JP5894913B2 - Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ - Google Patents

Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ Download PDF

Info

Publication number
JP5894913B2
JP5894913B2 JP2012516211A JP2012516211A JP5894913B2 JP 5894913 B2 JP5894913 B2 JP 5894913B2 JP 2012516211 A JP2012516211 A JP 2012516211A JP 2012516211 A JP2012516211 A JP 2012516211A JP 5894913 B2 JP5894913 B2 JP 5894913B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dsrna
lipid
pcsk9
acid
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2012516211A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2012530143A (ja
Inventor
ケビン・フィッツジェラルド
グレゴリー・ヒンクル
アキン・アキンク
スチュアート・ミルスタイン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2012530143A publication Critical patent/JP2012530143A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5894913B2 publication Critical patent/JP5894913B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓＲＮＡを含む組成物、およびＰＣＳＫ９遺伝子発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法に関する。
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年６月１５日出願の米国仮特許第６１／１８７，１６９号、および２００９年６月１８日出願の米国仮特許第６１／２１８，３５０号、および２００９年９月２２日出願の米国仮特許第６１／２４４，７９０号、および２００９年１２月１１日出願の米国仮特許第６１／２８５，５９８号、および２０１０年１月８日出願の米国仮特許第６１／２９３，４７４号、および２０１０年３月１２日出願の米国仮特許第６１／３１３，５７８号の恩典を主張し、これらの全ては、全ての目的で、その全体として、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
本出願は、２０１０年ＸＸ月に作成された、ＸＸＸ，ＸＸＸバイトのサイズの１６７３３ＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のテキストファイルで電子的に提出された配列表を含む。本配列表は、参照することによって組み込まれる。
発明の背景
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。他の８つの哺乳類サブチリシンプロテアーゼＰＣＳＫ１〜ＰＣＳＫ８（ＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＣ７、およびＳ１Ｐ／ＳＫＩ−１とも呼ばれる）は、分泌経路において様々なタンパク質を処理し、多様な生物学的プロセスにおいて役割を果たすプロタンパク質転換酵素である（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｆ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４，１-２２、Ｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｋ．，（１９９８）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９，１１-１７、Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．（１９９９）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８４８，４５-６２、Ｔａｙｌｏｒ，Ｎ．Ａ．，（２００３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７，１２１５-１２２７、およびＺｈｏｕ，Ａ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２０７４５-２０７４８）．ＰＣＳＫ９はコレステロール代謝において役割を果たすことが提唱されている。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現は、コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と同様に、マウスでは、食餌コレステロール摂取により下方調節され（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４，２１０９−２１１９）、ＨｅｐＧ２細胞ではスタチンにより上方調節され、（Ｄｕｂｕｃ，Ｇ．，（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１４５４−１４５９）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスでは上方調節される（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，１２０２７−１２０３２）。さらに、ＰＣＳＫ９ミスセンス突然変異は、常染色体優性高コレステロール血症（Ｈｃｈｏｌａ３）の一形態と関連していることが分かっている（Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４−１５６、Ｔｉｍｍｓ，Ｋ．Ｍ．，（２００４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４，３４９−３５３、Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５，４１９−４２２）。ＰＣＳＫ９はまた、一般集団のＬＤＬコレステロールレベルの決定においても役割を果たしている可能性があるが、これは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、日本人の集団のコレステロールレベルと関連しているからである（Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．，（２００４）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９，１０９-１１４）。
常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は単一遺伝子疾患であり、この疾患では、患者が、総コレステロールレベルとＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫、および早期アテローム性動脈硬化症を示す（Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．，（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７９５-１８０３）。ＡＤＨと劣性型の常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４，１２１-１２７）の発病は、肝臓によるＬＤＬ取込みの欠陥が原因である。ＡＤＨは、ＬＤＬ取込みを妨げるＬＤＬＲ突然変異によって、またはＬＤＬＲに結合するＬＤＬ上のタンパク質、アポリポタンパク質Ｂの突然変異によって引き起こされることもある。ＡＲＨは、クラスリンとの相互作用を介したＬＤＬＲ−ＬＤＬ複合体のエンドサイトーシスに必要なＡＲＨタンパク質の突然変異によって引き起こされる。したがって、ＰＣＳＫ９突然変異がＨｃｈｏｌａ３家系において原因となる場合には、ＰＣＳＫ９が受容体を介するＬＤＬ取込みにおいて役割を果たしている可能性が高いと思われる。
過剰発現研究により、ＬＤＬＲレベル、したがって、肝臓によるＬＤＬ取込みを制御する上でのＰＣＳＫ９の役割が指摘されている（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，７１００-７１０５、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５-４８８７５，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０-５０６３８）。マウスにおける３日または４日間のアデノウイルス媒介性のマウスＰＣＳＫ９またはヒトＰＣＳＫ９の過剰発現は、総コレステロールレベルとＬＤＬコレステロールレベルの上昇をもたらすが、この効果は、ＬＤＬＲノックアウト動物では見られない（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，７１００-７１０５、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５-４８８７５、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０-５０６３８）。さらに、ＰＣＳＫ９過剰発現は、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベル、またはＳＲＥＢＰタンパク質の核対細胞質比には影響を及ぼさずに、肝臓ＬＤＬＲタンパク質の深刻な低下をもたらす。
ＰＣＳＫ９の機能喪失突然変異がマウスモデル（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，（２００５）ＰＮＡＳ，１０２，５３７４−５３７９）で設計され、ヒト個体（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１６１−１６５）で同定されている。両方の場合において、ＰＣＳＫ９機能の喪失は、総コレステロールとＬＤＬｃコレステロールの低減をもたらす。１５年にわたるレトロスペクティブな転帰研究では、１コピーのＰＣＳＫ９の喪失が、ＬＤＬｃレベルをより低く変化させ、心血管心疾患の発症からのリスク便益保護の増大をもたらすことが示された（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５４：１２６４−１２７２）。
近年、二重鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構において遺伝子発現を阻止することが示されている。国際公開第ＷＯ ９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）には、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において遺伝子の発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開第ＷＯ ９９／５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、および第ＷＯ ９９／６１６３１号、Ｈｅｉｆｅｔｚ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照されたい））、ならびに哺乳類（国際公開第ＷＯ ００／４４８９５号、Ｌｉｍｍｅｒ、および独国特許第１０１ ００ ５８６．５号、Ｋｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）を含む、他の生物において標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然の機構は、今では、遺伝子の異常なまたは望ましくない調節によって引き起こされる障害を治療するための新しい部類の薬学的薬剤の開発の焦点となっている。
ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの説明は、米国特許第７，６０５，２５１号および国際公開第ＷＯ ２００７／１３４１６１号において見出すことができる。追加の開示は、米国特許公報第２０１０／００１００６６号および国際公開第ＷＯ ２００９／１３４４８７号において見出すことができる。
以下でより詳細に説明されるとおり、本明細書において、ＰＣＳＫ９を標的とする脂質で製剤化されたｓｉＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９を標的とするＭＣ３で製剤化されたｓｉＲＮＡを含む、組成物を開示する。また、ＰＣＳＫ９発現の阻害のため、およびＰＣＳＫ９発現に関連する病理、例えば、高脂血症の処置のために、本組成物を使用する方法も開示する。
したがって、本発明の一態様は、細胞において、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、核酸脂質粒子は、４５〜６５ｍｏｌ％のカチオン性脂質と、５ｍｏｌ％から約１０ｍｏｌ％の非カチオン性脂質と、２５〜４０ｍｏｌ％のステロールと、０．５〜５ｍｏｌ％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む、脂質製剤を含み、ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とから成り、センス鎖は、第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１５２３（５’−ＵＵＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵ−３’）の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な第２の配列を含み、第１の配列は、第２の配列に相補的であり、ｄｓＲＮＡは、１５〜３０塩基対長である。
本明細書に説明されるとおり、本組成物は、カチオン性脂質を含む。一実施形態において、カチオン性脂質は、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートを含む。例えば、脂質製剤は、以下から選択することができる。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
他の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ａを含み、式Ａは、
Figure 0005894913
 、
または
Figure 0005894913
 、
または
Figure 0005894913
 である。
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニルであり、各々は、任意に置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、任意に置換された複素環式環を形成することができる。一部の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ａを含み、かつＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。脂質製剤は、カチオン性脂質ＸＴＣ、非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、ステロールコレステロール、およびＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧを含むことができる。他の実施形態において、カチオン性脂質は、ＸＴＣを含み、製剤は、以下から成る群より選択される。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
なおさらなる実施形態において、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））を含む。例えば、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００を含み、製剤は、５０／１０／３８．５／１．５の比において、ＡＬＮＹ−１００／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧから成る。
本組成物は、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態において、センス鎖は、配列番号１２２７を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１２２８を含む。他の実施形態において、センス鎖は、配列番号１２２７から成り、アンチセンス鎖は、配列番号１２２８から成る。１つまたは両方の鎖は、修飾されてもよく、例えば、各鎖は、小文字「ｃ」または「ｕ」によって示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、および小文字「ｓ」によって示されるホスホロチオエートを含むように、以下のとおりに修飾され、ｄｓＲＮＡは、
配列番号１２２９（５’−ｕｕｃｕＡＧＡｃｃｕＧｕｕｕｕＧｃｕｕＴｓＴ−３’）から成るセンス鎖、および
配列番号１２３０（５’−ＡＡＧｃＡＡＡＡｃＡＧＧＵＣｕＡＧＡＡＴｓＴ−３’）から成るアンチセンス鎖
から成る。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結される末端ヌクレオチドの群から選択される修飾ヌクレオチドを含み、ならびに／または、例えば、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つのヌクレオチドとを含む。
本組成物は、１５〜３０塩基対長のｄｓＲＮＡを含む。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの各鎖は、１９〜２３塩基長、または、例えば、２１〜２３塩基長、または、例えば、２１塩基長である。
一態様において、本組成物は、リポタンパク質、例えば、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を含む。一部の実施形態において、本組成物は、リポタンパク質を含み、ｄｓＲＮＡは、脂質親和体、例えば、コレステロールにコンジュゲートされる。ＡｐｏＥは、少なくとも１つの両親媒性物質、例えば、リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、およびこれらの組み合わせから成る群より選択されるリン脂質で再構成することができる。一部の実施形態において、ＡｐｏＥは、高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）で再構成される。
本組成物、例えば、ＰＣＳＫ９を標的とする脂質で製剤化されたｄｓＲＮＡは、細胞もしくは対象、例えば、霊長類、例えば、ヒトに投与することができる。一態様において、本組成物の投与は、ＰＣＳＫ９の発現を、対照の投与と比較して、少なくとも４０％阻害する、ならびに／または、哺乳類において、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを、対照の投与と比較して、低減する、ならびに／または、哺乳類において、ＬＤＬｃレベルを、対照の投与と比較して、低減する、ならびに／または、０．１ｍｇ／ｋｇ未満の投与量で、ＰＣＳＫ９肝ｍＲＮＡおよび総血清コレステロールの両方を、対照の投与と比較して、低減する、ならびに／または、対照の投与と比較して、約０．２ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０で、ＰＣＳＫ９肝ｍＲＮＡを低減する、ならびに、約０．０８ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０で、総血清コレステロールを低減する、ならびに／または、対照の投与と比較して、血清ＬＤＬ粒子数を９０％超低減する、または、血清ＨＤＬ粒子数を７５％超低減する。
本発明はまた、本明細書に説明される、脂質で製剤化されたＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡ組成物を投与することを含む方法も提供する。一実施形態において、本発明は、細胞において、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための方法であって、本組成物を細胞に投与することを含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、処置を必要とする哺乳類において、ＬＤＬｃレベルを低減するための方法であって、本組成物を哺乳類に投与することを含む方法を含む。
以下でより詳細に説明するとおり、本方法は、任意の適切な投与量、例えば、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または、例えば、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、もしくは５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを含むことができる。
また、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、対象に、本明細書に説明される、脂質で製剤化されたＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡ組成物を、約３ｍｇ／ｋｇの第１の用量で投与することと、その後、少なくとも１つのその後の用量を週に１回投与することとを含み、その後の用量は、第１の用量よりも低い方法を本明細書に説明する。対象は、例えば、ラット、または非ヒト霊長類、またはヒトであってもよい。その後の用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇであってもよい。一部の実施形態において、その後の用量は、週に１回４週間投与される。一部の実施形態において、第１の用量の投与は、総コレステロールレベルを約１５〜６０％減少させる。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明に示されている。本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。
図面の簡単な説明
接頭語「ＡＤ−」、「ＤＰ−」、および「ＡＬ−ＤＰ−」は、互換的に使用される（例えば、「ＡＬ−ＤＰ−９３２７」および「ＡＤ−９３２７」）。
ＮＤ−９８脂質の構造を示す。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの異なるＯＲＦ領域（グラフ上に示されたＯＲＦ位置に対応する最初のヌクレオチドを有する）に対して向けられた１６個のマウス特異的な（ＡＬ−ＤＰ−９３２７からＡＬ−ＤＰ−９３４２までの）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの体内スクリーニングの結果を示す。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの異なるＯＲＦ領域（グラフ上に示されたＯＲＦ位置に対応する最初のヌクレオチドを有する）に対して向けられた１６個のヒト／マウス／ラット交差反応性の（ＡＬ−ＤＰ−９３１１からＡＬ−ＤＰ−９３２６までの）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの体内スクリーニングの結果を示す。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における１６個のマウス特異的な（ＡＬ−ＤＰ−９３２７からＡＬ−ＤＰ−９３４２までの）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの体内スクリーニングの結果を示す。総血清コレステロールレベルを各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における１６個のヒト／マウス／ラット交差反応性の（ＡＬ−ＤＰ−９３１１からＡＬ−ＤＰ−９３２６までの）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの体内スクリーニングの結果を示す。総血清コレステロールレベルを各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。 ＡおよびＢは、それぞれ、ＰＣＳＫ９のサイレンシングについての体外の結果と体内の結果を比較したものである。 ＡおよびＢは、サル初代肝細胞を用いたＰＣＳＫ９のサイレンシングについての体外の結果の一例である。 ＡＬ−ＤＰ−９６８０とＡＬ−ＤＰ−９６８０の化学修飾バージョンとを用いたサル初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９のサイレンシングについての結果を示す。 ＬＮＰ−０１で製剤化されたｓｉＲＮＡのＰＣＳＫ−９に対する体内活性を示す。 ＡおよびＢは、ＬＮＰ−０１で製剤化された化学修飾９３１４と化学修飾を有する誘導体（例えば、ＡＤ−１０７９２、ＡＤ−１２３８２、ＡＤ−１２３８４、ＡＤ−１２３４１）の、マウスにおける単回投与後の様々な時点での体内活性を示す。 製剤化されたＡＤ−１０７９２の単回投与後のラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 １０Ａと同様の実験での血清総コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。製剤化されたＡＤ−１０７９２の単回投与により、ラットにおける総コレステロールは約６０％低減するが、これは、約３〜４週間後にベースラインに戻る。 １０Ａと同じ実験での肝臓のコレステロールレベルとトリグリセリドレベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 肝臓のＬＤＬ受容体レベルが、ラットにおいてＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを投与した後に上方調節されたことを示すウェスタンブロットである。 それぞれ、製剤化されたＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 それぞれ、製剤化されたＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 それぞれ、製剤化されたＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 それぞれ、製剤化されたＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 未修飾のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−Ａ１Ａ（ＡＤ−９３１４）は、ヒト初代血液単球においてＩＦＮ−αを誘導したが、２’ＯＭｅ修飾したｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１Ａ２（ＡＤ−１０７９２）は誘導しなかったことを示すグラフである 未修飾のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−Ａ１Ａ（ＡＤ−９３１４）は、ヒト初代血液単球においてＴＮＦ−αも誘導したが、２’ＯＭｅ修飾したｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１Ａ２（ＡＤ−１０７９２）は誘導しなかったことを示すグラフである。 ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１Ａ２（別名、ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ａ２または別名、「製剤化されたＡＤ−１０７９２」）が、用量依存的にマウス肝臓におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを減少させたことを示すグラフである。 ５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１Ａ２の単回投与が、４８時間以内にマウスにおける血清総コレステロールレベルを減少させたことを示すグラフである。 ヒトとサルのＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ｃ２）（別名、「製剤化されたＡＤ−９７３６」）、およびマウスＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ａ２）（別名、「製剤化されたＡＤ−１０７９２」）が、ヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジェニックマウスにおける肝臓ＰＣＳＫ９レベルを低下させたことを示すグラフである。 ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ｃ２とＬＮＰ−ＰＣＳ−Ａ２が、同じトランスジェニックマウスにおける血漿ＰＣＳＫ９レベルを低下させたことを示すグラフである。 ３’末端でのリン酸結合を介してＣｈｏｌ−ｐ−（ＧａｌＮＡｃ）３にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの構造を示す。 ＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（（ＧａｌＮＡｃ）３−３’−リトコール−オレオイルｓｉＲＮＡコンジュゲート）にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの構造を示す。 マウスにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対するコンジュゲートｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。 ラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対する脂質で製剤化されたｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。 表６に記載のＡＤ−９６８０とＡＤ−９６８０の変形物とを用いた、ＨｅＬａ細胞におけるＰＣＳＫ９転写物レベルに対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を示すグラフである。 表６に記載のＡＤ−14676とＡＤ−14676の変形物とを用いた、ＨｅＬａ細胞におけるＰＣＳＫ９転写物レベルに対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を示すグラフである。 Ｈｅｐ３Ｂ細胞のＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡトランスフェクションの結果、ならびにＰＣＳＫ９およびオフターゲット遺伝子レベルに対する効果を伴うグラフである。 ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの維持用量でのラットにおける処置の結果を示す。 修飾ｓｉＲＮＡでのＨｅＬａ細胞の処置の用量反応曲線である。 ｓｉＲＮＡの平均ＩＣ５０対ヒトＰＣＳＫ９転写物における標的位置のグラフである。大きな青い点は、ＩＣ５０およびＡＤ−９６８０の場所を示す。 ｒＥＨＤＬで製剤化されたコレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡの投与の結果を伴うグラフである。 第２世代のＬＮＰで製剤化されたＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ１１におけるＡＤ−９６８０）の非ヒト霊長類への投与の結果を伴うグラフであり、ＰＣＳＫ９タンパク質およびＬＤＬｃレベルの両方における低減を示す。ＬＤＬｃ：低密度リポタンパク質コレステロール、ｍｐｋ：ｋｇあたりのｍｇ。 ＰＣＳＫ９を標的とするＬＮＰで製剤化されたｓｉＲＮＡでの処置後の、非ヒト霊長類における、用量依存的ＰＣＳＫ ｍＲＮＡサイレンシングを示す、棒グラフである。 第２世代のＬＮＰで製剤化されたＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＤ−９６８０）の非ヒト霊長類への投与の結果を伴うグラフであり、ＨＤＬｃレベルにおける変化が無いことを示す。 カチオン性脂質ＭＣ３およびＡＬＮＹ−１００の化学構造を例解する。 ＬＮＰ−０９で製剤化されたＡＤ−１０７９２、齧歯類ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの投与後の、ラットにおける、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡおよび血清コレステロールレベルに対する効果のグラフである。 ＬＮＰ−０９で製剤化されたＡＤ−１０７９２、齧歯類ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの投与後の、ＣＥＴＰ／ＡｐｏＢ ｔｇマウスにおける、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡおよびＬＤＬ／ＨＤＬ粒子数に対する効果のグラフである。
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングするための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節によって調節することができる疾患（例えば、高脂血症）を治療する問題の解決策を提供する。
本発明は、ｄｓＲＮＡを用いて対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方調節することによって調節することができる病理学的状態および疾患（例えば、高脂血症）を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通して配列特異的なｍＲＮＡの分解を導く。
本発明の組成物および方法に有用なｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド未満の長さの、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｄｓＲＮＡの使用によって、ＬＤＬ受容体レベルと循環コレステロールレベルの調節に関与するｍＲＮＡを標的とした分解が可能となる。細胞ベースのアッセイと動物アッセイを用いて、本発明者らは、非常に低用量のこれらのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に仲介し、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の顕著な阻害をもたらすことができることを示した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む方法および組成物は、高脂血症の治療と同様に、ＰＣＳＫ９を下方調節することによって調節することができる病理学的プロセスを治療するために有用である。
以下の詳細な説明には、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡとｄｓＲＮＡを含む組成物の作製法および使用法、ならびにＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方調節することによって調節することができる疾患（例えば、高脂血症）を治療するための組成物および方法が開示されている。本発明の薬学的組成物は、３０ヌクレオチド未満の長さの、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さの相補領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的であるｄｓＲＮＡを、薬学的に許容される担体とともに含む。
したがって、本発明のある態様は、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体とともに含む薬学的組成物、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためにこれらの組成物を使用する方法、およびＰＣＳＫ９の発現を下方調節することによって疾患を治療するためにこれらの薬学的組成物を使用する方法を提供する。
定義
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の用法と本節において提供されるその定義との間に明白な矛盾がある場合には、本節における定義が優先されるものとする。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」は各々、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書で互換的に使用され、ヌクレオ塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳細に記載されるような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分を指すこともあり得ることが理解されよう。当業者にはよく知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分に置換し、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させないでおくことが可能である。例えば、限定するものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含むヌクレオチドに置換し得る。このような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９」は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９遺伝子またはプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９遺伝子タンパク質（別名、ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ−１、ＮＡＲＣ１）を指す。ＰＣＳＫ９に対するｍＲＮＡ配列の例としては、以下のもの、すなわち、ヒト：ＮＭ＿１７４９３６、マウス：ＮＭ＿１５３５６５、およびラット：ＮＭ＿１９９２５３が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを用いて容易に入手可能である。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
本明細書で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって記述されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、および別途指示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合の「相補的」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、特定の条件下で二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることができ、その場合、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄。生物の内部で直面し得るような生理学的に関連する条件等の、他の条件が適用されることもある。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件の組を決定することができるであろう。
これは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する塩基対形成を含む。このような配列は、互いに対して「完全に相補的」と呼ばれ得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書における第２の配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、この２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはこれらの配列は、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の、しかし通常は、多くて４つ、３つ、もしくは２つのミスマッチの塩基対を形成しながらも、その最終的な適用に最も関連がある条件下でハイブリダイズする能力を保持し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するように設計される場合、そのような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチドの長さの一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチドの長さのもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡは、やはり「完全に相補的」と呼ばれ得る。
本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック型塩基対および／または非天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、あるいはこれらの塩基対から完全に形成されてもよい。そのような非ワトソン−クリック型塩基対としては、Ｇ：Ｕ ＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対合が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらを使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基ミスマッチに関して使用され得る。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む、対象となる（例えば、ＰＣＳＫ９をコードする）ｍＲＮＡの連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される「二重鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、かつ上で定義されたような、実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を指す。一般に、各々の鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるように、各々のまたは両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含むことができる。さらに、本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおけるかなりの修飾を含み、かつ本明細書に開示されるかまたは当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでもよい。ｓｉＲＮＡ型の分子で使用される場合、任意のそのような修飾が、本明細書および特許請求の範囲の目的で、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
この二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２つの鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子である場合、このようなｄｓＲＮＡは、文献中でｓｉＲＮＡ（「短干渉ＲＮＡ」）と呼ばれることが多い。２つの鎖が１つのより大きい分子の部分であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、接続構造体は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドから二重鎖に存在する全ての突出を引いた数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。一般に、各々の鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるように、各々のまたは両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含むことができる。さらに、本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおけるかなりの修飾を含み、かつ本明細書に開示されるかまたは当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでもよい。ｓｉＲＮＡ型の分子で使用される場合、任意のそのような修飾が、本明細書および特許請求の範囲の目的で、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する不対ヌクレオチド（単数または複数）を指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二重鎖である、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡのことである。明確にするために、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｓｉＲＮＡに突出があるかまたはｓｉＲＮＡが平滑末端であるかを決定する上で考慮されない。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、「相補領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは分子の内部領域または末端領域において許容され得る。通常、最も許容されるミスマッチは、末端領域に、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、人の手を借りない拡散プロセスもしくは細胞の能動的プロセスを通じてなされ得るし、または補助的な薬剤もしくは装置によってなされ得る。この用語の意味は、体外の細胞に限定されるものでなく、ｄｓＲＮＡは、生きた生物の一部である「細胞に導入される」場合もある。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含むことになる。例えば、体内送達のために、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入するか、または全身投与することができる。体外での細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクション等の当該技術分野で公知の方法が含まれる。
「〜をサイレンシングする」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方調節する」、「〜の発現を抑制する」等の用語は、これらの用語がＰＣＳＫ９遺伝子を指すものである限り、本明細書では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を指し、この抑制は、ＰＣＳＫ９遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群であって、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるように処理された細胞または細胞群から単離し得る、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、第１の細胞または細胞群のように処理されていない細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、減少していることによって明らかにされるようなものである。阻害の程度は通常、以下で表される。
Figure 0005894913
あるいは、阻害の程度は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現に機能的関連があるパラメータ（例えば、細胞によって分泌される、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされたタンパク質の量、またはある表現型を示す細胞の数）の減少という観点から与えられる場合もある。原則として、標的遺伝子のサイレンシングは、構成的にかまたはゲノム工学によるかのいずれかで、標的を発現している任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって測定することができる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子の発現を一定の度合いで阻害するかどうか、したがって、このｄｓＲＮＡが本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、そのような参照としての役割を果たすものとする。
本明細書で使用される場合、ＰＣＳＫ９発現との関連において、「治療する」、「治療」等の用語は、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの緩和または軽減を指す。本発明との関連において、（ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセス以外の）以下に本明細書で引用される他の状態のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」等の用語は、そのような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。例えば、高脂血症との関連において、治療は、血清脂質レベルの減少を伴う。
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」および「予防的有効量」という語句は、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセス、またはＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの明白な症状の治療、予防、または管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、当該技術分野で公知の要因、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスのタイプ、患者の病歴と年齢、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの段階、およびＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスを防止する他の薬剤の投与等によって変動し得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」には、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」とは、意図した薬理学的効果、治療的効果、または予防的効果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下したときに、所与の臨床治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するための薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下をもたらすのに必要な量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤を投与するための担体を指す。このような担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これら担体は、以下により詳細に記載されている。この用語は、細胞培養培地を特に除外する。
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞のことである。
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
以下に詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳類におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法および二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を有する組成物を提供し、ここで、このｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含み、かつこの相補領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子を発現する細胞と接触したときに、例えば、本明細書に記載のアッセイ等によって測定されるように、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。例えば、ＨｅｐＢ３細胞といった細胞培養物におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎアッセイによって等、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または、ＥＬＩＳＡアッセイによって等、タンパク質レベルを測定することによって、評価することができる。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出をさらに含むことができる。
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような、自動ＤＮＡ合成装置の使用により、以下にさらに論じられるような当該技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な２つの核酸鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に実質的に相補的で、かつ通常は完全に相補的な相補領域を有することができる。もう一方の鎖（センス鎖）は、好適な条件下で組み合わされたときに、２つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するような、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、１５〜３０、もしくは２５〜３０、もしくは１８〜２５、もしくは１９〜２４、もしくは１９〜２１、または１９、２０、もしくは２１塩基対長である。一実施形態では、二重鎖構造は、１９塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖構造は、２１塩基対長である。２つの異なるｓｉＲＮＡｓが組み合わせて使用されるとき、二重鎖の長さは、同一であっても異なってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡの各鎖は、概して、１５〜３０、もしくは１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、各鎖は、２５〜３０ヌクレオチド長である。二重鎖の各鎖は、同一または異なる長さであることが可能である。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用されるとき、各ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一または異なることが可能である。
本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の１本鎖突出（複数を含む）を含むことができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４ヌクレオチド、一般的に１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出を有する。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖上の３’末端および５’末端に各々１〜１０ヌクレオチド突出を有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖上の３’末端および５’末端に各々１〜１０ヌクレオチド突出を有する。
少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端対応物よりも予想外に優れた阻害特性を有する。一部の実施形態において、わずか１つのヌクレオチド突出の存在は、全体的な安定性に影響を与えることなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化する。わずか１つの突出を有するｄｓＲＮＡは、体内で、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液、および血清中で特に安定かつ有効であることが分かっている。通常、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端、またはその代わりにセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、通常、アンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有し得る。このようなｄｓＲＮＡは、改善された安定性と阻害活性を有し、それによって、低用量、すなわち、１日にレシピエントの体重１ｋｇ当たり５ｍｇ未満での投与が可能となる。一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端でのヌクレオチド突出を有し、５’末端は平滑である。別の実施形態では、突出内のヌクレオチドのうちの１つ以上が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような、自動ＤＮＡ合成装置の使用により、以下にさらに論じられるような当該技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１ａ、表２ａ、および表５ａのセンス配列から選択される第１の鎖と、表１ａ、表２ａ、および表５ａのアンチセンス配列から選択される第２の鎖とを含む。表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される標的配列のどこかを標的とする代わりのアンチセンス剤は、標的配列とそれに隣接するＰＣＳＫ９配列とを用いて容易に決定することができる。
例えば、（表１ａの）ｄｓＲＮＡ ＡＤ−９６８０は、３５３０−３５４８においてＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする。したがって、標的配列は以下の通りである：５’ＵＵＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵ３’（配列番号１５２３）。（表１ａの）ｄｓＲＮＡ ＡＤ−１０７９２は、１０９１−１１０９においてＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする。したがって、標的配列は以下の通りである：５’ＧＣＣＵＧＧＡＧＵＵＵＡＵＵＣＧＧＡＡ３’（配列番号１５２４）。配列番号１５２３と配列番号１５２４に対する相補領域を有するｄｓＲＮＡが本発明に含まれる。
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列であって、この少なくとも２つの配列の一方が、この少なくとも２つの配列のもう一方に相補的であり、かつこの少なくとも２つの配列の一方が、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。通常、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドは、表１ａ、表２ａ、および表５ａでセンス鎖として記載されており、第２のオリゴヌクレオチドは、表１ａ、表２ａ、および表５ａでアンチセンス鎖として記載されている。
当業者にはよく知られているように、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを誘導するのに特に有効であることが認められている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、より短いまたはより長いｄｓＲＮＡも同様に有効であり得ることが見出されている。上記の実施形態では、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本発明のｄｓＲＮＡは、最小で２１ｎｔの長さの少なくとも１つの鎖を含むことができる。表１ａ、表２ａ、および表５ａの配列の１つから、一方または両方の末端上のほんの数ヌクレオチドを除いたものを有するより短いｄｓＲＮＡが上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることがかなり期待され得る。したがって、表１ａ、表２ａ、および表５ａの配列の１つに由来する少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドの部分配列を有し、かつ以下に本明細書に記載されるＦＡＣＳアッセイにおいてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する能力が、完全配列を含むｄｓＲＮＡと５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％阻害を超えない程度に異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。さらに、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される標的配列内で切断するｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９配列と示された標的配列とを用いて容易に作成することできる。
さらに、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示されるＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉに基づく切断を受けやすいＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ内の部位を識別する。したがって、本発明は、本発明の薬剤の１つによって標的とされる配列内を標的とするＲＮＡｉ剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、第２のＲＮＡｉ剤が、第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡ内のどこかでメッセージを切断するならば、この第２のＲＮＡｉ剤は、第１のＲＮＡｉ剤の配列内を標的とすると言われる。このような第２の薬剤は、通常、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の１つに由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを、ＰＣＳＫ９遺伝子中の選択配列に対して連続する領域から取得されたさらなるヌクレオチド配列と連結したものからなる。例えば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチド（付加されたＡＡ配列は除く）を、標的ＰＣＳＫ９遺伝子由来の次の６ヌクレオチドと組み合わせたものは、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の１つをベースにした２１ヌクレオチドの一本鎖薬剤を生じる。
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含むことができる。一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、わずか１つの、わずか２つの、またはわずか３つのミスマッチを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は標的配列に対するミスマッチを含んでおり、ミスマッチの部分は相補領域の中心には位置しない。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は標的配列に対するミスマッチを含んでおり、ミスマッチは、どちらかの末端に由来する５ヌクレオチドに、例えば、相補領域の５’末端または３’末端のどちらかに由来する５、４、３、２、または１ヌクレオチドに制限される。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子のある領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは、中央の１３ヌクレオチドにミスマッチを１つも含まない。本発明に記載される方法を用いて、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。特に、ＰＣＳＫ９遺伝子内の特定の相補領域に、集団内の多型配列変異があることが知られている場合、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する上でミスマッチを有するｄｓＲＮＡの効力を考慮することは重要である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４ヌクレオチド、通常１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出を有する。少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端対応物よりも予想外に優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチド突出の存在によって、全体的な安定性に影響を与えることなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化されることを発見した。わずか１つの突出を有するｄｓＲＮＡは、体内で、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液、および血清中で特に安定かつ有効であることが分かっている。通常、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端、またはその代わりにセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、通常、アンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有し得る。このようなｄｓＲＮＡは、改善された安定性と阻害活性を有し、それによって、低用量、すなわち、１日にレシピエントの体重１ｋｇ当たり５ｍｇ未満での投与が可能となる。通常、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端でのヌクレオチド突出を有し、５’末端は平滑である。別の実施形態では、突出内のヌクレオチドのうちの１つまたは複数をヌクレオシドチオリン酸と置換する。
化学修飾と化学コンジュゲート
また別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、安定性を増強するために化学修飾される。本発明の核酸は、参照により本明細書に組み入れられる「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ」に記載されている方法のような、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成および／または修飾され得る。化学修飾としては、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学的部分への共有結合、およびヌクレオチド間リン酸結合と別の結合（例えば、チオリン酸）との置換を挙げることができるが、これらに限定されない。２つ以上のこのような修飾を利用し得る。
２つの別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学結合は、種々の公知の技術のいずれかによって、例えば、共有結合、イオン結合、もしくは水素結合の導入によって、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、もしくはスタッキング相互作用によって、金属イオン配位によって、またはプリン類似体の使用によって達成し得る。一般に、ｄｓＲＮＡを修飾するために使用することができる化学基としては、メチレンブルー；二官能性基、通常、ビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびプソラレンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、リンカーは、ヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは、固相合成によって産生され、ヘキサエチレングリコールリンカーは標準的な方法に従って組み込まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．およびＫ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：１４６６５−１４６７０）。特定の一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端は、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に連結される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端での化学結合は、通常、三重らせん結合によって形成される。表１ａ、表２ａ、および表５ａに、本発明の修飾ＲＮＡｉ剤の例を示す。
また別の実施形態では、例えば、特定のヌクレアーゼ等の、しかしこれらに限定されない、細胞酵素の分解活性を防止または阻害するために、２つの一本鎖の一方または両方のヌクレオチドを修飾し得る。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害するための技術は、当該技術分野で公知であり、これには、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、およびホスホロアミデートが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１：１１１６−８を参照されたい）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基が、化学基に、通常、２’−アミノ基または２’−メチル基に置換される。また、ロックされたヌクレオチドを生成するために、少なくとも１つのヌクレオチドを修飾し得る。このようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素を接続するメチレン架橋を含む。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０）およびＯｂｉｋａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４）に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入することにより、相補的な配列への親和性が向上し、融解温度が数℃増大する（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．およびＤ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１−７）。
リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすることにより、細胞への吸収、および特定の組織への標的化または特定の種類の細胞（例えば、肝臓細胞）による取込みが増強され得る。特定の例では、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートして、細胞膜の直接透過および／または肝臓細胞を越える取込みを促進する。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされたリガンドは、受容体を介するエンドサイトーシスの基質となる。こうした手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとｄｓＲＮＡ剤の細胞透過を促進するために使用されている。例えば、コレステロールが様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、そのコンジュゲートされていない類似体と比較して大幅により活性のある化合物となっている。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他の親油性化合物としては、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、およびメントールが挙げられる。受容体を介するエンドサイトーシスのリガンドの一例は、葉酸である。葉酸は、葉酸受容体を介するエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。葉酸を有するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体を介するエンドサイトーシスによって効率的に細胞内に輸送されるであろう。Ｌｉと共同研究者らは、オリゴヌクレオチドの３’末端に葉酸を結合させることによって、オリゴヌクレオチドの細胞取込みが８倍増大したことを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，１５４０。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他のリガンドとしては、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、送達ペプチド、ならびに脂質（例えば、コレステロールおよびコレステリルアミン）が挙げられる。糖質クラスターの例としては、Ｃｈｏｌ−ｐ−（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ−アセチルガラクトサミンコレステロール）およびＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ−アセチルガラクトサミン−３’−リトコール−オレオイルが挙げられる。
特定の例では、カチオン性リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることによって、ヌクレアーゼに対する抵抗性が向上する。カチオン性リガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、カチオン性リガンドがオリゴヌクレオチド全体に分散している場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対する高い結合親和性を保持することが報告されている。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３およびその中の参考文献を参照されたい。
いくつかの例では、リガンドは多官能性であり得る、および／またはｄｓＲＮＡは２つ以上のリガンドにコンジュゲートすることができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、取込みを向上させるための１つのリガンドと放出を向上させるための第２のリガンドにコンジュゲートすることができる。
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、連結分子をｄｓＲＮＡに結合させることによって得られるような、反応性ペンダント官能性を有するｄｓＲＮＡを使用することによって合成し得る。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させ得る。本発明の方法は、いくつかの実施形態では、リガンドと適切にコンジュゲートされており、かつ固体支持体材料にさらに結合され得るヌクレオシド単量体を使用することによって、リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡの合成を促進する。任意で固体支持体材料に結合される、このようなリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合リガンドと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位にある連結部分との反応によって、本明細書に記載される方法の特定の実施形態に従って調製される。特定の例では、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、まず、長鎖アミノアルキル基を介して単量体ビルディングブロックを制御された多孔性ガラス支持体に共有結合させることによって調製される。その後、ヌクレオチドは、標準的な固相合成技術によって、固体支持体に結合した単量体ビルディングブロックに結合させられる。単量体ビルディングブロックは、ヌクレオシドまたは固相合成と適合する他の有機化合物であり得る。
本発明のコンジュゲートで使用されるｄｓＲＮＡは、固相合成の公知の技術によって好都合にかつ日常的に作製し得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、いくつかの業者によって販売されている。当該技術分野で公知のこのような合成用の任意の他の手段をさらにまたは代わりに利用し得る。同様の技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等の、他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
合成
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示を以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のための単量体に対して引用される米国特許第５，２１２，２９５号；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；骨格修飾オリゴヌクレオチドと還元的カップリングによるその調製に対して引用される米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系をベースにした修飾ヌクレオ塩基とその合成方法に対して引用される米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンをベースにした修飾ヌクレオ塩基に対して引用される米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに対して引用される米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に対して引用される米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドを合成するための方法および材料に対して引用される米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、そのような基がヌクレオシドの様々な位置のいずれかにおいて付加される他の部分に対するリンカーとして使用し得るヌクレオシドに対して引用される米国特許第５，５７８，７１８号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび関連化合物（２，６−ジアミノプリン化合物を含む）を調製するためのプロセスに対して引用される米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，４７０号；コンジュゲートされた４’−デスメチルヌクレオシド類似体に対して両方とも引用される米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に対して引用される米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；とりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法に対して引用される米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号。
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡと、配列特異的な連結ヌクレオシドを有するリガンド分子とにおいて、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド前駆体もしくはヌクレオシド前駆体、または既に連結部分を有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を有するリガンド−ヌクレオチド前駆体またはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有するビルディングブロックを利用して、好適なＤＮＡ合成装置でアセンブルしてもよい。
既に連結部分を有するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用する場合には、通常、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成を完了させ、その後、リガンド分子をこの連結部分と反応させて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを生成する。種々の分子（例えば、ステロイド、ビタミン、脂質、およびレポータ分子）を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートがこれまでに記載されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３号を参照されたい）。一実施形態では、本発明に掲載されるオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成で日常的に使用される標準的なホスホロアミダイトと標準的でないホスホロアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホロアミダイトを用いて自動合成装置で合成される。
オリゴヌクレオチドのヌクレオシドに２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、または２’−デオキシ−２’−フルオロ基を組み込むことによって、ハイブリダイゼーション特性の増強がオリゴヌクレオチドに付与される。さらに、ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、増強されたヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、本発明の官能化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート骨格、または２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基、もしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のどちらか一方もしくは両方を含むように強化することができる。当該技術分野で公知のいくつかのオリゴヌクレオチド修飾のまとめのリストは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３７０９１８号に見出される。
いくつかの実施形態では、５’末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列を、ＤＮＡ合成装置を用いて調製し、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は当業者に公知である。代表的な活性エステルとしては、Ｎ−ハイドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、およびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルの反応によって、選択されたリガンドが連結基を介して５’位に結合したオリゴヌクレオチドが生じる。５’末端のアミノ基は、５’−アミノ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を利用して調製することができる。一実施形態では、リガンド分子は、リガンド−ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用することによって、５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得るが、この場合、リガンドは、リンカーを介して直接的または間接的に５’−ヒドロキシ基に連結される。５’末端にリガンドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを提供するために、このようなリガンド−ヌクレオシドホスホロアミダイトは、通常、自動合成手順の最後で使用される。
修飾されたヌクレオシド間結合またはヌクレオシド間骨格の例としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および逆の極性を有するボラノホスフェートであって、ヌクレオシド単位の連続する対が、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合しているボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
上記のリン原子含有連結の調製に関する、代表的な米国特許としては、各々参照することによって、本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号、および同第５，６９７，２４８号が挙げられるが、これらに限定されない。
その中にリン原子を含まない修飾されたヌクレオシド間結合またはヌクレオシド間骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環の糖間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する他のものが含まれる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する、代表的な米国特許としては、各々参照することによって、本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の例では、オリゴヌクレオチドは、非リガンド基で修飾され得る。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強するために、多くの非リガンド分子がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための方法は科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分としては、脂質部分（例えば、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３））、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５））、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９））、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７））、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９））、もしくはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上で列記されている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。その後、アミノ基を、適当なカップリング試薬または活性化試薬を用いて、コンジュゲートされている分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体に依然として結合しているオリゴヌクレオチドを用いてかまたはオリゴヌクレオチドの切断後に溶液相において実施され得る。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製によって、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートの使用が特に好ましいが、それは、そのような部分が、ＰＣＳＫ９発現部位である肝臓細胞への標的化を増大させることができるからである。
ベクターにコードされたＲＮＡｉ剤
本発明の別の態様において、ＰＣＳＫ９遺伝子発現活性を調節するＰＣＳＫ９特異的なｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。これらのトランスジーンは、線状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができる。これらは、宿主ゲノムに取り込まれ、宿主ゲノムに組み込まれたトランスジーンとして継承され得る。トランスジーンは、染色体外プラスミドとして継承されるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの別々の発現ベクター上のプロモータによって転写し、標的細胞にコトランスフェクトすることができる。あるいは、各々の個々のｄｓＲＮＡの鎖を、両方とも同じ発現プラスミド上にあるプロモータによって転写することができる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡがステム・ループ構造を有するように、ｄｓＲＮＡをリンカーポリヌクレオチド配列によって接続された逆向き反復として発現させる。
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）を参照されたい）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）、またはアルファウイルスならびに当該技術分野で公知の他のウイルスをベースにして構築することができる。レトロウイルスは、上皮細胞を含む、多くの異なる細胞型に、体外および／または体内で種々の遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ８９／０７１３６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ８９／０２４６８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ８９／０５３４５号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９２／０７５７３号を参照されたい）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子の形質導入と発現が可能な組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを好適なパッケージング細胞株（例えば、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰ）にトランスフェクトすることによって産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは、感染しやすい宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）における様々な細胞と組織に感染させるために使用することができ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染のために有糸分裂が活発な細胞を必要としないという利点もある。
発現されるｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることが可能な任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの指向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、または必要に応じて、異なるウイルスカプシドタンパク質を代用することによって修飾することができる。
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等に由来する表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを改変することによって、本発明のＡＡＶベクターを、異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型２のゲノム上の血清型２のカプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子を、血清型５のカプシド遺伝子に置き換えて、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたく、この開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明で使用するのに好適な組換えウイルスベクター、このベクターにｄｓＲＮＡを発現させるための核酸配列を挿入する方法、およびこのウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４、Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０、およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたく、この開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するベクターである。特に好ましい一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡを、例えば、Ｕ６ ＲＮＡプロモータもしくはＨ１ ＲＮＡプロモータのいずれか、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるための好適なＡＶベクター、この組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびこのベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるための好適なＡＡＶベクター、この組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびこのベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願第ＷＯ ９４／１３７８８号、および国際特許出願第ＷＯ ９３／２４６４１号に記載されており、これらの開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかにおけるｄｓＲＮＡ発現を推進するプロモータは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ（例えば、リボソームＲＮＡプロモータ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ（例えば、ＣＭＶ初期プロモータもしくはアクチンプロモータもしくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモータ）、または通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモータもしくは７ＳＫ ＲＮＡプロモータ）であってもよく、あるいは発現プラスミドが、Ｔ７プロモータからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードするならば、原核生物のプロモータ（例えば、Ｔ７プロモータ）であってもよい。プロモータは、トランスジーン発現を膵臓に向けることもできる（例えば、膵臓用のインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照されたい）。
さらに、トランスジーンの発現は、例えば、特定の生理的調節因子（例えば、循環グルコースレベル）、またはホルモンに感受性のある調節配列のような、誘導可能な調節配列と発現系を用いて、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳類におけるトランスジーン発現の制御に好適なこのような誘導可能な発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者ならば、ｄｓＲＮＡトランスジーンの意図される使用に基づいて適切な調節／プロモータ配列を選択することができるであろう。
通常、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能な組換えベクターは、以下に記載されるように送達され、標的細胞内にとどまる。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現をもたらすウイルスベクターを用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。ひとたび発現すれば、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内への投与によるか、患者から外植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって全身性とすることができる。
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、通常、カチオン性脂質担体（例えば、オリゴｆｅｃｔアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。１週間またはそれより長い期間にわたる単一のＰＣＳＫ９遺伝子の異なる領域または複数のＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって企図される。宿主細胞内への本発明のベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いてモニタすることができる。例えば、一過性発現は、レポータ、例えば、蛍光マーカ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を用いてシグナルを得ることができる。生体外細胞の安定的トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を与えるマーカを用いて確実にすることができる。
ＰＣＳＫ９特異的なｄｓＲＮＡ分子をベクターに挿入し、ヒト患者用の遺伝子治療ベクターとして使用することもできる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照されたい）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製は、許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができるし、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞から無傷で産生することができる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物、およびこれらを投与する方法を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害、例えば、ＰＣＳＫ９発現によって仲介される病理学的プロセス（例えば、高脂血症）を治療するために有用である。このような薬学的組成物は、送達の様式に基づいて製剤化される。
投薬量
本明細書に掲載される薬学的組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与される。一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日にレシピエントの体重１キログラム当たり０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、通常、１日に体重１キログラム当たり１〜５０ｍｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
別の実施形態において、投与量は、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．１１ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．１３ｍｇ／ｋｇ、０．１４ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．１７ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．１９ｍｇ／ｋｇ、または０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
一実施形態において、投与量は、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
ｄｓＲＮＡは、０．０３、０．１、０．３、または１．３、または３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
薬学的組成物は、１日に１回投与することができ、またはｄｓＲＮＡは、１日の全体を通して適当な間隔で２回、３回、もしくはそれより多くのサブ用量として投与し得る。ＰＣＳＫ９レベルに対する単回用量の効果は長続きするので、次の用量は、７日を超えない間隔で、または１、２、３、もしくは４週間を超えない間隔で投与される。
一実施形態において、脂質で製剤化されたＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡは、約３ｍｇ／ｋｇの第１の用量で投与され、その後、少なくとも１つのその後の用量で週に１回投与され、その後の用量は、第１の用量よりも低く、例えば、その後の用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇである。その後の用量は、例えば、週に１回４週間投与することができる。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、制御放出製剤による連続的な注入または送達を用いて投与される。その場合、各々のサブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、１日の総投薬量を達成するために、それ相応により小さくなければならない。数日間にわたる送達のために、例えば、数日間にわたるｄｓＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて投薬単位を構成することもできる。持続放出製剤は、当該技術分野で公知であり、特に、特定の部位での薬剤の送達に有用であり、例えば、本発明の薬剤とともに使用することができる。この実施形態では、投薬単位は、相応の複数回の１日量を含む。
対象の疾患もしくは障害の重症度、過去の治療、全般的な健康、および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、特定の要因が、対象を有効に治療するのに必要とされる投薬量と時機に影響を及ぼし得ることを当業者は理解するであろう。さらに、治療的有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって企図される個々のｄｓＲＮＡについての有効投薬量と体内半減期の推定は、本明細書の別の箇所で記載されるように、従来の手法を用いるか、または適当な動物モデルを用いた体内試験に基づいて行なうことができる。
マウス遺伝学の進歩により、ＰＣＳＫ９発現によって仲介される病理学的プロセスのような、様々なヒト疾患を研究するための多くのマウスモデルが作製された。このようなモデルは、ｄｓＲＮＡの体内試験に、および治療的有効用量の決定に使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＰＣＳＫ９を発現するプラスミドを含むマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジーンを有するトランスジェニックマウスである。
そのような化合物の毒性と治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）とＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトで使用される様々な投薬量を製剤化する際に使用することができる。本発明に掲載される組成物の投薬量は、通常、毒性がほとんどないかまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される投薬形態および利用される投与経路によって、この範囲内で変動し得る。本発明に掲載される方法で使用される任意の化合物について、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、または適切な場合には、（例えば、ポリペプチドの濃度の減少を達成する）標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルにおいて製剤化し得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィにより測定し得る。
上で論じられたような投与に加えて、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現によって仲介される病理学的プロセスの治療に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。任意の事象において、投与医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を用いて観察される効果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量と時機を調整することができる。
投与
本発明の薬学的組成物は、局所治療が望ましいかまたは全身治療が望ましいかということと、治療されるべき部分とに応じて、多くの方法で投与し得る。投与は、局所、経肺（例えば、ネブライザーによるものを含めた、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹入によるもの）、気管内、鼻腔内、経表皮と経皮と真皮下、経口、または非経口（例えば、皮下）であり得る。
通常、高脂血症の哺乳類を治療する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、非経口手段によって全身投与される。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内への注射または注入、あるいは頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内、または脳室内への投与が挙げられる。例えば、リポソームとコンジュゲートされたｄｓＲＮＡもしくはリポソームとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡ、またはリポソームとともに製剤化されたｄｓＲＮＡまたはリポソームとともに製剤化されていないｄｓＲＮＡを、患者に静脈内投与することができる。そのような投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、一般的な溶媒（例えば、アルコール）中の非水性溶液、または液体油基剤もしくは固体油基剤中の溶液のような組成物中に製剤化することができる。このような溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加物を含むこともできる。非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の好適な添加物（例えば、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体）をも含む、滅菌水溶液のような組成物中に製剤化することができる。製剤については、本明細書により詳細に記載されている。
ｄｓＲＮＡは、特定の組織、例えば、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）を標的とするような様態で送達することができる。
製剤
本発明の薬学的製剤は、単位投薬形態で好都合に提示し得るが、これは、薬学産業で公知の従来技術に従って調製し得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ密接に関連させ、その後、必要があれば、生成物を成形することによって調製する。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、軟性ジェル、坐剤、および浣腸剤等の、しかしこれらに限定されない、多くの可能な投薬形態のいずれかに製剤化し得る。本発明の組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液としても製剤化し得る。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質をさらに含み得る。懸濁液はまた、安定化剤を含み得る。
本発明の薬学的組成物には、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない、種々の成分から生成し得る。一態様では、高脂血症等の肝障害を治療する場合、肝臓を標的とする製剤とする。
さらに、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造体、または核酸の混合物とともに混合されているか、封入されているか、コンジュゲートされているか、または別の形で関連しているｄｓＲＮＡを含む組成物に製剤化することができる。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ剤を含む組成物は、他の治療剤、例えば、脂質を低減させる他の薬剤（例えば、スタチン）、またはＰＣＳＫ９以外の遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ化合物を含むことができる。
経口製剤、非経口製剤、局所製剤、および生物学的製剤
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末剤または顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ジェルカプセル、サシェー剤、錠剤、あるいはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましい場合もある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と併せて投与される製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、浸透増強剤の組合せ、例えば、脂肪酸／塩を胆汁酸／塩と組み合わせたものを使用する。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸とカプリン酸とＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達してもよいし、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体化してもよい。ｄｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、カチオン化アルブミン、カチオン化デンプン、カチオン化アクリレート、カチオン化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびカチオン化デンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ＤＥＡＥ誘導体化ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、ＤＥＡＥ誘導体化セルロース、ならびにＤＥＡＥ誘導体化デンプンが挙げられる。好適な複合化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、およびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ））、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤とその調製については、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。
非経口投与、実質内（脳内）投与、髄腔内投与、脳室内投与、または肝内投与のための組成物および製剤としては、滅菌水溶液を挙げることができ、これらの滅菌水溶液は、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の好適な添加剤（例えば、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤を含むが、これらに限定されない）も含み得る。
局所投与用の薬学的組成物および薬学的製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、坐剤、スプレー、液剤、および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性基剤、粉末基剤、または油状基剤、増粘剤等が必要であるかまたは望ましい場合もある。好適な局所製剤には、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡが局所送達剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤）と混合している製剤が含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性のもの（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性のもの（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、ならびにカチオン性のもの（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、リポソーム中に封入されてもよいし、またはそれに対する、特に、カチオン性リポソームに対する複合体を形成してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質に対して、特に、カチオン性脂質に対して複合体化してもよい。好適な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。局所製剤については、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されている。さらに、ｄｓＲＮＡ分子は、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されているような生物学的手段または非生物学的手段として哺乳類に投与することができる。非生物学的送達は、種々の方法によって達成することができ、これらの方法には、限定するものではないが、（１）本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ酸分子をリポソームに充填すること、および（２）ｄｓＲＮＡ分子を脂質またはリポソームと複合体化し、核酸−脂質複合体または核酸−リポソーム複合体を形成させることが含まれる。リポソームは、体外で細胞をトランスフェクトするのに一般に使用されるカチオン性脂質と中性脂質から構成され得る。カチオン性脂質は、負の電荷を持つ核酸と複合体化（例えば、電荷会合）し、リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例としては、リポフェクチン、リポフェクトアミン、リポフェクトエース、およびＤＯＴＡＰが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを形成させるための方法は、当該技術分野で公知である。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成させることができる。リポフェクチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびエフェクテン（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を含む、多くの親油性薬剤が市販されている。さらに、全身送達の方法は、市販のカチオン性脂質、例えば、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰ（これらは各々、ＤＯＰＥまたはコレステロール等の中性脂質と混合し得る）を用いて最適化することができる。場合によっては、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：６４７−６５２（１９９７））によって記載されているリポソームのようなリポソームを使用することができる。他の実施形態では、ポリカチオン（例えば、ポリエチレンイミン）を用いて、体内および生体外での送達を達成することができる（Ｂｏｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１７２８（１９９６））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第６，２７１，３５９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９６４号、およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００５．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００２−７に見出すことができる。
生物学的送達は、ウイルスベクターの使用を含むが、これに限定されない、種々の方法によって達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を肝臓細胞に送達することができる。標準的な分子生物学の技術を用いて、本明細書に提供される１つ以上のｄｓＲＮＡを、細胞に核酸を送達するためにこれまでに開発された多くの様々なウイルスベクターのうちの１つに導入することができる。これらの得られたウイルスベクターを用いて、１つ以上のｄｓＲＮＡを、例えば、感染によって、細胞に送達することができる。
リポソーム製剤
研究され、薬物の製剤化に使用されているマイクロエマルションの他にも、組織化された界面活性剤構造は多く存在する。これらのものとしては、単層、ミセル、二重層、および小胞が挙げられる。小胞（例えば、リポソーム）は、薬物送達の観点から見た、それらが提供する作用の特異性と持続時間が理由で、高い関心を集めている。本発明で使用される場合、「リポソーム」という用語は、球状の二重層（単数または複数）となって配置された両親媒性脂質から構成された小胞を意味する。
リポソームとは、親油性物質と水性内部から形成された膜を有する単層状または多層状の小胞のことである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、体内でマクロファージによって取り込まれる。
無傷の哺乳類皮膚を横断するためには、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、各々５０ｎｍ未満の直径の、一連の細孔を通過しなければならない。したがって、非常に変形しやすく、かつこのような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点としては、中性リン脂質から得られたリポソームが生体適合性かつ生体分解性であること、リポソームが広範な水溶性薬物と脂溶性薬物を取り込むことができること、リポソームがリポソーム内部のコンパートメント内に封入された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
リポソームは、活性成分の作用部位への移動および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームは、細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進むにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用し得る細胞内に流入する。
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として広範な研究の焦点となっている。局所投与に関して、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を提供するという証拠が増えている。このような利点としては、投与薬物の高い全身吸収と関連する副作用の低下、所望の標的における投与薬物の蓄積の増大、および親水性と疎水性の両方の、様々な薬物を皮膚に投与する能力が挙げられる。
いくつかの報告には、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大半は、皮膚上層を標的とする結果となった。
リポソームは２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正の電荷を持つリポソームであり、これは、負の電荷を持つＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正の電荷を持つＤＮＡ／リポソーム複合体は、負の電荷を持つ細胞表面に結合し、エンドソーム中に内在化される。エンドソーム内のｐＨが酸性であるため、リポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性であるかまたは負の電荷を持つリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを封入する。ＤＮＡと脂質は両方とも同じような電荷を持つので、複合体形成ではなく、反発が生じる。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養されている細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現は標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要なタイプとして、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成させることができる。アニオン性のリポソーム組成物は、通常、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性の融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究では、リポソーム性薬物製剤の皮膚への局所送達が評価されている。モルモットの皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用が、皮膚ヘルペスの痛みを低下させたのに対し、他の手段を介する（例えば、溶液としてのまたはエマルションとしての）インターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究では、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を用いたインターフェロンの投与に対する有効性が検討され、リポソーム製剤が水性投与よりも優れていることが結論付けられた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
非イオン性リポソーム系もまた、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む特定の系において、薬物を皮膚に送達する際の有用性を決定するために検討されている。ノバソーム（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびノバソーム（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮にサイクロスポリン−Ａを送達するために使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の様々な層へのサイクロスポリン−Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームも含まれる。これは、本明細書で使用される場合、１つ以上の特殊化した脂質を含むリポソームであって、そのような特殊化した脂質がリポソームに組み込まれたときに、そのような脂質を欠くリポソームと比べて循環寿命が増加するリポソームを指す用語である。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）１つ以上の糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）で誘導体化されているリポソームである。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取込みの低下によるものであると当該技術分野で考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を向上させることができることを報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳述された。両方ともＡｌｌｅｎらに対する米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４号には、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）には、スフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。１．２，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマー性グリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングによって、血液半減期が顕著に増加することを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の付加によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓによって記載されている（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が顕著に増大することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察結果を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成される他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）にまで拡大した。外表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用の方法は、Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）、ならびにＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって説明されている。．いくつかの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、（両方ともＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．に対する）ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号ならびにＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）には、その表面上の官能性部分でさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームが記載されている。
核酸を含むいくつかのリポソームが当該技術分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ９６／４００６２号には、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法が開示されている。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許第５，２６４，２２１号には、タンパク質結合リポソームが開示され、そのようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることが主張されている。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許第５，６６５，７１０号には、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法が記載されている。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ９７／０４７８７号には、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームが開示されている。
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、さらに別のタイプのリポソームで、非常に変形しやすい脂質凝集体であり、これは、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスファーソームは脂肪滴と記述されてもよく、これは、非常に変形しやすいので、この液滴よりも小さい孔を容易に貫通することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応することができ、例えば、これらは、自己最適化し（皮膚の孔の形に適応する）、自己修復し、断片化することなく標的に達することが多く、かつ自己ローディング（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）することが多い。トランスファーソームを作るために、表面縁活性化物質（通常、界面活性剤）を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームを介する血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同じくらい有効であることが示されている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム等の製剤において広く適用されている。天然と合成の両方の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および区別する最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（別名、「頭部」）の性質は、製剤で使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は薬学的製品および化粧製品に広く適用されており、広範囲のｐＨ値で使用可能である。一般に、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、その構造によって２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが含まれる。非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもまた、この部類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の部類の中で最も一般的なメンバーである。
水に溶解または分散させたときに、界面活性剤分子が負電荷を持つ場合、界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、カルボキシレート（例えば、セッケン）、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（例えば、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェート）、スルホネート（例えば、アルキルベンゼンスルホネート）、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤の部類の中で最も重要なメンバーは、アルキルサルフェートおよびセッケンである。
水に溶解または分散させたときに、界面活性剤分子が正電荷を持つ場合、界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。四級アンモニウム塩は、この部類の中で最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正または負のいずれかの電荷を持つ能力を有する場合、この界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。
薬品、製剤における、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明で扱うｄｓＲＮＡは、例えば、核酸脂質粒子を形成するように、例えば、脂質製剤中に完全に封入される。核酸脂質粒子は、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。核酸脂質粒子は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環寿命の延長を示し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）で蓄積するので、全身適用に極めて有用である。さらに、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で抵抗性である。核酸−脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；および同第６，８１５，４３２号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
核酸脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質、および／またはコレステロールといった他の成分をさらに含むことができる。他の脂質は、脂質の酸化を防ぐため、またはリガンドをリポソーム表面に結合させるため、といった種々の目的のために、リポソーム組成物に含まれてもよい。両親媒性、中性、カチオン性、およびアニオン性脂質を含む、任意の数の脂質が存在し得る。そのような脂質は、単独で、または組み合わせて使用することができる。存在し得る追加の脂質成分の具体的な例は、本明細書で説明される。
核酸脂質粒子に存在し得る追加の成分としては、ポリアミドオリゴマーといった二層安定化成分（例えば、米国特許第６，３２０，０１７を参照されたい）、ペプチド、タンパク質、洗浄剤、ホスファチジルエタノールアミンに連結されたＰＥＧおよびセラミドにコンジュゲートされたＰＥＧといった脂質誘導体（米国特許第５，８８５，６１３を参照されたい）が挙げられる。
核酸脂質粒子は、形成中に電荷に誘起された凝集を防ぐ、粒子の立体安定化に起因し得る、形成中の脂質粒子の凝集を低減するように選択される、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および脂質のうちの１つ以上を含むことができる。
核酸脂質粒子としては、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、およびＳＮＡＬＰが挙げられる。「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む、安定した核酸脂質粒子を指す。「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＰＬＰには、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０３６８３号に示されるような封入された凝縮薬剤−核酸複合体を含む、「ｐＳＰＬＰ」が含まれる。
本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、かつ実質的に無毒である。
一実施形態では、脂質対薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１、または約６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、または３３：１の範囲にある。
カチオン性脂質
本発明の核酸脂質粒子は、典型的に、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、もしくは３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮＹ−１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、あるいはそれらの混合物であってもよい。
また、上で具体的に説明されるものに加え、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を有する他のカチオン性脂質は、本発明の脂質粒子に含まれ得る。そのようなカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）、３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセタート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリストイルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、ならびにＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）といった、カチオン性脂質のいくつかの商業的調製物を使用することができる。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。
本明細書において使用するとき、「アミノ脂質」という用語は、生理学的ｐＨでカチオン性脂質を形成するようにプロトン化され得る、１つまたは２つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖およびアミノ頭部基（アルキルアミノもしくはジアルキルアミノ基を含む）を有する、それらの脂質を含むことを意味する。
他のアミノ脂質は、アルキル置換基が異なる（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−等）ものを含む、代替の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するものを含む。Ｒ１１およびＲ１２がともに長鎖アルキルまたはアシル基である、それらの実施形態に関して、それらは、同一または異なることが可能である。一般的に、より少ない飽和アシル鎖を有するアミノ脂質は、特に、複合体が、濾過滅菌の目的で、約０．３ミクロン未満にサイズ決定されなければならない場合、より容易にサイズ決定される。Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を伴う不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が好ましい。他の足場もまた、アミノ脂質のアミノ基および脂肪酸または脂肪アルキル部分を分離するために使用することができる。好適な足場は、当業者に既知である。
ある実施形態において、本発明のアミノまたはカチオン性脂質は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ ７．４）以下のｐＨで正に荷電され、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性となるように、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有する。当然のことながら、ｐＨに応じたプロトンの追加または除去は、平衡プロセスであり、荷電された、または中性脂質への言及は、優勢種の特性を指し、脂質の全てが荷電された、または中性形態で存在することは必須ではないことを理解されよう。２つ以上のプロトン化可能もしくは脱プロトン化可能基を有する、または双性イオン性である、脂質は、本発明における使用から除外される。
ある実施形態において、本発明に従うプロトン化可能脂質は、約４から約１１の範囲のプロトン化可能基のｐＫａを有する。これらの脂質は、より低いｐＨ製剤化段階でカチオン性である一方で、粒子は、ｐＨ７．４周辺の生理学的ｐＨで、大部分が（完全にではないが）表面中性化されるため、約４から約７のｐＫａが最も好ましい。このｐＫａの利益のうちの１つは、粒子の外面に関連する、少なくとも一部の核酸が、生理学的ｐＨでその静電相互作用を喪失し、単純な透析によって除去され、したがって、粒子のクリアランスへの感受性を大幅に低減するということである。
カチオン性脂質の一例は、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。ＤＬｉｎＤＭＡを含む核酸脂質粒子の合成および調製は、２００９年４月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００４９６号に説明されている。
一実施形態において、カチオン性脂質ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）は、核酸脂質粒子を調製するために使用される。ＸＴＣの合成は、２００８年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に説明されており、これは、参照することによって本明細書に組み込まれる。
一態様において、カチオン性脂質は、以下の構造、
Figure 0005894913
 およびその塩または異性体を有し、式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、各発生において、任意に置換されたＣ１０−Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０−Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０−Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０−Ｃ３０アシル、または−リンカー−リガンドであり、Ｒ３は、Ｈ、任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０アルキニル、アルキル複素環、アルキルリン酸、アルキルホスホロチオエート、アルキルホスホロジチオエート、ホスホン酸アルキル、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｍｗ １００−４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（ｍｗ １２０−４０Ｋ）、ヘテロアリール、複素環、またはリンカー−リガンドであり、Ｅは、Ｃ（Ｏ）ＯもしくはＯＣ（Ｏ）である。この脂質ファミリーの合成および使用は、２００９年１１月１０日出願の国際公開第ＷＯ ２０１０／０５４４０１（ＰＣＴＵＳ２００９／０６３９２７号に説明されている。カチオン性脂質ＭＣ３は、カチオン性脂質のこのファミリーの一実施形態である。
別の実施形態において、カチオン性脂質ＭＣ３（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）（例えば、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）は、核酸脂質粒子を調製するために使用される。製剤を含むＭＣ３およびＭＣ３の合成は、例えば、２００９年９月２２日出願の米国仮特許第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日出願の米国仮特許第６１／１８５，８００号、および２０１０年６月１０日出願の米国特許出願第１２／８１３／４４８号に説明されており、これらは、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、カチオン性脂質ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン）は、核酸脂質粒子を調製するために使用される。ＡＬＮＹ−１００の合成は、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に説明されており、これは、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
図２８は、ＡＬＮＹ−１００およびＭＣ３の構造を例解する。
カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％から約７０ｍｏｌ％、または約４５〜６５ｍｏｌ％、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、もしくは７０ｍｏｌ％を成すことができる。
非カチオン性脂質
本発明の核酸脂質粒子は、非カチオン性脂質を含むことができる。非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であってもよい。例としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ ＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の脂質粒子における使用に好適なアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルフォスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイル フォスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニル ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリル ホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合された他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
中性脂質は、脂質粒子内に存在する場合、非荷電、または生理学的ｐＨで中性双性イオン性形態のいずれかで存在する、いくつかの脂質種のうちのいずれであってもよい。そのような脂質としては、例えば、ジアシルフォスファチジル塩素、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に説明される粒子において使用するための中性脂質の選択は、例えば、リポソームサイズおよび血流におけるリポソームの安定性の考慮によって一般的に誘導される。好ましくは、中性脂質成分は、２つのアシル基（即ち、ジアシルフォスファチジル塩素およびジアシルホスファチジルエタノールアミン）を有する、脂質である。様々な鎖長および飽和度の多様なアシル鎖基を有する脂質が利用可能である、または、公知の技術によって単離もしくは合成することができる。実施形態の一群において、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を伴う飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。実施形態別の群において、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を伴うモノ−もしくはジ−不飽和脂肪酸を伴う脂質が使用される。さらに、飽和および不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。好ましくは、本発明において使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連するフォスファチジル塩素である。本発明において有用な中性脂質もまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールといった他の頭部基を伴うリン脂質から成ってもよい。
一実施形態において、非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。別の実施形態において、非カチオン性脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。
コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％であり得る。
コンジュゲート脂質
コンジュゲート脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（米国特許第６，３２０，０１７号に説明）を含む、凝集を防ぐために核酸脂質粒子において使用することができる。ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡのように、製剤化中の凝集を防ぐ、非荷電、親水性、立体障壁部分を伴う他の化合物もまた、本発明の方法および組成物における使用のために、脂質に連結することができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号において説明されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３、５，５３４，４９９号および第５，８８５，６１３号において説明されている。典型的に、凝集を低減するために選択される脂質成分の濃度は、約１から１５％（脂質のモル％で）である。
本発明において有用である、ＰＥＧで修飾された脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体的な例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固着させるように、種々の「固定」脂質部分を有することができる。好適なＰＥＧで修飾された脂質の例としては、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）（参照することによって本明細書に組み込まれる、同時係属第ＵＳＳＮ ０８／４８６，２１４号において説明）、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミンおよびＰＥＧで修飾された１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが、特に好ましい。
ＰＥＧまたはＡＴＴＡといった立体的に大きな部分が、脂質アンカーにコンジュゲートされる実施形態において、脂質アンカーの選択は、コンジュゲートが脂質粒子とどのようなタイプの会合を有するかに依存する。ｍｅＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）が、粒子が、可能であれば数日中に、血液循環から除去されるまで、リポソームと会合したままであることは、公知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０といった他のコンジュゲートは、同様の滞留能力を有する。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、一部のアッセイにおいて、６０分未満のＴ１／２で、血清への曝露後、製剤から素早く交換される。米国特許出願第ＳＮ ０８／４８６，２１４号に例解されるように、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和、および立体障壁頭部基のサイズという、少なくとも３つの特徴が交換速度に影響する。これらの特性の好適な変化を有する化合物が、本発明にとって有用であり得る。一部の治療用途に関して、ＰＥＧで修飾された脂質が、体内で素早く核酸脂質粒子から喪失されることが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧで修飾された脂質は、比較的短い脂質アンカーを有する。他の治療用途において、核酸脂質粒子がより長い血漿循環期間を呈することが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧで修飾された脂質は、比較的長い脂質アンカーを有する。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ１４から約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４から約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。一部の実施形態において、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。
凝集防止化合物が、適切に機能するように、脂質コンジュゲートを必ずしも必要としないことに留意されたい。溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡは、凝集を防止するのに十分であり得る。粒子が製剤化後に安定している場合、ＰＥＧまたはＡＴＴＡを、対象への投与前に透析することができる。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であってもよく、これらのものとしては、例えば、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃｉ８）であってもよい。追加のコンジュゲート脂質としては、ポリエチレングリコール−ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１４、ＰＥＧは、２０００Ｄａの平均分子量を有する）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル１−（メトキシ ポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート）（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリストイルオキシプロピルアミン（ＰＥＧは、２０００Ｄａの平均分子量を有する（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ））、Ｎ−アセチルガラクトアミン−（（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート））（ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧ）、およびポリエチレングリコール−ジパルミトイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＰＧ）が挙げられる。
一実施形態において、コンジュゲート脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。別の実施形態において、コンジュゲート脂質は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡである。なお別の実施形態において、コンジュゲート脂質は、ＰＥＧ−ＤＰＧである。代替的に、コンジュゲート脂質は、ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧである。
粒子の凝集を防ぐコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、０．５〜約５．０ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌであり得る。
脂質混合物のステロール成分は、存在するとき、リポソーム、脂質小胞、または脂質粒子調製の分野で従来使用されるそれらのステロールであることが可能である。好ましいステロールは、コレステロールである。
一部の実施形態において、核酸脂質粒子は、例えば、粒子内に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％から約６０ｍｏｌ％、または約２５から約４０ｍｏｌ％、または約４８ｍｏｌ％のステロール、例えば、コレステロールをさらに含む。
リポタンパク質
一実施形態において、本発明の製剤は、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書において使用するとき、「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に既知のアポリポタンパク質、ならびにその変異体および断片と、以下に説明されるアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体、または断片とを指す。
好適なアポリポタンパク質としては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥ、ならびに活性多形態、アイソフォーム、変異体、および突然変異体、さらにそれらの断片または切断形態が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質を含有するチオールである。「アポリポタンパク質を含有するチオール」は、少なくとも１つのシステイン残渣を含有する、アポリポタンパク質、変異体、断片、またはアイソフォームを指す。最も一般的なアポリポタンパク質を含有するチオールは、１つのシステイン残渣を含有する、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９７：２０６−１３；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２、およびＡｐｏＥ３もまた、アポリポタンパク質を含有するチオールである。単離ＡｐｏＥ、ならびに／またはその組み換え生成形態を含む、その活性断片およびポリペプチド類似体は、米国特許第５，６７２，６８５号、第５，５２５，４７２号、第５，４７３，０３９号、第５，１８２，３６４号、第５，１７７，１８９号、第５，１６８，０４５号、第５，１１６，７３９号に説明されており、これらの開示は、参照することによって、本明細書に組み込まれる。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ Ｅ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏ−Ｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：９０７７−９０８３、およびＲａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）７９：４６９６−４７００に開示されている。（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ００３９６も参照されたい。）
ある実施形態において、アポリポタンパク質は、その成熟形態、そのプレプロアポリポタンパク質形態、またはそのプロアポリポタンパク質形態であることが可能である。プロおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：（３）１６７９−８７；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）のホモおよびヘテロ二量体（実現可能な場合）もまた、本発明の範囲内で利用することができる。
ある実施形態において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体、またはアイソフォームであることが可能である。「断片」という用語は、天然のアポリポタンパク質よりも短いアミノ酸配列を有し、断片が、脂質結合特性を含む、天然のアポリポタンパク質の活性を保持する、任意のアポリポタンパク質を指す。「変異体」は、アポリポタンパク質のアミノ酸配列における、置換または変化を意味し、この置換または変化、例えば、アミノ酸残渣の追加および削除は、脂質結合特性を含む、天然のアポリポタンパク質の活性を破壊しない。このため、変異体は、１つ以上のアミノ酸残渣が、化学的に類似したアミノ酸で保存的に置換されている、本明細書において提供される、天然のアポリポタンパク質と、実質的に同一のアミノ酸配列を有する、タンパク質またはペプチドを含むことができる。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンといった、少なくとも１つの疎水性残渣の別のものへの置換が挙げられる。同様に、本発明は、例えば、例えば、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間といった、少なくとも１つの親水性残渣の置換を企図する（米国特許第６，００４，９２５、６，０３７，３２３号および第６，０４６，１６６号を参照されたい）。「アイソフォーム」という用語は、同一、上回る、または部分的機能、および類似、同一または部分的配列を有するタンパク質を指し、同一遺伝子の、通常は組織特異的生成物であってもなくてもよい（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１、Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５、Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６、Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０、Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２、Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４、Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８、Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４０（１−３）：１８１−７、Ｗｅｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００（１−３）：４８１−９２、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３３）：２９９１９−２６、Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（２３）：１４８８８−９３、および米国特許第６，３７２，８８６号を参照されたい）。
ある実施形態において、本発明の方法および組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構造の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構造は、虚血再かん流保護特性を含有する、アポリポタンパク質ドメインに関連する、高い脂質結合能力を伴う、アポリポタンパク質ドメインから成ることができる。アポリポタンパク質のキメラ構造は、アポリポタンパク質内の別個の領域を含む構造（即ち、同種構造）であることが可能であるか、または、キメラ構造は、異なるアポリポタンパク質間の別個の領域を含む構造（即ち、異種構造）であることが可能である。キメラ構造を含む組成物はまた、アポリポタンパク質変異体、または、特定の特徴（例えば、脂質結合特性、受容体結合特性、酵素的特性、酵素活性化特性、抗酸化もしくは還元酸化特性）を有するように設計されたセグメントである、セグメントも含むことができる（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１、Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５、Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６、Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０、Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２、Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４、Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９（９）：２２１４−２５、Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：３２８−３８：Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０６２−７０、Ｄｙｅｒ １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）：１５０００９−１５、Ｈｉｌｌ １９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３０９７９−８４を参照されたい）。
本発明において利用されるアポリポタンパク質はまた、組み換え、合成、半合成、または精製アポリポタンパク質を含む。本発明によって利用される、アポリポタンパク質またはその同等物を得るための方法は、当該技術分野において、公知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば、密度勾配遠心分離もしくはイムノアフィニティクロマトグラフィによって、血漿もしくは天然生成物から分離する、または合成的に、半合成的に、もしくは当業者に既知の組み換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９、Ｐｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９、米国特許第５，０５９，５２８号、第５，８３４，５９６、５，８７６，９６８号、および第５，７２１，１１４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ８６／０４９２０号、および第ＷＯ ８７／０２０６２を参照されたい）。
本発明において利用されるアポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣する、ペプチドおよびペプチド類似体といった、アポリポタンパク質アゴニストをさらに含む。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第６，００４，９２５号、第６，０３７，３２３、６，０４６，１６６号、および第５，８４０，６８８号に説明されているもののうちのいずれであることも可能であり、これらの内容は、その全体として、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
アポリポタンパク質アゴニストペプチドまたはペプチド類似体は、例えば、米国特許第６，００４，９２５号、第６，０３７，３２３号、および第６，０４６，１６６号に説明される技術を含む、当該技術分野において既知のペプチド合成のための任意の技術を使用して、合成または製造することができる。例えば、ペプチドは、最初にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）によって説明された固相合成技術を使用して、調製されてもよい。他のペプチド合成技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｄ Ｅｄ．，（１９７６）、および当業者にとって容易に利用可能な他の参考文献において見出すことができる。ポリペプチド合成技術の要約は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）において見出すことができる。ペプチドはまた、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）において説明されるような解法によって、合成することができる。異なるペプチド合成において使用するための適切な保護基は、上記の本文、ならびにＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）において説明されている。本発明のペプチドは、例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのより大きな部分から、化学的もしくは酵素的切断によって、調製される可能性もある。
ある実施形態において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であることが可能である。一実施形態において、アポリポタンパク質は、同種混合物、つまり、単一タイプのアポリポタンパク質であることが可能である。別の実施形態において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の異種混合物、つまり、２つ以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であることが可能である。アポリポタンパク質の異種混合物の実施形態は、例えば、動物源からのアポリポタンパク質の混合物、および半合成源からのアポリポタンパク質を含むことができる。ある実施形態において、異種混合物は、例えば、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏの混合物を含むことができる。ある実施形態において、異種混合物は、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ ＭｉｌａｎｏおよびＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓの混合物を含むことができる。本発明の方法および組成物において使用するための好適な混合物は、当業者には明らかであろう。
アポリポタンパク質が、天然源から得られる場合、それは、植物または動物源から得ることができる。アポリポタンパク質が動物源から得られる場合、アポリポタンパク質は、いかなる種からのものであってもよい。ある実施形態において、アポリポタンパク質は、動物源から得ることができる。ある実施形態において、アポリポタンパク質は、ヒト源から得ることができる。本発明の好ましい実施形態において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同一の種から派生される。
他の成分
多数の実施形態において、両親媒性脂質は、本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」は、任意の好適な材料を指し、脂質材料の疎水性部分は、疎水性相に配向するが、親水性部分は、水相に向かって配向する。そのような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、フォスファチジル塩素、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレイルフォスファチジル塩素が挙げられる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質族、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキソ酸といった、他のリン欠乏化合物もまた、使用することができる。さらに、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールといった、他の脂質と容易に混合することができる。
また、プログラム可能な融合脂質が、本発明の脂質粒子に含むために好適である。そのような脂質粒子は、所与のシグナル事象が発生するまで、細胞膜と融合する、およびそれらのペイロードを送達する傾向がほとんどない。これは、生命体または病変部位への注射後、それが細胞と融合しだす前に、脂質粒子がより均一に分布することを可能にする。シグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であり得る。後者の場合は、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートといった、融合遅延または「クローキング」成分は、経時的に、脂質粒子膜から単に交換され得る。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ１４から約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４から約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。一部の実施形態において、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。
核酸薬剤にコンジュゲートされた脂質粒子はまた、標的部分、例えば、細胞タイプまたは組織に特異的である標的部分を含むことができる。リガンド、細胞表面受容体、グリコタンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、およびモノクロナール抗体といった、種々の標的部分を使用する、脂質粒子の標的化は、これまでに説明されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照されたい）。標的部分は、全体のタンパク質またはその断片を含むことができる。標的機構は、一般的に、標的部分が、標的、例えば、細胞表面受容体と相互作用するために利用可能である様態で、標的薬剤が、脂質粒子の表面に位置付けられることが必要である。種々の異なる標的薬剤および方法は、例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ＴＭ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）、およびＡｂｒａ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１−３，（２００２）において説明されるものを含む、当該技術分野において既知であり、利用可能である。
標的化のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖といった、親水性ポリマー鎖の表面コーティングを伴う、脂質粒子、即ち、リポソームの使用が提唱されている（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８（１９９５）、ＤｅＦｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８：６１０１−６１０４（１９９６）、Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４（１９９３）、Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）、米国特許第５，０１３５５６号、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２９６−２９９（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３：７１−７４（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ ９（Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄｓ）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ（１９９５））。一手法において、脂質粒子を標的化するための、抗体といった、リガンドは、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に連結される。別の手法において、標的リガンドは、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合される（Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）、Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８：１１５−１１８（１９９６））。
標的薬剤を連結するための標準的な方法を使用することができる。例えば、標的薬剤の結合のために活性化することができるか、または脂質誘導体化されたブレオマイシンといった、親油性化合物を誘導体化することができる、ホスファチジルエタノールアミンを使用することができる。抗体標的化リポソームは、例えば、タンパク質Ａを取り込むリポソームを使用して構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７ １６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照されたい）。抗体コンジュゲートの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、この教示は、参照することによって、本明細書に組み込まれる。また、標的部分の例には、新生物または腫瘍と会合する抗原を含む、細胞成分に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的部分として使用されるタンパク質は、共有結合を介して、リポソームに結合することができる（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい）。他の標的方法としては、ビオチン−アビジン系が挙げられる。
核酸脂質粒子の生成
一実施形態において、本発明の核酸脂質粒子製剤は、押出方法、またはインライン混合方法を介して生成される。
押出方法（予成形方法またはバッチプロセスとも称される）は、まず空のリポソーム（即ち、無核酸）が調製され、その後、空のリポソームに核酸が添加される方法である。小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した、リポソーム組成物の押出は、比較的明確に定められたサイズ分布をもたらす。典型的に、懸濁液は、所望のリポソーム複合体のサイズ分布が達成されるまで、１回以上膜を循環される。リポソームは、リポソームサイズの段階的な低減を達成するように、連続的により小さな孔の膜を通して押出されてもよい。場合によっては、形成される脂質核酸組成物は、いかなるサイズ決定も行うことなく使用することができる。これらの方法は、第ＵＳ ５，００８，０５０号、第ＵＳ ４，９２７，６３７号、第ＵＳ ４，７３７，３２３、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９７９ Ｏｃｔ １９；５５７（１）：９−２３、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８０ Ｏｃｔ ２；６０１（３）：５５９−７、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８６ Ｊｕｎ １３；８５８（１）：１６１−８、およびＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８５ ８１２，５５−６５において説明されており、これらは、参照することにより、それらの全体として本明細書に組み込まれる。
インライン混合方法は、脂質および核酸の両方が、並行して混合チャンバに添加される方法である。混合チャンバは、単純なＴコネクタ、または当業者に既知の任意の他の混合チャンバであることが可能である。これらの方法は、米国特許第６，５３４，０１８号、および第ＵＳ ６，８５５，２７７号、米国公報第２００７／００４２０３１号、ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３，Ｍａｒ．２００５，ｐ．３６２−３７２において説明されており、これらは、参照することにより、それらの全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の製剤は、当業者に既知の任意の方法によって、調製することができることを、さらに理解されたい。
核酸脂質粒子の特徴付け
標準的な方法または押出成形を含まない方法のいずれかによって調製された製剤を、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は、通常、目視検査で特徴付けられる。これらは、凝集物または堆積物を含まない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質−ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いた光散乱によって測定することができる。粒子は、約２０〜３００ｎｍ（例えば、４０〜１００ｎｍのサイズ）であるべきである。粒子サイズ分布は、単峰型であるべきである。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、および封入された画分は、色素排出アッセイを用いて推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料は、製剤を崩壊させる界面活性剤（例えば、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合色素（例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））とともにインキュベートすることができる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線と比べた、界面活性剤を含む試料からのシグナルによって決定することができる。封入された画分は、総ｓｉＲＮＡ含有量から（界面活性剤の非存在下でのシグナルによって測定される）「遊離の」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって決定される。封入されるｓｉＲＮＡの割合は、通常、＞８５％である。一実施形態において、本発明の製剤は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％封入される。
ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、通常、約少なくとも５０ｎｍ〜約少なくとも１１０ｎｍ、約少なくとも６０ｎｍ〜約少なくとも１００ｎｍ、または約少なくとも８０ｎｍ〜約少なくとも９０ｎｍである。
核酸脂質粒子の製剤化
ＬＮＰ０１
核酸脂質粒子の合成の一例は、以下のとおりである。核酸脂質粒子は、リピドイド ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（式 １）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、合成される。この核酸脂質粒子は、ＬＮＰ０１粒子と称される場合もある。エタノール中の各々のストック溶液は、以下のとおりに調製することができる。ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ、コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。その後、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６のストック溶液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせることができる。組み合わせた脂質溶液を、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％となり、かつ最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中の）水性ｓｉＲＮＡと混合することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られるナノ粒子混合物を、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）のようなサーモバレル押出し成形機を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押出し成形することができる。場合によっては、押出し成形工程を省くことができる。エタノール除去およびそれと同時に行なわれる緩衝液交換を、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
Figure 0005894913
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際出願公開ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
追加の例示的な核酸脂質粒子製剤を、以下の表に記載する。表中の核酸脂質粒子の名称は、限定することを意味しないことが理解されるものとする。例えば、本明細書において使用するとき、ＳＮＡＬＰという用語は、カチオン性脂質ＤＬｉｎＤＭＡを含む製剤を指す。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
ＸＴＣ含有製剤は、例えば、参照することによって、本明細書に組み込まれる、２００９年９月３日出願の米国仮特許第６１／２３９，６８６号に説明されている。
ＭＣ３含有製剤は、例えば、参照することによって、本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日出願の米国仮特許第６１／２４４，８３４号に説明されている。
ＡＬＮＹ−１００含有製剤は、例えば、参照することによって、本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に説明されている。
追加の代表的な製剤を、表１１および１２に記述する。脂質は、カチオン性脂質を指す。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
カチオン性脂質の合成
本発明の核酸脂質粒子において使用される化合物、例えば、カチオン性脂質等のいずれも、実施例においてより詳細に説明される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製され得る。全ての置換基は、別途指示がない限り、以下に定義されるとおりである。
「アルキル」は、１から２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖、非環状または環状、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が挙げられるが、飽和分岐鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられるが、不飽和環状アルキルとしては、シクロペンテニル、およびシクロヘキセニル等が挙げられる。
「アルケニル」は、隣接する炭素原子間の少なくとも１つの二重結合を含有する、上に定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルには、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐鎖アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられる。
「アルキニル」は、隣接する炭素間の少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上に定義されるような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐鎖アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等が挙げられる。
「アシル」は、以下に定義されるように、結合点の炭素が、オキソ基で置換される、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される、１もしくは２個のヘテロ原子を含有する、５から７員の単環式、または７から１０員の二環式の複素環式環を意味し、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意に四級化されてもよく、上記の複素環のいずれかが、ベンゼン環に融合される、二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環としては、以下に定義されるようなヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルフォニリル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられる。
「任意に置換されたアルキル」、「任意に置換されたアルケニル」、「任意に置換されたアルキニル」、「任意に置換されたアシル」、および「任意に置換された複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が、置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。この点に関して、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、 ＮＲｘＲｙ、 ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、 ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、 Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、 Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、 Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、式中、ｎは０、１、または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同一または異なり、かつ独立して水素、アルキル、または複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基の各々が、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、 ＮＲｘＲｙ、 ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、 ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、 Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、 Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、 Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、 ＳＯｎＲｘ、および ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ以上でさらに置換され得る。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
一部の実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に公知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡潔に述べると、本発明の文脈における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減または排除する、任意の基である。保護基は、ある反応中のその反応性をマスクするように、官能基に添加することができ、次いで、元の官能基を明らかにするように除去することができる。一部の実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を減少または排除する、任意の基である。保護基は、当該技術分野において公知の技術を使用して、添加および除去することができる。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（即ち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は、以下のとおりである。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で終夜撹拌した。溶液を、希釈塩酸、その後、希釈重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を回転蒸発器上で除去した。残渣を１〜５％メタノール／ジクロロメタン溶離勾配を使用して、シリカゲルカラム（２０ｇ）に通過させた。精製された生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を除去して、無色油（０．５４ｇ）を得た。さらなる説明は、国際公開第ＷＯ ２０１０／０５４４０１号（２００９年１１月１０日出願の第ＰＣＴＵＳ２００９／０６３９２７号、および２０１０年６月１０日出願の米国特許出願第１２／８１３／４４８号）に提供されている。
式Ａの合成
一実施形態において、本発明の核酸脂質粒子は、式Ａのカチオン性脂質を使用して製剤化される。
Figure 0005894913
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々は、任意に置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、任意に置換された複素環式環を形成することができる。一部の実施形態において、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である、一般的に、上の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２によって作製されてもよく、全ての置換基は、別途指示がない限り、上に定義されるとおりである。
Figure 0005894913
脂質Ａ（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々は、任意に置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、任意に置換された複素環式環を形成することができる）は、スキーム１に従って調製することができる。ケトン１および臭化物２は、購入することができる、または当業者に既知の方法で調製することができる。１および２の反応は、ケタール３を生成する。ケタール３のアミン４での処置は、式Ａの脂質を生成する。式Ａの脂質は、式５の有機塩を伴う、対応するアンモニウム塩へ変換することができ、式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸、硫酸等から選択される、アニオン対イオンである。
Figure 0005894913
代替的に、出発原料のケトン１は、スキーム２に従って調製することができる。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入することができる、または当業者に既知の方法で調製することができる。６および７の反応は、ケトン１を生成する。ケトン１の対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に説明されるとおりである。
ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成は、以下のスキーム３を使用して実施した。
Figure 0005894913
５１５の合成：
２口ＲＢＦ（１Ｌ）内の２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に、窒素雰囲気下で０℃の７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加した。完全な添加後、反応混合物を室温まで加温し、次いで、４時間加熱して還流させた。反応の進行は、ＴＬＣによってモニタした。（ＴＬＣによる）反応の完了後、混合物を０℃まで冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を慎重に添加しながら反応停止させた。反応混合物を、室温で４時間撹拌し、濾過した。残渣をＴＨＦでよく洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃縮ＨＣｌで希釈し、２０分間室温で撹拌した。真空下で揮発性を取り除き、５１５の塩酸塩を白色固体として得た。収量：７．１２ｇ １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、５．６８（ｓ、２Ｈ）、３．７４（ｍ、１Ｈ）、２．６６−２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．５０−２．４５（ｍ、５Ｈ）。
５１６の合成：
２５０ｍＬ ２口ＲＢＦ内の１００ｍＬ 無水ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌された溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。５０ｍＬ 無水ＤＣＭ中のＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−クシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと添加した後、反応混合物を室温まで加温させた。反応の完了後（ＴＬＣによって２〜３時間）、混合物を１Ｎ ＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次いで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得、これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製し、５１６を粘着性のある塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６−７．２７（ｍ、５Ｈ）、５．６９（ｓ、２Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．、１Ｈ）２．７４（ｓ、３Ｈ）、２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．３０−２．２５（ｍ、２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］−２３２．３（９６．９４％）。
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、１口５００ｍＬ ＲＢＦ内の２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液に溶解し、それに、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、その後、室温のｔｅｒｔ−ブタノール中のＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の４．２ｍＬの７．６％溶液を添加した。反応の完了後（約３時間）、混合物を固体Ｎａ２ＳＯ３の添加で反応停止させ、結果として得られた混合物を１．５時間、室温で撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、その後、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、そして最後に塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィ精製により、ジアステレオマーの混合物を得、これを分取ＨＰＬＣによって分離した。
収量：−６ｇ粗
５１７Ａ−ピーク−１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９−７．３１（ｍ、５Ｈ）、５．０４（ｓ、２Ｈ）、４．７８−４．７３（ｍ、１Ｈ）、４．４８−４．４７（ｄ、２Ｈ）、３．９４−３．９３（ｍ、２Ｈ）、２．７１（ｓ、３Ｈ）、１．７２−１．６７（ｍ、４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ−［Ｍ＋Ｈ］−２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］−２８３．５存在、ＨＰＬＣ−９７．８６％。ペンテンはＸ線によって確認。
５１８の合成：
化合物５０５の合成に関して説明されるものと同様の手順を使用して、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）が、無色油として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５−７．３３（ｍ、４Ｈ）、７．３０−７．２７（ｍ、１Ｈ）、５．３７−５．２７（ｍ、８Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、４．５８−４．５７（ｍ，２Ｈ）、２．７８−２．７４（ｍ，７Ｈ）、２．０６−２．００（ｍ，８Ｈ）、１．９６−１．９１（ｍ、２Ｈ）、１．６２（ｍ、４Ｈ）、１．４８（ｍ、２Ｈ）、１．３７−１．２５（ｂｒ ｍ、３６Ｈ）、０．８７（ｍ、６Ｈ）。ＨＰＬＣ−９８．６５％。
化合物５１９の合成のための一般手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷溶液に滴下添加した。完全な添加後、混合物を４０℃で０．５時間にわたって加熱し、次いで、氷浴上で再び冷却した。混合物を慎重に飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液で加水分解し、次いでセライトを通して濾過し、油に濃縮した。カラムクロマトグラフィによって、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）を得、これは、無色油として得られた。１３Ｃ ＮＭＲ δ ＝ １３０．２、１３０．１（ｘ２）、１２７．９（ｘ３）、１１２．３、７９．３、６４．４、４４．７、３８．３、３５．４、３１．５、２９．９（ｘ２）、２９．７、２９．６（ｘ２）、２９．５（ｘ３）、２９．３（ｘ２）、２７．２（ｘ３）、２５．６、２４．５、２３．３、２２６、１４．１；エレクトロスプレイＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量 計算値６５４．６、実測値６５４．６。
治療薬剤脂質粒子組成物および製剤
本発明は、本発明の脂質粒子および活性薬剤を含み、活性薬剤が脂質粒子と会合している組成物を含む。特定の実施形態において、活性薬剤は、治療薬剤である。特定の実施形態において、活性薬剤は、脂質粒子の水性内部に封入されている。他の実施形態において、活性薬剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層内に存在する。他の実施形態において、活性薬剤は、脂質粒子の外側または内側の脂質表面に結合している。
本明細書で使用される「完全に封入された」とは、粒子中の核酸が、遊離ＤＮＡを著しく分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝露された後に著しくは分解されないことを示す。完全に封入された系において、通常は遊離の核酸の１００％を分解する処置において、粒子核酸の２５％未満が分解されることが好ましく、粒子核酸の１０％未満が分解されることがより好ましく、粒子核酸の５％未満が分解されることが最も好ましい。代替的に、完全に封入されていることを、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイで決定してもよい。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度の蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手可能）。完全に封入されていることにより、粒子が血清安定性であること、すなわち、体内投与の後、粒子が速やかにその構成部分へと分解することはないことも示唆される。
本明細書において使用される活性薬剤には、細胞、組織、器官、または対象に対して所望の効果を発揮することができる任意の分子または化合物が含まれる。このような効果は、例えば、生物学的なもの、生理学的なもの、または美容上のものであってもよい。活性薬剤は、例えば、核酸、ペプチドおよびポリペプチド（例えば、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および霊長類化（商標）抗体）、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそのリガンド；ホルモンを含む）、ならびに小分子（有機小分子または有機小化合物を含む）を含む、任意の種類の分子または化合物であってもよい。
一実施形態において、活性薬剤は、治療薬剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療薬剤誘導体は、それ自体に治療的活性があってもよく、または治療薬剤誘導体は、さらに修飾されることによって活性を持つようになるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態において、治療薬剤誘導体は、未修飾の薬剤と比較した場合に治療的活性の一部または全てを保持するが、別の実施形態においては、治療薬剤誘導体は、治療活性を欠く。
種々の実施形態において、治療薬剤には、抗炎症化合物、抗鬱剤、刺激剤、鎮痛剤、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張剤、抗血管新生剤、細胞血管剤、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば、抗不整脈剤、血管収縮薬、ホルモン、およびステロイドといった、任意の治療的に有効な薬剤または薬物が含まれる。
ある実施形態において、治療薬剤は、腫瘍学薬物であり、これは、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗新生物剤等と称される場合もある。本発明に従って使用され得る腫瘍学薬物の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈用ブサルファン、経口用ブサルファン、カペシタビン（ゼローダ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（ジェムザール）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（カンプトスター、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、リトレチノイン、メガストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテレ、テモゾロマイド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（ハイカムチン）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、ならびにビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用され得る腫瘍学薬物の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンである。
追加の製剤
エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製および製剤化してもよい。エマルションとは、通常、１つの液体が通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体に分散している不均質系のことである（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルションは、互いに緊密に混合および分散した２つの不混和液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかであり得る。水相が細かく分離し、微小液滴として分散してバルク油相となる場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が細かく分離し、微小液滴として分散してバルク水相となる場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相の他にさらなる成分と、溶液として水相中に、油相中に、またはそれ自体分離相としてのいずれかで存在し得る活性薬物とを含んでもよい。薬学的賦形剤（例えば、乳化剤、安定化剤、色素、および酸化防止剤）も、必要な場合には、エマルション中に存在してよい。薬学的エマルションはまた、例えば、油水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルションおよび水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合のような、３つ以上の相から構成される多重エマルションであってもよい。このような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルションが提供しない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を閉じ込める多重エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水球に閉じ込められた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないことまたは熱力学的安定性が全くないことを特徴とする。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、よく分散して外側相または連続相となり、乳化剤によってまたは製剤の粘性によってこの形態に維持される。エマルション型の軟膏基剤またはクリームの場合には、エマルションの相のどちらかが、半固体または固体であってもよい。エマルションを安定化する他の手段は、組み込まれてエマルションのどちらかの相になり得る乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、４つのカテゴリー、すなわち、合成界面活性剤、天然の乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に大きく分類される（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られているが、これは、エマルションの製剤において広く適用され、文献に概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性対疎水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれており、製剤の調製において界面活性剤を類別および選択する上で有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて異なるクラス、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類し得る（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５）。
エマルション製剤で使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン、およびアラビアゴムが挙げられる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏエマルションを形成しながらも、半固体の硬さを保持することができるような親水性特性を有する（例えば、無水ラノリンおよび親水性ワセリン）。微粉固体も、特に界面活性剤との組合せで、および粘性のある調製物において優れた乳化剤として使用されている。これらには、極性無機固体（例えば、重金属水酸化物）、非膨潤性粘土（例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、およびコロイド状ケイ酸マグネシウム・アルミニウム）、色素、ならびに非極性固体（例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリル）が含まれる。
多様な非乳化物質もエマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および酸化防止剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムと、多糖等の合成ポリマー（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）と、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）と、合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）とが挙げられる。これらは水中で分散または膨潤してコロイド溶液を生成し、この溶液は、分散相の液滴の周りに強い界面フィルムを生成することよって、および外側相の粘度を増大させることによって、エマルションを安定化する。
エマルションは微生物の増殖を容易に支持し得る、糖質、タンパク質、ステロール、およびホスファチド等のいくつかの成分を含むことが多いため、これらの製剤は防腐剤を組み入れることが多い。エマルション製剤に含まれるよく用いられる防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防ぐために、酸化防止剤もエマルション製剤に一般に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤（例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに酸化防止剤の共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であってもよい。
経皮経路、経口経路、および非経口経路によるエマルション製剤の適用、ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性といった理由により、非常に広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。鉱油を基剤とする緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物も、ｏ／ｗエマルションとして一般に経口投与されている物質に含まれる。
本発明の一実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、光学的に等方性でかつ熱力学的に安定な単一の液体溶液である、水と油と両親媒性物質の系と定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。通常、マイクロエマルションは、まず油を水性界面活性剤溶液に分散させ、次いで十分な量の第４の成分、通常は、中間鎖長アルコールを加えて、透明な系を生成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される２つの不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性に透明な分散液とも記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルションは一般に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む３つから５つの成分の組合せによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油と界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部と炭化水素尾部の構造および幾何学的充填によって決まる（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相図を利用する現象学的手法は広く研究されており、マイクロエマルションをどのようにして製剤化するかについての包括的知識を当業者にもたらしている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５）。通常のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に生成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に水不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、これは、界面活性剤フィルム中に浸透し、結果として界面活性剤分子間に空隙が生じるために無秩序なフィルムを生成することによって、界面の流動性を増大させる作用を有する。しかしながら、マイクロエマルションは共界面活性剤を使用せずに調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルション系が当該技術分野で知られている。水相は、通常、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）ジグリセリド、および中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）トリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーン油等の物質を挙げることができるが、これらに限定されない。
マイクロエマルションは、薬物の可溶化と薬物の吸収促進の見地から特に興味が持たれる。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティを増強することが提唱されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルションは、薬物の可溶性の向上、薬物の酵素的加水分解からの保護、界面活性剤によって誘導される膜の流動性と浸透性の変化による薬物吸収促進の可能性、調製の容易さ、固体投薬形態に優る経口投与の容易さ、臨床効力の改善、および毒性の減少という利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。多くの場合、マイクロエマルションは、その成分が周囲温度で組み合わせられると、自発的に生成し得る。このことは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを製剤化する場合に、特に有利であり得る。マイクロエマルションは、美容用途と薬学的用途の両方における活性成分の経皮送達でも有効である。本発明のマイクロエマルション組成物とマイクロエマルション製剤は、消化管からのｄｓＲＮＡと核酸の全身吸収の増大を促進するだけでなく、ｄｓＲＮＡと核酸の局所的な細胞取込みをも向上させると予想される。
本発明のマイクロエマルションはまた、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡと核酸の吸収を増強するために、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾール、および浸透増強剤等の追加の成分および添加物を含んでもよい。本発明のマイクロエマルションで使用される浸透増強剤は、次の５つの幅広いカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類し得る：界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々については、上で論じられている。
浸透増強剤
一実施形態では、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効果的な送達をもたらすために、様々な浸透増強剤を利用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態と非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂溶性または親油性の薬物しか細胞膜を容易に横断しない。横断される膜を浸透増強剤で処理した場合、非親油性薬物でも細胞膜を横断し得ることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を越えて拡散することを促進するのに加えて、浸透増強剤は、親油性薬物の透過性も増強する。
浸透増強剤は、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類し得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透増強剤の上記のクラスの各々については、以下により詳細に記載されている。
Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ：界面活性剤：本発明との関連において、界面活性剤（または「表面活性剤」）とは、水溶液に溶かしたときに、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、結果として粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化学的実体のことである。胆汁塩と脂肪酸の他に、これらの浸透増強剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、ならびにペルフルオロ化合物のエマルション、例えば、ＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
脂肪酸：浸透増強剤として作用する様々な脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロへプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。様々な天然胆汁塩、およびその合成誘導体は、浸透増強剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の任意の天然成分、および任意のその合成誘導体も含まれる。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩である、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
キレート剤：本発明との関連において使用されるキレート剤は、金属性イオンと錯体を形成することによって、溶液から金属性イオンを除去し、結果として粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる。本発明における浸透増強剤としてのその使用に関して、特徴解析されているほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用に２価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるので、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するというさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート、およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、ならびにβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用される場合、非キレート非界面活性剤浸透増強化合物は、キレート剤としてまたは界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず、消化器粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。この種類の浸透増強剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルカノン誘導体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；ならびに非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
また、細胞レベルでｄｓＲＮＡの取込みを増強する薬剤を、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加してもよい。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１号））もまた、ｄｓＲＮＡの細胞取込みを増強することが知られている。
投与された核酸の浸透を増強するために、グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）、ピロール（例えば、２−ピロール）、アゾン、ならびにテルペン（例えば、リモネンおよびメントン）を含む、他の薬剤を利用してもよい。
担体
本発明のｄｓＲＮＡは、薬学的に許容される担体または希釈剤中に製剤化することができる。「薬学的に許容される担体」（本明細書で「賦形剤」とも呼ばれる）とは、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルのことである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、所望の大きさ、硬さ、他の関連する輸送特性および化学特性を提供するように、計画された投与様式を念頭において選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体には、例として、水；食塩水溶液；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）；潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み入れている。本明細書で使用される場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解するか、または循環からのその除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させる体内過程によって核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物の共投与は、通常、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体を担体化合物と核酸との間で競合するため、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵器官に回収される核酸の量を実質的に低下させることができる。例えば、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与した場合、部分的にホスホロチオエートであるｄｓＲＮＡの肝組織における回収を低下させることができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」とは、動物に１つ以上の核酸を送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルのことである。賦形剤は、液体または固体であってもよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望の大きさ、硬さ等を提供するように、計画された投与様式を念頭において選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアレート、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸と有害に反応しない、非経口以外の投与に好適な薬学的に許容される有機賦形剤または無機賦形剤を用いて、本発明の組成物を製剤化することもできる。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水性溶液、または液体油基剤もしくは固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤を含み得る。核酸と有害に反応しない、非経口以外の投与に好適な薬学的に許容される有機賦形剤または無機賦形剤を使用することができる。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。
他の成分
本発明の組成物は、薬学的組成物に慣用的に見られる他の補助成分を、その技術分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、もしくは抗炎症剤等の、適合性で、薬学的に活性のあるさらなる物質を含み得るし、または例えば、色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤等の、本発明の組成物の様々な投薬形態を物理的に製剤化する際に有用なさらなる物質を含み得る。しかしながら、このような物質は、添加されるときに、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害してはならない。製剤を滅菌し、望ましい場合には、製剤の核酸と有害に相互作用しない、補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味料、および／または芳香物質等）と混合することができる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた、安定化剤を含み得る。
併用療法
一態様において、本発明の組成物は、併用療法に使用することができる。「併用療法」という用語は、他の生物学的に活性な成分（第２のおよび異なる抗悪性腫瘍剤等であるが、それらに限定されない）および非薬物療法（外科手術または放射線治療等であるが、それらに限定されない）とさらに組み合わせた対象化合物の投与を含む。例えば、本発明の化合物は、他の薬学的に活性な化合物、好ましくは、本発明の化合物の効果を強化することができる化合物と組み合わせて使用することができる。本発明の化合物は、同時に（単一の調製物または別個の調製物として）または他方の薬物療法に続いて投与することができる。概して、併用療法は、治療の単一の周期または過程中の２つ以上の薬物の投与を想定する。
本発明の一態様において、対象化合物は、種々の病状に関与するタンパク質キナーゼを調節する１つ以上の別個の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。かかるキナーゼの例としては、次のものを挙げることができるが、それらに限定されない：セリン／トレオニン特異的キナーゼ、受容体チロシン特異的キナーゼ、および非受容体チロシン特異的キナーゼ。セリン／トレオニンキナーゼには、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、減数分裂特異的キナーゼ（ＭＥＫ）、ＲＡＦ、およびオーロラキナーゼが含まれる。受容体キナーゼファミリーの例としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｘｍｒｋ、ＤＥＲ、Ｌｅｔ２３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えば、ＦＧＦ−Ｒｌ、ＧＦＦ−Ｒ２／ＢＥＫ／ＣＥＫ３、ＦＧＦ−Ｒ３／ＣＥＫ２、ＦＧＦ−Ｒ４／ＴＫＦ、ＫＧＦ−Ｒ）、肝細胞成長／分散因子受容体（ＨＧＦＲ）（例えば、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＳＥＡ、ＳＥＸ）、インスリン受容体（例えば、ＩＧＦＩ−Ｒ）、Ｅｐｈ（例えば、ＣＥＫ５、ＣＥＫ８、ＥＢＫ、ＥＣＫ、ＥＥＫ、ＥＨＫ−Ｉ、ＥＨＫ−２、ＥＬＫ、ＥＰＨ、ＥＲＫ、ＨＥＫ、ＭＤＫ２、ＭＤＫ５、ＳＥＫ）、ＡｘＩ（例えば、Ｍｅｒ／Ｎｙｋ、Ｒｓｅ）、ＲＥＴ、および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（例えば、ＰＤＧＦα−Ｒ、ＰＤＧβ−Ｒ、ＣＳＦｌ−Ｒ／ＦＭＳ、ＳＣＦ−Ｒ／Ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦ−Ｒ／ＦＬＴ、ＮＥＫ／ＦＬＫ１、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２／ＳＴＫ−１）が挙げられる。非受容体チロシンキナーゼファミリーには、ＢＣＲ−ＡＢＬ（例えば、ｐ４３ａｂｌ、ＡＲＧ）、ＢＴＫ（例えば、ＩＴＫ／ＥＭＴ、ＴＥＣ）、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＢＭＸ、ＦＥＲ、ＣＤＫ、およびＳＹＫが含まれるが、それらに限定されない。
本発明の別の態様において、対象化合物は、非キナーゼ生物学的標的またはプロセスを調節する１つ以上の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。かかる標的には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０）、およびプロテアソームが含まれる。
一実施形態において、対象化合物は、Ｚｏｌｉｎｚａ、Ｔａｒｃｅｖａ、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｇｌｅｅｖｅｃ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｓｐｒｙｃｅｌ、Ｎｅｘａｖａｒ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ＣＮＦ２０２４、ＲＧ１０８、ＢＭＳ３８７０３２、Ａｆｆｍｉｔａｋ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＡＧ２４３２２、ＰＤ３２５９０１、ＺＤ６４７４、ＰＤ１８４３２２、Ｏｂａｔｏｄａｘ、ＡＢＴ７３７、およびＡＥＥ７８８等の、１つ以上の生物学的標的を阻害する抗悪性腫瘍剤（例えば、小分子、モノクローナル抗体、アンチセンスＲＮＡ、および融合タンパク質）と組み合わされてもよい。かかる組み合わせは、薬剤のいずれかのみによって達成される有効性を上回って、治療有効性を強化し得、耐性突然変異的変異体の出現を予防または遅延し得る。
ある種の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。化学療法剤は、腫瘍学の分野における広範な治療的処置を包含する。これらの薬剤は、腫瘍を縮小させる、外科手術後に残された残存する癌細胞を破壊する、寛解を誘発する、寛解を維持する、および／または癌およびその処置に関連する症状を緩和する目的のために、種々の病期において投与される。かかる薬剤の例としては、マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド）、エチレンイミン（チオテパ、ヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホン酸塩（ブサルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびテモゾロミド）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、イホスファミドおよび金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）等のアルキル化薬剤；ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびカンプトテシン類似体（イリノテカンおよびトポテカン）等の植物アルカロイド；クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、およびイダルビシン）、およびマイトマイシン、アクチノマイシン等の抗癌抗生物質、ならびにブレオマイシン等のその他の抗生物質；葉酸アンタゴニスト（メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン）、ピリミジンアンタゴニスト（５−フルオロウラシル、フォクスリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン）、プリンアンタゴニスト（６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン）、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、クロファラビン、チオグアニン、ネララビン、およびペントスタチン）等の抗代謝剤；トポイソメラーゼＩ阻害剤（イロノテカン、トポテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸、テニポシド）等のトポイソメラーゼ阻害剤；モノクローナル抗体（アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ）；ならびにリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（ヒドロキシ尿素）等のその他の抗悪性腫瘍剤；副腎皮質ステロイド阻害剤（ミトタン）；酵素（アスパラギナーゼおよびペガスパルガーゼ）；微小管阻害剤（エストラムスチン）；ならびにレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。ある種の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学保護剤と組み合わせて投与される。化学保護剤は、身体を保護する、または化学療法の副作用を最小化するように作用する。かかる薬剤の例としては、アミホスチン、メスナ、およびデクスラゾキサンが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の一態様において、対象化合物は、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線は、一般的に、内部的に（癌部位の近くへの放射性材料の移植）、または光子（ｘ線またはガンマ線）もしくは粒子放射線を用いる機械から外部的に送達される。併用療法が放射線治療をさらに含む場合、放射線治療は、治療薬剤および放射線治療の組み合わせの相互作用からの有益な効果が達成される限り、任意の好適な時間に行われてもよい。例えば、適切な場合には、有益な効果は、放射線治療が、おそらくは数日間またはさらに数週間、治療薬剤の投与から一時的に除去された場合にも依然として達成される。
本発明の化合物が、免疫療法剤と組み合わせて使用され得ることは理解されよう。免疫療法の１つの形態は、腫瘍から離れた部位にワクチン組成物を投与することによる、宿主起源の活性な全身性腫瘍特異的免疫反応の生成である。単離された腫瘍−抗原ワクチンおよび抗イディオタイプワクチンを含む、種々のタイプのワクチンが提案されている。別のアプローチは、治療される対象からの腫瘍細胞またはかかる細胞の誘導体を使用することである（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：４８７により概説される）。米国特許第５，４８４，５９６号、Ｈａｎｎａ Ｊｒ．らは、腫瘍を手術により除去すること、コラゲナーゼにより細胞を分散させること、細胞に照射すること、および患者に約１０７細胞の用量を少なくとも３回連続でワクチン投与することを含む、再発または転移を予防するために切除可能な癌を治療するための方法を特許請求する。
本発明の化合物が、１つ以上の補助的な治療剤と組み合わせて有利に使用され得ることは理解されよう。補助的療法に好適な薬剤の例としては、コルチコステロイド（アムシノニド、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、酢酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、１７−プロピオン酸クロベタゾール、コルチゾン、デフラザコルト、デスオキシメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デソニド、フロ酸塩、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、およびハロベタゾールプロプリオナート）等のステロイド；トリプタン（例えば、スマトリプタンまたはナラトリプタン）等の５ＨＴｉアゴニスト；アデノシンＡｌアゴニスト；ＥＰリガンド；グリシンアンタゴニスト等のＮＭＤＡ調節物質；ナトリウムチャンネル遮断薬（例えば、ラモトリジン）；サブスタンスＰアンタゴニスト（例えば、ＮＫｉアンタゴニスト）；カンナビノイド；アセトアミノフェンまたはフェナセチン；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエン受容体アンタゴニスト；ＤＭＡＲＤ（例えば、メトトレキセート）；ガバペンチンおよび関連する化合物；三環系抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン）；ニューロン安定化抗てんかん薬；モノ−アミン作動性取り込み阻害剤（例えば、ベンラファキシン）；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；ｉＮＯＳもしくはｎＮＯＳ阻害剤等の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤；腫瘍壊死因子の放出もしくは作用の阻害剤；モノクローナル抗体療法等の抗体療法；ヌクレオシド阻害剤（例えば、ラミブジン）または免疫系調節物質（例えば、インターフェロン）等の抗ウイルス剤；オピオイド鎮痛剤；局所麻酔薬；カフェインを含む刺激剤；Ｈ２−アンタゴニスト（例えば、ラニチジン）；プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）；制酸剤（例えば、水酸化アルミニウムまたはマグネシウム；消泡剤（例えば、シメシコン）；充血緩和剤（例えば、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボ−デソキシエフェドリン）；鎮咳薬（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カルミフェン、カルベタペンタン、またはデキストロメトルファン）；利尿薬；または鎮静もしくは非鎮静抗ヒスタミン薬が挙げられる。
本発明の化合物は、他の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと同時投与することができる。例えば、本発明の化合物は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと同時投与することができる。一例において、ＡＤ−１２１１５は、ｃ−Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡと同時投与することができる。ｃ−Ｍｙｃ標的化ｓｉＲＮＡの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３７３，０３９号に開示される。
脂質粒子を調製する方法
本発明の方法および組成物は、ある種のカチオン性脂質を活用し、その合成、調製、および特性化は、下におよび添付の実施例に説明される。加えて、本発明は、治療剤、例えば、核酸に関連する粒子を含む、脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間混合物を生成し、ここで封入された核酸は、約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５〜１５重量％の核酸／脂質比で存在する。中間混合物は、任意に、脂質で封入された核酸粒子を得るようにサイズ調節されてもよく、ここで脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単一ラメラ小胞である。次いでｐＨは、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部分を中和するように上昇させられ、このようにして少なくとも部分的に表面が中和された脂質で封入された核酸組成物を提供する。
上述の通り、これらのカチオン性脂質のうちの複数は、アミノ基のｐＫａを下回るｐＨで荷電され、ｐＫａを上回るｐＨで実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と称され、２ステッププロセスを用いて本発明の製剤に使用することができる。第１に、脂質小胞は、核酸の存在下で、滴定可能なカチオン性脂質および他の小胞成分と共に、より低いｐＨで形成することができる。この様態においては、小胞は核酸を封入し、取り込む。第２に、新たに形成された小胞の表面電荷は、培地のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａを上回るレベルまで、すなわち、生理学的ｐＨまたはそれよりも高いレベルまで増加させることによって、中和することができる。このプロセスの特に有利な態様は、任意の表面吸着した核酸および中性表面を有する得られた核酸送達媒体の両方の簡便な除去を含む。中性表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環からの急速なクリアランスを回避し、またカチオン性リポソーム調製に関連するある種の毒性を回避することが予想される。核酸−脂質粒子の製剤における、かかる滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関する追加的詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号に提供される。
この様態で形成された小胞が、高含量の核酸を有する均一の小胞サイズの製剤を提供することにさらに留意されたい。追加的に、小胞は、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍのサイズ範囲を有する。
任意の特定の理論に束縛されることを意図せずに、非常に高い効率の核酸封入は、低ｐＨでの静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で、小胞表面は、静電相互作用を通じて、荷電され、核酸の部分を結合させる。外部の酸性緩衝剤がより中性の緩衝剤（例えば、ｐＨ７．５）と交換されるとき、脂質粒子またはリポソームの表面は、中和され、あらゆる外部の核酸が除去されることを可能にする。製剤プロセスについてのより詳細な情報は、種々の刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）に提供される。
上記を考慮して、本発明は、脂質／核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書に記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間混合物を生成し、例えば、ここで封入された核酸は、約１０重量％〜約２０重量％の核酸／脂質比で存在する。中間混合物は、任意に、脂質で封入された核酸粒子を得るようにサイズ調節され、ここで脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単一ラメラ小胞である。次いでｐＨは、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部分を中和するように上昇させられ、このようにして少なくとも部分的に表面が中和された脂質で封入された核酸組成物を提供する。
ある実施形態において、脂質の混合物は、少なくとも次の２つの脂質成分を含む：脂質が、ｐＫａを下回るｐＨでカチオン性であり、ｐＫａを上回るｐＨで中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択される、本発明の第１のアミノ脂質成分、および脂質−核酸粒子の形成中に粒子凝集を防止する脂質の中から選択される、第２の脂質成分。特定の実施形態において、アミノ脂質は、本発明の新規カチオン性脂質である。
本発明の核酸−脂質粒子を調製する際、脂質の混合物は、典型的に有機溶媒中の脂質の溶液である。次いでこの脂質の混合物を乾燥させて薄膜を形成、または凍結乾燥させて粉末を形成した後、緩衝剤水溶液と水和させてリポソームを形成することができる。代替的に、好ましい方法において、脂質混合物をエタノール等の水混和性アルコール中で可溶化し、このエタノール溶液を緩衝剤水溶液に添加し、自発的なリポソーム形成をもたらすことができる。ほとんどの実施形態において、アルコールは、市販されている形態で使用される。例えば、エタノールは、無水エタノール（１００％）として、または残りが水である９５％エタノールとして使用することができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号）にさらに詳細に記載される。
本発明に従って、脂質混合物は、核酸を含有し得る緩衝水溶液と組み合わされる。緩衝水溶液は、典型的に、緩衝剤が脂質混合物中のプロトン化可能脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する溶液である。好適な緩衝剤の例としては、リン酸、酢酸塩、およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩緩衝剤である。好ましい緩衝剤は、封入されている核酸の化学に依存して１〜１０００ｍＭの範囲のアニオンであることが予想され、緩衝剤濃度の最適化は、高い充填レベルの達成にとって重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照されたい）。代替的に、塩化物、硫酸塩等でｐＨ５〜６まで酸性化された純水が有用であり得る。この場合、５％グルコース、もしくは粒子を透析してエタノールを除去するときに粒子膜にわたって浸透ポテンシャルを平衡させるであろう別の非イオン性溶質を添加すること、ｐＨを増加させること、または通常の食塩水等の薬学的に許容される担体と混合することが好適であり得る。緩衝剤中の核酸の量は、異なってもよいが、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬであろう。
脂質および治療用核酸の緩衝水溶液の混合物は、組み合わされて、中間混合物を提供する。中間混合物は、典型的に、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。追加的に、中間混合物もまた、粒子表面上の負電荷性核酸および陽電荷性脂質のイオン性引力に起因して（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質上のプロトン化可能な基のｐＫａ未満のｐＨを有する緩衝剤中で陽電荷性である）、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に結合された核酸のある部分を含有し得る。好ましい実施形態の一群において、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、溶液の各々の体積は、組み合わせたとき、得られたアルコール含量が約２０容量％〜約４５容量％になるように調整される。混合物を組み合わせる方法は、しばしば生成される製剤の規模に依存して種々のプロセスのいずれを含んでもよい。例えば、総体積が約１０〜２０ｍＬ以下である場合、溶液は、試験管中で組み合わせ、ボルテックスミキサーを用いて共に撹拌することができる。好適な生成規模のガラス製品中で、大規模なプロセスを行なうことができる。
任意に、脂質混合物および治療剤（核酸）の緩衝水溶液を組み合わせることによって生成される、脂質で封入された治療剤（例えば、核酸）複合体は、所望のサイズ範囲および比較的狭い分布の脂質粒子サイズを達成するようにサイズ調節することができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物は、約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均直径に合わせてサイズ調節されるであろう。リポソームを所望のサイズに合わせるための複数の技術が利用可能である。１つのサイズ調節方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号に記載される。リポソーム懸濁液をバスソニケーションまたはプローブソニケーションのいずれかによって超音波で分解することにより、約０．０５ミクロン未満の小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）にまでの漸進的なサイズの縮小がもたらされる。均質化は、エネルギーをせん断して大きいリポソームをより小さいリポソームに断片化することに依存する別の方法である。典型的な均質化手順において、多層状の小胞は、選択されたリポソームサイズ、典型的に約０．１〜０．５ミクロンが観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通して再循環される。両方の方法において、粒子サイズ分布は、従来のレーザービーム粒子サイズ決定によってモニタされてもよい。本明細書のある種の方法について、均一な小胞サイズを得るために押出が使用される。
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通すリポソーム組成物の押出は、比較的明確に定められたサイズ分布をもたらす。典型的に、懸濁液は、所望のリポソーム複合体サイズ分布が達成されるまで、膜を通して１回以上循環させられる。リポソームは、リポソームサイズの段階的縮小を達成するために、順次により細孔な膜を通して押出されてもよい。場合によっては、いかなるサイズ調節も行わずに、形成される脂質−核酸組成物を使用することができる。
特定の実施形態において、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質上部分の表面電荷の少なくとも一部を中和するステップをさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、封入されていない核酸が脂質粒子表面から遊離され、従来の技術を用いて組成物から除去することができる。好ましくは、封入されおらず、表面吸着した核酸は、緩衝剤溶液の交換を通じて得られた組成物から除去される。例えば、クエン酸塩緩衝剤（ｐＨ約４．０、組成物を形成するために使用）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ ｐＨ約７．５）溶液と交換することにより、リポソームは中和され、核酸が表面から放出される。次いで放出された核酸は、標準的な方法を用いてクロマトグラフィを介して除去することができ、次いで使用される、脂質のＫａを上回るｐＨを有する緩衝剤に切り替えることができる。
任意に、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を緩衝剤水溶液中の水和によって形成し、核酸の添加前に、上述の方法のいずれかを用いてサイズ調節することができる。上述の通り、緩衝剤水溶液は、アミノ脂質のｐＫａを下回るｐＨであるべきである。次いで核酸の溶液は、これらのサイズ調節された、形成済み小胞に添加される。かかる「形成済み」小胞への核酸の封入を可能にするために、混合物は、エタノール等のアルコールを含有しているべきである。エタノールの場合、それは、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在するべきである。加えて、緩衝剤水溶液−エタノール混合物中の、形成済み小胞および核酸の混合物を、脂質小胞の組成物および拡散の性質に依存して約２５℃〜約５０℃の温度まで加温することが必要な可能性がある。脂質小胞中の核酸の所望のレベルを達成するための封入プロセスの最適化は、エタノール濃度および温度等の可変要素の操作を必要とするであろうことは、当業者にとって明らかであろう。核酸封入に好適な条件の例は、実施例に提供される。一旦核酸が形成済み小胞内に封入されると、外部のｐＨは、表面電荷を少なくとも部分的に中和するために増加させることができる。次いで封入されておらず、表面吸着した核酸を上述の通りに除去することができる。
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法
また別の態様において、本発明は、哺乳類におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本方法は、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が、長い持続期間、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、または４週間以上減少するように、本発明の組成物を哺乳類に投与することを含む。
例えば、ある種の例では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、本明細書に記載される二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。表１ｂ、表２ｂ、および表５ｂは、種々の濃度の種々のＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡ分子を用いた体外アッセイで得られた発現の阻害についての広範な値を提供する。
好ましくは、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の減少の効果は、哺乳類の血液中の、およびより具体的には血清中の、ＬＤＬｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルの減少をもたらす。幾つかの実施形態において、ＬＤＬｃレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、もしくは６０％、またはそれより多く減少する。
本方法は、ｄｓＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、この場合、ｄｓＲＮＡは、治療される哺乳類のＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する。治療される生物が、ヒト等の哺乳類である場合、組成物は、経口経路、または静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の手段によって投与することができる。幾つかの実施形態において、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。
本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を下方調節することによって調節され得る疾患および病態を治療することができる。例えば、本明細書に記載される組成物を使用して、高脂血症、また高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、ならびに心疾患および循環器疾患等のこれらの障害に関連する病理学的病態等の他の形態の脂質平衡失調を治療することができる。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡで治療される患者には、脂質障害を治療することが知られている薬剤等のｄｓＲＮＡ以外の治療剤も投与される。
一態様において、本発明は、対象、例えば、ヒトにおけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、第１の単回用量のｄｓＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間抑制するのに十分な用量を投与すること、および任意に、第２の単回用量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、ここで、第２の単回用量は、第１の単回用量を投与してから、少なくとも５日、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日後に投与され、それによって、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの用量は、多くて４週間に１回、多くて３週間に１回、多くて２週間に１回、または多くて１週間に１回、投与される。別の実施形態において、投与は、１か月間、２か月間、３か月間、または６か月間、または１年間、またはそれより長い間維持することができる。
別の実施形態において、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）レベルが、７０ｍｇ／ｄＬ超、１３０ｍｇ／ｄＬ超、１５０ｍｇ／ｄＬ超、２００ｍｇ／ｄＬ超、３００ｍｇ／ｄＬ超、または４００ｍｇ／ｄＬ超等の所定の最小レベルに到達するかまたはそれを超えた場合に、投与を提供することができる。
一実施形態において、対象は、（単に、誰がそれ必要としているかという理由で患者を選択するのとは対照的に）少なくとも一部は、ＬＤＬを低下させるか、ＨＤＬを低下させることなくＬＤＬを低下させるか、ＡｐｏＢを低下させるか、またはＨＤＬを低下させることなく総コレステロールを低下させる必要があることに基づいて選択される。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、免疫系を活性化せず、例えば、ｄｓＲＮＡは、ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−アルファレベル等のサイトカインレベルを増大させない。例えば、本明細書に記載されるアッセイ等の、体外のＰＢＭＣアッセイ等のアッセイによって測定した場合に、ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−アルファのレベルの増大は、ＰＣＳＫ９を標的としないｄｓＲＮＡ等の対照ｄｓＲＮＡで処置した対照細胞の３０％、２０％、または１０％未満である。
一態様において、本発明は、例えば、ヒト対象等の対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子発現の下方調節によって仲介可能な、障害、病理学的プロセス、または症状を、治療、予防、または管理する方法を提供する。一実施形態において、障害は高脂血症である。本方法は、第１の単回用量のｄｓＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間抑制するのに十分な用量を投与すること、および任意に、第２の単回用量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、ここで、第２の単回用量は、第１の単回用量を投与してから、少なくとも５日、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日後に投与され、それによって、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
別の実施形態において、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡ、すなわち、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、または脂質代謝異常等の脂質障害を治療することが知られている薬剤等の、ｄｓＲＮＡ以外の治療剤と共に投与される。例えば、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタンカリウム、例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．のコザール（登録商標））、アセチルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、遺伝子ベースの治療、複合血管保護剤（例えば、Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓ製のＡＧＩ−１０６７）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様化合物であるＩＢＡＴ阻害剤（例えば、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ製のＳ−８９２１）、スクアレン合成酵素阻害剤、または単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−Ｉ阻害剤とともに投与することができる。例示的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤としては、アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒのリピトール（登録商標）／タホール／ソルティス／トルバスト／カーディル）、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのプラバコール、Ｓａｎｋｙｏのメバロチン／サナプラブ）、シンバスタチン（Ｍｅｒｃｋのゾコール（登録商標）／シンバコール、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍのデナン、Ｂａｎｙｕのリポバス）、ロバスタチン（Ｍｅｒｃｋのメバコール／メビナコール、Ｂｅｘａｌのロバスタチナ、セパ；Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐｈａｒｍａのリポスクラー）、フルバスタチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓのレスコール（登録商標）／ロコール／ローコール、Ｆｕｊｉｓａｗａのクラノック、Ｓｏｌｖａｙのディガリル）、セリバスタチン（Ｂａｙｅｒのリポベイ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのベイコール）、ロスバスタチン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのクレストール（登録商標））、およびピチバスタチン（イタバスタチン／リシバスタチン）（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｗａ Ｋｏｇｙｏ、Ｓａｎｋｙｏ、およびＮｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。例示的なフィブラートとしては、例えば、ベザフィブラート（例えば、Ｒｏｃｈｅのベフィザール（登録商標）／セデュル（登録商標）／ベザリップ（登録商標）、Ｋｉｓｓｅｉのベザトール）、クロフィブラート（例えば、Ｗｙｅｔｈのアトロミド−Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒのリピディル／リパンチル、Ａｂｂｏｔｔのトリコール（登録商標）、Ｔａｋｅｄａのリパンチル、ジェネリック品）、ジェムフィブロジル（例えば、Ｐｆｉｚｅｒのロピッド／リプール）、およびシプロフィブラート（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏのモダリム（登録商標））が挙げられる。例示的な胆汁酸捕捉剤としては、例えば、コレスチラミン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのクエストラン（登録商標）およびクエストラン・ライト（商標））、コレスチポール（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａのコレスチド）、ならびにコレセベラン（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｓａｎｋｙｏのウェルコール（商標））が挙げられる。例示的なナイアシン治療としては、例えば、Ａｖｅｎｔｉｓのニコビッド、Ｕｐｓｈｅｒ−Ｓｍｉｔｈのナイアコール、Ａｖｅｎｔｉｓのニコラー、およびＳａｎｗａｋａｇａｋｕのペリシット等の即時放出製剤が挙げられる。ナイアシン持続放出製剤としては、例えば、Ｋｏｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのナイアスパンおよびＵｐｓｈｅｒ−ＳｍｉｔｈのＳＩｏ−ナイアシンが挙げられる。例示的な抗血小板剤としては、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒのアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのプラビックス）、ならびにチクロピジン（例えば、ＳａｎｏｆｉＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのチクリッドおよびＤａｉｉｃｈｉのパナルジン）が挙げられる。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと組み合わせて有用な他のアスピリン様化合物には、例えば、アサカード（徐放性アスピリン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）およびパミコグレル（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）が含まれる。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤としては、例えば、ラミプリル（例えば、Ａｖｅｎｔｉｓのアルテース）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．のバソテック）が挙げられる。例示的なアシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤としては、例えば、アバシマイブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシマイブ（ＢｉｏＭεｒｉｅｕｘ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ−５０５（ＳａｎｋｙｏおよびＫｙｏｔｏ）、およびＳＭＰ−７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）が挙げられる。例示的なコレステロール吸収阻害剤としては、例えば、エゼチミブ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ゼチーア（登録商標））およびパマケシド（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。例示的なＣＥＴＰ阻害剤としては、例えば、トルセトラピブ（ＣＰ−５２９４１４とも呼ばれる、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ−７０５（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、およびＣＥＴｉ−Ｉ（Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤としては、例えば、インプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ−１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ−３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。他の例示的なコレステロール調節物質としては、例えば、ＮＯ−１８８６（Ｏｔｓｕｋａ／ＴＡＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ−１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ−１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）が挙げられる。例示的な胆汁酸調節物質としては、例えば、ＨＢＳ−１０７（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕ／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ−５１１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ−１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ−８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＳＤ−５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ−７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストとしては、例えば、テサグリタザール（ＡＺ−２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ネトグリタゾン（ＭＣＣ−５５５）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ−４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ−５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ−９２９（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、およびにＭＫ−７６７（ＭｅｒｃｋおよびＫｙｏｒｉｎ）が挙げられる。例示的な遺伝子ベースの治療としては、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ１２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ−００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）（ＣＶ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）が挙げられる。例示的な糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤としては、例えば、ロキシフィバン（ＤＭＰ７５４とも呼ばれる、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ガントフィバン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ）、およびクロマフィバン（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。例示的なスクワレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＢＭＳ−１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ−２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ−４７５（Ｔａｋｅｄａ）が挙げられる。例示的なＭＣＰ−Ｉ阻害剤は、例えば、ＲＳ−５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。抗アテローム性動脈硬化剤ＢＯ−６５３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体ナイクリン（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ）もまた、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡと組み合わせて投与するのに適している。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとともに投与するのに好適な例示的な併用療法としては、例えば、アドビコール（Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ製のナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにエゼチミブ／シンバスタチン（例えば、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ製のバイトリン（登録商標）１０／１０錠、１０／２０錠、１０／４０錠、および１０／８０錠）が挙げられる。高コレステロール血症を治療するための薬剤であって、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと組み合わせて投与するのに好適なものとしては、例えば、ロバスタチン、ナイアシンアルトプレブ（登録商標）持続放出錠（Ａｎｄｒｘ Ｌａｂｓ）、ロバスタチンカデュエット（登録商標）錠（Ｐｆｉｚｅｒ）、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムクレストール（登録商標）錠（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムレスコール（登録商標）カプセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムレスコール（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムリピトール（登録商標）錠（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、アトルバスタチンカルシウムロフィブラ（登録商標）カプセル（Ｇａｔｅ）、ナイアスパン持続放出錠（Ｋｏｓ）、ナイアシンプラバコール錠（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムトリコール（登録商標）錠（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートバイトリン（登録商標）１０／１０錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンＷｅｌＣｈｏｌ（商標）錠（Ｓａｎｋｙｏ）、塩酸コレセベラムゼチーア（登録商標）錠（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブゼチーア（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブゾコール（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。
一実施形態において、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡは、エゼチミブ／シンバスタチンの組合せ（例えば、バイトリン（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡが患者に投与され、次いでｄｓＲＮＡ以外の薬剤が患者に投与される（またはその逆）。別の実施形態において、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ以外の治療剤は、同時に投与される。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを投与する方法をエンドユーザー、例えば、介護者または対象に指示する方法を掲載する。本方法は、任意に、エンドユーザーに１回以上の用量のｄｓＲＮＡを提供すること、および本明細書に記載される治療計画に基づいてｄｓＲＮＡを投与するようエンドユーザーに指示し、それによって、エンドユーザーに指示することを含む。
また別の態様において、本発明は、患者が、ＬＤＬを低下させること、ＨＤＬを低下させることなくＬＤＬを低下させること、ＡｐｏＢを低下させること、またはＨＤＬを低下させることなく総コレステロールを低下させることを必要としていることに基づいて患者を選択することによって、患者を治療する方法を提供する。本方法は、例えば、ＨＤＬレベルを実質的に低下させることなく、患者のＬＤＬレベルまたはＡｐｏＢレベルを低下させるのに十分な量でＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを患者に投与することを含む。
別の態様において、本発明は、患者が、ＡｐｏＢレベルの低下を必要としていることに基づいて患者を選択し、患者のＡｐｏＢレベルを低下させるのに十分な量でＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを患者に投与するすることによって、患者を治療する方法を提供する。一実施形態において、ＰＣＳＫ９の量は、ＬＤＬレベルおよびＡｐｏＢレベルを低下させるのに十分である。別の実施形態において、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡの投与は、患者におけるＨＤＬコレステロールのレベルには影響を及ぼさない。
別途規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野に精通する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含めて、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、例証であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
実施例１．ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子ウォーキング
２つの別々の選択で同定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行なった。
ａ）ヒトとマウスまたはラットのいずれかのＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡおよび
ｂ）標的遺伝子ＰＣＳＫ９に対する予測される特異性を有する全てのヒト反応性ｓｉＲＮＡ。
ヒト、マウス、およびラットのＰＣＳＫ９に対するｍＲＮＡ配列を用いた。ヒト配列ＮＭ＿１７４９３６．２は、ｓｉＲＮＡ選択手順の全体にわたって参照配列として用いた。
ヒトとマウス、およびヒトとラットのＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列で保存されている１９ｍｅｒのストレッチを最初の工程で同定し、ヒトとマウスに交差反応するｓｉＲＮＡ、およびヒトとラットの標的に交差反応するｓｉＲＮＡを選択した。
ヒトＰＣＳＫ９を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを第２の選択で同定した。全ての潜在的なヒトＰＣＳＫ９の１９ｍｅｒ配列を抽出し、候補標的配列として規定した。ヒト、サルに交差反応する配列、ならびにマウス、ラット、ヒト、およびサルに交差反応する配列を表１ａおよび表２ａに全て記載する。これらの配列の化学修飾バージョンおよび体内アッセイと体外アッセイの両方におけるそれらの活性も表１ａおよび表２ａに全て記載する。データは、実施例と図２〜８に記載されている。
候補標的配列とそれらの対応ｓｉＲＮＡをランク付けして、適当なものを選択するために、無関係な標的と相互作用するそれらの予測される潜在能（オフターゲット潜在能）をランキングパラメータとして採用した。低いオフターゲット潜在能を有するｓｉＲＮＡを好ましいものとして規定し、体内でより特異的であると仮定した。
ｓｉＲＮＡ特異的なオフターゲット潜在能を予測するために、以下の仮定を行なった。
１）（５’から３’に数えて）鎖の位置２〜９（シード領域）は、配列の残り部分（非シード領域と切断部位領域）よりも大きくオフターゲット潜在能に寄与し得る。
２）（５’から３’に数えて）鎖の位置１０と１１（切断部位領域）は、非シード領域よりも大きくオフターゲット潜在能に寄与し得る。
３）各々の鎖の位置１と１９は、オフターゲット相互作用に関係がない。
４）オフターゲットスコアは、遺伝子の配列に対するｓｉＲＮＡ鎖配列の相補性とミスマッチの位置とに基づいて、各々の遺伝子と各々の鎖について算出することができる。
５）予測されるオフターゲットの数と最も高いオフターゲットスコアは、オフターゲット潜在能と考えられるに違いない。
６）オフターゲットスコアは、オフターゲットの数よりもオフターゲット潜在能に関連があると考えられるべきである。
７）導入された内部修飾によってセンス鎖活性が不全になる可能性を仮定すれば、アンチセンス鎖のオフターゲット潜在能のみが関連があることになる。
潜在的なオフターゲット遺伝子を同定するために、１９ｍｅｒの候補配列を、公的に入手可能なヒトＲＮＡ配列に対する相同性検索に供した。
オフターゲットスコアを算出するために、各々のオフターゲット遺伝子について、各々の１９ｍｅｒインプット配列に関する以下のオフターゲット特性を抽出した。
Figure 0005894913
オフターゲットスコアは、１〜３の仮定を考慮して以下のように算出した。
Figure 0005894913
インプットの１９ｍｅｒ配列に対応する各々のｓｉＲＮＡに対して最も関連があるオフターゲット遺伝子を、最も低いオフターゲットスコアを有する遺伝子と規定した。したがって、最も低いオフターゲットスコアを、各々のｓｉＲＮＡに対して関連があるオフターゲットスコアと規定した。
実施例２．ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に示されていない場合、そのような試薬は、分子生物学での適用に標準的な品質／純度の分子生物学用試薬の任意の供給業者から入手し得る。
ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および固体支持体として制御された多孔性ガラス（ＣＰＧ，５００Ａ，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１μモルのスケールで固相合成によって生成した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを、それぞれ、対応するホスホロアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、固相合成によって作製した。これらのビルディングブロックを、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト化学を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をボーケージ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）のアセトニトリル（１％）溶液と置き換えることによって導入した。さらなる補助試薬は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護と精製は、確立された方法に従って行なった。収率と濃度は、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２６０ｎｍの波長におけるそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により決定した。二重鎖ＲＮＡは、アニーリング緩衝剤（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合することによって作製し、８５〜９０℃で３分間、水浴で加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却した。アニールしたＲＮＡの溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。
コンジュゲートｓｉＲＮＡ
３’−コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（本明細書で−Ｃｈｏｌ−３’とも呼ぶ）を合成するために、適切に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成に使用した。修飾された固体支持体は、以下のように調製した。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
Figure 0005894913
撹拌し、氷冷したグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水（５０ｍｌ）溶液に、４．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を添加した。その後、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、反応の完了がＴＬＣで確認されるまで混合物を室温で撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
Figure 0005894913
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍｌ、２５．８３ｍｍｏｌ）をこの溶液に０℃で添加した。次いで、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温にし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製して、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
Figure 0005894913
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、２０％ピペリジンを含むジメチルホルムアミドに０℃で溶解した。溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物をその塩酸塩に変換することにより精製した。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
Figure 0005894913
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩をジクロロメタン中に入れた。懸濁液を氷上で０℃に冷却した。懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、クロロギ酸コレステリル（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
Figure 0005894913
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリー化した。混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを、撹拌しながら２０分以内にゆっくり添加した。添加中、温度を５℃未満に保った。撹拌を０℃で３０分間継続し、１ｍＬの氷酢酸を添加し、直後に４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含む４０ｍＬの水を添加した。得られた混合物を各々１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を各々１０ｍＬのリン酸緩衝剤で２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、３回５０ｍＬずつの冷ｐＨ９．５炭酸緩衝剤で抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に合わせ、５回４０ｍＬずつのクロロホルムで抽出し、これを合わせ、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するカラムクロマトグラフィで精製して、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得た。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
Figure 0005894913
メタノール（２ｍＬ）を、ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混合物を含むテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に１時間かけて滴下して添加した。撹拌を還流温度で１時間継続した。室温に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（３ラ４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮し、生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１．５−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−−１０．１３，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
Figure 0005894913
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）を、真空中でピリジン（２×５ｍＬ）とともに蒸発させることにより乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）と４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。反応を室温で一晩行なった。反応をメタノールの添加により反応停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍ水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンとともに蒸発させることにより除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中））で精製した（１．７５ｇ、９５％）。
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ
Figure 0005894913
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をコハク無水物（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空中、４０℃で一晩乾燥させた。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温でアルゴン雰囲気下１６時間撹拌した。その後、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷水性クエン酸（５重量％、３０ｍＬ）および水（２ラ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をそのまま次の工程に使用した。
コレステロール誘導体ＣＰＧ ＡＩ
Figure 0005894913
スクシネートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）混合液に溶解した。この溶液に、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（１．２５ｍＬ）、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）を連続的に添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（０．６ｍｌ）を添加した。反応混合物は明るいオレンジ色に変わった。リストアクションシェーカーを用いて、溶液を短く撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗に通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続的に洗浄した。未反応アミノ基を酢酸無水物／ピリジンを用いてマスクした。達成されたＣＰＧの充填を、ＵＶを測ることによって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
コレステリル誘導体について、核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入するためにボーケージ試薬を用いて酸化工程を行なったことを除き、５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書で「５’−Ｃ３２−」と呼ぶ）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書で「５’−Ｃｈｏｌ−」と呼ぶ）を有するｓｉＲＮＡの合成は、ＷＯ２００４／０６５６０１号に記載の通りに実施した。
Ｃｈｏｌ−ｐ−（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ−アセチルガラクトサミン−コレステロール）（図１６）およびＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ−アセチルガラクトサミン−３’−リトコール−オレオイル）（図１７）にコンジュゲートされたｄｓＲＮＡの合成は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１２／３２８，５２８号（２００８年１２月４日出願）に記載されている。
実施例３．ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、および初代サル肝細胞におけるＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡスクリーニングは、高度に活性のある配列を見出す
ＨｕＨ−７細胞は、ＪＣＲＢ細胞Ｂａｎｋ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（Ｓｈｉｎｊｕｋｕ，Ｊａｐａｎ，カタログ番号：ＪＣＲＢ０４０３）から入手した。細胞は、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ａ２２１３）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｋ０２８２）を含むように補充したダルベッコのＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｆ０４３５）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で培養した。ＨｅｐＧ２細胞とＨｅＬａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ タイプ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，カタログ番号ＨＢ−８０６５）から入手し、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ａ２２１３）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｋ−０２９３）、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｌ−０４７３）を含むように補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号２１０９０−０２２）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で培養した。
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に２．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（単回用量スクリーニング用に３０ｎＭ）のトランスフェクションを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１６６８−０１９）を用いて、製造元により記載されている通りに行なった。
トランスフェクションから２４時間後、ＨｕＨ７細胞とＨｅｐＧ２細胞を溶解し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをプロトコルに従ってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ−０００−０２）を用いて定量した。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化した。各々のｓｉＲＮＡについて、８つの個々のデータポイントを収集した。ＰＣＳＫ９遺伝子と無関係なｓｉＲＮＡ二重鎖を対照として用いた。所与のＰＣＳＫ９特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、対照ｓｉＲＮＡ二重鎖で処置した細胞におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ濃度と比べた、処置細胞におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ濃度の割合として表した。
初代カニクイザル肝細胞（凍結保存したもの）を、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｍ００３０５）から入手し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（カタログ番号Ｚ９９０２９）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター内で培養した。
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、初代カニクイザル細胞をコラーゲンコートプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０８−７７４−５）に、９６ウェルプレート中、３．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（３０ｎＭからの２倍希釈系列を８つ）の２つ１組でのトランスフェクションを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１６６８−０１９）を用いて、製造元により記載されている通りに行なった。
トランスフェクションから１６時間後、培地を、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックス（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号Ｚ９９０００）が添加された新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地に交換した。
培地交換から２４時間後、初代カニクイザル細胞を溶解し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをプロトコルに従ってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ−０００−０２）を用いて定量した。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化した。その後、正規化したＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比を、リポフェクトアミン２０００のみの対照のＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比と比較した。
表１ｂおよび表２ｂ（および図６Ａ）に結果をまとめ、異なる細胞株における異なる用量での体内スクリーニングの例を示す。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングは、所与の用量での残存する転写物のパーセンテージとして表した。
高度に活性のある配列とは、１００ｎＭ以下の用量の所与のｓｉＲＮＡで処置した後に７０％未満の転写物が残存する配列のことである。非常に活性のある配列とは、１００ｎＭ以下の用量の処置後に６０％未満の転写物が残存する配列のことである。活性のある配列とは、高用量（１００ｎＭ）で処置した後に９０％未満の転写物が残存する配列のことである。
また、活性のあるｓｉＲＮＡの例を、以下に記載の通りに、リピドイド製剤中でマウスにおいて体内でスクリーニングした。体外で活性のある配列は、一般に、体内でも活性があった（図６Ａおよび図６Ｂおよび実施例４参照）。
実施例４．マウスにおけるＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの体内効力のスクリーニング
ＬＮＰ−０１リポソーム中に処方された３２個のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを、マウスモデルにおいて体内で試験した。ＬＮＰ０１は、コレステロール、ｍＰＥＧ２０００−Ｃ１４グリセリド、およびｄｓＲＮＡから生成されたリピドイド製剤である。ＬＮＰ０１製剤は、ｄｓＲＮＡを肝臓に送達するのに有用である。
処方手順
リピドイドＬＮＰ−０１・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（図１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ脂質）を用いて、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。各々のエタノールストック溶液を調製した：ＬＮＰ−０１、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。その後、ＬＮＰ−０１コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６のストック溶液を、４２：４８：１０のモル比で組み合わせた。組み合わせた脂質溶液を、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％となり、かつ最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、（酢酸ナトリウムｐＨ５中の）水性ｓｉＲＮＡと速やかに混合した。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、サーモバレル押出し成形機（Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ脂質，Ｉｎｃ）を用いて、ポリカーボネート膜（１００ｎｍカットオフ）を通して押出し成形した場合もあった。押出し成形工程を省いた場合もあった。エタノール除去およびそれと同時に行なわれる緩衝剤交換を、透析または接線流濾過のいずれかによって達成した。緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。
製剤の特徴付け
標準的な方法または押出成形を含まない方法のいずれかによって調製された製剤を、同様の方法で特徴付けることができる。製剤は、まず目視検査で特徴付けられる。これらは、凝集物または堆積物を含まない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質−ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いた動的光散乱によって測定される。粒子は、２０〜３００ｎｍ、理想的には、４０〜１００ｎｍのサイズであるべきである。粒子サイズ分布は、単峰型であるべきである。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、および封入された画分は、色素排出アッセイを用いて推定される。処方されたｓｉＲＮＡの試料は、製剤を崩壊させる界面活性剤である０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合色素リボｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートされる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線と比べた、界面活性剤を含む試料からのシグナルによって決定される。封入された画分は、総ｓｉＲＮＡ含有量から（界面活性剤の非存在下でのシグナルによって測定される）「遊離の」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって決定される。封入されるｓｉＲＮＡの割合は、通常、＞８５％である。
ボーラス投与
Ｃ５７／ＢＬ５マウス（６匹／群、８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＬＮＰ−０１中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、体重１ｇ当たり１０μＬで、５ｍｇ／ｋｇ用量の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、マウスを赤外線ランプの下に置いた。
投与から４８時間後に、ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、−８０℃で保存した。
凍結した肝臓は、６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析するまで−８０℃で保存した。
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μＬの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μＬのライセートを９０μＬの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨまたはシクロフィリンＢに特異的なプローブセットとともに、５２℃で一晩インキュベートした。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア２．０（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ−００２−０２）を援用して、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＥ）プローブ用、Ｌａｂｅｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＬＥ）プローブ用、およびブロッキング（ＢＬ）プローブ用の核酸配列を、ＰＣＳＫ９、ＧＡＰＤＨ、およびシクロフィリンＢの核酸配列から選択した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡまたはシクロフィリンＢ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
マウス血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、ＳｔａｎＢｉｏ コレステロールＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒキット（ＳｔａｎＢｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｏｅｒｎｅ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、４９５ｎｍで測定を行なった。
結果
少なくとも１０個のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡは、ＰＢＳで処置した対照群と比較して４０％よりも大きいＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡノックダウンを示したのに対し、無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群には効果がなかった（図２〜図３）。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングは、これらの動物における総血清コレステロールの低減とも相関した（図４〜図５）。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのノックダウンに関して最も効果のあるｓｉＲＮＡは、最も顕著なコレステロール低減効果も示した（図２〜図３と図４〜図５を比較されたい）。さらに、体外で活性のある分子と体内で活性のある分子の間には、強い相関関係があった（図６Ａと図６Ｂを比較されたい）。
異なる化学修飾を含む配列もまた、体外（表１および表２）と体内でスクリーニングした。一例として、あまり修飾されていない配列ＡＤ−９３１４およびＡＤ−９３１８と、その配列ＡＤ−９３１４がより修飾されたバージョン（ＡＤ−１０７９2、ＡＤ−１０７９3、およびＡＤ−１０７９6）；ＡＤ−９３１８がより修飾されたバージョン（ＡＤ−１０７９4、ＡＤ−１０７９５、ＡＤ−１０７９７）を、体外（初代サル肝細胞）または体内で両方とも試験した（ＬＮＰ−０１中に処方されたＡＤ−９３１４およびＡＤ−１０７９２）。図７（表１および表２も参照）は、親分子ＡＤ−９３１４およびＡＤ−９３１８と、その修飾バージョン全てに体外で活性があったことを示している。一例としての図８は、親ＡＤ−９３１４配列とより高度に修飾されたＡＤ−１０７９２配列の両方に体内で活性があり、それらがマウスにおける内在性ＰＣＳＫ９の５０〜６０％のサイレンシングを示すことを示している。図９は、ＡＤ−９３１４およびＡＤ−０７９２の他の化学修飾バージョンの活性をさらに例示している。
ＡＤ−１０７９２の誘導体である、ＡＤ−３５１１は、１０７９２と同じくらい効果的であった（約０．０７〜０．２ｎＭのＩＣ５０）（データは示さない）。ＡＤ−３５１１のセンス鎖とアンチセンス鎖の配列は以下の通りである。
センス鎖：５’−ＧｃｃｕＧＧＡＧｕｕｕＡｕｕｃＧＧＡＡｄＴｓｄＴ配列番号１５２１
アンチセンス鎖：５’−ｐｕＵＣＣＧＡＡｕＡＡＡＣＵＣｃＡＧＧＣｄＴｓｄＴ配列番号１５２２
実施例５．ラットおよびＮＨＰにおけるＰＣＳＫ９の作用持続時間に関する実験
ラット
ラットを尾静脈注射により５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１−１０７９２（処方されたＡＬＤＰ−１０７９２）で処置した。示した時点（表３参照）で血液を採取し、ＰＢＳ処置動物と比較した総コレステロールの量を標準的な方法で測定した。総コレステロールレベルは、２日目に約６０％減少したが、２８日目までにベースラインに戻った。これらのデータは、ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの処方されたバージョンが、コレステロールレベルを長時間低減させることを示している。
サル
カニクイザルをＬＮＰ０１で処方されたｄｓＲＮＡで処置し、ＬＤＬ−Ｃレベルを評価した。合計１９匹のカニクイザルを投与群に割り当てた。１１日目から始めて、動物に以下のスケジュールに従って１日２回、制限給餌した：午前９時に給餌、午前１０時に食餌除去、午後４時に給餌、午後５時に食餌除去。投与の最初の日に、全ての動物に３０分の静脈内注入を１回投与した。臨床兆候、体重、および臨床病理指数（直接的なＬＤＬコレステロールとＨＤＬコレステロールを含む）の変化について、動物を評価した。
大腿静脈からの静脈穿刺を用いて、血液試料を採取した。試料は、朝の給餌の前（すなわち、午前９時前）と朝の給餌の約４時間後（午後１時から）に、第１群〜第７群については３日前、１日前、３日目、４日目、５日目、および７日目に；第１群、第４群、および第６群については１４日目に；第１群については１８日目と２１日目に；ならびに第４群および第６群については２１日目に採取した。各時点において、１．０ｍｌの試料を少なくとも２つ採取した。
１．０ｍｌの血清試料には抗凝固剤を添加せず、各々１．０ｍｌの血漿試料には乾燥抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（Ｋ２）を添加した。凝固を促進するために、血清試料を少なくとも２０分間室温で静置し、その後、試料を氷上に置いた。血漿試料は、試料採取後できるだけ速やかに氷上に置いた。さらなる処理のために、試料は３０分以内に臨床病理学実験室に運んだ。
冷却遠心分離機を用いて、試験施設標準操作手順によって、血液試料をできるだけ速やかに処理して血清または血漿にした。各々の試料をほぼ等しい３つの容量に分けて、液体窒素中で素早く凍結し、−７０℃に置いた。各々のアリコートは、最低でも約５０μＬとなったはずであった。採取された全試料容量が１５０μＬ未満の場合、残りの試料容量を最後のチューブに入れた。各々の試料に、動物番号、投与群、採取日、日付、名目採取時間、および研究番号をラベルした。血清ＬＤＬコレステロールは、製造元の指示書に従ってＢｅｃｋｍａｎ分析装置で標準的な手順により直接測定した。
結果を表４に示す。５ｍｇ／ｋｇで投与したＬＮＰ０１−１０７９２とＬＮＰ０１−９６８０は、用量投与後３〜７日以内に血清ＬＤＬコレステロールを減少させた。血清ＬＤＬコレステロールは、ＬＮＰ０１−１０７９２を受けた動物では１４日目までに、およびＬＮＰ０１−９６８０を受けた動物では２１日目までに、ベースラインレベルに戻った。このデータにより、ＬＮＰ０１で処方されたＡＬＤＰ−９６８０のコレステロール低減について２１日を上回る作用持続時間が示された。
実施例６．ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡは肝臓抽出物におけるＰＣＳＫ ｍＲＮＡ減少を引き起こし、血清コレステロールレベルを低減させる。
ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡによるＰＣＳＫ９転写物の急性サイレンシング（およびその後のＰＣＳＫ９タンパク質の下方調節）が、総コレステロールレベルを急性に低減させることになるかどうかを検討するために、ｓｉＲＮＡ分子ＡＤ−１ａ２（ＡＤ−１０７９２）をＬＮＰ０１リピドイド製剤中に処方した。これらのｄｓＲＮＡの配列と修飾を表５ａに示す。リポソームで処方されたｓｉＲＮＡ二重鎖ＡＤ−１ａ２（ＬＮＰ０１−１ａ２）を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスまたはＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに異なる用量で低容量（マウスの場合、約０．２ｍｌ、ラットの場合、約１．０ｍｌ）で尾静脈から注射した。
マウスでは、注射から４８時間後に、肝臓を採取し、ＰＣＳＫ９転写物のレベルを測定した。肝臓に加えて、血液を採取し、総コレステロールの解析に供した。ＬＮＰ０１−１ａ２は、明白な用量応答を示し、ルシフェラーゼを標的とする対照ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ０１−ｃｔｒｌ）またはＰＢＳ処置動物と比較してＰＣＳＫ９メッセージの抑制が最大であった（約６０〜７０％）（図１４Ａ）。最高の用量でのＰＣＳＫ９転写物の減少により、マウスにおける総コレステロールが約３０％低減することになった（図１４Ｂ）。このコレステロール低下レベルは、ヘテロ接合ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスについて報告されたレベルとホモ接合ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスについて報告されたレベルの間である（Ｒａｓｈｉｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５３７４−９，２００５，ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ １，２００５）。したがって、ＲＮＡｉ機構によるＰＣＳＫ９転写物の低減は、マウスにおける総コレステロールを急性に減少させることができる。さらに、ＰＣＳＫ９転写物に対する効果は２０〜３０日間持続し、より高い用量でより大きい初期の転写物レベルの低下を示し、また、より持続する効果を後に示した。
高用量のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤でさえもコレステロールレベルが変化しないままであるので、ラットにおける総コレステロールの下方調節は、歴史的に見て困難であった。興味深いことに、マウスと比較して、ラットは、ｂＤＮＡアッセイで測定した場合に、遥かにより高レベルのＰＣＳＫ９基礎転写物レベルを有するように見える。ラットに、１、２．５、および５ｍｇ／ｋｇで尾静脈からＬＮＰ０１−ａ２の単回注射を投与した。注射から７２時間後肝臓組織と血液を採取した。ＬＮＰ０１−１ａ２は、対照ルシフェラーゼｓｉＲＮＡおよびＰＢＳと比較して、明白な用量応答効果を示し、最も高い用量でＰＣＳＫ９転写物が最大５０〜６０％サイレンシングされた（図１０Ａ）。ｍＲＮＡのサイレンシングは、１０日間持続する約５０〜６０％の急性の血清総コレステロール減少を伴い（図１０Ａおよび図１０Ｂ）、約３週までに徐々に投与前のレベルに戻った（図１０Ｂ）。この結果から、ｓｉＲＮＡターゲッティングによるＰＣＳＫ９の低減が、ラットモデル系において総コレステロールに対する急性の強力な持続的効果を有することが示された。観察された転写物の低下がｓｉＲＮＡ機構によるものであったことを確認するために、処置動物または対照動物に由来する肝臓抽出物を５’ＲＡＣＥに供した。５’ＲＡＣＥは、予測されたｓｉＲＮＡ切断事象が起こることを示すために以前に利用された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ．４４１：１１１−４，２００６，Ｅｐｕｂ ２００６ Ｍａｒ ２６）。ＰＣＲ増幅と予測された部位特異的ｍＲＮＡ切断事象の検出は、ＬＮＰ０１−１ａ２で処置した動物で観察されたが、ＰＢＳ対照動物またはＬＮＰ０１−ｃｔｒｌ対照動物では観察されなかった（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍａｎｅｔｓｋｙら（２００８）ＰＮＡＳ １０５：１１９７１５−１１９２０）。この結果から、観察されたＬＮＰ０１−１ａ２の効果は、ｓｉＲＮＡ特異的機構を介したＰＣＳＫ９転写物の切断によるものであることが示された。
ＰＣＳＫ９がコレステロールレベルに影響を及ぼす機構は、細胞表面上のＬＤＬＲの数と関連がある。（マウス、ＮＨＰ、およびヒトとは対照的に）ラットは、コレステロール合成を厳しく調節することによって、また、それ程ではないがＬＤＬＲレベルを制御することによって、コレステロールレベルを制御している。ＬＤＬＲの調節がＲＮＡｉによるＰＣＳＫ９の治療的ターゲッティングによって起こったかどうかを調べるために、本発明者らは、５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１−１ａ２で処置したラットで（ウェスタンブロッティングによって）肝臓ＬＤＬＲレベルを定量した。図１１に示すように、ＬＮＰ０１−１ａ２で処置した動物は、ＰＢＳまたはＬＮＰ０１−ｃｔｒｌ対照ｓｉＲＮＡで処置した動物と比較して、ＬＮＰ０１−１ａ２の単回投与から４８時間後のＬＤＬＲレベルを著しく（約３〜５倍）誘導していた。
ＰＣＳＫ９の低下によって肝臓自体のトリグリセリドとコレステロールのレベルが変化するかどうかを検討するためのアッセイも行なった。ＶＬＤＬの会合と分泌に関与する遺伝子（例えば、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）またはＡｐｏＢ）を、遺伝子欠失、化合物、またはｓｉＲＮＡ阻害剤により急性に低減させることによって、肝臓トリグリセリドが増大した（例えば、Ａｋｄｉｍら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．脂質ｏｌ．１８：３９７−４００，２００７参照）。肝臓でのＰＣＳＫ９サイレンシングによって誘導される血漿コレステロールの排除の増大（およびその後の肝臓ＬＤＬＲレベルの増大）が肝臓トリグリセリドの蓄積をもたらすことは予測されていなかった。しかしながら、この可能性を検討するために、処置動物または対照動物の肝臓における肝臓コレステロールと肝臓トリグリセリドの濃度を定量した。図１０Ｃに示すように、対照と比較して、ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを投与されたラットの肝臓ＴＧレベルまたは肝臓コレステロールレベルには統計的な差がなかった。これらの結果により、ＰＣＳＫ９サイレンシングとその後のコレステロール低減は、過剰な肝脂質蓄積をもたらす可能性が低いことが示された。
実施例７．ｓｉＲＮＡに対するさらなる修飾は、ラットにおけるコレステロール低下のサイレンシングと持続時間に影響を及ぼさない
ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端でのホスホロチオエート修飾は、エキソヌクレアーゼから保護することができる。ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方における２’ＯＭｅ修飾と２’Ｆ修飾は、エンドヌクレアーゼから保護することができる。ＡＤ−１ａ２（表５ｂ参照）は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に２’ＯＭｅ修飾を含む。化学修飾（２’ＯＭｅ修飾と２’Ｆ修飾またはその混合）の（ヒト血清中でのｓｉＲＮＡ安定性によって測定される）固有の安定性またはその程度もしくは種類が、観察されたラットでのサイレンシング効果の効力または持続時間に関連するかどうかを明らかにするために実験を行なった。同じＡＤ−１ａ２コア配列を有するが、異なる化学修飾を含むｓｉＲＮＡの安定性を生じさせ、初代カニクイザル肝細胞における体外の活性について調べた。一連のこれらの分子は、ＰＣＳＫ９サイレンシングについて、体外のＩＣ５０値によって測定した場合によく似た活性を維持したが（表５ｂ）、その後、これらをヒト血清中でのエキソヌクレアーゼ切断とエンドヌクレアーゼ切断に対する安定性について調べた。各々の二重鎖をヒト血清中、３７℃（タイムコース）でインキュベートし、ＨＰＬＣ分析に供した。親配列ＡＤ−１ａ２は、ヒトプール血清中で約７時間のＴ１／２を有していた。配列ＡＤ−１ａ３、ＡＤ−１ａ５、およびＡＤ−１ａ４は、より大きく修飾されていたが（表５の化学修飾を参照）、全て２４時間を上回るＴ１／２’を有していた。化学修飾または安定性の違いによって効力の変化が生じたのかどうかを検討するために、ＡＤ−１ａ２配列、ＡＤ−１ａ３配列、ＡＤ−１ａ５配列、ＡＤ−１ａ４配列、およびＡＤ−対照配列を処方し、ラットに注射した。投与後の様々な日に動物から血液を採取し、総コレステロール濃度を測定した。以前の実験から、ＬＮＰ０１−１ａ２で処置されたラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルの低減と総コレステロールレベルの低減との間に非常に密接な相関があることが示されていた（図１０Ａ）。４つの分子は全て、投与２日目に（ＰＢＳまたは対照ｓｉＲＮＡに対して）総コレステロールを約６０％減少させることが観察され、また、これらの分子は全て、総コレステロールレベルに対して同等の効果を有し、よく似た強度プロファイルと持続時間プロファイルを示した。ヒト血清中での異なる化学的性質または安定性にもかかわらず、これらの分子によって示されるコレステロール低減の大きさと効果の持続時間に統計的な差はなかった。
実施例８．ＬＮＰ０１−１ａ２とＬＮＰ０１−３ａ１は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＣＳＫ９と循環ヒトＰＣＳＫ９タンパク質をサイレンシングする。
ＬＮＰ０１−１ａ２（すなわち、ＰＣＳ−Ａ２またはＡＤ−１０７９２）と、別の分子ＡＤ−３ａ１（すなわち、ＰＣＳ−Ｃ２またはＡＤ−９７３６）（これは、ヒトとサルのＰＣＳＫ９メッセージのみを標的とする）がヒトＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングする効力を体外で調べた。ＡｐｏＥプロモーターの下でヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジェニックマウスの株を用いた（Ｌａｇａｃｅら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２９９５−３００５，２００６）。１１６：２９９５−３００５、２００６）．それぞれ、ヒトの転写物とタンパク質は検出するが、マウスの転写物とタンパク質は検出しない、特異的ＰＣＲ試薬と特異的抗体を設計した。ヒト化マウスのコホートに、単回用量のＬＮＰ０１−１ａ２（別名、ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ａ２）またはＬＮＰ０１−３ａ１（別名、ＬＮＰ−ＰＣＳ−Ｃ２）を注射し、４８時間後に肝臓と血液を採取した。単回用量のＬＮＰ０１−１ａ２またはＬＮＰ０１−３ａ１は、ヒトＰＣＳＫ９ 転写物レベルを＞７０％減少させることができ（図１５Ａ）、この転写物の下方調節によって、ＥＬＩＳＡで測定した場合に著しくより低いレベルの循環ヒトＰＣＳＫ９タンパク質がもたらされた（図１５Ｂ）。これらの結果により、両方のｓｉＲＮＡがヒト転写物をサイレンシングすることができ、また後に循環血漿のヒトＰＣＳＫ９タンパク質の量を低下させることができることが示された。
実施例９．分泌ＰＣＳＫ９レベルは、ＮＨＰでは食餌によって調節される。
マウスでは、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルは、ステロール調節エレメント結合タンパク質−２という転写因子によって調節されており、絶食によって低下する。臨床的な慣例、および標準的なＮＨＰ研究では、一晩の絶食期間の後、血液採取とコレステロールレベルを測定する。これは、一部には、循環ＴＧの変化によってＬＤＬｃ値の算出が妨げられる可能性があるためである。マウスでの絶食行為と給餌行為によるＰＣＳＫ９レベルの調節を考慮して、ＮＨＰにおける絶食と給餌の効果を理解するために実験を行なった。
１時間後に食餌を除去する１日２回の給餌スケジュールにカニクイザルを順化させた。動物に、朝９時から１０時まで食餌を与え、その後、食餌を除去した。動物には、次に午後５時から６時までの１時間、もう１度食餌を与え、その後、食餌を除去した。（午後６時から翌朝の９時までの）一晩の絶食の後と、さらに、朝９時の給餌から２時間後および４時間後に、血液を採取した。血液血漿または血液血清中のＰＣＳＫ９レベルをＥＬＩＳＡアッセイで測定した（方法を参照）。興味深いことに、循環ＰＣＳＫ９レベルは、一晩の絶食の後により高く、給餌から２時間後と４時間後に減少することが分かった。このデータは、ＰＣＳＫ９レベルが食餌の摂取によって高度に調節される齧歯類モデルと一致していた。しかしながら、予期しないことに、ＰＣＳＫ９のレベルは、給餌後の最初の数時間下がった。この結果により、処方されたＡＤ−１ａ２と初代カニクイザル肝細胞で高度に活性のある別のＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−２ａ１）の有効性を、より慎重に設計したＮＨＰ実験によって追跡することができるようになった。
実施例１０．ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における循環ＬＤＬｃ、ＡｐｏＢ、およびＰＣＳＫ９を低下させるが、ＨＤＬｃは低下させない。
ＰＣＳＫ９標的化ｓｉＲＮＡにより、マウスとラットにおいて、投与後７２時間までにＰＣＳＫ９レベルと総コレステロールレベルの両方が急性に低減し、単回投与後、約２１〜３０日持続した。こうした知見を、そのリポタンパク質プロファイルがヒトのリポタンパク質プロファイルと最もよく似ている種にまで拡大するために、さらなる実験をカニクイザル（Ｃｙｎｏ）モデルで行なった。
両方ともＰＣＳＫ９を標的とする、ｓｉＲＮＡ １（ＬＮＰ０１−１０７９２）とｓｉＲＮＡ ２（ＬＮＰ−０１−９６８０）を、カニクイザルに投与した。図１２に示すように、両方のｓｉＲＮＡは、投与後７日までの間、顕著な脂質低減を引き起こした。ｓｉＲＮＡ ２は、投与後少なくとも７日間の約５０％の脂質低減と、投与後１４日での約６０％の脂質低減を引き起こし、ｓｉＲＮＡ １は、少なくとも７日間の約６０％の脂質低減を引き起こした。
まず、オスのカニクイザルを、４０ｍｇ／ｄｌ以上のＬＤＬｃを有するサルかどうかについて事前にスクリーニングした。その後、選ばれた動物に絶食／給餌の食餌投与計画を施し、１１日間順化させた。投与の３日前と１日前に、絶食時と給餌後４時間の両方の時点で血清を採取し、総コレステロール（Ｔｃ）、ＬＤＬ（ＬＤＬｃ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬｃ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）、ならびにＰＣＳＫ９の血漿レベルを解析した。３日前のＬＤＬｃレベルに基づいて動物を無作為抽出した。投与の日（１日目と表記する）に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＬＮＰ０１−１ａ２および５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ０１−２ａ１を、対照としてのＰＢＳおよび１ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ０１−ｃｔｒｌと並行して注射した。投与は全て十分に許容され、生存中の所見はなかった。実験が進むにつれて、より低い用量は有効でないことが（ＬＤＬｃ低減に基づいて）明らかになった。したがって、本発明者らは、ＰＢＳ群の動物に１４日目に５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ０１−ｃｔｒｌ対照ｓｉＲＮＡを投与したが、これはその後、５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ０１−１ａ２および５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ０１−２ａ１の高用量群に対する追加の対照としての役割を果たすことができた。まず、投与後３、４、５、および７日目に動物から血液を採取し、Ｔｃ、ＨＤＬｃ、ＬＤＬｃ、およびＴＧの濃度を測定した。（ＬＤＬｃレベルが７日目までにベースラインに戻らなかったので）高用量群のＬＮＰ０１−１ａ２、ＬＮＰ０１−２ａ１からの追加の採血は、投与後１４日目と２１日目に行なった。
図１２Ａに示すように、ＬＮＰ０１−１ａ２またはＬＮＰ０１−２ａ１の単回投与は、投与後３日目からの統計的に有意なＬＤＬｃの低下をもたらし、これは、約１４日（ＬＮＰ０１−１ａ２の場合）および約２１日（ＬＮＰ０１−２ａ１）かけてベースラインに戻った。この効果は、ＰＢＳ群でも、対照ｓｉＲＮＡ群でも、１ｍｇ／ｋｇ処置群でも見られなかった。投与前のレベルと比較して、ＬＮＰ０１−２ａ１は、投与から７２時間後に平均で５６％のＬＤＬｃ低減をもたらし、４匹の動物のうちの１匹は、ほぼ７０％のＬＤＬｃ減少を達成し、他は全て、＞５０％のＬＤＬｃ減少を達成した（図１２Ａ参照）。予期した通り、血清ＥＬＩＳＡで測定した場合、処置動物におけるＬＤＬｃの低減は、循環ＡｐｏＢレベルの低下とも相関した（図１２Ｂ）。興味深いことに、このカニクイザルの研究で観察されたＬＤＬｃ低減の程度は、高用量スタチンについて、および高コレステロール血症のために使用される他の現在のケア化合物標準について報告されている程度よりも大きかった。作用の開始も、スタチンの作用の開始よりも遥かにより急性であり、投与後早くも４８時間で見られる。
ＬＮＰ０１−１ａ２処置もＬＮＰ０１−２ａ１処置も、ＨＤＬｃの低減をもたらさなかった。それどころか、両分子とも、Ｔｃ／ＨＤＬ比の減少傾向を（平均的に）もたらした（図１２Ｃ）。さらに、循環トリグリセリドレベルと、１匹の動物を例外として、ＡＬＴとＡＳＴのレベルは、それほど影響されなかった。
ＰＣＳＫ９タンパク質レベルも処置動物と対照動物で測定した。図１１に示すように、ＬＮＰ０１−１ａ２処置とＬＮＰ０１−２ａ１処置は各々、投与前と比べて、循環ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの減少傾向をもたらした。具体的に、より活性のあるｓｉＲＮＡ ＬＮＰ０１−２ａ１は、ＰＢＳ対照（３〜２１日目）およびＬＮＰ０１−ｃｔｒｌ ｓｉＲＮＡ（４日目、７日目）対照と比べて、循環ＰＣＳＫ９タンパク質の顕著な低下を示した。
実施例１１．修飾されたｓｉＲＮＡおよびｐｈｏｂｉｃ中の免疫反応の活性化
初代ヒト血液単球（ｐｈｏｂｉｃ）中の免疫系の活性化について、ｓｉＲＮＡを試験した。２つの対照誘導配列と未修飾の親化合物ＡＤ−１ａ１は、ＩＦＮ−αとＴＮＦ−αの両方を誘導することが分かった。しかしながら、この配列の化学修飾バージョン（ＡＤ−１ａ２、ＡＤ−１ａ３、ＡＤ−１ａ５、およびＡＤ−１ａ４）ならびにＡＤ−２ａ１は、これらの同じアッセイにおけるＩＦＮ−αとＴＮＦ−αの両方の誘導について陰性であった（表５、ならびに図１３Ａおよび１３Ｂを参照）。したがって、化学修飾は、ｓｉＲＮＡ分子に対するＩＦＮ−α応答とＴＮＦ−α応答の両方を鈍化させることができる。さらに、リポソームに処方して、マウスで試験したとき、ＡＤ−１ａ２も、ＡＤ−２ａ１も、ＩＦＮ−αを活性化しなかった。
実施例１２．ｓｉＲＮＡコンジュゲートの評価
ＡＤ−−１０７９２をＧａｌＮＡｃ）３／コレステロール（図１６）またはＧａｌＮＡｃ）３／ＬＣＯ（図１７）にコンジュゲートした。このコンジュゲートを用いてセンス鎖を３’末端に合成した。コンジュゲートｓｉＲＮＡを、以下に示す方法を用いて、マウスにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対する効果についてアッセイした。
簡潔に述べると、尻尾への注射により２つのコンジュゲートｓｉＲＮＡまたはＰＢＳのうちの１つを連続３日間、すなわち、０日目、１日目、および２日目に、約１００、５０、２５、または１２．５ｍｇ／ｋｇの投薬量でマウスに投与した。最後の投与から２４時間後にマウスを屠殺し、血液試料と肝臓試料を取得し、保存し、処理し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルと総血清コレステロールを測定した。
結果を図１８に示す。対照ＰＢＳと比較して、両方のｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＧａｌＮＡｃ）３／コレステロールコンジュゲートＡＤ−１０７９２については、３ラ５０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０、およびＧａｌＮＡｃ）３／ＬＣＯコンジュゲートＡＤ−１０７９２については、３×１００ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０の活性を示した。これらの結果により、ＧａｌＮＡｃを含むコレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡは、肝臓で活性があり、ＰＣＳＫ９のサイレンシングが可能であり、結果としてコレステロール低減をもたらすことが示されている。
ボーラス投与
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（６匹／群、８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡをＬＮＰ−０１中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、ＰＢＳで１．０、０．５、０．２５、および０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、体重１ｇ当たり１０μＬで、１００、５０、２５、および１２．５ｍｇ／ｋｇ用量の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、マウスを赤外線ランプの下に置いた。
最後の投与から２４時間後に、ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、−８０℃で保存した。凍結した肝臓は、６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析するまで−８０℃で保存した。
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μＬの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μＬのライセートを９０μＬの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットとともに、５２℃で一晩インキュベートした。マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨのプローブセットはＰａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡから購入した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
マウス血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、総 コレステロールアッセイ（Ｗａｋｏ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、６００ｎｍで測定を行なった。
実施例１３．脂質で処方されたｓｉＲＮＡの評価
簡潔に述べると、尻尾への注射によりＳＮＡＬＰで処方されたｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを、ＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ−１０７９２の単回投薬量を約０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇにして、ラットに投与した。投与から７２時間後にラットを屠殺し、血液試料と肝臓試料を取得し、保存し、処理し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルと総血清コレステロールを測定した。対照ＰＢＳと比較して、ＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ−１０７９２（図１９Ａ）は、ＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルの両方の低減について、約１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有した。これらの結果は、ＳＮＡＬＰで処方されたｓｉＲＮＡの投与が、体内での効果的でかつ効率的なＰＣＳＫ９のサイレンシングとその後の総コレステロールの低減をもたらすことを示している。
ボーラス投与
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（５匹／群、１７０〜１９０ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰ中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、ＰＢＳで０．０６６、０．２、および０．６ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、体重１ｇ当たり５μＬで、０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ−１０７９２の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、ラットを赤外線ランプの下に置いた。
最後の投与から７２時間後に、ＣＯ２窒息によりラットを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、−８０℃で保存した。凍結した肝臓は、６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析するまで−８０℃で保存した。
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μＬの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μＬのライセートを９０μＬの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、ラットＰＣＳＫ９およびラットＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットとともに５２℃で一晩インキュベートした。ラットＰＣＳＫ９およびラットＧＡＰＤＨのプローブセットはＰａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡから購入した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるラットＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ラットＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
ラット血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、総 コレステロールアッセイ（Ｗａｋｏ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、６００ｎｍで測定を行なった。
実施例１４．ＡＤ−９６８０およびＡＤ−１４６７６のミスマッチ歩行のＨｅｌａ細胞中の体外効力のスクリーニング
ＡＤ−９６８０、ＡＤ−１４６７６、およびＡＤ−１０７９２の有効性に対する配列の変異または修飾の効果をＨｅＬａ細胞でアッセイした。表６に示す通り、幾つかの変異体を合成し、ＤＦＴ（２，４−ジフルオロトルイル、ワトソン−クリック対を欠くチミジン三リン酸形状類似体）の添加を含め、すなわち、単独または組み合わせのミスマッチを添加し、次の２つの異なる骨格化学を試験した：２’−Ｏメチルによる主導、または２’Ｆでの置換。
３つの親二重鎖の配列は表１に見出すことができ、それらを次の通り複製する：
Figure 0005894913
Figure 0005894913
ＨｅＬａを、１００μＬの１０％胎仔ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェルプレート（８，０００〜１０，０００細胞／ウェル）に入れた。細胞が約５０％コンフルエンスに達したとき（約２４時間後）、１０ｎＭから連続４倍希釈のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ウェル当たり０．４μＬのトランスフェクション試薬リポフェクトアミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションを行なった。すなわち、ｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体を以下のように調製した。適当な量のｓｉＲＮＡを、血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ 血清Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、穏やかに混合した。リポフェクトアミン（商標）２０００を使用前に穏やかに混合し、その後、９６ウェルプレートの各ウェルに対して、０．４μＬを、２５μＬの血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ 血清Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。５分のインキュベーションの後、１μＬの希釈したｓｉＲＮＡを、希釈したリポフェクトアミン（商標）２０００と組み合わせた（総容量は２６．４μＬである）。この複合体を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体を形成させた。その後、１０％胎仔ウシ血清を含む１００μＬのＤＭＥＭを、各々のｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体に添加し、プレートを前後に揺り動かすことによって穏やかに混合した。１００μＬの上記混合物を、細胞を含む各ウェルに添加し、プレートをＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２４時間インキュベートし、その後、培養培地を除去し、１０％胎仔ウシ血清を含む１００μＬのＤＭＥＭを添加した。
培地交換から２４時間後に、培地を除去し、細胞を溶解し、細胞ライセートを、製造元のプロトコルに従いｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）によって、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのサイレンシングについてアッセイした。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。細胞ライセートにおけるヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比をリポフェクトアミン（商標）２０００のみの対照で処置した細胞のヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比と比較した。
図２０は、ＡＤ−９６８０と関連する一連の化合物の用量応答曲線である。図２１は、ＡＤ−１４６７６と関連する一連の化合物の用量応答曲線である。これらの結果は、特定の位置におけるＤＦＴまたはミスマッチが、（より低いＩＣ５０値からも明らかなように）両方の親化合物の活性を増大させることができることを示している。図２４は、親二重鎖ＡＤ−９６８０およびＡＤ−１０７９２の効率を、修飾された二重鎖と比較する用量反応曲線であり、ここでＤＦＴはセンス鎖の１０位に挿入される。この修飾は、ＨｅＬａ細胞中の効率を約２倍改善する。
理論に束縛されることを望まないが、ミスマッチ、またはＤＦＴの導入によるセンス鎖の不安定化は、センス鎖のより素早い除去をもたらし得ることが仮定される。
実施例１５．高濃度のＨｅｐ３Ｂ細胞中のオフターゲット効果の欠如
製造業者の指示に従って（１μＬのトランスフェクション試薬、逆トランスフェクションプロトコル）、試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、脂質で製剤化されたＰＣＳＫ９標的化ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−９６８０）を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中に、２５０ｎｍ、１μＭ、および５μＭの濃度で３通りにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に試料を収集した。総ＲＮＡを、ＭａｇＭＡＸ（商標）−９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した。ＲＮａｓｅ阻害剤を用いるＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ）により、１３．５μＬのＲＮＡ分取からｃＤＮＡを合成た。ＡＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔａｑｍａｎを使用した。製造業者の指示に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）を用いてｑ−ＰＣＲ反応を設定し、ＡＢＩ ７９００機械上で実行した。デルタデルタＣｔ法を使用して値を産出した。試料をｈＧＡＰＤＨに対して正規化し、モックトランスフェクションに対して校正した。
標的配列に最も近い相同性を有する次の遺伝子についての転写物レベルを測定した：ＯＲＭＤＬ２、ＢＭＰ６、ＴＡＰＴ１、ＭＹＥＦ２、ＬＯＣ４４２２５２、ＲＦＴ１、およびＰＣＳＫ９。
結果を図２２に示す。高濃度のｄｓＲＮＡ（ＰＣＳ−Ｂ２＝ＡＤ−９６８０）でオフターゲット効果は観察されなかった。
Figure 0005894913
実施例１６．より低い投与量のＡＤ−１０７９２によるラットにおける総コレステロールレベルの減少の維持
ラットを３ｍｇ／ｋｇボーラス用量のＳＮＡＬＰ−ＤｌｉｎＤＭＡ製剤化ＡＤ−１０７９２で処置した。２日目に、総血清コレステロールレベルを決定した。これに続いて、週に１回、１．０および０．３ｍｇ／ｋｇで４週間投薬を行った。投薬を反復する１日前にラットを採血し、総血清コレステロールレベルを決定した。陰性対照は、ＰＢＳであった。
結果を図２３のグラフに示す。３ｍｇ／ｋｇボーラス用量後、総コレステロールレベルは、６０％減少し、週に１回、１．０および０．３ｍｇ／ｋｇの投薬を反復することによって約５０％で維持され、反復投薬の停止後は、事前用量のレベルに戻る。
週に１回の、１０倍低い（ＥＣ５０よりも）維持用量は、サイレンシングを効果的に維持し、コレステロールレベルは、最後の注射の１５日後にはベースラインに戻る。総血清コレステロールの減少によって反映されるように、初回用量のＣＳＫ９は、ＬＤＬＲレベルを増加させた。このＬＤＬＲレベルの増加は、り低い投与量の後続の投薬ＡＤ−１０７９２によって反映されるように、ＰＣＳＫ９標的化ｓｉＲＮＡの有効性を増加させた。
実施例１７．ＡＤ−１０７９２の種々の脂質製剤の投与後の、ラットにおけるコレステロールレベルに及ぼす効果のアッセイ
ラットを、ＳＮＡＬＰおよびＬＮＰ０８を含めて、本明細書に記載される、ＡＤ−１０７９２の４つの異なる脂質製剤で処置した。３日目に、総血清コレステロールレベルを決定した。実験は、本明細書に記載される方法を用いて行った。ＬＮＰ−０８で製剤化されたＡＤ−１０７９２の投与は、ＬＮＰ０１製剤（２．０ｍｇ／ｋｇのＥＣ５０）およびＳＮＡＬＰ製剤（１．０ｍｇ／ｋｇのＥＣ５０）と比較して最も低い０．０８ｍｇ／ｋｇのＥＣ５０をもたらす。（データ示されず）。
実施例１８．ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡタイリング実験
ＰＣＳＫ９タイリングセットのバイオインフォマティクス選択
センスおよびアンチセンスオリゴマーを、ＡＬＮ−ＰＣＳＫ９（ＡＤ−９６８０）の１９塩基の標的領域のすぐ上流および下流の隣接領域における、ヒトＰＣＳＫ９転写物を標的とするように設計した。ＰＣＳＫ９遺伝子のための参照ヒト転写物として、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑ ＮＭ＿１７４９３６．２を使用した。ＡＤ−９６８０のアンチセンスオリゴは、ｍＲＮＡの始まりに対して、３５３０位〜３５４８位のＮＭ＿１７４９３６の領域における塩基に相補的な、１９個の連続した塩基を含有した。１セットのｓｉＲＮＡ分子を、ＡＤ−９６８０の標的領域の５’末端から１０塩基上流〜３’末端から１０塩基下流によって定められる、各々独特の１９ｍｅｒの転写物配列のサブセットに対して設計した。ＮＭ＿１７４９３６．２転写物に関して、センスオリゴ１９ｍｅｒの５’位における第１の塩基は、３５２０位〜３５５８位に延長する（表７および８）。
ＰＣＳＫ９タイリング配列の合成：
ＰＣＳＫ９配列を、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成器上で合成した。２セットの配列を作製した。第１のセットは、化学修飾を含有せず（未修飾）、第２のセットは、エンドライト化学修飾により作製した。エンドライト化学修飾を含有する配列において、センス鎖における全てのピリミジン（シトシンおよびウリジン）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換した。アンチセンス鎖において、リボＡヌクレオシドに隣接する（５’位に向かって）ピリミジンを、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドで置換した。センスおよびアンチセンス配列の両方の３’末端において２塩基ｄＴｓｄＴ伸長を導入した。配列ファイルをテキストファイルに変換して、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成ソフトウェアにおける充填に対して適合させた。
ＰＣＳＫ９配列の合成は、ホスホラミダイト化学を用いる固体支持オリゴヌクレオチド合成を使用した。１μｍ規模、９６ウェルプレート中で、上の配列の合成を行った。アミダイト溶液を０．１Ｍ濃度で調整し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を、活性化剤として使用した。第１ステップにおいてメチルアミンを用いて、および第２ステップにおいてフッ化物イオンを用いて、合成した配列を９６ウェルプレート中で切断し、脱保護した。このようにして得た粗配列を、アセトン：エタノール混合物を用いて沈殿させ、ペレットを０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝剤中に再懸濁させた。各配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析し、得られた質量データにより、配列の同一性を確認した。また、選択された試料のセットもＩＥＸクロマトグラフィによって分析した。全ての配列を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを用いるＡＫＴＡ エクスプローラ精製システム上で精製した。完全長配列に相当する単一のピークを溶出液中で収集し、その後、純度についてイオン交換クロマトグラフィによって分析した。精製された配列を、ＡＫＴＡ精製器を用いるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上で脱塩した。脱塩されたＰＣＳＫ９配列を濃度および純度について分析した。次いで一本鎖をアニーリングに供した。
ＰＣＳＫ９タイリングｓｉＲＮＡの体外スクリーニング：
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｈｅｌａ 細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、３７℃で、５％ＣＯ２の雰囲気中で、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、グルタミン（ＡＴＣＣ）を補充したＥａｇｌｅのＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ）中、ほぼコンフルエンスになるまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから放出させた。１ウェル当たり５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ〜５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖を、１ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）と共に９６ウェルプレート中に添加することによって、逆トランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次いで抗生物質を含まず２．０×１０４Ｈｅｌａ細胞を含有する８０μＬの完全増殖培地を添加した。ＲＮＡ精製前に細胞を２４時間インキュベートした。０．１または１０ｎＭ最終二重鎖濃度で実験を行った。用量反応スクリーンについて、１ｎＭ〜１ｆＭの７倍、１０倍連続希釈上で、ＨｅＬａ細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
ＭａｇＭＡＸ−９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｒｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ，パート番号ＡＭ１８３０）を用いて総ＲＮＡを単離した。細胞を収穫し、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解させ、次いで８５０ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて１分間混合した（混合速度はプロセス全体を通じて同一であった）。２０マイクロリットルの磁気ビーズおよび溶解／結合増強剤混合物を、細胞溶解液中に添加し、５分間混合した。時期ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清の除去後、磁気ビーズを洗浄溶液１（イソプロパノールを添加した）で洗浄、１分間撹拌した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次いでビーズを１５０μＬ洗浄溶液２（エタノールを添加した）で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次いで５０μＬのＤＮａｓｅ混合物（ＭａｇＭａｘターボＤＮａｓｅ緩衝剤およびターボＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ Ｒｅｂｉｎｄｉｎｇ溶液を添加し、３分間混合した。上清を除去し、磁気ビーズを１５０μＬ洗浄溶液２で再び洗浄し１分間混合し、上清を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合して乾燥させた後、ＲＮＡを５０μＬの水で溶出した。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を用いてｃＤＮＡを合成した。１反応当たり２μＬ１０Ｘ緩衝剤、０．８μＬ２５Ｘ ｄＮＴＰｓ、２μＬＲａｎｄｏｍプライマー、１μＬＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、１μＬＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μＬのＨ２Ｏのマスター混合物を、１０μＬ総ＲＮＡ中に添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００ 熱循環器（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、次のステップを通じて、ｃＤＮＡを生成した：２５℃１０分間、３７℃１２０分間、８５℃５秒間、４℃維持。
リアルタイムＰＣＲを次の通り行った。２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４７２９７４００１）中、１ウェル当たり１μＬ ＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、１μＬ ＰＣＳＫ９ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＨＳ０３０３７３５５＿Ｍ１）、および１０μＬ Ｒｏｃｈｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ機械（Ｒｏｃｈｅ）中でリアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖を、２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを複製でアッセイした。
ΔΔ Ｃｔ法を用いてリアルタイムデータを分析した。各試料をＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、非標的二重鎖ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞に対してノックダウンを査定した。ＸＬフィットにおいて４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を定めた。
単回用量実験についてのデータを表９に示す。データは、対照ＡＤ−１９５５で標的化された細胞に対して残ったメッセージの百分率として表される。
用量反応スクリーンについてのデータを表１０に示す。データは、ＡＤ−１９５５に対して５０％阻害をもたらすｐＭ単位の用量として表される。各用量反応を２回反復した（Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２）。２つの用量反応スクリーンで生成したＩＣ５０の平均を示す。
図２５において、ＡＤ−９６８０に隣接するｓｉＲＮＡについての平均ＩＣ５０を、ヒトＰＣＳＫ９転写物における標的領域の出発位置に対してプロットした。
このようにして、ＲＮＡｉ剤によりＰＣＳＫ９のヌクレオチド領域３５２０−３５５５を標的とすることは、ＰＣＳＫ９阻害において非常に効果的である。
実施例１９．ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと複合化されたＡｐｏＥ３ベースの再構成ＨＤＬ
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、３０ｍｇ／ｋｇ ｒＥＨＤＬ／ｃｈｏｌ−ｓｉＰＣＳＫ９を、単回ボーラス用量で静脈内投与（尾静脈注射）によって投与した。
Ｃｈｏｌ−ｓｉＰＣＳＫ９（ｄｓＲＮＡ 二重鎖ＡＤ−２０５８３）は、次の配列を有する：
センス：ＧｃｃｕＧＧＡＧｕｕｕＡｕｕｃＧＧＡＡｄＴｓｄＴＬ１０（配列番号１７２９）
アンチセンス：ＰｕＵｆｃＣｆｇＡｆａＵｆａＡｆａＣｆｕＣｆｃＡｆｇＧｆｃｄＴｓｄＴ（配列番号１７３０）
Ｌ１０の構造は次の通りである：
Figure 0005894913
注射後、マウスを終夜絶食させ（約１４時間）、次いで投与の４８時間後に屠殺した。肝臓からのｍＲＮＡレベルをｂＤＮＡアッセイによって決定し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
結果
ｂＤＮＡアッセイの結果を図２６に示し、それは、ｒＥＨＤＬ／ｃｈｏｌ−ｓｉＰＣＳＫ９の投与に続いて、ＰＣＳＫ９における有意な低減が存在するが、複合化されないｓｉＲＮＡｓ（ｃｈｏｌ−ｓｉＰＣＳＫ９）の投与に続いてはそれが存在しないことを示す。ＥＨＤＬ／ｃｈｏｌ−ｓｉＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを約８０％減少させた。
実施例２０．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＬＮＰ−１１で製剤化されたｓｉＲＮＡ
ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＤ−９６８０）をＬＮＰ−１１製剤（本明細書に記載される）中で製剤化し、カニクイザルに投与した。対照は、ＡＤ−１９５５であった。脂質で製剤化されたｓｉＲＮＡを、０．０３、０．１、０．３、および１．０ｍｇ／ｋｇの投与量で３０分間の注入を介して投与した。対照を１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。３日目に、肝臓生検を、ＰＣＳＫ９転写物の測定について行った。−３、−１、３、４、５、７、９、１１、１２、１５、２２、３０、および３７日目に血液試料を収集し、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルならびにＬＤＬ数およびＨＤＬ数を決定した。
結果を図２７Ａ、図２７Ｂ、および図２７Ｃに示す。
図２７Ａおよび図２７Ｂに示すとおり、投与は、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルにおける、迅速で持続可能な用量依存的な低減をもたらし、ＬＤＬ（ＬＤＬコレステロール）レベルにおける５０％超の低減をもたらした。これらの効果は、１キログラム当たり３０〜１００マイクログラムのＥＤ５０用量レベルで非常に強力であった。図２７Ｃに示すとおり、投与は、ＨＤＬレベルにおける変化をもたらさなかった。
実施例２１．ラットにおける、ＬＮＰ−０９で製剤化されたＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡでの用量反応
ｄｓＲＮＡ ＡＤ−１０７９２（標的率ＰＣＳＫ９）を製剤、例えば、ＬＮＰ０９製剤を含有するＸＴＣ中に封入した。ＬＮＰ０９製剤は、５０／１０／３８．５／１．５のモル比％のＸＴＣ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ、および１０：１の脂質：ｓｉＲＮＡ比であった。
製剤を、尾静脈を介して、単回用量（ＤＲＣでラットに注射した。注射の７２時間後に肝臓および血漿を収穫した（１群当たり５匹の動物）。製造業者のプロトコル通り、ＰＣＳＫ９転写物レベルを、調整した肝臓中のｂＤＮＡを介して測定した。また、ＧＡＰＤＨ転写物レベルも測定し、ＰＣＳＫ９のＧＡＰＤＨに対する比率をＰＢＳ対照のそれらに対して正規化し、グラフ化した。ＷＡＫＯ ＴＸ製のコレステロールキットを用いて、血清中の総コレステロールを測定した。
結果を図２９に示す。この製剤により、０．１ｍｇ／ｋｇ未満の用量でラットにおけるＰＣＳＫ９サイレンシングおよび総コレステロール低下が達成された。ＥＤ５０は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの低下について０．２ｍｇ／ｋｇであり、血清コレステロール低下について０．２ｍｇ／ｋｇおよび０．０８であった。
実施例２２．ＬＮＰ−０９で製剤化されたＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡによるトランスジェニックマウスの処置
ヒトＣＥＴＰおよびＡｐｏＢ１００を過剰発現するトランスジェニックマウス（ＣＥＴＰ／ＡｐｏＢ二重ヒト化トランスジェニックマウス、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ）は、ヒトに見出されるＬＤＬ／ＨＤＬ比をより正確に模倣する。
ＣＥＴＰ／ＡｐｏＢ二重ヒト化トランスジェニックマウスをＴａｃｏｎｉｃ ｌａｂｓより購入した。動物に尾静脈を介して５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９で製剤化されたＡＤ−１０７９２（標準的な製剤手順）、またはＡＤ−１９５５ルシフェラーゼ対照を注射した（単回注射）（１群当たり４匹の動物）。注射の７２時間後、肝臓および血漿を収穫し（１群当たり５匹の動物）、肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ、ＬＤＬ粒子、およびＨＤＬ粒子数を決定した。
ＰＣＳＫ９転写物レベルを、製造業者のプロトコルに従って調製された肝臓中のｂＤＮＡを介して測定した。また、ＧＡＰＤＨ転写物レベルも測定し、ＰＣＳＫ９のＧＡＰＤＨに対する比率をグラフ化し、ＰＢＳ対照のそれらに対して正規化した。それらのＳＯＰに基づいてＮＭＲ（Ｌｉｐｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）によってＬＤＬおよびＨＤＬ粒子数／濃度を測定した。
結果を図３０に示す。ＰＣＳＫ９のサイレンシングは、ＬＤＬ粒子濃度を約９０％低下させた一方で、ＨＤＬレベルはやや低下した（ＰＢＳ対照で処置したそれらの処置動物と比較して）。これは、これらの動物における、ＰＣＳＫ９レベルの有意な低下とその後のＬＤＬの低下を実証する。
実施例２３．ヒトにおけるＰＣＳＫ９発現の阻害
単回投与の後、長時間、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害し、コレステロールレベルを低減させるために、ヒト対象を、本明細書に記載されるＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする脂質で製剤化されたｄｓＲＮＡで処置する。一実施形態において、脂質で製剤化されたｄｓＲＮＡは、脂質ＭＣ３を含む。
治療を必要とする対象を選択または特定する。対象は、ＬＤＬを低減させるか、ＨＤＬを低減させることなくＬＤＬを低減させるか、ＡｐｏＢを低減させるか、または総コレステロールを低減させる必要があり得る。対象の特定は、臨床の場で、またはどこか他の場所、例えば、対象の家で、対象自らが自己検査キットを使用することにより、行なわれ得る。
ゼロ時間で、好適な第１の用量の抗ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを対象に皮下投与する。ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の通りに処方する。第１の用量からしばらく経った後、例えば、７日、１４日、および２１日後に、対象の状態を、例えば、ＬＤＬ、ＡｐｏＢ、および／または総コレステロールのレベルを測定することによって評価する。この測定に伴って、該対象におけるＰＣＳＫ９発現、および／または成功したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡターゲッティングの産物を測定することができる。他の関連性のある基準も測定することができる。用量の数と強度は、対象の必要性によって調整される。
処置後、対象のＬＤＬ、ＡｐｏＢ、または総コレステロールのレベルは、処置前に存在したレベルと比べて、または同じように罹患しているが、処置していない対象で測定されるレベルと比べて低減している。
当業者は、本開示に具体的に示された方法および組成物に加えて、本発明を後に添付される特許請求の範囲の全ての範囲に対して実施することを可能にする方法および組成物に精通している。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
 Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ−」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチド上に５’リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド上に３’−ＯＨを有する。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
 Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド；ｍｏｃ、ｍｏｕ、ｍｏｇ、ｍｏａ：対応する２’−ＭＯＥヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって接続されている；ａｂ：３’末端無塩基ヌクレオチド；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ−」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチド上に５’リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド上に３’−ＯＨを有する。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
 Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ−」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチド上に５’リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド上に３’−ＯＨを有する。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
 鎖:Ｓ／センス；ＡＳ／アンチセンス
U、C、A、G：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド；Ｙ１はＤＦＴジフルオロトルイルリボ（またはデオキシリボ）ヌクレオチドに対応する；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ−」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチド上に５’リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド上に３’−ＯＨを有する。
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913
Figure 0005894913

Claims (18)

  1. 細胞におけるヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための、二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、
    前記核酸脂質粒子は、４５〜６５ｍｏｌ％のカチオン性脂質と、５ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％の非カチオン性脂質と、２５〜４０ｍｏｌ％のステロールと、０．５〜５ｍｏｌ％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む、脂質製剤を含み、
    前記カチオン性脂質は、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）を含み、
    前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とから成り、前記センス鎖は、配列番号：１２２７から成り、前記アンチセンス鎖は、配列番号：１２２８から成るものである、組成物。
  2. 前記脂質製剤は、以下から成る群より選択される、請求項１に記載の組成物。
    Figure 0005894913
  3. 各鎖は、小文字「ｃ」または「ｕ」によって示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、および小文字「ｓ」によって示されるホスホロチオエートを含むように、以下のとおりに修飾され、
    前記ｄｓＲＮＡは、
    配列番号１２２９（５’−ｕｕｃｕＡＧＡｃｃｕＧｕｕｕｕＧｃｕｕＴｓＴ−３’）
    から成るセンス鎖、および
    配列番号１２３０（５’−ＡＡＧｃＡＡＡＡｃＡＧＧＵＣｕＡＧＡＡＴｓＴ−３’）
    から成るアンチセンス鎖
    から成る、請求項１または２に記載の組成物。
  4. リポタンパク質をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記ｄｓＲＮＡは、脂質親和体にコンジュゲートされる、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記脂質親和体は、コレステロールである、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ＡｐｏＥは、少なくとも１つの両親媒性物質で再構成される、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記両親媒性物質は、リン脂質である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記両親媒性物質は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される、リン脂質である、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記ＡｐｏＥは、高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）で再構成される、請求項９に記載の組成物。
  12. 細胞において、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物を前記細胞に投与することを含む、方法、ただし、ヒトの治療方法を除く。
  13. 哺乳類において、ＬＤＬｃレベルを低減するための方法に使用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 請求項１３に記載の組成物であって、
    （ａ）哺乳類に投与される用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを含むものであり；あるいは
    （ｂ）ヒトに投与されるｄｓＲＮＡは、０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５．０ｍｇ／ｋｇである、
    組成物。
  15. 対象において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法に使用される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、３ｍｇ／ｋｇの第１の用量で対象に投与され、その後、第１の用量よりも少ない用量で週に少なくとも１回投与される、組成物。
  16. 請求項１５に記載の組成物であって、
    （ａ）前記対象は、ラット、または非ヒト霊長類、またはヒトであり；
    （ｂ）前記その後の用量は、１．０ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇであり；そして／あるいは
    （ｃ）前記その後の用量は、週に１回４週間投与される、
    組成物。
  17. 請求項１５に記載の組成物であって、前記第１の用量の投与は、総コレステロールレベルを１５〜６０％減少させるものである、組成物。
  18. 細胞において、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための方法に使用される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
JP2012516211A 2009-06-15 2010-06-15 Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ Expired - Fee Related JP5894913B2 (ja)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18716909P 2009-06-15 2009-06-15
US61/187,169 2009-06-15
US21835009P 2009-06-18 2009-06-18
US61/218,350 2009-06-18
US24479009P 2009-09-22 2009-09-22
US61/244,790 2009-09-22
US28559809P 2009-12-11 2009-12-11
US61/285,598 2009-12-11
US29347410P 2010-01-08 2010-01-08
US61/293,474 2010-01-08
US31357810P 2010-03-12 2010-03-12
US61/313,578 2010-03-12
PCT/US2010/038707 WO2010148013A2 (en) 2009-06-15 2010-06-15 Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015220441A Division JP2016074685A (ja) 2009-06-15 2015-11-10 Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2012530143A JP2012530143A (ja) 2012-11-29
JP5894913B2 true JP5894913B2 (ja) 2016-03-30

Family

ID=43357015

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012516211A Expired - Fee Related JP5894913B2 (ja) 2009-06-15 2010-06-15 Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
JP2015220441A Pending JP2016074685A (ja) 2009-06-15 2015-11-10 Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015220441A Pending JP2016074685A (ja) 2009-06-15 2015-11-10 Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ

Country Status (13)

Country Link
US (4) US8273869B2 (ja)
EP (1) EP2442792A4 (ja)
JP (2) JP5894913B2 (ja)
KR (1) KR20120050429A (ja)
CN (2) CN104651408A (ja)
AU (1) AU2010260148A1 (ja)
BR (1) BRPI1010689A2 (ja)
CA (1) CA2764832A1 (ja)
EA (1) EA201270019A1 (ja)
IL (1) IL216886A0 (ja)
MX (1) MX2011013421A (ja)
NZ (1) NZ597504A (ja)
WO (1) WO2010148013A2 (ja)

Families Citing this family (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3249052B1 (en) 2006-05-11 2019-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
AU2009241591A1 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of DSRNA targeting the PCSK9 gene
KR102042721B1 (ko) * 2008-11-10 2019-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
BRPI1010689A2 (pt) 2009-06-15 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc "dsrna formulado por lipídios direcionados para o gene pcsk9"
US9187746B2 (en) 2009-09-22 2015-11-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting siRNA agents
PT3338765T (pt) 2009-12-01 2019-03-18 Translate Bio Inc Derivado de esteróide adequado para a administração de arnm em doenças genéticas humanas
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9290760B2 (en) 2010-09-15 2016-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
CA3162352A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
WO2012058693A2 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of pcsk9 genes
ES2702428T3 (es) 2010-11-15 2019-02-28 Life Technologies Corp Reactivos de transfección que contienen amina y métodos para prepararlos y usarlos
CA2822161C (en) * 2010-12-29 2018-05-29 Philipp Hadwiger Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
BR112013018740A2 (pt) 2011-01-28 2019-01-08 Sanofi Sa anticorpos humanos para pcsk9 para uso em métodos de tratamento de grupos específicos de indivíduos
JP6108628B2 (ja) * 2011-03-29 2017-04-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｔｍｐｒｓｓ６遺伝子の発現を阻害する組成物および方法
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012149386A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of cideb expression
BR112013031553A2 (pt) 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
CN103649103A (zh) * 2011-06-21 2014-03-19 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制载脂蛋白c-iii(apoc3)基因表达的组合物与方法
EP3388068A1 (en) 2011-06-21 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes
RU2711799C2 (ru) 2011-06-21 2020-01-22 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3(ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
AU2012318249B2 (en) * 2011-10-05 2016-04-21 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing aldehyde dehydrogenase
KR20220045091A (ko) 2011-11-18 2022-04-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
EA201490993A1 (ru) 2011-11-18 2014-09-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СРЕДСТВА РНКи
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
AU2013243946A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
US10577604B2 (en) 2012-10-15 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring C9ORF72 expression
US10058630B2 (en) * 2012-10-22 2018-08-28 Concievalve, Llc Methods for inhibiting stenosis, obstruction, or calcification of a stented heart valve or bioprosthesis
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
EP2912182B1 (en) 2012-10-23 2021-12-08 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
HUE035887T2 (en) * 2012-12-05 2018-05-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc PCSK9 iRNA preparations and methods for their use
US9939443B2 (en) 2012-12-19 2018-04-10 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Compositions and methods for aptamer screening
US9957499B2 (en) 2013-03-14 2018-05-01 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
IL305374A (en) 2013-03-14 2023-10-01 Ethris Gmbh CFTR mRNA Assemblies and Related Methods and Uses
MX366660B (es) * 2013-03-14 2019-07-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni contra el componente c5 del complemento y métodos para su uso.
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
AU2014259759B2 (en) 2013-05-01 2020-06-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods
AR096203A1 (es) 2013-05-06 2015-12-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Dosificaciones y métodos para administrar moléculas de ácido nucleico formuladas en lípidos
KR102234623B1 (ko) 2013-05-22 2021-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
UY35582A (es) 2013-05-22 2014-10-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES DE ARNi DE SERPINA1 Y SUS MÉTODOS DE USO
EP2810955A1 (en) 2013-06-07 2014-12-10 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
US10494442B2 (en) 2013-06-07 2019-12-03 Sanofi Biotechnology Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP2853595A1 (en) * 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1 specific siRNA molecules
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
KR102307389B1 (ko) 2013-10-04 2021-09-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ａｌａｓ1 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
BR112016007751A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-12 Ionis Pharmaceuticals Inc composições para modulação de expressão de c9orf72
EA202090893A3 (ru) * 2013-10-17 2021-09-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции с ирнк к pcsk9 и способы их применения
EP3574923A1 (en) 2013-10-22 2019-12-04 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
CA2928188A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
US10233465B2 (en) * 2013-11-04 2019-03-19 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
KR101647178B1 (ko) * 2013-11-28 2016-08-23 충남대학교산학협력단 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자
EP3105331B1 (en) * 2014-02-11 2021-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
IL247600B (en) * 2014-03-19 2022-06-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Preparations for the modulation of ataxin 2 expression
EP3981437A1 (en) * 2014-04-23 2022-04-13 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
ES2750661T3 (es) 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
MX2016014013A (es) 2014-05-01 2016-11-15 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del receptor de la hormona del crecimiento.
RU2701645C2 (ru) 2014-05-01 2019-09-30 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии фактора комплемента в
WO2015168532A2 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating pkk expression
BR122020024443B1 (pt) 2014-05-01 2022-02-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto e composição farmacêutica para modulação da expressão de angptl3
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
SG11201609376SA (en) 2014-05-22 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
CA2955294A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Sanofi Biotechnology Methods for treating patients with heterozygous familial hypercholesterolemia (hefh)
WO2016030863A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Compounds and methods for treating viral infections
US9339029B2 (en) * 2014-09-04 2016-05-17 Preceres Inc. Hydrazinyl lipidoids and uses thereof
US9950194B2 (en) 2014-09-09 2018-04-24 Mevion Medical Systems, Inc. Patient positioning system
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
US10307491B2 (en) 2015-01-30 2019-06-04 The Regents Of The University Of Michigan Liposomal particles comprising biological molecules and uses thereof
EP3273944A4 (en) * 2015-03-25 2019-02-27 The Regents of The University of Michigan COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTERING BIOMACROMOLECULE AGENTS
TWI723986B (zh) 2015-04-13 2021-04-11 美商阿尼拉製藥公司 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法
ES2791995T3 (es) 2015-04-16 2020-11-06 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones para modular la expresión de C90RF72
GB2537614A (en) * 2015-04-20 2016-10-26 Heart Biotech Ltd Formulations for inhibition of PCSK9 for the treatment of hypercholesterolemia
CN109477106B (zh) 2015-07-10 2022-10-04 Ionis制药公司 二酰基甘油酰基转移酶2(dgat2)的调节剂
EP3328439B1 (en) 2015-07-31 2020-04-08 Arcturus Therapeutics, Inc. Multiligand agent for drug delivery
PL3329002T3 (pl) 2015-07-31 2021-04-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje irna transtyretyny (ttr) i sposoby ich zastosowania do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z ttr
KR20180034672A (ko) 2015-08-18 2018-04-04 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 지단백질 분리반출술을 경험하고 있는 고지혈증을 갖는 환자를 치료하기 위한 항-pcsk9 억제성 항체
WO2017035340A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating a proprotein convertase subtilisin kexin (pcsk9) gene-associated disorder
EP3736261B1 (en) 2015-09-17 2023-10-11 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US20180273577A1 (en) 2015-09-24 2018-09-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of kras expression
US11260073B2 (en) 2015-11-02 2022-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating C90RF72
EP3371201A4 (en) 2015-11-06 2019-09-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
MX2018005277A (es) 2015-11-06 2018-08-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Modular la expresion de apolipoproteina (a).
CN106810609A (zh) * 2015-11-27 2017-06-09 苏州君盟生物医药科技有限公司 抗pcsk9抗体及其应用
WO2017099823A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
HUE057877T2 (hu) 2015-12-22 2022-06-28 Modernatx Inc Vegyületek és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására
WO2017127750A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
MA45295A (fr) * 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
JP7066632B2 (ja) * 2016-05-09 2022-05-13 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 親油性抗炎症剤を含む脂質ナノ粒子およびその使用方法
CN107441506A (zh) * 2016-05-30 2017-12-08 上海交通大学 基因输送载体及其制备与应用
EP3471778A4 (en) * 2016-06-20 2020-02-19 The Regents of The University of Michigan COMPOSITIONS AND METHOD FOR DELIVERING BIOMACROMOLECOLIC ACTIVE SUBSTANCES
JP7197463B2 (ja) 2016-07-15 2022-12-27 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｓｍｎ２の調節のための化合物及び方法
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
WO2018089540A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
JOP20190112A1 (ar) 2016-11-14 2019-05-14 Amgen Inc علاجات مدمجة لتصلب الشرايين، شاملة مرض قلبي وعائي تصلبي
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
CN108265052B (zh) * 2016-12-30 2021-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
EP3585417B1 (en) 2017-02-27 2023-02-22 Translate Bio, Inc. Method of making a codon-optimized cftr mrna
ES2940259T3 (es) 2017-03-15 2023-05-04 Modernatx Inc Compuesto y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
US11969506B2 (en) 2017-03-15 2024-04-30 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
ES2911186T3 (es) 2017-03-15 2022-05-18 Modernatx Inc Formas cristalinas de aminolípidos
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
WO2018208960A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 Dimension Therapeutics, Inc. Scalable method for producing transfection reagents
IL270631B2 (en) 2017-05-16 2024-03-01 Translate Bio Inc Treatment of cystic fibrosis through the administration of mRNA with an optimal codon encoding ctfr
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
KR20200089656A (ko) 2017-09-19 2020-07-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스타이레틴(ttr) 매개 아밀로이드증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2019105418A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
US11414665B2 (en) 2017-12-01 2022-08-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
US11660347B2 (en) 2017-12-01 2023-05-30 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof
CN110945130B (zh) 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3677679A4 (en) * 2017-12-26 2020-12-02 Guangzhou Ribobio Co., Ltd. ARNSI MOLECULE INHIBITING PCSK9 GENE EXPRESSION AND ITS APPLICATION
CN116375774A (zh) 2017-12-29 2023-07-04 苏州瑞博生物技术股份有限公司 缀合物及其制备方法和用途
PE20211242A1 (es) 2018-01-15 2021-07-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion dnm2
EP3752612A4 (en) 2018-02-12 2021-11-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED COMPOUNDS AND USES THEREOF
WO2019204021A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Pcsk9 targeting oligonucleotides for treating hypercholesterolemia and related conditions
JOP20200280A1 (ar) 2018-05-09 2020-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن fxi
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
CN111655849B (zh) 2018-08-21 2024-05-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
US11174500B2 (en) 2018-08-24 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
WO2020191103A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 Arcturus Therapeutics, Inc. Method of making lipid-encapsulated rna nanoparticles
WO2020247382A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Guide Therapeutics, Inc. Analysis of materials for tissue delivery
JP2022548304A (ja) 2019-09-19 2022-11-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための分岐状尾部脂質化合物及び組成物
EP4045062A1 (en) 2019-10-14 2022-08-24 Astrazeneca AB Modulators of pnpla3 expression
CN110638788A (zh) * 2019-10-25 2020-01-03 广州医科大学 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用
KR102269256B1 (ko) * 2019-11-04 2021-06-24 건국대학교 산학협력단 케피어 유래 프로바이오틱 효모 클루이베로미세스 막시아누스 a5 및 이의 용도
CN111087332B (zh) * 2019-12-11 2021-07-06 东南大学 一种阳离子氨基脂质及其合成方法与应用
BR112022016238A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para modular smn2
EP4081642A1 (en) * 2020-03-16 2022-11-02 Argonaute Rna Limited Antagonist of pcsk9
TW202227101A (zh) 2020-11-18 2022-07-16 美商Ionis製藥公司 用於調節血管收縮素原表現之化合物及方法
CN114657136A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
JP2024515423A (ja) 2021-02-26 2024-04-10 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CA3212128A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
IL307926A (en) 2021-04-26 2023-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transmembrane assemblies, serine 6 ((TMPRSS6 IRNA) and methods of using them
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
DE69634084T2 (de) 1995-06-07 2005-12-08 Inex Pharmaceuticals Corp. Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
WO2000022113A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US20030229037A1 (en) * 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
WO2002081628A2 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
CZ302719B6 (cs) 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20080249040A1 (en) 2001-05-18 2008-10-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040009216A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-15 Rodrigueza Wendi V. Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
SG190613A1 (en) 2003-07-16 2013-06-28 Protiva Biotherapeutics Inc Lipid encapsulated interfering rna
JP2007512355A (ja) 2003-11-21 2007-05-17 アルザ コーポレイション 開裂性のｐｅｇで表面修飾されたリポソーム−ｄｎａ複合体で媒介される遺伝子送達
WO2006073419A2 (en) * 2004-04-01 2006-07-13 Gang Zheng Lipoprotein nanoplatforms
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
AU2005306533B2 (en) 2004-11-17 2012-05-31 Arbutus Biopharma Corporation siRNA silencing of apolipoprotein B
AU2006336384B2 (en) 2005-02-14 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
US7915230B2 (en) 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
CA2616877C (en) 2005-07-27 2014-01-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
AU2006308765B2 (en) 2005-11-02 2013-09-05 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2007115168A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
EP3249052B1 (en) 2006-05-11 2019-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
WO2008011431A2 (en) * 2006-07-17 2008-01-24 Sirna Therapeutics Inc. Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
CA3144493A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
TW200838551A (en) 2006-11-27 2008-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc Methods for treating hypercholesterolemia
WO2008109369A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
CA2930393C (en) * 2007-12-04 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
AU2008342535B2 (en) 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
AU2009241591A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of DSRNA targeting the PCSK9 gene
CA2716793A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
AU2009303345B2 (en) * 2008-10-09 2015-08-20 Arbutus Biopharma Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EA020312B1 (ru) * 2008-10-20 2014-10-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
KR102042721B1 (ko) 2008-11-10 2019-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
EP2373382B1 (en) 2008-12-10 2017-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
EP2391343B1 (en) 2009-01-29 2017-03-01 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
CA3042927C (en) 2009-05-05 2022-05-17 Arbutus Biopharma Corporation Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
BRPI1010689A2 (pt) 2009-06-15 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc "dsrna formulado por lipídios direcionados para o gene pcsk9"
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
WO2012058693A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of pcsk9 genes

Also Published As

Publication number Publication date
CN102458366B (zh) 2015-02-11
JP2012530143A (ja) 2012-11-29
EA201270019A1 (ru) 2012-06-29
NZ597504A (en) 2013-10-25
CN104651408A (zh) 2015-05-27
WO2010148013A3 (en) 2011-02-24
WO2010148013A2 (en) 2010-12-23
US8598139B2 (en) 2013-12-03
US20110015252A1 (en) 2011-01-20
KR20120050429A (ko) 2012-05-18
AU2010260148A1 (en) 2012-02-02
EP2442792A2 (en) 2012-04-25
CN102458366A (zh) 2012-05-16
EP2442792A4 (en) 2015-12-23
JP2016074685A (ja) 2016-05-12
US20130035371A1 (en) 2013-02-07
US20170000815A1 (en) 2017-01-05
BRPI1010689A2 (pt) 2016-03-15
IL216886A0 (en) 2012-02-29
US8273869B2 (en) 2012-09-25
MX2011013421A (es) 2012-03-16
US20140121263A1 (en) 2014-05-01
CA2764832A1 (en) 2010-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5894913B2 (ja) Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
US20190153443A1 (en) METHODS FOR INCREASING EFFICACY OF LIPID FORMULATED siRNA
JP6032724B2 (ja) 脂質製剤組成物およびＥｇ５遺伝子とＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する方法
KR102096014B1 (ko) PCSK9 iRNA 조성물 및 그 사용 방법
KR101397407B1 (ko) Ｅｇ5 및 ＶＥＧＦ 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
JP2017012176A (ja) Ｐｃｓｋ９遺伝子の阻害のための組成物および方法
JP2011511004A (ja) ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを送達するための最適化された方法
JP2013510161A (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
WO2011017548A1 (en) Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
EA037110B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ С иРНК К PCSK9 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130516

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20140120

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140617

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140916

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140924

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20141016

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20141023

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20141217

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150512

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150807

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150818

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151110

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160202

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160229

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5894913

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees