 1 지질 성분을 구성하는 아미노 지질 또는 다른 지질은 지질 상 양성자를 부가할 수 있는 기의 pKa 미만의 pH를 갖는 완충액 중에서 양으로 하전된다). 바람직한 구현예의 한 군에 있어서, 지질 혼합물은 지질의 알코올 용액이며, 각 용액의 부피는 조합 시 생성 알코올 함량이 약 20부피% 내지 약 45부피%가 되도록 조정한다. 혼합물의 조합 방법에는 종종 제조되는 제형물의 스케일에 따라 다양한 임의 절차가 포함될 수 있다. 예를 들어 전체 부피가 약 10-20mL이하인 경우, 용액을 시험관 내에 조합하고 볼텍스 혼합기를 이용하여 함께 교반할 수 있다. 대규모 절차를 적합한 생산 스케일의 글래스웨어에서 수행할 수 있다.
선택적으로 지질 혼합물 및 치료제(핵산)의 완충 수용액을 조합하여 제조되는 지질 캡슐화 치료제(예컨대, 핵산) 복합체를 체질하여 원하는 크기 범위 및 상대적으로 좁은 지질 입자 크기 분포를 얻을 수 있다. 바람직하게는 본원에 제공되는 조성물을 평균 직경 약 70 내지 약 200nm, 보다 바람직하게는 약 90 내지 약 130nm으로 체질하게 된다. 원하는 크기로 리포좀을 체질하기 위한 여러 기법을 이용할 수 있다. 하나의 체질 방법은 본원에 참조함으로써 통합되는 미국 특허 번호 4,737,323에 설명되어 있다. 조 또는 탐침 초음파 분쇄에 의해 리포좀 현탁액을 초음파 분쇄하여 약 0.05마이크론 미만 크기인 작은 단층 운반체(SUV)로 크기를 감소시킨다. 호모게나이제이션은 큰 리포좀을 더 작은 것으로 절편화시키기 위해 전단 에너지에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 호모게나이제이션 절차에 있어서, 다층 운반체를 선택한 리포좀 크기, 전형적으로 약 0.1 및 0.5마이크론이 관찰될 때까지 표준 에멀션 호모게나이저를 통해 재순환시킨다. 두 방법 모두에 있어서, 입자 크기 분포는 통상적인 레이저빔 입자 크기 결정에 의해 모니터링할 수 있다. 본원에 특정 방법에 있어서, 압출을 이용하여 균일한 운반체 크기를 수득한다.
소구경 폴리카보네이트막 또는 비대층 세라믹막을 통한 리포좀 조성물의 압출로 상대적으로 잘 정의되는 크기 분포를 얻게 된다. 전형적으로 원하는 리포좀 복합체 크기 분포를 얻을 때까지 현탁액을 막을 통해 1회 이상 순환시킨다. 리포좀을 연속적으로 더 작은 구경의 막을 통해 압출하여 리포좀 크기를 점차적으로 감소시킬 수 있다. 일부 경우에 있어서, 형성되는 지질-핵산 조성물을 체질하지 않고 사용할 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 또한 지질-핵산 조성물의 지질 부분 상에 적어도 일부 표면 전하의 중화 단계를 포함한다. 적어도 부분적으로 표면 전하를 중화시킴으로써, 미캡슐화 핵산을 지질 입자 표면에서 제거하고, 통상적 기법을 이용하여 조성물에서 제거할 수 있다. 바람직하게는 미캡슐화되고 표면 흡수된 핵산을 완충액 용액의 교환을 통해 생성 조성물에서 제거한다. 예를 들어 시트레이트 완충액(pH 약 4.0, 조성물 형성에 사용)을 HEPES-완충 식염수(HBS pH 약 7.5) 용액으로 교체하면 리포좀 표면이 중화되고 핵산이 표면에서 방출된다. 이어서 방출되는 핵산을 표준 방법을 이용하여 크로마토그래피를 통해 제거한 후 사용하는 지질의 pKa 초과 pH를 갖는 완충액으로 바꿀 수 있다.
선택적으로 지질 운반체(즉 지질 입자)는 핵산의 첨가 전에 상술된 임의 방법을 이용하여 수성 완충액 중에 수화로 형성하고 체질할 수 있다. 상술된 바와 같이, 수성 완충액은 아미노 지질의 pKa 미만 pH여야 한다. 이어서 핵산 용액을 이들 체질하고 사전 형성한 운반체에 첨가할 수 있다. 핵산을 이와 같은 사전 형성한 운반체 내에 캡슐화하려면 혼합물은 알코올, 예컨대 에탄올을 포함해야 한다. 에탄올의 경우, 약 20%(w/w) 내지 약 45%(w/w)의 농도로 존재해야 한다. 또한, 수성 완충액-에탄올 혼합물 중 사전 형성된 운반체 및 핵산의 혼합물을 지질 운반체의 조성 및 핵산의 성질에 따라 약 25℃ 내지 약 50℃의 온도로 가온해야 할 수 있다. 당업자에게는 지질 운반체 중에 원하는 핵산 수준을 얻기 위해 캡슐화 공정을 최적화하는 것이 변수, 예컨대 에탄올 농도 및 온도의 조작을 필요로 할 것이라는 점이 자명할 것이다. 핵산 캡슐화를 위해 적합한 조건의 예는 실시예에 제공된다. 일단 핵산을 사전 형성된 운반체 내에 캡슐화하면, 외부 pH를 증가시켜 표면 전하를 적어도 부분적으로 중화시킬 수 있다. 이어서 캡슐화되지 않고 표면 흡수된 핵산을 상술된 바와 같이 제거할 수 있다.
PCSK9 유전자의 발현 저해 방법
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에서는 포유류에서 PCSK9 유전자의 발현 저해 방법을 제공한다. 이 방법에는 표적 PCSK9 유전자의 발현을 연장된 기간 동안, 예컨대, 적어도 1주, 2주, 3주 또는 4주 이상 감소시키도록 본 발명의 조성물을 포유류에게 투여하는 것이 포함된다.
예를 들어 특정 예에 있어서, PCSK9 유전자의 발현은 본원에 기재되는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 저해된다. 일부 구현예에 있어서, PCSK9 유전자는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 60%, 70%, 또는 80% 저해된다. 일부 구현예에 있어서, PCSK9 유전자는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90%, 또는 95% 저해된다. 표 1b, 표 2b, 및 표 5b에서는 다양한 PCSK9 dsRNA 분자를 다양한 농도로 사용하여 시험관 내 분석에서 수득되는 광범위한 발현 저해값을 제공한다.
감소된 표적 PCSK9 유전자의 효과는 바람직하게는 포유류의 혈액, 보다 구체적으로는 혈청 중 LDLc(저밀도 지질단백질 콜레스테롤) 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에 있어서, LDLc 수준은 치료 전 수준에 비해 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 이상 감소된다.
이 방법에는 dsRNA를 포함하는 조성물의 투여가 포함되며, 여기서 dsRNA는 치료할 포유류의 PCSK9 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 치료할 유기체가 포유류, 예컨대 인간인 경우, 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피 및 기도(에어로졸) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구 경로를 비제한적으로 포함하는 당분야에 공지된 임의 수단으로 투여할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 조성물은 정맥 내 주입 또는 주사로 투여된다.
본원에서 설명된 방법 및 조성물을 사용하여 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함으로써 조정할 수 있는 질환 및 상태를 치료할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재되는 조성물을 사용하여 고지혈증 및 기타 형태의 지질 불균형, 예컨대 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세리드혈증 및 이러한 장애와 연관된 병리학적 상태, 예컨대 심장 및 순환 질환을 치료할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, PCSK9 dsRNA로 치료하는 환자에게 또한 비-dsRNA 치료제, 예컨대 지질 장애를 치료하는 것으로 공지된 제제를 투여한다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 피험체, 예컨대 인간에서 PCSK9 유전자의 발현 저해 방법을 제공한다. 이 방법에는 dsRNA의 첫번째 단회 용량, 예컨대 PCSK9 mRNA 수준을 적어도 5, 보다 바람직하게는 7, 10, 14, 21, 25, 30 또는 40일 억제하기 충분한 용량을 투여하고; 선택적으로 dsRNA의 두번째 단회 용량을 투여하여 대상체에서 PCSK9 유전자의 발현을 저해하는 것이 포함되며, 여기서 두번째 단회 용량은 첫번째 단회 용량을 투여하고 적어도 5, 보다 바람직하게는 7, 10, 14, 21, 25, 30 또는 40일 후에 투여한다.
하나의 구현예에 있어서, dsRNA의 용량은 매 4주 1회 이하, 매 3주 1회 이하, 매 2주 1회 이하, 또는 매 1주 1회 이하로 투여된다. 또 다른 구현예에 있어서, 투여를 1, 2, 3 또는 6개월, 또는 1년 이상 유지할 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 투여는 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDLc) 수준이 소정 최소 수준, 예컨대 70mg/dL, 130mg/dL, 150mg/dL, 200mg/dL, 300mg/dL, 또는 400mg/dL 초과에 도달하였거나 이를 넘었을 때 제공할 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 대상체는 적어도 부분적으로 LDL 저하, HDL 저하 없는 LDL 저하, ApoB 저하, 또는 HDL 저하 없는 전체 콜레스테롤 저하에 대한 필요성에 근거하여(이를 필요로 하게 될 기준에서 환자를 단순 선택하는 것과 대조적으로) 선택된다.
하나의 구현예에 있어서, dsRNA는 면역계를 활성화시키지 않는다, 예컨대 TNF-알파 또는 IFN-알파 수준과 같은 시토카인 수준을 증가시키지 않는다. 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 시험관 내 PBMC 분석과 같은 분석에 의해 측정하는 경우, TNF-알파 또는 IFN-알파 수준의 증가는 대조군 dsRNA, 예컨대 PCSK9를 표적으로 하지 않는 dsRNA로 처리한 대조군 세포의 30%, 20% 또는 10% 미만이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명에서는 예를 들어 대상체, 예컨대 인간 대상체에서 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절하여 매개할 수 있는 장애, 병리학적 절차 또는 증상의 치료, 예방 또는 관리 방법을 제공한다. 하나의 구현예에 있어서, 이 장애는 고지혈증이다. 이 방법에는 dsRNA의 첫번째 단회 용량, 예컨대 PCSK9 mRNA 수준을 적어도 5, 보다 바람직하게는 7, 10, 14, 21, 25, 30 또는 40일 억제하기 충분한 용량을 투여하고; 선택적으로 dsRNA의 두번째 단회 용량을 투여하여 대상체에서 PCSK9 유전자의 발현을 저해하는 것이 포함되며, 여기서 두번째 단회 용량은 첫번째 단회 용량을 투여하고 적어도 5, 보다 바람직하게는 7, 10, 14, 21, 25, 30 또는 40일 후에 투여한다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에서 특징적인 dsRNA, 즉 PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA를 포함하는 조성물은 비-dsRNA 치료제, 예컨대 고콜레스테롤혈증, 죽상경화 또는 이상지질혈증과 같은 지질 장애를 치료하는 것으로 공지되어 있는 제제와 함께 투여한다. 예를 들어, 본 발명에서 특징적인 dsRNA는 예컨대 HMG-CoA 환원효소 저해제(예컨대 스타틴), 피브레이트, 담즙산 격리제, 니아신, 항혈소판제, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 안지오텐신 II 수용체 길항제(예컨대 로사르탄 포타슘, 예컨대 Merck ＆ Co.의 Cozaar®), 아실CoA 콜레스테롤 아세틸트랜스퍼라아제(ACAT) 저해제, 콜레스테롤 흡수 저해제, 콜레스테롤 에스테르 수송 단백질(CETP) 저해제, 미세소체 트리글리세리드 수송 단백질(MTTP) 저해제, 콜레스테롤 조정제, 담즙산 조정제, 페록시솜 증식 활성화 수용체(PPAR) 작동제, 유전자 기반 치료, 복합 혈관 보호제(예컨대 Atherogenics의 AGI-1067), 당단백질 IIb/IIIa 저해제, 아스피린 또는 아스피린 유사 화합물, IBAT 저해제(예컨대 Shionogi의 S-8921), 스쿠알렌 합성효소 저해제 또는 단핵구 화학유인 단백질(MCP)-I 저해제와 함께 투여할 수 있다. HMG-CoA 환원효소 저해제의 예에는 아토바스타틴(Pfizer의 Lipitor®/타호르/소르티스/토르바스트/카르딜), 프라바스타틴(Bristol-Myers Squibb의 프라바콜, Sankyo의 메발로틴/사나프라브), 심바스타틴(Merck의 조코/신바코, Boehringer Ingelheim의 데난, Banyu의 리포바스), 로바스타틴(Merck의 메바코/메비나코, Bexal의 로바스타티나, 세파; Schwarz Pharma의 리포스클레르), 플루바스타틴(Novartis의 Lescol®/로콜/로클, Fujisawa의 크라녹, Solvay의 디가릴), 세리바스타틴(Bayer의 리포베이/GlaxoSmithKline의 베이콜), 로수바스사틴(AstraZeneca의 Crestor®) 및 피타바스타틴(이타바스타틴/리시바스타틴)(Nissan Chemical, Kowa Kogyo, Sankyo, 및 Novartis)이 포함된다. 피브레이트의 예에는 예컨대 베자피브레이트(예컨대, Roche의 Befizal®/Cedur®/Bezalip®, Kissei의 베자톨), 클로피브브레이트(예컨대, Wyeth의 Astromid-S®), 페노피브레이트(예컨대, Fournier의 리피딜/리판틸, Abbott의 Tricor®, Takeda의 리판틸, 제네릭 제품들), 젬피브로질(예컨대, Pfizer의 로피드/리푸르) 및 시프로피브레이트(Sanofi-Synthelabo의 Modalim®)가 포함된다. 담즙산 격리제의 예에는 예컨대 콜레스티라민(Bristol-Myers Squibb의 Questran® 및 Questran Light™), 콜레스티폴(예컨대, Pharmacia의 콜레스티드), 및 콜레벨람(Genzyme/Sankyo의 WelChol™)이 포함된다. 니아신 치료의 예에는 예컨대 즉시 방출형 제형물, 예컨대 Aventis의 니토비드, Upsher-Smith의 니아코, Aventis의 니콜라 및 Sanwakagaku의 페리싯이 포함된다. 니아신 서방형 제형물에는 예컨대 Kos Pharmaceutical의 니아스판 및 Upsher-Smith의 시오-니아신이 포함된다. 항혈소판제의 예에는 예컨대 아스피린(예컨대, Bayer의 아스피린), 클로피도그렐(Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb의 플라빅스), 및 티클로피딘(예컨대, Sanofi-Synthelabo의 티클리드 및 Daiichi의 파날딘)이 포함된다. PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA와 병용하는데 유용한 다른 아스프린 유사 화합물에는 예컨대 아사카드(서방형 아스피린, Pharmacia) 및 파미코그렐(Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA)이 포함된다. 안지오텐신 전환 효소 저해제의 예에는 예컨대 라미프릴(예컨대, Aventis의 알테이스) 및 에날라프릴(예컨대, Merck ＆ Co.의 바소텍)이 포함된다. 아실 CoA 콜레스테롤 아세틸트랜스퍼라아제(ACAT) 저해제의 예에는 예컨대 아바시미베(Pfizer), 에플루시미베(BioMeieux Pierre Fabre/Eli Lilly), CS-505(Sankyo 및 Kyoto), 및 SMP-797(Sumito)이 포함된다. 콜레스테롤 흡수 저해제의 예에는 예컨대 에제티미베(Merck/Schering-Plough Pharmaceutical의 Zetia®) 및 파마퀘시드(Pfizer)가 포함된다. CETP 저해제의 예에는 예컨대 토르세트라피브(CP-529414로도 불림, Pfizer), JTT-705(Japan Tobacco), 및 CETi-I(Avant Immunotherapeutics)가 포함된다. 미세소체 트리글리세리드 수송 단백질(MTTP) 저해제의 예에는 예컨대 임플리타피드(Bayer), R-103757(Janssen), 및 CP-346086(Pfizer)이 포함된다. 다른 콜레스테롤 조정제의 예에는 예컨대 NO-1886(Otsuka/TAP Pharmaceutical), CI-1027(Pfizer), 및 WAY-135433(Wyeth-Ayerst)이 포함된다. 담즙산 조정제의 예에는 예컨대 HBS-107(Hisamitsu/Banyu), Btg-511(British Technology Group), BARI-1453(Aventis), S-8921(Shionogi), SD-5613(Pfizer) 및 AZD-7806(AstraZeneca)이 포함된다. 페록시솜 증식 활성화 수용체(PPAR) 작동제의 예에는 예컨대 테사글리타자르(AZ-242)(AstraZeneca), 네토글리타존(MCC-555)(Mitsubishi/Johnson ＆ Johnson), GW-409544(Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), GW-501516(Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), LY-929(Ligand Pharmaceuticals 및 Eli Lilly), LY-465608(Ligand Pharmaceuticals 및 Eli Lilly), LY-518674(Ligand Pharmaceuticals 및 Eli Lilly), 및 MK-767(Merck 및 Kyorin)이 포함된다. 유전자-기반 치료의 예에는 예컨대 AdGWEGF121.10(GenVec), ApoA1(UCB Pharma/Groupe Fournier), EG-004(트리남)(Ark Therapeutics), 및 ATP-결합 카세트 트랜스포터-A1(ABCAl)(CV Therapeutics/Incyte, Aventis, Xenon)이 포함된다. 당단백질 IIb/IIIa 저해제의 에에는 예컨대 록시피반(DMP754로도 불림, Bristol-Myers Squibb), 간토피반(Merck KGaA/Yamanouchi), 및 크로마피반(Millennium Pharmaceuticals)이 포함된다. 스쿠알렌 합성효소 저해제의 예에는 예컨대 BMS-1884941(Bristol-Myers Squibb), CP-210172(Pfizer), CP-295697(Pfizer), CP-294838(Pfizer), 및 TAK-475(Takeda)가 포함된다. MCP-I 저해제의 예에는 예컨대 RS-504393(Roche Bioscience)이 포함된다. 항죽상경화제 BO-653(Chugai Pharmaceuticals), 및 니코틴산 유도체 니클린(Yamanouchi Pharmacuticals)도 본 발명에서 특징으로 하는 dsRNA와 병용 투여하기 적합하다. PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA와 투여하기 적합한 병용 치료의 예에는 예컨대 아드비코르(니아신/로바스타틴, Kos Pharmaceuticals), 암로디핀/아토바스사틴(Pfizer), 및 에제티미베/심바스타틴(예컨대, Vytorin® 10/10, 10/20, 10/40, 및 10/80 정제, Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)이 포함된다. PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA와 함께 투여하기 적합한 고혈레스테롤혈증 치료용 제제에는 예컨대 로바스타틴, 니아신 Altoprev® 서방형 정제(Andrx Labs), 로바스타틴 Caduet® 정제(Pfizer), 암로디핀 베실레이트, 아토바스타틴 칼슘 Crestor® 정제(AstraZeneca), 로수바스타틴 칼슘 Lescol® 캡슐(Novartis), 플루바스타틴 나트륨 Lescol®(Reliant, Novartis), 플루바스타틴 나트륨 Lipitor® 정제(Parke-Davis), 아토바스타틴 칼슘 Lofibra® 캡슐(Gate), 니아스판 서방형 정제(Kos), 니아신 프라바콜 정제(Bristol-Myers Squibb), 프라바스타틴 나트륨 Tricor® 정제(Abbott), 페노피브레이트 Vytorin® 10/10 정제(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), 에제티미베, 심바스타틴 WelChol™ 정제(Sankyo), 콜레세벨람 히드로클로라이드 Zetia® 정제(Schering), 에제티미베 Zetia® 정제(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), 및 에제티미베 Zocor® 정제(Merck)가 포함된다.
하나의 구현예에 있어서, PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA는 에제티미베/심바스타틴 병용제(예컨대 Vytorin®Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals))와 함께 투여된다.
하나의 구현예에 있어서, PCSK9 dsRNA를 환자에게 투여한 후 비dsRNA 제제를 환자에게 투여한다(또는 반대로). 또 다른 구현예에 있어서, PCSK9 dsRNA 및 비dsRNA 치료제를 동시에 투여한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 최종 사용자, 예컨대 돌보미 또는 대상체에게 본원에 기재된 dsRNA를 투여하는 방식에 대한 지시 방법을 특징으로 한다. 이 방법에는 선택적으로 dsRNA의 하나 이상의 용량을 최종 사용자에게 제공하고, 최종 사용자에게 본원에 기재된 요법으로 dsRNA를 투여하도록 지시하여 최종 사용자에게 지침을 주는 것이 포함된다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에서는 환자의 LDL 저하, HDL 저하 없는 LDL 저하, ApoB 저하, 또는 전체 콜레스테롤 저하에 대한 필요성에 근거하여 환자를 선택함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법에는 예컨대 실질적으로 HDL 수준을 저하시키지 않으면서 LDL 수준 또는 ApoB 수준을 낮추기 충분한 양으로 PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA를 환자에게 투여하는 것이 포함된다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에서는 환자의 ApoB 수준을 저하시킬 필요성에 근거하여 환자를 선택하고, 환자에서 ApoB 수준을 낮추기 충분한 양으로 PCSK9를 표적으로 하는 dsRNA를 환자에게 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에 있어서, PCSK9의 양은 LDL 수준뿐만 아니라 ApoB 수준을 낮추기 충분하다. 또 다른 구현예에 있어서, PCSK9 dsRNA의 투여는 환자의 HDL 콜레스테롤 수준에 영향을 미치지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 평가에 사용할 수 있으나, 적합한 방법 및 재료를 후술한다. 본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허 적용, 특허, 및 기타 참고문헌은 참조함으로써 그 전문이 본원에 통합되어 있다. 상충되는 경우에는 정의를 포함하는 본 명세서가 우선이 될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예 1. PCSK9 유전자의 유전자 워킹(gene walking)
siRNA 설계를 수행하여 2가지 개별적 선별물을 동정하였다.
a) PCSK9 인간 및 마우스나 랫트 mRNA를 표적화하는 siRNA 및
b) 표적 유전자 PCSK9에 대한 예측된 특이성을 갖는 모든 인간 반응성 siRNA.
인간, 마우스 및 랫트 PCSK9에 대한 mRNA 서열들을 사용하였고, 인간 서열 NM_174936.2를 전체 siRNA 선발 과정 동안 참조 서열로 사용하였다.
인간 및 마우스, 및 인간 및 랫트 PCSK9 mRNA 서열들에 보존된 19머(mer) 구간(stretch)을 제1단계에서 동정하여, 인간 및 마우스 표적에 대해 교차-반응성인 siRNA, 및 인간 및 랫트 표적에 대해 교차 반응성인 siRNA를 선발하였다.
인간 PCSK9를 특이적으로 표적화하는 siRNA를 2차 선발에서 동정하였다. 인간 PCSK9의 모든 가능한 19머 서열을 추출하고 후보 표적 서열로서 정의하였다. 인간 및 원숭이에 대해 교차 반응성인 서열들, 및 마우스, 랫트, 인간 및 원숭이에 대해 교차 반응성인 서열들이 표 1a 및 2a에 기재되어 있다. 상기 서열들의 화학적으로 변형된 형태들과 시험관내 및 생체내 분석에서의 이들의 활성이 또한 표 1a 및 2a에 기재되어 있다. 상기 데이터는 실시예 및 도 2-8에 설명되어 있다.
후보 표적 서열 및 이의 대응되는 siRNA를 등급화하고 적절한 것을 선발하기 위해, 비관련 표적과 상호작용하는 이들의 예측되는 잠재성(오프-표적(off-target) 잠재성)을 등급화 매개변수로 취하였다. 오프-표적 잠재성이 낮은 siRNA를 바람직한 것으로 정의하였으며 생체내에서 보다 특이적인 것으로 가정하였다.
siRNA-특이적 오프-표적 잠재성을 예측하기 위해, 하기와 같이 가정하였다:
1) 가닥의 위치 2 내지 9(5'부터 3'으로 계수함)(핵심 영역(seed region))는 서열의 나머지(비-핵심 및 절단 부위 영역)보다 더욱 오프-표적 잠재성에 기여할 수 있다.
2) 가닥의 위치 10 및 11(5'부터 3'으로 계수함)(절단 부위 영역)은 비-핵심 영역보다 더욱 오프-표적 잠재성에 기여할 수 있다.
3) 각 가닥의 위치 1 및 19는 오프-표적 상호작용과 관련성이 없다.
4) 각 유전자 및 각 가닥에 대한 오프-표적 스코어는 유전자 서열에 대한 siRNA 가닥 서열의 상보성 및 불일치(mismatch) 위치에 기초하여 계산할 수 있다.
5) 예측되는 오프-표적의 수 뿐만 아니라 최고 오프-표적 스코어가 오프-표적 잠재성을 위해 고려되어야 한다
6) 오프-표적 스코어가 오프-표적의 수보다 오프-표적 잠재성과 더욱 관련되는 것으로 간주되어야 한다
7) 도입된 내부 변형에 의한 센스 가닥 활성의 잠재적인 중지를 가정할 때, 안티센스 가닥의 오프-표적 잠재성만이 관련될 것이다.
잠재적 오프-표적 유전자를 동정하기 위해, 19머 후보 서열들을 공개적으로 입수가능한 인간 mRNA 서열들과 상동성 조사를 수행하였다.
각 19머 입력 서열에 대한 하기 오프-표적 특성을 각 오프-표적 유전자에 대해 추출하여 오프-표적 스코어를 계산하였다:
비-핵심 영역에서의 불일치 개수
핵심 영역 영역에서의 불일치 개수
절단 부위 영역에서의 불일치 개수
가정 1 내지 3을 고려하여 하기와 같이 오프-표적 스코어를 계산하였다:
오프-표적 스코어 = 핵심 불일치의 개수 * 10
+ 절단 부위 불일치의 개수 * 1.2
+비-핵심 불일치의 개수 * 1
입력 19머 서열에 대응되는 각 siRNA에 대해 가장 관련되는 오프-표적 유전자를 오프-표적 스코어가 최저인 유전자로서 정의하였다. 따라서, 최저 오프-표적 스코어를 각 siRNA에 대해 관련되는 오프-표적 스코어로서 정의하였다.
실시예 2. dsRNA 합성
시약의 공급원
시약의 공급원은 본원에서 달리 특정되지 않으면, 그와 같은 시약은 분자생물학에서 적용을 위한 질/순도 표준에서 분자생물학에 대한 시약의 임의 공급자로부터 얻을 수 있다.
siRNA 합성
단일가닥 RNA를, Expedite 8909 합성기 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany) 및 고형 지지체로서 제어된 공극 유리 (controlled pore glass) (CPG, 500Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)을 사용하여 1 μmole의 크기로 고상 합성으로 생성했다. 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 및 RNA를 상응하는 포스포르아미다이트 및 2'-O-메틸 포스포르아미다이트 각각을 이용하는 고상 합성으로 산출했다 (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany). 이들 빌딩 블록(building block)을 하기에 기재된 바와 같은 표준 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 올리고리보뉴클레오티드 사슬의 서열 내의 선택된 부위에서 통합했다: Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY, USA. 포스포로티오에이트 결합을, 요오드 산화제 용액 중 아세토니트릴 (1%) 중 뷰케이지(Beaucage) 시약의 용액에 의한 대체로 도입했다 (Chruachem Ltd, Glasgow, UK). 추가 보조 시약을 Mallinckrodt Baker (Griesheim, Germany)로부터 얻었다.
음이온교환 HPLC에 의한 조 올리고리보뉴클레오티드의 탈보호 및 정제를 확립된 절차에 따라 수행했다. 수율 및 농도를 분광 광도계 (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiβheim, Germany)를 사용하여 260 nm의 파장에서 각 RNA의 용액의 UV 흡수로 측정했다. 이중가닥 RNA를 열처리(annealing) 버퍼 (20　mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8; 100 mM 염화나트륨) 중 상보적 가닥의 등몰 용액을 혼합하여 생성하고, 수욕에서 85 - 90℃에서 3분 동안 가열하고 3 - 4시간의 기간에 걸쳐 실온으로 냉각시켰다. 열처리된 RNA 용액을, 사용시까지 -20℃에서 보관했다.
콘쥬게이트된 siRNAs
3'-콜레스테롤 콘쥬게이트된 siRNAs (이하, -Chol-3'로 칭함)의 합성에 대해, 적당하게 변형된 고형 지지체를 RNA 합성을 위해 사용했다. 변형된 고형 지지체를 하기와 같이 준비했다:
디에틸-2-아자부탄-1,4-디카복실레이트 AA
Figure pct00020

수산화나트륨 (50 ml)의 4.7 M 수용액을 물 (50 ml) 중 에틸 글리시네이트 히드로클로라이드 (32.19 g, 0.23 mole)의 교반된 빙냉 용액에 첨가했다. 그 다음, 에틸 아크릴레이트 (23.1 g, 0.23 mole)을 첨가하고, 혼합물을, 반응의 완료를 TLC로 확인할 때까지 실온에서 교반했다. 19시간 후, 용액을 디클로로메탄 (3 x 100 ml)로 분할했다. 유기 층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔여물을 증류시켜 AA (28.8 g, 61%)를 얻었다.
3-{에톡시카보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐-아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 AB
Figure pct00021

Fmoc-6-아미노-헥산산 (9.12 g, 25.83 mmol)을 디클로로메탄 (50 ml)에서 용해시키고, 얼음으로 냉각시켰다. 디이소프로필카보디이미드 (3.25 g, 3.99 ml, 25.83 mmol)을 용액에 0℃에서 첨가했다. 그 다음, 이에 디에틸-아자부탄-1,4-디카복실레이트 (5 g, 24.6 mmol) 및 디메틸아미노 피리딘 (0.305 g, 2.5 mmol)을 첨가했다. 용액을 실온으로 올리고, 6시간 동안 추가 교반했다. 반응의 완료를 TLC로 확인했다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축하고, 에틸 아세테이트를 첨가하여 디이소프로필 우레아를 침전시켰다. 서스펜션을 여과했다. 여과물을 5% 염산, 5% 중탄산나트륨 및 물로 세정했다. 조합된 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축하여 조 생성물을 얻고, 이를 칼럼 크로마토그래피 (50 % EtOAC/헥산)으로 정제하여 11.87 g (88%)의 AB를 얻었다.
3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 AC
Figure pct00022

3-{에톡시카보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 AB (11.5 g, 21.3 mmol)을 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘에서 0℃에서 용해시켰다. 용액을 1시간 동안 교반을 계속했다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축하고, 물을 잔여물에 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출했다. 조 생성물을 정제하여 히드로클로라이드 염으로 전환시켰다.
3-({6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}에톡시카보닐메틸-아미노)-프로피온산 에틸 에스테르 AD
Figure pct00023

3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 AC (4.7 g, 14.8 mmol)의 히드로클로라이드 염을 디클로로메탄에서 취했다. 서스펜션을 얼음 상에서 0℃로 냉각시켰다. 서스펜션에 디이소프로필에틸아민 (3.87 g, 5.2 ml, 30 mmol)을 첨가했다. 수득한 용액에 콜레스테릴 클로로포르메이트 (6.675　g, 14.8 mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 밤새 교반했다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 10% 염산으로 세정했다. 생성물을 플래시 크로마토그래피 (10.3 g, 92%)로 정제했다.
1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a] 펜안트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}-4-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에틸 에스테르 AE
Figure pct00024

칼륨 t-부톡시드 (1.1 g, 9.8 mmol)을 30 ml의 건조 톨루엔에서 슬러리화시켰다. 혼합물을 얼음 상에서 0℃로 냉각시키고, 5 g (6.6 mmol)의 디에스테르 AD를 20분 내로 교반하면서 서서히 첨가했다. 온도를, 첨가 동안에 5℃ 미만으로 유지했다. 교반을 30분 동안 0℃에서 교반하고, 1 ml의 빙초산을 첨가하고, 직후, 40 ml의 물 중 4 g의 NaH2PO4·H2O을 첨가했다. 수득한 혼합물을 100 ml의 디클로로메탄 각각으로 2회 추출하고, 조합된 유기 추출물을 10 ml의 포스페이트 버퍼 각각으로 2회 세정하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔여물을 60 ml의 톨루엔에서 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 차가운 pH 9.5 카보네이트 버퍼의 50 ml x 3 부분으로 추출했다. 수성 추출물을 인산으로 pH 3으로 조정하고, 클로로포름의 5 x 40 ml 부분으로 추출하고, 이를 조합시키고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔여물을, 25% 에틸아세테이트/헥산을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 1.9 g의 b-케토에스테르 (39%)를 얻었다.
[6-(3-히드록시-4-히드록시메틸-피롤리딘-1-일)-6-옥소-헥실]-카밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]펜안트렌-3-일 에스테르 AF
Figure pct00025

메탄올 (2 ml)을 테트라히드로푸란 (10 ml) 중 b-케토에스테르 AE (1.5 g, 2.2 mmol) 및 나트륨 보호히드라이드 (0.226 g, 6 mmol)의 환류 혼합물에 1시간에 걸쳐 적가했다. 교반을 환류 온도에서 1시간 동안 계속했다. 실온으로 냉각한 후, 1 N HCl (12.5 ml)을 첨가하고, 혼합물을 에틸아세테이트 (3 x 40 ml)로 추출했다. 조합된 에틸아세테이트 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축하여 생성물을 얻고, 이를 칼럼 크로마토그래피 (10% MeOH/CHCl3) (89%)로 정제했다.
(6-{3-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-4-히드록시-피롤리딘-1-일}-6-옥소-헥실)-카밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]펜안트렌-3-일 에스테르 AG
Figure pct00026

디올 AF (1.25 gm 1.994 mmol)을 피리딘 (2 x 5　ml)로 진공에서 증발시켜 건조시켰다. 무수 피리딘 (10 ml) 및 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (0.724 g, 2.13 mmol)을 교반하면서 첨가했다. 반응을 실온에서 밤새 수행했다. 반응을 메탄올의 첨가로 켄칭했다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축하고, 잔여물에 디클로로메탄 (50 ml)을 첨가했다. 유기 층을 1M 수성 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔여 피리딘을 톨루엔과 함께 증발시켜 제거했다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (2% MeOH/클로로포름, Rf = 0.5, 5% MeOH/CHCl3에서) (1.75 g, 95%)로 정제했다.
석신산 모노머-(4-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H 시클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}-피롤리딘-3-일) 에스테르 AH
Figure pct00027

화합물 AG (1.0 g, 1.05 mmol)을 석신산 무수물 (0.150 g, 1.5 mmol) 및 DMAP (0.073 g, 0.6 mmol)과 혼합하고, 진공에서 40℃에서 밤새 건조시켰다. 혼합물을 무수 디클로로에탄 (3 ml)에서 용해시키고, 트리에틸아민 (0.318 g, 0.440　ml, 3.15 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 아르곤 분위기 하에서 16시간 동안 교반했다. 그 다음, 이를 디클로로메탄 (40 ml)로 희석하고, 빙냉 수성 시트르산 (5 wt%, 30 ml) 및 물 (2 X 20 ml)로 세정했다. 유기 상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 잔여물을 다음 단계를 위해 있는 그대로 사용했다.
콜레스테롤 유도화된 CPG AI
Figure pct00028

석시네이트 AH (0.254 g, 0.242 mmol)을 디클로로메탄/아세토니트릴 (3:2, 3 ml)의 혼합물에서 용해시켰다. 아세토니트릴 (1.25 ml) 중 DMAP (0.0296 g, 0.242 mmol)의 용액에, 아세토니트릴/디클로로에탄 (3:1, 1.25 ml) 중 2,2'-디티오-비스(5-니트로피리딘) (0.075 g, 0.242 mmol) 을 연속해서 첨가했다. 수득한 용액에 아세토니트릴 (0.6 ml) 중 트리페닐포스핀 (0.064 g, 0.242 mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물은 그 색상이 밝은 오렌지색으로 변했다. 용액을 손목 동작 진탕기 (5분)로 간단히 진탕했다. 장쇄 알킬 아민-CPG (LCAA-CPG) (1.5 g, 61　mM)을 첨가했다. 서스펜션을 2시간 동안 진탕했다. CPG를 소결 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 에테르로 연속해서 세정했다. 미반응 아미노 그룹을, 아세트산 무수물/피리딘을 사용하여 마스킹(masking)했다. CPG의 달성된 부하를 UV 측정 (37 mM/g)으로 측정했다.
5'-12-도데칸산 비스데실아미드 그룹 (이하, "5'-C32-"로 칭함) 또는 5'-콜레스테릴 유도체 그룹 (이하, "5'-Chol-"로 칭함)을 갖는 siRNA의 합성을 WO 2004/065601에 기재된 바와 같이 수행하고, 단, 콜레스테릴 유도체에 대해, 산화 단계를, 뷰케이지(Beaucage) 시약을 사용하여 수행하여, 핵산 올리고머의 5'-말단에서 포스포로티오에이트 연경을 도입했다.
Chol-p-(GalNAc)3 (N-아세틸 갈락토스아민 -콜레스테롤) (도 16) 및 LCO(GalNAc)3 (N-아세틸 갈락토스아민 - 3'-리토콜릭-올레오일) (도 17)에 콘쥬게이트된 dsRNA의 합성은 미국 특허출원 번호 12/328,528 (2008년 12월 4일 출원)에 기재되어 있고, 이 특허는 참고로 본원에 통합되어 있다.
실시예 3. HuH7, HepG2, HeLa 및 일차 원숭이 간세포에서의 PCSK9 siRNA 스크리닝에 의해 고활성 서열을 찾아낸다
HuH-7세포를 JCRB 세포 은행(Japanese Collection of Research Bioresources)(일본 신주쿠, 카달로그 번호: JCRB0403)으로부터 입수하였다. 세포를 습식 배양기(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany) 내의 5% CO2를 갖는 분위기에서 37℃에서, 10% 우태아혈청(FCS)(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. S0115), 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. A2213) 및 2mM L-글루타민(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No K0282)이 첨가된 둘베코 MEM(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. F0435)에서 배양하였다. HepG2 및 HeLa 세포를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)(Rockville, MD, cat. No. HB-8065)로부터 입수하고, 습식 배양기(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany) 내의 5% CO2를 갖는 분위기에서 37℃에서 10% 우태아혈청(FCS)(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. S0115), 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. A2213), 1x 비필수 아미노산(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. K-0293), 및 1mM 피루브산 나트륨(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. L-0473)이 첨가된 MEM(Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Germany, cat. No. 21090-022)에서 배양하였다.
siRNA로 형질감염시키기 위해, HuH7, HepG2, 또는 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 접종하고 곧바로 형질감염시켰다. 제조사에 의해 기술된 바와 같이 리포펙타민 2000(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019)을 이용하여 siRNA의 형질감염(단일 용량 스크리닝의 경우 30nM)을 수행하였다.
형질감염 24시간 후, HuH7 및 HepG2 세포를 용해시키고 프로토콜에 따라 Quantigene Explore 키트(Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02)를 이용하여 PCSK9 mRNA 수치를 정량하였다. PCSK9 mRNA 수치를 GAP-DH mRNA에 대하여 정규화하였다. 각 siRNA에 대해 8개의 개별 데이터포인트가 수집되었다. PCSK9 유전자와 관련되지 않은 siRNA 이중체들을 대조군으로 사용하였다. 소정의 PCSK9 특이적 siRNA 이중체의 활성을 대조군 siRNA 이중체로 처리된 세포 내의 PCSK9 mRNA 농도 대비 처리된 세포 내의 PCSK9 mRNA 농도의 퍼센트로 나타내었다.
일차 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 간세포(냉동보존됨)를 In vitro Technologies, Inc.(Baltimore, Maryland, USA, cat No M00305)으로부터 입수하고 습식 배양기 내의 5% CO2를 갖는 분위기에서 37℃에서 InVitroGRO CP 배지(cat No Z99029)에서 배양하였다.
siRNA로 형질감염시키기 위해, 일차 사이노몰거스 원숭이 세포를 96-웰 플레이트에 3.5 x 104 세포/웰의 밀도로 콜라겐 코팅된 플레이트(Fisher Scientific, cat. No. 08-774-5) 상에 접종하고 곧바로 형질감염시켰다. siRNA의 형질감염은 제조사에 의해 기술된 바와 같이 리포펙타민 2000(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019)을 이용하여 2회 반복하여 수행하였다.
형질감염 16시간 후, 배지를 토르페도 항생제 믹스(Torpedo Antibiotic Mix; In vitro Technologies, Inc, cat. No Z99000)가 첨가된 새로운 InVitroGRO CP 배지로 교환하였다.
배지 교환 24시간 후, 일차 사이노몰거스 원숭이 세포를 용해하고 프로토콜에 따라 Quantigene Explore 키트(Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02)를 이용하여 PCSK9 mRNA 수치를 정량하였다. PCSK9 mRNA 수치를 GAPDH mRNA에 대하여 정규화하였다. 그리고 나서, 정규화된 PCSK9/GAPDH 비율을 리포펙타민 2000 단독 대조군의 PCSK9/GAPDH 비율과 비교하였다.
표 1b 및 2b(및 도 6a)는 상기 결과들을 요약한 것이며, 상이한 용량에서 상이한 세포주에서의 시험관내 스크리닝의 예를 제공한다. PCSK9 전사체의 사일런싱(silencing)은 소정의 용량에서의 잔류하는 전사체의 퍼센트로 나타내었다.
고활성인 서열들은 100 nM 이하의 용량에서 소정의 siRNA를 처리한 후 잔류하는 전사체가 70% 미만인 서열들이다. 매우 활성인 서열들은 100 nM 이하의 용량으로 처리한 후 잔류하는 전사체가 60% 미만인 서열들이다. 활성인 서열들은 고용량(100 nM)으로 처리한 후 잔류하는 전사체가 90% 미만인 서열들이다.
또한, 활성인 siRNA의 예들을 하기 기술된 바와 같이 리피도이드(지방성물질(lipidoid)) 제형 중에서 마우스 생체내에서 스크리닝하였다. 시험관내 활성 서열들은 일반적으로 생체내에서도 활성이었다(도 6a 및 6b 및 실시예 4 참조).
실시예 4. 마우스에서 PCSK9 siRNA의 생체내 효능 스크리닝
LNP-01 리포좀 내에 제형화된 32개의 PCSK9 siRNA들을 마우스 모델에서 생체내에서 시험하였다. LNP01은 콜레스테롤, mPEG2000-C14 글리세라이드, 및 dsRNA로부터 형성된 지방성물질(lipidoid) 제형이다. 상기 LNP01 제형은 dsRNA를 간으로 전달하는데 유용하다.
제형화 과정
지방성물질 LNP-01·HCl(MW 1487)(도 1), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 및 PEG-세라마이드 C16(Avanti Polar Lipids)을 사용하여 지질-siRNA 나노입자를 제조하였다. 에탄올 중의 각각의 스톡 용액을 제조하였다: LNP-01, 133 mg/ml; 콜레스테롤, 25 mg/ml, PEG-세라마이드 C16, 100 mg/ml. 그리고 나서, LNP-01, 콜레스테롤, 및 PEG-세라마이드 C16 스톡 용액을 42:48:10 몰비로 배합시켰다. 배합된 지질 용액을 수성 siRNA(아세트산 나트륨 pH 5 중에서)와 신속하게 혼합하여 최종 에탄올 농도가 35-45%가 되도록 하고 최종 아세트산 나트륨 농도가 100-300 mM이 되도록 하였다. 혼합시 지질-siRNA 나노입자가 자연발생적으로 형성되었다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 수득된 나노입자 혼합물을 일부 경우 써모배럴 압출기(thermobarrel extruder, Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc)를 이용하여 폴리카보네이트 막(100 nm 컷오프)을 통해 압출시켰다. 그 외 경우, 압출 단계를 생략하였다. 에탄올 제거 및 동시적 완충액 교환을 투석 또는 접선류 여과(tangential flow filtration)에 의해 달성하였다. 완충액을 인산 완충 식염수(PBS) pH 7.2로 교환하였다. 제형의 특성규명
표준 방법 또는 비압출 방법에 의해 제조된 제형들은 유사한 방식으로 특성규명한다. 제형들은 우선 육안 검사에 의해 특성규명한다. 제형들은 응집물 또는 침전물이 없는 옅은 흰색의 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자들의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, USA)를 이용한 동적 광 산란(dynamic light scattering)에 의해 측정한다. 입자들은 20-300 nm, 이상적으로는, 40-100 nm의 크기이어야 한다. 입자 크기 분포는 단봉형(unimodal)이어야 한다. 제형 중의 총 siRNA 농도 뿐만 아니라 포획된 분획을 색소 배제법(dye exclusion 분석)으로 추정된다. 제형화된 siRNA의 샘플을 제형 붕괴 계면활성제인 0.5% 트리톤-X100의 존재 또는 부재하에 RNA-결합 염료 리보그린(Ribogreen, Molecular Probes)과 함께 배양한다. 제형 중의 총 siRNA를 표준 곡선과 비교하여, 계면활성제를 함유하는 샘플로부터의 시그날로 측정한다. 포획된 분획을 총 siRNA 함량으로부터 "유리(free)" siRNA 함량(계면활성제의 부재하의 시그날로 측정됨)을 감산하여 측정한다. 포획된 siRNA의 퍼센트는 통상적으로 >85%이다.
볼루스 투여
C57/BL6 마우스(5/그룹, 8-10 주령, 찰스 리버 연구소, MA)로의 제형화된 siRNA의 볼루스 투여를 27G 바늘을 이용하여 꼬리 정맥 주사에 의해 수행하였다. SiRNA를 10 μl/g 체중 중에 5mg/kg 용량이 전달될 수 있도록 0.5 mg/ml 농도로 LNP-01 중에 제형화되었다(이후, PBS로 투석됨). 주사를 용이하게 하기 위해 투여에 앞서 약 3분 동안 마우스를 적외선 램프 하에 두었다.
투여 48시간 후, 마우스를 CO2 질식에 의해 희생시켰다. 0.2 ml 혈액을 안와후(retro-orbital) 출혈에 의해 수집하고 간을 회수하여 액체 질소에 동결시켰다. 혈청 및 간을 -80℃에서 보관하였다.
동결된 간을 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder(SPEX CentriPrep, Inc)를 이용하여 분쇄하고 분말을 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다.
프로토콜에 따라 QuantiGene 시약 시스템(Genospectra)으로부터 분지-DNA(branched-DNA) 기술 기반의 키트를 이용하여 PCSK9 mRNA 수치를 검출하였다. 10-20mg의 동결된 간 분말을 65℃에서 3시간 동안 조직 및 세포 용해액(Epicentre, #MTC096H) 중의 600 μl의 0.16 μg/ml 프로티나아제 K((Epicentre, #MPRK092) 중에 용해시켰다. 그리고 나서, 상기 용해물 10 μl를 용해 작업 시약(Lysis Working Reagent)(2부피의 물 중의 1부피의 스톡 용해 혼합물)에 첨가하고, 마우스 PCSK9 및 마우스 GAPDH 또는 사이클로필린(cyclophilin) B에 특이적인 프로브 세트를 갖는 제노스펙트라 포획 플레이트 상에서 하룻밤 동안 52℃에서 배양하였다.
QuantiGene ProbeDesigner 소프트웨어 2.0(Genospectra, Fremont, CA, USA, cat. No. QG-002-02)의 도움으로 PCSK9, GAPDH 및 사이클로필린 B의 핵산 서열들로부터 캡쳐 익스텐더(Capture Extender, CE), 라벨 익스텐더(Label Extender, LE) 및 블로킹(BL) 프로브용 핵산 서열들을 선발하였다. 화학발광을 Victor2-Light (Perkin Elmer) 상에서 상대 발광 단위(Relative light unit)로서 판독하였다. 간 용해물 중의 GAPDH 또는 사이클로필린 B mRNA에 대한 PCSK9 mRNA의 비율을 각 처리군에 대하여 평균치를 구하고 PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액응고인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
마우스 혈청 내 총 혈청 콜레스테롤을 제조사의 지시에 따라 StanBio Cholesterol LiquiColor 키트(StanBio Laboratoory, Boerne, Texas, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정은 495 nm에서 Victor2 1420 멀티라벨 계수기(Perkin Elmer) 상에서 수행하였다.
결과
적어도 10개의 PCSK9 siRNA들이 PBS로 처리된 대조군에 비해 40% 이상의 PCSK9 mRNA 넉다운(knock down)을 나타낸 반면, 비관련 siRNA(혈액응고인자 VII)로 처리된 대조군은 효과가 없었다(도 2-3). PCSK9 전사체의 사일런싱은 또한 이들 동물에서의 총 혈청 콜레스테롤의 저하와 상관관계가 있었다(도 4-5). PCSK9 mRNA를 넉다운시키는 것과 관련하여 가장 효과적인 siRNA들은 또한 가장 두드러진 콜레스테롤 저하 효과를 나타내었다(도 2-3 및 도 4-5 비교). 또한, 시험관내에서 활성인 분자들과 생체내에서 활성인 분자들 간에는 강한 상관관계가 존재하였다 (도 6a 및 6b 비교).
상이한 화학적 변형을 함유하는 서열들을 시험관내(표 1 및 2) 및 생체내에서 또한 선별하였다. 예시로서, 변형이 덜 된 서열 AD-9314 및 AD-9318, 및 더 변형된 형태의 서열 AD-9314(AD-10792, AD-10793, 및 AD-10796); AD-9318-( AD-10794, AD-10795, AD-10797)을 시험관내(일차 원숭이 간세포에서) 또는 생체내(LNP-01 중에 제형화된 AD-9314 및 AD-10792)에서 시험하였다. 도　7(또한 표 1 및 2 참조)은 모 분자(parent molecule) AD-9314 및 AD-9318 및 상기 변형된 형태들이 모두 시험관내에서 활성이었음을 보여준다. 예시로서, 도　8은 모 AD-9314 및 보다 많이 변형된 AD-10792 서열 모두가 마우스에서 내인성 PCSK9의 50-60% 사일런싱을 나타내어 생체내에서 활성이었음을 보여준다. 도 9는 다른 화학적으로 변형된 형태의 AD-9314 및 AD-10792의 활성을 추가로 예시한다.
AD-10792의 유도체인 AD-3511은 10792만큼 효과적이었다(~0.07-0.2 nM의 IC50)(데이터 미제시). AD-3511의 센스 및 안티센스 가닥의 서열들은 하기와 같다:
센스 가닥: 5'- GccuGGAGuuuAuucGGAAdTsdT　 서열번호:1521
안티센스 가닥: 5'- puUCCGAAuAAACUCcAGGCdTsdT　 서열번호:1522
실시예 5. 랫트 및 NHP에서의 PCSK9 작용 지속시간 실험.
랫트
랫트에 꼬리 정맥 주사를 통해 5mg/kg의 LNP01-10792(제형화된 ALDP-10792)를 처리하였다. 표시된 시점(표 3 참조)에서 채혈하고, PBS 처리된 동물 대비 총 콜레스테롤 양을 표준 방식에 의해 측정하였다. 총 콜레스테롤 수준은 2일째에 ~60% 감소하였고 28일에 기준선(baseline)으로 되돌아갔다. 이들 데이터는 PCSK9 siRNA의 제형화된 형태가 연장된 기간 동안 콜레스테롤 수준을 낮춘다는 것을 보여준다.
원숭이
사이노몰거스 원숭이에 LNP01 제형화된 dsRNA를 처리하고 LDL-C 수치를 평가하였다. 총 19마리의 사이노몰거스 원숭이를 투여 그룹으로 할당하였다. -11일에 시작하여, 동물들을 하기 스케줄에 따라 하루에 2회로 제한급여하였다: 오전 9시에 급여, 오전 10시에 급여 제거, 오후 4시에 급여, 오후 5시에 급여 제거. 투여 첫째날에, 모든 동물들에게 30분 정맥내 주입을 통해 1회 투여하였다. 동물들의 임상학적 증상, 체중, 및 직접적인 LDL 및 HDL 콜레스테롤을 포함하는 임상 병리 지수의 변화를 평가하였다.
대퇴 정맥을 통한 정맥천자(venipuncture)를 사용하여 혈액 샘플을 수집하였다. 그룹 1-7의 경우 -3, -1, 3, 4, 5, 및 7일에; 그룹 1, 4, 및 6의 경우 14일에; 그룹 1의 경우 18 및 21일에; 그리고 그룹 4 및 6의 경우 21일에, 오전 급여 이전(즉, 오전 9시 이전) 및 오전 급여 후 약 4 시간에(오후 1시에 시작) 샘플들을 수집하였다. 각 시점에 적어도 1.0 ml의 샘플들을 수집하였다.
상기 1.0 ml의 혈청 샘플들에는 항응고제를 첨가하지 않았고, 각 1.0 ml의 혈장 샘플들에는 건조된 항응고성 에틸렌디아민테트라아세트산(K2)을 첨가하였다. 혈청 샘플들을 상온에서 적어도 20분간 방치하여 응고를 촉진시킨 다음, 상기 샘플을 얼음 위에 두었다. 혈장 샘플들을 샘플 수집 후 가능한 한 빨리 얼음 위에 두었다. 추가 처리를 위해 샘플들을 30분 이내에 임상병리 연구실로 옮겼다.
시험 설비 표준 운영 과정에 따라, 냉동된 원심분리기를 이용하여 가능한 한 빨리 혈액 샘플을 혈청 또는 혈장으로 가공하였다. 각각의 샘플을 3개의 거의 동일한 부피로 나누고, 액체 질소에서 급속 냉각한 다음, -70℃에 두었다. 각 분취물은 약 50 μL의 최소량을 가져야 한다. 만약 수집된 총 샘플 부피가 150　μL 미만인 경우, 잔량의 샘플 부피를 마지막 튜브 내로 넣었다. 각 샘플을 동물 수, 투여 그룹, 수집일, 날짜, 명목상의 수집 시간, 및 연구 수로 라벨링하였다. 제조사의 지침에 따라 베컴 분석기(Beckman analyzer) 상에서 표준 과정으로 곧바로 혈청 LDL 콜레스테롤을 측정하였다.
상기 결과가 표 4에 나타나 있다. 5 mg/kg으로 투여된 LNP01-10792 및 LNP01-9680은 투여 후 3 내지 7일 이내에 혈청 LDL 콜레스테롤을 감소시켰다. 혈청 LDL 콜레스테롤은 LNP01-10792를 받은 대부분의 동물에서 14일째에 그리고 LNP01-9680을 받은 동물에서는 21일째에 기준선 수치로 되돌아갔다. 이 데이터는 LNP01 제형화된 ALDP-9680의 콜레스테롤 저하를 위한 작용 지속시간이 21일보다 크다는 것을 입증한다.
실시예 6. PCSK9 siRNA는 간 추출물에서 PCSK mRNA 감소를 야기하며, 마우스 및 랫트에서 혈청 콜레스테롤 수준을 낮춘다.
PCSK9 siRNA에 의한 PCSK9 전사체의 급성 사일런싱(및 이후의 PCSK9 단백질 하향 조절)이 급격하게 총 콜레스테롤 수준을 낮추는지 시험하기 위해, siRNA 분자 AD-1a2(AD-10792)를 지방성물질 제형 내에 제형화하였다. 이들 dsRNA의 서열 및 변형이 표 5a에 나타나 있다. 리포좀으로 제형화된 siRNA 이중체 AD-1a2(LNP01-1a2)를 C57/BL6 마우스 또는 스프라구에 다울리 랫트 내로 상이한 용량으로 저용량(마우스의 경우 ~0.2 ml 및 랫트의 경우 ~1.0 ml)으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.
마우스에서, 주사 48시간 후 간을 회수하여 PCSK9 전사체의 수치를 결정하였다. 간 이외에, 혈액을 회수하여 총 콜레스테롤 분석을 수행하였다. LNP01-1a2는 대조군 siRNA 표적화 루시퍼라아제(LNP01-ctrl) 또는 PBS 처리된 동물에 비해 최대 PCSK9 메시지 억제((~60-70%)를 갖는 확실한 용량 반응을 나타내었다(도 14a). 가장 높은 용량에서의 PCSK9 전사체의 감소는 마우스에서의 총 콜레스테롤의 ~30% 저하로 바뀌었다(도 14b). 이러한 콜레스테롤 수준 감소는 이형콘쥬게이션 및 동형콘쥬게이션 PCSK9 넉아웃 마우스에 대해 보고된 것의 중간이다(Rashid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5374-9, 2005, epub April 1, 2005). 따라서, RNAi 기전을 통한 PCSK9 전사체의 저하는 마우스에서 총 콜레스테롤을 급격하게 낮출 수 있다. 더욱이, PCSK9 전사체에 대한 상기 효과는 20-30일 사이에 지속되었고, 더 높은 용량은 더 큰 초기 전사체 수치 감소를 나타낸 후 더 지속적인 효과를 나타내었다.
고용량의 HMG-CoA 환원효소 억제제에서도 콜레스테롤 수준이 변화지않는 상태로 유지되기 때문에, 랫트에서의 총 콜레스테롤의 하향 조절은 역사적으로 어려웠다. 흥미롭게도, 마우스에 비해, 랫트는 bDNA 분석에 의해 측정된 바와 같이 훨씬 높은 수치의 PCSK9 기준 전사체 수치를 갖는 것으로 보인다. 랫트에 꼬리 정맥을 통해 1, 2.5 및 5 mg/kg으로 LNP01-a2의 단독 주사를 투여하였다. 주사 72시간 후, 간 조직 및 혈액을 회수하였다. LNP01-1a2는, 대조군 루시퍼라아제 siRNA 및 PBS와 비교하여, 가장 높은 용량에서 PCSK9 전사체의 최대 50-60% 사일런싱을 갖는 확실한 용량 반응을 나타내었다(도 10a). 상기 mRNA 사일런싱은 10일간 지속되고(도 10a 및 10b), ~3주째에 투여 전 수치로 되돌아간(도 10b) 혈청 총 콜레스테롤의 급격한 ~50-60% 감소와 연관되어 있었다. 이 결과는 siRNA 표적화를 통한 PCSK9의 저하가 랫트 모델 시스템에서 총 콜레스테롤에 대한 급격하고, 강력하고, 지속적인 효과를 미친다는 것을 입증하였다. 상기 관찰된 전사체 감소가 siRNA 기전으로 인한 것임을 확인하기 위해, 처리된 동물 또는 대조군 동물로부터 얻은 간 추출물을 대상으로, 예측된 siRNA 절단 사건이 일어남을 입증하기 위해 종래에 사용된 방법인 5' RACE를 수행하였다(Zimmermann et al., Nature. 441:111-4, 2006, Epub 2006 Mar 26). PCR 증폭 및 예측된 부위 특이적 mRNA 절단 사건의 검출이 LNP01-1a2로 처리된 동물에서 관찰되었으나, PBS 또는 LNP01-ctrl 대조군 동물에서는 관찰되지 않았다(Frank-Kamanetsky et al. (2008) PNAS 105:119715-11920). 이 결과는 관찰된 LNP01-1a2의 효과가 siRNA 특이적 기전을 통한 PCSK9 전사체의 절단으로 인한 것임을 입증하였다.
PCSK9가 콜레스테롤 수준에 영향을 미치는 기전이 세포 표면상의 LDLR의 수와 연관되어 왔다. 랫트(마우스, NHP, 및 인간과는 대조적으로)는 콜레스테롤 합성의 엄격한 조절을 통해 그리고 어느 정도 LDLR 수치의 제어를 통해 콜레스테롤 수준을 제어한다. PCSK9의 RNAi 치료적 표적시 LDLR의 조절이 일어났는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 5mg/kg LNP01-1a2로 처리된 랫트에서 간 LDLR 수치를 정량화하였다(웨스턴 블롯팅을 통해). 도 11에 나타낸 바와 같이, LNP01-1a2로 처리된 동물들은 PBS 또는 LNP01-ctrl 대조군 siRNA 처리된 동물들과 비교하여 LNP01-1a2의 단독 투여 48 시간 후 LDLR 수치의 현저한 유도(평균 ~3-5배)를 나타내었다.
또한, PCSK9의 감소가 간 자체에서의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준을 변화시키는지 여부를 시험하기 위하여 분석을 수행하였다. 유전자 결실, 화합물, 또는 siRNA 억제제에 의한 마이크로좀 트리글리세라이드 운반 단백질(MTP) 또는 ApoB와 같은 VLDL 조립 및 분비에 관련된 유전자의 급격한 저하는 간 트리글리세라이드의 증가를 야기한다(예컨대, Akdim et al., Curr. Opin. Lipidol. 18:397-400, 2007 참조). 간에서 PCSK9 사일런싱에 의해 유도된 혈장 콜레스테롤의 제거율(clearance) 증가(및 이후의 간 LDLR 수치의 증가)는 간 트리글리세라이드의 축적을 야기하는 것으로 예측되지 않았다. 하지만, 이 가능성을 다루기 위해, 상기 처리된 동물 또는 대조군 동물의 간에서의 간 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 농도를 정량화하였다. 도 10c에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 PCSK9 siRNA가 투여된 랫트의 간 TG 수치 또는 콜레스테롤 수준에 통계적 유의성은 없었다. 이러한 결과들은 PCSK9 사일런싱 및 이후의 콜레스테롤 저하가 과다한 간 지질 축적을 야기할 것 같지 않음을 보여주었다.
실시예 7. siRNA에 대한 부가 변형이 사일런싱 및 랫트에서의 콜레스테롤 감소의 지속시간에 영향을 미치지 않는다.
dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥 모두의 3' 말단에서의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형은 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 대하여 보호할 수 있다. dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥 모두에서의 2'OMe 및 2'F 변형은 엑소뉴클레아제에 대하여 보호할 수 있다. AD-1a2(표 5b 참조)는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 2'OMe 변형을 함유한다. 화학적 변형의 고유 안정성(인간 혈청에서의 siRNA 안정성에 의해 측정됨) 또는 화학적 변형의 정도 또는 유형(2'OMe 대 2'F 또는 혼합물)이 관찰된 랫트 효능 또는 사일런싱 효과의 지속시간 중 어느 하나와 관련되어 있는지 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 동일한 AD-1a2 코어 서열을 갖지만 상이한 화학적 변형을 함유하는 siRNA들을 만들고 일차 사이아노 원숭이 간세포에서 시험관내 활성을 시험하였다. 그리고 나서, PCSK9 사일런싱에 대한 시험관내 IC50 값(표 5b)에 의해 측정된 바와 같은 유사한 활성을 유지했던 일련의 이들 분자들의 인간 혈청에서의 엑소 및 엔도뉴클레아제에 대한 안정성을 시험하였다. 각각의 이중체들을 37℃에서 인간 혈청 내에서 배양하고(시간대별 연구), HPLC 분석을 수행하였다. 모 서열 AD-1a2는 인간 혼주(pooled) 혈청에서 ~7 시간의 T1/2를 가지고 있었다. 더 심하게 변형된(표 5 내의 화학적 변형 참조) 서열 AD-1a3, AD-1a5, 및 AD-1a4는 모두 24시간을 초과하는 T1/2를 가지고 있었다. 화학적 변형 또는 안정성 차이가 효능 변화를 야기하였는지 여부를 시험하기 위해, AD-1a2, AD-1a3, AD-1a5, AD-1a4, 및 AD-대조군 서열들을 제형화하고 랫트 내로 주사하였다. 투여 후, 다양한 일자에 동물로부터 혈액을 수집하여 총 콜레스테롤 농도를 측정하였다. 종래 실험들은 LNP01-1a2로 처리된 랫트에서 PCSK9 전사체 수치의 저하와 총 콜레스테롤 값 사이에 매우 긴밀한 상관관계를 보여왔다(도 10a). 4개의 모든 분자들은 투여후 2일째에 총 콜레스테롤을 ~60%까지 감소시키는 것으로 관찰되었고(PBS 또는 대조 siRNA에 비해), 상기 분자들 모두는 비슷한 크기 및 지속시간 양상을 나타내어 총 콜레스테롤 수준에 대해 동일한 효과를 가지고 있었다. 인간 혈청에서의 이들의 상이한 화학 또는 안정성에 상관없이, 이들 분자에 의해 입증된 콜레스테롤 저하 크기 및 효과의 지속시간에 통계적 유의성은 없었다.
실시예 8. LNP01-1a2 및 LNP01-3a1은 형질전환 마우스에서 인간 PCSK9 및 순환하는 인간 PCSK9 단백질을 사일런싱시킨다
인간 PCSK9 유전자를 사일런싱시키는, LNP01-1a2(즉, PCS-A2 또는 AD-10792) 및 또다른 분자, AD-3a1(즉, PCS-C2 또는 AD-9736)(인간 및 원숭이 PCSK9 메시지만을 표적화함)을 생체내에서 시험하였다. ApoE 프로모터 하에서 인간 PCSK9를 발현하는 형질전환 마우스 계통주를 사용하였다(Lagace et al., J Clin Invest. 116:2995-3005, 2006). 인간 전사체 및 단백질을 검출하지만 각각 마우스 전사체 및 단백질을 검출하지 않도록 특이적 PCR 시약들과 항체들을 설계하였다. 인간화 마우스의 코호트(cohort)에 LNP01-1a2(LNP-PCS-A2로도 알려짐) 또는 LNP01-3a1(LNP-PCS-C2로도 알려짐)을 단독 용량으로 주사하고, 48시간 후 간과 혈액 모두를 수집하였다. 단독 용량의 LNP01-1a2 또는 LNP01-3a1은 인간 PCSK9 전사체 수치를 >70%까지 감소시킬 수 있었고(도 15a), 이 전사체 하향조절은 ELISA에 의해 측정된 것처럼 순환하는 인간 PCSK9 단백질의 수치를 현저히 낮추었다(도 15b). 이러한 결과들은 두 가지 siRNA가 상기 인간 전사체를 사일런싱시킨 다음 순환하는 혈장 인간 PCSK9 단백질의 양을 감소시킬 수 있음을 입증하였다.
실시예 9. 분비된 PCSK9 수치가 NHP에서 식이에 의해 조절된다
마우스에서, PCSK9 mRNA 수치는 전사 인자 스테롤 조절 요소 결합 단백질-2에 의해 조절되며 단식에 의해 감소된다. 임상학적 실행 및 표준 NHP 연구에서, 혈액 수집 및 콜레스테롤 수준은 하룻밤 단식 기간 후 측정된다. 이는 순환하는 TG의 변화가 LDLc 값의 계산을 방해할 가능성이 일부 존재하기 때문이다. 마우스에서 단식 및 급여 행동에 의한 PCSK9 수치의 조절을 고려해볼 때, NHP에서의 단식 및 급여의 효과를 이해하기 위해 실험을 수행하였다.
사이노 원숭이를 하루에 2회의 급여 스케줄에 적응시키고 상기 스케줄 동안 음식은 1시간 후 제거하였다. 오전 9-10시에 동물에게 급여한 후, 음식을 제거하였다. 그 다음, 오후 5시-6시 사이에 1시간 동안 동물에게 한번 더 급여한 다음 음식을 제거하였다. 하룻밤 단식(오후 6시부터 다음날 오전 9시까지) 후 그리고 오전 9시 급식 후 2시간 및 4시간에 채혈하였다. 혈액 혈장 또는 혈청 내 PCSK9 수치를 ELISA 분석(방법 참조)에 의해 결정하였다. 흥미롭게도, 순환하는 PCSK9 수치는 하룻밤 단식 후 더 높은 것으로 확인되었고 급여 2시간 및 4시간 후에 감소하는 것으로 확인되었다. 이 데이터는 음식 섭취에 의해 PCSK9 수치가 크게 조절된 설치류 모델과 일치하였다. 하지만, 예상외로, PCSK9 수치는 급여 후 처음 몇 시간 동안 감소하였다. 이 결과는 보다 주의깊게 설계된 NHP 실험이 제형화된 AD-1a2 및 일차 사이노 간세포에서 매우 활성이었던 또 다른 PCSK9 siRNA(AD-2a1)의 효능을 조사할 수 있게 하였다.
실시예 10. PCSK9 siRNA는 비-인간 영장류(NHP)에서 순환하는 LDLc, ApoB, 및 PCSK9를 감소시키지만 HDLc는 감소시키지 않는다.
PCSK9를 표적화하는 siRNA는 투여 후 72시간까지 PCSK9 및 총 콜레스테롤 수준 모두를 급격하게 저하시켰으며 마우스 및 랫트에서 단독 투여 후 ~21-30일간 지속되었다. 이러한 발견을 인간과 가장 유사한 지질단백질 프로파일을 갖는 종까지 확대하기 위해, 사이노몰거스(사이노) 원숭이 모델에서 추가 실험을 수행하였다.
PCSK9를 표적화하는 siRNA 1(LNP01-10792) 및 siRNA 2(LNP-01-9680)를 사이노몰거스 원숭이에게 투여하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 두 가지 siRNA는 투여 후 최대 7일간 현저한 지질 저하를 야기하였다. siRNA　2는 투여 후 적어도 7일간 ~50% 지질 저하를 야기하였고, 투여 후 14일에는 ~60% 지질 저하를 나타내었으며, siRNA　1은 적어도 7일간 ~60% LDLc 저하를 야기하였다.
40mg/dl 이상의 LDLc를 갖는 수컷 사이노를 일차 선별하였다. 그리고 나서, 선택된 동물들을 단식/급여 식이 요법에 두어 11일간 적응시켰다. 투여 전 -3일 및 -1일에, 단식 및 급여 후 4시간 시점 모두에 혈청을 얻어 총 콜레스테롤(Tc), LDL(LDLc), HDL 콜레스테롤(HDLc) 뿐만 아니라 트리글리세라이드(TG), 및 PCSK9 혈장 수치를 분석하였다. 이들의 -3일 LDLc 수치에 기초하여 동물들을 무작위로 추출하였다. 투여일(1일로 명명됨)에, 대조군으로서 PBS 및 1 mg/kg의 LNP01-ctrl과 함께, 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 LNP01-1a2 및 5 mg/kg의 LNP01-2a1을 주사하였다. 모든 용량들이 잘 용인되었고 생활 내 결과들은 없었다. 실험이 진행됨에 따라, 더 낮은 용량이 효과적이지 않음이 분명해졌다(LDLc 저하에 기초). 그리하여, 본 발명자들은 14일에 PBS 그룹 동물들에게 5mg/kg LNP01-ctrl 대조군 siRNA를 투여하였고, 이는 이후에 5 mg/kg LNP01-1a2 및 5 mg/kg LNP01-2a1의 고용량 그룹에 대한 부가적인 대조군으로서 쓰일 수 있었다. 초기에, 투여 후 3, 4, 5, 및 7일에 동물로부터 혈액을 얻어, Tc, HDLc, LDLc, 및 TGs 농도를 측정하였다. LNP01-1a2, LNP01-2a1 고용량 그룹으로부터의 부가적인 혈액 수집을 투여 후 14일 및 21일에 수행하였다(LDLc 수치가 7일까지 기저선으로 되돌아가지 않았기 때문임).
도 12a에 나타낸 바와 같이, LNP01-1a2 또는 LNP01-2a1의 단독 용량은 투여 후 3일에 시작되는 통계학적으로 유의한 LDLc의 감소를 야기하였고, 이는 ~14일(LNP01-1a2의 경우) 및 ~21일(LNP01-2a1)이 지나 기준선으로 되돌아갔다. 이 효과는 PBS, 대조군 siRNA 그룹, 또는 1 mg/kg 처리 그룹 중 어디에서도 관찰되지 않았다. LNP01-2a1은 투여 72시간 후 56%의 LDLc의 평균 저하를 야기하였고, 4마리의 동물 중 1마리는 거의 70% LDLc를 달성하였고, 다른 모든 동물들은 투여 전 수치와 비교하여 >50% LDLc 감소를 달성하였다(도 12a 참조). 예측된 바와 같이, 상기 처리된 동물에서의 LDLc의 저하는 혈청 ELISA에 의해 측정된 순환하는 ApoB 수치의 감소와도 상관관계가 있었다(도 12b). 흥미롭게도, 사이노 원숭이에서 관찰된 LDLc 저하 정도는 고용량 스타틴 뿐만 아니라 고콜레스테롤혈증에 사용되는 기타 현 표준 보호 화합물에 대해 보고된 것보다 더 컸다. 작용 개시시간은 또한 투여 후 48시간 정도로 효과가 일찍 관찰되는 스타틴보다 훨씬 더 급격하다.
LNP01-1a2 또는 LNP01-2a1 처리는 HDLc의 저하를 야기하지 않았다. 사실상, 두 가지 분자들은 (평균적으로) Tc/HDL 비율이 감소하는 경향을 야기하였다(도 12c). 또한, 순환하는 트리글리세라이드 수치, 및 한 마리 동물은 제외하고, ALT 및 AST 수치는 유의하게 영향을 받지 않았다.
또한 처리된 동물 및 대조군 동물에서 PCSK9 단백질 수치를 측정하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, LNP01-1a2 및 LNP01-2a1 처리는 각각 투여 전에 비해 순환하는 PCSK9 단백질 수치가 감소되는 경향을 야기하였다. 특이적으로, 보다 활성인 siRNA LNP01-2a1은 PBS(3-21일) 및 LNP01-ctrl siRNA 대조군(4일, 7일) 모두에 비해 순환하는 PCSK9 단백질의 유의한 감소를 나타내었다.
실시예 11. 변형된 siRNA 및 hPBMC에서의 면역 반응의 활성화
siRNA를 대상으로 일차 인간 혈액 수집 단핵구(hPBMC)에서의 면역 체계의 활성화를 시험하였다. 두 가지 대조군 유도 서열들 및 변형되지 않은 모 화합물 AD-1a1은 IFN-알파 및 TNF-알파 모두를 유도하는 것으로 확인되었다. 하지만, 이러한 서열의 화학적으로 변형된 형태들(AD-1a2, AD-1a3, AD-1a5, 및 AD-1a4) 뿐만 아니라 AD-2a1은 이러한 동일한 분석에서 IFN-알파 및 TNF-알파 모두에 대해 음성이었다(표 5, 및 도s. 13A 및 13B 참조). 따라서, 화학적 변형은 siRNA 분자에 대한 IFN-알파 및 TNF-알파 반응 모두를 약화시킬 수 있다. 또한, AD-1a2, 또는 AD-2a1은 리포좀 내로 제형화되어 마우스에 시험하는 경우 IFN-알파를 활성화시키지 않았다.
실시예 12. 마우스에서의 siRNA 결합체의 평가
AD-10792를 GalNAc)3/콜레스테롤(도 16) 또는 GalNAc)3/LCO(도 17)에 결합시켰다. 3' 말단 상에서 상기 결합체를 이용하여 센스 가닥을 합성하였다. 상기 결합된 siRNA를 대상으로 하기 기술된 방법을 이용하여 마우스에서의 PCSK9 전사체 수치 및 총 혈청 콜레스테롤에 대한 효과를 분석하였다.
간략하게, 약 100, 50, 25 또는 12.5 mg/kg의 복용량으로 연속된 3일: 0일, 1일 및 2일에 상기 2개의 결합된 siRNA 중 하나 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 투여하였다. 각 투여 그룹은 6마리의 마우스를 포함하였다. 마지막 투여 24시간 후 마우스를 희생시키고 혈액과 간 샘플들을 얻어, 보관하고, 가공하여 PCSK9 mRNA 수치 및 총 혈청 콜레스테롤을 결정하였다.
상기 결과가 도 18에 나타나 있다. 대조군 PBS와 비교하여, 두 가지 siRNA 결합체들은 GalNAc)3/콜레스테롤 결합된 AD-10792의 경우 3 X 50 mg/kg 및 GalNAc)3/LCO 결합된 AD-10792의 경우 3 X 100 mg/kg의 ED50을 갖는 활성을 나타내었다. 상기 결과들은 GalNAc를 갖는 콜레스테롤이 결합된 siRNA가 활성이며 간에서 PCSK9를 사일런싱시켜 콜레스테롤 저하를 야기할 수 있음을 보여준다.
볼루스(bolus) 투여
C57/BL6 마우스(6/그룹, 8-10주령, 찰스 리버 연구소, MA)에서의 제형화된 siRNA의 볼루스 투여를 27G 바늘을 이용한 꼬리 정맥 주사에 의해 수행하였다. SiRNA를 LNP-01 중에서 제형화하고(그 다음 PBS에 대해 투석함), PBS로 1.0, 0.5, 0.25 및 0.125 mg/ml의 농도로 희석하여 10 μl/g 체중으로 100; 50; 25 및 12.5 mg/kg 용량의 전달을 가능하게 하였다. 주사를 용이하게 하기 위해 투여에 앞서 약 3분 동안 마우스를 적외선 램프 하에 두었다.
마지막 투여 24시간 후에 마우스를 CO2-질식에 의해 희생시켰다. 안와후(retro-orbital) 출혈에 의해 0.2 ml의 혈액을 수집하고, 간을 회수하여 액체 질소에 냉동시켰다. 혈청 및 간을 -80℃에서 보관하였다. 냉동된 간을 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder(SPEX CentriPrep, Inc)를 이용하여 분쇄하고 분말을 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다.
QuantiGene 시약 시스템(Panomics, USA)으로부터 분지-DNA 기술 기반 키트를 이용하여 프로토콜에 따라 PCSK9 mRNA 수치를 검출하였다. 10-20mg의 냉동된 간 분말을 조직 및 세포 용해액(Epicentre, #MTC096H) 중의 600 μl의 0.16 μg/ml 프로티나아제 K((Epicentre, #MPRK092)에서 65℃에서 3시간 동안 용해시켰다. 그리고 나서, 상기 용해물 10 μl를 용해 작업 시약(Lysis Working Reagent)(2부피의 물 중에 1부피의 스톡 용해 혼합물)에 첨가하고, 마우스 PCSK9 및 마우스 GAPDH에 특이적인 프로브 세트를 갖는 제노스펙트라 캡쳐 플레이트 상에서 하룻밤 동안 52℃에서 배양하였다. 마우스 PCSK9 및 마우스 GAPDH에 대한 프로브 세트는 파노믹스사(Panomics, USA.)로부터 구입하였다. Victor2-Light(Perkin Elmer) 상에서 상대 발광 단위(Relative light unit)로서 화학발광을 판독하였다. 간 용해물에서 GAPDH mRNA에 대한 PCSK9 mRNA의 비율을 각 처리군에 대하여 평균을 내어 PBS로 처리된 대조군 또는 관련성이 없는 siRNA(혈액응고인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
마우스 혈청 내 총 혈청 콜레스테롤을 제조사의 지침에 따라 총 콜레스테롤 분석(Wako, USA)을 이용하여 측정하였다. 측정은 Victor2 1420 멀티라벨 계수기(Perkin Elmer) 상에서 600 nm에서 수행하였다.
실시예 13. 랫트에서의 지질 제형화된 siRNA의 평가
간략하게, 랫트에게 꼬리 정맥을 통하여 0.3, 1.0, 및 3.0 mg/kg의 SNALP 제형화된 AD-10792의 단독 복용량으로 SNALP 제형화된 siRNA 또는 PBS를 투여하였다. 각각의 투여 그룹은 5마리의 랫트를 포함하였다. 투여 72시간 후, 랫트를 희생시키고 혈액 및 간 샘플을 얻고, 보관하고, 가공하여 PCSK9 mRNA 및 총 혈청 콜레스테롤 수준을 결정하였다. 상기 결과가 도 19에 나타나 있다. 대조군 PBS와 비교하여, SNALP 제형화된 AD-10792(도 19A)는 PCSK9 전사체 수치 및 총 혈청 콜레스테롤 수준의 저하에 대해 약 1.0 mg/kg의 ED50을 나타내었다. 이러한 결과들은 SNALP 제형화된 siRNA의 투여가 효과적이고 효율적으로 PCSK9을 사일런싱시키고 이후 생체내 총 콜레스테롤을 저하시킨다는 것을 보여준다.
볼루스 투여
27G 바늘을 이용하여 꼬리 정맥 주사에 의해 스프라구에-다울레이 랫트(5/그룹, 170-190g 체중, 찰스 리버 연구소, MA)에 제형화된 siRNA의 볼루스 투여를 수행하였다. SiRNA를 LNP-01 중에서 제형화하고(그 다음 PBS에 대해 투석함), PBS로 1.0, 0.5, 0.25 및 0.125 mg/ml의 농도로 희석하여 5 μl/g 체중으로 0.3; 1.0 및 3.0 mg/kg의 SNALP 제형화된 AD-10792의 전달을 가능하게 하였다. 주사를 용이하게 하기 위해 투여에 앞서 약 3분 동안 랫트를 적외선 램프 하에 두었다.
마지막 투여 72시간 후에 랫트를 CO2-질식에 의해 희생시켰다. 안와후(retro-orbital) 출혈에 의해 0.2 ml의 혈액을 수집하고, 간을 회수하여 액체 질소에 냉동시켰다. 혈청 및 간을 -80℃에서 보관하였다. 냉동된 간을 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder(SPEX CentriPrep, Inc)를 이용하여 분쇄하고 분말을 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다.
QuantiGene 시약 시스템(Panomics, USA)으로부터 분지-DNA 기술 기반 키트를 이용하여 프로토콜에 따라 PCSK9 mRNA 수치를 검출하였다. 10-20mg의 냉동된 간 분말을 조직 및 세포 용해액(Epicentre, #MTC096H) 중의 600 μl의 0.16 μg/ml 프로티나아제 K((Epicentre, #MPRK092)에서 65℃에서 3시간 동안 용해시켰다. 그리고 나서, 상기 용해물 10 μl를 용해 작업 시약(Lysis Working Reagent)(2부피의 물 중에 1부피의 스톡 용해 혼합물)에 첨가하고, 랫트 PCSK9 및 랫트 GAPDH에 특이적인 프로브 세트를 갖는 제노스펙트라 캡쳐 플레이트 상에서 하룻밤 동안 52℃에서 배양하였다. 랫트 PCSK9 및 랫트 GAPDH에 대한 프로브 세트는 파노믹스사(Panomics, USA.)로부터 구입하였다. Victor2-Light(Perkin Elmer) 상에서 상대 발광 단위(Relative light unit)로서 화학발광을 판독하였다. 간 용해물에서 GAPDH mRNA에 대한 랫트 PCSK9 mRNA의 비율을 각 처리군에 대하여 평균을 내어 PBS로 처리된 대조군 또는 관련성이 없는 siRNA(혈액응고인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
랫트 혈청 내 총 혈청 콜레스테롤을 제조사의 지침에 따라 총 콜레스테롤 분석(Wako, USA)을 이용하여 측정하였다. 측정은 Victor2 1420 멀티라벨 계수기(Perkin Elmer) 상에서 600 nm에서 수행하였다. 실시예 14. AD-9680 및 AD-14676의 불일치 워크(walk)의 HeLa 세포에서의 시험관내 효능 선별
서열에서의 변화 또는 변형이 AD-9680, AD-14676, 및 AD-10792의 효과에 미치는 영향을 HeLa 세포에서 분석하였다. 여러 가지 변이체들을 표 6에 나타난 바와 같이 합성하였으며, 이들은 DFT(2,4-디플루오로톨루일, 왓슨-크릭 짝짓기가 없는 티미딘 삼인산 형태 유사체)를 가하는 것; 단일 또는 조합 불일치를 가하는 것; 및 두 가지 상이한 백본 화학을 시험하는 것: 2'-O 메틸을 이용하여 유도하는 것, 또는 2'F로 교체하는 것을 포함한다.
상기 3가지 모 이중체의 서열들은 표 1a에서 발견될 수 있으며 하기와 같이 복제된다:
Figure pct00029

HeLa를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 100 μl 10% 우태아혈청 중에서 96-웰 플레이트(8,000-10,000 세포/웰)에 도말하였다. 세포가 약 50% 컨플루언스(confluence)에 도달하면(~24시간 후), 이들을 10 nM에서 시작하여 연속 4차례 희석된 siRNA로 형질감염시켰다. 웰 당 0.4 μl의 형질감염 시약 리포펙타민TM 2000(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)을 사용하였고 형질감염은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 즉, siRNA: 리포펙타민TM 2000 복합물을 하기와 같이 준비하였다. 적절한 양의 siRNA를 혈청이 없는 Opti-MEM I 혈청 감소 배지에 희석하고 조심스럽게 혼합하였다. 상기 리포펙타민TM 2000을 사용에 앞서 조심스럽게 섞은 다음, 96 웰 플레이트의 각 웰에 대해 0.4 μl을 Opti-MEM I 혈청 감소 배지에 희석하고 조심스럽게 혼합하여 상온에서 5분 동안 배양하였다. 5분 배양 후, 1 μl의 희석된 siRNA를 상기 희석된 리포펙타민TM 2000과 결합시켰다(총 부피는 26.4 μl임). 상기 복합체를 조심스럽게 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양하여 siRNA: 리포펙타민TM 2000 복합체가 형성되게 하였다. 그리고 나서, 100 μl의 DMEM 중의 10% 우태아혈청을 각 siRNA:리포펙타민TM 2000 복합체에 가하고 플레이트를 앞뒤로 흔들어 조심스럽게 혼합하였다. 100 μl의 상기 혼합물을 세포를 함유하는 각각의 웰에 가하고 플레이트를 CO2 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양 배지를 제거하고 DMEM 중의 10% 우태아혈청 100 μl을 첨가하였다.
배지 교환 24 시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 용해시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 bDNA 분석(Panomics, USA)에 의하여 세포 용해물의 PCSK9 mRNA 사일런싱을 분석하였다. Victor2-Light(Perkin Elmer) 상에서 상대 발광 단위로서 화학발광을 판독하였다. 세포 용해물 내 인간 GAPDH mRNA에 대한 인간 PCSK9 mRNA의 비율을 리포펙타민TM 2000 단독 대조군으로 처리된 세포의 비율과 비교하였다.
도 20은 AD-9680과 관련된 일련의 화합물들의 용량 반응 곡선이다. 도 21은 AD-14676과 관련된 일련의 화합물들의 용량 반응 곡선이다. 상기 결과들은 특정 위치에서의 DFT 또는 불일치가 두 가지 모 화합물의 활성을 증가시킬 수 있음(더 낮은 IC50 값에 의해 입증됨)을 보여준다. 도 24는 모 이중체 AD-9680 및 AD-10792의 효율을 DFT가 센스 가닥의 위치 10에 삽입된 변형된 이중체와 비교한 용량 반응 곡선이다. 이 변형은 HeLa 세포에서 약 2배까지 효율을 증가시킨다.
이론에 구속됨이 없이, 불일치, 또는 DFT의 도입을 통한 센스 가닥의 불안정성이 상기 센스 가닥의 더 빠른 제거를 야기할지도 모른다는 가설이 세워졌다.
실시예 15. 고농도에서 Hep3B 세포에서의 벗어난 표적 효과의 부족
지질 제형화된 PCSK9 표적화된 siRNA(AD-9680)를 제조사의 프로토콜에 따라 시약 RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 세 차례 250　nM, 1　uM 및 5　uM의 농도로 Hep3B 세포 내로 형질감염시켰다: 1ul의 형질감염 시약; 역 형질감염 프로토콜. 형질감염 48시간 후 샘플을 수집하였다. MagMAXTM-96 총 RNA 분리 키트(Ambion)를 이용하여 총 RNA를 정제하였고, 13.5　μl의 RNA 프렙(prep)으로부터 RNase 억제제를 갖는 고성능 cDNA 역전사 키트(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; ABI)로 cDNA를 합성하였으며, ABI 유전자 발현 태크맨 분석을 사용하였고, TaqMan®유전자 발현 마스터 믹스(Expression Master Mix; ABI)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 q-PCR 반응을 준비하고 ABI 7900 기계상에서 작동시켰다. 델타 델타 Ct 방법(Delta delta Ct method)을 사용하여 값을 계산하였다. 샘플을 hGAPDH에 대해 정규화하고 보정하여 형질감염을 모의하였다.
표적 서열에 대해 가장 근접한 상동성을 갖는 하기 유전자에 대해 전사체 수치를 측정하였다: ORMDL2, BMP6, TAPT1, MYEF2, LOC442252, RFT1, 및 PCSK9.
상기 결과가 도 22에 나타나 있다. 고농도의 dsRNA에서 오프 표적 효과가 관찰되지 않았다(PCS-B2 = AD-9680).
Figure pct00030

실시예 16. 더 낮은 복용량의 AD-10792에 의한 랫트에서의 총 콜레스테롤 수준 감소의 유지
랫트에 3　mg/kg 볼루스 용량의 SNALP-DlinDMA 제형화된 AD-10792를 처리하였다. 2일째에, 총 혈청 콜레스테롤 수준을 결정하였다. 이후 4주간 1.0 및 0.3 mg/kg으로 1주일에 1회 투여하였다. 투여를 반복하기 전 날에 랫트를 출혈시키고 총 혈청 콜레스테롤 수준을 결정하였다. 음성 대조군은 PBS였다.
상기 결과들이 도 23의 그래프에 나타나 있다. 3　mg/kg 볼루스 투여 후, 총 콜레스테롤 수준이 60%까지 감소하였고 1주일에 1회의 반복된 1.0 및 0.3　mg/kg 투여에 의해 약 50%에 유지되고 반복 투여가 중지된 후 투여 전 수치로 되돌아갔다.
1주일에 1회, 10배 더 낮은(EC50보다) 유지 용량은 사일런싱을 효과적으로 유지하하고, 마지막 주사 후 15일에 콜레스테롤 수준이 기준선으로 되돌아간다. PCSK9의 초기 용량은 총 혈청 콜레스테롤 감소에 의해 반영된 바와 같이 LDLR 수치를 증가시켰다. 이러한 LDLR 수치의 감소는 보다 낮은 복용량의 이후의 AD-10792 투여에 의해 반영된 바와 같이 PCSK9 표적화된 siRNA의 효능을 증가시켰다.
실시예 17. AD-10792의 다양한 지질 제형의 투여 후 랫트에서의 콜레스테롤 수준에 미치는 효과의 분석
랫트에게 하기 기술된 SNALP 및 LNP08을 포함하는 4가지 상이한 지질 제형의 AD-10792를 처리하였다. 3일째에, 총 혈청 콜레스테롤 수준을 결정하였다. 본원에 기술된 방법을 이용하여 실험을 수행하였다. LNP-08 제형화된 AD-10792의 투여는 LNP01 제형화된 것(2.0　mg/kg의 EC50) 및 SNALP 제형화된 것(1.0 mg/kg의 EC50)과 비교하여 0.08 mg/kg의 가장 낮은 EC50을 야기하였다(데이터 미제시).
실시예 18. PCSK9 siRNA 틸팅(tiling) 실험
PCSK9 틸팅 세트의 생물정보학적 선발
ALN-PCSK9(AD-9680)의 19 염기 표적 영역의 플랭킹 영역(flanking region) 즉시 상류(immediately upstream) 및 하류(downstream) 내의 인간 PCSK9 전사체를 표적화하도록 센스 및 안티센스 올리고머를 설계하였다. 본 발명자들은 PCSK9 유전자에 대한 참조 인간 전사체로서 NCBI Refseq NM_174936.2를 사용하였다. AD-9680의 안티센스 올리고는 mRNA의 개시점 대비 위치 3530 내지 3548의 NM_174936 영역 내 염기들에 상보적인 19개의 인접한 염기들을 함유하고 있다. AD-9680의 표적 영역의 5' 말단으로부터 10 염기 상류 내지 3' 말단으로부터 10 염기 하류까지로 정의된 상기 전사체 서열의 하위세트의 각각의 독특한 19머에 대해 한 세트의 siRNA 분자들을 설계하였다. NM_174936.2 전사체와 관련하여, 센스 올리고 19머의 5' 위치에 있는 첫 번째 염기는 위치 3520으로부터 위치 3558로 확장된다(표 7 및 8).
PCSK9 틸팅 서열의 합성:
머메이드(MerMade) 192 합성기 상에서 PCSK9 서열들을 합성하였다. 두 가지 서열 세트를 제조하였다. 첫 번째 세트는 화학적 변형을 함유하지 않았으며(변형되지 않음), 두 번째 세트는 엔도라이트(endolight) 화학적 변형으로 제조하였다. 엔도라이트 화학적 변형을 함유하는 서열들에서, 센스 가닥 내 모든 피리미딘(시토신 및 우리딘)들은 대응되는 2'-O-메틸 염기로 치환되었다(2'O-메틸 C 및 2'-O-메틸 U). 안티센스 가닥에서, 리보 A 뉴클레오사이드에 인접한(5' 위치 쪽) 피리미딘들은 이들의 대응되는 2-O-메틸 뉴클레오사이드로 치환되었다. 두 가지 센스 및 안티센스 서열의 3' 말단에서의 두 가지 염기 dTsdT 확장이 도입되었다. 상기 서열 파일을 텍스트 파일로 변환하여 머메이드 192 합성 소프트웨어에 로딩하는데 적합하도록 하였다.
PCSK9 서열들의 합성은 포스포라미디트(phosphoramidite) 화학을 이용한 고체 지지 올리고뉴클레오타이드 합성법을 사용하였다. 상기 서열들의 합성은 96 웰 플레이트에서 1　μm 비율로 수행하였다. 아미디트 용액을 0.1　M 농도로 제조하였고 에틸 티오 테트라졸(아세토니트릴 중 0.6M)을 활성제로 사용하였다. 1단계에서는 메틸아민을 이용하고 2단계에서는 불소를 이용하여, 96 웰 플레이트에서 상기 합성된 서열을 절단하고 탈보호화하였다. 상기 수득된 조(crude) 서열을 아세톤:에탄올 믹스를 이용하여 침전시키고 펠렛을 0.2M 아세트산 나트륨 완충액에 재현탁하였다. 각 서열로부터 얻은 샘플을 LC-MS로 분석하였고 얻어진 매스 데이터로 상기 서열의 동일성을 확인하였다. 선발된 샘플 세트를 또한 IEX 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 모든 서열을 Source 15Q 컬럼을 이용하여 AKTA 익스플로러 정제 시스템 상에서 정제하였다. 상기 용출물에서 전장 서열에 해당하는 단일 피크를 수집한 후 이온 교환 크로마토그래피에 의해 순도를 분석하였다. 정제된 서열을 AKTA 정제기를 이용하여 세파덱스 G25 컬럼 상에서 탈염시켰다. 상기 탈염된 PCSK9 서열의 농도 및 순도를 분석하였다. 그리고 나서, 단일 가닥을 어닐링(annealing)시켰다.
PCSK9 틸팅 siRNA의 시험관내 선별:
세포 배양 및 형질감염:
Hela 세포(ATCC, Manassas, VA)를 트립신화에 의해 플레이트로부터 해방시키기 전에 배출시키기 전에 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 첨가된 이글스 최소 필수 배지(EMEM, ATCC)에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 컨플루언스 근처까지 배양하였다. 웰 당 10ml의 Opti-MEM 및 0.2ml의 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)와 함께 96-웰 플레이트 내로 웰당 5　ml의 siRNA 이중체에 5 ml의 Opti-MEM을 첨가함으로써 역 형질감염을 수행하고, 상온에서 15분간 배양하였다. 그리고 나서, 2.0 x 104 Hela 세포를 함유하는 ㅎ항생제가 없는 80μl의 완전 배양 배지를 첨가하였다. 세포를 RNA 정제에 앞서 24시간 동안 배양하였다. 0.1 또는 10nM 최종 이중체 농도에서 실험을 수행하였다. 용량 반응 선별을 위해, 1nM에서 1fM까지의 7개의 10배 연속 희석된 siRNA로 형질감염시켰다.
MagMAX-96 총 RNA 분리 키트(Applied Biosystem, Forer City CA, part #: AM1830)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 세포를 회수하고 140μl의 용해/결합액에서 용해시킨 다음, 에펜도르프 써모믹서(Eppendorf Thermomixer)를 이용하여 1분동안 혼합하였다(상기 혼합 속도는 공정 내내 동일하였다). 세포-용해물 내로 20 μl의 마그네틱 비드 및 용해/결합 인핸서 혼합물을 첨가하고 5분간 혼합하였다. 마그네틱 스탠드를 이용하여 마그네틱 비드를 붙잡고 상기 비드를 건들지 않으면서 상징액을 제거하였다. 상징액을 제거한 후, 마그네틱 비드를 세척액 1(이소프로판올이 첨가됨)로 세척하고 1분간 섞어주었다. 비드를 다시 붙잡고 상징액을 제거하였다. 그리고 나서, 비드를 150μl 세척액 2(에탄올이 첨가됨)로 세척하고, 붙잡고, 상징액을 제거하였다. 그리고 나서, 상기 비드에 50μl의 DNase 혼합물(MagMax turbo DNase 완충액 및 Turbo DNase)을 가하고, 이들을 10 내지 15분간 혼합하였다. 혼합 후, 100μl의 RNA 재결합액을 첨가하고 3분간 혼합하였다. 상징액을 제거하고 마그네틱 비드를 150μl 세척액 2로 다시 세척하고 1분간 섞어주고 상징액을 완전히 제거하였다. 상기 마그네틱 비드를 2분간 섞어주어 50μl의 물로 RNA가 용출되기 전에 건조시켰다.
ABI 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 반응에 대하여 2μl 10X 완충액, 0.8μl 25X dNTPs, 2μl 랜덤 프라이머, 1μl 역전사효소, 1μl RNase 억제제 및 3.2μl의 H2O의 마스터 믹스를 10ml 총 RNA 내로 첨가하였다. 하기 단계를 통해 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 써멀 사이클러(thermal cycler; Hercules, CA)를 이용하여 cDNA를 생성하였다: 25℃ 10분, 37℃ 120분, 85℃ 5초, 4℃ 유지.
실시간 PCR을 하기와 같이 수행하였다. LightCycler 480 384 웰 플레이트(Roche cat # 0472974001)에서 웰 당 1μl GAPDH TaqMan 프로브(Applied Biosystems Cat # 4326317E), 1μl PCSK9 TaqMan 프로브(Applied Biosystems cat # HS03037355_M1) 및 10μl Roche 프로브 마스터 믹스(Roche Cat # 04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 2μl의 cDNA를 첨가하였다. LightCycler 480 실시간 PCR 기계(Roche)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 두 개의 독립된 형질감염에서 각각의 이중체를 시험하고 각각의 형질감염을 2회 분석하였다.
△△ Ct 방법을 이용하여 실시간 데이터를 분석하였다. 각각의 샘플을 GAPDH 발현에 대하여 정규화하였고, 비-표적화 이중체 AD-1955로 형질감염된 세포 대비 넉다운을 평가하였다. XLfit에서 4 매개변수 피트 모델을 이용하여 IC50을 정의하였다.
단일 용량 실험에 대한 데이터가 표 9에 나타나 있다. 데이터는 대조군 AD-1955 대비 50% 억제를 야기하는 pM의 용량으로 표시된다.
용량 반응 선별을 위한 데이터가 표 10에 나타나 있다. 데이터는 대조군 AD-1955 대비 50% 억제를 야기하는 pM의 용량으로 표시된다. 각 용량 반응을 2회 반복하였다(Rep1 및 Rep2). 두 가지 용량 반응 선별에서 생성된 IC50의 평균이 나타나 있다.
siRNA 플랭킹 AD-9680에 대한 평균 IC50을 인간 PCSK9 전사체 내의 표적 영역의 출발 위치에 대하여 도로 표시하였다(도 25).
따라서, RNAi 제제를 이용하여 PCSK9의 뉴클레오티드 영역 3520-3555를 표적화하는 것은 PCSK9을 억제하는데 매우 효과적이다.
실시예 19. PCSK9를 표적화하는 dsRNA와 복합체화된 ApoE3-기반의 재구축된 HDL
C57BL6 마우스에게 정맥내 주사(꼬리 정맥 주사)에 의해 단일 볼루스 용량으로 30 mg/kg rEHDL/chol-siPCSK9를 투여하였다.
Chol-siPCSK9 (dsRNA 이중체 AD-20583)는 다음과 같은 서열을 가지고 있다 :
센스:　GccuGGAGuuuAuucGGAAdTsdTL10　　 (서열번호: 1729)
안티센스: PuUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcdTsdT　　 (서열번호:1730)
L10의 구조는:
Figure pct00031

주사 후, 마우스를 하룻밤 동안(~14시간) 단식시킨 다음, 48시간 주사 후 희생시켰다. bDNA 분석에 의해 간에서의 mRNA 수치를 결정하고, GAPDH mRNA 수치에 대해 정규화하였다.　
결과
bDNA 분석의 결과가 도 26에 나타나 있으며, 상기 도는 rEHDL/chol-siPCSK9의 투여 후에는 PCSK9가 유의하게 감소하였지만 복합체화되지 않은 siRNA (chol-siPCSK9)의 투여 후에는 그렇지 않았음을 보여준다.
rEHDL/chol-siPCSK9는 PCSK9 mRNA 수치를 약 80%까지 감소시켰다.
실시예 20. 비인간 영장류(NHP)에서의 LNP-11 제형화된 siRNA.
PCSK9를 표적화하는 siRNA(AD-9680)를 LNP-11 제형(본원에 기술됨) 내에 제형화시키고 사이노몰거스 원숭이에게 투여하였다. 대조군은 AD-1955였다. 상기 지질 제형화된 siRNA를 0.03, 0.1, 0.3, 및 1.0 mg/kg의 용량으로 첫째 날에 30분 주입을 통해 투여하였다. 대조군에게는 1.0 mg/kg으로 투여하였다. 3일째에, PCSK9 전사체의 측정을 위해 간 조직검사를 수행하였다. 혈액 샘플을 -3, -1, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 15, 22, 30, 및 37일에 수집하였고 PCSK9 단백질 수치 및 LDLc 수 및 HDLc 수를 결정하였다.
결과들이 도 27a, 도 27b, 및 도 27c에 나타나 있다.
도 27a 및 도 27b에 나타난 바와 같이, 투여는 PCSK9 단백질 수치의 급격하고 오래 지속되는 용량 의존적인 감소를 야기하였고, LDLc(LDL 콜레스테롤) 수치의 >50% 감소를 야기하였다. 이들 효과들은 30 내지 100 μg/kg의 ED50 용량 수치에서 매우 강력하였다. 도 27c에 나타난 바와 같이, 투여는 HDLc 수치에서 어떠한 변화도 야기하지 않았다.
실시예 21. LNP-09 제형화된 PCSK9 dsRNA를 이용한 랫트에서의 용량 반응
dsRNA AD-10792 (targeting rate PCSK9)를 XTC 함유 제형, 예컨대, LNP09 제형 내에 캡슐화하였다. LNP09 제형은 50/10/38.5/1.5의 % 몰 비율의 XTC/DSPC/콜레스테롤/PEG-DMG 및 10:1의 지질:siRNA 비율이었다
제형들을 랫트 내로 단일 용량(DRC)으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 주사 72시간 후 간 및 혈장을 회수하였다(그룹 당 5마리). 제조사의 프로토콜처럼 제조된 간에서 의 PCSK9 전사체 수치를 bDNA를 통해 측정하였다. GAPDH 전사체 수치 역시 측정하고 GAPDH에 대한 PCSK9의 비율을 PBS 대조군의 것에 대해 정규화하고 그래프를 작성하였다 WAKO TX사의 콜레스테롤 키트를 이용하여 혈청에서의 총 콜레스테롤를 측정하였다.
상기 결과가 도 29에 나타나 있다. 이 제형을 이용하여, 랫트에서의 PCSK9 사일런싱 및 총 콜레스테롤 저하가 용량 <0.1　mg/kg에서 달성되었다. PCSK9 mRNA를 낮추기 위한 ED50은 0.2　mg/kg이었고 혈청 콜레스테롤을 낮추기 위한 것은 0.2　mg/kg 및 0.08이었다.
실시예 22. LNP-09 제형화된 PCSK9 dsRNA를 이용한 형질전환 마우스의 처리
인간 CETP 및 ApoB100을 과발현하는 형질전환 마우스 (CETP/ApoB 이중 인간화된 형질전환 마우스, Taconic Labs)는 인간에게서 발견되는 LDL/HDL 비율을 한층 더 모방한다.
CETP/ApoB 이중 인간화된 형질전환 마우스를 타코닉 연구소(Taconic labs)로부터 구입하였다. 동물에게 5mg/kg의 LNP09 제형화된 AD-10792 (표준 제형 과정), 또는 AD-1955 루시퍼라아제 대조군을 꼬리 정맥을 통하여(단일 주사) 주사하였다(그룹당 4마리). 주사 72시간 후 간 및 혈장을 회수하였고(그룹당 5마리), 간 PCSK9 mRNA, LDL 입자, 및 HDL 입자수를 결정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 제조된 간에서 bDNA를통해 PCSK9 전사체 수치를 측정하였다. 또한 GAPDH 전사체 수치를 측정하고 GAPDH에 대한 PCSK9의 비율을 그래프로 작성하고, PBS 대조군의 것에 대해 정규화하였다. LDL 및 HDL 입자수/농도를 이들의 SOP에 기초한 NMR(Liposciences Inc.)에 의해 측정하였다.
상기 결과가 도 30에 나타나 있다. PCSK9의 사일런싱은 LDL 입자 농도를 ~90%로 낮춘 반면, HDL 수치는 (PBS 대조군으로 처리된 동물과 비교할때) 약간 더 낮았다. 이는 이들 동물에서 PCSK9 수치의 유의한 저하 및 이후의 LDLc 저하를 입증한다.
실시예 23. 인간에서의 PCSK9 발현의 억제
인간 대상에게 본원에 기술된 PCSK9 유전자를 표적으로 한 지질 제형화된 dsRNA로 처리하여 PCSK9 유전자의 발현을 억제하고 단일 투여 후 확장된 기간 동안 콜레스테롤수치를 낮춘다. 하나의 구현예에서, 상기 지질 제형화된 dsRNA는 지질 MC3를 포함한다.
처리를 필요로 하는 대상이 선발되거나 확인된다. 상기 대상은 LDL 저하, HDL 저하 없이 LDL 저하, ApoB 저하, 또는 총 콜레스테롤 저하를 필요로 할 수 있다. 상기 대상의 확인은 임상학적 셋팅 또는 그외 장소, 예컨대 대상의 자가 시험 키트를 이용을 통한대상의 집에서 일어날 수 있다.
시간 0에서, 적합한 일차용량의 항-PCSK9 siRNA가 대상엑데 피하 내로 투여된다. 상기 dsRNA는 본원에 기술된 바와 같이 제형화된다. 일차 투여 후 일정 시간, 예컨대, 7일, 14일, 및 21일 후, 예컨대, LDL, ApoB, 및/또는 총 콜레스테롤 수준을 측정함으로써, 상기 대상의 상태를 평가한다. 이 측정은 상기 대상에서의 PCSK9 발현의 측정, 및/또는 PCSK9 mRNA의 성공적인 siRNA-표적화의 생성물을 수반할 수 있다. 다른 관련 기준이 또한 측정될 수 있다. 투여 횟수 및 강도는 대상의 요구에 따라 조절된다.
처리 후, 대상의 LDL, ApoB, 또는 총 콜레스테롤 수준은 처리 전의 수치에 비해 또는 비슷하게 고통받고 있지만 처리되지 않은 대상에서 측정된 수치에 비해 낮아진다.
본 기술분야에서 숙련된 자는 본 내용에 구체적으로 제시된 것 이외에 이하 첨부된 전체 청구의 범위까지 본 발명을 실시할 수 있도록 하는 방법 및 조성물들을 잘 알고 있을 것이다. 표 1a: PCSK9에 표적화된 dsRNA 서열
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U, C, A, G: 상응하는 리보뉴클레오티드; T: 데옥시티미딘; u, c, a, g: 상응하는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드; Uf, Cf, Af, Gf: 상응하는 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드; 뉴클레오티드가 서열로 기재되는 경우, 3'-5' 포스포디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 사이에 끼워진 "s"를 갖는 뉴클레오티드는 3'-O-5'-O 포스포로티오디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 접두어 "p-"로 표시되지 않으면, 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 상에 5'-포스페이트 그룹이 없고; 모든 올리고뉴클레오티드는 3'-대부분의 뉴클레오티드 상에 3'-OH를 지니고 있다.
표 1b. PCSK9에 표적화된 siRNA의 선별
Figure pct00052

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표 2a. PCSK9에 표적화된 변형된 dsRNA의 서열
Figure pct00067

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Figure pct00069

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U, C, A, G: 상응하는 리보뉴클레오티드; T: 데옥시티미딘; u, c, a, g: 상응하는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드; Uf, Cf, Af, Gf: 상응하는 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드; moc, mou, mog, moa: 상응하는 2'-MOE 뉴클레오티드; 뉴클레오티드가 서열로 기재되는 경우, 3'-5' 포스포디에스테르 그룹에 의해 연결되고; ab: 3'-말단 어베이직(abasic) 뉴클레오티드; 사이에 끼워진 "s"를 갖는 뉴클레오티드는 3'-O-5'-O 포스포로티오디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 접두어 "p-"로 표시되지 않으면, 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 상에 5'-포스페이트 그룹이 없고; 모든 올리고뉴클레오티드는 3'-대부분의 뉴클레오티드 상에 3'-OH를 지니고 있다
표 2b. PCSK9에 표적화된 dsRNA의 선별
Figure pct00071

Figure pct00072

표 3. LNP01-10792로 처리된 랫트의 콜레스테롤 수준
5 mg/kg의 복용량, 그룹 당 n=6 랫트
Figure pct00073

표 4. LNP 제형화된 dsRNA로 처리된 긴꼬리원숭이의 혈청 LDL-C 수치
혈청 LDL-C (투여전 대비)
Figure pct00074

표 5a: PCSK9에 표적화된 변형된 dsRNA
Figure pct00075

U, C, A, G: 상응하는 리보뉴클레오티드; T: 데옥시티미딘; u, c, a, g: 상응하는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드; Uf, Cf, Af, Gf: 상응하는 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드; 뉴클레오티드가 서열로 기재되는 경우, 3'-5' 포스포디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 사이에 끼워진 "s"를 갖는 뉴클레오티드는 3'-O-5'-O 포스포로티오디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 접두어 "p-"로 표시되지 않으면, 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 상에 5'-포스페이트 그룹이 없고; 모든 올리고뉴클레오티드는 3'-대부분의 뉴클레오티드 상에 3'-OH를 지니고 있다.
표 5b: 원숭이 간세포에서의 변형된 dsRNA의 사일런싱 활성
Figure pct00076

표 6: PCSK9에 표적화된 dsRNA: 불일치 및 변형
Figure pct00077

Figure pct00078

가닥: S/센스; AS/안티센스
U, C, A, G: 상응하는 리보뉴클레오티드; T: 데옥시티미딘; u, c, a, g: 상응하는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드; Uf, Cf, Af, Gf: 상응하는 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드; Y1은 DFT 디플루오로톨루일 리보(또는 데옥시리보)뉴클레오티드에 상응하고; 뉴클레오티드가 서열로 기재되는 경우, 3'-5' 포스포디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 사이에 끼워진 "s"를 갖는 뉴클레오티드는 3'-O-5'-O 포스포로티오디에스테르 그룹에 의해 연결되고; 접두어 "p-"로 표시되지 않으면, 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 상에 5'-포스페이트 그룹이 없고; 모든 올리고뉴클레오티드는 3'-대부분의 뉴클레오티드 상에 3'-OH를 지니고 있다
표 7: 변형되지 않은 siRNA 플랭킹(flanking) AD-9680의 서열
Figure pct00079

Figure pct00080

Figure pct00081

표 8: 변형된 siRNA 플랭킹 AD-9680의 서열
Figure pct00082

Figure pct00083

Figure pct00084

표 9: siRNA 플랭킹 AD-9680를 이용한 HeLa 세포의 단일 용량 처리
Figure pct00085

Figure pct00086

표 10: siRNA 플랭킹 AD-9680을 이용한 HeLa 세포에서의 IC50
Figure pct00087
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> LIPID FORMULATED DSRNA TARGETING THE PCSK9 GENE <130> 26421-16733 PCT <140> PCT/US10/38707 <141> 2010-06-15 <150> US 61/313,578 <151> 2010-03-12 <150> US 61/293,474 <151> 2010-01-08 <150> US 61/285,598 <151> 2009-12-11 <150> US 61/244,790 <151> 2009-09-22 <150> US 61/218,350 <151> 2009-06-18 <150> US 61/187,169 <151> 2009-06-15 <160> 1732 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 agcgacgucg aggcgcucat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ugagcgccuc gacgucgcut t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gcgcgcggaa uccuggcugt t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cagccaggau uccgcgcgct t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gcgcgcggaa uccuggcugt t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 agcuccugca caguccucct t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggaggacugu gcaggagcut t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 agcuccugca caguccucct t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 ggaggacugu gcaggagcut t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 caccgcaagg cucaaggcgt t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 cgccuugagc cuugcggugt t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 45 cgcaaggcuc aaggcgccgt t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 46 cggcgccuug agccuugcgt t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 47 caaggcucaa ggcgccgcct t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ggcggcgccu ugagccuugt t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 49 guggaccgcg cacggccuct t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gaggccgugc gcgguccact t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 51 uggaccgcgc acggccucut t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 52 agaggccgug cgcgguccat t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ggaccgcgca cggccucuat t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 uagaggccgu gcgcggucct t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gaccgcgcac ggccucuagt t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 56 cuagaggccg ugcgcgguct t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 57 accgcgcacg gccucuaggt t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 ccuagaggcc gugcgcggut t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 59 ccgcgcacgg ccucuaggut t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 60 accuagaggc cgugcgcggt t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 61 cgcgcacggc cucuagguct t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 62 gaccuagagg ccgugcgcgt t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gcgcacggcc ucuaggucut t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 64 agaccuagag gccgugcgct t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 65 cgcacggccu cuaggucuct t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gagaccuaga ggccgugcgt t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 67 cucuaggucu ccucgccagt t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 68 cuggcgagga gaccuagagt t 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ucuaggucuc cucgccaggt t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ccuggcgagg agaccuagat t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 71 cuaggucucc ucgccaggat t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 72 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21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 cgucagcucc aggcggucct t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 78 ggaccgccug gagcugacgt t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 79 cgucagcucc aggcggucct t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 80 ggaccgccug gagcugacgt t 21 <210> 81 <211> 21 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ggcgcccgug cgcaggaggt t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ccuccugcgc acgggcgcct t 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 87 ggagcuggug cuagccuugt t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 caaggcuagc accagcucct t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 ggagcuggug cuagccuugt t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 caaggcuagc accagcucct t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 91 gcuggugcua gccuugcgut t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 92 acgcaaggcu agcaccagct t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 93 gcuggugcua gccuugcgut t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 acgcaaggcu agcaccagct t 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 95 cuggugcuag ccuugcguut t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 aacgcaaggc uagcaccagt t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 cuggugcuag ccuugcguut t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 aacgcaaggc uagcaccagt t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 cuggugcuag ccuugcguut t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 aacgcaaggc uagcaccagt t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 ugcuagccuu gcguuccgat t 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ucggaacgca aggcuagcat t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 103 ugcuagccuu gcguuccgat t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 104 ucggaacgca aggcuagcat t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 105 uagccuugcg uuccgaggat t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 106 uccucggaac gcaaggcuat t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uagccuugcg uuccgaggat t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 108 uccucggaac gcaaggcuat t 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gacggccugg ccgaagcact t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gugcuucggc caggccguct t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 111 ggccgaagca cccgagcact t 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gugcucgggu gcuucggcct t 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gccgaagcac ccgagcacgt t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 114 cgugcucggg ugcuucggct t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 115 ccgaagcacc cgagcacggt t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ccgugcucgg gugcuucggt t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 117 ccgagcacgg aaccacagct t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gcugugguuc cgugcucggt t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 119 caccgcugcg ccaaggauct t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gauccuuggc gcagcggugt t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 121 ccgcugcgcc aaggauccgt t 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 122 cggauccuug gcgcagcggt t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 123 cgcugcgcca aggauccgut t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 124 acggauccuu ggcgcagcgt t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 125 cugcgccaag gauccguggt t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 ccacggaucc uuggcgcagt t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 127 auccguggag guugccuggt t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 128 ccaggcaacc uccacggaut t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gguugccugg caccuacgut t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 130 acguaggugc caggcaacct t 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 131 aggagaccca ccucucgcat t 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 132 ugcgagaggu gggucuccut t 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 133 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 150 ggcagugcgc ucugacugct t 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gcagucagag cgcacugcct t 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ggcagugcgc ucugacugct t 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gggauaccuc accaagauct t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gaucuuggug agguauccct t 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gggauaccuc accaagauct t 21 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gaucuuggug agguauccct t 21 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 157 uggugaagau gaguggcgat t 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ucgccacuca ucuucaccat t 21 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 159 uggugaagau gaguggcgat t 21 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 160 ucgccacuca ucuucaccat t 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 161 gaagaugagu ggcgaccugt t 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 162 caggucgcca cucaucuuct t 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 163 gaagaugagu ggcgaccugt t 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 164 caggucgcca cucaucuuct t 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 165 cccaugucga cuacaucgat t 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 166 ucgauguagu cgacaugggt t 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 167 cccaugucga cuacaucgat t 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 168 ucgauguagu cgacaugggt t 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 169 aucgaggagg acuccucugt t 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 170 cagaggaguc cuccucgaut t 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 171 aucgaggagg acuccucugt t 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 172 cagaggaguc cuccucgaut t 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 173 ggaaccugga gcggauuact t 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 174 guaauccgcu ccagguucct t 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 175 gaaccuggag cggauuacct t 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 176 gguaauccgc uccagguuct t 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 177 aaccuggagc ggauuaccct t 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 178 ggguaauccg cuccagguut t 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 179 cccuccacgg uaccgggcgt t 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 180 cgcccgguac cguggagggt t 21 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 181 cacgguaccg ggcggaugat t 21 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 182 ucauccgccc gguaccgugt t 21 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 183 cacgguaccg ggcggaugat t 21 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 184 ucauccgccc gguaccgugt t 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 185 acgguaccgg gcggaugaat t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 186 uucauccgcc cgguaccgut t 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 187 acgguaccgg gcggaugaat t 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 188 uucauccgcc cgguaccgut t 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 189 cgguaccggg cggaugaaut t 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 190 auucauccgc ccgguaccgt t 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 191 cgguaccggg cggaugaaut t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 192 auucauccgc ccgguaccgt t 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 193 gguaccgggc ggaugaauat t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 194 uauucauccg cccgguacct t 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 195 gguaccgggc ggaugaauat t 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 196 uauucauccg cccgguacct t 21 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 197 guaccgggcg gaugaauact t 21 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 198 guauucaucc gcccgguact t 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 199 guaccgggcg gaugaauact t 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 200 guauucaucc gcccgguact t 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 201 accgggcgga ugaauaccat t 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 202 ugguauucau ccgcccggut t 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 203 accgggcgga ugaauaccat t 21 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 204 ugguauucau ccgcccggut t 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 205 ccgggcggau gaauaccagt t 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 206 cugguauuca uccgcccggt t 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 207 ccgggcggau gaauaccagt t 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 208 cugguauuca uccgcccggt t 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 209 ccugguggag guguaucuct t 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 210 gagauacacc uccaccaggt t 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 211 ccugguggag guguaucuct t 21 <210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gagauacacc uccaccaggt t 21 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 213 cugguggagg uguaucucct t 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 214 ggagauacac 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<210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ugguggaggu guaucuccut t 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 220 aggagauaca ccuccaccat t 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 221 gguggaggug uaucuccuat t 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 222 uaggagauac accuccacct t 21 <210> 223 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ggagguguau cuccuagact t 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gucuaggaga uacaccucct t 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 229 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 230 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 239 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 240 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 241 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 242 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 243 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 244 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 245 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 246 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 247 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 248 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 250 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 251 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 252 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 253 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 254 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 259 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 260 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 261 uguaucuccu agacaccagt t 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 262 cuggugucua ggagauacat t 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 263 uguaucuccu agacaccagt t 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 264 cuggugucua ggagauacat t 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 265 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 266 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 268 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 269 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 270 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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Synthetic oligonucleotide <400> 275 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 276 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 277 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 277 ucuccuaaac accagcauat t 21 <210> 278 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 278 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 279 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 280 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ucuccuagac accagcauat t 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 282 uaugcuggug ucuaggagat t 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 283 aggccuggag uuuauucggt t 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ccgaauaaac uccaggccut t 21 <210> 285 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 285 aggccuggag uuuauucggt t 21 <210> 286 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 286 ccgaauaaac uccaggccut t 21 <210> 287 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 287 aggccuggag uuuauucggt t 21 <210> 288 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 288 ccgaauaaac uccaggccut t 21 <210> 289 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 289 aggccuggag uuuauucggt t 21 <210> 290 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ccgaauaaac uccaggccut t 21 <210> 291 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 291 aggccuggag 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 304 uguaugcugg ugucuaggat t 21 <210> 305 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 305 ccuagacacc agcauacagt t 21 <210> 306 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 306 cuguaugcug gugucuaggt t 21 <210> 307 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 307 ccuagacacc agcauacagt t 21 <210> 308 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 316 ccggugguca cucuguaugt t 21 <210> 317 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 317 agagugacca ccgggaaaut t 21 <210> 318 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 318 auuucccggu ggucacucut t 21 <210> 319 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 319 agagugacca ccgggaaaut t 21 <210> 320 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 320 auuucccggu ggucacucut t 21 <210> 321 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 321 gagugaccac cgggaaauct t 21 <210> 322 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 322 gauuucccgg uggucacuct t 21 <210> 323 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gagugaccac cgggaaauct t 21 <210> 324 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 324 gauuucccgg uggucacuct t 21 <210> 325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 325 gugaccaccg ggaaaucgat t 21 <210> 326 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 326 ucgauuuccc gguggucact t 21 <210> 327 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 327 gugaccaccg ggaaaucgat t 21 <210> 328 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 328 ucgauuuccc gguggucact t 21 <210> 329 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 329 gaccaccggg aaaucgaggt t 21 <210> 330 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 330 ccucgauuuc ccggugguct t 21 <210> 331 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 331 gaccaccggg aaaucgaggt t 21 <210> 332 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 332 ccucgauuuc ccggugguct t 21 <210> 333 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 333 accaccggga aaucgagggt t 21 <210> 334 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 334 cccucgauuu cccgguggut t 21 <210> 335 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 335 accaccggga aaucgagggt t 21 <210> 336 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 336 cccucgauuu cccgguggut t 21 <210> 337 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 337 ccaccgggaa aucgagggct t 21 <210> 338 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 338 gcccucgauu ucccgguggt t 21 <210> 339 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 339 ccaccgggaa aucgagggct t 21 <210> 340 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 340 gcccucgauu ucccgguggt t 21 <210> 341 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 341 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 342 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 342 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 343 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 343 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 344 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 344 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 345 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 345 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 346 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 346 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 347 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 347 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 348 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 348 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 349 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 349 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 350 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 350 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 351 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 351 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 352 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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oligonucleotide <400> 356 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 357 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 357 aaaucgaggg cagggucaut t 21 <210> 358 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 358 augacccugc ccucgauuut t 21 <210> 359 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 359 cggcacccuc auaggccugt t 21 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 360 caggccuaug agggugccgt t 21 <210> 361 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 361 cggcacccuc auaggccugt t 21 <210> 362 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 362 caggccuaug agggugccgt t 21 <210> 363 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 363 cggcacccuc auaggccugt t 21 <210> 364 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 364 caggccuaug agggugccgt t 21 <210> 365 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 365 cggcacccuc auaggccugt t 21 <210> 366 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 366 caggccuaug agggugccgt t 21 <210> 367 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 367 cggcacccuc auaggccugt t 21 <210> 368 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 368 caggccuaug 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<210> 373 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 373 aucgagggca gggucauggt t 21 <210> 374 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 374 ccaugacccu gcccucgaut t 21 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 375 aucgagggca gggucauggt t 21 <210> 376 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 376 ccaugacccu gcccucgaut t 21 <210> 377 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 377 cgagggcagg gucaugguct t 21 <210> 378 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 378 gaccaugacc cugcccucgt t 21 <210> 379 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 379 gagggcaggg ucauggucat t 21 <210> 380 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 380 ugaccaugac ccugcccuct t 21 <210> 381 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 381 gagggcaggg ucauggucat t 21 <210> 382 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 382 ugaccaugac ccugcccuct t 21 <210> 383 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 383 gggcaggguc auggucacct t 21 <210> 384 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 384 ggugaccaug acccugccct t 21 <210> 385 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 393 agggucaugg ucaccgacut t 21 <210> 394 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 394 agucggugac caugacccut t 21 <210> 395 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 395 auggucaccg acuucgagat t 21 <210> 396 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 396 ucucgaaguc ggugaccaut t 21 <210> 397 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 397 auggucaccg acuucgagat t 21 <210> 398 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 398 ucucgaaguc ggugaccaut t 21 <210> 399 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 399 ccgacuucga gaaugugcct t 21 <210> 400 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 400 ggcacauucu cgaagucggt t 21 <210> 401 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 401 ggaggacggg acccgcuuct t 21 <210> 402 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 402 gaagcggguc ccguccucct t 21 <210> 403 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 403 cagcggccgg gaugccggct t 21 <210> 404 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 404 gccggcaucc cggccgcugt t 21 <210> 405 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 405 cagcggccgg gaugccggct t 21 <210> 406 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 406 gccggcaucc cggccgcugt t 21 <210> 407 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 407 gggugccagc augcgcagct t 21 <210> 408 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 408 gcugcgcaug cuggcaccct t 21 <210> 409 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 409 ccugcgcgug cucaacugct t 21 <210> 410 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 410 gcaguugagc acgcgcaggt t 21 <210> 411 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 411 ccugcgcgug cucaacugct t 21 <210> 412 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 412 gcaguugagc acgcgcaggt t 21 <210> 413 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 413 ugcgcgugcu caacugccat t 21 <210> 414 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 414 uggcaguuga gcacgcgcat t 21 <210> 415 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 415 ugcgcgugcu caacugccat t 21 <210> 416 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 416 uggcaguuga gcacgcgcat t 21 <210> 417 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 417 cgcgugcuca acugccaagt t 21 <210> 418 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 418 cuuggcaguu gagcacgcgt t 21 <210> 419 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 419 cgcgugcuca acugccaagt t 21 <210> 420 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 420 cuuggcaguu gagcacgcgt t 21 <210> 421 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 421 cugccaaggg aagggcacgt t 21 <210> 422 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 422 cgugcccuuc ccuuggcagt t 21 <210> 423 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 423 cugccaaggg aagggcacgt t 21 <210> 424 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 424 cgugcccuuc ccuuggcagt t 21 <210> 425 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 425 caagggaagg gcacgguuat t 21 <210> 426 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 426 uaaccgugcc cuucccuugt t 21 <210> 427 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 427 aagggaaggg cacgguuagt t 21 <210> 428 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 428 cuaaccgugc ccuucccuut t 21 <210> 429 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 429 agggaagggc acgguuagct t 21 <210> 430 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 430 gcuaaccgug cccuucccut t 21 <210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 gggaagggca cgguuagcgt t 21 <210> 432 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 cgcuaaccgu gcccuuccct t 21 <210> 433 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 433 ggaagggcac gguuagcggt t 21 <210> 434 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 434 ccgcuaaccg ugcccuucct t 21 <210> 435 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 435 gaagggcacg guuagcggct t 21 <210> 436 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 436 gccgcuaacc gugcccuuct t 21 <210> 437 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 437 aagggcacgg uuagcggcat t 21 <210> 438 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 438 ugccgcuaac cgugcccuut t 21 <210> 439 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 439 agggcacggu uagcggcact t 21 <210> 440 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gugccgcuaa ccgugcccut t 21 <210> 441 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 441 cacgguuagc ggcacccuct t 21 <210> 442 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 442 gagggugccg cuaaccgugt t 21 <210> 443 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 443 acgguuagcg gcacccucat t 21 <210> 444 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 444 ugagggugcc gcuaaccgut t 21 <210> 445 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 445 guuagcggca cccucauagt t 21 <210> 446 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 446 cuaugagggu gccgcuaact t 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 uuagcggcac ccucauaggt t 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 ccuaugaggg ugccgcuaat t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 449 gcggcacccu cauaggccut t 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 450 aggccuauga gggugccgct t 21 <210> 451 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 451 gcacccucau aggccuggat t 21 <210> 452 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 452 uccaggccua ugagggugct t 21 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 454 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 454 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 455 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 455 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 456 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 456 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 457 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 457 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 458 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 458 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 459 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 459 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 460 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 460 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 461 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 461 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 462 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 462 uuccgaauaa cuccaggctt 20 <210> 463 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 463 cuggaguuua uucggaaaat t 21 <210> 464 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 464 uuuuccgaau aaacuccagt t 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 465 cuggaguuua uucggaaaat t 21 <210> 466 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 466 uuuuccgaau aaacuccagt t 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 467 ggaguuuauu cggaaaagct t 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 468 gcuuuuccga auaaacucct t 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 469 ggaguuuauu cggaaaagct t 21 <210> 470 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 470 gcuuuuccga auaaacucct t 21 <210> 471 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 471 gaguuuauuc ggaaaagcct t 21 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 472 ggcuuuuccg aauaaacuct t 21 <210> 473 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 473 gaguuuauuc ggaaaagcct t 21 <210> 474 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 474 ggcuuuuccg aauaaacuct t 21 <210> 475 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 475 uuauucggaa aagccagcut t 21 <210> 476 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 476 agcuggcuuu uccgaauaat t 21 <210> 477 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 477 uuauucggaa aagccagcut t 21 <210> 478 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 agcuggcuuu uccgaauaat t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 cccuggcggg uggguacagt t 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 480 cuguacccac ccgccagggt t 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 cccuggcggg uggguacagt t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 482 cuguacccac ccgccagggt t 21 <210> 483 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 483 ccuggcgggu ggguacagct t 21 <210> 484 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 484 gcuguaccca cccgccaggt t 21 <210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 485 uggcgggugg guacagccgt t 21 <210> 486 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 494 gaggacgcgg cuguacccat t 21 <210> 495 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 495 gccgcguccu caacgccgct t 21 <210> 496 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 496 gcggcguuga ggacgcggct t 21 <210> 497 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 497 ccgcguccuc aacgccgcct t 21 <210> 498 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 498 ggcggcguug aggacgcggt t 21 <210> 499 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 499 gucgugcugg ucaccgcugt t 21 <210> 500 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 500 cagcggugac cagcacgact t 21 <210> 501 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 501 gucgugcugg ucaccgcugt t 21 <210> 502 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 502 cagcggugac cagcacgact t 21 <210> 503 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 503 ucgugcuggu caccgcugct t 21 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 504 gcagcgguga ccagcacgat t 21 <210> 505 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 505 ucgugcuggu caccgcugct t 21 <210> 506 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 506 gcagcgguga ccagcacgat t 21 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 507 uggucaccgc ugccggcaat t 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 uugccggcag cggugaccat t 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 509 uggucaccgc ugccggcaat t 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 510 uugccggcag cggugaccat t 21 <210> 511 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 511 ggucaccgcu gccggcaact t 21 <210> 512 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 512 guugccggca gcggugacct t 21 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 513 ggucaccgcu gccggcaact t 21 <210> 514 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 514 guugccggca gcggugacct t 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 caccgcugcc ggcaacuuct t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 gaaguugccg gcagcggugt t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 caccgcugcc ggcaacuuct t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 gaaguugccg gcagcggugt t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 ccgcugccgg caacuuccgt t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 cggaaguugc cggcagcggt t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 ccgcugccgg caacuuccgt t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 cggaaguugc 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<210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 527 gcugccggca acuuccgggt t 21 <210> 528 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 528 cccggaaguu gccggcagct t 21 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 529 gcugccggca acuuccgggt t 21 <210> 530 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 530 cccggaaguu gccggcagct t 21 <210> 531 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 535 ggcaacuucc gggacgaugt t 21 <210> 536 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 536 caucgucccg gaaguugcct t 21 <210> 537 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 537 ggcaacuucc gggacgaugt t 21 <210> 538 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 538 caucgucccg gaaguugcct t 21 <210> 539 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 ggacgaugcc ugccucuact t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 guagaggcag gcaucgucct t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 gcucccgagg ucaucacagt t 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 cugugaugac cucgggagct t 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 571 gacaucauug gugccuccat t 21 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 572 uggaggcacc aaugauguct t 21 <210> 573 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 573 gacaucauug gugccuccat t 21 <210> 574 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 574 uggaggcacc aaugauguct t 21 <210> 575 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 575 ucauuggugc cuccagcgat t 21 <210> 576 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 576 ucgcuggagg caccaaugat t 21 <210> 577 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 577 ucauuggugc cuccagcgat t 21 <210> 578 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 578 ucgcuggagg caccaaugat t 21 <210> 579 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 608 ugacaucuuu ggcagagaat t 21 <210> 609 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 609 cucugccaaa gaugucauct t 21 <210> 610 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 610 gaugacaucu uuggcagagt t 21 <210> 611 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 611 cucugccaaa gaugucauct t 21 <210> 612 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 612 gaugacaucu uuggcagagt t 21 <210> 613 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 613 cugaggacca gcggguacut t 21 <210> 614 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 614 aguacccgcu gguccucagt t 21 <210> 615 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 615 cugaggacca gcggguacut t 21 <210> 616 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 616 aguacccgcu gguccucagt t 21 <210> 617 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 617 ugaggaccag cggguacugt t 21 <210> 618 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 618 caguacccgc ugguccucat t 21 <210> 619 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 619 ugaggaccag cggguacugt t 21 <210> 620 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 620 caguacccgc ugguccucat t 21 <210> 621 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 621 acuguauggu cagcacacut t 21 <210> 622 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 622 agugugcuga ccauacagut t 21 <210> 623 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 623 uguaugguca gcacacucgt t 21 <210> 624 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 624 cgagugugcu gaccauacat t 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 guauggucag cacacucggt t 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 626 ccgagugugc ugaccauact t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 627 ggauggccac agccgucgct t 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 628 gcgacggcug uggccaucct t 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 629 gauggccaca gccgucgcct t 21 <210> 630 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 630 ggcgacggcu guggccauct t 21 <210> 631 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 631 caagcugguc ugccgggcct t 21 <210> 632 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 632 ggcccggcag accagcuugt t 21 <210> 633 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 633 cugccgggcc cacaacgcut t 21 <210> 634 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 634 agcguugugg gcccggcagt t 21 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 635 cugccgggcc cacaacgcut t 21 <210> 636 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 640 aagcguugug ggcccggcat t 21 <210> 641 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 641 ccgggcccac aacgcuuuut t 21 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 642 aaaagcguug ugggcccggt t 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 643 ccgggcccac aacgcuuuut t 21 <210> 644 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 644 aaaagcguug ugggcccggt t 21 <210> 645 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 645 gggcccacaa cgcuuuuggt t 21 <210> 646 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 646 ccaaaagcgu ugugggccct t 21 <210> 647 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 647 gggcccacaa cgcuuuuggt t 21 <210> 648 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 648 ccaaaagcgu ugugggccct t 21 <210> 649 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 649 ggugagggug ucuacgccat t 21 <210> 650 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 650 uggcguagac acccucacct t 21 <210> 651 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 651 ggugagggug ucuacgccat t 21 <210> 652 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 652 uggcguagac acccucacct t 21 <210> 653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 653 gagggugucu acgccauugt t 21 <210> 654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 654 caauggcgua gacacccuct t 21 <210> 655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 655 gagggugucu acgccauugt t 21 <210> 656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 656 caauggcgua gacacccuct t 21 <210> 657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 657 gccaggugcu gccugcuact t 21 <210> 658 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 658 guagcaggca gcaccuggct t 21 <210> 659 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 659 gccaggugcu gccugcuact t 21 <210> 660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 660 guagcaggca gcaccuggct t 21 <210> 661 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 661 ccaggugcug ccugcuacct t 21 <210> 662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 662 gguagcaggc agcaccuggt t 21 <210> 663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 663 ccaggugcug ccugcuacct t 21 <210> 664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 664 gguagcaggc agcaccuggt t 21 <210> 665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 665 acccacaagc cgccugugct t 21 <210> 666 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 666 gcacaggcgg cuugugggut t 21 <210> 667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 667 gugcugaggc cacgagguct t 21 <210> 668 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 668 gaccucgugg ccucagcact t 21 <210> 669 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 669 gugcugaggc cacgagguct t 21 <210> 670 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 670 gaccucgugg ccucagcact t 21 <210> 671 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 671 ugcugaggcc acgaggucat t 21 <210> 672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 672 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 685 ugcugaggcc acgaggucat t 21 <210> 686 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 686 ugaccucgug gccucagcat t 21 <210> 687 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 687 ugcugaggcc acgaggucat t 21 <210> 688 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 688 ugaccucgug gccucagcat t 21 <210> 689 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 689 ugcugaggcc acgaggucat t 21 <210> 690 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 690 ugaccucgug gccucagcat t 21 <210> 691 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 691 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 692 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 692 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 693 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 693 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 694 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 694 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 695 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 695 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 696 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 696 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 697 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 697 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 698 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 698 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 699 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 699 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 700 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 700 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 701 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 701 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 702 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 702 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 703 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 703 guggucagcg gccgggaugt t 21 <210> 704 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 704 caucccggcc gcugaccact t 21 <210> 705 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 705 ggccacgagg ucagcccaat t 21 <210> 706 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 706 uugggcugac cucguggcct t 21 <210> 707 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 707 cgaggucagc ccaaccagut t 21 <210> 708 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 708 acugguuggg cugaccucgt t 21 <210> 709 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 709 gucagcccaa ccagugcgut t 21 <210> 710 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 710 acgcacuggu ugggcugact t 21 <210> 711 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 711 cagcccaacc agugcguggt t 21 <210> 712 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 712 ccacgcacug guugggcugt t 21 <210> 713 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 725 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 726 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 726 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 727 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 727 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 728 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 728 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 729 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 729 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 730 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 730 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 731 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 731 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 732 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 732 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 733 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 733 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 734 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 734 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 735 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 735 agucaaggag cauggaauct t 21 <210> 736 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 736 gauuccaugc uccuugacut t 21 <210> 737 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 766 guguugucua cggcguaggt t 21 <210> 767 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 767 cuacgccgua gacaacacgt t 21 <210> 768 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 768 cguguugucu acggcguagt t 21 <210> 769 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 769 uacgccguag acaacacgut t 21 <210> 770 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 774 cacacguguu gucuacggct t 21 <210> 775 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 775 ccguagacaa cacgugugut t 21 <210> 776 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 776 acacacgugu ugucuacggt t 21 <210> 777 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 777 cguagacaac acguguguat t 21 <210> 778 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 778 uacacacgug uugucuacgt t 21 <210> 779 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 779 uagacaacac guguguagut t 21 <210> 780 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 780 acuacacacg uguugucuat t 21 <210> 781 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 781 agacaacacg uguguaguct t 21 <210> 782 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 782 gacuacacac guguugucut t 21 <210> 783 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 783 gacaacacgu guguagucat t 21 <210> 784 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 784 ugacuacaca cguguuguct t 21 <210> 785 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 785 acaacacgug uguagucagt t 21 <210> 786 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 786 cugacuacac acguguugut t 21 <210> 787 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 787 caacacgugu guagucaggt t 21 <210> 788 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 788 ccugacuaca cacguguugt t 21 <210> 789 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 789 cacgugugua gucaggagct t 21 <210> 790 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 802 cugacguccc ggcuccugat t 21 <210> 803 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 803 ucaggagccg ggacgucagt t 21 <210> 804 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 804 cugacguccc ggcuccugat t 21 <210> 805 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 805 caggagccgg gacgucagct t 21 <210> 806 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 806 gcugacgucc cggcuccugt t 21 <210> 807 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 807 caggagccgg gacgucagct t 21 <210> 808 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 808 gcugacgucc cggcuccugt t 21 <210> 809 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 809 agccgggacg ucagcacuat t 21 <210> 810 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 843 ccauggccug gcacgagggt t 21 <210> 844 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 844 cccucgugcc aggccauggt t 21 <210> 845 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 845 gaacucacuc acucugggut t 21 <210> 846 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 846 acccagagug agugaguuct t 21 <210> 847 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 851 cauucaaaca ggucgagcut t 21 <210> 852 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 852 agcucgaccu guuugaaugt t 21 <210> 853 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 853 auucaaacag gucgagcugt t 21 <210> 854 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 854 cagcucgacc uguuugaaut t 21 <210> 855 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 855 uucaaacagg ucgagcugut t 21 <210> 856 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 856 acagcucgac cuguuugaat t 21 <210> 857 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 857 ucaaacaggu cgagcugugt t 21 <210> 858 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 858 cacagcucga ccuguuugat t 21 <210> 859 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 859 caaacagguc gagcugugct t 21 <210> 860 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 860 gcacagcucg accuguuugt t 21 <210> 861 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 861 aaacaggucg agcugugcut t 21 <210> 862 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 862 agcacagcuc gaccuguuut t 21 <210> 863 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 863 aacaggucga gcugugcuct t 21 <210> 864 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 864 gagcacagcu cgaccuguut t 21 <210> 865 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 865 caggucgagc ugugcucggt t 21 <210> 866 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 866 ccgagcacag cucgaccugt t 21 <210> 867 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 867 aggucgagcu gugcucgggt t 21 <210> 868 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 868 cccgagcaca gcucgaccut t 21 <210> 869 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 869 gucgagcugu gcucgggugt t 21 <210> 870 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 870 cacccgagca cagcucgact t 21 <210> 871 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 879 ucccaaugug ccgaugucct t 21 <210> 880 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 880 ggacaucggc acauugggat t 21 <210> 881 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 881 ccaaugugcc gauguccgut t 21 <210> 882 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 882 acggacaucg gcacauuggt t 21 <210> 883 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 883 caaugugccg auguccgugt t 21 <210> 884 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 884 cacggacauc ggcacauugt t 21 <210> 885 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 885 aaugugccga uguccguggt t 21 <210> 886 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 886 ccacggacau cggcacauut t 21 <210> 887 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 887 ccgauguccg ugggcagaat t 21 <210> 888 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 888 uucugcccac ggacaucggt t 21 <210> 889 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 889 gauguccgug ggcagaaugt t 21 <210> 890 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 890 cauucugccc acggacauct t 21 <210> 891 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 920 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 921 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 921 caccaaggag gcaggauuct t 21 <210> 922 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 922 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 923 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 923 caccaaggag gcaggauuct t 21 <210> 924 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 928 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 929 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 929 caccaaggag gcaggauuct t 21 <210> 930 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 930 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 931 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 931 caccaaggag gcaggauuct t 21 <210> 932 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 932 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 933 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 933 caccaaggag gcaggauuct t 21 <210> 934 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 934 gaauccugcc uccuuggugt t 21 <210> 935 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 935 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 936 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 936 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 937 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 937 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 938 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 938 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 939 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 939 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 940 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 940 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 941 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 941 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 942 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 942 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 943 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 943 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 944 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 944 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 945 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 945 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 946 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 946 uccgaauaaa cuccaggcct t 21 <210> 947 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 947 ggccuggagu uuauucggat t 21 <210> 948 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 956 cccaacgaug uuugucccut t 21 <210> 957 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 957 cccucaucuc cagcuaacut t 21 <210> 958 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 958 aguuagcugg agaugagggt t 21 <210> 959 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 959 caucuccagc uaacuguggt t 21 <210> 960 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 960 ccacaguuag cuggagaugt t 21 <210> 961 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 961 gcucccugau uaauggaggt t 21 <210> 962 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 962 ccuccauuaa ucagggagct t 21 <210> 963 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 963 cccugauuaa uggaggcuut t 21 <210> 964 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 964 aagccuccau uaaucagggt t 21 <210> 965 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 965 ccugauuaau ggaggcuuat t 21 <210> 966 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 966 uaagccucca uuaaucaggt t 21 <210> 967 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 967 ugauuaaugg aggcuuagct t 21 <210> 968 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 968 gcuaagccuc cauuaaucat t 21 <210> 969 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 969 gauuaaugga ggcuuagcut t 21 <210> 970 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 970 agcuaagccu ccauuaauct t 21 <210> 971 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 971 auuaauggag gcuuagcuut t 21 <210> 972 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 972 aagcuaagcc uccauuaaut t 21 <210> 973 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 973 uuaauggagg cuuagcuuut t 21 <210> 974 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 974 aaagcuaagc cuccauuaat t 21 <210> 975 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 975 uuucuggaug gcaucuagct t 21 <210> 976 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 997 ccugagccac cuuuacucut t 21 <210> 998 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 998 agaguaaagg uggcucaggt t 21 <210> 999 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 999 ugagccaccu uuacucugct t 21 <210> 1000 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1000 gcagaguaaa gguggcucat t 21 <210> 1001 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1009 augccaggcu gugcuagcat t 21 <210> 1010 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1010 ugcuagcaca gccuggcaut t 21 <210> 1011 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1011 aggcugugcu agcaacacct t 21 <210> 1012 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1012 gguguugcua gcacagccut t 21 <210> 1013 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1013 cugugcuagc aacacccaat t 21 <210> 1014 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1014 uuggguguug cuagcacagt t 21 <210> 1015 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1015 gcuagcaaca cccaaaggut t 21 <210> 1016 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1016 accuuugggu guugcuagct t 21 <210> 1017 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1017 ggagccauca ccuaggacut t 21 <210> 1018 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1018 aguccuaggu gauggcucct t 21 <210> 1019 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1019 caccuaggac ugacucggct t 21 <210> 1020 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1020 gccgagucag uccuaggugt t 21 <210> 1021 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1089 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1090 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1090 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1091 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1091 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1092 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1092 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1093 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1093 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1094 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1094 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1095 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1095 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1096 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1096 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1097 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1097 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1098 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1098 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1099 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1099 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1100 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1101 ugguucccug aggaccagct t 21 <210> 1102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1102 gcugguccuc agggaaccat t 21 <210> 1103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1103 ucuucuuacu ucacccggct t 21 <210> 1104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1104 gccgggugaa guaagaagat t 21 <210> 1105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1105 cuucuuacuu cacccggcut t 21 <210> 1106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1106 agccggguga aguaagaagt t 21 <210> 1107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1107 uucuuacuuc acccggcugt t 21 <210> 1108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1108 cagccgggug aaguaagaat t 21 <210> 1109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1109 gggcuccuca uuuuuacggt t 21 <210> 1110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1110 ccguaaaaau gaggagccct t 21 <210> 1111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1111 ggcuccucau uuuuacgggt t 21 <210> 1112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1112 cccguaaaaa ugaggagcct t 21 <210> 1113 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1125 auuuuuacgg guaacagugt t 21 <210> 1126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1126 cacuguuacc cguaaaaaut t 21 <210> 1127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1127 uuuacgggua acagugaggt t 21 <210> 1128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1128 ccucacuguu acccguaaat t 21 <210> 1129 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1169 acugucccuc cuugagcact t 21 <210> 1170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1170 gugcucaagg agggacagut t 21 <210> 1171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 acugucccuc cuugagcact t 21 <210> 1172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1172 gugcucaagg agggacagut t 21 <210> 1173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1173 cugucccucc uugagcacct t 21 <210> 1174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1174 ggugcucaag gagggacagt t 21 <210> 1175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1175 cugucccucc uugagcacct t 21 <210> 1176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1176 ggugcucaag gagggacagt t 21 <210> 1177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1177 acauuuaucu uuugggucut t 21 <210> 1178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1178 agacccaaaa gauaaaugut t 21 <210> 1179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1179 acauuuaucu uuugggucut t 21 <210> 1180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1180 agacccaaaa gauaaaugut t 21 <210> 1181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1181 acauuuaucu uuugggucut t 21 <210> 1182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1182 agacccaaaa gauaaaugut t 21 <210> 1183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1183 acauuuaucu uuugggucut t 21 <210> 1184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1184 agacccaaaa gauaaaugut t 21 <210> 1185 <211> 21 <212> DNA <213> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1241 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1242 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1243 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1244 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1245 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1246 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1247 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1248 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1249 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1250 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1251 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1252 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1253 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1254 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1255 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1256 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1257 cauaggccug gaguuuauut t 21 <210> 1258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1258 aauaaacucc aggccuaugt t 21 <210> 1259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1259 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1260 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1261 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1262 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1263 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1264 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1265 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1266 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1267 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1268 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1269 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1270 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1271 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1272 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1273 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1273 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1274 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1275 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1275 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1276 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1277 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1277 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1278 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1278 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1279 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1280 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1281 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1282 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1283 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1284 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1285 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1285 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1286 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1286 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1287 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1287 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1288 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1288 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1289 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1289 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1290 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1290 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1291 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1291 ugaagauauu uauucugggt t 21 <210> 1292 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1292 cccagaauaa auaucuucat t 21 <210> 1293 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1293 ugaagauauu uauucugggt t 21 <210> 1294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1294 cccagaauaa auaucuucat t 21 <210> 1295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1295 ucuggguuuu guagcauuut t 21 <210> 1296 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1296 aaaugcuaca aaacccagat t 21 <210> 1297 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1297 ucuggguuuu guagcauuut t 21 <210> 1298 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1298 aaaugcuaca aaacccagat t 21 <210> 1299 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1299 auaaaaacaa acaaacguut t 21 <210> 1300 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1300 aacguuuguu uguuuuuaut t 21 <210> 1301 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1301 aaacaaacaa acguugucct t 21 <210> 1302 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1302 ggacaacguu uguuuguuut t 21 <210> 1303 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1303 aacaaacaaa cguuguccut t 21 <210> 1304 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1304 aggacaacgu uuguuuguut t 21 <210> 1305 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1305 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1306 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1306 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1307 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1307 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1308 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1308 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1309 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1309 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1310 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1310 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1311 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1311 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1312 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1312 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1313 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1313 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1314 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1314 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1315 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1315 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1316 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1316 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1317 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1317 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1318 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1318 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1319 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1319 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1320 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1320 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1321 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1321 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1322 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1322 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1323 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1323 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1324 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1324 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1325 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1326 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1326 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1327 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1327 gccuggaguu uauucggaa 19 <210> 1328 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1328 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 1329 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1329 gccuggaguu uauucggaaa 20 <210> 1330 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1330 uuuccgaaua aacuccaggc cu 22 <210> 1331 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1331 gccuggaguu uauucggaaa a 21 <210> 1332 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1332 uuuuccgaau aaacuccagg ccu 23 <210> 1333 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1333 gccuggaguu uauucggaaa ag 22 <210> 1334 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1334 cuuuuccgaa uaaacuccag gccu 24 <210> 1335 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> 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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1495 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1496 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1496 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 1497 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1497 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1498 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1498 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 1499 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1499 gccuggaguu uauucggaa 19 <210> 1500 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1500 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 1501 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1501 gccuggaggu uuauucggaa 20 <210> 1502 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1502 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 1503 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1503 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1504 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1505 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1505 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1506 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1506 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1507 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1508 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1509 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1510 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1511 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1511 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1512 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1512 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1513 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1514 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1514 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1515 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1516 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1517 agguguaucu ccuagacact t 21 <210> 1518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1518 gugucuagga gauacaccut t 21 <210> 1519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1519 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 1520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1520 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 1521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1521 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1522 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 1523 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1523 uucuagaccu guuuugcuu 19 <210> 1524 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1524 gccuggaguu uauucggaa 19 <210> 1525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1525 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1526 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1527 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1528 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1528 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1529 ucauaggccu ggaguuuaut t 21 <210> 1530 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1530 auaaacucca ggccuaugat t 21 <210> 1531 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1531 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1532 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1532 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1533 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1533 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1534 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1534 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1535 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1535 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1536 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1536 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1537 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1537 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1538 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1538 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1539 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1539 uucuagacug uuuugcuutt 20 <210> 1540 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1540 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1541 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1541 uucuagacnu 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1545 uucuagaccn guuuugcuut t 21 <210> 1546 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1546 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1547 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1547 uucuagaccn guuuugcuut t 21 <210> 1548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1548 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1549 uucuagaccu nuuuugcuut t 21 <210> 1550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1550 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1551 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1551 uucuagaccu nuuuugcuut t 21 <210> 1552 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1552 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1553 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1553 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1554 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1554 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1555 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1555 uucuagaccu guuuugcuut t 21 <210> 1556 <211> 21 <212> DNA <213> 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oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1563 uucuagacnu guuuugcuut t 21 <210> 1564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1564 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1565 uucuagaccn guuuugcuut t 21 <210> 1566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1566 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1567 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1567 uucuagaccn guuuugcuut t 21 <210> 1568 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1568 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1569 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1569 uucuagaccu nuuuugcuut t 21 <210> 1570 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1570 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1571 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> difluorotoluyl ribo(or deoxyribo)nucleotide <400> 1571 uucuagaccu nuuuugcuut t 21 <210> 1572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1572 aagcaaaaca ggucuagaat t 21 <210> 1573 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 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gaauaaauau cuucaaguut t 21 <210> 1645 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1645 acuugaagau auuuauucut t 21 <210> 1646 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1646 agaauaaaua ucuucaagut t 21 <210> 1647 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1647 cuugaagaua uuuauucugt t 21 <210> 1648 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1648 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cccagaauaa auaucuucat t 21 <210> 1653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1653 gaagauauuu auucugggut t 21 <210> 1654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1654 acccagaaua aauaucuuct t 21 <210> 1655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1655 cagccaacuu uucuagacct t 21 <210> 1656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1656 ggucuagaaa aguuggcugt t 21 <210> 1657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1657 agccaacuuu ucuagaccut t 21 <210> 1658 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1658 aggucuagaa aaguuggcut t 21 <210> 1659 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1659 gccaacuuuu cuagaccugt t 21 <210> 1660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1660 caggucuaga aaaguuggct t 21 <210> 1661 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1661 ccaacuuuuc uagaccugut t 21 <210> 1662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1662 acaggucuag aaaaguuggt t 21 <210> 1663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1663 caacuuuucu agaccuguut t 21 <210> 1664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1664 aacaggucua gaaaaguugt t 21 <210> 1665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1665 aacuuuucua gaccuguuut t 21 <210> 1666 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1666 aaacaggucu agaaaaguut t 21 <210> 1667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1667 acuuuucuag accuguuuut t 21 <210> 1668 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1668 aaaacagguc uagaaaagut t 21 <210> 1669 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1669 cuuuucuaga ccuguuuugt t 21 <210> 1670 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1670 caaaacaggu cuagaaaagt t 21 <210> 1671 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1671 uuuucuagac cuguuuugct t 21 <210> 1672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1672 gcaaaacagg ucuagaaaat t 21 <210> 1673 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1673 uuucuagacc uguuuugcut t 21 <210> 1674 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1674 agcaaaacag gucuagaaat t 21 <210> 1675 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1675 ucuagaccug uuuugcuuut t 21 <210> 1676 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1676 aaagcaaaac aggucuagat t 21 <210> 1677 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1677 cuagaccugu uuugcuuuut t 21 <210> 1678 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1678 aaaagcaaaa caggucuagt t 21 <210> 1679 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1679 uagaccuguu uugcuuuugt t 21 <210> 1680 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1680 caaaagcaaa acaggucuat t 21 <210> 1681 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1681 agaccuguuu ugcuuuugut t 21 <210> 1682 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1682 acaaaagcaa aacaggucut t 21 <210> 1683 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1683 gaccuguuuu gcuuuuguat t 21 <210> 1684 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1684 uacaaaagca aaacagguct t 21 <210> 1685 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1685 accuguuuug cuuuuguaat t 21 <210> 1686 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1686 uuacaaaagc aaaacaggut t 21 <210> 1687 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1687 ccuguuuugc uuuuguaact t 21 <210> 1688 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1688 guuacaaaag caaaacaggt t 21 <210> 1689 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1689 cuguuuugcu uuuguaacut t 21 <210> 1690 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1690 aguuacaaaa gcaaaacagt t 21 <210> 1691 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1691 uguuuugcuu uuguaacuut t 21 <210> 1692 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1692 aaguuacaaa agcaaaacat t 21 <210> 1693 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1693 guuuugcuuu uguaacuugt t 21 <210> 1694 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1694 caaguuacaa aagcaaaact t 21 <210> 1695 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1695 uuuugcuuuu guaacuugat t 21 <210> 1696 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1696 ucaaguuaca aaagcaaaat t 21 <210> 1697 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1697 uuugcuuuug uaacuugaat t 21 <210> 1698 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1698 uucaaguuac aaaagcaaat t 21 <210> 1699 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1699 uugcuuuugu aacuugaagt t 21 <210> 1700 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1700 cuucaaguua caaaagcaat t 21 <210> 1701 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1701 ugcuuuugua acuugaagat t 21 <210> 1702 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1702 ucuucaaguu acaaaagcat t 21 <210> 1703 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1703 gcuuuuguaa cuugaagaut t 21 <210> 1704 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1704 aucuucaagu uacaaaagct t 21 <210> 1705 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1705 cuuuuguaac uugaagauat t 21 <210> 1706 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1706 uaucuucaag uuacaaaagt t 21 <210> 1707 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1707 uuuuguaacu ugaagauaut t 21 <210> 1708 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1708 auaucuucaa guuacaaaat t 21 <210> 1709 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1709 uuuguaacuu gaagauauut t 21 <210> 1710 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1710 aauaucuuca aguuacaaat t 21 <210> 1711 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1711 uuguaacuug aagauauuut t 21 <210> 1712 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1712 aaauaucuuc aaguuacaat t 21 <210> 1713 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1713 uguaacuuga agauauuuat t 21 <210> 1714 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1714 uaaauaucuu caaguuacat t 21 <210> 1715 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1715 guaacuugaa gauauuuaut t 21 <210> 1716 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1716 auaaauaucu ucaaguuact t 21 <210> 1717 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1717 uaacuugaag auauuuauut t 21 <210> 1718 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1718 aauaaauauc uucaaguuat t 21 <210> 1719 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1719 aacuugaaga uauuuauuct t 21 <210> 1720 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1720 gaauaaauau cuucaaguut t 21 <210> 1721 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1721 acuugaagau auuuauucut t 21 <210> 1722 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1722 agaauaaaua ucuucaagut t 21 <210> 1723 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1723 cuugaagaua uuuauucugt t 21 <210> 1724 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1724 cagaauaaau aucuucaagt t 21 <210> 1725 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1725 uugaagauau uuauucuggt t 21 <210> 1726 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1726 ccagaauaaa uaucuucaat t 21 <210> 1727 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1727 ugaagauauu uauucugggt t 21 <210> 1728 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1728 cccagaauaa auaucuucat t 21 <210> 1729 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1729 gaagauauuu auucugggut t 21 <210> 1730 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1730 acccagaaua aauaucuuct t 21 <210> 1731 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1731 gccuggaguu uauucggaat t 21 <210> 1732 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1732 uuccgaauaa acuccaggct t 21

Claims (43)

  1. 세포에서 인간 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한, 이중가닥 리보핵산 (dsRNA)을 포함하는 핵산 지질 입자를 포함하는 조성물로서,
    상기 핵산 지질 입자는 45-65 mol %의 양이온성 지질, 5 mol % 내지 약 10 mol %의 비-양이온성 지질, 25-40 mol %의 스테롤, 및 0.5-5 mol %의 PEG 또는 PEG 변형된 지질을 포함하는 지질 제형을 포함하고,
    상기 dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호:1523 (5'-UUCUAGACCUGUUUUGCUU-3')의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 서열을 포함하고,
    상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 상보적이고, 상기 dsRNA는 그 길이가 15 내지 30개의 염기쌍인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트)를 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 MC3를 포함하고, 상기 지질 제형은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물:
    Figure pct00088
    .
  4. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 식 A를 포함하고, 상기 식 A는,
    Figure pct00089
    이고,
    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이고, 또는 R3 및 R4는 함께 임의 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)을 포함하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 XTC를 포함하고, 상기 비-양이온성 지질은 DSPC를 포함하고, 상기 스테롤은 콜레스테롤을 포함하고, 상기 PEG 지질은 PEG-DMG를 포함하는 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 XTC를 포함하고, 상기 제형은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물:
    Figure pct00090
    .
  8. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민))를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 ALNY-100을 포함하고, 상기 제형은 하기로 이루어진 조성물:
    Figure pct00091
    .
  10. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호:1227을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호:1228을 포함하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호:1227로 이루어지고 상기 안티센스 가닥은 서열번호:1228로 이루어지는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 가닥은 소문자 "c" 또는 "u"로 나타낸 바와 같은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 소문자 "s"로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트를 포함하도록 하기와 같이 변형되는 조성물:
    dsRNA는 서열번호:1229 (5'-uucuAGAccuGuuuuGcuuTsT-3')로 이루어진 센스 가닥 및 서열번호:1230 (5'-AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT-3')로 이루어진 안티센스 가닥으로 이루어진다.
  13. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 그룹 포함 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 그룹에 연결된 말단 뉴클레오티드의 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오티드, 락킹된(locked) 뉴클레오티드, 어베이직(abasic) 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 및 뉴클레오티드 포함 비-천연 염기의 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA는 적어도 하나의 2'-O-메틸 변형된 리보뉴클레오티드, 및 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 각각의 dsRNA 가닥은 그 길이가 19-23개의 염기인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 각각의 dsRNA 가닥은 그 길이가 21-23개의 염기인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 각각의 dsRNA 가닥은 그 길이가 21개의 염기인 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 지질단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 아포지질단백질 E (ApoE)을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 dsRNA는 친지질체에 콘쥬게이트되는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 친지질체는 콜레스테롤인 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 ApoE는 적어도 하나의 양친매제와 재조합되는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 양친매제는 인지질인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 양친매제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린 (DMPC), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 에그 포스파티딜콜린 (EPC), 스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), -포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-말), 및 이들의 조합로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인지질인 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 ApoE는 재조합된 고밀도 지질단백질 (rHDL)인 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 PCSK9 발현 세포에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 PCSK9의 발현을 적어도 40%까지 억제하는 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 포유동물에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 포유동물에서 PCSK9 단백질 수준을 감소시키는 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 영장류에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 포유동물에서 LDLc 수준을 감소시키는 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 포유동물에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 PCSK9 간 mRNA 및 총 혈청 콜레스테롤 모두를 0.1 mg/kg 미만의 복용량으로 감소시키는 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 포유동물에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 PCSK9 간 mRNA를 약 0.2 mg/kg의 ED50로 감소시키고, 총 혈청 콜레스테롤을 약 0.08 mg/kg의 ED50로 감소시키는 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 포유동물에의 투여는 대조군의 투여와 비교하여 혈청 LDL 입자 수를 90% 초과까지 감소시키고 또는 혈청 HDL 입자 수를 75% 초과까지 감소시키는 조성물.
  34. 세포에서 PCSK9의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항의 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  35. 치료가 필요한 포유동물에서 LDLc 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 제1항의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 0.25 mg/kg 내지 4 mg/kg dsRNA를 함유하는 복용량이 포유동물에게 투여되는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 dsRNA는 인간에게 약 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 또는 5.0 mg/kg로 투여되는 방법.
  38. 대상체에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제1항의 조성물을 약 3 mg/kg의 첫 번째 복용량으로 투여하고, 그 다음, 적어도 하나의 차후의 복용량을 주당 1회 투여하는 것을 포함하고, 상기 차후의 복용량은 상기 첫 번째 복용량 미만인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 대상체는 랫트 또는 비-인간 영장류 또는 인간인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 PCSK9 표적화된 dsRNA는 AD-9680를 포함하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 차후의 복용량은 약 1.0　mg/kg 또는 약 0.3　mg/kg인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 차후의 복용량은 4주 동안 주당 1회 투여되는 방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 첫 번째 복용량의 투여는 총 콜레스테롤 수준을 약 15-60%까지 감소시키는 방법.
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