RU2711799C2 - КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3(ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3(ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Download PDF

Info

Publication number
RU2711799C2
RU2711799C2 RU2014101627A RU2014101627A RU2711799C2 RU 2711799 C2 RU2711799 C2 RU 2711799C2 RU 2014101627 A RU2014101627 A RU 2014101627A RU 2014101627 A RU2014101627 A RU 2014101627A RU 2711799 C2 RU2711799 C2 RU 2711799C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mrna
dsrna
angptl3
cell
acid
Prior art date
Application number
RU2014101627A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014101627A (ru
Inventor
Брайан БЕТТЕНКОРТ
Уилльям КУЭРБС
Кевин Фитцжеральд
Мария Франк-Каменетски
Стюарт Милстейн
Светлана ШУЛЬГА-МОРСКАЯ
Original Assignee
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47423191&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2711799(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2014101627A publication Critical patent/RU2014101627A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2711799C2 publication Critical patent/RU2711799C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК) для ингибирования экспрессии ANGPTL3, а также к ее применению для ингибирования экспрессии ANGPTL3 в клетке и для лечения индивидуума с нарушением, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3. Также раскрыта фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, содержащая эффективное количество вышеуказанной дцРНК. Изобретение позволяет эффективно ингибировать экспрессию ANGPTL3. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 16 табл., 4 пр.

Description

Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/499620, зарегистрированной 21 июня 2011 года, и предварительной заявки США № 61/638288, зарегистрированной 25 апреля 2012 года, полное содержание каждой из которых, таким образом, полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Список последовательностей
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который подавали в формате ASCII посредством EFS-Web и, таким образом, он полностью включен посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 11 июля 2012 года, называется 12130100.txt, и ее размер составляет 444346 бит.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Сходный с ангиопоэтином 3 белок (ANGPTL3) является членом семейства сходных с ангиопоэтином секретируемых факторов, которые регулируют метаболизм липидов и которые преимущественно экспрессируются в печени (Koishi R. et al., (2002) Nat. Genet., 30(2): 151-157). ANGPTL3 двойственным образом ингибирует каталитическую активность липопротеинлипазы (LPL), которая катализирует гидролиз триглицеридов, и эндотелиальной липазы (EL), которая гидролизует фосфолипиды липопротеинов высокой плотности (HDL). У мышей KK/Snk с гиполипидемией, даже страдающих ожирением, снижение экспрессии ANGPTL3 обладает защитным эффектом против гиперлипидемии и атеросклероза, способствуя клиренсу триглицеридов (Ando et al., (2003) J. Lipid Res., 44:1216-1223). У человека концентрации ANGPTL3 в плазме положительно коррелируют с уровнями холестерина HDL и фосфолипидов HDL в плазме (Shimamura et al., (2007) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 27:366-372).
Нарушения метаболизма липидов могут приводить к повышенным уровням липидов в сыворотке, таких как триглицериды и/или холестерин. Повышенные уровни липидов в сыворотке тесно ассоциированы с высоким артериальным давлением, сердечно-сосудистым заболеванием, диабетом и другими патологическими состояниями. Гипертриглицеридемия представляет собой пример нарушения метаболизма липидов, которое характеризуется высокими уровнями триглицеридов в крови. Установлена их ассоциация с атеросклерозом, даже при отсутствии высоких уровней холестерина (гиперхолестеринемии). Когда концентрации триглицеридов являются избыточными (т.е. более 1000 мг/дл или 12 ммоль/л), гипертриглицеридемия может также приводить к панкреатиту. Гиперлипидемия представляет собой другой пример нарушения метаболизма липидов, которое характеризуется повышенными уровнями любого или всех липидов и/или липопротеинов в крови. В настоящее время существующие виды лечения нарушения метаболизма липидов, включая соблюдение диеты, физические упражнения и лечение статинами, и другие лекарственные средства не всегда являются эффективными. Таким образом, в данной области существует необходимость в альтернативных видах лечения для индивидуумов с нарушениями метаболизма липидов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям иРНК, которые вызывают опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC) расщепление транскриптов РНК гена ANGPL3. Ген ANGPL3 может находиться внутри клетки, например, клетки у индивидуума, такого как человек. Настоящее изобретение также относится к способам применения композиций иРНК по изобретению для ингибирования экспрессии гена ANGPL3 и/или для лечения индивидуума, который получит положительный результат в результате ингибирования или снижения экспрессии гена ANGPL3, например, индивидуума страдающего или подверженного нарушению метаболизма липидов, такого как индивидуума, страдающего или подверженного гиперлипидемии или гипертриглицеридемии.
Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к двухцепочечным рибонуклеиновым кислотам (дцРНК) для ингибирования экспрессии ANGPTL3. ДцРНК содержат смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем на 3 нуклеотида, из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотида, отличающихся не более чем на 3 нуклеотида, из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к двухцепочечным рибонуклеиновым кислотам (дцРНК) для ингибирования экспрессии ANGPTL3. дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10.
В одном из вариантов осуществления смысловые и антисмысловые цепи содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из AD-53063.1, AD-53001.1, AD-53015.1, AD-52986.1, AD-52981.1, AD-52953.1, AD-53024.1, AD-53033.1, AD-53030.1, AD-53080.1, AD-53073.1, AD-53132.1, AD-52983.1, AD-52954.1, AD-52961.1, AD-52994.1, AD-52970.1, AD-53075.1, AD-53147.1, AD-53077.1 из таблиц 7 и 8.
В определенных вариантах осуществления дцРНК содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 2'-O-метил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-тиофосфоротиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с производным холестерила или бисдециламидной группой додекановой кислоты. В другом варианте осуществления модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-дезокси-2-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, нуклеотида с удаленными азотистыми основаниями, 2’-аминомодифицированного нуклеотида, 2’-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и содержащего неприродное основание нуклеотида.
Длина участка комплементарности дцРНК может составлять по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину, от 19 до 21 нуклеотида или 19 нуклеотидов.
В одном из вариантов осуществления длина каждой цепи дцРНК составляет не более 30 нуклеотидов.
По меньшей мере одна цепь дцРНК может содержать 3’-липкий конец по меньшей мере 1 нуклеотида или по меньшей мере 2 нуклеотидов.
В определенных вариантах осуществления дцРНК дополнительно содержит лиганд. В одном из вариантов осуществления лиганд конъюгирован с 3’-концом смысловой цепи дцРНК.
В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой одно или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc), связанных через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер. В конкретных вариантах осуществления лиганд представляет собой
Figure 00000001
В некоторых вариантах осуществления средство РНКи конъюгировано с лигандом, как представлено на следующей схеме
Figure 00000002
В некоторых вариантах осуществления средство РНКи дополнительно содержит по меньшей мере одну тиофосфатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь. В некоторых вариантах осуществления тиофосфатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 3'-конце одной цепи. В некоторых вариантах осуществления цепь представляет собой антисмысловую цепь. В других вариантах осуществления цепь представляет собой смысловую цепь.
В одном из вариантов осуществления участок комплементарности дцРНК состоит из одной из антисмысловых последовательностей из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10.
В другом варианте осуществления дцРНК содержит смысловую цепь, состоящую из последовательности смысловой цепи, выбранной из последовательностей из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10, и антисмысловую цепь, состоящую из последовательности антисмысловой цепи, выбранной из последовательностей, из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, например, гепатоциту, содержащей дцРНК по изобретению.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, кодирующему по меньшей мере одну цепь дцРНК, где дцРНК содержит участок, комплементарный по меньшей мере участку мРНК, кодирующей ANGPTL3, где длина дцРНК составляет 30 пар оснований или менее, и где дцРНК направлена на расщепление мРНК. Длина участка комплементарности может составлять по меньшей мере 15 нуклеотидов или от 19 до 21 нуклеотида.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор, кодирующий по меньшей мере одну цепь дцРНК, где дцРНК сдержит участок, комплементарный по меньшей мере участку мРНК, кодирующему ANGPTL3, где длина дцРНК составляет 30 пар оснований или менее, и где дцРНК направлена на расщепление мРНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей дцРНК или вектор по изобретению, для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3.
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит липидный состав, такой как состав MC3, SNALP или XTC.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии ANGPTL3 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт с дцРНК или вектором по изобретению и поддержание клетки, продуцируемой в течение периода времени, достаточного для получения деградации транскрипта мРНК гена ANGPTL3, таким образом, ингибируя экспрессию гена ANGPTL3 в клетке.
Клетка может находиться у индивидуума, такого как являющийся человеком индивидуум, например, являющийся человеком индивидуум с нарушением метаболизма липидов, например, гиперлипидемией или гипертриглицеридемией.
В одном из вариантов осуществления способов по изобретению экспрессию ANGPTL3 ингибируют по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума с нарушением, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3, например, нарушением метаболизма липидов, таким как гиперлипидемия или гипертриглицеридемия. Способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества дцРНК или вектора по изобретению, таким образом, проводя лечение индивидуума.
Нарушение может представлять собой нарушение метаболизма липидов, такое как гиперлипидемия или гипертриглицеридемия.
В одном из вариантов осуществления введение дцРНК индивидууму вызывает снижение уровня липидов, триглицеридов, холестерина и/или свободных жирных кислот в сыворотке и/или снижение накопления белка ANGPTL3. В одном из вариантов осуществления введение дцРНК индивидууму вызывает снижение уровня LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C и/или общего холестерина.
В одном из вариантов осуществления дцРНК вводят в дозе приблизительно от 0,01 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, например, приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,2 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,2 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,3 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,3 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,4 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,4 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 1,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 1,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 2 мг/кг приблизительно до 2,5 мг/кг, приблизительно от 2 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 3 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 3 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 3,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 4,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 5,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 6 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 6,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 7 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 7,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 8 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 8,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 9 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг или приблизительно от 9,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг. Также подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, являются частью настоящего изобретения.
Например, дцРНК можно вводить в дозе приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Также подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, являются частью настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления дцРНК вводят в дозе приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 45 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 45 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 40 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 20 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 20 мг/кг или приблизительно от 15 приблизительно до 20 мг/кг. Также подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, являются частью настоящего изобретения.
Например, индивидуумам можно вводить терапевтическое количество иРНК, такое как приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Также подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, являются частью настоящего изобретения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии ANGPTL3 у индивидуума. Способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количество дцРНК или вектора по изобретению, таким образом, ингибируя экспрессию ANGPTL3 у индивидуума.
В еще одном аспекте изобретение относится к наборам для проведения способов по изобретению. В одном из аспектов изобретение относится к набору для проведения способа ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 в клетке посредством приведения клетки в контакт со средством двухцепочечной РНКи в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии ANGPTL3 в клетке. Набор содержит средство РНКи и инструкции по применению и необязательно устройства для введения средства РНКи индивидууму.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет собой схему экспериментального способа, используемого для тестов in vivo, описанных в примере 2.
Фигура 2, панель A представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни белка ANGPTL3 у мышей WT после обработки указанной иРНК или контролем. Фигура 2, панель B представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни белка ANGPTL3 у мышей ob/ob после обработки указанной иРНК или контролем.
Фигура 3, панель A представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни LDL-c у мышей WT после обработки указанной иРНК или контролем. Фигура 3, панель B представляет собой график демонстрирующий измеряемые уровни LDL-c у мышей ob/ob после обработки указанной иРНК или контролем.
Фигура 4, панель A представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни триглицеридов у мышей WT после обработки указанной иРНК или контролем. Фигура 4, панель B представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни триглицеридов у мышей ob/ob после обработки указанной иРНК или контролем.
Фигура 5, панель A представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни общего холестерина (TC) у мышей WT после обработки указанной иРНК или контролем. Фигура 5, панель B представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни общего холестерина (TC) у мышей ob/ob после обработки указанной иРНК или контролем.
Фигура 6, панель A представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни HDL-c у мышей WT после обработки указанной иРНК или контролем. Фигура 6, панель B представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни HDL-c у мышей ob/ob после обработки указанной иРНК или контролем.
Фигура 7 представляет собой график, демонстрирующий измеряемые уровни белка ANGPTL3 у мышей, трансгенных по PCS человека, после обработки однократной дозой указанной иРНК или контролем.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям иРНК, которые влияют на опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC) расщепление транскриптов РНК гена ANGPTL3. Ген ANGPTL3 может находиться в клетке, например, клетке у индивидуума, такого как человек. Настоящее изобретение также относится к способам применения композиций иРНК по изобретению для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 и/или для лечения индивидуума с нарушением, на которое окажет благоприятное действие ингибирование или снижение экспрессии гена ANGPTL3, например, нарушением метаболизма липидов, таким как гиперлипидемия или гипертриглицеридемия.
иРНК по изобретению содержат цепь РНК (антисмысловую цепь), содержащую участок, длина которого составляет приблизительно 30 нуклеотидов или менее, например, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27,19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотидов, которая по существу является комплементарной по меньшей мере участку транскрипта мРНК гена ANGPTL3. Использование этих иРНК обеспечивает направленную деградацию мРНК гена ANGPTL3 у млекопитающих. В частности, очень низкие дозы иРНК ANGPTL3 могут специфически и эффективно опосредовать РНК-интерференцию (РНКи), приводящую к значительному ингибированию экспрессии гена ANGPTL3. С использованием анализов на основе клеток авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что иРНК, направленные на ANGPTL3, могу опосредовать РНКи, приводя к значительному ингибированию экспрессии гена ANGPTL3. Таким образом, способы и композиции, содержащие эти иРНК, являются пригодными для лечения индивидуума, на которого окажет благоприятное действие снижение уровней и/или активности белка ANGPTL3, такого как индивидуум с нарушением метаболизма липидов, таким как гиперлипидемия или гипертриглицеридемия.
В следующем ниже подробном описание описано, как получать и использовать композиции, содержащие иРНК, для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, а также описаны композиции и способы лечения индивидуумов с заболеваниями и нарушениями, на которые окажет благоприятное действие ингибирование и/или снижение экспрессии этого гена.
I. Определения
Для того, чтобы настоящее изобретение могло быть более понятным, сначала приводят определение определенных терминов. Кроме того, следует отметить, что, когда перечисляют значение или диапазон значений параметра, следует понимать, что подразумевают, значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Формы единственного числа применяют в настоящем описании для обозначения одного или более одного (т.е. по меньшей мере одним) грамматического объекта такой формы. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более одного элемента, например, совокупность элементов.
Термин "включая" используют в настоящем описании для обозначения и используют взаимозаменяемо с фразой "включая в качестве неограничивающих примеров". Термин "или" используют в настоящем описании для обозначения и используют взаимозаменяемо с термином "и/или", если из контекста явно не следует иное.
Термин "ANGPTL3" относится к сходному с ангиопоэтином 3 белку, содержащему аминокислотную последовательность из любого источника, к которому относятся позвоночные или млекопитающие, включая в качестве неограничивающих примеров, человека, жвачное животное, курицу, грызуна, мышь, крысу, свинью, овцу, примата, обезьяну и морскую свинку, если не указано иное. Термин также относится к фрагментам и вариантам нативного ANGPTL3, которые сохраняют по меньшей мере одну in vivo или in vitro активность нативного ANGPTL3. Термин включает полноразмерные непроцессированные формы предшественника ANGPTL3, а также зрелые формы, получаемые в результате посттрансляционного расщепления сигнального пептида, и формы, получаемые в результате протеолитического процессинга фибриногенподобного домена. Последовательность транскрипта мРНК ANGPTL3 человека можно найти, например, по номеру доступа GeneBank GI: 41327750 (NM_014495.2; SEQ ID NO:1). Теоретически рассчитанную последовательность мРНК ANGPTL3 макак-резуса можно найти, например, по номеру доступа GeneBank GI: 297278846 (XM_001086114.2; SEQ ID NO:2). Последовательность мРНК ANGPTL3 мыши можно найти, например, по номеру доступа GeneBank GI: 142388354 (NM_013913.3; SEQ ID NO:3). Последовательность мРНК ANGPTL3 крысы можно найти, например, по номеру доступа GeneBank GI: 68163568 (NM_001025065.1; SEQ ID NO:4).
Термин "ANGPTL3", как используют в настоящем описании, также относится к конкретному полипептиду, экспрессируемому в клетке вариантами природной последовательности ДНК гена ANGPTL3, такими как однонуклеотидный полиморфизм в гене ANGPTL3. Идентифицированы многие SNP в гене ANGPTL3 и их можно найти, например, NCBI dbSNP (см. например, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Неограничивающие примеры SNP в гене ANGPTL3 можно найти по номерам доступа NCBI dbSNP rs193064039, rs192778191, rs192764027, rs192528948, rs191931953, rs191293319, rs191171206, rs191145608, rs191086880, rs191012841 или rs190255403.
Как используют в настоящем описании, "последовательность-мишень" относится к смежному участку нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образуемой во время транскрипции гена ANGPTL3, включая мРНК, которая представляет собой продукт процессинга РНК первичного продукта транскрипции. В одном из вариантов участок-мишень последовательности является по меньшей мере достаточно длинным для того, чтобы служить в качестве субстрата для иРНК-направленного расщепления в этом участке нуклеотидной последовательности или около него молекулы мРНК, образуемой во время транскрипции гена ANGPTL3.
Длина последовательности-мишени может составлять приблизительно от 9-36 нуклеотидов, например, приблизительно 15-30 нуклеотидов. Например, длина последовательности-мишени может составлять приблизительно от 15-30 нуклеотидов, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотидов. Также подразумевают, что диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным диапазонам и длинам, являются частью настоящего изобретения.
Как используют в настоящем описании, термин "цепь, содержащая последовательность" относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которую описывают последовательностью, указанную с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.
Каждый "G", "C", "A", "T" и "U", как правило, относится к нуклеотиду, который содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил в качестве основания, соответственно. Однако следует понимать, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" также может относится к модифицированному нуклеотиду, как дополнительно подробно описано ниже, или к замещающей группе. Специалисту хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил можно заменять другими группами по существу без изменений свойств спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, содержащего такую замещающую группу. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве своего основания, может образовывать пару с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Таким образом, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, можно заменять в нуклеотидных последовательностях дцРНК по изобретению на нуклеотид, содержащий, например, инозин. В другом примере аденин и цитозин в любом месте в олигонуклеотиде можно замещать гуанином и урацилом соответственно с образованием G-U неоднозначных пар оснований с мРНК-мишенью. Последовательности, содержащие такие замещающие группы, являются подходящими для композиций и способов по изобретению.
Термины "иРНК", "средства РНКи", "средства иРНК", "средства РНК-интерференции", как взаимозаменяемо используют в настоящем описании, относятся к средству, которое содержит РНК, как этот термин определяют в настоящем описании, и которое опосредует направленное расщепление транскрипта РНК по пути индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). иРНК направляет специфическую деградацию последовательности мРНК посредством процесса, известного как РНК-интерференция (РНКи). иРНК модулирует, например, ингибирует, экспрессию ANGPTL3 в клетке, например, в клетке у индивидуума, такого как индивидуума, являющегося млекопитающим.
В одном из вариантов осуществления средство РНКи по изобретению содержит одноцепочечную РНК, которая взаимодействует с последовательностью РНК-мишени, например, последовательностью мРНК-мишени ANGPTL3, направляя расщепление РНК-мишени. Не ограничиваясь теорией, длинная двухцепочечная РНК, вводимая в клетки, расщепляется на миРНК эндонуклеазой III типа, известной как Dicer (Sharp et al., Genes Dev., 2001, 15:485). Dicer, сходный с рибонуклеазой III фермент, процессирует дцРНК с образованием малых интерферирующих РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными двумя парами липких 3’-концов (Bernstein et al., (2001) Nature, 409:363). Затем миРНК вводят в индуцируемый РНК комплексом сайленсинга (RISC), где одна или несколько геликаз обеспечивает раскручивание двухцепочечной миРНК, обеспечивая возможность комплементарной антисмысловой цепи проводить распознавание мишени (Nykanen et al., (2001) Cell, 107:309). После связывания с соответствующей мРНК-мишенью одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень, индуцируя сайленсинг (Elbashir et al., (2001) Genes Dev., 15:188). Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к одноцепочечной РНК (миРНК), генерируемой в клетке, и которая способствует образованию комплекса RISC, вызывая сайленсинг гена-мишени, т.е. гена ANGPTL3. Таким образом, термин "миРНК" также используют в настоящем описании для обозначения РНКи, как описано выше.
В другом аспекте средство РНКи представляет собой одноцепочечную антисмысловую молекулу РНК. Антисмысловая молекула РНК является комплементарной последовательности в мРНК-мишени. Антисмысловая РНК может ингибировать трансляцию стехиометрическим образом посредством спаривания оснований с мРНК и физического препятствия механизму трансляции, см. Dias N. et al., (2002) Mol. Cancer Ther., 1:347-355. Одноцепочечная антисмысловая молекула РНК может являться приблизительно от 13 до приблизительно 30 нуклеотидов длиной и содержать последовательность, которая является комплементарной последовательности-мишени. Например, одноцепочечная антисмысловая молекула РНК может содержать последовательность, которая составляет по меньшей мере приблизительно 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из одной из антисмысловых последовательностей в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10.
В другом варианте осуществления "иРНК" для применения в композициях и способах по изобретению представляет собой двухцепочечную РНК, и в настоящем описании ее обозначают как "средство двухцепочечной РНКи", "молекула двухцепочечной РНК (дцРНК)", "средством дцРНК" или "дцРНК". Термин "дцРНК" относится к комплексу молекул рибонуклеиновой кислоты, обладающих дуплексной структурой, содержащей две антипараллельные и по существу комплементарные цепи нуклеиновой кислоты, обозначаемые как имеющие "смысловую" и "антисмысловую" ориентации в отношении РНК-мишени, т.е. гена ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления изобретения двухцепочечная РНК (дцРНК) инициирует деградацию РНК-мишени, например, мРНК, посредством посттранскрипционного механизма сайленсинга генов, обозначаемого в настоящем описании как РНК-интерференция или РНКи.
Длина дуплексной области может быть любой, которая обеспечивает возможность специфической деградации желаемой РНК-мишени по пути RISC и может находиться в диапазоне приблизительно от 9 до 36 пар оснований, например, приблизительно 15-30 пар оснований в длину, например, приблизительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 пар оснований в длину, такую как приблизительно 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 пары оснований в длину. Подразумевают, что диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным диапазонам и длинам, также являются частью настоящего изобретения.
Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут представлять собой различные участки одной более крупной молекулы РНК, или они могут представлять собой отдельные молекулы РНК. Когда две цепи представляют собой одну более крупную молекулу и, таким образом, являются связанными непрерывной цепью нуклеотидов между 3’-концом одной цепи и 5’-концом соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, соединительную цепь РНК обозначают как "шпилечная петля". Петля шпилька может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления шпилечная петля может содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или более неспаренных нуклеотидов.
Когда две по существу комплементарные цепи дцРНК содержатся в отдельных молекулах РНК, эти молекулы необязательно, но могут быть ковалентно связанными. Когда две цепи ковалентно соединены посредством отличной непрерывной цепью нуклеотидов между 3’-концом одной цепи и 5’-концом соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, соединительную структуру обозначают как "линкер". Цепи РНК могут содержать одинаковое или различное число нуклеотидов. Максимальное число пар оснований представляет собой число нуклеотидов в наиболее короткой цепи дцРНК минус любые липкие концы, которые находятся в дуплексе. В дополнение к дуплексной структуре РНКи может содержать один или более нуклеотидных липких концов.
Как используют в настоящем описании, термин "нуклеотидный липкий конец" относится по меньшей мере к одному неспаренному нуклеотиду, который выступает из дуплексной структуры иРНК, например, дцРНК. Например, когда 3’-конец одной цепи дцРНК простирается за пределы 5’-конца другой цепи или наоборот, существует нуклеотидный липкий конец. дцРНК может содержать липкий конец по меньшей мере из одного нуклеотида, альтернативно липкий конец может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять нуклеотидов или более. Нуклеотидный липкий конец может содержать или состоять из нуклеотидного/нуклеозидного аналога, включая дезоксинуклеотид/нуклеозид. Липкий конец(ы) могут находиться на смысловой цепи, антисмысловой цепи или любом их сочетании. Кроме того, нуклеотид(ы) липкого конца могут находиться на 5’-конце, 3’-конце или обоих концах любой антисмысловой или смысловой цепи дцРНК.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 нуклеотидов, липкий конец на 3’-конце и/или 5’-конце. В одном из вариантов осуществления смысловая цепь дцРНК содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, липкий конец на 3’-конце и/или 5’-конце. В другом варианте осуществления один или более нуклеотидов в липком конце заменяют на нуклеозидтиофосфат.
Термины "тупой" или "тупой конец", как используют в настоящем описании по отношению к дцРНК, означает, что не существует неспаренных нуклеотидов или нуклеотидных аналогов на данном конце дцРНК, т.е. не является нуклеотидным липким концом. Один или оба конца дцРНК могут быть тупыми. Когда оба конца дцРНК являются тупыми, говорят, что дцРНК содержит тупые концы. Для ясности дцРНК с "тупым концом" представляет собой дцРНК, которая является тупой по обоим концам, т.е. не содержит нуклеотидных липких концов на любом конце молекулы. Наиболее часто такая молекула является двухцепочечной на протяжении всей длины.
Термин "антисмысловая цепь" или "направляющая цепь" относится к цепи иРНК, например, дцРНК, которая содержит участок, который по существу является комплементарным последовательности-мишень, например, мРНК ANGPTL3. Как используют в настоящем описании, термин "участок комплементарности" относится к участку в антисмысловой цепи, который по существу является комплементарным последовательности, например, последовательности-мишени, например, нуклеотидной последовательности ANGPTL3, как определено в настоящем описании. Когда участок комплементарности не является полностью комплементарным последовательности-мишени, несоответствия могут находиться во внешних или концевых участках молекулы. Как правило, наиболее допустимые несоответствия находятся в концевых участках, например, в 5, 4, 3 или 2 нуклеотидах 5’- и/или 3'-конца иРНК.
Термин "смысловая цепь" или "сопровождающая цепь", как используют в настоящем описании, относится к цепи иРНК, которая содержит участок, который по существу является комплементарным участку антисмысловой цепи, как этот термин определяют в настоящем описании.
Как используют в настоящем описании, и если не указано иное, термин "комплементарный", когда используют для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру в определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как понятно специалисту. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ ЭДТА, 50ºC или 70ºC в течение 12-16 часов с последующим промыванием (см., например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Можно применять другие условия, такие как соответствующие физиологическим условиям, какие могут встречаться внутри организма. Специалист может определять набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с окончательным применением гибридизованных нуклеотидов.
Комплементарные последовательности в иРНК, например, в дцРНК, как описано в настоящем описании, включают спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности можно обозначать как "полностью комплементарные" в отношении друг друга в настоящем описании. Однако когда первую последовательность обозначают как "по существу комплементарная" по отношению ко второй последовательности в настоящем описании, две последовательности могут являться полностью комплементарными, или они могут образовывать при гибридизации одну или несколько, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 несовпадающих пар оснований, для дуплекса до 30 пар оснований, сохраняя способность гибридизоваться в условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например, ингибированию экспрессии гена по пути RISC. Однако когда конструируют два олигонуклеотида для образования при гибридизации одного или нескольких одноцепочечных липких концов, такие липкие концы не следует рассматривать как несоответствия в отношении определения комплементарности. Например, дцРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая является полностью комплементарной более короткому олигонуклеотиду, можно также обозначать как "полностью комплементарная" для описываемых в настоящем описании целей.
"Комплементарные" последовательности, как используют в настоящем описании, также могут содержать или быть образованными полностью из не-уотсон-криковских пар оснований и/или пар оснований, образованных из неприродных и модифицированных нуклеотидов, при условии выполнения указанных выше требования в отношении их способности гибридизоваться. Такие не-уотсон-криковские пары оснований в качестве неограничивающих примеров включают G:U неоднозначное или хугстиновское спаривание оснований.
Термины "комплементарный", "полностью комплементарный" и "по существу комплементарный" в настоящем описании можно использовать в отношении соответствия пар между смысловой цепью и антисмысловой цепью дцРНК, или между антисмысловой цепью средства иРНК и последовательностью-мишенью, как будет понятно из контекста их применения.
Как используют в настоящем описании, полинуклеотид, который является "по существу комплементарным по меньшей мере части" матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который является по существу комплементарным смежному участку представляющей интерес мРНК (например, мРНК, кодирующей ANGPTL3). Например, полинуклеотид является комплементарным по меньшей мере части мРНК ANGPTL3, если последовательность является по существу комплементарной непрерывающемуся участку мРНК, кодирующей ANGPTL3.
Как правило, большая часть нуклеотидов каждой цепи представляет собой рибонуклеотиды, но как подробно описано в настоящем описании, каждая или обе цепи также могут содержать один или более нерибонуклеотидов, например, дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, "иРНК" может содержать рибонуклеотиды с химическими модификациями. Такие модификации могут включать все типы модификаций, описываемых в настоящем описании или известных в данной области. Любые такие модификации, как используемые в молекуле иРНК, включены в термин "иРНК" для целей описания и формулы изобретения.
Термин "ингибирование", как используют в настоящем описании, используют взаимозаменяемо со "снижением", "сайленсингом", "понижением регуляции", "подавлением" и другими аналогичными терминами, и он включает любой уровень ингибирования.
Фраза "ингибирование экспрессии ANGPTL3", как используют в настоящем описании, включает ингибирование экспрессии любого гена ANGPTL3 (такого как, например, гена ANGPTL3 мыши, гена ANGPTL3 крысы, гена ANGPTL3 обезьяны или гена ANGPTL3 человека), а также вариантов или мутантов гена ANGPTL3, который кодирует белок ANGPTL3.
"Ингибирование экспрессии гена ANGPTL3" включает любой уровень ингибирования гена ANGPTL3, например, по меньшей мере частичное подавление экспрессии гена ANGPTL3, такой как ингибирование по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%.
Экспрессию гена ANGPTL3 можно оценивать на основе уровня любой переменной, ассоциированной с экспрессией гена ANGPTL3, например, уровень мРНК ANGPTL3 или уровень белка ANGPTL3. Экспрессию ANGPTL3 также можно оценивать опосредованно на основании уровней липидов, триглицеридов, холестерина (включая LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C и общий холестерин) или свободных жирных кислот в сыворотке. Ингибирование можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одной или нескольких из этих переменных по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой любой тип контрольного уровня, который используют в данной области, например, фоновый уровень до дозирования или уровень, определяемый у аналогичного индивидуума, клетки или образца, который не подвергали обработке или обрабатывали контролем (таким как, например, только контрольным буфером или инактивирующим средство контролем).
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере частичное подавление экспрессии гена ANGPTL3 оценивают по снижению количества мРНК ANGPTL3, которую можно выделять из или детектировать в первой клетке или группе клеток, в которых транскрибируется ген ANGPTL3, и которую обрабатывали или которые обрабатывали таким образом, что экспрессию гена ANGPTL3 ингибируют по сравнению со второй клеткой или группой клеток по существу идентичной первой клетка или группе клеток, но которую не обрабатывали или которые не обрабатывали таким образом (контрольные клетки). Степень ингибирования можно выражать следующим образом:
Figure 00000003
Фраза "приведение клетки в контакт со средством РНКи", таким как дцРНК, как используют в настоящем описании, включает приведение клетки в контакт любыми возможными способами. Приведение клетки в контакт со средством РНКи включает приведение клетки в контакт in vitro с иРНК или приведение клетки в контакт in vivo с иРНК. Приведение в контакт можно проводить непосредственно или опосредованно. Таким образом, например, средство РНКи можно приводить в физический контакт с клеткой индивидуальным проведением способа или, альтернативно, средство РНКи можно приводить в состояние, которое обеспечивает или способствует тому, что оно затем вступает в контакт с клеткой.
Приведение клетки в контакт in vitro можно проводить, например, посредством инкубации клетки со средством РНКи. Приведение клетки в контакт in vivo можно проводить, например, посредством инъекции средства РНКи в ткань или вблизи нее, где локализована клетка, или посредством инъекции средства РНКи в другую область, например, кровоток или подкожное пространство, таким образом, чтобы средство затем попадало в ткань, где локализована клетка, с которой необходимо контактировать. Например, средство РНКи может содержать лиганд и/или являться связанным с ним, например, GalNAc3, который направляет средство РНКи к представляющему интерес участку, например, печени. Также возможными являются комбинации in vitro и in vivo способов приведения в контакт. Например, клетку также можно приводить в контакт in vitro со средством РНКи, а затем трансплантировать индивидууму.
В одном из вариантов осуществления приведение клетки в контакт с иРНК включает "введение" или "доставку иРНК в клетку" посредством облегчения или проведения захвата или поглощения клеткой. Поглощение или захват иРНК может происходить через диффузионные или активные клеточные процессы без содействия или посредством вспомогательных средств или устройств. Введение иРНК в клетку можно проводить in vitro и/или in vivo. Например, для введения in vivo иРНК можно инъецировать в область ткани или вводить системно. Доставку in vivo также можно проводить посредством системы доставки на основе бета-глюкана, такой как системы, описанные в патентах США №№ 5032401 и 5607677 и публикации США № 2005/0281781, таким образом, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Введение in vitro в клетки включает известные в данной области способы, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны в настоящем описании ниже и/или являются известными в данной области.
Термин "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. SNALP представляет собой везикулу из липидов, покрывающих внутреннюю область со сниженным содержанием воды, содержащую нуклеиновую кислоту, такую как иРНК или плазмида, из которой транскрибируется иРНК. SNALP описаны, например, в публикации патентной заявки США №№ 20060240093, 20070135372 и в международной заявке № WO 2009082817, таким образом, полные содержания которых включены в настоящее описание посредством ссылки. Примеры составов "SNALP" описаны ниже.
Как используют в настоящем описании, "индивидуум" представляет собой животное, такое как млекопитающее, включая примата (такого как человек, не являющегося человеком примата, например, обезьяну и шимпанзе), не являющееся приматом млекопитающее (такое как корова, свинья, верблюд, лама, лошадь, коза, кролик, овца, хомяк, морская свинка, кошка, собака, крыса, мышь, лошадь и кит), или птицу (например, утку или гуся). В одном из вариантов осуществления индивидуум представляет собой человека, такого как человек, у которого проводят лечение или оценку заболевания, нарушения или состояния, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3; человека, подвергающегося риску заболевания, нарушения или состояния, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3; человека с заболеванием, нарушением или состоянием, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3, и/или человека, получавшего лечение заболевания, нарушения или состояния, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3, как описано в настоящем описании. Как используют в настоящем описании, термины "лечащий" или "лечение" относятся к благоприятному или желаемому результату, включая такой как снижение уровней триглицеридов у индивидуума. Термины "лечащий или "лечение" также включает, но не ограничивается ими, облегчение или улучшение состояния одного или нескольких симптомов нарушения метаболизма липидов, таких как, например, уменьшение размера эруптивных ксантом. "Лечение" может также означать увеличенную продолжительность жизни по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни при отсутствии лечения.
Под "более низким" в отношении маркера или симптома заболевания подразумевают статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или более, и, предпочтительно, достигает уровня, принятого в диапазоне нормы у индивидуума без такого нарушения. Как используют в настоящем описании, "профилактика" или "профилактический", когда используют по отношению к заболеванию, нарушению или состоянию, на которое оказывает благоприятное действие снижение экспрессии гена ANGPTL3, относится к снижению вероятности, что у индивидуума разовьется симптом, ассоциированный с таким заболеванием, нарушением или состоянием, например, высокие уровни триглицеридов или эруптивная ксантома. Вероятность развития высоких уровней триглицеридов или эруптивной ксантомы снижается, например, когда у индивидуума, подвергающегося одному или нескольким факторам риска высоких уровней триглицеридов или эруптивной ксантомы, не развиваются высокие уровни триглицеридов или эруптивная ксантома или развиваются высокие уровни триглицеридов или эруптивная ксантома с меньшей тяжестью относительно популяции, подвергающейся аналогичным факторам риска и не получающей лечение, как описано в настоящем описании. Отсутствие развития заболевания, нарушения или состояния или уменьшение развития симптома, ассоциированного с таким заболеванием, нарушением или состоянием (например, по меньшей мере приблизительно на 10% по клинической принятой шкале для такого заболевания или нарушения), или проявление отсроченных симптомов (например, на сутки, недели, месяцы или годы) рассматривают как эффективную профилактику.
Как используют в настоящем описании, термин "сывороточный липид" относится к любому основному липиду, содержащемуся в крови. Сывороточные липиды могут содержаться в крови в свободной форме или в виде части белкового комплекса, например, комплекса липопротеинов. Неограничивающие примеры сывороточных липидов могут включать триглицериды и холестерин, такой как общий холестерин (TG), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL-C), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C), холестерин липопротеинов очень низкой плотности (VLDL-C) и холестерин липопротеинов средней плотности (IDL-C).
Как используют в настоящем описании, "нарушение метаболизма липидов" относится к любому нарушению, ассоциированному с или вызываемому нарушением метаболизма липидов. Например, этот термин включает любое нарушение, заболевание или состояние, которое может приводить к гиперлипидемии, или состояние, характеризуемое аномальным повышением уровней любого или всех липидов и/или липопротеинов в крови. Этот термин относится к наследственному нарушению, такому как семейная гипертриглицеридемия, или к приобретенному нарушению, такому как нарушение, приобретенное в результате рациона или приема определенных лекарственных средств. Иллюстративные нарушения метаболизма липидов включают, но не ограничиваются ими, атеросклероз, дислипидемию, гипертриглицеридемию (включая индуцированную лекарственными средствами гипертриглицеридемию, индуцированную диуретиками гипертриглицеридемию, индуцированную алкоголем гипертриглицеридемию, индуцированную β-адренергическими блокаторами гипертриглицеридемию, индуцированную эстрогеном гипертриглицеридемию, индуцированную глюкокортикоидами гипертриглицеридемию, индуцированную ретиноидами гипертриглицеридемию, индуцированную циметидином гипертриглицеридемию и семейную гипертриглицеридемию), ассоциированный с гипертриглицеридемией острый панкреатит, хиломикронный синдром, семейную хиломикронемию, дефицит или устойчивость АпоЕ, дефицит или пониженную активность LPL, гиперлипидемию (включая семейную комбинированную гиперлипидемию), гиперхолестеринемию, подагру, ассоциированную с гиперхолестеринемией, ксантоматоз (подкожные отложения холестерина).
Сердечно-сосудистые заболевания, ассоциированные с нарушениями метаболизма липидов также рассматривают как "нарушения метаболизма липидов", как определено в настоящем описании. Эти заболевания могут включать болезнь коронарных артерий (также называемую ишемической болезнью сердца), воспаление, ассоциированное с болезнью коронарных артерий, рестеноз, заболевания периферических сосудов и инсульт.
Нарушения, связанные с массой тела, также рассматривают как "нарушения метаболизма липидов", как определено в настоящем описании. Такие нарушения могут включать ожирение, метаболический синдром, включая независимые компоненты метаболического синдрома (например, общее ожирение, FBG/преддиабет/диабет, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию и гипертензию), гипотиреоз, уремию и другие состояния, ассоциированные с увеличением массы (включая быстрое увеличение массы), потерю массы, поддержание потери массы или риск увеличения массы после потери массы.
Нарушения уровня сахара в крови дополнительно рассматривают как "нарушения метаболизма липидов", как определено в настоящем описании. Такие нарушения могут включать диабет, гипертензию и синдром поликистоза яичников, связанный с резистентностью к инсулину. Другие иллюстративные нарушения метаболизма липидов также могут включать трансплантацию почки, нефротический синдром, синдром Иценко-Кушинга, акромегалию, системную красную волчанку, дисглобулинемию, липодистрофию, гликогеноз I типа и болезнь Аддисона.
Подразумевают, что "терапевтически эффективное количество", как используют в настоящем описании, включает количество средства РНКи, которое при введении индивидууму с нарушением метаболизма липидов, является достаточным для эффективного лечения заболевания (например, уменьшения, улучшения состояния или поддержания существующего заболевания, или один или нескольких симптомов заболевания). "Терапевтически эффективное количество" может изменяться в зависимости от средства РНКи, того как вводят средство, заболевания и его тяжести и истории, возраста, массы, семейного анамнеза, набора генов, типов предшествовавших или сопутствующих видов лечения при их наличии и других индивидуальных характеристик подлежащего лечению индивидуума.
Подразумевают, что "профилактически эффективное количество", как используют в настоящем описании, включает количество средства иРНК, которое при введении индивидууму с нарушением метаболизма липидов, является достаточным для профилактики или улучшения состояния заболевания, или одного или нескольких симптомов заболевания. Улучшение состояния заболевание включает замедление течения заболевания или снижение тяжести развивающегося позже заболевания. "Профилактически эффективное количество" может изменяться в зависимости от иРНК, того как вводят средство, степени риска заболевания и истории, возраста, массы, семейного анамнеза, набора генов, типов предшествовавших или сопутствующих видов лечения при их наличие и других индивидуальных характеристик подлежащего лечению пациента.
"Терапевтически-эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" также включает количество средства РНКи, которое оказывает некоторое желаемое локальное или системное действие при целесообразном отношении польза/риск, применимом к любому лечению. иРНК, применяемую в способах по настоящему изобретению, можно вводить в достаточном количестве для получения целесообразного отношения польза/риск, применимого для такого лечения.
Фразу "фармацевтически приемлемый" применяют в настоящем описании для обозначения таких соединений, веществ, композиций и/или лекарственных форм, которые с медицинской точки зрения являются пригодными для использования при контактировании с тканями являющихся людьми индивидуумов и являющихся животными индивидуумов без излишней токсичности, раздражения, аллергического ответа или другой проблемы или осложнения в соответствии с целесообразным отношением польза/риск.
Фраза "фармацевтически приемлемый носитель", как используют в настоящем описании, означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, облегчающее получение средство (например, смазочное средство, тальк, стеарат магния, кальция или цинка или стеариновая кислота), или инкапсулирующее растворитель вещество, участвующее в переносе или транспортировке целевого соединения из одного органа или части организма в другой орган или часть организма. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в смысле, чтобы быть совместимым с другими ингредиентами состава и не являться вредным для подлежащего лечению индивидуума. Некоторые примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза, (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал, (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы, (4) порошкообразный трагакант, (5) солод, (6) желатин, (7) смазки, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк, (8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев, (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, сезамовое масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло, (10) гликоли, такие как пропиленгликоль, (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль, (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этилдаурат, (13) агар, (14) буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия, (15) альгиновую кислоту, (16) апирогенную воду, (17) изотонический физиологический раствор, (18) раствор Рингера, (19) этиловый спирт, (20) pH забуференные растворы, (21) сложные полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; (22) наполнители, так как полипептиды и аминокислоты, (23) компонент сыворотки, такой как сывороточный альбумин, HDL и LDL и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.
Термин "образец", как используют в настоящем описании, включает набор аналогичных жидкостей, клеток или тканей, выделяемых у индивидуума, а также жидкостей, клеток или тканей, содержащихся у индивидуума. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку и серозные жидкости, плазму, цереброспинальную жидкость, глазные жидкости, лимфу, мочу, слюну и т.п. Образцы ткани могут включать образцы из тканей, органов или локализованных областей. Например, образцы можно получать из конкретных органов, частей органов, или жидкостей или клеток в этих органах. В определенных вариантах осуществления образцы можно получать из печени (например, всей печени или определенных сегментов печени или определенных типов клеток в печени, таких как, например, гепатоциты). В некоторых вариантах осуществления "образец, получаемый у индивидуума" относится к крови или плазме, получаемой у индивидуума.
II. иРНК по изобретению
Описываемое в настоящем описании представляет собой иРНК, которые ингибируют экспрессию гена ANGPTL3. В одном из вариантов осуществления средство иРНК содержит молекулы двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 в клетке, такой как клетка у индивидуума, например, млекопитающего, такого как человек с нарушением метаболизма липидов, например, семейной гиперлипидемией. дцРНК содержит антисмысловую цепь, содержащую участок комплементарности, который является комплементарным по меньшей мере части мРНК, образуемой при экспрессии гена ANGPTL3. Длина участка комплементарности составляет приблизительно 30 нуклеотидов или менее (например, приблизительно 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 или 18 нуклеотидов или менее). При контактировании с клеткой, экспрессирующей ген ANGPTL3, иРНК ингибирует экспрессию гена ANGPTL3 (например, гена ANGPTL3 человека, примата, непримата или птицы) по меньшей мере приблизительно на 10%, как анализируют, например, ПЦР или способом на основе разветвленной ДНК (bDNA), или способом на основе белков, таким как иммунофлуоресценый анализ, с использованием, например, Вестерн-блоттинга или способов проточной цитометрии.
дцРНК содержит две цепи РНК, которые являются комплементарными и гибридизуются с образованием дуплексной структуры в условиях, в которых будут использовать дцРНК. Одна цепь дцРНК (антисмысловая цепь) содержит участок комплементарности, который по существу является комплементарным и, как правило, полностью комплементарным последовательности-мишени. Последовательность-мишень можно получать из последовательности мРНК, образуемой во время экспрессии гена ANGPTL3. Другая цепь (смысловая цепь) содержит участок, который является комплементарным антисмысловой цепи, таким образом, что две цепи гибридизуются и образуют дуплексную структуру при объединении в подходящих условиях. Как описано в иных местах настоящего описания, и как известно в данной области, комплементарные последовательности дцРНК также могут содержаться как самокомплементарные участки одной молекулы нуклеиновой кислоты, а не находиться в отдельных олигонуклеотидах.
Как правило, длина дуплексной структуры составляет от 15 до 30 пар оснований, например, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 пары оснований. Подразумевают, что диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным диапазонам и длинам, также являются частью настоящего изобретения.
Аналогично, длина участка комплементарности последовательности-мишени составляет от 15 до 30 нуклеотидов, например, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотида. Подразумевают, что диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным диапазонам и длинам, также являются частью настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления длина дцРНК составляет приблизительно от 15 приблизительно до 20 нуклеотидов или приблизительно от 25 приблизительно до 30 нуклеотидов. Как правило, дцРНК является достаточно длинной, чтобы служить в качестве субстрата для фермента Dicer. Например, в данной области хорошо известно, что дцРНК длиннее, чем приблизительно 21-23 нуклеотида, могут служить в качестве субстратов для Dicer. Как правило, специалисту также понятно, что участок РНК, являющийся мишенью для расщепления, чаще всего представляет собой участок более крупной молекулы РНК, часто молекулы мРНК. В соответствующих случаях "часть" мРНК-мишени представляет собой смежную последовательность мРНК-мишени достаточной длины для того, чтобы быть субстратом для РНКи-направленного расщепления (т.е. расщепления по пути RISC).
Специалисту в данной области также понятно, что дуплексная область представляет собой первый функциональный участок дцРНК, например, дуплексная область приблизительно от 9 до 36 пар оснований, например, приблизительно 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 пар оснований. Таким образом, в одном из вариантов осуществления при условии, что она подвергается процессированию до функционального дуплекса, например, 15-30 пар оснований, который направляет расщепление желаемой РНК, молекула РНК или комплекс молекул РНК, содержащих дуплексную область более 30 пар оснований, представляет собой дцРНК. Таким образом, как правило, специалисту в данной области понятно, что в одном из вариантов осуществления мкРНК представляет собой дцРНК. В другом варианте осуществления дцРНК не является природной мкРНК. В другом варианте осуществления средство иРНК, пригодное для направления экспрессии ANGPTL3, не образуется в клетке-мишени посредством расщепления более крупной дцРНК.
дцРНК, как описано в настоящем описании, может дополнительно содержать один или более одноцепочечных нуклеотидных липких концов, например, 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов. дцРНК, содержащие по меньшей мере один нуклеотидный липкий конец, могут обладать неожиданно превосходными свойствами ингибирования относительно своих аналогов с тупыми концами. Нуклеотидный липкий конец может содержать или состоят из нуклеотидного/нуклеозидного аналога, содержащего дезоксинуклеотид/нуклеозид. Липкий конец(ы) может находиться на смысловой цепи, антисмысловой цепи или любом их сочетании. Кроме того, нуклеотид(ы) липкого конца может находиться на 5’-конце, 3’-конце или обоих концах антисмысловой или смысловой цепи дцРНК.
дцРНК можно синтезировать стандартными известными в данной области способами, как дополнительно обсуждается ниже, например, с использованием автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступные, например, от Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
Соединения иРНК по изобретению можно получать двухстадийным способом. Сначала раздельно получают индивидуальные цепи молекулы двухцепочечной РНК. Затем соединяют цепи компонентов. Индивидуальные цепи соединения миРНК можно получать с использованием жидкофазного или твердофазного органического синтеза или обоих. Органический синтез обеспечивает такое преимущество, что олигонуклеотидные цепи, содержащие неприродные или модифицированные нуклеотиды, можно легко получать. Одноцепочечные олигонуклеотиды по изобретению можно получать с использованием жидкофазного или твердофазного органического синтеза или обоих.
В одном из аспектов дцРНК по изобретению содержит по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, смысловую последовательность и антисмысловую последовательность. Смысловая цепь выбрана из группы последовательностей, предоставленных в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, и соответствующая антисмысловая цепь смысловой цепи выбрана из группы последовательностей из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10. В этом аспекте одна из двух последовательностей является комплементарной другой из двух последовательностей, где одна из последовательностей является по существу комплементарной последовательности мРНК, генерируемой при экспрессии гена ANGPTL3. Таким образом, в этом аспекте дцРНК содержит два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая цепь в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, и второй олигонуклеотид описан как соответствующая антисмысловая цепь смысловой цепи в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10. В одном из вариантов осуществления по существу комплементарные последовательности дцРНК содержатся в отдельных олигонуклеотидах. В другом варианте осуществления по существу комплементарные последовательности дцРНК содержаться в одном олигонуклеотиде.
Специалисту хорошо известно, что дцРНК с дуплексной структурой приблизительно из 20-23 пар оснований, например, 21 пары оснований, признаны как особенно эффективные для индукции РНК-интерференция (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). Однако было выявлено, что другие более короткие или длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными (Chu and Rana, (2007) RNA, 14:1714-1719; Kim et al., (2005) Nat. Biotech, 23:222-226). В вариантах осуществления, описанных выше, вследствие природы олигонуклеотидных последовательностей, предоставленных в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, дцРНК, как описано в настоящем описании, могут содержать по меньшей мере одну цепь длиной минимум в 21 нуклеотид. Можно с полным основанием ожидать, что более короткие дуплексы, содержащие одну из последовательностей из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10 минус только несколько нуклеотидов на одном или обоих концах, могут являться аналогичным образом эффективными по сравнению с дцРНК, описанными выше. Таким образом, предполагают, что дцРНК, содержащие последовательность по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов, получаемых из одной из последовательностей из таблиц 2, 3, 7, 8, 9 и 10 и отличающихся по своей способности ингибировать экспрессию гена ANGPTL3 не более, чем приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от дцРНК, содержащей полную последовательность, входят в объем настоящего изобретения.
Кроме того, РНК, предоставленные в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, идентифицируют участок(и) в транскрипте ANGPTL3, который является чувствительным к опосредованному RISC расщеплению. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к иРНК, которые направлены на один из этих участков. Как используют в настоящем описании, иРНК называют направленной на конкретный участок транскрипта РНК, если иРНК способствует расщеплению транскрипта в любой области в этом конкретном участке. Такая иРНК, как правило, содержит по меньшей мере приблизительно 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, предоставленных в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из области, смежной с выбранной последовательностью в гене ANGPTL3.
Несмотря на то, что длина последовательности-мишени, как правило, составляет приблизительно 15-30 нуклеотидов, существует широкая вариация пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для направленного расщепления любой заданной РНК-мишени. Различные пакеты программного обеспечения и руководства, указанные в настоящем описании, предоставляют руководство по идентификации оптимальных последовательностей-мишеней для любого заданного гена-мишени, а также можно применять эмпирический подход, в котором "окно" или "маску" заданного размера (в качестве неограничивающего примера 21 нуклеотид) буквально или в переносном смысле (включая, например, компьютерное моделирование) помещают на последовательность РНК-мишени для идентификации последовательностей в диапазоне размера, который может служить в качестве последовательностей-мишеней. Передвигая постепенно "окно" последовательности на один нуклеотид выше или ниже начального положения последовательности-мишени, можно идентифицировать следующую потенциальную последовательность-мишень, до тех пор, пока полный набор последовательностей не идентифицируют для данного выбранного размера мишени. Этим способом в сочетании с общим синтезом и тестированием идентифицируемых последовательностей (анализами, как описано в настоящем описании или как известно в данной области) идентификации таких последовательностей, которые оптимально функционируют, можно идентифицировать такие последовательности РНК которые, при воздействии средства иРНК, опосредуют лучшее ингибирование экспрессии гена-мишени. Таким образом, несмотря на то, что идентифицированные последовательности, например, в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, представляют собой эффективные последовательности-мишени, предусмотрено, что можно получать дополнительную оптимизацию эффективности ингибирования посредством постепенной "прогулки по окну" на один нуклеотид выше или ниже данных последовательностей для идентификации последовательностей с эквивалентными или лучшими характеристиками ингибирования.
Кроме того, предусмотрено, что для любой идентифицируемой последовательности, например, в таблицах 2, 3, 7, 8, 9 и 10, можно получать дополнительную оптимизацию посредством систематического добавления или удаления нуклеотидов с получением более длинных или более коротких последовательностей, и тестируя эти получаемые последовательности "прогулкой" по окну большего или меньшего размера выше или ниже РНК-мишени из этой точки. Кроме того, сочетание этого подхода получения новых мишеней-кандидатов с тестированием эффективности иРНК на основе этих последовательностей-мишеней в анализе ингибирования, как известно в данной области и/или как описано в настоящем описании, может приводить к дополнительным улучшениям эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности можно регулировать, например, введением модифицированных нуклеотидов, как описано в настоящем описании или как известно в данной области, добавлением или изменениями в липком конце или другими модификациями, как известно в данной области и/или обсуждается в настоящем описании, для дополнительной оптимизации молекулы в качестве ингибитора экспрессии (например, повышения стабильности в сыворотке или периода полувыведения из кровотока, повышения термостабильности, увеличения трансмембранной доставки, направленной доставки к конкретному местоположению или типу клеток, повышения взаимодействия с ферментами пути сайленсинга, повышения выделения из эндосом).
иРНК, как описано в настоящем описании, может содержать одно или несколько несоответствий с последовательностью-мишенью. В одном из вариантов осуществления иРНК, как описано в настоящем описании, содержит не более 3 несоответствий. Если антисмысловая цепь иРНК содержит несоответствия с последовательностью-мишенью, предпочтительно, область несоответствия не располагается в центре участка комплементарности. Если антисмысловая цепь иРНК содержит несоответствия с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы несоответствие являлось ограниченным последними 5 нуклеотидами в 5’- или 3’-конце участка комплементарности. Например, для средства иРНК длиной 23 нуклеотида цепь, которая является комплементарной участку гена ANGPTL3, как правило, не содержит какого-либо несоответствия в центральных 13 нуклеотидах. Способы, описываемые в настоящем описании или известные в данной области, можно использовать для определения, является ли иРНК, содержащая несоответствие с последовательностью-мишенью, эффективной для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3. Рассмотрение фактора эффективности иРНК с несоответствиями для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 является важным, в частности, если известно, что конкретный участок комплементарности в гене ANGPTL3 содержит полиморфные варианты последовательности в популяции.
III. Модифицированные иРНК по изобретению
В одном из вариантов осуществления РНК иРНК по изобретению, например, дцРНК, химически модифицируют для повышения стабильности или других благоприятных характеристик. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно синтезировать и/или модифицировать общепризнанными в данной области способами, такими как способы, описанные в "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage S.L. et al., (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, которая, таким образом, полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Модификации включают, например, модификации концов, например, модификации 5’-конца (фосфорилирование, конъюгацию, инвертированные связи) или модификации 3’-конца (конъюгацию, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т.д.); модификации оснований, например, замену стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару с широким спектром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды с удаленными азотистыми основаниями) или конъюгированные основания; модификации сахаров (например, в 2’-положении или 4’-положении) или замену сахара, и/или модификации каркаса, включая модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений иРНК, пригодных в вариантах осуществления, описываемых в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, РНК, содержащие модифицированные каркасы или неприродные межнуклеозидные связи. РНК, содержащие модифицированные каркасы, включают наряду с другими такие, которые не содержат атом фосфора в каркасе. Для целей настоящего описания, и как иногда указывают в данной области, модифицированные РНК, которые не содержат атом фосфора в своем межнуклеозидном каркасе, также можно считать олигонуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированная иРНК содержит атом фосфора в своем межнуклеозидном каркасе.
Модифицированные каркасы РНК содержат, например, тиофосфаты, хиральные тиофосфаты, фосфордиотиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3’-алкилен фосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, содержащие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги и аналоги, имеющие обратную полярность, где смежные пары нуклеозидных звеньев являются связанными 3'-5' с 5'-3' или 2’-5' с 5'-2'. Также содержатся различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение указанных выше содержащих фосфор связей, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № 3687808, 4469863, 4476301, 5023243, 5177195, 5188897, 5264423, 5276019, 5278302, 5286717, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233, 5466677, 5476925, 5519126, 5536821, 5541316, 5550111, 5563253, 5571799, 5587361, 5625050, 6028188, 6124445, 6160109, 6169170, 6172209, 6239265, 6277603, 6326199, 6346614, 6444423, 6531590, 6534639, 6608035, 6683167, 6858715, 6867294, 6878805, 7015315, 7041816, 7273933, 7321029 и патент США RE39464, таким образом, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Модифицированные каркасы РНК, которые не содержат атом фосфора, обладают остовами, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают каркасы, содержащие связи морфолино (частично образованные из фрагмента сахара нуклеозида); силоксановые каркасы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые каркасы; формацетильные и тиоформацетильные каркасы; метиленформацетильные и тиоформацетильные каркасы; содержащие алкен каркасы; сульфаматные каркасы; метилениминовые и метиленгидразиновые каркасы; сульфонат и сульфонамид каркасы; амидные каркасы и другие, содержащие смешанные компонентные части N, O, S и CH2.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение указанных выше олигонуклеозидов, включают, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 5034506, 5166315, 5185444, 5214134, 5216141, 5235033, 564562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470967, 5489677, 5541307, 5561225, 5596086, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663312, 5633360, 5677437 и 5677439, таким образом, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
В других вариантах осуществления предусматривают применение подходящих миметиков РНК в иРНК, в которых сахар и межнуклеозидную связь, т.е. каркас нуклеотидных звеньев, заменяют новыми группами. Основные звенья сохраняют для гибридизации с соответствующим соединением нуклеиновой кислоты-мишени. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, для которого было продемонстрировано, что он обладает превосходными гибридизационными свойствами, обозначают как пептид нуклеиновой кислоты (ПНК). В соединениях ПНК сахарный каркас РНК заменяют содержащим амид каркасом, в частности, аминоэтилглициновым каркасом. Нуклеиновые основания сохраняют, и они являются связанными прямо или опосредованно с аза-атомами азота амидного фрагмента каркаса. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение соединений ПНК, включают, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 5539082, 5714331 и 5719262, таким образом, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Дополнительные соединения ПНК, пригодные для использования в иРНК по изобретению, описаны, например, у Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Некоторые варианты осуществления по изобретению относятся к РНК с тиофосфатными каркасами и олигонуклеозидам с гетероатомными каркасами, и, в частности, -CH2-NH-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [известный как каркас метилен (метилимино) или MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- и -N(CH3)-CH2-CH2- [где нативный фосфодиэфирный каркас представляют как -O-P-O-CH2-] указанного выше патента США № 5489677 и амидным каркасам указанного выше патента США № 5602240. В некоторых вариантах осуществления РНК согласно настоящему описанию имеют каркасные структуры морфолино указанного выше патента США № 5034506.
Модифицированные РНК также могут содержать одну или несколько замещенных групп сахаров. иРНК, например, дцРНК согласно настоящему описанию могут содержать один из следующих ниже элементов в 2'-положении: OH, F, O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил, или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными C1-C10алкилом или C2-C10алкенилом и алкинилом. Иллюстративные подходящие модификации включают O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m составляют от 1 до приблизительно 10. В других вариантах осуществления дцРНК содержат один из следующих ниже элементов в 2'-положении: C1-C10низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, O-алкарил или O-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляемую группу РНК, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств иРНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств иРНК и другие заместители, обладающие аналогичными свойствами. В некоторых вариантах осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-CH2CH2OCH3, также известный как 2'-O-(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) т.е., алкокси-алкоксигруппу. Другая иллюстративная модификация представляет собой 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группу O(CH2)2ON(CH3)2, также известную как 2'-DMAOE, как описано в примерах в настоящем описании ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известный в данной области как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
Другие модификации включают 2'-метокси (2-OCH3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Аналогичные модификации также можно проводить в других положениях в РНК иРНК, в частности, в 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных дцРНК и 5'-положении на 5'-концевом нуклеотиде. иРНК также могут содержать миметики сахаров, такие как циклобутильные группы вместо пентофуранозильного сахара. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких структур модифицированных сахаров, включают, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5658873, 5670633 и 5700920, некоторые из которых имеют общее с настоящей заявкой владельца. Таким образом, полное содержание каждого из указанных выше патентов включено в настоящее описание посредством ссылки.
иРНК также могут содержать модификации или замены нуклеинового основания (часто обозначаемого в данной области просто как "основание"). Как используют в настоящем описании, "немодифицированные" или "природные" нуклеиновые основания включают пуриновые основания: аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания: тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеиновые основания включают другие синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и 5-галогенцитозин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин, 6-азоурацил, 6-азоцитозин и 6-азотимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеиновые основания включают такие, как описанные в патенте США № 3687808, такие, как описанные в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn P. ed. Wiley-VCH, 2008; такие, как описанные в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz J.L, ed. John Wiley & Sons, 1990, такие, как описанные Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613, и такие, как описанные Sanghvi Y.S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke S.T. and Lebleu B., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеиновых оснований являются особенно пригодными для повышения аффинности связывания олигомерных соединений по изобретению. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Продемонстрировано, что 5-метилцитозиновые замены повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2ºC (Sanghvi Y.S., Crooke S.T. and Lebleu B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и представляют собой иллюстративные замены оснований, даже более конкретно в комбинации с 2'-O-метоксиэтильными модификациями сахаров.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение определенных отмеченных выше модифицированных нуклеиновых оснований, а также других модифицированных нуклеиновых оснований включают, но не ограничиваются ими, указанные выше патенты США №№ 3687808, 4845205, 513030, 5134066, 5175273, 5367066, 5432272, 5457187, 5459255, 5484908, 5502177, 5525711, 5552540, 5587469, 5594121, 5596091, 5614617, 5681941, 5750692, 6015886, 6147200, 6166197, 6222025, 6235887, 6380368, 6528640, 6639062, 6617438, 7045610, 7427672 и 7495088, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в настоящее описание посредством ссылки.
РНК иРНК также можно модифицировать таким образом, чтобы она содержала одну или несколько закрытых нуклеиновых кислот (ЗНК). Закрытая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, содержащий модифицированную группу рибозы, в которой группа рибозы содержит дополнительную связь, соединяющую 2'- и 4'-атомы углероды. Эта структура эффективно "замыкает" рибозу в 3'-концевой структурной конформации. Продемонстрировано, что добавление закрытых нуклеиновых кислот к миРНК повышает стабильность миРНК в сыворотке и снижает нецелевые эффекты (Elmen J. et al., (2005) Nucleic Acids Research, 33(1):439-447; Mook O.R. et al., (2007) Mol. Canc Ther., 6(3):833-843; Grunweller? A. et al, (2003) Nucleic Acids Research, 31(12):3185-3193).
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, следующие патенты США №№ 6268490, 6670461, 6794499, 6998484, 7053207, 7084125 и 7399845, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в настоящее описание посредством ссылки.
Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекулы РНК могут включать N-(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), N-(капроил-4-гидроксипролинол (Hyp-C6), N-(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-O-дезокситимидин (простой эфир), N-(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-амино), 2-докозаноилуридин-3'-фосфат, инвертированное основание dT (idT) и другие. Описание такой модификации можно найти в публикации PCT № WO 2011/005861.
IV. Конъюгированные с лигандами иРНК
Другая модификация РНК иРНК по изобретению включает химическое связывание с РНК одного или нескольких лигандов, групп или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточный захват иРНК. Такие группы включают, но не ограничиваются ими, липидные группы, такие как группа холестерина (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060), тиоэфир, например, берил-S-тритилтиол (Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J., 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654), пальмитиловаую группу (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237) или группу октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937).
В одном из вариантов осуществления лиганд изменяет распределение, направленную доставку или период полувыведения средства иРНК, в которое его вводят. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд обеспечивает повышение аффинности к выбранной мишени, например, молекуле, клетке или типу клеток, компартменту, например, компартменту клетки или органа, ткани, органу или участку организма, например, по сравнению с соединением без такого лиганда. Предпочтительные лиганды не участвуют в образовании пар дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.
Лиганды могут включать природные вещества, такие как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), или глобулин), углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин или гиалуроновая кислота) или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, которая представляет собой полилизин (PLL), поли-L-аспарагиновую кислоту, поли-L-глутаминовую кислоту, стиролмалеиновую кислоту ангидридный сополимер, сополимер поли(L-лактид-когликолид), сополимер дивинилового эфира-малеинового ангидрида, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида (HMPA), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиурентан, поли(2-этилакрилловая кислота), полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Пример полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидомиметический полиамин, дендримерный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.
Лиганды также могут содержать направляющие группы, например, направляющее средство к клетке или ткани, например, лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, которое связывается с определенным типом клеток, таким как клетки почки. Направляющая группа может представлять собой тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностно-активный белок A, углевод муцина, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглутаминат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин B12, витамин A, биотин или пептид RGD или миметик пептида RGD.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркаляторы (например, акридины), сшивающие средства (например, псорален, митомицин C), порфирины (TPPC4, тексапирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, ЭДТА), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, бомеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин)и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, пептид Tat), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, полиамино, алкил, замещенный алкил, радиоактивномеченные маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), вещества, облегчающие транспорт/всасывание (например, аспирин, витамин E, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кастеры, конъюгаты акридин-имидазола, комплексы Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP или AP.
Лиганды могут представлять собой белки, например, гликопротеины или пептиды, например, молекулы, обладающие конкретной аффинностью к колигандам, или антитела, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клеток, таким как клетка печени. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные соединения, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу или поливалентную фукозу. Лиганд может представлять собой, например, липополисахарид, активатор p38 MAP-киназы или активатор NF-κB.
Лиганд может представлять собой вещество, например, лекарственное средство, которое может повышать поступление средства иРНК в клетку, например, посредством разрушения цитоскелета клетки, например, посредством разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственное средство может представлять собой, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, джаплакинолид, латрункулин A, фаллоидин, свинхолид A, инданоцин или миосервин.
В некоторых вариантах осуществления лиганд, прикрепленный к иРНК, как описано в настоящем описании, действует как фармакокинетический модулятор (PK модулятор). PK модуляторы включают липофильные вещества, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, связывающие белок средства, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные PK модуляторы включают, но не ограничиваются ими, холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин E, биотин и т.д. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат ряд тиофосфатных связей, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие много тиофосфатных связей в каркасе, также являются пригодными по настоящему изобретению в качестве лигандов (например, PK модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связываются с компонентами сыворотки (например, сывороточными белками), также являются пригодными для использования в качестве PK модулирующих лигандов в вариантах осуществления, описываемых в настоящем описании.
Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды по изобретению можно синтезировать с использованием олигонуклеотида, который несет концевую реакционноспособную функциональную группу, такую как получаемую в результате прикрепления линкерной молекулы на олигонуклеотид (описываемый выше). Этот реакционноспособный олигонуклеотид может непосредственно взаимодействовать с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют, чтобы они несли любую из ряда защитных групп, или лигандами, которые содержат линкерную группу, прикрепленную к ним.
Олигонуклеотиды, используемые в конъюгатах по настоящему изобретению, можно получать подходящим способом и общепринятой хорошо известной техникой твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза реализует несколько продавцов, включая, например, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Дополнительно или альтернативно можно применять любые другие средства, известные в данной области, для такого синтеза. Также известно, что аналогичные техники используют для получения других олигонуклеотидов, таких как тиофосфаты и алкилированные производные.
В конъюгированных с лигандом олигонуклеотидах и молекуле лиганда, несущей последовательность-специфические связанные нуклеозиды по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды можно синтезировать на подходящем синтезаторе ДНК с использованием стандартных предшественников нуклеотидов или нуклеозидов или предшественников нуклеотидных или нуклеозидных конъюгатов, которые уже несут линкерную группу, предшественников лиганда-нуклеотида или нуклеозида-конъюгата, которые уже несут молекулу лиганда или структурных блоков, несущих ненуклеозидный лиганд.
При использовании предшественников нуклеотида-конъюгата, которые уже несут линкерную группу, как правило, проводят синтез последовательность-специфических связанных нуклеозидов, и затем подвергают молекулу лиганда взаимодействию с линкерной группой с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды по настоящему изобретению синтезируют на автоматическом синтезаторе с использованием фосфорамидитов, получаемых из конъюгатов лиганда-нуклеозида наряду со стандартными фосфорамидитами и нестандартными фосфорамидитами, которые являются коммерчески доступными и общепринято используемыми в олигонуклеотидном синтезе.
A. Липидные конъюгаты
В одном из вариантов осуществления лиганд или конъюгат представляет собой липид или молекулу на основе липида. Такой липид или молекула на основе липида, предпочтительно, связывается с сывороточным белком, например, сывороточным альбумином человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд способствует распределению конъюгата в ткани-мишени, например, непочечной ткани-мишени организма. Например, ткань-мишень может представлять собой печень, включая паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно использовать другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например, можно использовать непроксин или аспирин. Липид или лиганд на основе липида может (a) повышать устойчивость к деградации конъюгата, (b) повышать направленную доставку или транспорт в клетку-мишень или клеточную мембрану, и/или (c) их можно использовать для регуляции связывания с сывороточным белком, например, HSA.
Лиганд на основе липида можно использовать для ингибирования, например, контроля связывания конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA с большей силой, является с меньшей вероятностью направленным на почки и, таким образом, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA с меньшей силой можно использовать для направленной доставки конъюгата к почкам.
В предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывается с HSA. Предпочтительно, он связывается с HSA с такой достаточной аффинностью, что конъюгат предпочтительно распределяется в непочечной ткани. Однако, предпочтительно, чтобы аффинность не являлась такой сильной, что связывание с HSA лиганда могло бы стать необратимым.
В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида слабо связывается с HSA или совсем не связывается, таким образом, что конъюгат, предпочтительно, распределяется в почке. Также можно использовать другие группы, которые направлены на клетки почки, вместо или в дополнение к лиганду на основе липида.
В другом аспекте лиганд представляет собой молекулу, например, витамин, которая захватывается клеткой-мишенью, например, пролиферирующей клеткой. Они являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной клеточной пролиферацией, например, злокачественного или доброкачественного типа, например, злокачественных клеток. Иллюстративные витамины включают витамин A, E и K. Другие иллюстративные витамины включают витамин B, например, фолиевую кислоту, B12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, захватываемые клетками-мишенями, такими как клетки печени. Также включены HSA и липопротеин низкой плотности (LDL).
B. Проникающие в клетку средства
В другом аспекте лиганд представляет собой проникающее в клетку средство, предпочтительно, спиральное проникающее в клетку средство. Предпочтительно, средство является амфипатическим. Иллюстративное средство представляет собой пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, его можно модифицировать, включая пептидомиметик, инвертированные изомеры, непептидные или псевдопептидные связи, и использовать D-аминокислоты. Спиральное средство представляет собой, предпочтительно, альфа-спиральное средство, которое предпочтительно содержит липофильную и липофобную фазу.
Лиганд может представлять собой пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также обозначаемый в настоящем описании как олигопептидомиметик) представляет собой молекулу, способную сворачиваться в определенную трехмерную структуру, аналогичную природному пептиду. Связывание пептида и пептидомиметиков со средствами иРНК может влиять на фармакокинетическое распределение иРНК, такое как повышение клеточного распознавания и поглощения. Длина пептида или молекулы пептидомиметика может составлять приблизительно 5-50 аминокислот, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот.
Пептид или пептидомиметик может представлять собой, например, проникающий в клетку пептид, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий преимущественно из Tyr, Trp или Phe). Пептидная молекула может представлять собой дендримерный пептид, конформационно ограниченный пептид или сшитый пептид. В другом альтернативном варианте пептидная молекула может содержать гидрофобную последовательность мембранной транслокации (MTS). Иллюстративный пептид, содержащий гидрофобную MTS, представляет собой RFGF, содержащий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:13). Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:10), содержащая гидрофобную MTS также может представлять собой направляющую группу. Пептидная молекула может представлять собой "транспортный" пептид, который может переносить крупные полярные молекулы, включая пептиды, олигонуклеотиды и белок через клеточные мембраны. Например, было выявлено, что последовательности белка Tat ВИЧ (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:11) и белка Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:12) могут функционировать, как транспортные пептиды. Пептид или пептидомиметик можно кодировать случайной последовательностью ДНК, такой как пептид, определяемый из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки "одна гранула-одно соединение" (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Примеры пептида или пептидомиметика, связанного со средством дцРНК через встроенное мономерное звено для связывания с клеткой, представляют собой аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD)-пептид или имитатор RGD. Длина пептидной молекулы может находиться в диапазоне приблизительно от 5 аминокислот приблизительно до 40 аминокислот. Пептидные молекулы могут содержать такую структурную модификацию, чтобы повышать стабильность или направлять конформационные свойства. Можно использовать любую из структурных модификаций, описанных ниже.
Пептид RGD для применения в композициях и способах по изобретению может быть линейным или циклическим, и его можно модифицировать, например, подвергая гликозилированию или метилированию, для облегчения направленной доставки в конкретную ткань(и). Содержащие RGD пептиды и пептидомиметики могут содержать D-аминокислоты, а также синтетические имитаторы RGD. В дополнение к RGD можно использовать другие группы, которые направлены на лиганд интегрина. Предпочтительные конъюгаты такого лиганда направлены на PECAM-1 или VEGF.
"Проникающий в клетку пептид" способен проникать в клетку, например, микробную клетку, такую как клетка бактерий или грибков, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Проникающий в микробную клетку пептид может представлять собой, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или церопин P1), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин) или пептид, содержащий только одну или две доминирующих аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Проникающий в клетку пептид также может содержать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, проникающий в клетку пептид может представлять собой двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получают из домена слитого пептида gp41 ВИЧ-1 и NLS большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res., 31:2717-2724, 2003).
C. Углеводные конъюгаты
В некоторых вариантах осуществления композиций и способов по изобретению олигонуклеотид иРНК дополнительно содержит углевод. Конъюгированная с углеводом иРНК является предпочтительной для доставки in vivo нуклеиновых кислот, а также композиций, подходящих для терапевтическое применения in vivo, как описано в настоящем описании. Как используют в настоящем описании, "углевод" относится к соединению, которое представляет собой углевод сам по себе, состоящий из одного или нескольких моносахаридных звеньев, содержащих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода, или соединение, содержащее в качестве своей части углеводную группу, состоящую из одного или нескольких моносахаридных звеньев, где каждое содержит по меньшей мере шесть атомы углерода (которое может быть линейным, разветвленным или циклическим), с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Репрезентативные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие приблизительно от 4, 5, 6, 7, 8 или 9 моносахаридных звеньев) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные камеди. Конкретные моносахариды включают C5 и более (например, C5, C6, C7 или C8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара, содержащие два или три моносахаридных звена (например, C5, C6, C7 или C8).
В одном из вариантов осуществления углеводный конъюгат для применения в композициях и способах по изобретению представляет собой моносахарид. В одном из вариантов осуществления моносахарид представляет собой N-ацетилгалактозамин, такой как
Figure 00000004
В другом варианте осуществления углеводный конъюгат для применения в композициях и способах по изобретению выбран из группы, состоящей из:
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Другой репрезентативный углеводный конъюгат для применения в вариантах осуществления, описываемых в настоящем описании, включает, но не ограничивается ими,
Figure 00000022
(Формула XXIII), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
В некоторых вариантах осуществления углеводный конъюгат дополнительно содержит один или более дополнительных лигандов, как описано выше, таких как, но, не ограничиваясь ими, модулятор PK и/или проникающий в клетки пептид.
D. Линкеры
В некоторых вариантах осуществления описываемые в настоящем описании конъюгат или лиганд можно связывать с олигонуклеотидом иРНК различными линкерами, которые могут быть расщепляемыми или не расщепляемыми.
Термин "линкер" или "линкерная группа" означает органическую группу, которая соединяет две части соединения, например, ковалентно связывает две части соединения. Линкеры, как правило, содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, звено, такое как NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH или цепь из атомов, такую как, но, не ограничиваясь ими, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, где один или более метиленов могут прерываться или заканчиваться на O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероцикл; где R8 представляет собой водород, ацил, алифатическую или замещенную алифатическую. В одном из вариантов осуществления линкер состоит приблизительно из 1-24 атомов, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17 или 8-16 атомов.
Расщепляемая линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая является достаточно стабильной вне клетки, но которая при попадании в клетку-мишень расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. В предпочтительном варианте осуществления расщепляемая линкерная группа расщепляется по меньшей мере приблизительно в 10 раз, 20, раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или более, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз быстрее в клетке-мишени или при первом эталонном условии (которое можно, например, выбирать для имитации или предоставления внутриклеточных условий), чем в крови индивидуума или при втором эталонном условии (которое можно, например, выбирать для имитации или предоставления условий, выявляемых в крови или сыворотки).
Расщепляемые линкерные группы являются чувствительными к расщепляемым средствам, например, pH, окислительно-восстановительному потенциалу или наличию деструктивных молекул. Как правило, расщепляющие средства являются наиболее распространенными или содержатся на более высоких уровнях или с высокими активностями в клетках, чем в сыворотке или крови. Примеры таких деструктивных средств включают: окислительно-восстановительное средство, которое выбирают для конкретных субстратов или которое не обладает субстратной специфичностью, включая, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановители, такие как меркаптаны, содержащиеся в клетках, которые могут разрушать расщепляемую в окислительно-восстановительных условиях линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, такие, которые приводят к pH пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой линкерную группу, действуя как основная кислота, пептидазы (которые могут быть специфичными к субстрату) и фосфатазы.
Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может являться чувствительной к pH. pH сыворотки человека составляет 7,4, тогда как средний внутриклеточный pH является незначительно ниже в диапазоне приблизительно от 7,1-7,3. Эндосомы имеют более кислый pH в диапазоне 5,5-6,0, и лизосомы имеют еще более кислый pH приблизительно 5,0. Некоторые линкеры содержат расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном pH, таким образом, высвобождая катионный липид из лиганда внутри клетки или в желаемом компартменте клетки.
Линкер может содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, вводимой в линкер, может зависеть от клетки, в которую необходима направленная доставка. Например, направленный на печень лиганд можно связывать с катионным липидом посредством линкера, который содержит сложную эфирную группу. В клетки печени наблюдают высокое содержание эстераз, и, таким образом, линкер будет расщепляться более эффективно в клетках печени, чем в типах клеток, в которых не наблюдают высокого содержания эстераз. Другие типы клеток с высоким содержанием эстераз включают клетки легкого, коркового вещества почки и семенников.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно использовать при направленной доставки в типы клеток с высоким содержанием пептидазы, таких как клетки печени и синовиоциты.
В основном пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы можно оценивать, тестируя способность деструктивного средства (или условия) расщеплять кандидатную линкерную группу. Кроме того, желательно также тестировать кандидатную расщепляемую линкерную группу на способность не поддаваться расщеплению в крови или при контактировании с другими не являющимися мишенью тканями. Таким образом, можно определять относительную подверженность расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбирают, чтобы оно являлось показателем расщепления в клетке-мишени и второе выбирают, чтобы оно являлось показателем расщепления в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке. Оценки можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культурах клеток, в органах или тканевых культурах или на животных. Пригодным может являться проведение предварительных оценок в условиях без клеток или в условиях культивирования и подтверждать посредством дополнительных оценок на животных. В предпочтительных вариантах осуществления пригодные соединения-кандидаты расщепляются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбираемых для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбираемых для имитации внеклеточных условий).
i. Расщепляемые в окислительно-восстановительных условиях линкерные группы
В одном из вариантов осуществления расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую в окислительно восстановительных условиях линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Пример расщепляемой в восстановительных условиях линкерной группы представляет собой дисульфидную линкерную группу (-S-S-). Для определения является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа подходящей "расщепляемой в восстановительных условиях линкерной группой" или, например, пригодной для использования с конкретной группой иРНК и конкретным средством направленной доставки, можно рассматривать способы, описываемые в настоящем описании. Например, кандидата можно оценивать посредством инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем с использованием известных в данной области реагентов, которые имитируют скорость расщепления, которую наблюдают в клетке, например, в клетке-мишени. Кандидатов также можно оценивать в условиях, которые выбирают для имитации условий крови или сыворотки. В одном из вариантов осуществления соединения-кандидаты расщепляются не более приблизительно 10% в крови. В других вариантах осуществления пригодные соединения-кандидаты разрушаются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбираемых для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбираемых для имитации внеклеточных условий). Скорость расщепления соединений-кандидатов можно определять стандартными анализами ферментативной кинетики в условиях, выбираемых для имитации внутриклеточной среды, и сравнивать с условиями, выбираемые для имитации внеклеточной среды.
ii. Расщепляемые линкерные группы на основе фосфата
В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую линкерную группу на основе фосфата. Расщепляемая линкерная группа на основе фосфата расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Пример средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, представляет собой ферменты, такие как фосфатазы в клетках. Примеры линкерных групп на основе фосфата представляют собой -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительные варианты осуществления представляют собой -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительный вариант осуществления представляет собой -O-P(O)(OH)-O-. Этих кандидатов можно оценивать способами, аналогичными способам, описанным выше.
iii. Расщепляемые кислотой линкерные группы
В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая расщепляется в кислых условиях. В предпочтительных вариантах осуществления расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с pH приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже), или средствами, такими как ферменты, которые могу действовать как основная кислота. В клетке органеллы с конкретным низким pH, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечивать расщепляющую среду для расщепляемых кислотой линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотой линкерных групп включают, но не ограничиваются ими, гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотой группы могут иметь общую формулу -C=NN-, C(O)O или -OC(O). Предпочтительный вариант осуществления является таким, когда углерод, присоединенный к кислороду сложного эфира (алкоксигруппа) представляет собой арильную группу, замещенную алкильную группу или третичную алкильную группу, такую как диметилпентил или трет-бутил. Этих кандидатов можно оценивать способами, аналогичными способам, описанным выше.
iv. Линкерные группы на основе сложного эфира
В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую линкерную группу на основе сложного эфира. Расщепляемая линкерная группа на основе сложного эфира расщепляется в клетках ферментами, такими как эстеразы и амидазы. Примеры расщепляемых линкерных групп на основе сложного эфира включают, но не ограничиваются ими, сложные эфиры алкилена, алкенилен и алкиниленовые группы. Расщепляемые линкерные группы на основе сложного эфира имеют общую формулу -C(O)O- или -OC(O)-. Этих кандидатов можно оценивать способами, аналогичными способам, описанным выше.
v. Расщепляемые группы на основе пептида
В еще одном варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую линкерную группу на основе пептида. Расщепляемая линкерная группа на основе пептида расщепляется в клетке ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Расщепляемые линкерные группы на основе пептида представляют собой пептидные связи, образуемые между аминокислотами с получением олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Расщепляемые группы на основе пептида не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может образовываться между любым алкиленом, алкениленом или алкиниленом. Пептидная связь представляет собой конкретный тип амидной связи, образуемой между аминокислотами с получением пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептида является, как правило, ограниченной пептидной связью (т.е. амидной связью), образуемой между аминокислотами с получением пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Расщепляемые линкерные группы на основе пептида имеют общую формулу -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB представляют собой группы R двух смежных аминокислот. Этих кандидатов можно оценивать способами, аналогичными способам, описанным выше.
В одном из вариантов осуществления иРНК по изобретению конъюгирована с углеводом через линкер. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов иРНК с линкерами композиций и способов по изобретению включают, но не ограничиваются ими,
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
(Формула XXX), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
В определенных вариантах осуществления композиций и способов по изобретению лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc (N-ацетилгалактозамина), соединенных через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению конъюгирована с двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, представленных в любой из формул (XXXI)-(XXXIV):
Figure 00000028
где:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C представляют собой независимо для каждого случая 0-20, и где повторяющееся звено может являться одинаковым или различным;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C каждый независимо для каждого случая не содержится, представляют собой CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH или CH2O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C каждый независимо для каждого случая не содержится, представляют собой алкилен, замещенный алкилен, где один или более метиленов могут прерываться или заканчиваться одним или несколькими из O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C=C или C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C каждый независимо для каждого случая не содержится, представляют собой NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(О), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO,
Figure 00000029
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B и L5C представляют собой лиганд, т.е. каждый независимо для каждого случая представляет собой моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид, и Ra представляет собой H или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентные конъюгированные производные GalNAc являются особенно пригодными для применения со средствами РНКи для ингибирования гена-мишени, такие как производные формулы XXXV:
Формула XXXV
Figure 00000030
где L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают, но не ограничиваются ими, структуры, перечисленные выше в виде формул II_VII, XI, X и XIII.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение конъюгатов РНК включают, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 4828979, 4948882, 5218105, 5525465, 5541313, 5545730, 5552538, 5578717, 5580731, 5591584, 5109124, 5118802, 5138045, 5414077, 5486603, 5512439, 5578718, 5608046, 4587044, 4605735, 4667025, 4762779, 4789737, 4824941, 4835263, 4876335, 4904582, 4958013, 5082830, 5112963, 5214136, 5082830, 5112963, 5214136, 5245022, 5254469, 5258506, 5262536, 5272250, 5292873, 5317098, 5371241, 5391723, 5416203, 5451463, 5510475, 5512667, 5514785, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5595726, 5597696, 5599923, 5599928 и 5688941, 6294664, 6320017, 6576752, 6783931, 6900297, 7037646, 8106022, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в настоящее описание посредством ссылки.
Необязательно, что все положения в данном соединении являлись одинаково модифицированными, и фактически можно вводить более одной из указанных выше модификаций в одно соединение или даже в один нуклеозид в иРНК. Настоящее изобретение также относится к соединениям иРНК, которые представляют собой химерные соединения.
"Химерные" соединения иРНК или "химеры" в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения иРНК, предпочтительно, дцРНК, которые содержат два или более химически отличных участка, где каждый состоит по меньшей мере из одного мономерного звена, т.е. нуклеотида в случае соединения дцРНК. Такие иРНК, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицируют таким образом, чтобы обеспечивать при повышенной устойчивости иРНК к разрушению нуклеазами повышенный клеточный захват и/или повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительный участок иРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Активация РНКазы H, таким образом, приводит к расщеплению РНК-мишени, таким образом, значительно повышая эффективность ингибирования иРНК экспрессии гена. Таким образом, часто можно получать сравнимые результаты для более коротких иРНК, когда используют химерные дцРНК, по сравнению с тиофосфатными дезокси-дцРНК, гибридизующимися с аналогичным участком-мишенью. Расщепление РНК-мишени можно общепринято детектировать электрофорезом в геле, и при необходимости ассоциированными способами гибридизации нуклеиновых кислот, известными в данной области.
В определенных случаях РНК иРНК можно модифицировать не относящейся к лигандам группой. Многие не относящиеся к лигандам молекулы конъюгировали с иРНК для повышения активности, клеточного распределения или клеточного поглощения иРНК, и способы проведения таких конъюгаций являются доступными в научной литературе. Такие не относящиеся к лигандам группы включали липидные группы, такие как холестерин (Kubo T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-H-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловую группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) или группу октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов РНК, перечислены выше. Характерные протоколы конъюгации включают синтез РНК, несущей аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают взаимодействию с молекулой, конъюгированной с использованием соответствующих связывающих или активирующих реагентов. Реакцию конъюгации можно проводить с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, или после расщепления РНК в жидкой фазе. Чистый конъюгат, как правило, получают очисткой конъюгата РНК ВЭЖХ.
IV. Доставка иРНК по изобретению
Доставку иРНК по изобретению в клетку, например, клетку индивидуума, такого как являющийся человеком индивидуум (например, нуждающийся в этом индивидуум, такой как индивидуум с нарушением метаболизма липидов) можно проводить рядом различных способов. Например, доставку можно проводить посредством приведения клетки в контакт с иРНК по изобретению in vitro или in vivo. Доставку in vivo также можно проводить непосредственно введением композиции, содержащей иРНК, например, дцРНК, индивидууму. Альтернативно, доставку in vivo можно проводить опосредованно введением одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию иРНК. Эти альтернативные варианты дополнительно описаны ниже.
В основном любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты (in vitro или in vivo) можно адаптировать для использования с иРНК по изобретению (см., например, Akhtar S. and Julian R.L., (1992) Trends Cell. Biol., 2(5):139-144 и WO94/02595, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Для доставки in vivo факторы, которые необходимо учитывать для доставки молекулы иРНК, включают, например, биологическую стабильность доставляемой молекулы, предотвращение неспецифических эффектов и накопление доставляемой молекулы в ткани-мишени. Неспецифические эффекты иРНК можно минимизировать посредством локального введения, например, посредством инъекции или имплантации в ткань или местного введения препарата. Локальное введение в участок обработки максимально повышает локальную концентрацию средства, ограничивает экспозицию средством системных тканей, которое иным образом может повреждать средство, или которые могут разрушать средство, и оно обеспечивает меньшую суммарную дозу молекулы иРНК, которую необходимо вводить. В нескольких исследованиях продемонстрировали успешный "нокдаун" продуктов генов при локальном введении иРНК. Например, продемонстрировано, что внутриглазная доставка дцРНК VEGF посредством интравитреальной инъекции у яванских макак (Tolentino M.J. et al., (2004) Retina, 24:132-138) и субретинальные инъекции у мышей (Reich S.J. et al., (2003) Mol. Vis., 9:210-216) предотвращают неоваскуляризацию на экспериментальной модели, связанной с возрастной дегенерацией желтого пятна. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция дцРНК у мышей уменьшает объем опухоли (Pille J. et al., (2005) Mol. Ther., 11:267-274) и может увеличивать выживаемость несущих опухоль мышей (Kim W.J. et al., (2006) Mol. Ther., 14:343-350; Li S. et al., (2007) Mol. Ther., 15:515-523). Также продемонстрирована успешная РНК-интерференция при локальной доставке в ЦНС посредством прямой инъекции (Dorn G. et al., (2004) Nucleic Acids, 32:с49; Tan P.H. et al., (2005) Gene Ther., 12:59-66; Makimura H. et al., (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina G.T. et al., (2004) Neuroscience, 129:521-528; Thakker E.R. et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:17270-17275; Akaneya Y., et al., (2005) J. Neurophysiol., 93:594-602) и в легкие посредством интраназального введения (Howard K.A. et al., (2006) Mol. Ther., 14:476-484; Zhang X. et al., (2004) J. Biol. Chem., 279:10677-10684; Bitko V. et al., (2005) Nat. Med., 11:50-55). Для системного введения иРНК для лечения заболевания РНК можно модифицировать или альтернативно доставлять с использованием системы доставки лекарственных средств; оба способа действуют, предотвращая быстрое разрушение дцРНК эндо- и экзонуклеазами in vivo. Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут обеспечивать направленную доставку композиция иРНК в ткань-мишень и предотвращать нежелательные нецелевые эффекты. Молекулы иРНК можно модифицировать посредством химической конъюгации с липофильными группами, такими как холестерин, для повышения поглощения клетками и предотвращения деградации. Например, иРНК, направленную против апоB, конъюгированную с липофильной группой холестерина, системно инъецировали мышам, и она вызывала "нокдаун" мРНК апоВ в печени и тонкой кишке (Soutschek J. et al., (2004) Nature, 432:173-178). Продемонстрировано, что конъюгация иРНК с аптамером ингибирует рост опухоли и опосредует регрессию опухоли на модели рака предстательной железы на мышах (McNamara J.O. et al., (2006) Nat. Biotechnol., 24:1005-1015). В альтернативном варианте осуществления иРНК можно доставлять с использованием систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки облегчают связывание молекулы иРНК (отрицательно заряженной), а также усиливает взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране, обеспечивая эффективное поглощение иРНК клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры можно связывать с иРНК или индуцировать с образованием везикулы или мицеллы (см., например, Kim S.H. et al., (2008) Journal of Controlled Release, 129(2): 107-116), в которые помещают иРНК. Образование везикул или мицелл дополнительно предотвращает деградацию иРНК при системном введении. Способы получения и введения катионных комплексов иРНК хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Sorensen D.R. et al., (2003) J. Mol. Biol., 327:761-766; Verma U.N. et al., (2003) Clin. Cancer Res., 9:1291-1300; Arnold A.S. et al., (2007) J. Hypertens., 25:197-205, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственного средства, пригодных для системной доставки иРНК, включают DOTAP (Sorensen D.R. et al., (2003), выше; Verma U.N. et al., (2003), выше), олигофектамин, "твердые частицы нуклеиновая кислота-липид" (Zimmermann T.S. et al., (2006) Nature, 441:111-114), кардиолипин (Chien P.Y. et al., (2005) Cancer Gene Ther., 12:321-328; Pal A. et al., (2005) Int. J. Oncol., 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner A. (2006) J. Biomed. Biotechnol., 71659), пептиды Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu S. (2006) Mol. Pharm., 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia D.A. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans., 35:61-67; Yoo H. et al., (1999) Pharm. Res., 16:1799-1804). В некоторых вариантах осуществления иРНК образует комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции иРНК и циклодекстринов можно найти в патенте США № 7427605, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
A. Кодируемые вектором иРНК по изобретению
иРНК, направленную на ген ANGPTL3, можно экспрессировать из единицы транскрипции, встраиваемых в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture A. et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillrn A. et al., международная публикация PCT № WO 00/22113, Conrad, международная публикация PCT № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от часов до недель) или постоянной (от недель до месяцев или более), зависящая от конкретной используемой конструкции и ткани-мишени или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может представлять собой интегрирующий или неинтегрирующий вектор. Трансген также можно конструировать таким образом, чтобы обеспечивать возможность его наследственной передачи в виде внехромосомной плазмиды (Gassman et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1292).
Индивидуальную цепь или цепи иРНК можно транскрибировать с промотора на векторе для экспрессии. Когда необходимо экспрессировать две отдельные цепи для получения, например, дцРНК, можно вводить совместно два отдельных вектора для экспрессии (например, посредством трансфекции или инфекции) в клетку-мишень. Альтернативно каждую индивидуальную цепь дцРНК можно транскрибировать посредством промоторов, которые оба располагают в одной и той же плазмиде для экспрессии. В одном из вариантов осуществления дцРНК экспрессируют в виде полинуклеотидов с инвертированными повторами, соединенными линкерной полинуклеотидной последовательностью, таким образом, что дцРНК обладает структурой стебля и петли.
Векторы для экспрессии иРНК, как правило, представляют собой ДНК-плазмиды или вирусные векторы. Для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии иРНК, как описано в настоящем описании, можно использовать векторы для экспрессии, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно, экспрессирующие векторы, совместимые с клетками позвоночных. Экспрессирующие векторы на основе эукариотической клетки хорошо известны в данной области и являются доступными из ряда коммерческих источников. Как правило, такие векторы при условии, что они содержат подходящие участки рестрикции для встраивания желаемого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов для экспрессии иРНК может быть системной, такой как посредством внутривенного или внутримышечного введения, посредством введения в клетки-мишени, эксплантированные у пациента, с последующим обратным введением пациенту или любыми другими способами, которые обеспечивают введение в желаемую клетку-мишень.
Плазмиды для экспрессии иРНК можно трансфицировать в клетки-мишени в виде комплекса с катионными липидными носителями (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). Также в настоящем изобретении предусматривают многие липидные трансфекции для опосредуемого иРНК нокдауна, направленного на различные участки РНК-мишени в течение недели или более. За успешным введением векторов в клетки-хозяева можно наблюдать различными известными способами. Например, временную трансфекцию можно выявлять с использованием репортера, такого как флуоресцентный маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильную трансфекцию клеток ex vivo можно обеспечивать с использованием маркеров, которые придают трансфицируемой клетке устойчивость к конкретным факторам среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такую как устойчивость к гигромицину B.
Системы вирусных векторов, которые можно использовать в способах и композициях, описываемых в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, (a) аденовирусные векторы, (b) ретровирусные векторы, включая, но, не ограничиваясь ими, лентивирусные векторы, вирус лейкоза Молони мышей и т.д., (c) аденоассоциированные вирусные векторы, (d) векторы на основе вируса простого герпеса, (e) векторы SV 40, (f) векторы на основе вируса полиомы, (g) векторы на основе вируса папилломы, (h) векторы на основе пикорнавируса, (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопоксвируса, например, векторы на основе вируса осповакцины, или вируса оспы птиц, например, оспы канареек или оспы-дифтерита птиц, и (j) зависимый от вируса-помощника или аденовирус с усеченным геномом. Предпочтительными также могут быть вирусы с дефектом репликации. Различные векторы встраиваются или не встраиваются в геном клеток. При желании конструкции могут содержать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкцию можно вводить в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы EPV и EBV. Для конструкций для рекомбинантной экспрессии иРНК, как правило, необходимы регуляторные элементы, например, промоторы, энхансеры и т.д. для обеспечения экспрессии иРНК в клетках-мишенях. Другие аспекты, которые необходимо учитывать для векторов и конструкций, дополнительно описаны ниже.
Пригодные для доставки иРНК векторы содержат регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии иРНК в желаемой клетки-мишени или ткани-мишени. Регуляторные элементы можно выбирать, чтобы обеспечивать конститутивную или регулируемую/индуцируемую экспрессию.
Экспрессию иРНК можно точно регулировать, например, с использованием индуцируемой регуляторной последовательности, которая является чувствительной к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J., 8:20-24). Такие индуцируемые экспрессирующие системы, подходящие для регуляции экспрессии дцРНК в клетках или у млекопитающих, включают, например, регуляцию экдизоном, эстрогеном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-бета-D1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Специалист в данной области может выбирать подходящую регуляторную/промоторную последовательность в зависимости от предполагаемого применения трансгена иРНК.
Можно использовать вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иРНК. Например, можно использовать ретровирусный вектор (см. Miller et al, (1993) Meth. Enzymol., 217:581-599). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иРНК, клонируют в один или более векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты у пациента. Более подробную информацию о ретровирусных векторах можно найти, например, у Boesen et al., Biotherapy, 6:291-302 (1994), которые описывают применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 в гематопоэтических стволовых клетках с целью получения стволовых клеток более устойчивых к химиотерапии. Другие ссылки, иллюстрирующие применение ретровирусных векторов в генной терапии, представляют собой Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest., 93:644-651; Kiem et al., (1994) Blood, 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, (1993) Human Gene Therapy, 4:129-141 и Grossman and Wilson, (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel., 3:110-114. Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе ВИЧ, описанные в патентах США №№ 6143520, 5665557 и 5981276, которые включены в настоящее описание посредством ссылки.
Аденовирусы также предусматривают для применения для доставки иРНК по изобретению. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями, например, для доставки генов в эпителиальную ткань дыхательных путей. Аденовирусы естественным путем инфицируют эпителиальную ткань дыхательных путей, когда они вызывают легкое заболевание. Другие мишени систем доставки на основе аденовируса представляют собой печень, центральную нервную систему, эндотелиальные клетки и мышцу. Аденовирусы обладают преимуществом, являясь способными инфицировать неделящиеся клетки. Kozarsky and Wilson, (1993) Current Opinion in Genetics and Development, 3:499-503 предоставляют обзор генной терапии на основе аденовируса. Bout et al, (1994) Human Gene Therapy, 5:3-10 продемонстрировали применение аденовирусных векторов для переноса генов в эпителиальную ткань дыхательных путей макак-резуса. Другие случая применения аденовирусов в генной терапии можно найти у Rosenfeld et al., (1991) Science, 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell, 68:143-155; Mastrangeli et al., (1993) J. Clin. Invest., 91:225-234; в публикации PCT WO94/12649 и у Wang et al., (1995) Gene Therapy 2:775-783. Подходящий AV вектор для экспрессии иРНК по изобретению, способ конструкции рекомбинантного AV вектора и способ доставки вектора в клетки-мишени описаны у Xia H. et al., (2002), Nat. Biotech., 20:1006-1010.
Для доставки иРНК по изобретению также можно использовать векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) (Walsh et al., (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 204:289-300, патент США № 5436146). В одном из вариантов осуществления иРНК можно экспрессировать в виде двух отдельных комплементарных одноцепочечных молекул РНК из рекомбинантного вектора на основе AAV, содержащего, например, РНК промоторы U6 или H1 или промотор цитомегаловируса (CMV). Подходящие векторы на основе AAV для экспрессии дцРНК по изобретению, способы конструкции рекомбинантного AV вектора и способы доставки векторов в клетки-мишени описаны у Samulski R. et al., (1987), J. Virol., 61: 3096-3101; Fisher K.J. et al., (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R. et al., (1989), J. Virol., 63: 3822-3826; в патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной патентной заявке № WO 94/13788 и международной патентной заявке № WO 93/24641, полное описание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Другой вирусный вектор, подходящий для доставки иРНК по изобретению, представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например, аттенуированный вирус осповакцины, такой как модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, вирус оспы птиц, такой как оспы-дифтерита птиц или оспы канареек.
При необходимости тропизм вирусных векторов можно модифицировать посредством псевдотипирования векторов с оболочками белков или другими поверхностными антигенами от других вирусов или посредством замены различных капсидных белков вируса. Например, лентивирусные векторы можно псевдотипировать с поверхностными белками от вируса везикулярного стоматита (VSV), бешенства, Эбола, Мокола и т.п. Векторы на основе AAV можно модифицировать для направленной доставки в различные клетки посредством конструирования векторов для экспрессии различных серотипов капсидного белка, см., например, Rabinowitz J. E. et al. (2002), J. Virol., 76:791-801, полное описание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
Фармацевтический препарат вектора может содержать вектор в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс с замедленным высвобождением, в который погружают носитель для доставки гена. Альтернативно, когда полный вектор для доставки гена можно получать в интактном виде из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может содержать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки гена.
V. Фармацевтические композиции по изобретению
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и составам, которые содержат иРНК по изобретению. В одном из вариантов осуществления в настоящем описании раскрыты фармацевтические композиции, содержащие иРНК, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие иРНК, являются пригодными для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена ANGPTL3, например, нарушения метаболизма липидов, такого как гипертриглицеридемия.
Такие фармацевтические композиции формулируют в зависимости от способа доставки. Один из примеров представляет собой композиции, которые формулируют для системного введения посредством парентеральной доставки, например, посредством внутривенной (в/в), или для подкожной доставки. Другой пример представляет собой композиции, которые формулируют для прямой доставки в печень, например, посредством инфузии в печень, такой как непрерывная инфузия с использованием насоса.
Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3. Как правило, подходящая доза иРНК по изобретению находится в диапазоне приблизительно от 0,001 приблизительно до 200,0 миллиграммы на килограмм массы тела реципиента в сутки, как правило, в диапазоне приблизительно от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, дцРНК можно вводить приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,05 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг или приблизительно 50 мг/кг в однократной дозе.
Например, дцРНК можно вводить в дозе приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления дцРНК вводят в дозе приблизительно от 0,1 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 50 мг/мг, приблизительно от 2 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 45 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 45 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 40 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 20 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 20 мг/кг или приблизительно от 15 приблизительно до 20 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Например, дцРНК можно вводить в дозе приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления дцРНК вводят в дозе приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 45 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 45 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 40 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 20 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 20 мг/кг или приблизительно от 15 приблизительно до 20 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Например, индивидуумам можно вводить терапевтическое количество иРНК, такое как приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в день, или иРНК можно вводить в виде двух, трех или более частей доз в соответствующих интервалах в течение суток или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки посредством состава с контролируемым высвобождением. В этом случае иРНК, содержащаяся в каждой части дозы должна являться соответствующим образом меньше для получения общего суточного дозирования. Единицу дозирования также можно составлять для доставки в течение нескольких суток, например, с использованием общепринятых составов с длительным высвобождением, которые обеспечивают длительное высвобождение иРНК в течение нескольких суток. Составы с длительным высвобождением хорошо известны в данной области и являются особенно пригодными для доставки средств в конкретный участок, такие как, которые можно использовать со средствами по настоящему изобретению. В этом варианте осуществления единица дозирования содержит соответствующую совокупность суточной дозы.
Эффект однократной дозы на уровни ANGPTL3 может быть продолжительным, таким что, последующие дозы вводят не более чем с интервалами 3, 4 или 5 суток, или не более чем с интервалами 1, 2, 3 или 4 недели.
Специалисту в данной области понятно, что определенные факторы могут влиять на дозирование и время, необходимое для эффективного лечения индивидуума, включая, но, не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания или нарушения, предшествовавшие виды лечения, общее состояние здоровья и/или возраст индивидуума и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение индивидуума с использованием терапевтически эффективного количества композиции может включать однократное лечение или серию видов лечения. Оценки эффективного дозирования и времени полужизни in vivo для индивидуальных иРНК, входящих в изобретение, можно проводить общепринятыми способами или на основании тестирования in vivo с использованием соответствующей модели на животных, как описано где-либо в настоящем описании.
Успехи генетики мышей породили ряд моделей на мышах для исследования различных заболеваний человека, таких как нарушения метаболизма липидов, на которое оказывает благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3. Такие модели можно использовать для тестирования in vivo иРНК, а также для определения терапевтически эффективной дозы. В данной области известны подходящие модели на мышах, и они включают, например, страдающую ожирением (ob/ob) мышь, несущую мутацию в гене ожирения (ob) (Wiegman et al., (2003) Diabetes, 52:1081-1089); мышь, несущую гомозиготный нокаут рецептора LDL (мышь LDLR -/-; Ishibashi et al., (1993) J. Clin. Invest., 92(2):883-893); модель индуцированного рационом атеросклероза на мышах (Ishida et al., (1991) J. Lipid. Res., 32:559-568) и модель гетерозиготного нокаута по липопротеинлипазе на мышах (Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest., 96(6):2555-2568).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, является ли желательным системное или местное лечение, и от участка, подлежащего лечению. Введение может быть местным (например, посредством трансдермального пластыря), легочным, например, посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая посредством распылителя, внутритрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, интраперитонеальную или внутримышечную инъекцию или инфузию, подкожное, например, через имплантированное устройство, или интракраниальное, например, посредством интрапаренхиматозного, интратекального или внутрижелудочкового введения.
иРНК можно доставлять таким образом, чтобы обеспечивать направленную доставку в конкретную ткань, такую как печень (например, гепатоциты печени).
Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Необязательными или желательными могут являться общепринятые фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Также пригодными могут являться презервативы с покрытием, перчатки и т.п. Подходящие местные составы включают такие, в которых иРНК по изобретению находятся в смеси со средством местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC, дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). иРНК по изобретению можно инкапсулировать в липосомы или можно формулировать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, иРНК можно формулировать в виде комплекса с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают, но не ограничиваются ими, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или C1-20алкильный сложный эфир (например, изопропилмиристат IPM), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемые соль. Местные составы подробно описаны в патенте США № 6747014, включенном в настоящее описание посредством ссылки.
A. Составы иРНК, содержащие мембранные молекулярные агрегаты
иРНК для применения в композициях и способах по изобретению можно формулировать для доставки в мембранном молекулярном агрегате, например, липосоме или мицелле. Как используют в настоящем описании, термин "липосома" относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, расположенных в виде по меньшей мере одного бислоя, например, одного бислоя или нескольких бислоев. Липосомы включают однослойные и многослойные везикулы, которые содержат мембрану, образованную из липофильного вещества и водного содержимого. Водная часть содержит композицию иРНК. Липофильное вещество отделяет водное содержимое от водной внешней среды, которая, как правило, не содержит композицию иРНК, хотя в некоторых примерах, может содержать. Липосомы являются пригодными для переноса и доставки активных ингредиентов в место приложения действия. Вследствие того, что мембрана липосом является структурно аналогичной биологическим мембранам, когда липосомы наносят на ткань, бислой липосом сливается с бислоем клеточных мембран. По мере прогрессирования слияния липосомы и клетки внутреннее водное содержимое, которое содержит иРНК, доставляется в клетку, где иРНК сможет специфически связываться с РНК-мишенью и может опосредовать РНКи. В некоторых случаях липосомы также являются конкретно направленными, например, для направления иРНК к конкретным типам клеток.
Липосому, содержащую средство РНКи, можно получать различными способами. В одном из примеров липидный компонент липосомы растворяют в детергенте таким образом, чтобы получать мицеллы с липидным компонентом. Например, липидный компонент может представлять собой амфипатический катионный липид или липидный конъюгат. Детергент может обладать высокой критической концентрацией мицеллообразования и может быть неионным. Иллюстративные детергенты включают холат, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Препарат средства РНКи затем добавляют в мицеллы, которые содержат липидный компонент. Катионные группы на липиде взаимодействуют со средством РНКи и конденсируются вокруг средства РНКи с образованием липосомы. После конденсации детергент удаляют, например, диализом, с получением липосомального препарата средства РНКи.
При необходимости можно добавлять соединение-носитель, которое способствует конденсации, во время реакции конденсации, например, посредством контролируемого добавления. Например, соединение-носитель может представлять собой полимер, отличный от нуклеиновой кислоты (например, спермин или спермидин). pH также можно регулировать, чтобы поддерживать конденсацию.
Способы получения стабильных носителей для доставки полинуклеотидов, которые вводят комплекс полинуклеотид/катионный липид в качестве структурных компонентов носителя доставки, дополнительно описаны, например, в WO 96/37194, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки. Получение липосом также может включать один или более аспектов иллюстративных способов, описанных у Felgner P.L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:7413-7417; в патенте США № 4897355, патенте США № 5171678; у Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol., 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta, 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta, 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta, 728:339 и Fukunaga et al., (1984) Endocrinol 115:757. Широко используемые способы для получения липидных агрегатов подходящего размера для применения в качестве носителей для доставки включают обработку ультразвуком и замораживание-оттаивание плюс экструзия (см., например, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta, 858:161. Можно использовать микрофлюидизацию, когда желательны сопоставимо небольшие (от 50 до 200 нм) и относительно однородные агрегаты (Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta, 775:169. Эти способы можно легко адаптировать для упаковки препаратов средства РНКи в липосомы.
Липосомы делятся на два обширных класса. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновой кислоты с образованием стабильного комплекса. Комплексы положительно заряженной нуклеиновой кислоты/липосомы связываются с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализуются в эндосому. Вследствие кислого pH в эндосоме липосомы разрушаются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клетки (Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985).
Липосомы, которые являются чувствительными к pH или отрицательно заряженными, лучше захватывают нуклеиновые кислоты, чем комплекс с ними. Вследствие того, что нуклеиновая кислота и липид обладают одинаковым зарядом, чаще происходит отталкивание, чем образование комплекса. Однако некоторое количество нуклеиновой кислоты захватывается в водное содержимое таких липосом. Чувствительные к pH липосомы использовали для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих ген тимидинкиназа в клеточные монослои в культуре. Экспрессию экзогенного гена детектировали в клетках-мишенях (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274).
Один из основных типов липосомальной композиции включает фосфолипиды, отличные от природного фосфатидилхолина. Нейтральные липосомальные композиции, например, можно получать из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомальные композиции, как правило, получают из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные способствующие слиянию липосомы получают преимущественно из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомальной композиции получают из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, соевый PC и яичный PC. Другой тип получают из смеси фосфолипида и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
Примеры других способов введения липосом в клетки in vitro и in vivo включают патент США № 5283185, патент США № 5171678, WO 94/00569, WO 93/24640, WO 91/16024, Felgner, (1994) J. Biol. Chem., 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther., 3:649; Gershon, (1993) Biochem., 32:7143 и Strauss, (1992) EMBO J., 11:417.
Также анализировали неионные липосомальные системы для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомальные составы, содержащие NovasomeTM I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и NovasomeTM II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина A в дерму кожи мышей. Результаты свидетельствовали о том, что такие неионные липосомальные системы являлись эффективными до облегчения депонирования циклоспорина A в различных слоях кожи (Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
Липосомы также включают "стерически стабилизованные" липосомы, термин, который, как используют в настоящем описании, относится к липосомам, содержащим один или более специализированных липидов, которые при введении в липосомы, приводят к повышению времени жизни в кровяном русле относительно липосом, не содержащих такие специализированные липиды. Примеры стерически стабилизованных липосом представляют собой такие, в которых часть образующей везикулы липидной фракции липосомы (A) содержит один или более гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, или (B) дериватизируют с один или более гидрофильных полимеров, таких как группа полиэтиленгликоль (PEG). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией в данной области, предполагают, что по меньшей мере для стерически стабилизованных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-дериватизированные липиды, повышенное время полужизни в кровяном русле этих стерически стабилизованных липосом возникает в результате сниженного поглощения в клетки ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765).
В данной области известны различные липосомы, содержащие один или более гликолипидов. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64) описали способность моносиалоганглиозида GM1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола улучшать время полужизни липосом в крови. Эти открытия интерпретировали Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949). В патенте США № 4837028 и WO 88/04924, оба на имя Allen et al., описаны липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложный эфир сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al.) описаны липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, описаны в WO 97/13499 (Lim et al.).
В одном из вариантов осуществления используют катионные липосомы. Катионные липосомы обладают преимуществом, являясь способными сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы, несмотря на то, что они неспособны сливаться так эффективно с плазматической мембраной, поглощаются макрофагами in vivo, и их можно использовать для доставки средств РНКи в макрофаги.
Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, получаемые из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биоразлагаемыми, в липосомы можно инкорпорировать широкий диапазон водорастворимых и липидорастворимых лекарственных средств, липосомы могут защищать инкапсулированные средства РНКи в своих внутренних компартментах от метаболизма и деградации (Rosoff, в "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Важные рассматриваемые факторы при получении составов липосом представляют собой поверхностный заряд липидов, размер везикул и водный объем липосом.
Положительно заряженный синтетический катионный липид, N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмонийхлорид (DOTMA) можно использовать для получения небольших липосом, которые спонтанно взаимодействуют с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липид-нуклеиновая кислота, которые способны к слиянию с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры тканей, приводя к доставке средства РНКи (для описания DOTMA и его использования с ДНК см., например, Felgner P.L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:7413-7417 и патент США № 4897355).
Аналог DOTMA 1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP) можно использовать в комбинации с фосфолипидом для получения образующих комплекс с ДНК везикул. ЛипофектинТМ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) представляет собой эффективное средство для доставки сильно анионных нуклеиновых кислот в живые клетки культуры тканей, которые содержат положительно заряженные липосомы DOTMA, которые спонтанно взаимодействуют с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Когда используют достаточно положительно заряженные липосомы, результирующий заряд на получаемых комплексах также является положительным. Положительно заряженные комплексы, получаемые таким образом, спонтанно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты, например, в клетки культуры тканей. Другой коммерчески доступный катионный липид 1,2-бис(олеилокси)-3,3-(триметиламмоний)пропан ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) отличается от DOTMA тем, что олеиловые группы связаны сложными эфирными связями, а не простыми эфирными связями.
Другие описанные соединения на основе катионных липидов включают такие, которые конъюгировали с различными группами, включая, например, карбоксиспермин, который конъюгировали с одним из двух типов липидов, и включают соединения, такие как 5-карбоксиспермилглициндиоктаолеиламид ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин 5-карбоксиспермиламид ("DPPES") (см., например, патент США № 5171678).
Другой конъюгат катионных липидов включает дериватизацию липида с холестерином ("DC-Chol"), который можно формулировать в липосомы в комбинации с DOPE (см., Gao X. and Huang L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun., 179:280). Опубликовано, что липополилизин, получаемый конъюгацией полилизина с DOPE, является эффективным для трансфекции в присутствии сыворотки (Zhou X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1065:8). Указано, что для определенных линий клеток эти липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, проявляют более низкую токсичность и обеспечивают более эффективную трансфекцию, чем содержащие DOTMA композиции. Другие коммерчески доступные продукты катионных липидов включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) и липофектамин (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и WO 96/37194.
Липосомальные составы являются особенно подходящими для местного введения, липосомы предоставляют несколько преимуществ перед другими составами. Такие преимущества включают сниженные побочные эффекты, связанные с высоким системным всасыванием вводимого лекарственного средства, повышенное накопление вводимого лекарственного средства в желаемой мишени и с возможность вводить средство РНКи в кожу. В некоторых реализациях липосомы используют для доставки средства РНКи в эпидермальные клетки, а также для повышения проникновения средства РНКи в дермальные ткани, например, в кожу. Например, липосомы можно наносить местно. Документально подтверждена местная доставка лекарственных средств, сформулированных в виде липосом, в кожу (см., например, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 и du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino R.J. and Fould-Fogerite S., (1998) Biotechniques, 6:682-690; Itani T. et al., (1987) Gene, 56:267-276; Nicolau C. et al., (1987) Meth. Enzymol., 149:157-176; Straubinger R.M. and Papahadjopoulos D., (1983) Meth. Enzymol., 101:512-527; Wang C.Y. and Huang L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7851-7855).
Неионные липосомальные системы также анализировали для определения их полезности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомальные составы, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) использовали для доставки лекарственного средства в дерму кожи мыши. Такие составы со средством РНКи являются пригодными для лечения дерматологического нарушения.
Липосомы, которые содержат иРНК, можно получать в высокой степени деформируемыми. Такая способность к деформации может обеспечивать проникновение липосом через пору, которая является меньше, чем средний радиус липосомы. Например, трансферсомы представляют собой тип деформируемых липосом. Трансферсомы можно получать, добавляя активаторы поверхности раздела фаз поверхность, как правило, поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомальной композиции. Трансферсомы, которые содержат средство РНКи, можно доставлять, например, подкожно посредством инфекции с целью доставки средства РНКи в кератиноциты в коже. Для прохождения через интактную кожу млекопитающих липидные везикулы должны проходить через серию мелких пор, каждой с диаметром менее 50 нм, под влиянием подходящего трансдермального градиента. Кроме того, вследствие липидных свойств, такие трансферсомы могут являться самооптимизирующимися (адаптированными к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися и могут многократно достигать свои мишени без фрагментации и часто являются самонагружаемыми.
Другие составы, пригодные для настоящего изобретения, описаны в предварительных заявках США с серийными №№ 61/018616, зарегистрированной 2 января 2008 года; 61/018611, зарегистрированной 2 января 2008 года; 61/039748, зарегистрированной 26 марта 2008 года; 61/047087, зарегистрированной 22 апреля 2008 года, и 61/051528, зарегистрированной 8 мая 2008 года. В заявке № PCT/US2007/080331, зарегистрированной 3 октября 2007 года, также описаны составы, которые являются пригодными для настоящего изобретения.
Трансферсомы представляют собой еще один другой тип липосом и являются высоко деформируемыми липидными агрегатами, которые являются привлекательными кандидатами для доставки носителей лекарственных средств. Трансферсомы можно описать как липидные капли, которые являются настолько высоко деформируемыми, что они могут легко проникать через поры, которые являются меньше чем капля. Трансферсомы адаптируются к среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (адаптированными к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися и могут многократно достигать свои мишени без фрагментации и часто являются самонагружаемыми. Для получения трансферсом необходимо добавлять активаторы раздела фаз поверхности, как правило, поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомальной композиции. Трансферсомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредованная трансферсомами доставка сывороточного альбумина является такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классификации и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетических, является использование гидрофильного/липофильного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как "голова") обеспечивает наиболее пригодные способы категоризации различных поверхностно-активных веществ, используемых в составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не является ионизированной, ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах и являются применимыми в широком диапазоне значений pH. Как правило, их значения HLB находятся в диапазоне от 2 приблизительно до 18 в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные эфиры глицерила, сложные эфиры полиглицерила, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Также к этому классу относятся неионные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блокполимеры. Поверхностно-активные вещества на основе полиоксиэтилена являются наиболее известными членами класса неионных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд, когда ее растворяют или диспергируют в воде, поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты и фосфаты. Наиболее важные члены класса анионных поверхностно-активных веществ представляют собой алкилсульфаты и мыла.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд, когда ее растворяют или диспергируют в воде, поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония представляют собой наиболее используемые члены этого класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести положительный или отрицательный заряд, поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфолипиды.
Описано применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
иРНК для применения в способах по изобретению также можно предоставлять в виде мицеллярных составов. "Мицеллы" определяют в настоящем описании как конкретный тип молекулярного агрегата, в котором амфипатические молекулы располагаются в виде сферической структуры, таким образом, что все гидрофобные участки молекул направлены внутрь, оставляя гидрофильный участки в контакте с окружающей водной фазой. Если окружающая среда является гидрофобной, существует обратное расположение.
Смешанные мицеллярные состав, подходящие для доставки через трансдермальные мембраны, можно получать смешиванием водного раствора композиции миРНК, C8-C22алкилсульфата щелочного металла и образующего мицеллы соединения. Иллюстративные образующие мицеллы соединения включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, экстракт ромашки, экстракт огурца, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло первоцвета вечернего, ментол, тригидроксиоксохоланилглицин и их фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, простые эфиры полиоксиэтилена и их аналоги, полидоканолалкиловые эфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Образующие мицеллы соединения можно добавлять одновременно или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы получают по существу при любом типе перемешивания ингредиентов, но при интенсивном перемешивании для обеспечения меньшего размера мицелл.
В одном из способов получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию миРНК и по меньшей мере алкилсульфат щелочного металла. Затем первую мицеллярную композицию смешивают по меньшей мере с тремя образующими мицеллы соединениями с получением смешанной мицелярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают смешиванием композиции миРНК, алкилсульфата щелочного металла и по меньшей мере одного из образующих мицеллы соединений с последующим добавлением оставшихся образующих мицеллы соединений при интенсивном перемешивании.
Для стабилизации состава и защиты от роста бактерий к смешанной мицеллярной композиции можно добавлять фенол и/или мета-крезол. Альтернативно, фенол и/или мета-крезол можно добавлять совместно с образующими мицеллы ингредиентами. Также можно добавлять средство придания изотоничности, такое как глицерин, после образования смешанной мицеллярной композиции.
Для доставки мицеллярного состава в виде спрея состав можно помещать в аэрозольный дозатор, и заполнять диспенсер пропеллентом. Пропеллент, который находится под давлением, содержатся в жидкой форме в дозаторе. Отношения ингредиентов регулируют таким образом, чтобы водная фаза и фаза пропеллента становились одной, т.е. существует одна фаза. Если существует две фазы, необходимо встряхивать дозатор перед дозированием части содержимого, например, через дозирующий клапан. Дозируемую дозу фармацевтического средства проталкивают через дозирующий клапан в виде тонкодисперсного спрея.
Пропелленты могут включать содержащие водород хлорфторуглероды, содержащие водород фторуглероды, простой диметиловый эфир и простой диэтиловый эфир. В определенных вариантах осуществления можно использовать HFA 134a (1,1,1,2-тетрафторэтан).
Конкретные концентрации основных ингредиентов можно определять относительно простым экспериментированием. Для всасывания через ротовую полость, часто желательно повышать, например, по меньшей мере вдвое или втрое, дозу для прямой инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.
B. Частицы нуклеиновая кислота-липид
иРНК, например, дцРНК по изобретению можно полностью инкапсулировать в липидный состав, например, для получения SPLP, pSPLP, SNALP или других частиц нуклеиновая кислота-липид. Как используют в настоящем описании, термин "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, включая SPLP. Как используют в настоящем описании, термин "SPLP" относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидную везикулу. SNALP и SPLP, как правило, содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предотвращает агрегацию частицы (например, конъюгата PEG-липид). SNALP и SPLP являются чрезвычайно пригодными для системных применений, т.к. они демонстрируют увеличенное время жизни в кровяном русле после внутривенной (в/в) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках физически отделенных от участка введения). SPLP включают "pSPLP", которые включают инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, как указано в публикации PCT № WO 00/03683. Частицы по настоящему изобретению, как правило, имеют средний диаметр приблизительно от 50 нм приблизительно до 150 нм, как правило, приблизительно от 60 нм приблизительно до 130 нм, как правило, приблизительно от 70 нм приблизительно до 110 нм, как правило, приблизительно от 70 нм приблизительно до 90 нм и являются по существу нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда содержатся в частицах нуклеиновая кислота-липид по настоящему изобретению, являются устойчивыми в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получение описаны, например, в патентах США №№ 5976567, 5981501, 6534484, 6586410, 6815432, публикации США № 2010/0324120 и публикации PCT № WO 96/40964.
В одном из вариантов осуществления отношение липида к лекарственному средству (отношение масс./масс.) (например, отношение липида к дцРНК) находится в диапазоне приблизительно от 1:1 приблизительно до 50:1, приблизительно от 1:1 приблизительно до 25:1, приблизительно от 3:1 приблизительно до 15:1, приблизительно от 4:1 приблизительно до 10:1, приблизительно от 5:1 приблизительно до 9:1 или приблизительно 6:1 приблизительно до 9:1. Предусматривают, что диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам, также являются частью изобретения.
Катионный липид может представлять собой, например, N,N-диолеил-N,N-диметиламмонийхлорид (DODAC), N,N-дистеарил-N,N-диметиламмонийбромид (DDAB), N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмонийхлорид (DOTAP), N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмонийхлорид (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилоксипропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси-3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлоридная соль 1,2-Дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлоридная соль 1,2-дилинолеил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или их аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может содержать приблизительно от 20% моль приблизительно до 50% моль или приблизительно 40% моль от общего липида, содержащегося в частице.
В другом варианте осуществления можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц липид-миРНК. Синтез 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной патентной заявке США номер 61/107998, зарегистрированной 23 октября 2008 года, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
В одном из вариантов осуществления частица липид-миРНК содержит 40% 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана:10% DSPC:40% холестерина:10% PEG-C-DOMG (молярный процент) с размером частицы 63,0±20 нм и отношением миРНК/липид 0,027.
Ионизуемый/некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, включая, но, не ограничиваясь ими, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-O-монометил-PE, 16-O-диметил-PE, 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеил-фосфатидиэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять приблизительно от 5% моль приблизительно до 90% моль, приблизительно 10% моль или приблизительно 58% моль, если содержится холестерин, от общего липида, содержащегося в частице.
Конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (PEG)-липид, включая без ограничения PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (Ci2), PEG-димиристилоксипропил (Ci4), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci6), или PEG-дистеарилоксипропил (Ci9). Конъюгированный липид, который предотвращает агрегацию частиц, может составлять от 0% моль приблизительно до 20% моль или приблизительно 2% моль от общего липида, содержащегося в частице.
В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид дополнительно содержит холестерин, например, приблизительно от 10% моль приблизительно до 60% моль или приблизительно 48% моль от общего липида, содержащегося в частице.
В одном из вариантов осуществления можно использовать липидоид ND98-4HC1 (ММ 1487) (см. патентную заявку США № 12/056230, зарегистрированную 26 марта 2008 года, включенную в настоящее описание посредством ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид C16 (Avanti Polar Lipids) для получения наночастиц липид-дцРНК (т.е. частиц LNP01). Исходные растворы каждого в этаноле можно получать, как указано ниже: ND98 133 мг/мл, холестерин 25 мг/мл, PEG-церамид C16 100 мг/мл. Затем исходные растворы ND98, холестерин и PEG-церамид C16 можно объединять, например, в молярном отношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водной дцРНК (например, в ацетате натрия pH 5) таким образом, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, и конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-дцРНК, как правило, образуются спонтанно при перемешивании. В зависимости от желаемого распределения размера частиц получаемую смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с границей пропускания 100 нм) с использованием, например, экструдера с термобарабаном, такого как экструдер Lipex (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно исключать. Удаление этанола и одновременную замену буфера можно сопровождать, например, диализом или фильтрованием тангенциальным потоком. Буфер можно заменять, например, на фосфатно-солевой буфер (PBS) при приблизительно pH 7, например, приблизительно pH 6,9, приблизительно pH 7,0, приблизительно pH 7,1, приблизительно pH 7,2, приблизительно pH 7,3 или приблизительно pH 7,4.
Figure 00000031
Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, таким образом, включенной посредством ссылки.
Дополнительные иллюстративные составы липид-дцРНК описаны в таблице ниже.
Ионизуемый/катионный липид Конъюгат катионный липид/некатионный липид/холестерин/PEG-липид отношение липид:миРНК
SNALP-1 1,2-диленолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/холестерин/PEG-cDMA
(57,1/7,1/34,4/1,4)
липид:миРНК ~ 7:1
2-XTC 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DPPC/холестерин/PEG-cDMA 57,1/7,1/34,4/1,4
липид:миРНК ~ 7:1
LNP05 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG
57,5/7,5/31,5/3,5
липид:миРНК ~ 6:1
LNP06 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG
57,5/7,5/31,5/3,5
липид:миРНК ~ 11:1
LNP07 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG
60/7,5/31/1,5,
липид:миРНК ~ 6:1
LNP08 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG
60/7,5/31/1,5,
липид:миРНК ~ 11:1
LNP09 2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/Холестерин/PEG-DMG
диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК 10:1
LNP10 (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN100) ALN100/DSPC/холестерин/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид:миРНК 10:1
LNP11 (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3) MC-3/DSPC/холестерин/PEG-
DMG
50/10/38,5/1,5
липид:миРНК 10:1
LNP12 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)-этил)(2-гидроксидодецил)амино)-этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)-дидодекан-2-ол (Tech G1) Tech G1/DSPC/холестерин/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид:миРНК 10:1
LNP13 XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 33:1
LNP14 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG
40/15/40/5
липид:миРНК: 11:1
LNP15 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-
DSG/GalNAc-PEG-DSG
50/10/35/4,5/0,5
липид:миРНК: 11:1
LNP16 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 7:1
LNP17 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 10:1
LNP18 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 12:1
LNP19 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG
50/10/35/5
липид:миРНК: 8:1
LNP20 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 10:1
LNP21 C12-200 C12-200/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 7:1
LNP22 XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5
липид:миРНК: 10:1
DSPC: дистеароилфосфатидилхолин
DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин
PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (C14-PEG или PEG-C14) (PEG со средней молекулярной массой 2000)
PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со средней молекулярной массой 2000)
PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристилоксипропиламин (PEG со средней молекулярной массой 2000)
SNALP (1,2-диленолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)), содержащий составы, описанные в международной публикации № WO2009/127060, зарегистрированной 15 апреля 2009 года, таким образом, включенной посредством ссылки.
XTC, содержащий составы, описанные, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, зарегистрированной 29 января 2009 года, предварительной заявке США с серийным № 61/156851, зарегистрированной 2 марта, 2009 года, предварительной заявке США с серийным №, зарегистрированной 10 июня 2009 года, предварительной заявке США с серийным № 61/228373, зарегистрированной 24 июля 2009 года, предварительной заявке США с серийным № 61/239686, зарегистрированной 3 сентября, 2009 года и международной заявке № PCT/US2010/022614, зарегистрированной 29 января 2010 года, которые, таким образом, включены посредством ссылки.
MC3, содержащий составы, описанные, например, в публикации США № 2010/0324120, зарегистрированной 10 июня 2010 года, полное содержание которое включено, таким образом, посредством ссылки.
ALNY-100, содержащий составы, описанные, например, в международной патентной заявке номер PCT/US09/63933, зарегистрированной 10 ноября 2009 года, таким образом, включенной посредством ссылки.
C12-200, содержащий составы, описанные в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, зарегистрированной 5 мая 2009 года и международной заявке № PCT/US10/33777, зарегистрированной 5 мая 2010 года, которые включены, таким образом, посредством ссылки.
Синтез ионизуемых/катионных липидов
Любое из соединений, например, катионные липиды и т.п., используемые в частицах нуклеиновая кислота-липид по изобретению, можно получать известными способами органического синтеза, включая способы, более подробно описанные в примерах. Все заместители представляют собой такие, как определено ниже, если не указано иное.
"Алкил" означает неразветвленную цепь или разветвленную, нециклическую или циклическую, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Репрезентативные насыщенные алкилы с неразветвленной цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п., при этом насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Репрезентативные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п., при этом ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т.п.
"Алкенил" означает алкил, как определено выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают цис- и транс-изомеры. Репрезентативные алкенилы с неразветвленной и разветвленной цепью включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и т.п.
"Алкинил" означает любой алкил или алкенил, как определено выше, который дополнительно содержит по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Репрезентативные алкинилы с неразветвленной и разветвленной цепью включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1 бутинил и т.п.
"Ацил" означает любой алкил, алкенил или алкинил, где углерод в точке присоединения замещают на оксогруппу, как определено ниже. Например, -C(=O)алкил, -C(=O)алкенил и -C(=O)алкинил представляют собой ацильные группы.
"Гетероцикл" означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, которое является насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, и которое содержит от 1 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы могут быть необязательно окисленными, и гетероатом азота может быть необязательно кватернизированным, включая бициклические кольца, в которых любой из указанных выше гетероциклов является слитым с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, как определено ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.
Термины "необязательно замещенный алкил", "необязательно замещенный алкенил", "необязательно замещенный алкинил", "необязательно замещенный ацил" и "необязательно замещенный гетероцикл" означают, что при замещении по меньшей мере один атом водорода замещают заместителем. В случае оксо-заместителя (=O) замещают два атома водорода. В связи с этим заместители включают оксо, галоген, гетероцикл, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy, где n равно 0, 1 или 2, Rx и Ry являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой водород, алкил или гетероцикл, и каждый из указанного алкильных и гетероциклических заместителей можно дополнительно замещать одним или более из оксо, галогена, -OH, -CN, алкила, -ORx, гетероцикла, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy.
"Галоген" означает фтор, хлор, бром и йод.
В некоторых вариантах осуществления в способах по изобретению может являться необходимым использование защитных групп. Способ защитных групп хорошо известен специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). В кратком изложении, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональной группы. Защитную группу можно добавлять к функциональной группе для маскировки ее реакционной способности во время определенных реакций, а затем удалять, открывая исходную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления используют "спиртовую защитную группу". "Спиртовая защитная группа" представляет собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную реакционную способность спиртовой функциональной группы. Защитные группы можно добавлять и удалять хорошо известными в данной области способами.
Синтез формулы A
В некоторых вариантах осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид по изобретению формулируют с использованием катионного липида формулы A:
Figure 00000032
где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, каждый может являться необязательно замещенным, и R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил, или R3 и R4 можно принимать в совокупности с образованием необязательно замещенного гетероциклического кольца. В некоторых вариантах осуществления катионный липид представляет собой XTC (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан). Как правило, липид формулы A выше можно получать по следующим ниже схемам реакций 1 или 2, где все заместители представляют собой такие, как определено выше, если не указано иное.
Схема 1
Figure 00000033
Липид A, где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, каждый может являться необязательно замещенным, и R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил, или R3 и R4 можно принимать в совокупности с образованием необязательно замещенного гетероциклического кольца, можно получать в соответствии со схемой 1. Кетон 1 и бромид 2 можно приобретать или получать способами, известными специалистам в данной области. В реакции 1 и 2 получают кеталь 3. Обработкой кеталя 3 амином 4 получают липиды формулы A. Липиды формулы A можно преобразовывать до соответствующей аммонийной соли органической солью формулы 5, где X представляет собой анионный противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или т.п.
Схема 2
Figure 00000034
Альтернативно, исходное вещество кетон 1 можно получать в соответствии со схемой 2. Реагент Гриньяра 6 и цианид 7 можно приобретать или получать способами, известными специалистам в данной области. В реакции 6 и 7 получают кетон 1. Преобразование кетона 1 до соответствующих липидов формулы A является таким, как описано в схеме 1.
Синтез MC3
Получение DLin-M-C3-DMA (т.е. (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) являлось таким, как указано ниже. Раствор (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ол (0,53 г), 4-N,N-диметиламиномасляной кислоты гидрохлорида (0,51 г), 4-N,N-диметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной соляной кислотой с последующим разбавлением водным бикарбонатом натрия. Органические фракции сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и удаляли растворитель в роторном вакуумном испарителе. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г) с использованием градиента элюирования 1-5% метанола/дихлорметана. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и удаляли растворитель, получая бесцветное масло (0,54 г).
Синтез ALNY-100
Синтез кеталя 519 [ALNY-100] проводили с использованием следующей ниже схемы
Figure 00000035
Синтез 515
К перемешиваемой суспензии LiAlH4 (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводном THF в двухгорловой RBF (1 л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл THF при 0ºC в атмосфере азота. После добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, а затем нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 4 часов. За ходом реакции наблюдали посредством TLC. После завершения реакции (TLC) смесь охлаждали до 0ºC и гасили, аккуратно добавляя насыщенный раствор Na2SO4. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре и фильтровали. Остаток хорошо промывали THF. Фильтрат и промытые фракции смешивали и разбавляли 400 мл диоксана и 26 мл концентрированной HCl, и перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Летучие вещества перемешивали в вакууме, получая гидрохлориднную соль 515 в виде белого твердого вещества. Выход продукта: 7,12 г 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ=9,34 (широкий, 2H), 5,68 (с, 2H), 3,74 (м, 1H), 2,66-2,60 (м, 2H), 2,50-2,45 (м, 5H).
Синтез 516
К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл сухой DCM в 250 мл двухгорловой RBF добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0ºC в атмосфере азота. После медленного добавления N-(бензилокси-карбонилокси)-сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл сухой DCM реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 часа TLC) смесь последовательно промывали 1н. раствором HCl (1×100 мл) и насыщенным раствором NaHCO3 (1×50 мл). Затем сушили органический слой над ангидридом Na2SO4 и выпаривали растворитель с получением неочищенного вещества, которое очищали колоночной хроматографией с силикагелем с получением 516 в виде вязкой массы. Выход: 11 г (89%). 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ = 7,36-7,27 (м, 5H), 5,69 (с, 2H), 5,12 (с, 2H), 4,96 (широкий, 1H) 2,74 (с, 3H), 2,60 (м, 2H), 2,30-2,25 (м, 2H). LC-MS [M+H] -232,3 (96,94%).
Синтез 517A и 517B
Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорловой 500 мл RBF и добавляли к нему N-метилморфолин-N-оксид (7,6 г, 0,06492 моль) с последующим добавлением 4,2 мл 7,6% раствора OsO4 (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~3 часа), смесь гасили добавлением твердого Na2SO3 и перемешивали получаемую смесь в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли DCM (300 мл) и промывали водой (2×100 мл) с последующим промыванием насыщенным раствором NaHCO3 (1×50 мл), водой (1×30 мл) и в заключении насыщенным солевым раствором (1×50 мл). Органическую фаза сушили над ангидридом Na2SO4 и удаляли растворитель в вакууме. Очисткой неочищенного вещества колоночной хроматографией на силикагеле получали смесь диастереомеров, которую разделяли препаративной ВЭЖХ. Выход продукта: - 6 г неочищенного 517A - пик-1 (белое твердое вещество), 5,13 г (96%). 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ=7,39-7,31 (м, 5H), 5,04 (с, 2H), 4,78-4,73 (м, 1H), 4,48-4,47 (д, 2H), 3,94-3,93 (м, 2H), 2,71 (с, 3H), 1,72-1,67 (м, 4H). LC-MS - присутствуют [M+H]-266,3, [M+NH4+]-283,5, ВЭЖХ-97,86%. Стереохимия подтверждена рентгенограммой.
Синтез 518
Способом, аналогичным способу, описанному для синтеза соединения 505 получали соединение 518 (1,2 г, 41%) в виде бесцветного масла. 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ= 7,35-7,33 (м, 4H), 7,30-7,27 (м, 1H), 5,37-5,27 (м, 8H), 5,12 (с, 2H), 4,75 (м,1H), 4,58-4,57 (м,2H), 2,78-2,74 (м,7H), 2,06-2,00(м,8H), 1,96-1,91(м, 2H), 1,62(м, 4H), 1,48 (м, 2H), 1,37-1,25 (широкий м, 36H), 0,87 (м, 6H). HPLC-98,65%.
Общий способ синтеза соединения 519
Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) капельно добавляли к ледяному раствору LAH в THF (1M, 2 экв.). После добавления смесь нагревали при 40ºC в течение 0,5 часов, затем снова охлаждали на водяной бане. Смесь тщательно подвергали гидролизу насыщенным водным Na2SO4, затем фильтровали через целит и восстанавливали до масла. Колоночной хроматографией получали чистый 519 (1,3 г, 68%), который получали в виде бесцветного масла. 13C-ЯМР δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; MS с электрораспылением (+ve): Молекулярную массу C44H80NO2 (M+H)+ вычисляемую как 654,6, выявляли как 654,6.
Составы, получаемые стандартным способом или способом без экструзии, можно охарактеризовать аналогичным образом. Например, составы, как правило, характеризовали визуальным наблюдением. Они должны представлять собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение размера частиц липида-наночастиц можно измерять светорассеянием с использованием, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Размер частицы должен составлять приблизительно 20-300 нм, такой как 40-100 нм. Распределение размера частиц должно быть однородным. Концентрацию общей дцРНК в составе, а также захваченной фракции оценивали анализом исключения красителя. Образец формулированной дцРНК можно инкубировать со связывающимся с РНК красителем, таким как Ribogreen (Molecular Probes) в присутствии или отсутствие состава, разрушающего поверхностно-активное вещество, например, 0,5% Triton-X100. Общую дцРНК в составе можно определять по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, относительно стандартной кривой. Захваченную фракцию определяют, вычитая содержание "свободной" дцРНК (как измерено по сигналу при отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания дцРНК. Процент захваченной дцРНК, как правило, составляет >85%. Для состава SNALP размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон, как правило, составляет приблизительно от по меньшей мере 50 нм приблизительно до по меньшей мере 110 нм, приблизительно от по меньшей мере 60 нм приблизительно до по меньшей мере 100 нм или приблизительно от по меньшей мере 80 нм приблизительно до по меньшей мере 90 нм.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Желательными могут являться загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связывающие средства. В некоторых вариантах осуществления пероральные составы представляют собой такие, в которых дцРНК по изобретению вводят в сочетании с одним или более усилителей впитывания поверхностно-активных веществ и хелаторов. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). В некоторых вариантах осуществления используют комбинации усилителей впитывания, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. Одна из иллюстративных комбинаций представляет собой натриевую соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные усилители впитывания включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-сэтиловый эфир. дцРНК по изобретению можно доставлять перорально, в гранулярной форме, включая распыляемые сухие частицы, или в виде комплексов с образованием микро- или наночастиц. Средства, образующие комплексы с дцРНК, включают полиаминокислоты, полиимины, полиакрилаты, полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты, желатины в катионной форме, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы, полиалкилцианоакрилаты, DEAE-дериватизированные полиимины, поллюланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразователи включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен P(TDAE), полиаминостирол (например, п-амино-), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), сополимер поли(DL-молочной-гликолевой кислоты) (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для дцРНК и их получение подробно описано в патенте США 6887906, публикации США № 20030027780 и в патенте США № 6747014, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозногой (в головной мозг), интратекального, внутрижелудочкового или внутрипеченочного введения могут содержать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но, не ограничиваясь ими, усилители впитывания, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции можно получать из различных компонентов, которые включают, но не ограничиваются ими, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Особенно предпочтительными являются составы, которые направлены на печень при лечении заболеваний печени, таких как печеночная карцинома.
Фармацевтические составы по настоящему изобретению, которые можно подходящим способом предоставлять в стандартной лекарственной форме, можно получать общепринятыми способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают стадию приведения во взаимодействие активных ингредиентов с фармацевтическим носителем(ями) или эксципиентом(ами). Как правило, составы получают посредством однородного и равномерного приведения во взаимодействия активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или обеими формами, а затем при необходимости придавая форму продукту.
Композиции по настоящему изобретению можно формулировать в любой из многих возможных лекарственных форм, таких как, но, не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизма. Композиции по настоящему изобретению также можно формулировать в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
C. Дополнительные составы
i. Эмульсии
Композиции по настоящему изобретению можно получать и формулировать в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой в форме капель, как правило, превышающих 0,1 мкм в диаметре (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешивающиеся жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспергированные друг в друге. Как правило, эмульсии могут представлять собой вариант типа вода-в-масле (в/м) или масло-в-воде (м/в). Когда водную фаза тщательно измельчают и диспергируют в виде мелких капель в объеме масляной фазы, получаемую композицию называют эмульсия вода-в-масле (в/м). Альтернативно, когда масляную фазу тщательно измельчают и диспергируют в виде мелких капель в объеме водной фазы, получаемую композицию называют эмульсия масло-в-воде (м/в). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты в дополнение к диспергируемым фазам и активное лекарственное средство, которое может содержаться в виде раствора в водной фазе, масляной фазе или само по себе в виде отдельно фазы. Фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты также могут содержаться в эмульсиях по мере необходимости. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более двух фаз, такие как, например, в случае эмульсий типа масло-в-воде-в-масле (м/в/м) и вода-в-масле-в-воде (в/м/в). Такие сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двойные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых индивидуальные капли масла эмульсии м/в содержат маленькие капли воды, представляют собой эмульсию в/м/в. Аналогично, система капель масла, заключенных в глобулах воды, стабилизированных в масляной непрерывной фазе, представляет собой эмульсию м/в/м.
Эмульсии характеризуются небольшой термодинамической стабильностью или ее отсутствием. Часто диспергируемую или прерывистую фазу эмульсии хорошо диспергируют во внешней или непрерывной фазе и поддерживают в такой форме посредством эмульгаторов или вязкости состава. Любая из фаз эмульсии может представлять собой полутвердое или твердое вещество, как в случае основ эмульсионного типа для мазей и кремов. Другие средства стабилизации эмульсий включают использование эмульгаторов, которые можно вводить в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы можно широко классифицировать на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, природные эмульгаторы, абсорбирующие основы и тонко диспергированные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как поверхностно-активные средства, нашли широкое применение для получения эмульсий, и они описаны в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199). Поверхностно-активные вещества, как правило, являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильного к гидрофобного компоненту поверхностно-активного вещества называют гидрофильным/липофильным балансом (HLB), и он представляет собой важное средство для категоризации и выбора поверхностно-активных веществ для получения составов. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать на различные классы в зависимости от природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
Природные эмульгаторы, используемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфолипиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбирующие основы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий в/м, при этом сохраняя свою полутвердую консистенцию. Тонко размельченные твердые вещества также использовали в качестве хороших эмульгаторов, в частности, в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердыне вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерилтристеарат.
Целый ряд неэмульгирующих веществ также могут содержаться в составах эмульсий и вносят определенный вклад в свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают природные камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии, образуя сильные межповерхностные пленки вокруг фазы диспергированных капель и повышая вязкость внешней фазы.
Вследствие того, что эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфолипиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, в эти составы часто вводят консерванты. Широко используемые консерванты, вводимые в составы эмульсии, включают метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного аммония, хлорид бензалкония, сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. В составы эмульсий также общепринято добавляют антиоксиданты для предотвращения ухудшения состава. Используемые антиоксиданты могут представлять собой ловушки свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергисты антиоксидантов, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение составов эмульсий через кожный, пероральный и парентеральный пути и способы их получения описаны в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Составы эмульсий для пероральной доставки широко использовали вследствие простоты их получения, а также эффективности с точки зрения всысывания и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Слабительные средства на основе минерального масла, маслорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира входят в число веществ, которые общепринято вводят перорально в виде эмульсий м/в.
ii. Микроэмульсии
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции иРНК и нуклеиновых кислоты формулируют в виде микроэмульсий. Микроэмульсию можно определить как систему воды, масла и амфифильного вещества, которая представляет собой один оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Как правило, микроэмульсии представляют собой системы, которые получают сначала диспергированием масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавлением достаточного количества четвертого компонента, в основном спирта с цепью промежуточной длины, с образованием прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также описаны как термодинамически стабильные, изотропно прозрачные дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, которые стабилизированы посредством межповерхностных пленок поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии общепринято получают комбинацией от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вспомогательное поверхностно-активное вещество и электролит. Независимо от типа вода-в-масле (в/м) или масло-в-воде (м/в) микроэмульсия зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных голов и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
Широкое изучение феноменологического подхода с использованием фазовых диаграмм привело к глубоким познаниям специалиста в данной области, как формулировать микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению с общепринятыми эмульсиями микроэмульсии обеспечивают преимущество солюбилизации нерастворимых в воде лекарственных средств в составе термодинамически стабильных капель, которые образуются спонтанно.
Поверхностно-активные вещества, используемые для получения микроэмульсий включают, но не ограничиваются ими, ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры полиглицерина и жирных кислот, тетраглицеринмонолаурат (ML310), тетраглицеринмоноолеат (MO310), гексаглицеринмоноолеат (PO310), гексаглицеринпентаолеат (PO500), декаглицеринмонокапрат (MCA750), декаглицеринмоноолеат (MO750), декаглицеринсеквиолеат (SO750), декаглицериндекаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации с вспомогательными поверхностно-активными веществами. Вспомогательное поверхностно-активное вещество, как правило, короткоцепочечный спирт, такой как этанол, 1-пропанол, и 1-бутанол, служит для повышения межповерхностной текучести посредством проникновения в пленку поверхностно-активного вещества и таким образом создания разупорядоченной пленки вследствие свободного пространства, образуемого между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии можно получать без использования вспомогательных поверхностно-активных веществ, и в данной области известны не содержащие спирт самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий. Водная фаза, как правило, может представлять собой, но не ограничена ими, воду, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может содержать, но не ограничена ими, вещества, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (C8-C12) моно-, ди- и трилицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры глицерина и жирных кислот, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные C8-C10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации лекарственного средства и повышенного всасывания лекарственных средств. Для повышения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды, были предложены микроэмульсии на основе липидов (м/в и в/м) (см., например, патенты США №№ 6191105, 7063860, 7070802, 7157099, Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества улучшенной солюбилизации лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного усиления всасывания лекарственного средства вследствие индуцируемых поверхностно-активным веществом изменений текучести и проницаемости мембраны, простоты получения, простоты перорального введения по сравнению с твердыми лекарственными формами, улучшенной клинической активности и сниженной токсичности (см., например, патенты США №№ 6191105, 7063860, 7070802, 7157099, Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно, когда их компоненты приводят в контакт при температуре окружающей среды. Они могут быть особенно эффективными при формулировании термолабильных лекарственных средства, пептидов или иРНК. Микроэмульсии также являются эффективными для трансдермальной доставки активных компонентов, как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Ожидают, что композиции и составы микроэмульсий по настоящему изобретению будут способствовать повышенному системному всасыванию иРНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать местное клеточное поглощение иРНК и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), лабразол и усилители впитывания, для улучшения свойств состава и усиления всасывания иРНК и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Усилители впитывания, используемые в микроэмульсиях по настоящему изобретению, можно классифицировать, как принадлежащие к одной из пяти крупных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и не относящиеся к хелатирующим поверхностно-активным веществам средства (Lee et al., критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов обсуждали выше.
iii. Микрочастицы
Средство РНКи по изобретению можно вводить в частицу, например, микрочастицу. Микрочастицы можно получать сушкой распылением, а также можно получать другими способами, включая лиофилизацию, выпаривание, сушку в псевдоожиженном слое, вакуумную сушку или комбинацией этих способов.
iv. Усилители проникновения
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении применяют различные усилители проникновения для обеспечения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности, иРНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств содержится в растворе в ионизованной и неионизированной формах. Однако, как правило, только липидорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было открыто, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрану, через которую необходимо пройти, обрабатывают усилителем проникновения. В дополнение к облегчению диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны усилители проникновения также повышают проходимость липофильных лекарственных средств.
Усилители проникновения можно классифицировать, как принадлежащие к одной из пяти крупных категорий, т.е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и не относящиеся к хелатирующим поверхностно-активным веществам средства (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из указанных выше классов усилителей проникновения более подробно описан ниже.
Поверхностно-активные вещества (или "поверхностно-активные средства") представляют собой химические соединения, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или междуфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, что приводит к тому, что всасывание иРНК через слизистую оболочку повышается. В дополнение к солям желчных кислот и жирным кислотам эти усилители проникновения включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир) (см., например, Malmsten M., Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфторхимические эмульсии, такие как FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усилители проникновения, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, C1-20алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (см., например, Touitou E. et al., Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; E1 Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Физиологическая роль желчи включает облегчение диспергирования и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten M., Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как усилители проникновения. Таким образом, термин "соли желчных кислот" включает любые природные компоненты желчи, а также любые их синтетические производные. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (POE) (см., например, Malmsten M., Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp.Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства, как используют в контексте настоящего изобретения, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металлов из раствора, образуя с ними комплексы, что приводит к тому, что всасывание иРНК через слизистую оболочку повышается. Относительно их использования в качестве усилителей проникновения в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительными преимуществами, которые заключаются в том, что они служат в качестве ингибиторов ДНКазы, т.к. для большинства охарактеризованных ДНК-нуклеаз необходим двухвалентный ион металла для катилиза и, таким образом, они могут ингибироваться хелатирующими средствами (Jarrett J., Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают, но не ограничиваются ими, этилендиаминтетраацетат динатрия (ЭДТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), N-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацильные производные бета-дикетонов (енаминов) (см., например, Katdare A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Как используют в настоящем описании, повышающие проникновение соединения, которые не относятся ни к хелатирующим, ни к поверхностно-активным веществам, можно определить как соединения, которые демонстрируют незначительную активность в качестве хелатирующих средств или в качестве поверхностно-активных веществ, но которые, тем не менее, повышают всасывание иРНК через слизистую оболочку пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс усилителей проникновения включает, например, ненасыщенные циклические мочевины, 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканоновые производные (Lee et al., критический обзор в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Средства, которые усиливают поглощение иРНК на клеточном уровне, также можно отнести к фармацевтическим и другим композициям по настоящему изобретению. Например, также известно, что катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al., патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка PCT WO 97/30731) усиливают клеточное поглощение дцРНК. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции наряду с другими включают, например, Липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Липофектамин 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Целлфектин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Липофектамин™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Олигофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Оптифект™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), липосомальный реагент для трансфекции DOTAP (Grenzacherstrasse, Switzerland), липосомальный реагент для трансфекции DOSPER (Grenzacherstrasse, Switzerland) или Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент Трансфектам® (Promega; Madison, WI), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, USA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), или HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA).
Для усиления проникновения вводимых нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, включая гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
v. Носители
Определенные композиции по настоящему изобретению также содержат в своем составе соединения-носители. Как используют в настоящем описании, "соединение-носитель" или "носитель" может относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, который является инертным (т.е. не обладает биологической активностью сам по себе), но распознается как нуклеиновая кислота процессами in vivo, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, например, путем деградации биологически активной нуклеиновой кислоты или ускорением ее удаления из кровяного русла. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, как правило, в избытке последнего вещества, может приводить к существенному снижению количества нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой в печени, почках или других резервуарах вне кровотока, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, выход частично тиофосфатной дцРНК в ткани печени может быть снижен, когда ее совместно вводят с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостилбен-2,2-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
vi. Эксципиенты
В отличие от соединения-носителя "фармацевтический носитель" или "эксципиент" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или более нуклеиновых кислоты у животного. Эксципиент может являться жидким или твердым и выбран с учетом предполагаемого способа введения таким образом, чтобы обеспечивать желаемый объем, консистенцию и т.д. при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Характерные фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, связывающие средства (например, прежелатинизированный кукуруза крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.), наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.), смазочные средства (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.), дезинтегранты (например, крахмал, крахмалгликолят натрия и т.д.) и средства для смачивания (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не взаимодействуют вредным образом с нуклеиновыми кислотами, также можно использовать для формулирования композиций по настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Составы для местного введения нуклеиновых кислот могут содержать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в общепринятых растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основ. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно использовать фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не взаимодействуют вредным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
vii. Другие компоненты
Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, общепринято используемые в фармацевтических композициях на их уровнях применения, установленных в данной области. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически-активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестезирующие средства или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные вещества, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, антиоксиданты, замутняющие средства, загустители и стабилизаторы, пригодные для физического формулирования различных лекарственных форм композиций по настоящему изобретению. Однако такие вещества при добавлении не должны оказывать неблагоприятное действие на виды биологической активности компонентов композиций по настоящему изобретению. Составы можно стерилизовать и при желании смешивать с вспомогательными средствами, например, смазочными средствами, консервантами, стабилизаторами, средствами для смачивания, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красителями, вкусовыми ароматизирующими веществами и/или ароматическими веществами и т.п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой кислотой(ами) состава.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по изобретению содержат (a) одно или более соединений иРНК и (b) одно или более средств, которые функционируют по механизму, отличному от РНКи, и которые являются пригодными для лечения нарушения метаболизма липидов. Примеры таких средств включают, но не ограничиваются ими, противовоспалительное средство, средство против ожирения, противовирусное и/или противофиброзное средство. Кроме того, в сочетании с иРНК, как описано в настоящем описании, также можно использовать другие вещества, широко используемые для защиты печени, такие как силимарин. Другие средства, пригодные для лечения заболеваний печени включают телбивудин, энтекавир и ингибиторы протеаз, такие как телапревир и другие, описанные, например, у Tung et al., публикации заявки США №№ 2005/0148548, 2004/167116 и 2003/0144217 и Hale et al., публикация заявки США № 2004/0127488.
Токсичность и терапевтическую эффективность каждых соединений можно определять стандартными фармацевтическими способами на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (летальной дозы для 50% популяции) и ED50 (терапевтически эффективной дозы у 50% популяции). Отношение доз токсических эффектов к терапевтическим эффектам представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать в виде отношения LD50/ED50. Предпочтительными являются соединения, которые обладают высокими терапевтическими индексами.
Данные, получаемые из анализов на культуре клеток и исследований на животных, можно использовать для определения диапазона доз для применения у людей. Дозирование композиций по изобретению, описываемых в настоящем описании, как правило, находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED50, с небольшой токсичностью или ее отсутствием. Дозирование может изменяться в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способах по изобретению, терапевтически эффективную дозу можно изначально устанавливать на основании анализов на культуре клеток. Дозу можно устанавливать на моделях на животных, получая диапазон циркулирующих концентраций в плазме соединения или при необходимости полипептидного продукта последовательности-мишени (например, получая сниженные концентрации полипептида), которая включает IC50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, при которой получают полумаксимальное ингибирование симптомов), как определено на культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз для людей. Уровни в плазме можно измерять, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией.
В дополнение к их введению, как указано выше, иРНК по изобретению можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными для лечения патологических процессов, опосредованных экспрессией ANGPTL3. В любом случае лечащий врач может регулировать количество и время введения иРНК на основании результатов, наблюдаемых с использованием стандартных величин эффективности, известных в данной области или описываемых в настоящем описании.
VI. Способы по изобретению
Настоящее изобретение также относится к способам применения иРНК по изобретению и/или композиции, содержащей иРНК по изобретению, для снижения и/или ингибирования экспрессии ANGPTL3 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт с дцРНК по изобретению и подержание клетки в течение периода времени, достаточного для получения деградации транскрипта мРНК гена ANGPTL3, таким образом, ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 в клетке. Снижение экспрессии гена можно оценивать любыми известными в данной области способами. Например, снижение экспрессии ANGPTL3 можно определять, определяя уровень экспрессии мРНК ANGPTL3 способами, известными специалисту в данной области, например, "нозерн"-блоттингом, количественной ПЦР в реальном времени, определяя уровень белка ANGPTL3 способами, известными специалисту в данной области, такими как вестерн-блоттинг, иммунологические способы. Снижение экспрессии ANGPTL3 также можно оценивать опосредованно, измеряя снижение биологической активности ANGPTL3, например, снижение уровня липидов, триглицеридов, холестерина и/или свободных жирных кислот в сыворотке.
В способах по изобретению клетку можно приводить в контакт in vitro или in vivo, т.е. клетка может находиться у индивидуума.
Клетка, подходящая для лечения способами по изобретению, может представлять собой любую клетку, которая экспрессирует ген ANGPTL3. Клетка, пригодная для использования в способах по изобретению, может представлять собой клетку млекопитающего, например, клетку приматов (такие как клетка человека или клетка не являющего человеком примата, например, клетка обезьяны или клетка шимпанзе), клетку неприматов (такие как клетка коровы, клетка свиньи, клетка верблюда, клетка ламы, клетка лошади, клетка козы, клетка кролика, клетка овцы, клетка хомяка, клетка морской свинки, клетка кошки, клетка собаки, клетка крысы, клетка мыши, клетка льва, клетка тигра, клетка медведя или клетка буйвола), клетку птицы (например, клетку утки или клетку гуся) или клетку кита. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку человека, например, клетку печени человека.
Экспрессию ANGPTL3 в клетке ингибируют по меньшей мере приблизительно на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно на 100%.
Способы in vivo по изобретению могут включать введение индивидууму композиции, содержащей иРНК, где иРНК включают нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части транскрипта РНК гена ANGPTL3 млекопитающего, подлежащего лечению. Когда организм, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающее, такое как человек, композицию можно вводить любым известным в данной области способом, включая, но, не ограничиваясь ими, пероральный, интраперитонеальный или парентеральный путь, включая интракраниальное (например, внутрижелудочковое, интрапаренхиматозное и интратекальное), внутривенное, внутримышечное, подкожное, трансдермальное, через дыхательные пути (аэрозоль), назальное, ректальное и местное (включая буккальное и сублингвальное) введение. В определенных вариантах осуществления композиции вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции. В определенных вариантах осуществления композиции вводят посредством подкожной инъекции.
В некоторых вариантах осуществления введение проводят посредством инъекция с замедленным всасыванием. Инъекция с замедленным всасыванием может выделять иРНК последовательным образом в течение длительного периода времени. Таким образом, инъекция с замедленным всасыванием может снижать частоту дозирования, необходимую для получения желаемого действия, например, желаемого ингибирования ANGPTL3, или терапевтического или профилактического эффекта. Инъекция с замедленным всасыванием может также обеспечивать более однородные концентрации в сыворотке. Инъекции с замедленным всасыванием могут включать подкожные инъекции или внутримышечные инъекции. В предпочтительных вариантах осуществления инъекция с замедленным всасыванием представляет собой подкожную инъекцию.
В некоторых вариантах осуществления введение проводят посредством насоса. Насос может представлять собой внешний насос или хирургически имплантированный насос. В определенных вариантах осуществления насос представляет собой подкожно имплантированный осмотический насос. В других вариантах осуществления насос представляет собой инфузионные насос. Инфузионные насос можно использовать для внутривенной, подкожной, артериальной или эпидуральной инфузий. В предпочтительных вариантах осуществления инфузионный насос представляет собой подкожный инфузионный насос. В других вариантах осуществления насос представляет собой хирургически имплантированный насос, который доставляет иРНК в печень.
Способ введения можно выбирать в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и в зависимости от области, подлежащей лечению. Способ и участок введения можно выбирать для повышения направленной доставки.
В одном из аспектов настоящее изобретение также относится к способам ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 у млекопитающего. Способы включают введение млекопитающему композиции, содержащей дцРНК, которая направлена на ген ANGPTL3 в клетке млекопитающего, и поддержание млекопитающего в течение периода времени, достаточного для получения деградации транскрипта мРНК гена ANGPTL3, таким образом, ингибируя экспрессию гена ANGPTL3 в клетке. Снижение экспрессии гена можно оценивать любыми способами, известными в данной области, и способами, например, количественной ПЦР в реальном времени, описываемой в настоящем описании. Снижение продукции белка можно оценивать любыми способами, известными в данной области, и способами, например, ELISA, описываемым в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления образец пункционной биопсии печени служит в качестве вещества ткани для наблюдения снижения экспрессии гена и/или белка ANGPTL3.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения нуждающегося в этом индивидуума. Способы лечения по изобретению включают введение иРНК по изобретению индивидууму, например, индивидууму, который получит благоприятное действие от снижения и/или ингибирования экспрессии ANGPTL3, в терапевтически эффективном количестве иРНК, направленной на ген ANGPTL3, или фармацевтической композиции, содержащей иРНК, направленную на ген ANGPTL3.
иРНК по изобретению можно вводить в виде "свободной иРНК". Свободную иРНК вводят при отсутствии фармацевтической композиции. Голая иРНК может находиться в подходящем буферном растворе. Буферный раствор может содержать ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат, или любое их сочетание. В одном из вариантов осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буфер (PBS). pH и осмолярность буферного раствора, содержащего иРНК можно регулировать так, чтобы он являлся подходящим для введения индивидууму.
Альтернативно, иРНК по изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, такой как липосомальный состав дцРНК.
Индивидуумы, которые получат благоприятное действие от снижения и/или ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, представляют собой индивидуумов с нарушением метаболизма липидов, например, наследственным нарушением метаболизма липидов или приобретенным нарушением метаболизма липидов. В одном из вариантов осуществления индивидуум с нарушением метаболизма липидов страдает гиперлипидемией. В другом варианте осуществления индивидуум с нарушением метаболизма липидов страдает гипертриглицеридемией. Лечение индивидуума, который получит благоприятное действие от снижения и/или ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, включает терапевтическое лечение (например, индивидуум страдает эруптивными ксантомами) и профилактическое лечение (например, индивидуум не страдает эруптивными ксантомами или индивидуум может подвергаться риску развития эруптивных ксантом).
Изобретение дополнительно относится к способам применения иРНК или ее фармацевтической композиции, например, для лечения индивидуума, который получит благоприятное действие от снижения и/или ингибирования экспрессии ANGPTL3, например, индивидуума с нарушением метаболизма липидов, в комбинации с другими фармацевтическими средствами и/или другими терапевтическими способами, например, с известными фармацевтическими средствами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, способами, которые применяют в настоящее время для лечения этих нарушений. Например, в определенных вариантах осуществления иРНК, направленную на ANGPTL3, вводят в комбинации, например, со средством пригодным для лечения нарушения метаболизма липидов, как описано где-либо в настоящем описании. Например, дополнительные средства, подходящие для лечения индивидуума, который получит благоприятное действие от снижения экспрессии ANGPTL3, например, индивидуума с нарушением метаболизма липидов, могут включать средства, которые снижают один или более липидов сыворотки. Неограничивающие примеры таких средств могут включать ингибиторы синтеза холестерина, такие как ингибиторы HMG-КоА редуктазы, например, статины. Статины могут включать аторвастатин (Lipitor), флувастатин (Lescol), ловастатин (Mevacor), ловастатин с пролонгированным высвобождением (Altoprev), питавастатин (Livalo), правастатин (Pravachol), розувастатин (Crestor) и симвастатин (Zocor). Другие пригодные для лечения нарушения метаболизма липидов средства могут включать секвестранты желчных кислот, такие как холестирамин и другие смолы, ингибиторы секреции VLDL, такие как ниацин, липофильные антиоксиданты, такие как пробукол, ингибиторы ацил-КоА-холестерин-ацилтрансферазы, антагонисты фарнезоидного Х-рецептора, активаторы белка, активирующего расщепление белка, связывающего стеролрегулирующие элементы (SCAP), ингибиторы микросомального белка-переносчика триглицеридов (MTP), АпоЕ-родственный пептид и терапевтические антитела против ANGPTL3. Дополнительные терапевтические средства также могут включать средства, которые повышают уровни липопротеина высокой плотности (HDL), такие как ингибиторы белка-переносчика сложных эфиров холестерина (CETP). Кроме того, дополнительные терапевтические средства также могут включать пищевые добавки, например, рыбий жир. иРНК и дополнительные терапевтические средства можно вводить одновременно и/или в одинаковой комбинации, например, парентерально, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить в виде части отдельной композиции или в отдельные моменты времени и/или другим способом, известным в данной области или описываемым в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления способ включает введение композиции по настоящему описанию, так чтобы снижать экспрессию гена-мишени ANGPTL3, таким образом как в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 часов, 28, 32 или приблизительно 36 часов. В одном из вариантов осуществления экспрессию гена-мишени ANGPTL3 снижают в течение продолжительного периода времени, например, по меньшей мере приблизительно на двое, трое, четверо суток или более, например, приблизительно на одну неделю, две недели, три недели или четыре недели или более.
Предпочтительно, иРНК, пригодные для способов, и композиции по настоящему описанию конкретно направлены на РНК (первичные или процессированные) гена-мишени ANGPTL3. Композиции и способы ингибирования экспрессии этих генов с использованием иРНК можно получать и проводить, как описано в настоящем описании.
Введение дцРНК способами по изобретению может приводить к снижению тяжести, признаков, симптомов и/или маркеров такого заболевания или нарушения у пациента с нарушением метаболизма липидов. Под "снижением" в этом контексте подразумевают статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или приблизительно 100%.
Эффективность лечения или профилактики заболевания можно оценивать, например, посредством определения прогрессирования заболевания, ремиссии заболевания, тяжести симптомов, ослабления боли, качества жизни, дозы лекарственного средства, необходимой для поддержания терапевтического эффекта, уровня маркера заболевания или любого другого измеряемого параметра, соответствующего данному заболеванию, для которого проводят лечение или на которое направлена профилактика. Специалисту в данной области хорошо известно, как проводить наблюдение за эффективностью лечения или профилактики посредством измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. Например, эффективность лечения нарушения метаболизма липидов можно оценивать, например, периодическим наблюдением за одним или более уровнями липидов в сыворотке. Сравнение последних показаний с начальными показаниями служит для врача показателем, является ли лечение эффективным. Специалист в данной области может проводить наблюдение за эффективностью лечения или профилактики посредством измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. Относительно введения иРНК, направленной на ANGPTL3, или ее фармацевтической композиции "эффективная в отношении" нарушения метаболизма липидов означает, что введение принятым в клинической практике способом приводит к положительному действию по меньшей мере для статистически значимой популяции пациентов, такому как улучшение симптомов, выздоровление, уменьшение заболевания, увеличение продолжительности жизни, улучшение качества жизни или другому эффекту, общепризнанному как положительный врачами, занимающимися лечением нарушения метаболизма липидов и родственными факторами.
Лечебное или профилактическое действие выявляют, когда наблюдают статистически значимое улучшение одного или более параметров статуса заболевания, или по отсутствию ухудшения или развития симптомов, где их в ином случае ожидали. Например, благоприятное изменение по меньшей мере на 10% измеряемого параметра заболевания и предпочтительно по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50% или более может свидетельствовать об эффективности лечения. Эффективность для данного лекарственного средства иРНК или состава такого лекарственного средства также можно оценивать с использованием экспериментальной модели на животных для данного заболевания, как известно в данной области. При использовании экспериментальной модели на животных эффективность лечения подтверждают, когда наблюдают статистически значимое уменьшение маркера или симптома.
Альтернативно, эффективность можно определять по снижению тяжести заболевания, как определяет специалист в области диагностики на основании клинически одобренной шкалы оценки тяжести заболевания, такой как, например, система классификации по Чайльду-Пью (иногда система классификации по Чайльда-Туркотта-Пью). Любое положительное изменение, приводящее, например, к уменьшению тяжести заболевания, измеряемой с использованием соответствующей шкалы, свидетельствует об адекватном лечении с использованием иРНК или состава иРНК, как описано в настоящем описании.
Индивидуумам можно вводить терапевтическое количество дцРНК, такое как приблизительно от 0,01 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,01 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,2 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,2 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,3 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,3 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,4 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,4 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 0,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 0,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 1,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 1,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 2 мг/кг приблизительно до приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно от 2 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 3 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 3 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 3,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4,5 мг/кг приблизительно до 5 мг/кг, приблизительно от 4 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 4,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 5,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 6 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 6,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 7 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 7,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 8 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 8,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 9 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг или приблизительно от 9,5 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Например, дцРНК можно вводить в дозе приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6,6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
В других вариантах осуществления, например, когда композиция по изобретению содержит дцРНК, как описано в настоящем описании, и N-ацетилгалактозамин, индивидуумам можно вводить терапевтическое количество дцРНК, такое как дозу приблизительно от 0,1 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 45 приблизительно до 50 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 45 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 40 приблизительно до 45 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 40 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 25 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 30 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 35 приблизительно до 40 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 30 мг/т.п.н., приблизительно от 2 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 15 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 20 приблизительно до 30 мг/кг, приблизительно от 0,1 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,25 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 0,75 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 1 приблизительно до 20 мг/мг, приблизительно от 1,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 2,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 3,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 4,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 7,5 приблизительно до 20 мг/кг, приблизительно от 10 приблизительно до 20 мг/кг или приблизительно от 15 приблизительно до 20 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Например, индивидуумам можно вводить терапевтическое количество дцРНК, такое как приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
иРНК можно вводить посредством внутривенной инфузии в течение периода времени, такого как в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или приблизительно 25 минут. Введение можно повторять, например, на регулярной основе, такой как раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или более. После начальной схемы лечения лечение можно проводить реже. Например, после введения одного раза в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять раз в месяц, в течение шести месяцев или одного года или более. Введение иРНК может снижать уровни ANGPTL3, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента по меньшей мере приблизительно на 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99% или более.
Перед введением полной дозы иРНК пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как при 5% инфузионной реакции, и наблюдать за побочными эффектами, такими как аллергическая реакция. В другом примере наблюдают за пациентом в отношении нежелательных иммуностимулирующих эффектов, таких как повышенные уровни цитокинов (например, TNF-альфа или INF-альфа).
Альтернативно, иРНК можно вводить подкожно, т.е. посредством подкожной инъекции. Одну или более инъекций можно использовать для доставки желаемой суточной дозы иРНК индивидууму. Инъекции можно повторять в течение периода времени, такого как в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 суток. Введение можно повторять, например, на регулярной основе, такой как раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или более. После начальной схемы лечения лечение можно проводить реже. В некоторых вариантах осуществления после однократной дозы иРНК следует ежемесячное дозирование. В некоторых вариантах осуществления дозирование может включать фазу нагрузки многократными дозами на последующие сутки.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют аналогичное значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании иРНК и способов по изобретению можно использовать способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описываем в настоящем описании, подходящие способы и вещества описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, является основополагающим. Кроме того, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Синтез иРНК
Источник реагентов
Когда источник реагента конкретно не указан в настоящем описании, такой реагент можно получать от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии со стандартным качеством/чистотой для применения в молекулярной биологии.
Транскрипты
Проводили конструирование миРНК для идентификации миРНК, направленных на транскрипт ANGPTL3 человека, аннотированный в базе данных генов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), и транскрипт ANGPTL3 яванского макака (Macaca fascicularis в дальнейшем "cyno"), получаемых секвенированием кДНК, получаемой из РНК из печени. Секвенирование мРНК ANGPTL3 cyno проводили по принятым в лаборатории правилам, и последовательность мРНК продемонстрирована в SEQ ID NO:9.
При конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции NCBI: NM_014495.2 (SEQ ID NO:1) человека, NM_013913.3 (SEQ ID NO:2) мыши. Конструировали все дуплексы миРНК, которые обладали 100% идентичностью с перечисленными транскриптами человека и cyno. Субпопуляция дуплексов миРНК, описанных ниже, также обладала 100% идентичностью с транскриптом ANGPTL3 мыши (Mus musculus), обнаруженном в базе данных генов NCBI.
Конструирование миРНК, специфичность и прогнозирование эффективности
Теоретически рассчитанную специфичность всех возможных 19-мерных последовательностей теоретически рассчитывали для каждой последовательности. Затем отбирали кандидатные 19-мерные последовательности, в которых отсутствуют повторы длиной более 7 нуклеотидов. Затем эти 977 кандидатных миРНК человека/cyno и субпопуляцию из 38, которая также совпадала с мышью ("кадидатные миРНК человека/cyno/мыши") использовали для комплексного поиска по отношению к транскриптому человека (определяемому, как набор записей NM_ и XM_ в наборе эталонных последовательностей человека NCBI) с использованием всестороннего алгоритма "перебора", реализуемого скриптом на языке Python "BruteForce.py". Затем скриптом интерпретировали выравнивания транскрипта-олиго с получением оценки в зависимости от положения и числа несоответствий между миРНК и любым потенциальным транскриптом "нерелевантной мишенью". Оценку "нерелевантной мишени" взвешивали для того, чтобы выделить различия в "затравочной" области миРНК в положениях 2-9 от 5'-конца молекулы. Для каждой пары олиго-транскрипта на основании поиска "перебором" получали оценку несоответствия, суммируя индивидуальные оценки несоответствия, несоответствия в положениях 2-9 подсчитывали как 2,8, несоответствия в положении участка расщепления 10-11 подсчитывали как 1,2 и несоответствия в участках 12-19 подсчитывали как 1,0. Дополнительно прогнозирование нерелевантной мишени проводили, сравнивая частоту гептамеров и октомеров, получаемых из 3 различных, получаемых из затравочной области гексамеров каждого олиго. Гексамеры положений 2-7 относительно 5'-начала использовали для получения 2 гептамеров и одного октомера. "Гептамер 1" получали добавлением 3'-A к гексамеру, "гептамер 2" получали добавлением 5'-A к гексамеру, октомер получали добавлением A к 5'- и 3'-концам гексамера. Предварительно вычисляли частоту октомеров и гептамеров в 3’UTRome человека (определяемой как подпоследовательность транскриптома из базы данных эталонных последовательностей NCBI, где конец кодирующей области "CDS" четко определен). Частоту октомеров нормализовали на частоту гептамеров с использованием медианного значения из диапазона частот октомера. Затем рассчитывали "mirSeedScore", вычисляя сумму ((3×число нормализованных октомеров)+(2×число гептамера 2)+(1×число гептамера 1)).
Обеим цепям миРНК назначали категорию специфичности согласно рассчитанным оценкам: оценку приблизительно 3 определяли как высоко специфичную, равную 3 как специфичную и от 2,2 до 2,8 как умеренно специфичную. Сортировку проводили по специфичности антисмысловой цепи. Затем выбирали дуплексы из набора человек/cyno с антисмысловыми олиго, в которых отсутствуют совпадения в затравочной области мкРНК, оценки 3 или выше, менее 65% всего содержания GC, не GC в первом положении, 4 или более U или A в затравочной области, и GC в девятнадцатом положении. Также выбирали дуплексы из набора человек/cyno/мышь с антисмысловыми олиго с оценками 2 или выше, менее чем 65% общего содержания GC, и не GC в первом положении.
Выбор последовательностей миРНК
Всего синтезировали и получали в виде дуплекса 47 смысловых олиго и 47 антисмысловых олиго, получаемых из миРНК из набора человек/cyno. Всего синтезировали и получали в виде дуплекса 15 смысловых олиго и 15 антисмысловых последовательностей, получаемых из миРНК из набора человек/cyno/мышь.
Синтез последовательностей ANGPTL3
Последовательности ANGPTL3 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 в масштабе 1 или 0,2 мкмоль. Отдельные цепи синтезировали с 2’O-метил-модификациями для трансфекции на основе скрининга in vitro. Для применения в анализах скрининга свободного поглощения 3'-конъюгаты GalNAc получали с химическими 2’-F- и 2’-O-метил-модификациями. При таком конструировании группу GalNAc помещали на 3'-конец смысловой цепи. Антисмысловая последовательность имела длину 23 нуклеотида, а также содержала химические 2’-F- и 2’-O-метил-модификации с двумя тиофосфатными связями на 3'-конце.
Для одного набора 21-мерных одиночных цепей и дуплексов применяли химические реагенты "Endolight", как подробно описано ниже.
- Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой цепи модифицировали 2’-O-метилнуклеотидами (2’-O-метил-C и 2’-O-метил-U).
- В антисмысловой цепи пиримидины, смежные (в направлении 5'-положения) с рибо-A нуклеозидом, заменяли их соответствующими 2’-O-метилнуклеозидами.
- Вводили удлинения двух оснований dTsdT на 3'-конце смысловой и антисмысловой последовательностей.
Для GalNAc, конъюгированного с 21-мерной смысловой и комплементарной 23-мерной антисмысловой последовательностями, синтезировали отдельные цепи с 2’-F- и 2’-O-метил-модификациями. Синтез проводили на модифицированной GalNAc подложке CPG для смысловой цепи и CPG, модифицированным универсальной подложкой для антисмысловой последовательности в масштабе 1 мкмоль. Применяли мотив последовательности, называемый TOFFEE, в котором смысловая цепь содержала три-нуклеотид 2’-F-модифицированный мотив в положениях 9, 10 и 11, и в антисмысловую цепь вводили 2’-O-метил-модифицированный мотив в положениях 11,12 и 13.
Синтез, расщепление и снятие защиты
В синтезе последовательностей ANGPTL3 использовали олигонуклеотидный синтез с твердой подложкой с использованием фосфорамидитной химии. Для 21-мерных последовательностей от Endolight использовали дезокситимидин CPG в качестве твердой подложки, тогда как для конъюгатов GalNAc, использовали твердую подложку на основе GalNAc для смысловой цепи и универсальный CPG для антисмысловой цепи.
Синтез указанных выше последовательностей проводили в масштабе 1 или 0,2 мкм в 96-луночных планшетах. Растворы амидита получали в концентрации 0,1 M и использовали этилтиотетразол (0,6 M в ацетонитриле) в качестве активатора.
Синтезированные последовательности расщепляли и проводили снятие защиты в 96-луночных планшетах с использованием метиламина на первой стадии и фторидного реагента на второй стадии. Для содержащих GalNAc и 2’-F-нуклеозид последовательностей условия снятие защиты модифицировали. Последовательности после расщепления и снятия защиты осаждали с использованием смеси ацетона:этанола (80:20) и ресуспендировали осадки в 0,2M буфере ацетата натрия. Образцы из каждой последовательности анализировали LC-MS для подтверждения идентичности, УФ для количественного определения и выбранные наборы образцов хроматографией IEX для определения чистоты.
Очистка, обессоливание и отжиг
Последовательности ANGPTL3 осаждали и очищали на системе для очистки AKTA с использованием колонки с сефадексом. ANGPTL3 проводили при температуре окружающей среды. Впрыск образцов и сбор проводили в 96-луночных планшетах с глубиной лунок 1,8 мл. В элюенте получали одиночный пик, соответствующий, последовательности полной длины. В последовательностях ANGPTL3 после удаления солей анализировали концентрацию (посредством УФ-измерения при A260) и чистоту (ионообменной ВЭЖХ). Затем объединяли комплементарные одиночные цепи в стехиометрическом отношении 1:1 с получением дуплексов миРНК.
Пример 2. Скрининг in vitro
Культура клеток и трансфекции
Клетки Hep3B (ATCC, Manassas, VA) выращивали до около конфлюэнтного состояния при 37ºC в атмосфере 5% CO2 в RPMI (ATCC) с добавлением 10% FBS, стрептомицина и глутамина (ATCC) перед тем как их удаляли с планшета трипсинизацией. Трансфекцию проводили посредством добавления 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogcn, Carlsbad CA. каталожный № 13778-150) к 5 мкл дуплексов миРНК на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем к смеси миРНК добавляли 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотика, содержащей ~2×104 клеток Hep3B. Клетки инкубировали в течение 24 или 120 часов до очистки РНК. Эксперименты с однократной дозой проводили при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ и эксперименты "доза-эффект" проводили при конечной концентрации дуплекса 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 и 0,00001 нМ, если не указано иное.
Трансфекция со свободным поглощением
В каждой лунке 96-луночного планшета 5 мкл каждой конъюгированной с GalNac миРНК в PBS комбинировали с 4×104 только что оттаявших криоконсервированных гепатоцитов Яванского макака, ресуспендированных в 95 мкл среды In Vitro Gro CP (In Vitro Technologies - Celsis, Baltimore, MD). Смесь инкубировали в течение приблизительно 24 часов при 37ºC в атмосфере 5% CO2. миРНК тестировали в конечных концентрациях 500 нМ, 100 нМ и 10 нМ в отношении эффективности анализами свободного поглощения. Для скрининга "доза-эффект" конечные концентрации миРНК составляли 500 нМ, 100 нМ, 20 нМ, 4 нМ, 0,8 нМ, 0,16 нМ, 0,032 нМ и 0,0064 нМ.
Выделение тотальной РНК с использованием набора для выделения мРНК DYNABEADS (Invitrogen, № партии 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин. с использованием термомиксера Eppendorf (скорость перемешивания являлась одинаковой на всем протяжении процесса). В круглодонный планшет добавляли смесь десяти микролитров магнитных гранул и 80 мкл лизирующего/связывающего буфера и перемешивали в течение 1 минуту. Магнитные гранулы удерживали с использованием магнитного держателя и удаляли супернатант, не затрагивая гранулы. После удаления супернатанта к оставшимся гранулам добавляли лизированные клетки и перемешивали в течение 5 минут. После удаления супернатанта магнитные гранулы отмывали 2 раза 150 мкл буфера A для промывания и перемешивали в течение 1 минуту. Гранулы снова удерживали и удаляли супернатант. Затем гранулы промывали 150 мкл буфера B для промывания, удерживали и удаляли супернатант. Затем гранулы промывали 150 мкл элюирующего буфера, удерживали и удаляли супернатант. Гранулы оставляли сушиться в течение 2 минут. После сушки добавляли 50 мкл элюирующего буфера и перемешивали в течение 5 минут при 70ºC. Гранулы удерживали на магните в течение 5 минут. Удаляли 40 мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез кДНК с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription (Applied Biosystems, Foster City, CA, каталожный № 4368813)
К 10 мкл тотальной РНК добавляли исходную смесь из 2 мкл 10X буфера, 0,8 мкл 25X dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл H2O на реакцию. кДНК получали с использованием термального циклера Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, CA) через следующие стадии: 25ºC 10 мин, 37ºC 120 мин, 85ºC 5 с, 4ºC хранение.
ПРЦ в реальном времени
2 мкл кДНК добавляли к исходной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда TaqMan GAPDH (Applied Biosystems каталожный № 4326317E), 0,5 мкл зонда TaqMan ANGPTL (Applied Biosystems каталожный № Hs00205581_m1) и 5 мкл исходной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche каталожный № 04887301001) на лунку в 50 384-луночных планшетов (Roche каталожный № 04887301001). ПЦР в реальном времени проводили в системе для проведения ПЦР в реальном времени ABI 7900HT (Applied Biosystems) с использованием анализа ΔΔCt(RQ). Каждый дуплекс тестировали в двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию анализировали в двух повторениях, если не указано иное в сводных таблицах.
Для расчета относительного кратного изменения получаемые в реальном времени данные анализировали способом ΔΔCt и нормализовали на анализы, проводимые с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955 или клеток с имитационной трансфекцией. IC50 рассчитывали с использованием модели для подбора с 4 параметрами с использованием XLFit и нормализовали на клетки, трансфицированные AD-1955, или нативные клетки в аналогичном диапазоне доз, или их собственную наименьшую дозу. Последовательность AD-1955, используемая в качестве отрицательного контроля, направлена на люциферазу и имеют следующую последовательность: смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO:14); антисмысловую: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO:15).
Скрининги выживаемости
Выживаемость клеток измеряли на сутки 3 и 6 на клетках HeLa и Hep3B после трансфекции 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05 нМ миРНК. Клетки высевали в плотности 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Каждую миРНК анализировали в трех повторениях и усредняли данные. Для оценки потери выживаемости в качестве положительных контролей включали миРНК, направленные на PLK1 и AD-19200, и в качестве отрицательных контролей клетки, трансфицированные AD-1955 и в условиях имитации. PLK1 и AD-19200 приводят к дозозависимой потери выживаемости. Для измерения выживаемости через 3 или 6 суток в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли 20 мкл CellTiter Blue (Promega) и инкубировали при 37ºC в течение 2 часов. Затем планшеты анализировали на спектрофотометре (Molecular Devices) при 560 возбуждение/590 испускание. Выживаемость выражали в виде среднего значения единиц света трансфекций в трех повторениях +/- стандартное отклонение. Относительную выживаемость оценивали сначала, усредняя трансфекций в трех повторениях, а затем нормализуя на клетки, трансфицированные в условиях имитации. Данные выражают в виде % жизнеспособных клеток.
Таблица 1: Сокращенные обозначения мономеров нуклеотидов, используемые при предоставлении последовательностей нуклеиновых кислот
Следует понимать, что эти мономеры, когда содержатся в олигонуклеотиде, являются попарно связанными 5'-3'-фосфодиэфирными связями.
Сокращенное обозначение Нуклеотид(ы)
A аденозин
C цитидин
G гуанозин
T тимидин
u уридин
N любой нуклеотид (G, A, C, T или U)
a 2'-O-метиладенозин
c 2'-O-метилцитидин
g 2'-O-метилгуанозин
u 2'-O-метилуридин
dT 2'-дезокситимидин
s тиофосфатная связь
Таблица 2
Немодифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3
ID дуплекса Название смысловой цепи Смысловая последовательность (SEQ ID NO:16-77, соответственно в порядке появления) Положение в NM_014495.2 Название антисмысловой цепи Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:78-139, соответственно в порядке появления) Положение в NM_014495.2
AD-45939.1 A-96225.1 UAUUUGAUCAGUCUUUUUA 281-299 A-96226.1 UAAAAAGACUGAUCAAAUA 281-299
AD-45858.1 A-96149.1 GAGCAACUAACUAACUUAA 478-496 A-96150.1 UUAAGUUAGUUAGUUGCUC 478-496
AD-45869.1 A-96137.1 GGCCAAAUUAAUGACAUAU 247-265 A-96138.1 AUAUGUCAUUAAUUUGGCC 247-265
AD-45884.1 A-96189.1 CGAAUUGAGUUGGAAGACU 1045-1063 A-96190.1 AGUCUUCCAACUCAAUUCG 1045-1063
AD-45892.1 A-96129.1 CCUCCUUCAGUUGGGACAU 198-216 A-96130.1 AUGUCCCAACUGAAGGAGG 198-216
AD-45899.1 A-96147.1 CACUUGAACUCAACUCAAA 401-419 A-96148.1 UUUGAGUUGAGUUCAAGUG 401-419
AD-45915.1 A-96231.1 GUCCAUGGACAUUAAUUCA 890-908 A-96232.1 UGAAUUAAUGUCCAUGGAC 890-908
AD-45924.1 A-96219.1 AAUCAAGAUUUGCUAUGUU 152-170 A-96220.1 AACAUAGCAAAUCUUGAUU 152-170
AD-45860.1 A-96181.1 CUAGAGAAGAUAUACUCCA 1000-1018 A-96182.1 UGGAGUAUAUCUUCUCUAG 1000-1018
AD-45870.1 A-96153.1 CUAACUAACUUAAUUCAAA 484-502 A-96154.1 UUUGAAUUAAGUUAGUUAG 484-502
AD-45870.2 A-96153.2 CUAACUAACUUAAUUCAAA 484-502 A-96154.2 UUUGAAUUAAGUUAGUUAG 484-502
AD-45877.1 A-96171.1 CAUUAAUUCAACAUCGAAU 899-917 A-96172.1 AUUCGAUGUUGAAUUAAUG 899-917
AD-45885.1 A-96205.1 CAAAAUGUUGAUCCAUCCA 1392-1410 A-96206.1 UGGAUGGAUCAACAUUUUG 1392-1410
AD-45893.1 A-96145.1 CAUAUAAACUACAAGUCAA 359-377 A-96146.1 UUGACUUGUAGUUUAUAUG 359-377
AD-45900.1 A-96163.1 GACCCAGCAACUCUCAAGU 839-857 A-96164.1 ACUUGAGAGUUGCUGGGUC 839-857
AD-45925.1 A-96235.1 GGUUGGGCCUAGAGAAGAU 992-1010 A-96236.1 AUCUUCUCUAGGCCCAACC 992-1010
AD-45861.1 A-96197.1 GUGUGGAGAAAACAACCUA 1272-1290 A-96198.1 UAGGUUGUUUUCUCCACAC 1272-1290
AD-45871.1 A-96169.1 GACAUUAAUUCAACAUCGA 897-915 A-96170.1 UCGAUGUUGAAUUAAUGUC 897-915
AD-45878.1 A-96187.1 CAUAGUGAAGCAAUCUAAU 1017-1035 A-96188.1 AUUAGAUUGCUUCACUAUG 1017-1035
AD-45886.1 A-96127.1 CUAUGUUAGACGAUGUAAA 164-182 A-96128.1 UUUACAUCGUCUAACAUAG 164-182
AD-45894.1 A-96161.1 CACAGAAAUUUCUCUAUCU 684-702 A-96162.1 AGAUAGAGAAAUUUCUGUG 684-702
AD-45901.1 A-96179.1 GUUGGGCCUAGAGAAGAUA 993-1011 A-96180.1 UAUCUUCUCUAGGCCCAAC 993-1011
AD-45909.1 A-96213.1 GCCAAAAUCAAGAUUUGCU 147-165 A-96214.1 AGCAAAUCUUGAUUUUGGC 147-165
AD-45934.1 A-96223.1 ACAUAUUUGAUCAGUCUUU 278-296 A-96224.1 AAAGACUGAUCAAAUAUGU 278-296
AD-45934.2 A-96223.2 ACAUAUUUGAUCAGUCUUU 278-296 A-96224.2 AAAGACUGAUCAAAUAUGU 278-296
AD-45863.1 A-96135.1 CUUAAAGACUUUGUCCAUA 220-238 A-96136.1 UAUGGACAAAGUCUUUAAG 220-238
AD-45872.1 A-96185.1 CCAUAGUGAAGCAAUCUAA 1016-1034 A-96186.1 UUAGAUUGCUUCACUAUGG 1016-1034
AD-45879.1 A-96203.1 CAACCAAAAUGUUGAUCCA 1388-1406 A-96204.1 UGGAUCAACAUUUUGGUUG 1388-1406
AD-45887.1 A-96143.1 CUACAUAUAAACUACAAGU 356-374 A-96144.1 ACUUGUAGUUUAUAUGUAG 356-374
AD-45895.1 A-96177.1 GGGAGGCUUGAUGGAGAAU 970-988 A-96178.1 AUUCUCCAUCAAGCCUCCC 970-988
AD-45902.1 A-96195.1 GGUGUUUUCUACUUGGGAU 1188-1206 A-96196.1 AUCCCAAGUAGAAAACACC 1188-1206
AD-45910.1 A-96229.1 AAGAGCACCAAGAACUACU 711-729 A-96230.1 AGUAGUUCUUGGUGCUCUU 711-729
AD-45935.1 A-96239.1 UGGAGAAAACAACCUAAAU 1275-1293 A-96240.1 AUUUAGGUUGUUUUCUCCA 1275-1293
AD-45864.1 A-96151.1 GCAACUAACUAACUUAAUU 480-498 A-96152.1 AAUUAAGUUAGUUAGUUGC 480-498
AD-45873.1 A-96201.1 CAACCUAAAUGGUAAAUAU 1284-1302 A-96202.1 AUAUUUACCAUUUAGGUUG 1284-1302
AD-45880.1 A-96125.1 GCUAUGUUAGACGAUGUAA 163-181 A-96126.1 UUACAUCGUCUAACAUAGC 163-181
AD-45888.1 A-96159.1 CCCACAGAAAUUUCUCUAU 682-700 A-96160.1 AUAGAGAAAUUUCUGUGGG 682-700
AD-45896.1 A-96193.1 GAUUUGGUGUUUUCUACUU 1183-1201 A-96194.1 AAGUAGAAAACACCAAAUC 1183-1201
AD-45903.1 A-96211.1 CAGAGCCAAAAUCAAGAUU 143-161 A-96212.1 AAUCUUGAUUUUGGCUCUG 143-161
AD-45919.1 A-96217.1 AAAUCAAGAUUUGCUAUGU 151-169 A-96218.1 ACAUAGCAAAUCUUGAUUU 151-169
AD-45865.1 A-96167.1 CAUGGACAUUAAUUCAACA 893-911 A-96168.1 UGUUGAAUUAAUGUCCAUG 893-911
AD-45874.1 A-96123.1 GAUUUGCUAUGUUAGACGA 158-176 A-96124.1 UCGUCUAACAUAGCAAAUC 158-176
AD-45881.1 A-96141.1 GAACUACAUAUAAACUACA 353-371 A-96142.1 UGUAGUUUAUAUGUAGUUC 353-371
AD-45889.1 A-96175.1 CGAAUAGAUGGAUCACAAA 913-931 A-96176.1 UUUGUGAUCCAUCUAUUCG 913-931
AD-45897.1 A-96209.1 CUUGUUAAAACUCUAAACU 1817-1835 A-96210.1 AGUUUAGAGUUUUAACAAG 1817-1835
AD-45904.1 A-96227.1 AUUUGAUCAGUCUUUUUAU 282-300 A-96228.1 AUAAAAAGACUGAUCAAAU 282-300
AD-45920.1 A-96233.1 UCCAUGGACAUUAAUUCAA 891-909 A-96234.1 UUGAAUUAAUGUCCAUGGA 891-909
AD-45856.1 A-96117.1 CACAAUUAAGCUCCUUCUU 57-75 A-96118.1 AAGAAGGAGCUUAAUUGUG 57-75
AD-45929.1 A-96221.1 CAACAUAUUUGAUCAGUCU 276-294 A-96222.1 AGACUGAUCAAAUAUGUUG 276-294
AD-45866.1 A-96183.1 CUCCAUAGUGAAGCAAUCU 1014-1032 A-96184.1 AGAUUGCUUCACUAUGGAG 1014-1032
AD-45875.1 A-96139.1 GCCAAAUUAAUGACAUAUU 248-266 A-96140.1 AAUAUGUCAUUAAUUUGGC 248-266
AD-45882.1 A-96157.1 CAACAGCAUAGUCAAAUAA 622-640 A-96158.1 UUAUUUGACUAUGCUGUUG 622-640
AD-45890.1 A-96191.1 GGAAAUCACGAAACCAACU 1105-1123 A-96192.1 AGUUGGUUUCGUGAUUUCC 1105-1123
AD-45898.1 A-96131.1 CAGUUGGGACAUGGUCUUA 205-223 A-96132.1 UAAGACCAUGUCCCAACUG 205-223
AD-45857.1 A-96133.1 GACAUGGUCUUAAAGACUU 212-230 A-96134.1 AAGUCUUUAAGACCAUGUC 212-230
AD-45930.1 A-96237.1 UGUGGAGAAAACAACCUAA 1273-1291 A-96238.1 UUAGGUUGUUUUCUCCACA 1273-1291
AD-45867.1 A-96199.1 GUGGAGAAAACAACCUAAA 1274-1292 A-96200.1 UUUAGGUUGUUUUCUCCAC 1274-1292
AD-45876.1 A-96155.1 CCAACAGCAUAGUCAAAUA 621-639 A-96156.1 UAUUUGACUAUGCUGUUGG 621-639
AD-45883.1 A-96173.1 CAACAUCGAAUAGAUGGAU 907-925 A-96174.1 AUCCAUCUAUUCGAUGUUG 907-925
AD-45891.1 A-96207.1 GCAAAUUUAAAAGGCAAUA 1441-1459 A-96208.1 UAUUGCCUUUUAAAUUUGC 1441-1459
AD-45914.1 A-96215.1 CAAAAUCAAGAUUUGCUAU 149-167 A-96216.1 AUAGCAAAUCUUGAUUUUG 149-167
AD-15838.1 A-26242.1 AGAGCCAAAAUCAAGAUUU 144-162 A-26243.2 AAAUCUUGAUUUUGGCUCU 144-162
Таблица 3
Модифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3
ID дуплекса Название смыслового олиго Смысловая последовательность (SEQ ID NO:140-201, соответственно в порядке появления) Название антисмыслового олиго Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:202-263, соответственно в порядке появления)
AD-45939.1 A-96225.1 uAuuuGAucAGucuuuuuAdTsdT A-96226.1 uAAAAAGACUGAUcAAAuAdTsdT
AD-45858.1 A-96149.1 GAGcAAcuAAcuAAcuuAAdTsdT A-96150.1 UuAAGUuAGUuAGUUGCUCdTsdT
AD-45869.1 A-96137.1 GGccAAAuuAAuGAcAuAudTsdT A-96138.1 AuAUGUcAUuAAUUUGGCCdTsdT
AD-45884.1 A-96189.1 cGAAuuGAGuuGGAAGAcudTsdT A-96190.1 AGUCUUCcAACUcAAUUCGdTsdT
AD-45892.1 A-96129.1 ccuccuucAGuuGGGAcAudTsdT A-96130.1 AUGUCCcAACUGAAGGAGGdTsdT
AD-45899.1 A-96147.1 cAcuuGAAcucAAcucAAAdTsdT A-96148.1 UUUGAGUUGAGUUcAAGUGdTsdT
AD-45915.1 A-96231.1 GuccAuGGAcAuuAAuucAdTsdT A-96232.1 UGAAUuAAUGUCcAUGGACdTsdT
AD-45924.1 A-96219.1 AAucAAGAuuuGcuAuGuudTsdT A-96220.1 AAcAuAGcAAAUCUUGAUUdTsdT
AD-45860.1 A-96181.1 cuAGAGAAGAuAuAcuccAdTsdT A-96182.1 UGGAGuAuAUCUUCUCuAGdTsdT
AD-45870.1 A-96153.1 cuAAcuAAcuuAAuucAAAdTsdT A-96154.1 UUUGAAUuAAGUuAGUuAGdTsdT
AD-45870.2 A-96153.2 cuAAcuAAcuuAAuucAAAdTsdT A-96154.2 UUUGAAUuAAGUuAGUuAGdTsdT
AD-45877.1 A-96171.1 cAuuAAuucAAcAucGAAudTsdT A-96172.1 AUUCGAUGUUGAAUuAAUGdTsdT
AD-45885.1 A-96205.1 cAAAAuGuuGAuccAuccAdTsdT A-96206.1 UGGAUGGAUcAAcAUUUUGdTsdT
AD-45893.1 A-96145.1 cAuAuAAAcuAcAAGucAAdTsdT A-96146.1 UUGACUUGuAGUUuAuAUGdTsdT
AD-45900.1 A-96163.1 GAcccAGcAAcucucAAGudTsdT A-96164.1 ACUUGAGAGUUGCUGGGUCdTsdT
AD-45925.1 A-96235.1 GGuuGGGccuAGAGAAGAudTsdT A-96236.1 AUCUUCUCuAGGCCcAACCdTsdT
AD-45861.1 A-96197.1 GuGuGGAGAAAAcAAccuAdTsdT A-96198.1 uAGGUUGUUUUCUCcAcACdTsdT
AD-45871.1 A-96169.1 GAcAuuAAuucAAcAucGAdTsdT A-96170.1 UCGAUGUUGAAUuAAUGUCdTsdT
AD-45878.1 A-96187.1 cAuAGuGAAGcAAucuAAudTsdT A-96188.1 AUuAGAUUGCUUcACuAUGdTsdT
AD-45886.1 A-96127.1 cuAuGuuAGAcGAuGuAAAdTsdT A-96128.1 UUuAcAUCGUCuAAcAuAGdTsdT
AD-45894.1 A-96161.1 cAcAGAAAuuucucuAucudTsdT A-96162.1 AGAuAGAGAAAUUUCUGUGdTsdT
AD-45901.1 A-96179.1 GuuGGGccuAGAGAAGAuAdTsdT A-96180.1 uAUCUUCUCuAGGCCcAACdTsdT
AD-45909.1 A-96213.1 GccAAAAucAAGAuuuGcudTsdT A-96214.1 AGcAAAUCUUGAUUUUGGCdTsdT
AD-45934.1 A-96223.1 AcAuAuuuGAucAGucuuudTsdT A-96224.1 AAAGACUGAUcAAAuAUGUdTsdT
AD-45934.2 A-96223.2 AcAuAuuuGAucAGucuuudTsdT A-96224.2 AAAGACUGAUcAAAuAUGUdTsdT
AD-45863.1 A-96135.1 cuuAAAGAcuuuGuccAuAdTsdT A-96136.1 uAUGGAcAAAGUCUUuAAGdTsdT
AD-45872.1 A-96185.1 ccAuAGuGAAGcAAucuAAdTsdT A-96186.1 UuAGAUUGCUUcACuAUGGdTsdT
AD-45879.1 A-96203.1 cAAccAAAAuGuuGAuccAdTsdT A-96204.1 UGGAUcAAcAUUUUGGUUGdTsdT
AD-45887.1 A-96143.1 cuAcAuAuAAAcuAcAAGudTsdT A-96144.1 ACUUGuAGUUuAuAUGuAGdTsdT
AD-45895.1 A-96177.1 GGGAGGcuuGAuGGAGAAudTsdT A-96178.1 AUUCUCcAUcAAGCCUCCCdTsdT
AD-45902.1 A-96195.1 GGuGuuuucuAcuuGGGAudTsdT A-96196.1 AUCCcAAGuAGAAAAcACCdTsdT
AD-45910.1 A-96229.1 AAGAGcAccAAGAAcuAcudTsdT A-96230.1 AGuAGUUCUUGGUGCUCUUdTsdT
AD-45935.1 A-96239.1 uGGAGAAAAcAAccuAAAudTsdT A-96240.1 AUUuAGGUUGUUUUCUCcAdTsdT
AD-45864.1 A-96151.1 GcAAcuAAcuAAcuuAAuudTsdT A-96152.1 AAUuAAGUuAGUuAGUUGCdTsdT
AD-45873.1 A-96201.1 cAAccuAAAuGGuAAAuAudTsdT A-96202.1 AuAUUuACcAUUuAGGUUGdTsdT
AD-45880.1 A-96125.1 GcuAuGuuAGAcGAuGuAAdTsdT A-96126.1 UuAcAUCGUCuAAcAuAGCdTsdT
AD-45888.1 A-96159.1 cccAcAGAAAuuucucuAudTsdT A-96160.1 AuAGAGAAAUUUCUGUGGGdTsdT
AD-45896.1 A-96193.1 GAuuuGGuGuuuucuAcuudTsdT A-96194.1 AAGuAGAAAAcACcAAAUCdTsdT
AD-45903.1 A-96211.1 cAGAGccAAAAucAAGAuudTsdT A-96212.1 AAUCUUGAUUUUGGCUCUGdTsdT
AD-45919.1 A-96217.1 AAAucAAGAuuuGcuAuGudTsdT A-96218.1 AcAuAGcAAAUCUUGAUUUdTsdT
AD-45865.1 A-96167.1 cAuGGAcAuuAAuucAAcAdTsdT A-96168.1 UGUUGAAUuAAUGUCcAUGdTsdT
AD-45874.1 A-96123.1 GAuuuGcuAuGuuAGAcGAdTsdT A-96124.1 UCGUCuAAcAuAGcAAAUCdTsdT
AD-45881.1 A-96141.1 GAAcuAcAuAuAAAcuAcAdTsdT A-96142.1 UGuAGUUuAuAUGuAGUUCdTsdT
AD-45889.1 A-96175.1 cGAAuAGAuGGAucAcAAAdTsdT A-96176.1 UUUGUGAUCcAUCuAUUCGdTsdT
AD-45897.1 A-96209.1 cuuGuuAAAAcucuAAAcudTsdT A-96210.1 AGUUuAGAGUUUuAAcAAGdTsdT
AD-45904.1 A-96227.1 AuuuGAucAGucuuuuuAudTsdT A-96228.1 AuAAAAAGACUGAUcAAAUdTsdT
AD-45920.1 A-96233.1 uccAuGGAcAuuAAuucAAdTsdT A-96234.1 UUGAAUuAAUGUCcAUGGAdTsdT
AD-45856.1 A-96117.1 cAcAAuuAAGcuccuucuudTsdT A-96118.1 AAGAAGGAGCUuAAUUGUGdTsdT
AD-45929.1 A-96221.1 cAAcAuAuuuGAucAGucudTsdT A-96222.1 AGACUGAUcAAAuAUGUUGdTsdT
AD-45866.1 A-96183.1 cuccAuAGuGAAGcAAucudTsdT A-96184.1 AGAUUGCUUcACuAUGGAGdTsdT
AD-45875.1 A-96139.1 GccAAAuuAAuGAcAuAuudTsdT A-96140.1 AAuAUGUcAUuAAUUUGGCdTsdT
AD-45882.1 A-96157.1 cAAcAGcAuAGucAAAuAAdTsdT A-96158.1 UuAUUUGACuAUGCUGUUGdTsdT
AD-45890.1 A-96191.1 GGAAAucAcGAAAccAAcudTsdT A-96192.1 AGUUGGUUUCGUGAUUUCCdTsdT
AD-45898.1 A-96131.1 cAGuuGGGAcAuGGucuuAdTsdT A-96132.1 uAAGACcAUGUCCcAACUGdTsdT
AD-45857.1 A-96133.1 GAcAuGGucuuAAAGAcuudTsdT A-96134.1 AAGUCUUuAAGACcAUGUCdTsdT
AD-45930.1 A-96237.1 uGuGGAGAAAAcAAccuAAdTsdT A-96238.1 UuAGGUUGUUUUCUCcAcAdTsdT
AD-45867.1 A-96199.1 GuGGAGAAAAcAAccuAAAdTsdT A-96200.1 UUuAGGUUGUUUUCUCcACdTsdT
AD-45876.1 A-96155.1 ccAAcAGcAuAGucAAAuAdTsdT A-96156.1 uAUUUGACuAUGCUGUUGGdTsdT
AD-45883.1 A-96173.1 cAAcAucGAAuAGAuGGAudTsdT A-96174.1 AUCcAUCuAUUCGAUGUUGdTsdT
AD-45891.1 A-96207.1 GcAAAuuuAAAAGGcAAuAdTsdT A-96208.1 uAUUGCCUUUuAAAUUUGCdTsdT
AD-45914.1 A-96215.1 cAAAAucAAGAuuuGcuAudTsdT A-96216.1 AuAGcAAAUCUUGAUUUUGdTsdT
AD-15838.1 A-26242.1 AGAGccAAAAucAAGAuuudTsdT A-26243.2 AAAUCUuGAUUUuGGCUCUdTsdT
Обозначенные строчными буквами нуклеотиды (a, u, g, c) представляют собой 2'-O-метилнуклеотиды, s представляет собой тиофосфатную связь.
Таблица 4
Результаты скрининга однократной дозы с использованием последовательностей дцРНК ANGPTL3
Эксперименты проводили с использованием модифицированных олигонуклеотидных дуплексов, перечисленных в таблице 3. Последовательность AD-15838.2 является идентичной последовательности AD-15838.1. Доставка дуплексов миРНК проводили с использованием LNP.
клетки Hep3B человека
Дуплекс 10 нМ 0,1 нМ Станд.откл. 10 нМ Станд.откл., 0,1 нМ
AD-15838.2 0,09 0,66 0,008 0,030
AD-45856.1 0,32 0,91 0,026 0,032
AD-45857.1 2,46 1,07 0,140 0,044
AD-45858.1 0,10 0,74 0,010 0,070
AD-45860.1 0,02 0,47 0,002 0,097
AD-45861.1 0,03 0,68 0,004 0,062
AD-45863.1 1,42 0,95 0,145 0,126
AD-45864.1 0,02 0,17 0,002 0,045
AD-45865.1 0,32 0,93 0,022 0,062
AD-45866.1 0,10 0,92 0,010 0,041
AD-45867.1 0,04 0,61 0,000 0,048
AD-45869.1 0,45 1,08 0,028 0,081
AD-45870.1 0,01 0,10 0,003 0,010
AD-45871.1 0,05 0,57 0,006 0,071
AD-45872.1 0,07 0,71 0,007 0,034
AD-45873.1 0,02 0,23 0,001 0,011
AD-45874.1 0,08 0,75 0,013 0,049
AD-45875.1 0,13 0,82 0,017 0,040
AD-45876.1 0,03 0,54 0,000 0,013
AD-45877.1 0,06 0,47 0,002 0,025
AD-45878.1 0,02 0,44 0,002 0,031
AD-45879.1 0,03 0,35 0,003 0,023
AD-45880.1 0,49 1,00 0,039 0,088
AD-45881.1 0,20 0,90 0,019 0,095
AD-45882.1 0,20 0,95 0,012 0,086
AD-45883.1 0,16 0,98 0,011 0,058
AD-45884.1 0,09 0,94 0,003 0,044
AD-45885.1 0,22 0,91 0,020 0,145
AD-45886.1 0,04 0,40 0,008 0,080
AD-45887.1 0,03 0,35 0,002 0,057
AD-45888.1 0,05 0,80 0,006 0,042
AD-45889.1 0,31 0,91 0,013 0,052
AD-45890.1 0,06 0,90 0,001 0,047
AD-45891.1 0,06 0,82 0,007 0,034
AD-45892.1 1,01 1,09 0,033 0,211
AD-45893.1 0,04 0,58 0,002 0,046
AD-45894.1 0,04 0,59 0,003 0,024
AD-45895.1 0,84 1,00 0,047 0,047
AD-45896.1 0,84 0,98 0,032 0,095
AD-45897.1 0,36 0,61 0,032 0,053
AD-45898.1 0,98 1,09 0,021 0,117
AD-45899.1 0,04 0,59 0,005 0,095
AD-45900.1 0,06 0,80 0,005 0,091
AD-45901.1 0,33 0,94 0,025 0,096
AD-45902.1 0,24 1,03 0,010 0,079
AD-45903.1 0,74 1,02 0,003 0,092
AD-45904.1 0,39 0,87 0,010 0,010
AD-45909.1 0,04 0,73 0,008 0,013
AD-45910.1 1,08 1,01 0,037 0,089
AD-45914.1 0,52 0,99 0,018 0,071
AD-45915.1 0,06 0,48 0,004 0,046
AD-45919.1 0,67 0,98 0,048 0,064
AD-45920.1 0,61 1,00 0,031 0,038
AD-45924.1 0,09 0,67 0,005 0,012
AD-45925.1 0,13 0,90 0,008 0,100
AD-45929.1 0,02 0,42 0,001 0,083
AD-45930.1 0,05 0,63 0,005 0,052
AD-45934.1 0,04 0,41 0,001 0,062
AD-45935.1 0,08 0,76 0,006 0,058
AD-45939.1 0,23 0,82 0,030 0,028
AD-1955.1 0,93 0,93 0,068 0,073
AD-1955.1 0,94 1,01 0,028 0,113
AD-1955.1 1,00 1,02 0,032 0,065
AD-1955.1 1,15 1,06 0,053 0,019
Таблица 5
Результаты скрининга "доза-эффект" для последовательности дцРНК ANGPTL3
Эксперименты проводили с использованием модифицированных олигонуклеотидных дуплексов, перечисленных в таблице 3. Последовательность AD-15838.2 является идентичной последовательности AD-15838.1.
IC50 Hep3B
24 часа 120 часов
Дуплекс IC50 I (нМ) IC50 II (нМ) взвешенная IC50 (нМ) IC50 I (нМ) IC50 II (нМ) взвешенная IC50 (нМ)
AD-15838.2 0,027 0,006 0,017 0,657 0,937 0,800
AD-45860.1 0,006 0,002 0,004 0,045 0,032 0,039
AD-45864.1 0,002 0,001 0,002 0,046 0,042 0,044
AD-45870.1 0,002 0,001 0,001 0,011 0,008 0,010
AD-45873.1 0,005 0,004 0,005 0,037 0,025 0,031
AD-45876.1 0,032 0,006 0,019 0,269 0,045 0,156
AD-45877.1 0,018 0,012 0,015 1,660 0,538 1,091
AD-45878.1 0,023 0,015 0,019 0,252 0,131 0,190
AD-45879.1 0,002 0,003 0,003 0,023 0,029 0,026
AD-45886.1 0,004 0,004 0,004 0,030 0,018 0,025
AD-45887.1 0,010 0,009 0,010 0,058 0,059 0,059
AD-45915.1 0,016 0,015 0,015 0,110 0,056 0,083
AD-45929.1 0,023 0,008 0,016 0,227 0,025 0,124
AD-45934.1 0,006 0,006 0,006 0,110 0,045 0,077
Таблица 6
Результаты скрининга выживаемости клеток с использованием модифицированных последовательностей дцРНК ANGPTL3
Эксперименты проводили с использованием модифицированных олигонуклеотидных дуплексов, перечисленных в таблице 3. Последовательность AD-15838.2 является идентичной последовательности AD-15838.1. Данные выживаемости выражают в виде % жизнеспособных клеток относительно клеток, обрабатываемых в условиях имитации.
Сутки 3 HeLa
Мишень Дуплекс Усред-ненная 10 нМ Усред-ненная 1 нМ Усред-ненная 500 пМ Усред-ненная 100 пМ Усред-ненная 50 пМ Станд. отклон. 10 нМ Станд. отклон. 1 нМ Станд. отклон. 500 пМ Станд. отклон. 100 пМ Станд. отклон. 50 пМ
ANGPTL3 AD-15838.2 37,34 58,67 70,92 89,86 94,98 9,45 12,28 15,06 22,37 18,23
ANGPTL3 AD-15838.2 29,13 48,99 63,18 79,21 94,47 1,62 5,56 4,34 11,15 11,31
ANGPTL3 AD-45860.1 67,10 75,49 77,93 86,57 90,51 6,99 12,93 6,39 6,97 3,57
ANGPTL3 AD-45864.1 99,13 96,95 86,77 89,20 84,36 7,90 7,22 12,60 4,85 6,87
ANGPTL3 AD-45870.1 82,36 97,02 95,33 95,67 92,27 8,07 5,12 7,97 7,05 10,29
ANGPTL3 AD-45873.1 67,96 90,01 90,60 94,20 103,63 11,26 22,61 15,92 22,92 16,97
ANGPTL3 AD-45876.1 64,00 76,71 80,21 81,71 91,23 6,60 13,94 10,15 10,81 13,89
ANGPTL3 AD-45877.1 79,55 77,33 79,98 91,96 93,46 1,66 9,80 8,73 16,63 11,41
ANGPTL3 AD-45878.1 81,95 78,22 78,74 87,93 85,03 15,37 22,72 22,59 30,84 40,04
ANGPTL3 AD-45878.1 66,83 70,71 82,14 82,80 83,14 17,48 6,49 6,86 19,92 21,15
ANGPTL3 AD-45879.1 37,56 45,55 59,28 76,35 78,38 3,50 7,96 19,73 34,33 33,99
ANGPTL3 AD-45886.1 72,75 57,90 64,51 81,92 82,89 14,73 12,64 11,78 25,60 23,14
ANGPTL3 AD-45887.1 38,01 53,91 59,31 76,44 85,73 0,58 10,81 6,27 11,12 10,92
ANGPTL3 AD-45915.1 48,06 52,17 67,90 95,45 100,77 8,13 15,15 29,11 32,49 38,79
ANGPTL3 AD-45929.1 29,27 44,58 52,87 76,45 88,03 4,17 9,67 14,49 31,74 28,82
ANGPTL3 AD-45934.1 68,20 64,11 76,92 79,57 92,11 15,79 11,25 19,99 26,08 26,30
(+)контроль AD-19200 41,09 85,94 95,13 101,29 96,60 9,99 25,31 24,56 32,26 26,35
(+)контроль AD-19200 23,99 72,76 86,51 108,10 111,13 5,35 34,52 29,24 35,99 31,88
(-)контроль AD-1955 89,65 99,87 94,59 104,04 105,10 4,57 5,94 4,19 5,78 7,46
(-)контроль AD-1955 104,74 99,78 105,79 109,19 108,08 10,94 7,74 11,12 7,91 10,30
(-)контроль имитация 100,00 6,92
(-)контроль имитация 100,00 9,85
(+)контроль PLK 10,66 26,65 46,16 92,42 98,78 1,70 8,65 13,47 22,99 23,48
(+)контроль PLK 10,74 11,41 17,33 61,02 86,59 3,39 2,61 1,49 27,42 37,31
Сутки 6 HeLa
Мишень Дуплекс Усред-ненная 10 нМ Усред-ненная 1 нМ Усред-ненная 500 пМ Усред-ненная 100 пМ Усред-ненная 50 пМ Станд. отклон. 10 нМ Станд. отклон. 1 нМ Станд. отклон. 500 пМ Станд. отклон. 100 пМ Станд. отклон. 50 пМ
ANGPTL3 AD-15838.2 47,94 80,97 90,44 94,37 96,10 29,05 25,12 13,62 8,88 4,72
ANGPTL3 AD-15838.2 40,32 83,80 89,88 95,94 98,27 22,47 16,51 10,03 3,83 4,19
ANGPTL3 AD-45860.1 57,38 84,84 88,90 96,74 94,03 24,55 17,35 9,67 3,17 6,58
ANGPTL3 AD-45864.1 98,65 100,87 101,13 96,86 98,24 4,35 1,91 2,22 3,41 1,80
ANGPTL3 AD-45870.1 92,69 98,71 98,49 100,07 99,28 3,94 2,67 2,36 1,19 2,65
ANGPTL3 AD-45873.1 91,78 97,38 98,81 97,57 96,22 12,47 6,26 4,08 6,22 8,64
ANGPTL3 AD-45876.1 63,54 85,68 92,13 96,48 95,97 14,74 16,50 10,03 5,81 7,51
ANGPTL3 AD-45877.1 94,17 93,21 96,39 96,70 96,98 7,12 8,00 4,58 3,05 6,15
ANGPTL3 AD-45878.1 66,46 85,75 89,73 94,60 96,59 8,20 7,41 5,27 3,21 3,91
ANGPTL3 AD-45878.1 70,80 89,30 92,54 96,60 95,09 5,18 2,13 1,61 0,50 4,15
ANGPTL3 AD-45879.1 8,29 48,25 73,54 87,47 92,19 4,66 20,05 16,04 9,06 7,90
ANGPTL3 AD-45886.1 23,69 60,65 78,49 93,41 94,15 8,19 13,90 7,15 3,35 4,06
ANGPTL3 AD-45887.1 7,24 26,03 57,68 95,99 98,80 3,07 13,10 14,94 1,40 2,54
ANGPTL3 AD-45915.1 10,38 58,38 85,69 97,24 99,76 6,83 15,66 8,39 1,33 4,15
ANGPTL3 AD-45929.1 11,73 36,67 51,90 76,71 85,08 4,80 14,19 15,34 12,37 10,60
ANGPTL3 AD-45934.1 73,57 88,48 92,94 91,50 95,97 5,36 2,96 5,50 5,44 4,39
(+)контроль AD-19200 63,58 90,14 95,44 94,65 93,28 34,11 14,32 8,78 10,90 12,13
(+)контроль AD-19200 16,05 78,65 85,78 93,09 96,22 9,77 15,57 19,50 13,34 10,96
(-)контроль AD-1955 93,52 97,36 97,90 99,65 100,07 5,02 1,78 0,84 0,58 1,14
(-)контроль AD-1955 75,39 93,61 97,79 99,60 100,96 8,37 2,50 2,27 2,68 3,16
(-)контроль имитация 100,00 1,32
(-)контроль имитация 100,00 3,35
(+)контроль PLK 3,68 55,22 63,00 89,39 95,33 1,42 30,96 33,97 15,85 8,54
(+)контроль PLK 2,69 3,74 9,74 67,07 82,96 0,15 0,96 3,60 22,70 19,34
Сутки 3 Hep3B
Мишень Дуплекс Усред-ненная 10 нМ Усред-ненная 1 нМ Усред-ненная 500 пМ Усред-ненная 100 пМ Усред-ненная 50 пМ Станд. отклон. 10 нМ Станд. отклон. 1 нМ Станд. отклон. 500 пМ Станд. отклон. 100 пМ Станд. отклон. 50 пМ
ANGPTL3 AD-15838.2 35,33 61,00 68,79 82,74 90,41 2,41 6,21 4,21 2,61 7,07
ANGPTL3 AD-15838.2 35,34 61,04 72,14 89,71 106,88 1,49 2,61 7,37 6,48 7,13
ANGPTL3 AD-45860.1 17,79 39,25 60,57 94,28 99,85 1,07 3,51 3,57 13,09 16,41
ANGPTL3 AD-45864.1 80,35 88,19 87,01 89,39 92,09 6,93 6,98 9,42 7,41 17,05
ANGPTL3 AD-45870.1 75,00 93,30 96,64 106,29 99,08 7,10 12,24 4,01 5,95 9,64
ANGPTL3 AD-45873.1 42,68 78,45 82,26 97,11 96,58 5,17 5,04 8,31 12,11 11,33
ANGPTL3 AD-45876.1 31,37 55,00 70,69 93,49 91,00 4,39 6,09 5,47 15,11 6,38
ANGPTL3 AD-45877.1 74,45 94,60 96,70 103,77 106,75 3,27 2,44 3,45 6,10 7,40
ANGPTL3 AD-45878.1 50,22 69,65 80,49 92,77 97,37 2,51 14,94 10,44 8,21 5,30
ANGPTL3 AD-45878.1 44,85 65,39 75,67 92,83 109,67 10,10 7,76 8,56 7,78 4,97
ANGPTL3 AD-45879.1 23,73 60,81 84,59 95,72 108,68 6,43 21,36 19,62 13,69 5,95
ANGPTL3 AD-45886.1 27,19 55,35 64,97 100,18 102,09 0,97 6,65 11,46 6,91 4,08
ANGPTL3 AD-45887.1 41,70 97,18 101,91 111,27 105,18 9,26 6,81 7,36 1,72 2,23
ANGPTL3 AD-45915.1 45,10 66,31 82,22 97,97 103,30 6,91 11,84 14,79 6,54 2,48
ANGPTL3 AD-45929.1 48,58 79,14 89,96 95,00 101,37 10,40 10,29 10,52 18,24 10,53
ANGPTL3 AD-45934.1 80,15 102,93 112,82 114,16 113,98 5,28 0,62 4,19 0,75 3,99
(+)контроль AD-19200 14,79 55,23 72,90 89,64 94,30 2,17 5,42 7,19 10,28 16,39
(+)контроль AD-19200 22,76 92,02 101,56 106,68 113,09 6,61 18,99 7,41 9,83 10,64
(-)контроль AD-1955 77,77 81,25 82,23 88,21 95,02 2,83 5,40 5,08 5,42 6,63
(-)контроль AD-1955 80,42 86,70 90,23 93,46 97,04 10,53 5,70 8,14 3,27 3,45
(-)контроль имитация 100,00 5,77
(-)контроль имитация 100,00 9,79
(+)контроль PLK 10,91 12,89 14,31 23,87 50,93 0,17 0,87 1,64 1,13 7,80
(+)контроль PLK 13,19 16,12 22,89 55,03 94,35 0,78 0,88 8,36 18,88 9,85
Сутки 6 Hep3B
Мишень Дуплекс Усред-ненная 10 нМ Усред-ненная 1 нМ Усред-ненная 500 пМ Усред-ненная 100 пМ Усред-ненная 50 пМ Станд. отклон. 10 нМ Станд. отклон. 1 нМ Станд. отклон. 500 пМ Станд. отклон. 100 пМ Станд. отклон. 50 пМ
ANGPTL3 AD-15838.2 78,88 89,58 93,08 91,10 100,66 11,60 9,15 12,04 10,51 5,87
ANGPTL3 AD-15838.2 81,17 85,91 87,27 103,95 103,59 7,75 3,29 8,07 7,93 9,82
ANGPTL3 AD-45860.1 84,11 87,77 93,22 99,15 96,75 14,22 13,36 20,98 13,15 17,62
ANGPTL3 AD-45864.1 99,27 111,82 106,28 99,15 97,55 7,77 16,31 14,24 15,40 9,18
ANGPTL3 AD-45870.1 95,49 109,60 104,16 104,65 106,76 11,92 12,98 9,25 10,29 19,12
ANGPTL3 AD-45873.1 71,45 90,62 93,44 102,07 107,72 4,71 4,40 15,02 11,96 10,16
ANGPTL3 AD-45876.1 76,92 82,09 89,44 95,27 105,41 9,39 13,55 7,93 9,77 10,42
ANGPTL3 AD-45877.1 82,98 98,05 95,07 103,55 104,14 11,22 13,45 1,27 8,88 6,49
ANGPTL3 AD-45878.1 75,14 82,48 89,68 92,71 95,72 8,65 10,07 10,77 12,44 15,04
ANGPTL3 AD-45878.1 65,90 77,37 78,33 84,54 99,49 10,21 13,22 9,95 11,65 11,17
ANGPTL3 AD-45879.1 86,42 89,45 101,50 97,30 100,66 10,59 10,12 19,77 13,19 9,54
ANGPTL3 AD-45886.1 91,15 79,31 80,76 86,52 94,04 12,89 11,88 5,38 4,92 6,80
ANGPTL3 AD-45887.1 91,67 103,38 107,88 100,05 102,05 10,80 14,84 19,18 13,72 18,00
ANGPTL3 AD-45915.1 81,97 85,91 91,81 94,95 102,13 18,49 19,30 7,19 12,72 16,64
ANGPTL3 AD-45929.1 61,92 79,39 87,28 88,09 96,00 6,80 10,76 5,80 10,68 16,66
ANGPTL3 AD-45934.1 85,84 89,66 97,67 99,91 102,54 12,39 14,25 4,74 9,51 4,28
(+)контроль AD-19200 50,48 65,62 79,67 98,61 96,87 4,60 4,64 7,20 5,08 7,37
(+)контроль AD-19200 52,01 75,89 92,59 101,47 99,66 4,35 20,87 13,57 6,50 11,76
(-)контроль AD-1955 91,77 95,87 93,06 95,10 97,52 8,87 3,46 1,46 2,00 3,84
(-)контроль AD-1955 93,65 94,41 89,42 100,59 103,91 9,91 14,90 6,80 11,99 10,31
(-)контроль имитация 100,00 5,10
(-)контроль имитация 100,00 7,35
(+)контроль PLK 36,43 37,75 40,19 55,25 64,59 3,44 2,75 3,65 5,33 5,02
(+)контроль PLK 38,70 43,68 50,32 75,17 89,62 3,40 3,85 8,10 10,54 10,69
Таблица 7
Немодифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3, конъюгированных с GalNac
ID дуплекса Название смысловой цепи Смысловая последовательность (SEQ ID NO:264-448, соответственно, в порядке появления) Положение в NM_014495.2 Название антисмысловой цепи Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:449-633, соответственно, в порядке появления) Положение в NM_014495.2
AD-53063.1 A-108558.1 AAAGACAACAAACAUUAUAUUx 1066-1086 A-108559.1 AAUAUAAUGUUUGUUGUCUUUCC 1064-1086
AD-52965.1 A-108310.1 ACAAUUAAGCUCCUUCUUUUUx 58-78 A-108311.1 AAAAAGAAGGAGCUUAAUUGUGA 56-78
AD-53030.1 A-108410.1 UGUCACUUGAACUCAACUCAAx 398-418 A-108411.1 UUGAGUUGAGUUCAAGUGACAUA 396-418
AD-52953.1 A-108306.1 UCACAAUUAAGCUCCUUCUUUx 56-76 A-108307.1 AAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAAC 54-76
AD-53001.1 A-108416.1 CUUGAACUCAACUCAAAACUUx 403-423 A-108417.1 AAGUUUUGAGUUGAGUUCAAGUG 401-423
AD-53080.1 A-108548.1 CUCCAUAGUGAAGCAAUCUAAx 1014-1034 A-108549.1 UUAGAUUGCUUCACUAUGGAGUA 1012-1034
AD-52971.1 A-108312.1 CAAUUAAGCUCCUUCUUUUUAx 59-79 A-108313.1 UAAAAAGAAGGAGCUUAAUUGUG 57-79
AD-53071.1 A-108498.1 ACCCAGCAACUCUCAAGUUUUx 840-860 A-108499.1 AAAACUUGAGAGUUGCUGGGUCU 838-860
AD-53024.1 A-108408.1 GAAUAUGUCACUUGAACUCAAx 393-413 A-108409.1 UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU 391-413
AD-52977.1 A-108314.1 AAUUAAGCUCCUUCUUUUUAUx 60-80 A-108315.1 AUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUGU 58-80
AD-53064.1 A-108574.1 CAUUAUAUUGAAUAUUCUUUUx 1078-1098 A-108575.1 AAAAGAAUAUUCAAUAUAAUGUU 1076-1098
AD-53033.1 A-108458.1 ACUAACUAACUUAAUUCAAAAx 483-503 A-108459.1 UUUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUG 481-503
AD-52954.1 A-108322.1 UUAUUGUUCCUCUAGUUAUUUx 77-97 A-108323.1 AAAUAACUAGAGGAACAAUAAAA 75-97
AD-53098.1 A-108554.1 CAUAGUGAAGCAAUCUAAUUAx 1017-1037 A-108555.1 UAAUUAGAUUGCUUCACUAUGGA 1015-1037
AD-53092.1 A-108552.1 CCAUAGUGAAGCAAUCUAAUUx 1016-1036 A-108553.1 AAUUAGAUUGCUUCACUAUGGAG 1014-1036
AD-53073.1 A-108530.1 GAUCACAAAACUUCAAUGAAAx 923-943 A-108531.1 UUUCAUUGAAGUUUUGUGAUCCA 921-943
AD-53132.1 A-108628.1 AUGGAAGGUUAUACUCUAUAAx 1364-1384 A-108629.1 UUAUAGAGUAUAACCUUCCAUUU 1362-1384
AD-53086.1 A-108550.1 UCCAUAGUGAAGCAAUCUAAUx 1015-1035 A-108551.1 AUUAGAUUGCUUCACUAUGGAGU 1013-1035
AD-52961.1 A-108340.1 CUAUGUUAGACGAUGUAAAAAx 164-184 A-108341.1 UUUUUACAUCGUCUAACAUAGCA 162-184
AD-52983.1 A-108316.1 AUUAAGCUCCUUCUUUUUAUUx 61-81 A-108317.1 AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG 59-81
AD-53027.1 A-108456.1 AACUAACUAACUUAAUUCAAAx 482-502 A-108457.1 UUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGC 480-502
AD-52986.1 A-108364.1 GGCCAAAUUAAUGACAUAUUUx 247-267 A-108365.1 AAAUAUGUCAUUAAUUUGGCCCU 245-267
AD-52989.1 A-108318.1 UUUUAUUGUUCCUCUAGUUAUx 75-95 A-108319.1 AUAACUAGAGGAACAAUAAAAAG 73-95
AD-52981.1 A-108378.1 ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUUx 278-298 A-108379.1 AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG 276-298
AD-53077.1 A-108500.1 CCCAGCAACUCUCAAGUUUUUx 841-861 A-108501.1 AAAAACUUGAGAGUUGCUGGGUC 839-861
AD-53095.1 A-108506.1 CAGGUAGUCCAUGGACAUUAAx 884-904 A-108507.1 UUAAUGUCCAUGGACUACCUGAU 882-904
AD-52970.1 A-108390.1 ACUGAGAAGAACUACAUAUAAx 345-365 A-108391.1 UUAUAUGUAGUUCUUCUCAGUUC 343-365
AD-53015.1 A-108452.1 GAGCAACUAACUAACUUAAUUx 478-498 A-108453.1 AAUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUU 476-498
AD-53147.1 A-108618.1 AACAACCUAAAUGGUAAAUAUx 1282-1302 A-108619.1 AUAUUUACCAUUUAGGUUGUUUU 1280-1302
AD-53103.1 A-108540.1 CCUAGAGAAGAUAUACUCCAUx 999-1019 A-108541.1 AUGGAGUAUAUCUUCUCUAGGCC 997-1019
AD-52969.1 A-108374.1 CAACAUAUUUGAUCAGUCUUUx 276-296 A-108375.1 AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG 274-296
AD-53075.1 A-108562.1 ACAACAAACAUUAUAUUGAAUx 1070-1090 A-108563.1 AUUCAAUAUAAUGUUUGUUGUCU 1068-1090
AD-52994.1 A-108398.1 ACAUAUAAACUACAAGUCAAAx 358-378 A-108399.1 UUUGACUUGUAGUUUAUAUGUAG 356-378
AD-52960.1 A-108324.1 CUAGUUAUUUCCUCCAGAAUUx 88-108 A-108325.1 AAUUCUGGAGGAAAUAACUAGAG 86-108
AD-53003.1 A-108448.1 AAGAGCAACUAACUAACUUAAx 476-496 A-108449.1 UUAAGUUAGUUAGUUGCUCUUCU 474-496
AD-52995.1 A-108320.1 UUUAUUGUUCCUCUAGUUAUUx 76-96 A-108321.1 AAUAACUAGAGGAACAAUAAAAA 74-96
AD-53037.1 A-108428.1 CUCCUAGAAGAAAAAAUUCUAx 430-450 A-108429.1 UAGAAUUUUUUCUUCUAGGAGGC 428-450
AD-53087.1 A-108566.1 AACAAACAUUAUAUUGAAUAUx 1072-1092 A-108567.1 AUAUUCAAUAUAAUGUUUGUUGU 1070-1092
AD-53076.1 A-108578.1 GGAAAUCACGAAACCAACUAUx 1105-1125 A-108579.1 AUAGUUGGUUUCGUGAUUUCCCA 1103-1125
AD-52975.1 A-108376.1 AACAUAUUUGAUCAGUCUUUUx 277-297 A-108377.1 AAAAGACUGAUCAAAUAUGUUGA 275-297
AD-53138.1 A-108630.1 UGGAAGGUUAUACUCUAUAAAx 1365-1385 A-108631.1 UUUAUAGAGUAUAACCUUCCAUU 1363-1385
AD-53091.1 A-108536.1 GGAGAACUACAAAUAUGGUUUx 948-968 A-108537.1 AAACCAUAUUUGUAGUUCUCCCA 946-968
AD-53124.1 A-108594.1 GAAAACAAAGAUUUGGUGUUUx 1174-1194 A-108595.1 AAACACCAAAUCUUUGUUUUCCG 1172-1194
AD-53125.1 A-108610.1 AGUGUGGAGAAAACAACCUAAx 1271-1291 A-108611.1 UUAGGUUGUUUUCUCCACACUCA 1269-1291
AD-53036.1 A-108412.1 GUCACUUGAACUCAACUCAAAx 399-419 A-108413.1 UUUGAGUUGAGUUCAAGUGACAU 397-419
AD-53061.1 A-108526.1 GAUGGAUCACAAAACUUCAAUx 919-939 A-108527.1 AUUGAAGUUUUGUGAUCCAUCUA 917-939
AD-53093.1 A-108568.1 ACAAACAUUAUAUUGAAUAUUx 1073-1093 A-108569.1 AAUAUUCAAUAUAAUGUUUGUUG 1071-1093
AD-53137.1 A-108614.1 UGUGGAGAAAACAACCUAAAUx 1273-1293 A-108615.1 AUUUAGGUUGUUUUCUCCACACU 1271-1293
AD-52999.1 A-108384.1 AUCAGUCUUUUUAUGAUCUAUx 287-307 A-108385.1 AUAGAUCAUAAAAAGACUGAUCA 285-307
AD-53069.1 A-108560.1 GACAACAAACAUUAUAUUGAAx 1069-1089 A-108561.1 UUCAAUAUAAUGUUUGUUGUCUU 1067-1089
AD-53034.1 A-108474.1 CAACAGCAUAGUCAAAUAAAAx 622-642 A-108475.1 UUUUAUUUGACUAUGCUGUUGGU 620-642
AD-52976.1 A-108392.1 CUGAGAAGAACUACAUAUAAAx 346-366 A-108393.1 UUUAUAUGUAGUUCUUCUCAGUU 344-366
AD-52996.1 A-108336.1 UGCUAUGUUAGACGAUGUAAAx 162-182 A-108337.1 UUUACAUCGUCUAACAUAGCAAA 160-182
AD-53029.1 A-108488.1 AACCCACAGAAAUUUCUCUAUx 680-700 A-108489.1 AUAGAGAAAUUUCUGUGGGUUCU 678-700
AD-53020.1 A-108438.1 CUUCAACAAAAAGUGAAAUAUx 451-471 A-108439.1 AUAUUUCACUUUUUGUUGAAGUA 449-471
AD-53042.1 A-108414.1 UCACUUGAACUCAACUCAAAAx 400-420 A-108415.1 UUUUGAGUUGAGUUCAAGUGACA 398-420
AD-53011.1 A-108482.1 CAUAGUCAAAUAAAAGAAAUAx 628-648 A-108483.1 UAUUUCUUUUAUUUGACUAUGCU 626-648
AD-52957.1 A-108370.1 CAAAAACUCAACAUAUUUGAUx 268-288 A-108371.1 AUCAAAUAUGUUGAGUUUUUGAA 266-288
AD-53008.1 A-108434.1 UACUUCAACAAAAAGUGAAAUx 449-469 A-108435.1 AUUUCACUUUUUGUUGAAGUAGA 447-469
AD-53065.1 A-108496.1 GACCCAGCAACUCUCAAGUUUx 839-859 A-108497.1 AAACUUGAGAGUUGCUGGGUCUG 837-859
AD-53115.1 A-108638.1 UUGAAUGAACUGAGGCAAAUUx 1427-1447 A-108639.1 AAUUUGCCUCAGUUCAUUCAAAG 1425-1447
AD-53012.1 A-108404.1 UAUAAACUACAAGUCAAAAAUx 361-381 A-108405.1 AUUUUUGACUUGUAGUUUAUAUG 359-381
AD-53004.1 A-108464.1 AAACAAGAUAAUAGCAUCAAAx 559-579 A-108465.1 UUUGAUGCUAUUAUCUUGUUUUU 557-579
AD-53021.1 A-108454.1 CAACUAACUAACUUAAUUCAAx 481-501 A-108455.1 UUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGCU 479-501
AD-52955.1 A-108338.1 GCUAUGUUAGACGAUGUAAAAx 163-183 A-108339.1 UUUUACAUCGUCUAACAUAGCAA 161-183
AD-53119.1 A-108608.1 ACUUGGGAUCACAAAGCAAAAx 1198-1218 A-108609.1 UUUUGCUUUGUGAUCCCAAGUAG 1196-1218
AD-52990.1 A-108334.1 UUGCUAUGUUAGACGAUGUAAx 161-181 A-108335.1 UUACAUCGUCUAACAUAGCAAAU 159-181
AD-52964.1 A-108388.1 AACUGAGAAGAACUACAUAUAx 344-364 A-108389.1 UAUAUGUAGUUCUUCUCAGUUCC 342-364
AD-52973.1 A-108344.1 GAUGUAAAAAUUUUAGCCAAUx 175-195 A-108345.1 AUUGGCUAAAAUUUUUACAUCGU 173-195
AD-53074.1 A-108546.1 ACUCCAUAGUGAAGCAAUCUAx 1013-1033 A-108547.1 UAGAUUGCUUCACUAUGGAGUAU 1011-1033
AD-53026.1 A-108440.1 UUCAACAAAAAGUGAAAUAUUx 452-472 A-108441.1 AAUAUUUCACUUUUUGUUGAAGU 450-472
AD-53062.1 A-108542.1 CUAGAGAAGAUAUACUCCAUAx 1000-1020 A-108543.1 UAUGGAGUAUAUCUUCUCUAGGC 998-1020
AD-53114.1 A-108622.1 CAACCUAAAUGGUAAAUAUAAx 1284-1304 A-108623.1 UUAUAUUUACCAUUUAGGUUGUU 1282-1304
AD-53082.1 A-108580.1 GAAAUCACGAAACCAACUAUAx 1106-1126 A-108581.1 UAUAGUUGGUUUCGUGAUUUCCC 1104-1126
AD-53035.1 A-108490.1 CCACAGAAAUUUCUCUAUCUUx 683-703 A-108491.1 AAGAUAGAGAAAUUUCUGUGGGU 681-703
AD-52978.1 A-108330.1 AAAUCAAGAUUUGCUAUGUUAx 151-171 A-108331.1 UAACAUAGCAAAUCUUGAUUUUG 149-171
AD-53084.1 A-108518.1 ACAUUAAUUCAACAUCGAAUAx 898-918 A-108519.1 UAUUCGAUGUUGAAUUAAUGUCC 896-918
AD-52972.1 A-108328.1 CCAGAGCCAAAAUCAAGAUUUx 142-162 A-108329.1 AAAUCUUGAUUUUGGCUCUGGAG 140-162
AD-53002.1 A-108432.1 CUACUUCAACAAAAAGUGAAAx 448-468 A-108433.1 UUUCACUUUUUGUUGAAGUAGAA 446-468
AD-53078.1 A-108516.1 GACAUUAAUUCAACAUCGAAUx 897-917 A-108517.1 AUUCGAUGUUGAAUUAAUGUCCA 895-917
AD-53072.1 A-108514.1 GGACAUUAAUUCAACAUCGAAx 896-916 A-108515.1 UUCGAUGUUGAAUUAAUGUCCAU 894-916
AD-53005.1 A-108480.1 GCAUAGUCAAAUAAAAGAAAUx 627-647 A-108481.1 AUUUCUUUUAUUUGACUAUGCUG 625-647
AD-53083.1 A-108502.1 CUCUCAAGUUUUUCAUGUCUAx 849-869 A-108503.1 UAGACAUGAAAAACUUGAGAGUU 847-869
AD-53102.1 A-108524.1 AUCGAAUAGAUGGAUCACAAAx 911-931 A-108525.1 UUUGUGAUCCAUCUAUUCGAUGU 909-931
AD-53105.1 A-108572.1 ACAUUAUAUUGAAUAUUCUUUx 1077-1097 A-108573.1 AAAGAAUAUUCAAUAUAAUGUUU 1075-1097
AD-53090.1 A-108520.1 UUAAUUCAACAUCGAAUAGAUx 901-921 A-108521.1 AUCUAUUCGAUGUUGAAUUAAUG 899-921
AD-53010.1 A-108466.1 GAUAAUAGCAUCAAAGACCUUx 565-585 A-108467.1 AAGGUCUUUGAUGCUAUUAUCUU 563-585
AD-52998.1 A-108368.1 UGACAUAUUUCAAAAACUCAAx 258-278 A-108369.1 UUGAGUUUUUGAAAUAUGUCAUU 256-278
AD-52992.1 A-108366.1 AAAUUAAUGACAUAUUUCAAAx 251-271 A-108367.1 UUUGAAAUAUGUCAUUAAUUUGG 249-271
AD-53068.1 A-108544.1 GAAGAUAUACUCCAUAGUGAAx 1005-1025 A-108545.1 UUCACUAUGGAGUAUAUCUUCUC 1003-1025
AD-53032.1 A-108442.1 AAUAUUUAGAAGAGCAACUAAx 467-487 A-108443.1 UUAGUUGCUCUUCUAAAUAUUUC 465-487
AD-52967.1 A-108342.1 CGAUGUAAAAAUUUUAGCCAAx 174-194 A-108343.1 UUGGCUAAAAUUUUUACAUCGUC 172-194
AD-53096.1 A-108522.1 UUCAACAUCGAAUAGAUGGAUx 905-925 A-108523.1 AUCCAUCUAUUCGAUGUUGAAUU 903-925
AD-53131.1 A-108612.1 GUGUGGAGAAAACAACCUAAAx 1272-1292 A-108613.1 UUUAGGUUGUUUUCUCCACACUC 1270-1292
AD-52963.1 A-108372.1 UCAACAUAUUUGAUCAGUCUUx 275-295 A-108373.1 AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU 273-295
AD-53089.1 A-108504.1 UCAGGUAGUCCAUGGACAUUAx 883-903 A-108505.1 UAAUGUCCAUGGACUACCUGAUA 881-903
AD-53044.1 A-108446.1 UUUAGAAGAGCAACUAACUAAx 471-491 A-108447.1 UUAGUUAGUUGCUCUUCUAAAUA 469-491
AD-52988.1 A-108396.1 UACAUAUAAACUACAAGUCAAx 357-377 A-108397.1 UUGACUUGUAGUUUAUAUGUAGU 355-377
AD-53067.1 A-108528.1 GGAUCACAAAACUUCAAUGAAx 922-942 A-108529.1 UUCAUUGAAGUUUUGUGAUCCAU 920-942
AD-53009.1 A-108450.1 AGAGCAACUAACUAACUUAAUx 477-497 A-108451.1 AUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUUC 475-497
AD-53022.1 A-108470.1 ACCAACAGCAUAGUCAAAUAAx 620-640 A-108471.1 UUAUUUGACUAUGCUGUUGGUUU 618-640
AD-53016.1 A-108468.1 AACCAACAGCAUAGUCAAAUAx 619-639 A-108469.1 UAUUUGACUAUGCUGUUGGUUUA 617-639
AD-53007.1 A-108418.1 GAACUCAACUCAAAACUUGAAx 406-426 A-108419.1 UUCAAGUUUUGAGUUGAGUUCAA 404-426
AD-53148.1 A-108634.1 UACUCUAUAAAAUCAACCAAAx 1375-1395 A-108635.1 UUUGGUUGAUUUUAUAGAGUAUA 1373-1395
AD-53040.1 A-108476.1 CAGCAUAGUCAAAUAAAAGAAx 625-645 A-108477.1 UUCUUUUAUUUGACUAUGCUGUU 623-645
AD-53041.1 A-108492.1 GAAAUAAGAAAUGUAAAACAUx 748-768 A-108493.1 AUGUUUUACAUUUCUUAUUUCAU 746-768
AD-53039.1 A-108460.1 CUAACUAACUUAAUUCAAAAUx 484-504 A-108461.1 AUUUUGAAUUAAGUUAGUUAGUU 482-504
AD-53139.1 A-108646.1 AUGAACUGAGGCAAAUUUAAAx 1431-1451 A-108647.1 UUUAAAUUUGCCUCAGUUCAUUC 1429-1451
AD-53144.1 A-108648.1 UGAACUGAGGCAAAUUUAAAAx 1432-1452 A-108649.1 UUUUAAAUUUGCCUCAGUUCAUU 1430-1452
AD-53142.1 A-108616.1 AAACAACCUAAAUGGUAAAUAx 1281-1301 A-108617.1 UAUUUACCAUUUAGGUUGUUUUC 1279-1301
AD-53108.1 A-108620.1 ACAACCUAAAUGGUAAAUAUAx 1283-1303 A-108621.1 UAUAUUUACCAUUUAGGUUGUUU 1281-1303
AD-53079.1 A-108532.1 AACGUGGGAGAACUACAAAUAx 942-962 A-108533.1 UAUUUGUAGUUCUCCCACGUUUC 940-962
AD-53133.1 A-108644.1 AAUGAACUGAGGCAAAUUUAAx 1430-1450 A-108645.1 UUAAAUUUGCCUCAGUUCAUUCA 1428-1450
AD-53104.1 A-108556.1 GUUGGAAGACUGGAAAGACAAx 1053-1073 A-108557.1 UUGUCUUUCCAGUCUUCCAACUC 1051-1073
AD-53088.1 A-108582.1 UGGCAAUGUCCCCAAUGCAAUx 1149-1169 A-108583.1 AUUGCAUUGGGGACAUUGCCAGU 1147-1169
AD-53101.1 A-108508.1 GGUAGUCCAUGGACAUUAAUUx 886-906 A-108509.1 AAUUAAUGUCCAUGGACUACCUG 884-906
AD-53000.1 A-108400.1 CAUAUAAACUACAAGUCAAAAx 359-379 A-108401.1 UUUUGACUUGUAGUUUAUAUGUA 357-379
AD-53112.1 A-108590.1 AAUCCCGGAAAACAAAGAUUUx 1167-1187 A-108591.1 AAAUCUUUGUUUUCCGGGAUUGC 1165-1187
AD-53107.1 A-108604.1 CUACUUGGGAUCACAAAGCAAx 1196-1216 A-108605.1 UUGCUUUGUGAUCCCAAGUAGAA 1194-1216
AD-53121.1 A-108640.1 UGAAUGAACUGAGGCAAAUUUx 1428-1448 A-108641.1 AAAUUUGCCUCAGUUCAUUCAAA 1426-1448
AD-53046.1 A-108478.1 AGCAUAGUCAAAUAAAAGAAAx 626-646 A-108479.1 UUUCUUUUAUUUGACUAUGCUGU 624-646
AD-53038.1 A-108444.1 AUUUAGAAGAGCAACUAACUAx 470-490 A-108445.1 UAGUUAGUUGCUCUUCUAAAUAU 468-490
AD-53140.1 A-108662.1 AGGCAAAUUUAAAAGGCAAUAx 1439-1459 A-108663.1 UAUUGCCUUUUAAAUUUGCCUCA 1437-1459
AD-52987.1 A-108380.1 CAUAUUUGAUCAGUCUUUUUAx 279-299 A-108381.1 UAAAAAGACUGAUCAAAUAUGUU 277-299
AD-53130.1 A-108596.1 AAAACAAAGAUUUGGUGUUUUx 1175-1195 A-108597.1 AAAACACCAAAUCUUUGUUUUCC 1173-1195
AD-53106.1 A-108588.1 CAAUCCCGGAAAACAAAGAUUx 1166-1186 A-108589.1 AAUCUUUGUUUUCCGGGAUUGCA 1164-1186
AD-53081.1 A-108564.1 CAACAAACAUUAUAUUGAAUAx 1071-1091 A-108565.1 UAUUCAAUAUAAUGUUUGUUGUC 1069-1091
AD-53118.1 A-108592.1 GGAAAACAAAGAUUUGGUGUUx 1173-1193 A-108593.1 AACACCAAAUCUUUGUUUUCCGG 1171-1193
AD-53136.1 A-108598.1 ACAAAGAUUUGGUGUUUUCUAx 1178-1198 A-108599.1 UAGAAAACACCAAAUCUUUGUUU 1176-1198
AD-53127.1 A-108642.1 GAAUGAACUGAGGCAAAUUUAx 1429-1449 A-108643.1 UAAAUUUGCCUCAGUUCAUUCAA 1427-1449
AD-53066.1 A-108512.1 CCAUGGACAUUAAUUCAACAUx 892-912 A-108513.1 AUGUUGAAUUAAUGUCCAUGGAC 890-912
AD-53013.1 A-108420.1 AACUCAACUCAAAACUUGAAAx 407-427 A-108421.1 UUUCAAGUUUUGAGUUGAGUUCA 405-427
AD-52991.1 A-108350.1 CAGUUGGGACAUGGUCUUAAAx 205-225 A-108351.1 UUUAAGACCAUGUCCCAACUGAA 203-225
AD-53099.1 A-108570.1 AACAUUAUAUUGAAUAUUCUUx 1076-1096 A-108571.1 AAGAAUAUUCAAUAUAAUGUUUG 1074-1096
AD-52958.1 A-108386.1 ACCAGUGAAAUCAAAGAAGAAx 316-336 A-108387.1 UUCUUCUUUGAUUUCACUGGUUU 314-336
AD-53097.1 A-108538.1 GUUGGGCCUAGAGAAGAUAUAx 993-1013 A-108539.1 UAUAUCUUCUCUAGGCCCAACCA 991-1013
AD-52966.1 A-108326.1 CUCCAGAGCCAAAAUCAAGAUx 140-160 A-108327.1 AUCUUGAUUUUGGCUCUGGAGAU 138-160
AD-53145.1 A-108664.1 GGCAAAUUUAAAAGGCAAUAAx 1440-1460 A-108665.1 UUAUUGCCUUUUAAAUUUGCCUC 1438-1460
AD-53113.1 A-108606.1 UACUUGGGAUCACAAAGCAAAx 1197-1217 A-108607.1 UUUGCUUUGUGAUCCCAAGUAGA 1195-1217
AD-52993.1 A-108382.1 GAUCAGUCUUUUUAUGAUCUAx 286-306 A-108383.1 UAGAUCAUAAAAAGACUGAUCAA 284-306
AD-53031.1 A-108426.1 GAAAGCCUCCUAGAAGAAAAAx 424-444 A-108427.1 UUUUUCUUCUAGGAGGCUUUCAA 422-444
AD-53017.1 A-108484.1 AGUCAAAUAAAAGAAAUAGAAx 631-651 A-108485.1 UUCUAUUUCUUUUAUUUGACUAU 629-651
AD-53143.1 A-108632.1 AUACUCUAUAAAAUCAACCAAx 1374-1394 A-108633.1 UUGGUUGAUUUUAUAGAGUAUAA 1372-1394
AD-53149.1 A-108650.1 GAACUGAGGCAAAUUUAAAAAx 1433-1453 A-108651.1 UUUUUAAAUUUGCCUCAGUUCAU 1431-1453_G21A
AD-53059.1 A-108494.1 AGACCCAGCAACUCUCAAGUUx 838-858 A-108495.1 AACUUGAGAGUUGCUGGGUCUGA 836-858
AD-53006.1 A-108402.1 AUAUAAACUACAAGUCAAAAAx 360-380 A-108403.1 UUUUUGACUUGUAGUUUAUAUGU 358-380
AD-53025.1 A-108424.1 UGAAAGCCUCCUAGAAGAAAAx 423-443 A-108425.1 UUUUCUUCUAGGAGGCUUUCAAG 421-443
AD-53085.1 A-108534.1 GGGAGAACUACAAAUAUGGUUx 947-967 A-108535.1 AACCAUAUUUGUAGUUCUCCCAC 945-967
AD-52984.1 A-108332.1 AGAUUUGCUAUGUUAGACGAUx 157-177 A-108333.1 AUCGUCUAACAUAGCAAAUCUUG 155-177
AD-53023.1 A-108486.1 GAACCCACAGAAAUUUCUCUAx 679-699 A-108487.1 UAGAGAAAUUUCUGUGGGUUCUU 677-699
AD-53014.1 A-108436.1 ACUUCAACAAAAAGUGAAAUAx 450-470 A-108437.1 UAUUUCACUUUUUGUUGAAGUAG 448-470
AD-53060.1 A-108510.1 AGUCCAUGGACAUUAAUUCAAx 889-909 A-108511.1 UUGAAUUAAUGUCCAUGGACUAC 887-909
AD-53110.1 A-108652.1 AACUGAGGCAAAUUUAAAAGAx 1434-1454 A-108653.1 UCUUUUAAAUUUGCCUCAGUUCA 1432-1454_G21A
AD-52980.1 A-108362.1 GGGCCAAAUUAAUGACAUAUUx 246-266 A-108363.1 AAUAUGUCAUUAAUUUGGCCCUU 244-266
AD-53109.1 A-108636.1 AUCCAUCCAACAGAUUCAGAAx 1402-1422 A-108637.1 UUCUGAAUCUGUUGGAUGGAUCA 1400-1422
AD-53141.1 A-108600.1 AAGAUUUGGUGUUUUCUACUUx 1181-1201 A-108601.1 AAGUAGAAAACACCAAAUCUUUG 1179-1201
AD-53126.1 A-108626.1 GUCUCAAAAUGGAAGGUUAUAx 1356-1376 A-108627.1 UAUAACCUUCCAUUUUGAGACUU 1354-1376
AD-53116.1 A-108654.1 ACUGAGGCAAAUUUAAAAGGAx 1435-1455 A-108655.1 UCCUUUUAAAUUUGCCUCAGUUC 1433-1455_C21A
AD-52997.1 A-108352.1 GGGACAUGGUCUUAAAGACUUx 210-230 A-108353.1 AAGUCUUUAAGACCAUGUCCCAA 208-230
AD-53120.1 A-108624.1 AUGGUAAAUAUAACAAACCAAx 1292-1312 A-108625.1 UUGGUUUGUUAUAUUUACCAUUU 1290-1312
AD-53070.1 A-108576.1 GGGAAAUCACGAAACCAACUAx 1104-1124 A-108577.1 UAGUUGGUUUCGUGAUUUCCCAA 1102-1124
AD-53028.1 A-108472.1 CCAACAGCAUAGUCAAAUAAAx 621-641 A-108473.1 UUUAUUUGACUAUGCUGUUGGUU 619-641
AD-53146.1 A-108602.1 UUUUCUACUUGGGAUCACAAAx 1192-1212 A-108603.1 UUUGUGAUCCCAAGUAGAAAACA 1190-1212
AD-52982.1 A-108394.1 AGAACUACAUAUAAACUACAAx 352-372 A-108395.1 UUGUAGUUUAUAUGUAGUUCUUC 350-372
AD-53111.1 A-108668.1 AGAGUAUGUGUAAAAAUCUGUx 1915-1935 A-108669.1 ACAGAUUUUUACACAUACUCUGU 1913-1935
AD-53045.1 A-108462.1 AAAACAAGAUAAUAGCAUCAAx 558-578 A-108463.1 UUGAUGCUAUUAUCUUGUUUUUC 556-578
AD-53123.1 A-108672.1 AGUAUGUGUAAAAAUCUGUAAx 1917-1937 A-108673.1 UUACAGAUUUUUACACAUACUCU 1915-1937
AD-53018.1 A-108406.1 AGUCAAAAAUGAAGAGGUAAAx 372-392 A-108407.1 UUUACCUCUUCAUUUUUGACUUG 370-392
AD-52956.1 A-108354.1 GGACAUGGUCUUAAAGACUUUx 211-231 A-108355.1 AAAGUCUUUAAGACCAUGUCCCA 209-231
AD-53134.1 A-108660.1 GAGGCAAAUUUAAAAGGCAAUx 1438-1458 A-108661.1 AUUGCCUUUUAAAUUUGCCUCAG 1436-1458
AD-52968.1 A-108358.1 GUCUUAAAGACUUUGUCCAUAx 218-238 A-108359.1 UAUGGACAAAGUCUUUAAGACCA 216-238
AD-53122.1 A-108656.1 CUGAGGCAAAUUUAAAAGGCAx 1436-1456 A-108657.1 UGCCUUUUAAAUUUGCCUCAGUU 1434-1456
AD-53100.1 A-108586.1 GCAAUCCCGGAAAACAAAGAUx 1165-1185 A-108587.1 AUCUUUGUUUUCCGGGAUUGCAU 1163-1185
AD-53128.1 A-108658.1 UGAGGCAAAUUUAAAAGGCAAx 1437-1457 A-108659.1 UUGCCUUUUAAAUUUGCCUCAGU 1435-1457
AD-53043.1 A-108430.1 UCUACUUCAACAAAAAGUGAAx 447-467 A-108431.1 UUCACUUUUUGUUGAAGUAGAAU 445-467
AD-53135.1 A-108676.1 UAUGUGUAAAAAUCUGUAAUAx 1919-1939 A-108677.1 UAUUACAGAUUUUUACACAUACU 1917-1939
AD-53094.1 A-108584.1 AAUGCAAUCCCGGAAAACAAAx 1162-1182 A-108585.1 UUUGUUUUCCGGGAUUGCAUUGG 1160-1182
AD-53019.1 A-108422.1 CUUGAAAGCCUCCUAGAAGAAx 421-441 A-108423.1 UUCUUCUAGGAGGCUUUCAAGUU 419-441
AD-53129.1 A-108674.1 GUAUGUGUAAAAAUCUGUAAUx 1918-1938 A-108675.1 AUUACAGAUUUUUACACAUACUC 1916-1938
AD-53150.1 A-108666.1 CAGAGUAUGUGUAAAAAUCUUx 1914-1934 A-108667.1 AAGAUUUUUACACAUACUCUGUG 1912-1934_G21U
AD-53117.1 A-108670.1 GAGUAUGUGUAAAAAUCUGUAx 1916-1936 A-108671.1 UACAGAUUUUUACACAUACUCUG 1914-1936
AD-52985.1 A-108348.1 UCAGUUGGGACAUGGUCUUAAx 204-224 A-108349.1 UUAAGACCAUGUCCCAACUGAAG 202-224
AD-52962.1 A-108356.1 GGUCUUAAAGACUUUGUCCAUx 217-237 A-108357.1 AUGGACAAAGUCUUUAAGACCAU 215-237
AD-52974.1 A-108360.1 UCUUAAAGACUUUGUCCAUAAx 219-239 A-108361.1 UUAUGGACAAAGUCUUUAAGACC 217-239
AD-52979.1 A-108346.1 UUCAGUUGGGACAUGGUCUUAx 203-223 A-108347.1 UAAGACCAUGUCCCAACUGAAGG 201-223
Символ "x" означает, что последовательность содержит конъюгат GalNac.
Таблица 8
Модифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3, конъюгированных с GalNac
ID дуплекса Название смыслового олиго Смысловая последовательность (SEQ ID NO:634-818, соответственно, в порядке появления) Название антисмыслового олиго Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:819-1003, соответственно, в порядке появления)
AD-53063.1 A-108558.1 AfaAfgAfcAfaCfAfAfaCfaUfuAfuAfuUfL96 A-108559.1 aAfuAfuAfaUfgUfuugUfuGfuCfuUfusCfsc
AD-52965.1 A-108310.1 AfcAfaUfuAfaGfCfUfcCfuUfcUfuUfuUfL96 A-108311.1 aAfaAfaGfaAfgGfagcUfuAfaUfuGfusGfsa
AD-53030.1 A-108410.1 UfgUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAfL96 A-108411.1 uUfgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasUfsa
AD-52953.1 A-108306.1 UfcAfcAfaUfuAfAfGfcUfcCfuUfcUfuUfL96 A-108307.1 aAfaGfaAfgGfaGfcuuAfaUfuGfuGfasAfsc
AD-53001.1 A-108416.1 CfuUfgAfaCfuCfAfAfcUfcAfaAfaCfuUfL96 A-108417.1 aAfgUfuUfuGfaGfuugAfgUfuCfaAfgsUfsg
AD-53080.1 A-108548.1 CfuCfcAfuAfgUfGfAfaGfcAfaUfcUfaAfL96 A-108549.1 uUfaGfaUfuGfcUfucaCfuAfuGfgAfgsUfsa
AD-52971.1 A-108312.1 CfaAfuUfaAfgCfUfCfcUfuCfuUfuUfuAfL96 A-108313.1 uAfaAfaAfgAfaGfgagCfuUfaAfuUfgsUfsg
AD-53071.1 A-108498.1 AfcCfcAfgCfaAfCfUfcUfcAfaGfuUfuUfL96 A-108499.1 aAfaAfcUfuGfaGfaguUfgCfuGfgGfusCfsu
AD-53024.1 A-108408.1 GfaAfuAfuGfuCfAfCfuUfgAfaCfuCfaAfL96 A-108409.1 uUfgAfgUfuCfaAfgugAfcAfuAfuUfcsUfsu
AD-52977.1 A-108314.1 AfaUfuAfaGfcUfCfCfuUfcUfuUfuUfaUfL96 A-108315.1 aUfaAfaAfaGfaAfggaGfcUfuAfaUfusGfsu
AD-53064.1 A-108574.1 CfaUfuAfuAfuUfGfAfaUfaUfuCfuUfuUfL96 A-108575.1 aAfaAfgAfaUfaUfucaAfuAfuAfaUfgsUfsu
AD-53033.1 A-108458.1 AfcUfaAfcUfaAfCfUfuAfaUfuCfaAfaAfL96 A-108459.1 uUfuUfgAfaUfuAfaguUfaGfuUfaGfusUfsg
AD-52954.1 A-108322.1 UfuAfuUfgUfuCfCfUfcUfaGfuUfaUfuUfL96 A-108323.1 aAfaUfaAfcUfaGfaggAfaCfaAfuAfasAfsa
AD-53098.1 A-108554.1 CfaUfaGfuGfaAfGfCfaAfuCfuAfaUfuAfL96 A-108555.1 uAfaUfuAfgAfuUfgcuUfcAfcUfaUfgsGfsa
AD-53092.1 A-108552.1 CfcAfuAfgUfgAfAfGfcAfaUfcUfaAfuUfL96 A-108553.1 aAfuUfaGfaUfuGfcuuCfaCfuAfuGfgsAfsg
AD-53073.1 A-108530.1 GfaUfcAfcAfaAfAfCfuUfcAfaUfgAfaAfL96 A-108531.1 uUfuCfaUfuGfaAfguuUfuGfuGfaUfcsCfsa
AD-53132.1 A-108628.1 AfuGfgAfaGfgUfUfAfuAfcUfcUfaUfaAfL96 A-108629.1 uUfaUfaGfaGfuAfuaaCfcUfuCfcAfusUfsu
AD-53086.1 A-108550.1 UfcCfaUfaGfuGfAfAfgCfaAfuCfuAfaUfL96 A-108551.1 aUfuAfgAfuUfgCfuucAfcUfaUfgGfasGfsu
AD-52961.1 A-108340.1 CfuAfuGfuUfaGfAfCfgAfuGfuAfaAfaAfL96 A-108341.1 uUfuUfuAfcAfuCfgucUfaAfcAfuAfgsCfsa
AD-52983.1 A-108316.1 AfuUfaAfgCfuCfCfUfuCfuUfuUfuAfuUfL96 A-108317.1 aAfuAfaAfaAfgAfaggAfgCfuUfaAfusUfsg
AD-53027.1 A-108456.1 AfaCfuAfaCfuAfAfCfuUfaAfuUfcAfaAfL96 A-108457.1 uUfuGfaAfuUfaAfguuAfgUfuAfgUfusGfsc
AD-52986.1 A-108364.1 GfgCfcAfaAfuUfAfAfuGfaCfaUfaUfuUfL96 A-108365.1 aAfaUfaUfgUfcAfuuaAfuUfuGfgCfcsCfsu
AD-52989.1 A-108318.1 UfuUfuAfuUfgUfUfCfcUfcUfaGfuUfaUfL96 A-108319.1 aUfaAfcUfaGfaGfgaaCfaAfuAfaAfasAfsg
AD-52981.1 A-108378.1 AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 A-108379.1 aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg
AD-53077.1 A-108500.1 CfcCfaGfcAfaCfUfCfuCfaAfgUfuUfuUfL96 A-108501.1 aAfaAfaCfuUfgAfgagUfuGfcUfgGfgsUfsc
AD-53095.1 A-108506.1 CfaGfgUfaGfuCfCfAfuGfgAfcAfuUfaAfL96 A-108507.1 uUfaAfuGfuCfcAfuggAfcUfaCfcUfgsAfsu
AD-52970.1 A-108390.1 AfcUfgAfgAfaGfAfAfcUfaCfaUfaUfaAfL96 A-108391.1 uUfaUfaUfgUfaGfuucUfuCfuCfaGfusUfsc
AD-53015.1 A-108452.1 GfaGfcAfaCfuAfAfCfuAfaCfuUfaAfuUfL96 A-108453.1 aAfuUfaAfgUfuAfguuAfgUfuGfcUfcsUfsu
AD-53147.1 A-108618.1 AfaCfaAfcCfuAfAfAfuGfgUfaAfaUfaUfL96 A-108619.1 aUfaUfuUfaCfcAfuuuAfgGfuUfgUfusUfsu
AD-53103.1 A-108540.1 CfcUfaGfaGfaAfGfAfuAfuAfcUfcCfaUfL96 A-108541.1 aUfgGfaGfuAfuAfucuUfcUfcUfaGfgsCfsc
AD-52969.1 A-108374.1 CfaAfcAfuAfuUfUfGfaUfcAfgUfcUfuUfL96 A-108375.1 aAfaGfaCfuGfaUfcaaAfuAfuGfuUfgsAfsg
AD-53075.1 A-108562.1 AfcAfaCfaAfaCfAfUfuAfuAfuUfgAfaUfL96 A-108563.1 aUfuCfaAfuAfuAfaugUfuUfgUfuGfusCfsu
AD-52994.1 A-108398.1 AfcAfuAfuAfaAfCfUfaCfaAfgUfcAfaAfL96 A-108399.1 uUfuGfaCfuUfgUfaguUfuAfuAfuGfusAfsg
AD-52960.1 A-108324.1 CfuAfgUfuAfuUfUfCfcUfcCfaGfaAfuUfL96 A-108325.1 aAfuUfcUfgGfaGfgaaAfuAfaCfuAfgsAfsg
AD-53003.1 A-108448.1 AfaGfaGfcAfaCfUfAfaCfuAfaCfuUfaAfL96 A-108449.1 uUfaAfgUfuAfgUfuagUfuGfcUfcUfusCfsu
AD-52995.1 A-108320.1 UfuUfaUfuGfuUfCfCfuCfuAfgUfuAfuUfL96 A-108321.1 aAfuAfaCfuAfgAfggaAfcAfaUfaAfasAfsa
AD-53037.1 A-108428.1 CfuCfcUfaGfaAfGfAfaAfaAfaUfuCfuAfL96 A-108429.1 uAfgAfaUfuUfuUfucuUfcUfaGfgAfgsGfsc
AD-53087.1 A-108566.1 AfaCfaAfaCfaUfUfAfuAfuUfgAfaUfaUfL96 A-108567.1 aUfaUfuCfaAfuAfuaaUfgUfuUfgUfusGfsu
AD-53076.1 A-108578.1 GfgAfaAfuCfaCfGfAfaAfcCfaAfcUfaUfL96 A-108579.1 aUfaGfuUfgGfuUfucgUfgAfuUfuCfcsCfsa
AD-52975.1 A-108376.1 AfaCfaUfaUfuUfGfAfuCfaGfuCfuUfuUfL96 A-108377.1 aAfaAfgAfcUfgAfucaAfaUfaUfgUfusGfsa
AD-53138.1 A-108630.1 UfgGfaAfgGfuUfAfUfaCfuCfuAfuAfaAfL96 A-108631.1 uUfuAfuAfgAfgUfauaAfcCfuUfcCfasUfsu
AD-53091.1 A-108536.1 GfgAfgAfaCfuAfCfAfaAfuAfuGfgUfuUfL96 A-108537.1 aAfaCfcAfuAfuUfuguAfgUfuCfuCfcsCfsa
AD-53124.1 A-108594.1 GfaAfaAfcAfaAfGfAfuUfuGfgUfgUfuUfL96 A-108595.1 aAfaCfaCfcAfaAfucuUfuGfuUfuUfcsCfsg
AD-53125.1 A-108610.1 AfgUfgUfgGfaGfAfAfaAfcAfaCfcUfaAfL96 A-108611.1 uUfaGfgUfuGfuUfuucUfcCfaCfaCfusCfsa
AD-53036.1 A-108412.1 GfuCfaCfuUfgAfAfCfuCfaAfcUfcAfaAfL96 A-108413.1 uUfuGfaGfuUfgAfguuCfaAfgUfgAfcsAfsu
AD-53061.1 A-108526.1 GfaUfgGfaUfcAfCfAfaAfaCfuUfcAfaUfL96 A-108527.1 aUfuGfaAfgUfuUfuguGfaUfcCfaUfcsUfsa
AD-53093.1 A-108568.1 AfcAfaAfcAfuUfAfUfaUfuGfaAfuAfuUfL96 A-108569.1 aAfuAfuUfcAfaUfauaAfuGfuUfuGfusUfsg
AD-53137.1 A-108614.1 UfgUfgGfaGfaAfAfAfcAfaCfcUfaAfaUfL96 A-108615.1 aUfuUfaGfgUfuGfuuuUfcUfcCfaCfasCfsu
AD-52999.1 A-108384.1 AfuCfaGfuCfuUfUfUfuAfuGfaUfcUfaUfL96 A-108385.1 aUfaGfaUfcAfuAfaaaAfgAfcUfgAfusCfsa
AD-53069.1 A-108560.1 GfaCfaAfcAfaAfCfAfuUfaUfaUfuGfaAfL96 A-108561.1 uUfcAfaUfaUfaAfuguUfuGfuUfgUfcsUfsu
AD-53034.1 A-108474.1 CfaAfcAfgCfaUfAfGfuCfaAfaUfaAfaAfL96 A-108475.1 uUfuUfaUfuUfgAfcuaUfgCfuGfuUfgsGfsu
AD-52976.1 A-108392.1 CfuGfaGfaAfgAfAfCfuAfcAfuAfuAfaAfL96 A-108393.1 uUfuAfuAfuGfuAfguuCfuUfcUfcAfgsUfsu
AD-52996.1 A-108336.1 UfgCfuAfuGfuUfAfGfaCfgAfuGfuAfaAfL96 A-108337.1 uUfuAfcAfuCfgUfcuaAfcAfuAfgCfasAfsa
AD-53029.1 A-108488.1 AfaCfcCfaCfaGfAfAfaUfuUfcUfcUfaUfL96 A-108489.1 aUfaGfaGfaAfaUfuucUfgUfgGfgUfusCfsu
AD-53020.1 A-108438.1 CfuUfcAfaCfaAfAfAfaGfuGfaAfaUfaUfL96 A-108439.1 aUfaUfuUfcAfcUfuuuUfgUfuGfaAfgsUfsa
AD-53042.1 A-108414.1 UfcAfcUfuGfaAfCfUfcAfaCfuCfaAfaAfL96 A-108415.1 uUfuUfgAfgUfuGfaguUfcAfaGfuGfasCfsa
AD-53011.1 A-108482.1 CfaUfaGfuCfaAfAfUfaAfaAfgAfaAfuAfL96 A-108483.1 uAfuUfuCfuUfuUfauuUfgAfcUfaUfgsCfsu
AD-52957.1 A-108370.1 CfaAfaAfaCfuCfAfAfcAfuAfuUfuGfaUfL96 A-108371.1 aUfcAfaAfuAfuGfuugAfgUfuUfuUfgsAfsa
AD-53008.1 A-108434.1 UfaCfuUfcAfaCfAfAfaAfaGfuGfaAfaUfL96 A-108435.1 aUfuUfcAfcUfuUfuugUfuGfaAfgUfasGfsa
AD-53065.1 A-108496.1 GfaCfcCfaGfcAfAfCfuCfuCfaAfgUfuUfL96 A-108497.1 aAfaCfuUfgAfgAfguuGfcUfgGfgUfcsUfsg
AD-53115.1 A-108638.1 UfuGfaAfuGfaAfCfUfgAfgGfcAfaAfuUfL96 A-108639.1 aAfuUfuGfcCfuCfaguUfcAfuUfcAfasAfsg
AD-53012.1 A-108404.1 UfaUfaAfaCfuAfCfAfaGfuCfaAfaAfaUfL96 A-108405.1 aUfuUfuUfgAfcUfuguAfgUfuUfaUfasUfsg
AD-53004.1 A-108464.1 AfaAfcAfaGfaUfAfAfuAfgCfaUfcAfaAfL96 A-108465.1 uUfuGfaUfgCfuAfuuaUfcUfuGfuUfusUfsu
AD-53021.1 A-108454.1 CfaAfcUfaAfcUfAfAfcUfuAfaUfuCfaAfL96 A-108455.1 uUfgAfaUfuAfaGfuuaGfuUfaGfuUfgsCfsu
AD-52955.1 A-108338.1 GfcUfaUfgUfuAfGfAfcGfaUfgUfaAfaAfL96 A-108339.1 uUfuUfaCfaUfcGfucuAfaCfaUfaGfcsAfsa
AD-53119.1 A-108608.1 AfcUfuGfgGfaUfCfAfcAfaAfgCfaAfaAfL96 A-108609.1 uUfuUfgCfuUfuGfugaUfcCfcAfaGfusAfsg
AD-52990.1 A-108334.1 UfuGfcUfaUfgUfUfAfgAfcGfaUfgUfaAfL96 A-108335.1 uUfaCfaUfcGfuCfuaaCfaUfaGfcAfasAfsu
AD-52964.1 A-108388.1 AfaCfuGfaGfaAfGfAfaCfuAfcAfuAfuAfL96 A-108389.1 uAfuAfuGfuAfgUfucuUfcUfcAfgUfusCfsc
AD-52973.1 A-108344.1 GfaUfgUfaAfaAfAfUfuUfuAfgCfcAfaUfL96 A-108345.1 aUfuGfgCfuAfaAfauuUfuUfaCfaUfcsGfsu
AD-53074.1 A-108546.1 AfcUfcCfaUfaGfUfGfaAfgCfaAfuCfuAfL96 A-108547.1 uAfgAfuUfgCfuUfcacUfaUfgGfaGfusAfsu
AD-53026.1 A-108440.1 UfuCfaAfcAfaAfAfAfgUfgAfaAfuAfuUfL96 A-108441.1 aAfuAfuUfuCfaCfuuuUfuGfuUfgAfasGfsu
AD-53062.1 A-108542.1 CfuAfgAfgAfaGfAfUfaUfaCfuCfcAfuAfL96 A-108543.1 uAfuGfgAfgUfaUfaucUfuCfuCfuAfgsGfsc
AD-53114.1 A-108622.1 CfaAfcCfuAfaAfUfGfgUfaAfaUfaUfaAfL96 A-108623.1 uUfaUfaUfuUfaCfcauUfuAfgGfuUfgsUfsu
AD-53082.1 A-108580.1 GfaAfaUfcAfcGfAfAfaCfcAfaCfuAfuAfL96 A-108581.1 uAfuAfgUfuGfgUfuucGfuGfaUfuUfcsCfsc
AD-53035.1 A-108490.1 CfcAfcAfgAfaAfUfUfuCfuCfuAfuCfuUfL96 A-108491.1 aAfgAfuAfgAfgAfaauUfuCfuGfuGfgsGfsu
AD-52978.1 A-108330.1 AfaAfuCfaAfgAfUfUfuGfcUfaUfgUfuAfL96 A-108331.1 uAfaCfaUfaGfcAfaauCfuUfgAfuUfusUfsg
AD-53084.1 A-108518.1 AfcAfuUfaAfuUfCfAfaCfaUfcGfaAfuAfL96 A-108519.1 uAfuUfcGfaUfgUfugaAfuUfaAfuGfusCfsc
AD-52972.1 A-108328.1 CfcAfgAfgCfcAfAfAfaUfcAfaGfaUfuUfL96 A-108329.1 aAfaUfcUfuGfaUfuuuGfgCfuCfuGfgsAfsg
AD-53002.1 A-108432.1 CfuAfcUfuCfaAfCfAfaAfaAfgUfgAfaAfL96 A-108433.1 uUfuCfaCfuUfuUfuguUfgAfaGfuAfgsAfsa
AD-53078.1 A-108516.1 GfaCfaUfuAfaUfUfCfaAfcAfuCfgAfaUfL96 A-108517.1 aUfuCfgAfuGfuUfgaaUfuAfaUfgUfcsCfsa
AD-53072.1 A-108514.1 GfgAfcAfuUfaAfUfUfcAfaCfaUfcGfaAfL96 A-108515.1 uUfcGfaUfgUfuGfaauUfaAfuGfuCfcsAfsu
AD-53005.1 A-108480.1 GfcAfuAfgUfcAfAfAfuAfaAfaGfaAfaUfL96 A-108481.1 aUfuUfcUfuUfuAfuuuGfaCfuAfuGfcsUfsg
AD-53083.1 A-108502.1 CfuCfuCfaAfgUfUfUfuUfcAfuGfuCfuAfL96 A-108503.1 uAfgAfcAfuGfaAfaaaCfuUfgAfgAfgsUfsu
AD-53102.1 A-108524.1 AfuCfgAfaUfaGfAfUfgGfaUfcAfcAfaAfL96 A-108525.1 uUfuGfuGfaUfcCfaucUfaUfuCfgAfusGfsu
AD-53105.1 A-108572.1 AfcAfuUfaUfaUfUfGfaAfuAfuUfcUfuUfL96 A-108573.1 aAfaGfaAfuAfuUfcaaUfaUfaAfuGfusUfsu
AD-53090.1 A-108520.1 UfuAfaUfuCfaAfCfAfuCfgAfaUfaGfaUfL96 A-108521.1 aUfcUfaUfuCfgAfuguUfgAfaUfuAfasUfsg
AD-53010.1 A-108466.1 GfaUfaAfuAfgCfAfUfcAfaAfgAfcCfuUfL96 A-108467.1 aAfgGfuCfuUfuGfaugCfuAfuUfaUfcsUfsu
AD-52998.1 A-108368.1 UfgAfcAfuAfuUfUfCfaAfaAfaCfuCfaAfL96 A-108369.1 uUfgAfgUfuUfuUfgaaAfuAfuGfuCfasUfsu
AD-52992.1 A-108366.1 AfaAfuUfaAfuGfAfCfaUfaUfuUfcAfaAfL96 A-108367.1 uUfuGfaAfaUfaUfgucAfuUfaAfuUfusGfsg
AD-53068.1 A-108544.1 GfaAfgAfuAfuAfCfUfcCfaUfaGfuGfaAfL96 A-108545.1 uUfcAfcUfaUfgGfaguAfuAfuCfuUfcsUfsc
AD-53032.1 A-108442.1 AfaUfaUfuUfaGfAfAfgAfgCfaAfcUfaAfL96 A-108443.1 uUfaGfuUfgCfuCfuucUfaAfaUfaUfusUfsc
AD-52967.1 A-108342.1 CfgAfuGfuAfaAfAfAfuUfuUfaGfcCfaAfL96 A-108343.1 uUfgGfcUfaAfaAfuuuUfuAfcAfuCfgsUfsc
AD-53096.1 A-108522.1 UfuCfaAfcAfuCfGfAfaUfaGfaUfgGfaUfL96 A-108523.1 aUfcCfaUfcUfaUfucgAfuGfuUfgAfasUfsu
AD-53131.1 A-108612.1 GfuGfuGfgAfgAfAfAfaCfaAfcCfuAfaAfL96 A-108613.1 uUfuAfgGfuUfgUfuuuCfuCfcAfcAfcsUfsc
AD-52963.1 A-108372.1 UfcAfaCfaUfaUfUfUfgAfuCfaGfuCfuUfL96 A-108373.1 aAfgAfcUfgAfuCfaaaUfaUfgUfuGfasGfsu
AD-53089.1 A-108504.1 UfcAfgGfuAfgUfCfCfaUfgGfaCfaUfuAfL96 A-108505.1 uAfaUfgUfcCfaUfggaCfuAfcCfuGfasUfsa
AD-53044.1 A-108446.1 UfuUfaGfaAfgAfGfCfaAfcUfaAfcUfaAfL96 A-108447.1 uUfaGfuUfaGfuUfgcuCfuUfcUfaAfasUfsa
AD-52988.1 A-108396.1 UfaCfaUfaUfaAfAfCfuAfcAfaGfuCfaAfL96 A-108397.1 uUfgAfcUfuGfuAfguuUfaUfaUfgUfasGfsu
AD-53067.1 A-108528.1 GfgAfuCfaCfaAfAfAfcUfuCfaAfuGfaAfL96 A-108529.1 uUfcAfuUfgAfaGfuuuUfgUfgAfuCfcsAfsu
AD-53009.1 A-108450.1 AfgAfgCfaAfcUfAfAfcUfaAfcUfuAfaUfL96 A-108451.1 aUfuAfaGfuUfaGfuuaGfuUfgCfuCfusUfsc
AD-53022.1 A-108470.1 AfcCfaAfcAfgCfAfUfaGfuCfaAfaUfaAfL96 A-108471.1 uUfaUfuUfgAfcUfaugCfuGfuUfgGfusUfsu
AD-53016.1 A-108468.1 AfaCfcAfaCfaGfCfAfuAfgUfcAfaAfuAfL96 A-108469.1 uAfuUfuGfaCfuAfugcUfgUfuGfgUfusUfsa
AD-53007.1 A-108418.1 GfaAfcUfcAfaCfUfCfaAfaAfcUfuGfaAfL96 A-108419.1 uUfcAfaGfuUfuUfgagUfuGfaGfuUfcsAfsa
AD-53148.1 A-108634.1 UfaCfuCfuAfuAfAfAfaUfcAfaCfcAfaAfL96 A-108635.1 uUfuGfgUfuGfaUfuuuAfuAfgAfgUfasUfsa
AD-53040.1 A-108476.1 CfaGfcAfuAfgUfCfAfaAfuAfaAfaGfaAfL96 A-108477.1 uUfcUfuUfuAfuUfugaCfuAfuGfcUfgsUfsu
AD-53041.1 A-108492.1 GfaAfaUfaAfgAfAfAfuGfuAfaAfaCfaUfL96 A-108493.1 aUfgUfuUfuAfcAfuuuCfuUfaUfuUfcsAfsu
AD-53039.1 A-108460.1 CfuAfaCfuAfaCfUfUfaAfuUfcAfaAfaUfL96 A-108461.1 aUfuUfuGfaAfuUfaagUfuAfgUfuAfgsUfsu
AD-53139.1 A-108646.1 AfuGfaAfcUfgAfGfGfcAfaAfuUfuAfaAfL96 A-108647.1 uUfuAfaAfuUfuGfccuCfaGfuUfcAfusUfsc
AD-53144.1 A-108648.1 UfgAfaCfuGfaGfGfCfaAfaUfuUfaAfaAfL96 A-108649.1 uUfuUfaAfaUfuUfgccUfcAfgUfuCfasUfsu
AD-53142.1 A-108616.1 AfaAfcAfaCfcUfAfAfaUfgGfuAfaAfuAfL96 A-108617.1 uAfuUfuAfcCfaUfuuaGfgUfuGfuUfusUfsc
AD-53108.1 A-108620.1 AfcAfaCfcUfaAfAfUfgGfuAfaAfuAfuAfL96 A-108621.1 uAfuAfuUfuAfcCfauuUfaGfgUfuGfusUfsu
AD-53079.1 A-108532.1 AfaCfgUfgGfgAfGfAfaCfuAfcAfaAfuAfL96 A-108533.1 uAfuUfuGfuAfgUfucuCfcCfaCfgUfusUfsc
AD-53133.1 A-108644.1 AfaUfgAfaCfuGfAfGfgCfaAfaUfuUfaAfL96 A-108645.1 uUfaAfaUfuUfgCfcucAfgUfuCfaUfusCfsa
AD-53104.1 A-108556.1 GfuUfgGfaAfgAfCfUfgGfaAfaGfaCfaAfL96 A-108557.1 uUfgUfcUfuUfcCfaguCfuUfcCfaAfcsUfsc
AD-53088.1 A-108582.1 UfgGfcAfaUfgUfCfCfcCfaAfuGfcAfaUfL96 A-108583.1 aUfuGfcAfuUfgGfggaCfaUfuGfcCfasGfsu
AD-53101.1 A-108508.1 GfgUfaGfuCfcAfUfGfgAfcAfuUfaAfuUfL96 A-108509.1 aAfuUfaAfuGfuCfcauGfgAfcUfaCfcsUfsg
AD-53000.1 A-108400.1 CfaUfaUfaAfaCfUfAfcAfaGfuCfaAfaAfL96 A-108401.1 uUfuUfgAfcUfuGfuagUfuUfaUfaUfgsUfsa
AD-53112.1 A-108590.1 AfaUfcCfcGfgAfAfAfaCfaAfaGfaUfuUfL96 A-108591.1 aAfaUfcUfuUfgUfuuuCfcGfgGfaUfusGfsc
AD-53107.1 A-108604.1 CfuAfcUfuGfgGfAfUfcAfcAfaAfgCfaAfL96 A-108605.1 uUfgCfuUfuGfuGfaucCfcAfaGfuAfgsAfsa
AD-53121.1 A-108640.1 UfgAfaUfgAfaCfUfGfaGfgCfaAfaUfuUfL96 A-108641.1 aAfaUfuUfgCfcUfcagUfuCfaUfuCfasAfsa
AD-53046.1 A-108478.1 AfgCfaUfaGfuCfAfAfaUfaAfaAfgAfaAfL96 A-108479.1 uUfuCfuUfuUfaUfuugAfcUfaUfgCfusGfsu
AD-53038.1 A-108444.1 AfuUfuAfgAfaGfAfGfcAfaCfuAfaCfuAfL96 A-108445.1 uAfgUfuAfgUfuGfcucUfuCfuAfaAfusAfsu
AD-53140.1 A-108662.1 AfgGfcAfaAfuUfUfAfaAfaGfgCfaAfuAfL96 A-108663.1 uAfuUfgCfcUfuUfuaaAfuUfuGfcCfusCfsa
AD-52987.1 A-108380.1 CfaUfaUfuUfgAfUfCfaGfuCfuUfuUfuAfL96 A-108381.1 uAfaAfaAfgAfcUfgauCfaAfaUfaUfgsUfsu
AD-53130.1 A-108596.1 AfaAfaCfaAfaGfAfUfuUfgGfuGfuUfuUfL96 A-108597.1 aAfaAfcAfcCfaAfaucUfuUfgUfuUfusCfsc
AD-53106.1 A-108588.1 CfaAfuCfcCfgGfAfAfaAfcAfaAfgAfuUfL96 A-108589.1 aAfuCfuUfuGfuUfuucCfgGfgAfuUfgsCfsa
AD-53081.1 A-108564.1 CfaAfcAfaAfcAfUfUfaUfaUfuGfaAfuAfL96 A-108565.1 uAfuUfcAfaUfaUfaauGfuUfuGfuUfgsUfsc
AD-53118.1 A-108592.1 GfgAfaAfaCfaAfAfGfaUfuUfgGfuGfuUfL96 A-108593.1 aAfcAfcCfaAfaUfcuuUfgUfuUfuCfcsGfsg
AD-53136.1 A-108598.1 AfcAfaAfgAfuUfUfGfgUfgUfuUfuCfuAfL96 A-108599.1 uAfgAfaAfaCfaCfcaaAfuCfuUfuGfusUfsu
AD-53127.1 A-108642.1 GfaAfuGfaAfcUfGfAfgGfcAfaAfuUfuAfL96 A-108643.1 uAfaAfuUfuGfcCfucaGfuUfcAfuUfcsAfsa
AD-53066.1 A-108512.1 CfcAfuGfgAfcAfUfUfaAfuUfcAfaCfaUfL96 A-108513.1 aUfgUfuGfaAfuUfaauGfuCfcAfuGfgsAfsc
AD-53013.1 A-108420.1 AfaCfuCfaAfcUfCfAfaAfaCfuUfgAfaAfL96 A-108421.1 uUfuCfaAfgUfuUfugaGfuUfgAfgUfusCfsa
AD-52991.1 A-108350.1 CfaGfuUfgGfgAfCfAfuGfgUfcUfuAfaAfL96 A-108351.1 uUfuAfaGfaCfcAfuguCfcCfaAfcUfgsAfsa
AD-53099.1 A-108570.1 AfaCfaUfuAfuAfUfUfgAfaUfaUfuCfuUfL96 A-108571.1 aAfgAfaUfaUfuCfaauAfuAfaUfgUfusUfsg
AD-52958.1 A-108386.1 AfcCfaGfuGfaAfAfUfcAfaAfgAfaGfaAfL96 A-108387.1 uUfcUfuCfuUfuGfauuUfcAfcUfgGfusUfsu
AD-53097.1 A-108538.1 GfuUfgGfgCfcUfAfGfaGfaAfgAfuAfuAfL96 A-108539.1 uAfuAfuCfuUfcUfcuaGfgCfcCfaAfcsCfsa
AD-52966.1 A-108326.1 CfuCfcAfgAfgCfCfAfaAfaUfcAfaGfaUfL96 A-108327.1 aUfcUfuGfaUfuUfuggCfuCfuGfgAfgsAfsu
AD-53145.1 A-108664.1 GfgCfaAfaUfuUfAfAfaAfgGfcAfaUfaAfL96 A-108665.1 uUfaUfuGfcCfuUfuuaAfaUfuUfgCfcsUfsc
AD-53113.1 A-108606.1 UfaCfuUfgGfgAfUfCfaCfaAfaGfcAfaAfL96 A-108607.1 uUfuGfcUfuUfgUfgauCfcCfaAfgUfasGfsa
AD-52993.1 A-108382.1 GfaUfcAfgUfcUfUfUfuUfaUfgAfuCfuAfL96 A-108383.1 uAfgAfuCfaUfaAfaaaGfaCfuGfaUfcsAfsa
AD-53031.1 A-108426.1 GfaAfaGfcCfuCfCfUfaGfaAfgAfaAfaAfL96 A-108427.1 uUfuUfuCfuUfcUfaggAfgGfcUfuUfcsAfsa
AD-53017.1 A-108484.1 AfgUfcAfaAfuAfAfAfaGfaAfaUfaGfaAfL96 A-108485.1 uUfcUfaUfuUfcUfuuuAfuUfuGfaCfusAfsu
AD-53143.1 A-108632.1 AfuAfcUfcUfaUfAfAfaAfuCfaAfcCfaAfL96 A-108633.1 uUfgGfuUfgAfuUfuuaUfaGfaGfuAfusAfsa
AD-53149.1 A-108650.1 GfaAfcUfgAfgGfCfAfaAfuUfuAfaAfaAfL96 A-108651.1 uUfuUfuAfaAfuUfugcCfuCfaGfuUfcsAfsu
AD-53059.1 A-108494.1 AfgAfcCfcAfgCfAfAfcUfcUfcAfaGfuUfL96 A-108495.1 aAfcUfuGfaGfaGfuugCfuGfgGfuCfusGfsa
AD-53006.1 A-108402.1 AfuAfuAfaAfcUfAfCfaAfgUfcAfaAfaAfL96 A-108403.1 uUfuUfuGfaCfuUfguaGfuUfuAfuAfusGfsu
AD-53025.1 A-108424.1 UfgAfaAfgCfcUfCfCfuAfgAfaGfaAfaAfL96 A-108425.1 uUfuUfcUfuCfuAfggaGfgCfuUfuCfasAfsg
AD-53085.1 A-108534.1 GfgGfaGfaAfcUfAfCfaAfaUfaUfgGfuUfL96 A-108535.1 aAfcCfaUfaUfuUfguaGfuUfcUfcCfcsAfsc
AD-52984.1 A-108332.1 AfgAfuUfuGfcUfAfUfgUfuAfgAfcGfaUfL96 A-108333.1 aUfcGfuCfuAfaCfauaGfcAfaAfuCfusUfsg
AD-53023.1 A-108486.1 GfaAfcCfcAfcAfGfAfaAfuUfuCfuCfuAfL96 A-108487.1 uAfgAfgAfaAfuUfucuGfuGfgGfuUfcsUfsu
AD-53014.1 A-108436.1 AfcUfuCfaAfcAfAfAfaAfgUfgAfaAfuAfL96 A-108437.1 uAfuUfuCfaCfuUfuuuGfuUfgAfaGfusAfsg
AD-53060.1 A-108510.1 AfgUfcCfaUfgGfAfCfaUfuAfaUfuCfaAfL96 A-108511.1 uUfgAfaUfuAfaUfgucCfaUfgGfaCfusAfsc
AD-53110.1 A-108652.1 AfaCfuGfaGfgCfAfAfaUfuUfaAfaAfgAfL96 A-108653.1 uCfuUfuUfaAfaUfuugCfcUfcAfgUfusCfsa
AD-52980.1 A-108362.1 GfgGfcCfaAfaUfUfAfaUfgAfcAfuAfuUfL96 A-108363.1 aAfuAfuGfuCfaUfuaaUfuUfgGfcCfcsUfsu
AD-53109.1 A-108636.1 AfuCfcAfuCfcAfAfCfaGfaUfuCfaGfaAfL96 A-108637.1 uUfcUfgAfaUfcUfguuGfgAfuGfgAfusCfsa
AD-53141.1 A-108600.1 AfaGfaUfuUfgGfUfGfuUfuUfcUfaCfuUfL96 A-108601.1 aAfgUfaGfaAfaAfcacCfaAfaUfcUfusUfsg
AD-53126.1 A-108626.1 GfuCfuCfaAfaAfUfGfgAfaGfgUfuAfuAfL96 A-108627.1 uAfuAfaCfcUfuCfcauUfuUfgAfgAfcsUfsu
AD-53116.1 A-108654.1 AfcUfgAfgGfcAfAfAfuUfuAfaAfaGfgAfL96 A-108655.1 uCfcUfuUfuAfaAfuuuGfcCfuCfaGfusUfsc
AD-52997.1 A-108352.1 GfgGfaCfaUfgGfUfCfuUfaAfaGfaCfuUfL96 A-108353.1 aAfgUfcUfuUfaAfgacCfaUfgUfcCfcsAfsa
AD-53120.1 A-108624.1 AfuGfgUfaAfaUfAfUfaAfcAfaAfcCfaAfL96 A-108625.1 uUfgGfuUfuGfuUfauaUfuUfaCfcAfusUfsu
AD-53070.1 A-108576.1 GfgGfaAfaUfcAfCfGfaAfaCfcAfaCfuAfL96 A-108577.1 uAfgUfuGfgUfuUfcguGfaUfuUfcCfcsAfsa
AD-53028.1 A-108472.1 CfcAfaCfaGfcAfUfAfgUfcAfaAfuAfaAfL96 A-108473.1 uUfuAfuUfuGfaCfuauGfcUfgUfuGfgsUfsu
AD-53146.1 A-108602.1 UfuUfuCfuAfcUfUfGfgGfaUfcAfcAfaAfL96 A-108603.1 uUfuGfuGfaUfcCfcaaGfuAfgAfaAfasCfsa
AD-52982.1 A-108394.1 AfgAfaCfuAfcAfUfAfuAfaAfcUfaCfaAfL96 A-108395.1 uUfgUfaGfuUfuAfuauGfuAfgUfuCfusUfsc
AD-53111.1 A-108668.1 AfgAfgUfaUfgUfGfUfaAfaAfaUfcUfgUfL96 A-108669.1 aCfaGfaUfuUfuUfacaCfaUfaCfuCfusGfsu
AD-53045.1 A-108462.1 AfaAfaCfaAfgAfUfAfaUfaGfcAfuCfaAfL96 A-108463.1 uUfgAfuGfcUfaUfuauCfuUfgUfuUfusUfsc
AD-53123.1 A-108672.1 AfgUfaUfgUfgUfAfAfaAfaUfcUfgUfaAfL96 A-108673.1 uUfaCfaGfaUfuUfuuaCfaCfaUfaCfusCfsu
AD-53018.1 A-108406.1 AfgUfcAfaAfaAfUfGfaAfgAfgGfuAfaAfL96 A-108407.1 uUfuAfcCfuCfuUfcauUfuUfuGfaCfusUfsg
AD-52956.1 A-108354.1 GfgAfcAfuGfgUfCfUfuAfaAfgAfcUfuUfL96 A-108355.1 aAfaGfuCfuUfuAfagaCfcAfuGfuCfcsCfsa
AD-53134.1 A-108660.1 GfaGfgCfaAfaUfUfUfaAfaAfgGfcAfaUfL96 A-108661.1 aUfuGfcCfuUfuUfaaaUfuUfgCfcUfcsAfsg
AD-52968.1 A-108358.1 GfuCfuUfaAfaGfAfCfuUfuGfuCfcAfuAfL96 A-108359.1 uAfuGfgAfcAfaAfgucUfuUfaAfgAfcsCfsa
AD-53122.1 A-108656.1 CfuGfaGfgCfaAfAfUfuUfaAfaAfgGfcAfL96 A-108657.1 uGfcCfuUfuUfaAfauuUfgCfcUfcAfgsUfsu
AD-53100.1 A-108586.1 GfcAfaUfcCfcGfGfAfaAfaCfaAfaGfaUfL96 A-108587.1 aUfcUfuUfgUfuUfuccGfgGfaUfuGfcsAfsu
AD-53128.1 A-108658.1 UfgAfgGfcAfaAfUfUfuAfaAfaGfgCfaAfL96 A-108659.1 uUfgCfcUfuUfuAfaauUfuGfcCfuCfasGfsu
AD-53043.1 A-108430.1 UfcUfaCfuUfcAfAfCfaAfaAfaGfuGfaAfL96 A-108431.1 uUfcAfcUfuUfuUfguuGfaAfgUfaGfasAfsu
AD-53135.1 A-108676.1 UfaUfgUfgUfaAfAfAfaUfcUfgUfaAfuAfL96 A-108677.1 uAfuUfaCfaGfaUfuuuUfaCfaCfaUfasCfsu
AD-53094.1 A-108584.1 AfaUfgCfaAfuCfCfCfgGfaAfaAfcAfaAfL96 A-108585.1 uUfuGfuUfuUfcCfgggAfuUfgCfaUfusGfsg
AD-53019.1 A-108422.1 CfuUfgAfaAfgCfCfUfcCfuAfgAfaGfaAfL96 A-108423.1 uUfcUfuCfuAfgGfaggCfuUfuCfaAfgsUfsu
AD-53129.1 A-108674.1 GfuAfuGfuGfuAfAfAfaAfuCfuGfuAfaUfL96 A-108675.1 aUfuAfcAfgAfuUfuuuAfcAfcAfuAfcsUfsc
AD-53150.1 A-108666.1 CfaGfaGfuAfuGfUfGfuAfaAfaAfuCfuUfL96 A-108667.1 aAfgAfuUfuUfuAfcacAfuAfcUfcUfgsUfsg
AD-53117.1 A-108670.1 GfaGfuAfuGfuGfUfAfaAfaAfuCfuGfuAfL96 A-108671.1 uAfcAfgAfuUfuUfuacAfcAfuAfcUfcsUfsg
AD-52985.1 A-108348.1 UfcAfgUfuGfgGfAfCfaUfgGfuCfuUfaAfL96 A-108349.1 uUfaAfgAfcCfaUfgucCfcAfaCfuGfasAfsg
AD-52962.1 A-108356.1 GfgUfcUfuAfaAfGfAfcUfuUfgUfcCfaUfL96 A-108357.1 aUfgGfaCfaAfaGfucuUfuAfaGfaCfcsAfsu
AD-52974.1 A-108360.1 UfcUfuAfaAfgAfCfUfuUfgUfcCfaUfaAfL96 A-108361.1 uUfaUfgGfaCfaAfaguCfuUfuAfaGfasCfsc
AD-52979.1 A-108346.1 UfuCfaGfuUfgGfGfAfcAfuGfgUfcUfuAfL96 A-108347.1 uAfaGfaCfcAfuGfuccCfaAfcUfgAfasGfsg
Обозначенные строчными буквами нуклеотиды (a, u, g, c) представляют собой 2'-O-метилнуклеотиды, NF (например, Af) представляет собой 2'-O-фторнуклеотид, s представляет собой тиофосфатную связь, L96 означает лиганд GalNac.
Таблица 9
Немодифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3 без конъюгации с GalNal
Последовательности являются аналогичными последовательностям, перечисленным в таблице 7, за исключением того, что они не содержат конъюгации с GalNal
Название дуплекса Название смыслового олиго Смысловая последовательность (SEQ ID NO:1004-1184, соответственно, в порядке появления) Название антисмыслового олиго Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:1185-1365, соответственно, в порядке появления) Положение в NM_014495.2
AD-52637.1 A-108817.1 UCACAAUUAAGCUCCUUCUUU A-108307.2 AAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAAC 54-76
AD-52638.1 A-108825.1 UUAUUGUUCCUCUAGUUAUUU A-108323.2 AAAUAACUAGAGGAACAAUAAAA 75-97
AD-52639.1 A-108833.1 GCUAUGUUAGACGAUGUAAAA A-108339.2 UUUUACAUCGUCUAACAUAGCAA 161-183
AD-52640.1 A-108841.1 GGACAUGGUCUUAAAGACUUU A-108355.2 AAAGUCUUUAAGACCAUGUCCCA 209-231
AD-52641.1 A-108849.1 CAAAAACUCAACAUAUUUGAU A-108371.2 AUCAAAUAUGUUGAGUUUUUGAA 266-288
AD-52642.1 A-108857.1 ACCAGUGAAAUCAAAGAAGAA A-108387.2 UUCUUCUUUGAUUUCACUGGUUU 314-336
AD-52643.1 A-108818.1 CACAAUUAAGCUCCUUCUUUU A-108309.2 AAAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAA 55-77
AD-52645.1 A-108834.1 CUAUGUUAGACGAUGUAAAAA A-108341.2 UUUUUACAUCGUCUAACAUAGCA 162-184
AD-52647.1 A-108850.1 UCAACAUAUUUGAUCAGUCUU A-108373.2 AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU 273-295
AD-52648.1 A-108858.1 AACUGAGAAGAACUACAUAUA A-108389.2 UAUAUGUAGUUCUUCUCAGUUCC 342-364
AD-52649.1 A-108819.1 ACAAUUAAGCUCCUUCUUUUU A-108311.2 AAAAAGAAGGAGCUUAAUUGUGA 56-78
AD-52650.1 A-108827.1 CUCCAGAGCCAAAAUCAAGAU A-108327.2 AUCUUGAUUUUGGCUCUGGAGAU 138-160
AD-52651.1 A-108835.1 CGAUGUAAAAAUUUUAGCCAA A-108343.2 UUGGCUAAAAUUUUUACAUCGUC 172-194
AD-52652.1 A-108843.1 GUCUUAAAGACUUUGUCCAUA A-108359.2 UAUGGACAAAGUCUUUAAGACCA 216-238
AD-52653.1 A-108851.1 CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU A-108375.2 AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG 274-296
AD-52654.1 A-108859.1 ACUGAGAAGAACUACAUAUAA A-108391.2 UUAUAUGUAGUUCUUCUCAGUUC 343-365
AD-52656.1 A-108828.1 CCAGAGCCAAAAUCAAGAUUU A-108329.2 AAAUCUUGAUUUUGGCUCUGGAG 140-162
AD-52657.1 A-108836.1 GAUGUAAAAAUUUUAGCCAAU A-108345.2 AUUGGCUAAAAUUUUUACAUCGU 173-195
AD-52658.1 A-108844.1 UCUUAAAGACUUUGUCCAUAA A-108361.2 UUAUGGACAAAGUCUUUAAGACC 217-239
AD-52659.1 A-108852.1 AACAUAUUUGAUCAGUCUUUU A-108377.2 AAAAGACUGAUCAAAUAUGUUGA 275-297
AD-52660.1 A-108860.1 CUGAGAAGAACUACAUAUAAA A-108393.2 UUUAUAUGUAGUUCUUCUCAGUU 344-366
AD-52661.1 A-108821.1 AAUUAAGCUCCUUCUUUUUAU A-108315.2 AUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUGU 58-80
AD-52662.1 A-108829.1 AAAUCAAGAUUUGCUAUGUUA A-108331.2 UAACAUAGCAAAUCUUGAUUUUG 149-171
AD-52663.1 A-108837.1 UUCAGUUGGGACAUGGUCUUA A-108347.2 UAAGACCAUGUCCCAACUGAAGG 201-223
AD-52664.1 A-108845.1 GGGCCAAAUUAAUGACAUAUU A-108363.2 AAUAUGUCAUUAAUUUGGCCCUU 244-266
AD-52665.1 A-108853.1 ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU A-108379.2 AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG 276-298
AD-52666.1 A-108861.1 AGAACUACAUAUAAACUACAA A-108395.2 UUGUAGUUUAUAUGUAGUUCUUC 350-372
AD-52667.1 A-108822.1 AUUAAGCUCCUUCUUUUUAUU A-108317.2 AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG 59-81
AD-52668.1 A-108830.1 AGAUUUGCUAUGUUAGACGAU A-108333.2 AUCGUCUAACAUAGCAAAUCUUG 155-177
AD-52669.1 A-108838.1 UCAGUUGGGACAUGGUCUUAA A-108349.2 UUAAGACCAUGUCCCAACUGAAG 202-224
AD-52670.1 A-108846.1 GGCCAAAUUAAUGACAUAUUU A-108365.2 AAAUAUGUCAUUAAUUUGGCCCU 245-267
AD-52671.1 A-108854.1 CAUAUUUGAUCAGUCUUUUUA A-108381.2 UAAAAAGACUGAUCAAAUAUGUU 277-299
AD-52672.1 A-108862.1 UACAUAUAAACUACAAGUCAA A-108397.2 UUGACUUGUAGUUUAUAUGUAGU 355-377
AD-52673.1 A-108823.1 UUUUAUUGUUCCUCUAGUUAU A-108319.2 AUAACUAGAGGAACAAUAAAAAG 73-95
AD-52674.1 A-108831.1 UUGCUAUGUUAGACGAUGUAA A-108335.2 UUACAUCGUCUAACAUAGCAAAU 159-181
AD-52675.1 A-108839.1 CAGUUGGGACAUGGUCUUAAA A-108351.2 UUUAAGACCAUGUCCCAACUGAA 203-225
AD-52676.1 A-108847.1 AAAUUAAUGACAUAUUUCAAA A-108367.2 UUUGAAAUAUGUCAUUAAUUUGG 249-271
AD-52677.1 A-108855.1 GAUCAGUCUUUUUAUGAUCUA A-108383.2 UAGAUCAUAAAAAGACUGAUCAA 284-306
AD-52678.1 A-108863.1 ACAUAUAAACUACAAGUCAAA A-108399.2 UUUGACUUGUAGUUUAUAUGUAG 356-378
AD-52679.1 A-108824.1 UUUAUUGUUCCUCUAGUUAUU A-108321.2 AAUAACUAGAGGAACAAUAAAAA 74-96
AD-52680.1 A-108832.1 UGCUAUGUUAGACGAUGUAAA A-108337.2 UUUACAUCGUCUAACAUAGCAAA 160-182
AD-52681.1 A-108840.1 GGGACAUGGUCUUAAAGACUU A-108353.2 AAGUCUUUAAGACCAUGUCCCAA 208-230
AD-52682.1 A-108848.1 UGACAUAUUUCAAAAACUCAA A-108369.2 UUGAGUUUUUGAAAUAUGUCAUU 256-278
AD-52683.1 A-108856.1 AUCAGUCUUUUUAUGAUCUAU A-108385.2 AUAGAUCAUAAAAAGACUGAUCA 285-307
AD-52684.1 A-108864.1 CAUAUAAACUACAAGUCAAAA A-108401.2 UUUUGACUUGUAGUUUAUAUGUA 357-379
AD-52685.1 A-108872.1 CUUGAACUCAACUCAAAACUU A-108417.2 AAGUUUUGAGUUGAGUUCAAGUG 401-423
AD-52686.1 A-108880.1 CUACUUCAACAAAAAGUGAAA A-108433.2 UUUCACUUUUUGUUGAAGUAGAA 446-468
AD-52687.1 A-108888.1 AAGAGCAACUAACUAACUUAA A-108449.2 UUAAGUUAGUUAGUUGCUCUUCU 474-496
AD-52688.1 A-108896.1 AAACAAGAUAAUAGCAUCAAA A-108465.2 UUUGAUGCUAUUAUCUUGUUUUU 557-579
AD-52689.1 A-108904.1 GCAUAGUCAAAUAAAAGAAAU A-108481.2 AUUUCUUUUAUUUGACUAUGCUG 625-647
AD-52690.1 A-108865.1 AUAUAAACUACAAGUCAAAAA A-108403.2 UUUUUGACUUGUAGUUUAUAUGU 358-380
AD-52691.1 A-108873.1 GAACUCAACUCAAAACUUGAA A-108419.2 UUCAAGUUUUGAGUUGAGUUCAA 404-426
AD-52692.1 A-108881.1 UACUUCAACAAAAAGUGAAAU A-108435.2 AUUUCACUUUUUGUUGAAGUAGA 447-469
AD-52693.1 A-108889.1 AGAGCAACUAACUAACUUAAU A-108451.2 AUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUUC 475-497
AD-52694.1 A-108897.1 GAUAAUAGCAUCAAAGACCUU A-108467.2 AAGGUCUUUGAUGCUAUUAUCUU 563-585
AD-52695.1 A-108905.1 CAUAGUCAAAUAAAAGAAAUA A-108483.2 UAUUUCUUUUAUUUGACUAUGCU 626-648
AD-52696.1 A-108866.1 UAUAAACUACAAGUCAAAAAU A-108405.2 AUUUUUGACUUGUAGUUUAUAUG 359-381
AD-52697.1 A-108874.1 AACUCAACUCAAAACUUGAAA A-108421.2 UUUCAAGUUUUGAGUUGAGUUCA 405-427
AD-52698.1 A-108882.1 ACUUCAACAAAAAGUGAAAUA A-108437.2 UAUUUCACUUUUUGUUGAAGUAG 448-470
AD-52699.1 A-108890.1 GAGCAACUAACUAACUUAAUU A-108453.2 AAUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUU 476-498
AD-52700.1 A-108898.1 AACCAACAGCAUAGUCAAAUA A-108469.2 UAUUUGACUAUGCUGUUGGUUUA 617-639
AD-52701.1 A-108906.1 AGUCAAAUAAAAGAAAUAGAA A-108485.2 UUCUAUUUCUUUUAUUUGACUAU 629-651
AD-52702.1 A-108867.1 AGUCAAAAAUGAAGAGGUAAA A-108407.2 UUUACCUCUUCAUUUUUGACUUG 370-392
AD-52703.1 A-108875.1 CUUGAAAGCCUCCUAGAAGAA A-108423.2 UUCUUCUAGGAGGCUUUCAAGUU 419-441
AD-52704.1 A-108883.1 CUUCAACAAAAAGUGAAAUAU A-108439.2 AUAUUUCACUUUUUGUUGAAGUA 449-471
AD-52705.1 A-108891.1 CAACUAACUAACUUAAUUCAA A-108455.2 UUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGCU 479-501
AD-52706.1 A-108899.1 ACCAACAGCAUAGUCAAAUAA A-108471.2 UUAUUUGACUAUGCUGUUGGUUU 618-640
AD-52707.1 A-108907.1 GAACCCACAGAAAUUUCUCUA A-108487.2 UAGAGAAAUUUCUGUGGGUUCUU 677-699
AD-52708.1 A-108868.1 GAAUAUGUCACUUGAACUCAA A-108409.2 UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU 391-413
AD-52709.1 A-108876.1 UGAAAGCCUCCUAGAAGAAAA A-108425.2 UUUUCUUCUAGGAGGCUUUCAAG 421-443
AD-52710.1 A-108884.1 UUCAACAAAAAGUGAAAUAUU A-108441.2 AAUAUUUCACUUUUUGUUGAAGU 450-472
AD-52711.1 A-108892.1 AACUAACUAACUUAAUUCAAA A-108457.2 UUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGC 480-502
AD-52712.1 A-108900.1 CCAACAGCAUAGUCAAAUAAA A-108473.2 UUUAUUUGACUAUGCUGUUGGUU 619-641
AD-52713.1 A-108908.1 AACCCACAGAAAUUUCUCUAU A-108489.2 AUAGAGAAAUUUCUGUGGGUUCU 678-700
AD-52714.1 A-108869.1 UGUCACUUGAACUCAACUCAA A-108411.2 UUGAGUUGAGUUCAAGUGACAUA 396-418
AD-52715.1 A-108877.1 GAAAGCCUCCUAGAAGAAAAA A-108427.2 UUUUUCUUCUAGGAGGCUUUCAA 422-444
AD-52716.1 A-108885.1 AAUAUUUAGAAGAGCAACUAA A-108443.2 UUAGUUGCUCUUCUAAAUAUUUC 465-487
AD-52717.1 A-108893.1 ACUAACUAACUUAAUUCAAAA A-108459.2 UUUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUG 481-503
AD-52718.1 A-108901.1 CAACAGCAUAGUCAAAUAAAA A-108475.2 UUUUAUUUGACUAUGCUGUUGGU 620-642
AD-52719.1 A-108909.1 CCACAGAAAUUUCUCUAUCUU A-108491.2 AAGAUAGAGAAAUUUCUGUGGGU 681-703
AD-52720.1 A-108870.1 GUCACUUGAACUCAACUCAAA A-108413.2 UUUGAGUUGAGUUCAAGUGACAU 397-419
AD-52721.1 A-108878.1 CUCCUAGAAGAAAAAAUUCUA A-108429.2 UAGAAUUUUUUCUUCUAGGAGGC 428-450
AD-52722.1 A-108886.1 AUUUAGAAGAGCAACUAACUA A-108445.2 UAGUUAGUUGCUCUUCUAAAUAU 468-490
AD-52723.1 A-108894.1 CUAACUAACUUAAUUCAAAAU A-108461.2 AUUUUGAAUUAAGUUAGUUAGUU 482-504
AD-52724.1 A-108902.1 CAGCAUAGUCAAAUAAAAGAA A-108477.2 UUCUUUUAUUUGACUAUGCUGUU 623-645
AD-52725.1 A-108910.1 GAAAUAAGAAAUGUAAAACAU A-108493.2 AUGUUUUACAUUUCUUAUUUCAU 746-768
AD-52726.1 A-108871.1 UCACUUGAACUCAACUCAAAA A-108415.2 UUUUGAGUUGAGUUCAAGUGACA 398-420
AD-52727.1 A-108879.1 UCUACUUCAACAAAAAGUGAA A-108431.2 UUCACUUUUUGUUGAAGUAGAAU 445-467
AD-52728.1 A-108887.1 UUUAGAAGAGCAACUAACUAA A-108447.2 UUAGUUAGUUGCUCUUCUAAAUA 469-491
AD-52729.1 A-108895.1 AAAACAAGAUAAUAGCAUCAA A-108463.2 UUGAUGCUAUUAUCUUGUUUUUC 556-578
AD-52730.1 A-108903.1 AGCAUAGUCAAAUAAAAGAAA A-108479.2 UUUCUUUUAUUUGACUAUGCUGU 624-646
AD-52731.1 A-108958.1 AGACCCAGCAACUCUCAAGUU A-108495.2 AACUUGAGAGUUGCUGGGUCUGA 836-858
AD-52732.1 A-108966.1 AGUCCAUGGACAUUAAUUCAA A-108511.2 UUGAAUUAAUGUCCAUGGACUAC 887-909
AD-52733.1 A-108974.1 GAUGGAUCACAAAACUUCAAU A-108527.2 AUUGAAGUUUUGUGAUCCAUCUA 917-939
AD-52734.1 A-108982.1 CUAGAGAAGAUAUACUCCAUA A-108543.2 UAUGGAGUAUAUCUUCUCUAGGC 998-1020
AD-52735.1 A-108990.1 AAAGACAACAAACAUUAUAUU A-108559.2 AAUAUAAUGUUUGUUGUCUUUCC 1064-1086
AD-52736.1 A-108998.1 CAUUAUAUUGAAUAUUCUUUU A-108575.2 AAAAGAAUAUUCAAUAUAAUGUU 1076-1098
AD-52737.1 A-108959.1 GACCCAGCAACUCUCAAGUUU A-108497.2 AAACUUGAGAGUUGCUGGGUCUG 837-859
AD-52739.1 A-108975.1 GGAUCACAAAACUUCAAUGAA A-108529.2 UUCAUUGAAGUUUUGUGAUCCAU 920-942
AD-52740.1 A-108983.1 GAAGAUAUACUCCAUAGUGAA A-108545.2 UUCACUAUGGAGUAUAUCUUCUC 1003-1025
AD-52741.1 A-108991.1 GACAACAAACAUUAUAUUGAA A-108561.2 UUCAAUAUAAUGUUUGUUGUCUU 1067-1089
AD-52742.1 A-108999.1 GGGAAAUCACGAAACCAACUA A-108577.2 UAGUUGGUUUCGUGAUUUCCCAA 1102-1124
AD-52743.1 A-108960.1 ACCCAGCAACUCUCAAGUUUU A-108499.2 AAAACUUGAGAGUUGCUGGGUCU 838-860
AD-52744.1 A-108968.1 GGACAUUAAUUCAACAUCGAA A-108515.2 UUCGAUGUUGAAUUAAUGUCCAU 894-916
AD-52745.1 A-108976.1 GAUCACAAAACUUCAAUGAAA A-108531.2 UUUCAUUGAAGUUUUGUGAUCCA 921-943
AD-52746.1 A-108984.1 ACUCCAUAGUGAAGCAAUCUA A-108547.2 UAGAUUGCUUCACUAUGGAGUAU 1011-1033
AD-52747.1 A-108992.1 ACAACAAACAUUAUAUUGAAU A-108563.2 AUUCAAUAUAAUGUUUGUUGUCU 1068-1090
AD-52748.1 A-109000.1 GGAAAUCACGAAACCAACUAU A-108579.2 AUAGUUGGUUUCGUGAUUUCCCA 1103-1125
AD-52749.1 A-108961.1 CCCAGCAACUCUCAAGUUUUU A-108501.2 AAAAACUUGAGAGUUGCUGGGUC 839-861
AD-52750.1 A-108969.1 GACAUUAAUUCAACAUCGAAU A-108517.2 AUUCGAUGUUGAAUUAAUGUCCA 895-917
AD-52751.1 A-108977.1 AACGUGGGAGAACUACAAAUA A-108533.2 UAUUUGUAGUUCUCCCACGUUUC 940-962
AD-52752.1 A-108985.1 CUCCAUAGUGAAGCAAUCUAA A-108549.2 UUAGAUUGCUUCACUAUGGAGUA 1012-1034
AD-52753.1 A-108993.1 CAACAAACAUUAUAUUGAAUA A-108565.2 UAUUCAAUAUAAUGUUUGUUGUC 1069-1091
AD-52754.1 A-109001.1 GAAAUCACGAAACCAACUAUA A-108581.2 UAUAGUUGGUUUCGUGAUUUCCC 1104-1126
AD-52755.1 A-108962.1 CUCUCAAGUUUUUCAUGUCUA A-108503.2 UAGACAUGAAAAACUUGAGAGUU 847-869
AD-52756.1 A-108970.1 ACAUUAAUUCAACAUCGAAUA A-108519.2 UAUUCGAUGUUGAAUUAAUGUCC 896-918
AD-52757.1 A-108978.1 GGGAGAACUACAAAUAUGGUU A-108535.2 AACCAUAUUUGUAGUUCUCCCAC 945-967
AD-52758.1 A-108986.1 UCCAUAGUGAAGCAAUCUAAU A-108551.2 AUUAGAUUGCUUCACUAUGGAGU 1013-1035
AD-52759.1 A-108994.1 AACAAACAUUAUAUUGAAUAU A-108567.2 AUAUUCAAUAUAAUGUUUGUUGU 1070-1092
AD-52760.1 A-109002.1 UGGCAAUGUCCCCAAUGCAAU A-108583.2 AUUGCAUUGGGGACAUUGCCAGU 1147-1169
AD-52761.1 A-108963.1 UCAGGUAGUCCAUGGACAUUA A-108505.2 UAAUGUCCAUGGACUACCUGAUA 881-903
AD-52762.1 A-108971.1 UUAAUUCAACAUCGAAUAGAU A-108521.2 AUCUAUUCGAUGUUGAAUUAAUG 899-921
AD-52763.1 A-108979.1 GGAGAACUACAAAUAUGGUUU A-108537.2 AAACCAUAUUUGUAGUUCUCCCA 946-968
AD-52764.1 A-108987.1 CCAUAGUGAAGCAAUCUAAUU A-108553.2 AAUUAGAUUGCUUCACUAUGGAG 1014-1036
AD-52765.1 A-108995.1 ACAAACAUUAUAUUGAAUAUU A-108569.2 AAUAUUCAAUAUAAUGUUUGUUG 1071-1093
AD-52766.1 A-109003.1 AAUGCAAUCCCGGAAAACAAA A-108585.2 UUUGUUUUCCGGGAUUGCAUUGG 1160-1182
AD-52767.1 A-108964.1 CAGGUAGUCCAUGGACAUUAA A-108507.2 UUAAUGUCCAUGGACUACCUGAU 882-904
AD-52768.1 A-108972.1 UUCAACAUCGAAUAGAUGGAU A-108523.2 AUCCAUCUAUUCGAUGUUGAAUU 903-925
AD-52769.1 A-108980.1 GUUGGGCCUAGAGAAGAUAUA A-108539.2 UAUAUCUUCUCUAGGCCCAACCA 991-1013
AD-52770.1 A-108988.1 CAUAGUGAAGCAAUCUAAUUA A-108555.2 UAAUUAGAUUGCUUCACUAUGGA 1015-1037
AD-52771.1 A-108996.1 AACAUUAUAUUGAAUAUUCUU A-108571.2 AAGAAUAUUCAAUAUAAUGUUUG 1074-1096
AD-52772.1 A-109004.1 GCAAUCCCGGAAAACAAAGAU A-108587.2 AUCUUUGUUUUCCGGGAUUGCAU 1163-1185
AD-52773.1 A-108965.1 GGUAGUCCAUGGACAUUAAUU A-108509.2 AAUUAAUGUCCAUGGACUACCUG 884-906
AD-52774.1 A-108973.1 AUCGAAUAGAUGGAUCACAAA A-108525.2 UUUGUGAUCCAUCUAUUCGAUGU 909-931
AD-52775.1 A-108981.1 CCUAGAGAAGAUAUACUCCAU A-108541.2 AUGGAGUAUAUCUUCUCUAGGCC 997-1019
AD-52776.1 A-108989.1 GUUGGAAGACUGGAAAGACAA A-108557.2 UUGUCUUUCCAGUCUUCCAACUC 1051-1073
AD-52777.1 A-108997.1 ACAUUAUAUUGAAUAUUCUUU A-108573.2 AAAGAAUAUUCAAUAUAAUGUUU 1075-1097
AD-52778.1 A-109005.1 CAAUCCCGGAAAACAAAGAUU A-108589.2 AAUCUUUGUUUUCCGGGAUUGCA 1164-1186
AD-52779.1 A-109013.1 CUACUUGGGAUCACAAAGCAA A-108605.2 UUGCUUUGUGAUCCCAAGUAGAA 1194-1216
AD-52780.1 A-109021.1 ACAACCUAAAUGGUAAAUAUA A-108621.2 UAUAUUUACCAUUUAGGUUGUUU 1281-1303
AD-52781.1 A-109029.1 AUCCAUCCAACAGAUUCAGAA A-108637.2 UUCUGAAUCUGUUGGAUGGAUCA 1400-1422
AD-52782.1 A-109037.1 AACUGAGGCAAAUUUAAAAGA A-108653.2 UCUUUUAAAUUUGCCUCAGUUCA 1432-1454_G21A
AD-52783.1 A-109045.1 AGAGUAUGUGUAAAAAUCUGU A-108669.2 ACAGAUUUUUACACAUACUCUGU 1913-1935
AD-52784.1 A-109006.1 AAUCCCGGAAAACAAAGAUUU A-108591.2 AAAUCUUUGUUUUCCGGGAUUGC 1165-1187
AD-52785.1 A-109014.1 UACUUGGGAUCACAAAGCAAA A-108607.2 UUUGCUUUGUGAUCCCAAGUAGA 1195-1217
AD-52786.1 A-109022.1 CAACCUAAAUGGUAAAUAUAA A-108623.2 UUAUAUUUACCAUUUAGGUUGUU 1282-1304
AD-52787.1 A-109030.1 UUGAAUGAACUGAGGCAAAUU A-108639.2 AAUUUGCCUCAGUUCAUUCAAAG 1425-1447
AD-52788.1 A-109038.1 ACUGAGGCAAAUUUAAAAGGA A-108655.2 UCCUUUUAAAUUUGCCUCAGUUC 1433-1455_C21A
AD-52789.1 A-109046.1 GAGUAUGUGUAAAAAUCUGUA A-108671.2 UACAGAUUUUUACACAUACUCUG 1914-1936
AD-52791.1 A-109015.1 ACUUGGGAUCACAAAGCAAAA A-108609.2 UUUUGCUUUGUGAUCCCAAGUAG 1196-1218
AD-52792.1 A-109023.1 AUGGUAAAUAUAACAAACCAA A-108625.2 UUGGUUUGUUAUAUUUACCAUUU 1290-1312
AD-52793.1 A-109031.1 UGAAUGAACUGAGGCAAAUUU A-108641.2 AAAUUUGCCUCAGUUCAUUCAAA 1426-1448
AD-52794.1 A-109039.1 CUGAGGCAAAUUUAAAAGGCA A-108657.2 UGCCUUUUAAAUUUGCCUCAGUU 1434-1456
AD-52795.1 A-109047.1 AGUAUGUGUAAAAAUCUGUAA A-108673.2 UUACAGAUUUUUACACAUACUCU 1915-1937
AD-52796.1 A-109008.1 GAAAACAAAGAUUUGGUGUUU A-108595.2 AAACACCAAAUCUUUGUUUUCCG 1172-1194
AD-52797.1 A-109016.1 AGUGUGGAGAAAACAACCUAA A-108611.2 UUAGGUUGUUUUCUCCACACUCA 1269-1291
AD-52798.1 A-109024.1 GUCUCAAAAUGGAAGGUUAUA A-108627.2 UAUAACCUUCCAUUUUGAGACUU 1354-1376
AD-52799.1 A-109032.1 GAAUGAACUGAGGCAAAUUUA A-108643.2 UAAAUUUGCCUCAGUUCAUUCAA 1427-1449
AD-52800.1 A-109040.1 UGAGGCAAAUUUAAAAGGCAA A-108659.2 UUGCCUUUUAAAUUUGCCUCAGU 1435-1457
AD-52801.1 A-109048.1 GUAUGUGUAAAAAUCUGUAAU A-108675.2 AUUACAGAUUUUUACACAUACUC 1916-1938
AD-52802.1 A-109009.1 AAAACAAAGAUUUGGUGUUUU A-108597.2 AAAACACCAAAUCUUUGUUUUCC 1173-1195
AD-52803.1 A-109017.1 GUGUGGAGAAAACAACCUAAA A-108613.2 UUUAGGUUGUUUUCUCCACACUC 1270-1292
AD-52804.1 A-109025.1 AUGGAAGGUUAUACUCUAUAA A-108629.2 UUAUAGAGUAUAACCUUCCAUUU 1362-1384
AD-52805.1 A-109033.1 AAUGAACUGAGGCAAAUUUAA A-108645.2 UUAAAUUUGCCUCAGUUCAUUCA 1428-1450
AD-52806.1 A-109041.1 GAGGCAAAUUUAAAAGGCAAU A-108661.2 AUUGCCUUUUAAAUUUGCCUCAG 1436-1458
AD-52807.1 A-109049.1 UAUGUGUAAAAAUCUGUAAUA A-108677.2 UAUUACAGAUUUUUACACAUACU 1917-1939
AD-52808.1 A-109010.1 ACAAAGAUUUGGUGUUUUCUA A-108599.2 UAGAAAACACCAAAUCUUUGUUU 1176-1198
AD-52809.1 A-109018.1 UGUGGAGAAAACAACCUAAAU A-108615.2 AUUUAGGUUGUUUUCUCCACACU 1271-1293
AD-52810.1 A-109026.1 UGGAAGGUUAUACUCUAUAAA A-108631.2 UUUAUAGAGUAUAACCUUCCAUU 1363-1385
AD-52811.1 A-109034.1 AUGAACUGAGGCAAAUUUAAA A-108647.2 UUUAAAUUUGCCUCAGUUCAUUC 1429-1451
AD-52812.1 A-109042.1 AGGCAAAUUUAAAAGGCAAUA A-108663.2 UAUUGCCUUUUAAAUUUGCCUCA 1437-1459
AD-52813.1 A-109011.1 AAGAUUUGGUGUUUUCUACUU A-108601.2 AAGUAGAAAACACCAAAUCUUUG 1179-1201
AD-52814.1 A-109019.1 AAACAACCUAAAUGGUAAAUA A-108617.2 UAUUUACCAUUUAGGUUGUUUUC 1279-1301
AD-52815.1 A-109027.1 AUACUCUAUAAAAUCAACCAA A-108633.2 UUGGUUGAUUUUAUAGAGUAUAA 1372-1394
AD-52816.1 A-109035.1 UGAACUGAGGCAAAUUUAAAA A-108649.2 UUUUAAAUUUGCCUCAGUUCAUU 1430-1452
AD-52817.1 A-109043.1 GGCAAAUUUAAAAGGCAAUAA A-108665.2 UUAUUGCCUUUUAAAUUUGCCUC 1438-1460
AD-52818.1 A-109012.1 UUUUCUACUUGGGAUCACAAA A-108603.2 UUUGUGAUCCCAAGUAGAAAACA 1190-1212
AD-52819.1 A-109020.1 AACAACCUAAAUGGUAAAUAU A-108619.2 AUAUUUACCAUUUAGGUUGUUUU 1280-1302
AD-52820.1 A-109028.1 UACUCUAUAAAAUCAACCAAA A-108635.2 UUUGGUUGAUUUUAUAGAGUAUA 1373-1395
AD-52821.1 A-109036.1 GAACUGAGGCAAAUUUAAAAA A-108651.2 UUUUUAAAUUUGCCUCAGUUCAU 1431-1453_G21A
AD-52822.1 A-109044.1 CAGAGUAUGUGUAAAAAUCUU A-108667.2 AAGAUUUUUACACAUACUCUGUG 1912-1934_G21U
Таблица 10
Модифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ANGPTL3 без конъюгации с GalNal
Последовательности являются аналогичными последовательностям, перечисленным в таблице 8, за исключением того, что они не содержат конъюгации с GalNal
Название дуплекса Название смыслового олиго Смысловая последовательность (SEQ ID NO:1366-1546, соответственно, в порядке появления) Название анти-смыслового олиго Антисмысловая последовательность (SEQ ID NO:1547-1727, соответственно, в порядке появления)
AD-52637.1 A-108817.1 UfcAfcAfaUfuAfAfGfcUfcCfuUfcUfuUf A-108307.2 aAfaGfaAfgGfaGfcuuAfaUfuGfuGfasAfsc
AD-52638.1 A-108825.1 UfuAfuUfgUfuCfCfUfcUfaGfuUfaUfuUf A-108323.2 aAfaUfaAfcUfaGfaggAfaCfaAfuAfasAfsa
AD-52639.1 A-108833.1 GfcUfaUfgUfuAfGfAfcGfaUfgUfaAfaAf A-108339.2 uUfuUfaCfaUfcGfucuAfaCfaUfaGfcsAfsa
AD-52640.1 A-108841.1 GfgAfcAfuGfgUfCfUfuAfaAfgAfcUfuUf A-108355.2 aAfaGfuCfuUfuAfagaCfcAfuGfuCfcsCfsa
AD-52641.1 A-108849.1 CfaAfaAfaCfuCfAfAfcAfuAfuUfuGfaUf A-108371.2 aUfcAfaAfuAfuGfuugAfgUfuUfuUfgsAfsa
AD-52642.1 A-108857.1 AfcCfaGfuGfaAfAfUfcAfaAfgAfaGfaAf A-108387.2 uUfcUfuCfuUfuGfauuUfcAfcUfgGfusUfsu
AD-52643.1 A-108818.1 CfaCfaAfuUfaAfGfCfuCfcUfuCfuUfuUf A-108309.2 aAfaAfgAfaGfgAfgcuUfaAfuUfgUfgsAfsa
AD-52645.1 A-108834.1 CfuAfuGfuUfaGfAfCfgAfuGfuAfaAfaAf A-108341.2 uUfuUfuAfcAfuCfgucUfaAfcAfuAfgsCfsa
AD-52647.1 A-108850.1 UfcAfaCfaUfaUfUfUfgAfuCfaGfuCfuUf A-108373.2 aAfgAfcUfgAfuCfaaaUfaUfgUfuGfasGfsu
AD-52648.1 A-108858.1 AfaCfuGfaGfaAfGfAfaCfuAfcAfuAfuAf A-108389.2 uAfuAfuGfuAfgUfucuUfcUfcAfgUfusCfsc
AD-52649.1 A-108819.1 AfcAfaUfuAfaGfCfUfcCfuUfcUfuUfuUf A-108311.2 aAfaAfaGfaAfgGfagcUfuAfaUfuGfusGfsa
AD-52650.1 A-108827.1 CfuCfcAfgAfgCfCfAfaAfaUfcAfaGfaUf A-108327.2 aUfcUfuGfaUfuUfuggCfuCfuGfgAfgsAfsu
AD-52651.1 A-108835.1 CfgAfuGfuAfaAfAfAfuUfuUfaGfcCfaAf A-108343.2 uUfgGfcUfaAfaAfuuuUfuAfcAfuCfgsUfsc
AD-52652.1 A-108843.1 GfuCfuUfaAfaGfAfCfuUfuGfuCfcAfuAf A-108359.2 uAfuGfgAfcAfaAfgucUfuUfaAfgAfcsCfsa
AD-52653.1 A-108851.1 CfaAfcAfuAfuUfUfGfaUfcAfgUfcUfuUf A-108375.2 aAfaGfaCfuGfaUfcaaAfuAfuGfuUfgsAfsg
AD-52654.1 A-108859.1 AfcUfgAfgAfaGfAfAfcUfaCfaUfaUfaAf A-108391.2 uUfaUfaUfgUfaGfuucUfuCfuCfaGfusUfsc
AD-52656.1 A-108828.1 CfcAfgAfgCfcAfAfAfaUfcAfaGfaUfuUf A-108329.2 aAfaUfcUfuGfaUfuuuGfgCfuCfuGfgsAfsg
AD-52657.1 A-108836.1 GfaUfgUfaAfaAfAfUfuUfuAfgCfcAfaUf A-108345.2 aUfuGfgCfuAfaAfauuUfuUfaCfaUfcsGfsu
AD-52658.1 A-108844.1 UfcUfuAfaAfgAfCfUfuUfgUfcCfaUfaAf A-108361.2 uUfaUfgGfaCfaAfaguCfuUfuAfaGfasCfsc
AD-52659.1 A-108852.1 AfaCfaUfaUfuUfGfAfuCfaGfuCfuUfuUf A-108377.2 aAfaAfgAfcUfgAfucaAfaUfaUfgUfusGfsa
AD-52660.1 A-108860.1 CfuGfaGfaAfgAfAfCfuAfcAfuAfuAfaAf A-108393.2 uUfuAfuAfuGfuAfguuCfuUfcUfcAfgsUfsu
AD-52661.1 A-108821.1 AfaUfuAfaGfcUfCfCfuUfcUfuUfuUfaUf A-108315.2 aUfaAfaAfaGfaAfggaGfcUfuAfaUfusGfsu
AD-52662.1 A-108829.1 AfaAfuCfaAfgAfUfUfuGfcUfaUfgUfuAf A-108331.2 uAfaCfaUfaGfcAfaauCfuUfgAfuUfusUfsg
AD-52663.1 A-108837.1 UfuCfaGfuUfgGfGfAfcAfuGfgUfcUfuAf A-108347.2 uAfaGfaCfcAfuGfuccCfaAfcUfgAfasGfsg
AD-52664.1 A-108845.1 GfgGfcCfaAfaUfUfAfaUfgAfcAfuAfuUf A-108363.2 aAfuAfuGfuCfaUfuaaUfuUfgGfcCfcsUfsu
AD-52665.1 A-108853.1 AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf A-108379.2 aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg
AD-52666.1 A-108861.1 AfgAfaCfuAfcAfUfAfuAfaAfcUfaCfaAf A-108395.2 uUfgUfaGfuUfuAfuauGfuAfgUfuCfusUfsc
AD-52667.1 A-108822.1 AfuUfaAfgCfuCfCfUfuCfuUfuUfuAfuUf A-108317.2 aAfuAfaAfaAfgAfaggAfgCfuUfaAfusUfsg
AD-52668.1 A-108830.1 AfgAfuUfuGfcUfAfUfgUfuAfgAfcGfaUf A-108333.2 aUfcGfuCfuAfaCfauaGfcAfaAfuCfusUfsg
AD-52669.1 A-108838.1 UfcAfgUfuGfgGfAfCfaUfgGfuCfuUfaAf A-108349.2 uUfaAfgAfcCfaUfgucCfcAfaCfuGfasAfsg
AD-52670.1 A-108846.1 GfgCfcAfaAfuUfAfAfuGfaCfaUfaUfuUf A-108365.2 aAfaUfaUfgUfcAfuuaAfuUfuGfgCfcsCfsu
AD-52671.1 A-108854.1 CfaUfaUfuUfgAfUfCfaGfuCfuUfuUfuAf A-108381.2 uAfaAfaAfgAfcUfgauCfaAfaUfaUfgsUfsu
AD-52672.1 A-108862.1 UfaCfaUfaUfaAfAfCfuAfcAfaGfuCfaAf A-108397.2 uUfgAfcUfuGfuAfguuUfaUfaUfgUfasGfsu
AD-52673.1 A-108823.1 UfuUfuAfuUfgUfUfCfcUfcUfaGfuUfaUf A-108319.2 aUfaAfcUfaGfaGfgaaCfaAfuAfaAfasAfsg
AD-52674.1 A-108831.1 UfuGfcUfaUfgUfUfAfgAfcGfaUfgUfaAf A-108335.2 uUfaCfaUfcGfuCfuaaCfaUfaGfcAfasAfsu
AD-52675.1 A-108839.1 CfaGfuUfgGfgAfCfAfuGfgUfcUfuAfaAf A-108351.2 uUfuAfaGfaCfcAfuguCfcCfaAfcUfgsAfsa
AD-52676.1 A-108847.1 AfaAfuUfaAfuGfAfCfaUfaUfuUfcAfaAf A-108367.2 uUfuGfaAfaUfaUfgucAfuUfaAfuUfusGfsg
AD-52677.1 A-108855.1 GfaUfcAfgUfcUfUfUfuUfaUfgAfuCfuAf A-108383.2 uAfgAfuCfaUfaAfaaaGfaCfuGfaUfcsAfsa
AD-52678.1 A-108863.1 AfcAfuAfuAfaAfCfUfaCfaAfgUfcAfaAf A-108399.2 uUfuGfaCfuUfgUfaguUfuAfuAfuGfusAfsg
AD-52679.1 A-108824.1 UfuUfaUfuGfuUfCfCfuCfuAfgUfuAfuUf A-108321.2 aAfuAfaCfuAfgAfggaAfcAfaUfaAfasAfsa
AD-52680.1 A-108832.1 UfgCfuAfuGfuUfAfGfaCfgAfuGfuAfaAf A-108337.2 uUfuAfcAfuCfgUfcuaAfcAfuAfgCfasAfsa
AD-52681.1 A-108840.1 GfgGfaCfaUfgGfUfCfuUfaAfaGfaCfuUf A-108353.2 aAfgUfcUfuUfaAfgacCfaUfgUfcCfcsAfsa
AD-52682.1 A-108848.1 UfgAfcAfuAfuUfUfCfaAfaAfaCfuCfaAf A-108369.2 uUfgAfgUfuUfuUfgaaAfuAfuGfuCfasUfsu
AD-52683.1 A-108856.1 AfuCfaGfuCfuUfUfUfuAfuGfaUfcUfaUf A-108385.2 aUfaGfaUfcAfuAfaaaAfgAfcUfgAfusCfsa
AD-52684.1 A-108864.1 CfaUfaUfaAfaCfUfAfcAfaGfuCfaAfaAf A-108401.2 uUfuUfgAfcUfuGfuagUfuUfaUfaUfgsUfsa
AD-52685.1 A-108872.1 CfuUfgAfaCfuCfAfAfcUfcAfaAfaCfuUf A-108417.2 aAfgUfuUfuGfaGfuugAfgUfuCfaAfgsUfsg
AD-52686.1 A-108880.1 CfuAfcUfuCfaAfCfAfaAfaAfgUfgAfaAf A-108433.2 uUfuCfaCfuUfuUfuguUfgAfaGfuAfgsAfsa
AD-52687.1 A-108888.1 AfaGfaGfcAfaCfUfAfaCfuAfaCfuUfaAf A-108449.2 uUfaAfgUfuAfgUfuagUfuGfcUfcUfusCfsu
AD-52688.1 A-108896.1 AfaAfcAfaGfaUfAfAfuAfgCfaUfcAfaAf A-108465.2 uUfuGfaUfgCfuAfuuaUfcUfuGfuUfusUfsu
AD-52689.1 A-108904.1 GfcAfuAfgUfcAfAfAfuAfaAfaGfaAfaUf A-108481.2 aUfuUfcUfuUfuAfuuuGfaCfuAfuGfcsUfsg
AD-52690.1 A-108865.1 AfuAfuAfaAfcUfAfCfaAfgUfcAfaAfaAf A-108403.2 uUfuUfuGfaCfuUfguaGfuUfuAfuAfusGfsu
AD-52691.1 A-108873.1 GfaAfcUfcAfaCfUfCfaAfaAfcUfuGfaAf A-108419.2 uUfcAfaGfuUfuUfgagUfuGfaGfuUfcsAfsa
AD-52692.1 A-108881.1 UfaCfuUfcAfaCfAfAfaAfaGfuGfaAfaUf A-108435.2 aUfuUfcAfcUfuUfuugUfuGfaAfgUfasGfsa
AD-52693.1 A-108889.1 AfgAfgCfaAfcUfAfAfcUfaAfcUfuAfaUf A-108451.2 aUfuAfaGfuUfaGfuuaGfuUfgCfuCfusUfsc
AD-52694.1 A-108897.1 GfaUfaAfuAfgCfAfUfcAfaAfgAfcCfuUf A-108467.2 aAfgGfuCfuUfuGfaugCfuAfuUfaUfcsUfsu
AD-52695.1 A-108905.1 CfaUfaGfuCfaAfAfUfaAfaAfgAfaAfuAf A-108483.2 uAfuUfuCfuUfuUfauuUfgAfcUfaUfgsCfsu
AD-52696.1 A-108866.1 UfaUfaAfaCfuAfCfAfaGfuCfaAfaAfaUf A-108405.2 aUfuUfuUfgAfcUfuguAfgUfuUfaUfasUfsg
AD-52697.1 A-108874.1 AfaCfuCfaAfcUfCfAfaAfaCfuUfgAfaAf A-108421.2 uUfuCfaAfgUfuUfugaGfuUfgAfgUfusCfsa
AD-52698.1 A-108882.1 AfcUfuCfaAfcAfAfAfaAfgUfgAfaAfuAf A-108437.2 uAfuUfuCfaCfuUfuuuGfuUfgAfaGfusAfsg
AD-52699.1 A-108890.1 GfaGfcAfaCfuAfAfCfuAfaCfuUfaAfuUf A-108453.2 aAfuUfaAfgUfuAfguuAfgUfuGfcUfcsUfsu
AD-52700.1 A-108898.1 AfaCfcAfaCfaGfCfAfuAfgUfcAfaAfuAf A-108469.2 uAfuUfuGfaCfuAfugcUfgUfuGfgUfusUfsa
AD-52701.1 A-108906.1 AfgUfcAfaAfuAfAfAfaGfaAfaUfaGfaAf A-108485.2 uUfcUfaUfuUfcUfuuuAfuUfuGfaCfusAfsu
AD-52702.1 A-108867.1 AfgUfcAfaAfaAfUfGfaAfgAfgGfuAfaAf A-108407.2 uUfuAfcCfuCfuUfcauUfuUfuGfaCfusUfsg
AD-52703.1 A-108875.1 CfuUfgAfaAfgCfCfUfcCfuAfgAfaGfaAf A-108423.2 uUfcUfuCfuAfgGfaggCfuUfuCfaAfgsUfsu
AD-52704.1 A-108883.1 CfuUfcAfaCfaAfAfAfaGfuGfaAfaUfaUf A-108439.2 aUfaUfuUfcAfcUfuuuUfgUfuGfaAfgsUfsa
AD-52705.1 A-108891.1 CfaAfcUfaAfcUfAfAfcUfuAfaUfuCfaAf A-108455.2 uUfgAfaUfuAfaGfuuaGfuUfaGfuUfgsCfsu
AD-52706.1 A-108899.1 AfcCfaAfcAfgCfAfUfaGfuCfaAfaUfaAf A-108471.2 uUfaUfuUfgAfcUfaugCfuGfuUfgGfusUfsu
AD-52707.1 A-108907.1 GfaAfcCfcAfcAfGfAfaAfuUfuCfuCfuAf A-108487.2 uAfgAfgAfaAfuUfucuGfuGfgGfuUfcsUfsu
AD-52708.1 A-108868.1 GfaAfuAfuGfuCfAfCfuUfgAfaCfuCfaAf A-108409.2 uUfgAfgUfuCfaAfgugAfcAfuAfuUfcsUfsu
AD-52709.1 A-108876.1 UfgAfaAfgCfcUfCfCfuAfgAfaGfaAfaAf A-108425.2 uUfuUfcUfuCfuAfggaGfgCfuUfuCfasAfsg
AD-52710.1 A-108884.1 UfuCfaAfcAfaAfAfAfgUfgAfaAfuAfuUf A-108441.2 aAfuAfuUfuCfaCfuuuUfuGfuUfgAfasGfsu
AD-52711.1 A-108892.1 AfaCfuAfaCfuAfAfCfuUfaAfuUfcAfaAf A-108457.2 uUfuGfaAfuUfaAfguuAfgUfuAfgUfusGfsc
AD-52712.1 A-108900.1 CfcAfaCfaGfcAfUfAfgUfcAfaAfuAfaAf A-108473.2 uUfuAfuUfuGfaCfuauGfcUfgUfuGfgsUfsu
AD-52713.1 A-108908.1 AfaCfcCfaCfaGfAfAfaUfuUfcUfcUfaUf A-108489.2 aUfaGfaGfaAfaUfuucUfgUfgGfgUfusCfsu
AD-52714.1 A-108869.1 UfgUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAf A-108411.2 uUfgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasUfsa
AD-52715.1 A-108877.1 GfaAfaGfcCfuCfCfUfaGfaAfgAfaAfaAf A-108427.2 uUfuUfuCfuUfcUfaggAfgGfcUfuUfcsAfsa
AD-52716.1 A-108885.1 AfaUfaUfuUfaGfAfAfgAfgCfaAfcUfaAf A-108443.2 uUfaGfuUfgCfuCfuucUfaAfaUfaUfusUfsc
AD-52717.1 A-108893.1 AfcUfaAfcUfaAfCfUfuAfaUfuCfaAfaAf A-108459.2 uUfuUfgAfaUfuAfaguUfaGfuUfaGfusUfsg
AD-52718.1 A-108901.1 CfaAfcAfgCfaUfAfGfuCfaAfaUfaAfaAf A-108475.2 uUfuUfaUfuUfgAfcuaUfgCfuGfuUfgsGfsu
AD-52719.1 A-108909.1 CfcAfcAfgAfaAfUfUfuCfuCfuAfuCfuUf A-108491.2 aAfgAfuAfgAfgAfaauUfuCfuGfuGfgsGfsu
AD-52720.1 A-108870.1 GfuCfaCfuUfgAfAfCfuCfaAfcUfcAfaAf A-108413.2 uUfuGfaGfuUfgAfguuCfaAfgUfgAfcsAfsu
AD-52721.1 A-108878.1 CfuCfcUfaGfaAfGfAfaAfaAfaUfuCfuAf A-108429.2 uAfgAfaUfuUfuUfucuUfcUfaGfgAfgsGfsc
AD-52722.1 A-108886.1 AfuUfuAfgAfaGfAfGfcAfaCfuAfaCfuAf A-108445.2 uAfgUfuAfgUfuGfcucUfuCfuAfaAfusAfsu
AD-52723.1 A-108894.1 CfuAfaCfuAfaCfUfUfaAfuUfcAfaAfaUf A-108461.2 aUfuUfuGfaAfuUfaagUfuAfgUfuAfgsUfsu
AD-52724.1 A-108902.1 CfaGfcAfuAfgUfCfAfaAfuAfaAfaGfaAf A-108477.2 uUfcUfuUfuAfuUfugaCfuAfuGfcUfgsUfsu
AD-52725.1 A-108910.1 GfaAfaUfaAfgAfAfAfuGfuAfaAfaCfaUf A-108493.2 aUfgUfuUfuAfcAfuuuCfuUfaUfuUfcsAfsu
AD-52726.1 A-108871.1 UfcAfcUfuGfaAfCfUfcAfaCfuCfaAfaAf A-108415.2 uUfuUfgAfgUfuGfaguUfcAfaGfuGfasCfsa
AD-52727.1 A-108879.1 UfcUfaCfuUfcAfAfCfaAfaAfaGfuGfaAf A-108431.2 uUfcAfcUfuUfuUfguuGfaAfgUfaGfasAfsu
AD-52728.1 A-108887.1 UfuUfaGfaAfgAfGfCfaAfcUfaAfcUfaAf A-108447.2 uUfaGfuUfaGfuUfgcuCfuUfcUfaAfasUfsa
AD-52729.1 A-108895.1 AfaAfaCfaAfgAfUfAfaUfaGfcAfuCfaAf A-108463.2 uUfgAfuGfcUfaUfuauCfuUfgUfuUfusUfsc
AD-52730.1 A-108903.1 AfgCfaUfaGfuCfAfAfaUfaAfaAfgAfaAf A-108479.2 uUfuCfuUfuUfaUfuugAfcUfaUfgCfusGfsu
AD-52731.1 A-108958.1 AfgAfcCfcAfgCfAfAfcUfcUfcAfaGfuUf A-108495.2 aAfcUfuGfaGfaGfuugCfuGfgGfuCfusGfsa
AD-52732.1 A-108966.1 AfgUfcCfaUfgGfAfCfaUfuAfaUfuCfaAf A-108511.2 uUfgAfaUfuAfaUfgucCfaUfgGfaCfusAfsc
AD-52733.1 A-108974.1 GfaUfgGfaUfcAfCfAfaAfaCfuUfcAfaUf A-108527.2 aUfuGfaAfgUfuUfuguGfaUfcCfaUfcsUfsa
AD-52734.1 A-108982.1 CfuAfgAfgAfaGfAfUfaUfaCfuCfcAfuAf A-108543.2 uAfuGfgAfgUfaUfaucUfuCfuCfuAfgsGfsc
AD-52735.1 A-108990.1 AfaAfgAfcAfaCfAfAfaCfaUfuAfuAfuUf A-108559.2 aAfuAfuAfaUfgUfuugUfuGfuCfuUfusCfsc
AD-52736.1 A-108998.1 CfaUfuAfuAfuUfGfAfaUfaUfuCfuUfuUf A-108575.2 aAfaAfgAfaUfaUfucaAfuAfuAfaUfgsUfsu
AD-52737.1 A-108959.1 GfaCfcCfaGfcAfAfCfuCfuCfaAfgUfuUf A-108497.2 aAfaCfuUfgAfgAfguuGfcUfgGfgUfcsUfsg
AD-52739.1 A-108975.1 GfgAfuCfaCfaAfAfAfcUfuCfaAfuGfaAf A-108529.2 uUfcAfuUfgAfaGfuuuUfgUfgAfuCfcsAfsu
AD-52740.1 A-108983.1 GfaAfgAfuAfuAfCfUfcCfaUfaGfuGfaAf A-108545.2 uUfcAfcUfaUfgGfaguAfuAfuCfuUfcsUfsc
AD-52741.1 A-108991.1 GfaCfaAfcAfaAfCfAfuUfaUfaUfuGfaAf A-108561.2 uUfcAfaUfaUfaAfuguUfuGfuUfgUfcsUfsu
AD-52742.1 A-108999.1 GfgGfaAfaUfcAfCfGfaAfaCfcAfaCfuAf A-108577.2 uAfgUfuGfgUfuUfcguGfaUfuUfcCfcsAfsa
AD-52743.1 A-108960.1 AfcCfcAfgCfaAfCfUfcUfcAfaGfuUfuUf A-108499.2 aAfaAfcUfuGfaGfaguUfgCfuGfgGfusCfsu
AD-52744.1 A-108968.1 GfgAfcAfuUfaAfUfUfcAfaCfaUfcGfaAf A-108515.2 uUfcGfaUfgUfuGfaauUfaAfuGfuCfcsAfsu
AD-52745.1 A-108976.1 GfaUfcAfcAfaAfAfCfuUfcAfaUfgAfaAf A-108531.2 uUfuCfaUfuGfaAfguuUfuGfuGfaUfcsCfsa
AD-52746.1 A-108984.1 AfcUfcCfaUfaGfUfGfaAfgCfaAfuCfuAf A-108547.2 uAfgAfuUfgCfuUfcacUfaUfgGfaGfusAfsu
AD-52747.1 A-108992.1 AfcAfaCfaAfaCfAfUfuAfuAfuUfgAfaUf A-108563.2 aUfuCfaAfuAfuAfaugUfuUfgUfuGfusCfsu
AD-52748.1 A-109000.1 GfgAfaAfuCfaCfGfAfaAfcCfaAfcUfaUf A-108579.2 aUfaGfuUfgGfuUfucgUfgAfuUfuCfcsCfsa
AD-52749.1 A-108961.1 CfcCfaGfcAfaCfUfCfuCfaAfgUfuUfuUf A-108501.2 aAfaAfaCfuUfgAfgagUfuGfcUfgGfgsUfsc
AD-52750.1 A-108969.1 GfaCfaUfuAfaUfUfCfaAfcAfuCfgAfaUf A-108517.2 aUfuCfgAfuGfuUfgaaUfuAfaUfgUfcsCfsa
AD-52751.1 A-108977.1 AfaCfgUfgGfgAfGfAfaCfuAfcAfaAfuAf A-108533.2 uAfuUfuGfuAfgUfucuCfcCfaCfgUfusUfsc
AD-52752.1 A-108985.1 CfuCfcAfuAfgUfGfAfaGfcAfaUfcUfaAf A-108549.2 uUfaGfaUfuGfcUfucaCfuAfuGfgAfgsUfsa
AD-52753.1 A-108993.1 CfaAfcAfaAfcAfUfUfaUfaUfuGfaAfuAf A-108565.2 uAfuUfcAfaUfaUfaauGfuUfuGfuUfgsUfsc
AD-52754.1 A-109001.1 GfaAfaUfcAfcGfAfAfaCfcAfaCfuAfuAf A-108581.2 uAfuAfgUfuGfgUfuucGfuGfaUfuUfcsCfsc
AD-52755.1 A-108962.1 CfuCfuCfaAfgUfUfUfuUfcAfuGfuCfuAf A-108503.2 uAfgAfcAfuGfaAfaaaCfuUfgAfgAfgsUfsu
AD-52756.1 A-108970.1 AfcAfuUfaAfuUfCfAfaCfaUfcGfaAfuAf A-108519.2 uAfuUfcGfaUfgUfugaAfuUfaAfuGfusCfsc
AD-52757.1 A-108978.1 GfgGfaGfaAfcUfAfCfaAfaUfaUfgGfuUf A-108535.2 aAfcCfaUfaUfuUfguaGfuUfcUfcCfcsAfsc
AD-52758.1 A-108986.1 UfcCfaUfaGfuGfAfAfgCfaAfuCfuAfaUf A-108551.2 aUfuAfgAfuUfgCfuucAfcUfaUfgGfasGfsu
AD-52759.1 A-108994.1 AfaCfaAfaCfaUfUfAfuAfuUfgAfaUfaUf A-108567.2 aUfaUfuCfaAfuAfuaaUfgUfuUfgUfusGfsu
AD-52760.1 A-109002.1 UfgGfcAfaUfgUfCfCfcCfaAfuGfcAfaUf A-108583.2 aUfuGfcAfuUfgGfggaCfaUfuGfcCfasGfsu
AD-52761.1 A-108963.1 UfcAfgGfuAfgUfCfCfaUfgGfaCfaUfuAf A-108505.2 uAfaUfgUfcCfaUfggaCfuAfcCfuGfasUfsa
AD-52762.1 A-108971.1 UfuAfaUfuCfaAfCfAfuCfgAfaUfaGfaUf A-108521.2 aUfcUfaUfuCfgAfuguUfgAfaUfuAfasUfsg
AD-52763.1 A-108979.1 GfgAfgAfaCfuAfCfAfaAfuAfuGfgUfuUf A-108537.2 aAfaCfcAfuAfuUfuguAfgUfuCfuCfcsCfsa
AD-52764.1 A-108987.1 CfcAfuAfgUfgAfAfGfcAfaUfcUfaAfuUf A-108553.2 aAfuUfaGfaUfuGfcuuCfaCfuAfuGfgsAfsg
AD-52765.1 A-108995.1 AfcAfaAfcAfuUfAfUfaUfuGfaAfuAfuUf A-108569.2 aAfuAfuUfcAfaUfauaAfuGfuUfuGfusUfsg
AD-52766.1 A-109003.1 AfaUfgCfaAfuCfCfCfgGfaAfaAfcAfaAf A-108585.2 uUfuGfuUfuUfcCfgggAfuUfgCfaUfusGfsg
AD-52767.1 A-108964.1 CfaGfgUfaGfuCfCfAfuGfgAfcAfuUfaAf A-108507.2 uUfaAfuGfuCfcAfuggAfcUfaCfcUfgsAfsu
AD-52768.1 A-108972.1 UfuCfaAfcAfuCfGfAfaUfaGfaUfgGfaUf A-108523.2 aUfcCfaUfcUfaUfucgAfuGfuUfgAfasUfsu
AD-52769.1 A-108980.1 GfuUfgGfgCfcUfAfGfaGfaAfgAfuAfuAf A-108539.2 uAfuAfuCfuUfcUfcuaGfgCfcCfaAfcsCfsa
AD-52770.1 A-108988.1 CfaUfaGfuGfaAfGfCfaAfuCfuAfaUfuAf A-108555.2 uAfaUfuAfgAfuUfgcuUfcAfcUfaUfgsGfsa
AD-52771.1 A-108996.1 AfaCfaUfuAfuAfUfUfgAfaUfaUfuCfuUf A-108571.2 aAfgAfaUfaUfuCfaauAfuAfaUfgUfusUfsg
AD-52772.1 A-109004.1 GfcAfaUfcCfcGfGfAfaAfaCfaAfaGfaUf A-108587.2 aUfcUfuUfgUfuUfuccGfgGfaUfuGfcsAfsu
AD-52773.1 A-108965.1 GfgUfaGfuCfcAfUfGfgAfcAfuUfaAfuUf A-108509.2 aAfuUfaAfuGfuCfcauGfgAfcUfaCfcsUfsg
AD-52774.1 A-108973.1 AfuCfgAfaUfaGfAfUfgGfaUfcAfcAfaAf A-108525.2 uUfuGfuGfaUfcCfaucUfaUfuCfgAfusGfsu
AD-52775.1 A-108981.1 CfcUfaGfaGfaAfGfAfuAfuAfcUfcCfaUf A-108541.2 aUfgGfaGfuAfuAfucuUfcUfcUfaGfgsCfsc
AD-52776.1 A-108989.1 GfuUfgGfaAfgAfCfUfgGfaAfaGfaCfaAf A-108557.2 uUfgUfcUfuUfcCfaguCfuUfcCfaAfcsUfsc
AD-52777.1 A-108997.1 AfcAfuUfaUfaUfUfGfaAfuAfuUfcUfuUf A-108573.2 aAfaGfaAfuAfuUfcaaUfaUfaAfuGfusUfsu
AD-52778.1 A-109005.1 CfaAfuCfcCfgGfAfAfaAfcAfaAfgAfuUf A-108589.2 aAfuCfuUfuGfuUfuucCfgGfgAfuUfgsCfsa
AD-52779.1 A-109013.1 CfuAfcUfuGfgGfAfUfcAfcAfaAfgCfaAf A-108605.2 uUfgCfuUfuGfuGfaucCfcAfaGfuAfgsAfsa
AD-52780.1 A-109021.1 AfcAfaCfcUfaAfAfUfgGfuAfaAfuAfuAf A-108621.2 uAfuAfuUfuAfcCfauuUfaGfgUfuGfusUfsu
AD-52781.1 A-109029.1 AfuCfcAfuCfcAfAfCfaGfaUfuCfaGfaAf A-108637.2 uUfcUfgAfaUfcUfguuGfgAfuGfgAfusCfsa
AD-52782.1 A-109037.1 AfaCfuGfaGfgCfAfAfaUfuUfaAfaAfgAf A-108653.2 uCfuUfuUfaAfaUfuugCfcUfcAfgUfusCfsa
AD-52783.1 A-109045.1 AfgAfgUfaUfgUfGfUfaAfaAfaUfcUfgUf A-108669.2 aCfaGfaUfuUfuUfacaCfaUfaCfuCfusGfsu
AD-52784.1 A-109006.1 AfaUfcCfcGfgAfAfAfaCfaAfaGfaUfuUf A-108591.2 aAfaUfcUfuUfgUfuuuCfcGfgGfaUfusGfsc
AD-52785.1 A-109014.1 UfaCfuUfgGfgAfUfCfaCfaAfaGfcAfaAf A-108607.2 uUfuGfcUfuUfgUfgauCfcCfaAfgUfasGfsa
AD-52786.1 A-109022.1 CfaAfcCfuAfaAfUfGfgUfaAfaUfaUfaAf A-108623.2 uUfaUfaUfuUfaCfcauUfuAfgGfuUfgsUfsu
AD-52787.1 A-109030.1 UfuGfaAfuGfaAfCfUfgAfgGfcAfaAfuUf A-108639.2 aAfuUfuGfcCfuCfaguUfcAfuUfcAfasAfsg
AD-52788.1 A-109038.1 AfcUfgAfgGfcAfAfAfuUfuAfaAfaGfgAf A-108655.2 uCfcUfuUfuAfaAfuuuGfcCfuCfaGfusUfsc
AD-52789.1 A-109046.1 GfaGfuAfuGfuGfUfAfaAfaAfuCfuGfuAf A-108671.2 uAfcAfgAfuUfuUfuacAfcAfuAfcUfcsUfsg
AD-52791.1 A-109015.1 AfcUfuGfgGfaUfCfAfcAfaAfgCfaAfaAf A-108609.2 uUfuUfgCfuUfuGfugaUfcCfcAfaGfusAfsg
AD-52792.1 A-109023.1 AfuGfgUfaAfaUfAfUfaAfcAfaAfcCfaAf A-108625.2 uUfgGfuUfuGfuUfauaUfuUfaCfcAfusUfsu
AD-52793.1 A-109031.1 UfgAfaUfgAfaCfUfGfaGfgCfaAfaUfuUf A-108641.2 aAfaUfuUfgCfcUfcagUfuCfaUfuCfasAfsa
AD-52794.1 A-109039.1 CfuGfaGfgCfaAfAfUfuUfaAfaAfgGfcAf A-108657.2 uGfcCfuUfuUfaAfauuUfgCfcUfcAfgsUfsu
AD-52795.1 A-109047.1 AfgUfaUfgUfgUfAfAfaAfaUfcUfgUfaAf A-108673.2 uUfaCfaGfaUfuUfuuaCfaCfaUfaCfusCfsu
AD-52796.1 A-109008.1 GfaAfaAfcAfaAfGfAfuUfuGfgUfgUfuUf A-108595.2 aAfaCfaCfcAfaAfucuUfuGfuUfuUfcsCfsg
AD-52797.1 A-109016.1 AfgUfgUfgGfaGfAfAfaAfcAfaCfcUfaAf A-108611.2 uUfaGfgUfuGfuUfuucUfcCfaCfaCfusCfsa
AD-52798.1 A-109024.1 GfuCfuCfaAfaAfUfGfgAfaGfgUfuAfuAf A-108627.2 uAfuAfaCfcUfuCfcauUfuUfgAfgAfcsUfsu
AD-52799.1 A-109032.1 GfaAfuGfaAfcUfGfAfgGfcAfaAfuUfuAf A-108643.2 uAfaAfuUfuGfcCfucaGfuUfcAfuUfcsAfsa
AD-52800.1 A-109040.1 UfgAfgGfcAfaAfUfUfuAfaAfaGfgCfaAf A-108659.2 uUfgCfcUfuUfuAfaauUfuGfcCfuCfasGfsu
AD-52801.1 A-109048.1 GfuAfuGfuGfuAfAfAfaAfuCfuGfuAfaUf A-108675.2 aUfuAfcAfgAfuUfuuuAfcAfcAfuAfcsUfsc
AD-52802.1 A-109009.1 AfaAfaCfaAfaGfAfUfuUfgGfuGfuUfuUf A-108597.2 aAfaAfcAfcCfaAfaucUfuUfgUfuUfusCfsc
AD-52803.1 A-109017.1 GfuGfuGfgAfgAfAfAfaCfaAfcCfuAfaAf A-108613.2 uUfuAfgGfuUfgUfuuuCfuCfcAfcAfcsUfsc
AD-52804.1 A-109025.1 AfuGfgAfaGfgUfUfAfuAfcUfcUfaUfaAf A-108629.2 uUfaUfaGfaGfuAfuaaCfcUfuCfcAfusUfsu
AD-52805.1 A-109033.1 AfaUfgAfaCfuGfAfGfgCfaAfaUfuUfaAf A-108645.2 uUfaAfaUfuUfgCfcucAfgUfuCfaUfusCfsa
AD-52806.1 A-109041.1 GfaGfgCfaAfaUfUfUfaAfaAfgGfcAfaUf A-108661.2 aUfuGfcCfuUfuUfaaaUfuUfgCfcUfcsAfsg
AD-52807.1 A-109049.1 UfaUfgUfgUfaAfAfAfaUfcUfgUfaAfuAf A-108677.2 uAfuUfaCfaGfaUfuuuUfaCfaCfaUfasCfsu
AD-52808.1 A-109010.1 AfcAfaAfgAfuUfUfGfgUfgUfuUfuCfuAf A-108599.2 uAfgAfaAfaCfaCfcaaAfuCfuUfuGfusUfsu
AD-52809.1 A-109018.1 UfgUfgGfaGfaAfAfAfcAfaCfcUfaAfaUf A-108615.2 aUfuUfaGfgUfuGfuuuUfcUfcCfaCfasCfsu
AD-52810.1 A-109026.1 UfgGfaAfgGfuUfAfUfaCfuCfuAfuAfaAf A-108631.2 uUfuAfuAfgAfgUfauaAfcCfuUfcCfasUfsu
AD-52811.1 A-109034.1 AfuGfaAfcUfgAfGfGfcAfaAfuUfuAfaAf A-108647.2 uUfuAfaAfuUfuGfccuCfaGfuUfcAfusUfsc
AD-52812.1 A-109042.1 AfgGfcAfaAfuUfUfAfaAfaGfgCfaAfuAf A-108663.2 uAfuUfgCfcUfuUfuaaAfuUfuGfcCfusCfsa
AD-52813.1 A-109011.1 AfaGfaUfuUfgGfUfGfuUfuUfcUfaCfuUf A-108601.2 aAfgUfaGfaAfaAfcacCfaAfaUfcUfusUfsg
AD-52814.1 A-109019.1 AfaAfcAfaCfcUfAfAfaUfgGfuAfaAfuAf A-108617.2 uAfuUfuAfcCfaUfuuaGfgUfuGfuUfusUfsc
AD-52815.1 A-109027.1 AfuAfcUfcUfaUfAfAfaAfuCfaAfcCfaAf A-108633.2 uUfgGfuUfgAfuUfuuaUfaGfaGfuAfusAfsa
AD-52816.1 A-109035.1 UfgAfaCfuGfaGfGfCfaAfaUfuUfaAfaAf A-108649.2 uUfuUfaAfaUfuUfgccUfcAfgUfuCfasUfsu
AD-52817.1 A-109043.1 GfgCfaAfaUfuUfAfAfaAfgGfcAfaUfaAf A-108665.2 uUfaUfuGfcCfuUfuuaAfaUfuUfgCfcsUfsc
AD-52818.1 A-109012.1 UfuUfuCfuAfcUfUfGfgGfaUfcAfcAfaAf A-108603.2 uUfuGfuGfaUfcCfcaaGfuAfgAfaAfasCfsa
AD-52819.1 A-109020.1 AfaCfaAfcCfuAfAfAfuGfgUfaAfaUfaUf A-108619.2 aUfaUfuUfaCfcAfuuuAfgGfuUfgUfusUfsu
AD-52820.1 A-109028.1 UfaCfuCfuAfuAfAfAfaUfcAfaCfcAfaAf A-108635.2 uUfuGfgUfuGfaUfuuuAfuAfgAfgUfasUfsa
AD-52821.1 A-109036.1 GfaAfcUfgAfgGfCfAfaAfuUfuAfaAfaAf A-108651.2 uUfuUfuAfaAfuUfugcCfuCfaGfuUfcsAfsu
AD-52822.1 A-109044.1 CfaGfaGfuAfuGfUfGfuAfaAfaAfuCfuUf A-108667.2 aAfgAfuUfuUfuAfcacAfuAfcUfcUfgsUfsg
Таблица 11
Результаты скрининга однократной дозы с использованием дцРНК ANGPTL3, конъюгированной с GalNac
Тестировали модифицированные дцРНК посредством трансфекции клеток HEP3b и свободного поглощения в клетках яванского макака (PCH) в указанных выше дозах.
ID дуплекса 10 нМ (RNAimax) 0,1 нМ (RNAimax) 500 нМ PCH Celsis (FU) 100 нМ PCH Celsis (FU) 10 нМ PCH Celsis (FU) станд. отклон. 10 нМ (RNAimax) станд. отклон. 0,1 нМ (RNAimax) станд. отклон. 500 нМ (FU) станд. отклон. 100 нМ (FU) станд. отклон. 10 нМ (FU)
AD1955/ нативные FU 0,93 0,93 1,01 0,91 1,17 0,02 0,08 0,09 0,00 0,07
AD1955/ нативные FU 1,02 1,09 1,07 1,07 0,92 0,06 0,04 0,02 0,00 0,03
AD1955/ нативные FU 1,06 0,99 0,93 1,02 0,93 0,03 0,00 0,09 0,01 0,02
AD1955/ нативные FU 1,05 0,90 1,05 1,03 1,03 0,04 0,02 0,01 0,05 0,01
AD1955/ нативные FU 1,06 1,08 0,90 0,97 1,03 0,02 0,01 0,02 0,04 0,09
AD1955/ нативные FU 0,90 1,03 1,05 1,00 0,94 0,04 0,03 0,01 0,04 0,05
AD-45165 (TTR) 0,91 0,98 1,06 0,98 0,96 0,05 0,01 0,05 0,00 0,00
AD-52953.1 0,06 0,34 0,15 0,17 0,46 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01
AD-52954.1 0,09 0,39 0,17 0,20 0,55 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00
AD-52955.1 0,11 0,59 0,38 0,41 0,75 0,01 0,04 0,02 0,01 0,12
AD-52956.1 0,31 0,94 0,79 0,94 1,17 0,01 0,00 0,02 0,06 0,02
AD-52957.1 0,13 0,61 0,35 0,38 0,73 0,01 0,00 0,01 0,00 0,04
AD-52958.1 0,19 0,74 0,66 0,71 0,97 0,01 0,01 0,02 0,07 0,06
AD-52960.1 0,14 0,59 0,31 0,32 0,55 0,01 0,01 0,00 0,02 0,02
AD-52961.1 0,05 0,66 0,27 0,24 0,49 0,00 0,00 0,00 0,02 0,02
AD-52962.1 0,83 0,89 1,03 1,02 1,26 0,02 0,05 0,07 0,07 0,07
AD-52963.1 0,07 0,72 0,46 0,56 0,91 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06
AD-52964.1 0,13 0,73 0,41 0,47 0,68 0,01 0,03 0,02 0,03 0,01
AD-52965.1 0,07 0,44 0,16 0,18 0,43 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01
AD-52966.1 0,12 0,76 0,67 0,72 0,96 0,00 0,02 0,05 0,01 0,01
AD-52967.1 0,10 0,75 0,44 0,58 0,89 0,01 0,04 0,02 0,03 0,04
AD-52968.1 1,01 0,96 0,87 0,91 1,15 0,00 0,01 0,09 0,03 0,02
AD-52969.1 0,04 0,46 0,22 0,29 0,59 0,00 0,00 0,01 0,02 0,04
AD-52970.1 0,06 0,45 0,27 0,30 0,51 0,00 0,00 0,01 0,02 0,00
AD-52971.1 0,08 0,55 0,20 0,22 0,45 0,00 0,00 0,01 0,02 0,05
AD-52972.1 0,10 0,73 0,41 0,49 0,81 0,00 0,01 0,01 0,02 0,01
AD-52973.1 0,11 0,73 0,36 0,46 0,75 0,01 0,01 0,03 0,02 0,02
AD-52974.1 1,00 0,95 1,00 1,09 1,27 0,01 0,01 0,08 0,05 0,06
AD-52975.1 0,07 0,54 0,25 0,34 0,66 0,00 0,01 0,01 0,01 0,03
AD-52976.1 0,17 0,59 0,35 0,41 0,65 0,00 0,02 0,04 0,01 0,01
AD-52977.1 0,07 0,45 0,16 0,25 0,50 0,01 0,02 0,00 0,02 0,03
AD-52978.1 0,10 0,72 0,39 0,53 0,77 0,00 0,02 0,00 0,08 0,03
AD-52979.1 0,54 0,92 0,99 1,12 1,28 0,01 0,02 0,02 0,04 0,05
AD-52980.1 0,29 0,85 0,67 0,85 1,03 0,01 0,01 0,05 0,05 0,04
AD-52981.1 0,07 0,44 0,20 0,26 0,59 0,01 0,02 0,00 0,00 0,03
AD-52982.1 0,28 0,87 0,67 0,99 1,14 0,01 0,01 0,04 0,00 0,01
AD-52983.1 0,06 0,40 0,14 0,40 0,46 0,00 0,00 0,01 0,05 0,02
AD-52984.1 0,29 0,87 0,66 0,74 1,09 0,01 0,02 0,01 0,00 0,00
AD-52985.1 0,72 0,87 0,89 1,18 1,22 0,03 0,00 0,05 0,03 0,16
AD-52986.1 0,08 0,47 0,24 0,30 0,48 0,00 0,02 0,02 0,00 0,06
AD-52987.1 0,16 0,83 0,42 0,73 1,09 0,00 0,00 0,01 0,02 0,02
AD-52988.1 0,11 0,73 0,42 0,60 0,96 0,01 0,04 0,00 0,00 0,10
AD-52989.1 0,05 0,48 0,15 0,42 0,46 0,00 0,02 0,00 0,02 0,00
AD-52990.1 0,14 0,86 0,33 0,45 0,77 0,00 0,01 0,00 0,02 0,05
AD-52991.1 0,16 0,86 0,58 0,69 1,05 0,00 0,00 0,02 0,00 0,02
AD-52992.1 0,08 0,65 0,42 0,56 0,90 0,00 0,01 0,02 0,01 0,00
AD-52993.1 0,13 0,87 0,53 0,76 1,08 0,02 0,03 0,04 0,04 0,00
AD-52994.1 0,10 0,52 0,28 0,33 0,53 0,01 0,00 0,02 0,00 0,01
AD-52995.1 0,06 0,56 0,19 0,41 0,60 0,00 0,01 0,04 0,02 0,05
AD-52996.1 0,09 0,68 0,26 0,47 0,68 0,00 0,03 0,01 0,04 0,01
AD-52997.1 0,59 1,03 0,87 0,51 1,25 0,05 0,01 0,00 0,01 0,01
AD-52998.1 0,09 0,79 0,44 0,55 0,85 0,00 0,00 0,04 0,03 0,10
AD-52999.1 0,08 0,57 0,17 0,36 0,84 0,01 0,00 0,01 0,02 0,00
AD-53000.1 0,38 0,94 0,58 0,67 0,85 0,01 0,02 0,03 0,03 0,02
AD-53001.1 0,05 0,48 0,21 0,18 0,40 0,00 0,00 0,01 0,00 0,05
AD-53002.1 0,07 0,65 0,43 0,48 0,80 0,00 0,05 0,04 0,01 0,02
AD-53003.1 0,05 0,46 0,31 0,34 0,56 0,01 0,01 0,00 0,02 0,05
AD-53004.1 0,05 0,36 0,29 0,66 0,57 0,00 0,01 0,03 0,35 0,02
AD-53005.1 0,05 0,72 0,32 0,58 0,83 0,01 0,00 0,01 0,29 0,00
AD-53006.1 0,21 0,82 0,66 0,77 1,03 0,01 0,00 0,02 0,07 0,02
AD-53007.1 0,12 0,76 0,55 0,73 0,74 0,01 0,00 0,00 0,08 0,20
AD-53008.1 0,07 0,68 0,28 0,36 0,84 0,00 0,02 0,01 0,05 0,03
AD-53009.1 0,10 0,61 0,48 0,60 0,91 0,00 0,02 0,01 0,01 0,06
AD-53010.1 0,05 0,58 0,47 0,54 0,84 0,00 0,02 0,00 0,02 0,03
AD-53011.1 0,07 0,65 0,29 0,34 0,84 0,00 0,03 0,07 0,01 0,04
AD-53012.1 0,06 0,55 0,36 0,45 0,70 0,00 0,03 0,02 0,02 0,00
AD-53013.1 0,11 0,85 0,59 0,70 1,01 0,00 0,00 0,03 0,03 0,02
AD-53014.1 0,16 0,78 0,61 0,78 1,11 0,00 0,02 0,01 0,05 0,00
AD-53015.1 0,03 0,35 0,25 0,37 0,46 0,01 0,01 0,01 0,00 0,01
AD-53016.1 0,03 0,56 0,40 0,58 1,01 0,00 0,01 0,02 0,06 0,09
AD-53017.1 0,07 0,71 0,64 0,78 0,98 0,00 0,01 0,01 0,05 0,00
AD-53018.1 0,30 0,96 0,75 0,97 1,14 0,00 0,02 0,02 0,03 0,05
AD-53019.1 0,27 0,99 0,77 1,05 1,31 0,00 0,01 0,01 0,04 0,00
AD-53020.1 0,04 0,64 0,32 0,45 0,69 0,00 0,00 0,03 0,02 0,03
AD-53021.1 0,04 0,68 0,36 0,48 0,70 0,01 0,01 0,02 0,07 0,00
AD-53022.1 0,05 0,76 0,36 0,59 1,04 0,01 0,01 0,02 0,03 0,06
AD-53023.1 0,10 0,83 0,69 0,84 0,97 0,01 0,01 0,06 0,02 0,01
AD-53024.1 0,09 0,44 0,23 0,23 0,44 0,00 0,00 0,03 0,01 0,02
AD-53025.1 0,09 0,87 0,58 0,80 1,09 0,00 0,03 0,01 0,04 0,04
AD-53026.1 0,05 0,60 0,35 0,46 0,77 0,01 0,01 0,02 0,05 0,03
AD-53027.1 0,02 0,32 0,26 0,30 0,45 0,00 0,01 0,02 0,03 0,02
AD-53028.1 0,19 0,82 0,77 0,95 1,04 0,01 0,04 0,05 0,01 0,03
AD-53029.1 0,02 0,52 0,32 0,41 0,72 0,00 0,00 0,01 0,02 0,07
AD-53030.1 0,09 0,42 0,15 0,16 0,46 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02
AD-53031.1 0,12 0,79 0,63 0,73 1,04 0,02 0,05 0,02 0,04 0,03
AD-53032.1 0,12 0,71 0,41 0,59 0,90 0,01 0,00 0,02 0,04 0,00
AD-53033.1 0,02 0,48 0,20 0,21 0,51 0,00 0,02 0,02 0,01 0,00
AD-53034.1 0,04 0,52 0,31 0,36 0,71 0,00 0,01 0,07 0,02 0,01
AD-53035.1 0,02 0,63 0,34 0,50 0,85 0,00 0,02 0,03 0,00 0,03
AD-53036.1 0,10 0,57 0,31 0,35 0,65 0,01 0,01 0,03 0,03 0,01
AD-53037.1 0,08 0,47 0,27 0,36 0,60 0,00 0,02 0,01 0,03 0,01
AD-53038.1 0,05 0,85 0,48 0,63 1,08 0,00 0,05 0,00 0,02 0,05
AD-53039.1 0,08 0,82 0,45 0,64 0,97 0,00 0,01 0,01 0,03 0,00
AD-53040.1 0,05 0,79 0,46 0,62 0,97 0,01 0,01 0,01 0,05 0,06
AD-53041.1 0,06 0,72 0,59 0,61 0,86 0,00 0,01 0,05 0,06 0,03
AD-53042.1 0,08 0,85 0,30 0,35 0,81 0,01 0,00 0,00 0,03 0,03
AD-53043.1 0,63 1,00 0,92 1,04 1,07 0,03 0,00 0,06 0,03 0,07
AD-53044.1 0,05 0,91 0,35 0,61 0,97 0,01 0,01 0,01 0,04 0,02
AD-53045.1 0,20 1,00 0,85 1,00 0,98 0,00 0,03 0,04 0,01 0,04
AD-53046.1 0,07 0,70 0,44 0,62 1,12 0,00 0,01 0,03 0,00 0,09
AD-53059.1 0,35 1,04 0,75 0,85 0,86 0,01 0,01 0,03 0,02 0,04
AD-53060.1 0,34 0,85 0,72 0,96 0,82 0,00 0,01 0,02 0,01 0,02
AD-53061.1 0,17 0,94 0,36 0,37 0,59 0,00 0,00 0,02 0,00 0,02
AD-53062.1 0,09 0,76 0,43 0,47 0,69 0,01 0,01 0,01 0,03 0,01
AD-53063.1 0,06 0,48 0,18 0,16 0,25 0,00 0,01 0,01 0,01 0,02
AD-53064.1 0,07 0,59 0,22 0,22 0,48 0,01 0,02 0,01 0,02 0,06
AD-53065.1 0,08 0,97 0,45 0,39 0,64 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01
AD-53066.1 0,12 0,99 0,73 0,67 0,88 0,01 0,03 0,01 0,01 0,05
AD-53067.1 0,12 1,08 0,59 0,60 0,79 0,00 0,12 0,01 0,01 0,03
AD-53068.1 0,09 0,98 0,46 0,59 0,83 0,00 0,03 0,04 0,07 0,05
AD-53069.1 0,04 0,69 0,35 0,43 0,59 0,00 0,01 0,01 0,04 0,01
AD-53070.1 0,17 1,12 0,88 0,83 0,98 0,00 0,01 0,04 0,00 0,01
AD-53071.1 0,07 0,70 0,23 0,23 0,43 0,00 0,00 0,02 0,00 0,01
AD-53072.1 0,10 0,90 0,49 0,48 0,75 0,01 0,05 0,00 0,01 0,02
AD-53073.1 0,07 0,63 0,27 0,30 0,43 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00
AD-53074.1 0,07 0,88 0,46 0,49 0,62 0,01 0,08 0,01 0,06 0,03
AD-53075.1 0,05 0,76 0,29 0,35 0,50 0,01 0,01 0,00 0,02 0,03
AD-53076.1 0,09 0,80 0,31 0,40 0,54 0,01 0,01 0,02 0,05 0,02
AD-53077.1 0,07 0,96 0,29 0,28 0,49 0,00 0,03 0,00 0,01 0,01
AD-53078.1 0,16 0,95 0,51 0,51 0,70 0,00 0,04 0,01 0,01 0,06
AD-53079.1 0,08 0,96 0,59 0,67 0,83 0,00 0,02 0,01 0,03 0,01
AD-53080.1 0,04 0,63 0,20 0,22 0,43 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01
AD-53081.1 0,16 1,02 0,63 0,75 0,87 0,00 0,09 0,00 0,02 0,05
AD-53082.1 0,06 0,94 0,50 0,52 0,66 0,01 0,06 0,02 0,03 0,03
AD-53083.1 0,14 0,87 0,48 0,50 0,80 0,01 0,02 0,04 0,06 0,01
AD-53084.1 0,12 0,95 0,50 0,47 0,72 0,01 0,03 0,04 0,00 0,00
AD-53085.1 0,27 1,02 0,68 0,81 0,99 0,01 0,01 0,01 0,05 0,02
AD-53086.1 0,05 0,60 0,26 0,25 0,48 0,00 0,01 0,03 0,00 0,01
AD-53087.1 0,05 0,56 0,32 0,39 0,53 0,00 0,01 0,01 0,03 0,02
AD-53088.1 0,09 0,89 0,53 0,69 0,87 0,00 0,01 0,02 0,04 0,02
AD-53089.1 0,29 0,97 0,58 0,57 0,78 0,01 0,00 0,02 0,02 0,02
AD-53090.1 0,13 0,86 0,56 0,55 0,73 0,00 0,01 0,01 0,03 0,00
AD-53091.1 0,12 0,82 0,27 0,35 0,66 0,00 0,03 0,03 0,01 0,07
AD-53092.1 0,05 0,66 0,26 0,29 0,42 0,00 0,01 0,02 0,04 0,02
AD-53093.1 0,08 0,68 0,36 0,44 0,55 0,00 0,02 0,03 0,04 0,10
AD-53094.1 0,32 1,00 1,05 0,92 1,11 0,02 0,01 0,01 0,00 0,03
AD-53095.1 0,14 0,77 0,29 0,29 0,49 0,00 0,02 0,00 0,01 0,01
AD-53096.1 0,30 0,96 0,61 0,57 0,73 0,03 0,01 0,02 0,02 0,01
AD-53097.1 0,37 0,97 0,67 0,82 0,86 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01
AD-53098.1 0,06 0,65 0,22 0,30 0,43 0,00 0,03 0,03 0,00 0,01
AD-53099.1 0,34 0,99 0,61 0,81 0,91 0,00 0,00 0,04 0,02 0,06
AD-53100.1 0,31 1,04 0,95 1,03 1,00 0,02 0,01 0,06 0,02 0,17
AD-53101.1 0,46 0,93 0,63 0,69 0,78 0,00 0,01 0,04 0,03 0,04
AD-53102.1 0,23 0,80 0,60 0,55 0,66 0,00 0,03 0,01 0,02 0,03
AD-53103.1 0,05 0,61 0,27 0,32 0,50 0,01 0,02 0,00 0,01 0,00
AD-53104.1 0,13 0,80 0,64 0,68 0,77 0,00 0,02 0,03 0,01 0,05
AD-53105.1 0,15 0,77 0,43 0,65 0,77 0,01 0,03 0,02 0,02 0,05
AD-53106.1 0,16 0,87 0,72 0,70 0,83 0,01 0,02 0,00 0,00 0,04
AD-53107.1 0,19 0,95 0,62 0,65 0,90 0,00 0,02 0,01 0,03 0,04
AD-53108.1 0,22 0,94 0,60 0,68 0,81 0,00 0,01 0,00 0,03 0,04
AD-53109.1 0,16 1,01 0,82 0,78 0,96 0,01 0,08 0,04 0,01 0,07
AD-53110.1 0,10 0,86 0,79 0,77 0,94 0,00 0,05 0,03 0,01 0,05
AD-53111.1 0,22 0,78 0,94 0,85 1,04 0,01 0,01 0,01 0,01 0,07
AD-53112.1 0,09 0,96 0,64 0,65 0,86 0,01 0,02 0,07 0,07 0,00
AD-53113.1 0,10 0,97 0,71 0,77 0,88 0,01 0,05 0,01 0,02 0,01
AD-53114.1 0,19 0,83 0,48 0,52 0,66 0,01 0,01 0,02 0,01 0,00
AD-53115.1 0,10 0,59 0,42 0,44 0,66 0,01 0,03 0,04 0,00 0,02
AD-53116.1 0,11 0,87 0,82 0,85 0,95 0,00 0,05 0,05 0,05 0,05
AD-53117.1 0,52 0,64 1,21 1,00 1,08 0,01 0,03 0,09 0,04 0,07
AD-53118.1 0,19 1,04 0,60 0,72 0,94 0,00 0,07 0,02 0,05 0,06
AD-53119.1 0,06 0,77 0,44 0,47 0,64 0,01 0,03 0,00 0,01 0,01
AD-53120.1 0,10 0,97 0,78 0,89 1,01 0,01 0,04 0,05 0,01 0,04
AD-53121.1 0,23 0,80 0,58 0,69 0,90 0,01 0,02 0,04 0,02 0,06
AD-53122.1 0,09 0,80 0,90 0,94 1,09 0,01 0,07 0,02 0,04 0,10
AD-53123.1 0,27 0,74 0,95 0,93 0,97 0,00 0,01 0,03 0,01 0,08
AD-53124.1 0,08 0,81 0,33 0,34 0,61 0,01 0,02 0,00 0,01 0,01
AD-53125.1 0,08 0,82 0,34 0,38 0,58 0,00 0,02 0,00 0,01 0,07
AD-53126.1 0,15 0,95 0,70 0,86 1,06 0,01 0,04 0,05 0,02 0,00
AD-53127.1 0,21 0,81 0,62 0,75 0,91 0,02 0,04 0,01 0,03 0,00
AD-53128.1 0,08 0,79 0,80 1,14 1,09 0,00 0,06 0,04 0,01 0,03
AD-53129.1 0,48 0,78 1,05 1,00 1,10 0,00 0,01 0,06 0,01 0,03
AD-53130.1 0,25 1,08 0,63 0,72 0,88 0,01 0,02 0,00 0,01 0,00
AD-53131.1 0,14 0,96 0,54 0,57 0,81 0,02 0,02 0,05 0,01 0,04
AD-53132.1 0,03 0,54 0,24 0,27 0,49 0,00 0,02 0,02 0,00 0,01
AD-53133.1 0,12 0,76 0,50 0,67 0,93 0,00 0,03 0,01 0,01 0,06
AD-53134.1 0,28 0,86 1,14 0,81 0,97 0,01 0,04 0,05 0,02 0,04
AD-53135.1 0,47 0,74 1,03 0,94 1,09 0,01 0,03 0,04 0,07 0,04
AD-53136.1 0,09 0,99 0,64 0,69 0,94 0,01 0,05 0,01 0,05 0,02
AD-53137.1 0,08 0,75 0,39 0,39 0,59 0,01 0,03 0,00 0,00 0,00
AD-53138.1 0,04 0,71 0,33 0,34 0,60 0,00 0,02 0,00 0,03 0,00
AD-53139.1 0,11 0,76 0,55 0,66 0,84 0,01 0,01 0,06 0,01 0,02
AD-53140.1 0,09 0,71 0,64 0,71 0,86 0,00 0,04 0,01 0,02 0,02
AD-53141.1 0,24 1,09 0,77 0,91 0,93 0,00 0,01 0,00 0,06 0,00
AD-53142.1 0,13 0,95 0,55 0,70 0,82 0,01 0,03 0,03 0,04 0,02
AD-53143.1 0,13 0,91 0,67 0,83 0,94 0,01 0,00 0,03 0,03 0,07
AD-53144.1 0,10 0,72 0,54 0,69 0,84 0,01 0,03 0,01 0,03 0,00
AD-53145.1 0,08 0,72 0,70 0,78 0,88 0,01 0,03 0,01 0,08 0,02
AD-53146.1 0,83 1,07 0,85 0,96 0,98 0,01 0,06 0,00 0,05 0,00
AD-53147.1 0,08 0,56 0,27 0,34 0,47 0,00 0,01 0,01 0,01 0,01
AD-53148.1 0,06 0,81 0,61 0,68 0,74 0,01 0,00 0,03 0,06 0,05
AD-53149.1 0,23 0,86 0,71 0,83 0,92 0,01 0,02 0,06 0,02 0,03
AD-53150.1 0,41 0,70 1,03 1,09 1,03 0,03 0,06 0,03 0,04 0,01
Таблица 12
Результаты скрининга "доза-эффект" для последовательностей дцРНК ANGPTL3, конъюгированных с GalNac
Подгруппу активных миРНК из скрининга однократной дозы (относящихся к данным таблицы 11) тестировали в эксперименте "доза-эффект" посредством свободного поглощения клетками PCH. Подгруппу этих активных миРНК также тестировали в отношении "доза-эффект" на клетках Hep3B посредством трансфекции.
IC50 (нМ)
Свободное поглощение Трансфекция (RNAiMax)
AD-53063.1 1,60 0,03
AD-53001.1 2,27 0,01
AD-53015.1 2,90 0,02
AD-52953.1 2,94 0,03
AD-52986.1 3,30 0,03
AD-53024.1 3,42 0,02
AD-53033.1 3,42 0,02
AD-53027.1 3,84 0,01
AD-53030.1 3,90 0,03
AD-53080.1 4,08 0,04
AD-53073.1 4,20 0,05
AD-52965.1 4,63 ND
AD-53092.1 5,37 ND
AD-53132.1 5,54 ND
AD-52983.1 5,55 ND
AD-52954.1 5,67 ND
AD-52961.1 6,37 ND
AD-52994.1 6,43 ND
AD-53098.1 6,58 ND
AD-52970.1 6,71 ND
AD-53075.1 6,74 ND
AD-53086.1 7,08 ND
AD-52971.1 7,50 ND
AD-53064.1 8,33 ND
AD-53147.1 8,34 ND
AD-52969.1 8,86 ND
AD-53077.1 8,98 ND
AD-52981.1 9,44 ND
AD-52977.1 10,45 ND
AD-53071.1 11,19 ND
AD-52960.1 13,03 ND
AD-53095.1 21,31 ND
AD-53103.1 21,92 ND
Таблица 13
Результаты скрининга однократной дозы с использованием последовательностей, перечисленных в таблице 10.
Дуплекс 10 нМ 0,1 нМ 0,025 нМ станд. отклон. 10 нМ станд. отклон. 0,1 нМ станд. отклон. 0,025 нМ
AD-52719.1 0,01 0,60 0,35 0,000 0,093 0,002
AD-52717.1 0,02 0,31 0,32 0,001 0,014 0,008
AD-52713.1 0,02 0,37 0,36 0,001 0,011 0,007
AD-52711.1 0,03 0,22 0,23 0,005 0,011 0,009
AD-52718.1 0,03 0,31 0,39 0,000 0,025 0,023
AD-52687.1 0,03 0,37 0,38 0,005 0,020 0,002
AD-52699.1 0,03 0,25 0,21 0,002 0,011 0,002
AD-52679.1 0,03 0,51 0,24 0,345 0,008
AD-52689.1 0,03 0,44 0,42 0,000 0,039 0,002
AD-52700.1 0,03 0,56 0,57 0,005 0,044 0,020
AD-52637.1 0,04 0,27 0,23 0,001 0,003 0,005
AD-52730.1 0,04 0,61 0,59 0,005 0,053 0,014
AD-52725.1 0,04 0,62 0,61 0,002 0,027 0,012
AD-52688.1 0,04 0,23 0,20 0,006 0,012 0,011
AD-52661.1 0,04 0,61 0,25 0,001 0,449 0,009
AD-52667.1 0,04 0,28 0,22 0,004 0,018 0,013
AD-52665.1 0,04 0,43 0,48 0,007 0,019 0,009
AD-52638.1 0,04 0,28 0,25 0,000 0,016 0,027
AD-52724.1 0,05 0,86 0,76 0,001 0,055 0,011
AD-52705.1 0,05 0,74 0,65 0,004 0,022 0,016
AD-52708.1 0,05 0,53 0,52 0,001 0,034 0,013
AD-52659.1 0,05 0,56 0,48 0,000 0,000 0,033
AD-52678.1 0,05 0,53 0,53 0,002 0,034 0,000
AD-52670.1 0,05 0,35 0,33 0,002 0,009 0,003
AD-52695.1 0,05 0,63 0,67 0,001 0,012 0,013
AD-52704.1 0,05 0,55 0,53 0,002 0,005 0,034
AD-52683.1 0,05 0,36 0,28 0,002 0,021 0,011
AD-52673.1 0,05 0,22 0,19 0,023 0,010 0,002
AD-52721.1 0,05 0,60 0,53 0,003 0,006 0,029
AD-52710.1 0,05 0,56 0,40 0,007 0,073 0,000
AD-52714.1 0,05 0,40 0,51 0,000 0,016 0,003
AD-52686.1 0,05 0,57 0,60 0,003 0,014 0,000
AD-52645.1 0,05 0,62 0,59 0,004 0,030 0,003
AD-52662.1 0,05 0,55 0,52 0,002 0,030 0,008
AD-52720.1 0,05 0,50 0,46 0,003 0,007 0,011
AD-52654.1 0,05 0,29 0,36 0,008 0,037 0,014
AD-52680.1 0,06 0,48 0,41 0,001 0,019 0,026
AD-52723.1 0,06 0,84 0,76 0,001 0,041 0,004
AD-52726.1 0,06 0,72 0,66 0,003 0,028 0,016
AD-52701.1 0,06 0,67 0,39 0,001 0,003 0,002
AD-52694.1 0,06 0,68 0,59 0,004 0,040 0,012
AD-52685.1 0,06 0,30 0,25 0,002 0,013 0,016
AD-52728.1 0,06 0,80 0,79 0,005 0,043 0,015
AD-52676.1 0,06 0,68 0,67 0,002 0,023 0,029
AD-52639.1 0,06 0,47 0,45 0,000 0,005 0,007
AD-52722.1 0,06 0,81 0,93 0,005 0,004 0,027
AD-52682.1 0,06 0,87 0,73 0,009 0,038 0,014
AD-52660.1 0,07 0,69 0,68 0,002 0,014 0,017
AD-52709.1 0,07 0,89 0,82 0,001 0,013 0,020
AD-52643.1 0,07 0,27 0,24 0,006 0,016 0,012
AD-52696.1 0,07 0,53 0,46 0,003 0,026 0,007
AD-52657.1 0,08 0,60 0,58 0,008 0,030 0,006
AD-52706.1 0,08 0,84 0,78 0,001 0,021 0,019
AD-52653.1 0,08 0,41 0,45 0,057 0,004 0,029
AD-52656.1 0,08 0,65 0,50 0,004 0,022 0,012
AD-52693.1 0,09 0,61 0,62 0,007 0,021 0,018
AD-52692.1 0,09 0,54 0,52 0,023 0,018 0,033
AD-52674.1 0,10 0,79 0,64 0,001 0,008 0,028
AD-52648.1 0,10 0,67 0,53 0,002 0,013 0,028
AD-52651.1 0,10 0,84 0,73 0,000 0,000 0,007
AD-52641.1 0,10 0,62 0,50 0,004 0,172 0,002
AD-52707.1 0,10 0,92 0,81 0,001 0,018 0,032
AD-52671.1 0,11 0,87 0,84 0,005 0,034 0,025
AD-52650.1 0,12 0,88 0,94 0,007 0,013 0,041
AD-52642.1 0,12 0,90 0,76 0,015 0,022 0,004
AD-52675.1 0,13 0,94 0,89 0,001 0,018 0,044
AD-52647.1 0,13 0,80 0,79 0,031 0,008 0,023
AD-52716.1 0,14 0,61 0,69 0,010 0,060 0,013
AD-52649.1 0,14 0,31 0,29 0,136 0,020 0,006
AD-52677.1 0,16 1,01 0,72 0,059 0,040 0,007
AD-52697.1 0,16 0,86 0,77 0,012 0,021 0,015
AD-52715.1 0,17 0,90 0,89 0,005 0,009 0,022
AD-52691.1 0,18 0,93 0,88 0,004 0,036 0,017
AD-52698.1 0,20 0,97 0,87 0,010 0,028 0,000
AD-52672.1 0,20 0,70 0,66 0,170 0,014 0,019
AD-52712.1 0,29 0,92 0,90 0,007 0,036 0,004
AD-52690.1 0,30 0,95 0,85 0,115 0,032 0,004
AD-52640.1 0,30 1,04 0,91 0,018 0,046 0,013
AD-52684.1 0,31 0,90 0,94 0,014 0,018 0,014
AD-52666.1 0,32 1,04 0,91 0,013 0,005 0,004
AD-52703.1 0,32 1,02 0,96 0,016 0,015 0,005
AD-52729.1 0,33 1,02 0,87 0,032 0,020 0,008
AD-52668.1 0,35 0,94 0,90 0,029 0,046 0,026
AD-52681.1 0,57 1,00 0,99 0,003 0,034 0,039
AD-52702.1 0,72 1,02 0,92 0,658 0,060 0,014
AD-52727.1 0,73 1,03 0,91 0,004 0,065 0,027
AD-52663.1 0,78 1,05 0,96 0,027 0,010 0,005
AD-52669.1 0,91 0,91 0,94 0,004 0,049 0,032
AD-1955 0,95 0,84 0,95 0,005 0,021 0,019
AD-1955 0,97 1,07 1,03 0,000 0,021 0,015
AD-1955 1,01 1,08 1,01 0,035 0,011 0,005
имитация 1,02 0,96 0,97 0,030 0,037 0,005
AD-1955 1,08 1,03 1,02 0,032 0,051 0,005
AD-52652.1 1,13 1,11 1,02 0,028 0,043 0,020
AD-52658.1 1,33 1,10 0,93 0,091 0,043 0,018
AD-52664.1 1,49 0,95 0,88 0,438 0,019 0,009
AD-52752.1 0,03 0,43 0,69 0,002 0,015 0,017
AD-52741.1 0,03 0,56 0,86 0,001 0,044 0,021
AD-52804.1 0,03 0,49 0,89 0,001 0,002 0,017
AD-52764.1 0,03 0,54 0,79 0,005 0,016 0,078
AD-52770.1 0,03 0,58 0,78 0,000 0,006 0,027
AD-52735.1 0,03 0,31 0,46 0,003 0,031 0,009
AD-52810.1 0,03 0,67 0,86 0,001 0,013 0,025
AD-52759.1 0,03 0,54 0,79 0,000 0,018 0,023
AD-52736.1 0,03 0,51 0,60 0,004 0,012 0,023
AD-52775.1 0,03 0,54 0,73 0,005 0,024 0,022
AD-52758.1 0,03 0,57 0,78 0,001 0,014 0,050
AD-52743.1 0,03 0,45 0,67 0,002 0,018 0,033
AD-52747.1 0,04 0,57 0,84 0,002 0,061 0,058
AD-52819.1 0,04 0,26 0,45 0,005 0,001 0,022
AD-52765.1 0,04 0,68 0,83 0,000 0,013 0,053
AD-52754.1 0,04 0,76 1,00 0,000 0,007 0,015
AD-52787.1 0,05 0,55 0,68 0,001 0,043 0,060
AD-52791.1 0,05 0,70 0,91 0,001 0,014 0,084
AD-52811.1 0,05 0,73 0,84 0,002 0,014 0,058
AD-52817.1 0,05 0,77 0,92 0,003 0,011 0,031
AD-52745.1 0,06 0,62 0,77 0,007 0,021 0,000
AD-52749.1 0,06 0,63 0,88 0,005 0,037 0,043
AD-52740.1 0,06 0,83 0,94 0,007 0,012 0,051
AD-52796.1 0,06 0,72 0,92 0,003 0,021 0,054
AD-52820.1 0,06 0,90 0,87 0,001 0,026 0,064
AD-52809.1 0,06 0,76 0,90 0,001 0,037 0,027
AD-52760.1 0,06 0,81 0,97 0,001 0,056 0,047
AD-52767.1 0,07 0,55 0,55 0,001 0,016 0,013
AD-52734.1 0,07 0,61 0,64 0,004 0,003 0,003
AD-52794.1 0,07 0,94 0,87 0,007 0,014 0,051
AD-52797.1 0,07 0,69 0,87 0,004 0,000 0,038
AD-52737.1 0,08 0,70 0,84 0,004 0,031 0,012
AD-52812.1 0,08 0,75 0,88 0,004 0,000 0,056
AD-52748.1 0,08 0,70 0,89 0,001 0,010 0,009
AD-52782.1 0,08 0,68 0,78 0,004 0,023 0,011
AD-52816.1 0,08 0,71 0,88 0,003 0,042 0,060
AD-52763.1 0,08 0,68 0,77 0,002 0,013 0,026
AD-52788.1 0,08 0,89 1,00 0,004 0,017 0,034
AD-52762.1 0,08 0,78 0,91 0,007 0,046 0,009
AD-52785.1 0,08 0,88 0,95 0,002 0,004 0,019
AD-52800.1 0,09 0,82 0,94 0,001 0,040 0,005
AD-52792.1 0,09 0,93 0,94 0,002 0,018 0,037
AD-52784.1 0,10 0,84 0,92 0,000 0,066 0,032
AD-52746.1 0,10 0,82 0,93 0,002 0,060 0,059
AD-52814.1 0,10 0,85 0,88 0,002 0,042 0,013
AD-52751.1 0,10 0,88 0,98 0,005 0,030 0,067
AD-52786.1 0,10 0,81 0,81 0,006 0,028 0,048
AD-52755.1 0,10 0,93 0,99 0,003 0,032 0,048
AD-52808.1 0,11 0,98 0,92 0,000 0,038 0,032
AD-52815.1 0,11 0,96 0,96 0,002 0,009 0,000
AD-52805.1 0,11 0,79 0,86 0,003 0,050 0,008
AD-52777.1 0,11 0,88 0,94 0,001 0,065 0,000
AD-52756.1 0,11 0,92 0,91 0,003 0,032 0,004
AD-52733.1 0,12 0,66 0,65 0,005 0,071 0,022
AD-52739.1 0,13 0,83 0,95 0,002 0,008 0,061
AD-52780.1 0,13 0,70 0,67 0,012 0,021 0,059
AD-52798.1 0,13 0,64 0,97 0,001 0,006 0,038
AD-52776.1 0,14 0,97 0,94 0,011 0,029 0,023
AD-52753.1 0,15 0,88 1,09 0,001 0,048 0,005
AD-52778.1 0,16 0,76 0,69 0,003 0,067 0,003
AD-52744.1 0,16 0,90 0,91 0,002 0,000 0,049
AD-52750.1 0,16 0,87 1,01 0,000 0,060 0,055
AD-52774.1 0,17 0,71 0,89 0,002 0,010 0,017
AD-52803.1 0,18 0,87 0,92 0,015 0,026 0,040
AD-52821.1 0,18 0,86 0,87 0,005 0,046 0,055
AD-52781.1 0,18 0,78 0,66 0,008 0,000 0,023
AD-52779.1 0,20 0,83 0,66 0,002 0,024 0,016
AD-52793.1 0,20 0,74 0,88 0,010 0,025 0,069
AD-52799.1 0,20 0,75 1,01 0,005 0,018 0,010
AD-52761.1 0,22 0,83 0,92 0,000 0,024 0,023
AD-52768.1 0,22 0,96 0,97 0,001 ND 0,028
AD-52757.1 0,23 1,02 0,95 0,018 0,040 0,042
AD-52806.1 0,24 0,96 0,87 0,011 0,084 0,055
AD-52771.1 0,25 0,92 0,98 0,010 0,018 0,048
AD-52802.1 0,30 0,95 1,00 0,010 0,019 0,005
AD-52731.1 0,30 0,85 0,75 0,001 0,067 0,022
AD-52813.1 0,30 1,07 0,98 0,001 0,109 0,014
AD-52742.1 0,31 0,95 1,03 0,005 0,028 0,056
AD-52766.1 0,35 0,97 1,00 0,010 0,024 0,044
AD-52732.1 0,41 0,79 0,73 0,004 0,016 0,039
AD-52773.1 0,43 0,99 0,92 0,004 0,029 0,022
AD-52772.1 0,43 1,00 1,02 0,006 0,000 0,065
AD-52822.1 0,44 0,68 0,81 0,004 0,010 0,016
AD-52783.1 0,45 0,66 0,76 0,009 0,036 0,019
AD-52789.1 0,50 0,68 0,78 0,010 0,053 0,004
AD-52795.1 0,50 0,82 0,69 0,000 0,080 0,054
AD-52801.1 0,54 0,70 0,79 0,018 0,038 0,035
AD-52807.1 0,57 0,76 0,93 0,006 0,011 0,032
AD-52769.1 0,76 0,97 0,92 0,015 0,085 0,045
AD-1955 0,90 0,96 1,04 0,018 0,165 0,010
AD-52818.1 0,92 1,03 0,92 0,009 0,010 0,063
AD-1955 1,01 0,90 0,96 0,005 0,031 0,019
AD-1955 1,05 1,09 1,00 0,046 0,085 0,005
AD-1955 1,05 1,07 1,00 0,010 0,031 0,039
имитация 1,20 0,98 0,92 0,000 0,014 0,005
имитация 1,25 0,99 1,00 0,006 0,005 0,034
Таблица 14
Результаты скрининга "доза-эффект" с использованием подгруппы последовательностей из таблицы 13.
Подгруппу активных миРНК ANGPTL3 из таблицы 10 тестировали посредством трансфекции клеток Hep3B в скрининге "доза-эффект".
Дуплекс IC50 (нМ)
AD-52819.1 0,0036
AD-52667.1 0,0037
AD-52638.1 0,0048
AD-52673.1 0,0049
AD-52711.1 0,0050
AD-52661.1 0,0054
AD-52654.1 0,0058
AD-52637.1 0,0058
AD-52643.1 0,0060
AD-52685.1 0,0062
AD-52670.1 0,0064
AD-52679.1 0,0064
AD-52649.1 0,0066
AD-52683.1 0,0069
AD-52688.1 0,0071
AD-52717.1 0,0072
AD-52699.1 0,0073
AD-52714.1 0,0086
AD-52718.1 0,0088
AD-52735.1 0,0093
AD-52653.1 0,0102
AD-52687.1 0,0109
AD-52680.1 0,0120
AD-52713.1 0,0133
AD-52720.1 0,0143
AD-52639.1 0,0161
AD-52696.1 0,0163
AD-52662.1 0,0179
AD-52659.1 0,0180
AD-52710.1 0,0195
AD-52689.1 0,0216
AD-52787.1 0,0242
AD-52765.1 0,0318
Таблица 15
ID пар дуплексов для которых синтезировали и тестировали оба неконъюгированных и конъюгированных с GalNac варианта
Дуплексы обладают аналогичными последовательностями и характером модификации.
ID неконъюгированного дуплекса ID конъюгированного с GalNac дуплекса
AD-52637.1 AD-52953.1
AD-52638.1 AD-52954.1
AD-52639.1 AD-52955.1
AD-52640.1 AD-52956.1
AD-52641.1 AD-52957.1
AD-52642.1 AD-52958.1
AD-52643.1 Нет
Нет AD-52960.1
Нет AD-52961.1
AD-52645.1 AD-52962.1
AD-52647.1 AD-52963.1
AD-52648.1 AD-52964.1
AD-52649.1 AD-52965.1
AD-52650.1 AD-52966.1
AD-52651.1 AD-52967.1
AD-52652.1 AD-52968.1
AD-52653.1 AD-52969.1
AD-52654.1 AD-52970.1
Нет AD-52971.1
AD-52656.1 AD-52972.1
AD-52657.1 AD-52973.1
AD-52658.1 AD-52974.1
AD-52659.1 AD-52975.1
AD-52660.1 AD-52976.1
AD-52661.1 AD-52977.1
AD-52662.1 AD-52978.1
AD-52663.1 AD-52979.1
AD-52664.1 AD-52980.1
AD-52665.1 AD-52981.1
AD-52666.1 AD-52982.1
AD-52667.1 AD-52983.1
AD-52668.1 AD-52984.1
AD-52669.1 AD-52985.1
AD-52670.1 AD-52986.1
AD-52671.1 AD-52987.1
AD-52672.1 AD-52988.1
AD-52673.1 AD-52989.1
AD-52674.1 AD-52990.1
AD-52675.1 AD-52991.1
AD-52676.1 AD-52992.1
AD-52677.1 AD-52993.1
AD-52678.1 AD-52994.1
AD-52679.1 AD-52995.1
AD-52680.1 AD-52996.1
AD-52681.1 AD-52997.1
AD-52682.1 AD-52998.1
AD-52683.1 AD-52999.1
AD-52684.1 AD-53000.1
AD-52685.1 AD-53001.1
AD-52686.1 AD-53002.1
AD-52687.1 AD-53003.1
AD-52688.1 AD-53004.1
AD-52689.1 AD-53005.1
AD-52690.1 AD-53006.1
AD-52691.1 AD-53007.1
AD-52692.1 AD-53008.1
AD-52693.1 AD-53009.1
AD-52694.1 AD-53010.1
AD-52695.1 AD-53011.1
AD-52696.1 AD-53012.1
AD-52697.1 AD-53013.1
AD-52698.1 AD-53014.1
AD-52699.1 AD-53015.1
AD-52700.1 AD-53016.1
AD-52701.1 AD-53017.1
AD-52702.1 AD-53018.1
AD-52703.1 AD-53019.1
AD-52704.1 AD-53020.1
AD-52705.1 AD-53021.1
AD-52706.1 AD-53022.1
AD-52707.1 AD-53023.1
AD-52708.1 AD-53024.1
AD-52709.1 AD-53025.1
AD-52710.1 AD-53026.1
AD-52711.1 AD-53027.1
AD-52712.1 AD-53028.1
AD-52713.1 AD-53029.1
AD-52714.1 AD-53030.1
AD-52715.1 AD-53031.1
AD-52716.1 AD-53032.1
AD-52717.1 AD-53033.1
AD-52718.1 AD-53034.1
AD-52719.1 AD-53035.1
AD-52720.1 AD-53036.1
AD-52721.1 AD-53037.1
AD-52722.1 AD-53038.1
AD-52723.1 AD-53039.1
AD-52724.1 AD-53040.1
AD-52725.1 AD-53041.1
AD-52726.1 AD-53042.1
AD-52727.1 AD-53043.1
AD-52728.1 AD-53044.1
AD-52729.1 AD-53045.1
AD-52730.1 AD-53046.1
AD-52731.1 AD-53059.1
AD-52732.1 AD-53060.1
AD-52733.1 AD-53061.1
AD-52734.1 AD-53062.1
AD-52735.1 AD-53063.1
AD-52736.1 AD-53064.1
AD-52737.1 AD-53065.1
Нет AD-53066.1
AD-52739.1 AD-53067.1
AD-52740.1 AD-53068.1
AD-52741.1 AD-53069.1
AD-52742.1 AD-53070.1
AD-52743.1 AD-53071.1
AD-52744.1 AD-53072.1
AD-52745.1 AD-53073.1
AD-52746.1 AD-53074.1
AD-52747.1 AD-53075.1
AD-52748.1 AD-53076.1
AD-52749.1 AD-53077.1
AD-52750.1 AD-53078.1
AD-52751.1 AD-53079.1
AD-52752.1 AD-53080.1
AD-52753.1 AD-53081.1
AD-52754.1 AD-53082.1
AD-52755.1 AD-53083.1
AD-52756.1 AD-53084.1
AD-52757.1 AD-53085.1
AD-52758.1 AD-53086.1
AD-52759.1 AD-53087.1
AD-52760.1 AD-53088.1
AD-52761.1 AD-53089.1
AD-52762.1 AD-53090.1
AD-52763.1 AD-53091.1
AD-52764.1 AD-53092.1
AD-52765.1 AD-53093.1
AD-52766.1 AD-53094.1
AD-52767.1 AD-53095.1
AD-52768.1 AD-53096.1
AD-52769.1 AD-53097.1
AD-52770.1 AD-53098.1
AD-52771.1 AD-53099.1
AD-52772.1 AD-53100.1
AD-52773.1 AD-53101.1
AD-52774.1 AD-53102.1
AD-52775.1 AD-53103.1
AD-52776.1 AD-53104.1
AD-52777.1 AD-53105.1
AD-52778.1 AD-53106.1
AD-52779.1 AD-53107.1
AD-52780.1 AD-53108.1
AD-52781.1 AD-53109.1
AD-52782.1 AD-53110.1
AD-52783.1 AD-53111.1
AD-52784.1 AD-53112.1
AD-52785.1 AD-53113.1
AD-52786.1 AD-53114.1
AD-52787.1 AD-53115.1
AD-52788.1 AD-53116.1
AD-52789.1 AD-53117.1
Нет AD-53118.1
AD-52791.1 AD-53119.1
AD-52792.1 AD-53120.1
AD-52793.1 AD-53121.1
AD-52794.1 AD-53122.1
AD-52795.1 AD-53123.1
AD-52796.1 AD-53124.1
AD-52797.1 AD-53125.1
AD-52798.1 AD-53126.1
AD-52799.1 AD-53127.1
AD-52800.1 AD-53128.1
AD-52801.1 AD-53129.1
AD-52802.1 AD-53130.1
AD-52803.1 AD-53131.1
AD-52804.1 AD-53132.1
AD-52805.1 AD-53133.1
AD-52806.1 AD-53134.1
AD-52807.1 AD-53135.1
AD-52808.1 AD-53136.1
AD-52809.1 AD-53137.1
AD-52810.1 AD-53138.1
AD-52811.1 AD-53139.1
AD-52812.1 AD-53140.1
AD-52813.1 AD-53141.1
AD-52814.1 AD-53142.1
AD-52815.1 AD-53143.1
AD-52816.1 AD-53144.1
AD-52817.1 AD-53145.1
AD-52818.1 AD-53146.1
AD-52819.1 AD-53147.1
AD-52820.1 AD-53148.1
AD-52821.1 AD-53149.1
AD-52822.1 AD-53150.1
Тесты in Vivo
Пример 3
Тестируемые препараты
Эксперименты in vivo проводили с использованием последовательностей дцРНК по изобретению. Используемая в экспериментах последовательность дцРНК представляла собой конъюгированную с GalNac AD-52981 ("ANG", смысловая последовательность: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO:657); антисмысловая последовательность: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO:842)). Используемая в качестве отрицательного контроля последовательность дцРНК представляла собой конъюгированную с люциферазой AD-48399B1 ("Luc", смысловая последовательность: CfaCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAfL96 (SEQ ID NO:1728), антисмысловая последовательность: uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgUfgsAfsu (SEQ ID NO:1729)). Также в качестве отрицательного контроля использовали конъюгированную с GalNal AD-1955, содержащую изменяющие 2’-метил- и 2’-фтор-модификации.
Экспериментальный способ
Последовательности дцРНК тестировали на мышах C57BL/6 (WT) и ob/ob. Мыши WT получали пять суточных доз дцРНК в PBS, Luc 20 мг/кг или ANG 5 или 20 мг/кг, и мыши ob/ob получали пять суточных доз NPL, формулированных с Luc, 20 мг/кг или ANG 20 мг/кг. Все тестируемые препараты вводили посредством подкожной инъекции способом, представленным на фигуре 1. В частности, пять суточных доз тестируемых препаратов вводили пять последовательных суток (сутки 0, 1, 2, 3 и 4) и собирали образцы крови на 5, 3 или 1 сутки до введения, а также на сутки 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 15, 18, 21, 25, 30, 37, 45 и 50 после введения. Собранные образцы крови использовали для измерения экспрессии белка ANGPTL3 анализом ELISA. Также измеряли уровни триглицеридов (TG), липопротеина низкой плотности холестерина (LDLc), липопротеин высокой плотности холестерина (HDLc) и общего холестерина (TC) в сыворотке с использованием анализатора Olympus.
Результаты
Представленные на фигуре 2 панель A и B представляют собой уровни ANGPTL3 мыши (mANGPTL3), белка измеряемого у мышей WT после введения контроля или ANG в дозе от 5 до 20 мг/кг. Как представлено на фигуре 2 панель B представляет собой уровни белка mANGPTL3, измеряемого у мышей ob/ob после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Данные свидетельствуют, что для мышей WT и ob/ob введение ANG приводит к снижению уровней белка mANGPTL3 по сравнению с контролями.
Представленная на фигуре 3 панель A представляет собой уровни LDL-c, измеряемого у мышей WT после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Представленная на фигуре 3 панель B представляет собой уровни LDL-c, измеряемого у мышей ob/ob после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Данные свидетельствуют, что введение ANG вызывает снижение уровней LDL-c, в частности, у мышей ob/ob по сравнению с контролями.
Представленная на фигуре 4 панель A представляет собой уровни триглицеридов, измеряемых у мышей WT после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Представленная на фигуре 4 панель B представляет собой уровни триглицеридов, измеряемых у мышей ob/ob после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Данные свидетельствуют, что введение ANG вызывает снижение уровней триглицеридов, в частности, у мышей ob/ob, по сравнению с контролями.
Представленные на фигуре 5 панель A и B представляют собой уровни общего холестерина (TC), измеряемого у мыши WT и ob/ob, соответственно, после введения контроля или ANG в дозе 20 мг/кг. Данные свидетельствуют, что введение ANG вызывает умеренное снижение уровней TC у мышей ob/ob, но не у мышей WT. Аналогично, введение ANG вызывает умеренное снижение уровней HDL-c у мышей ob/ob, но не у мышей WT, как продемонстрировано на графиках на фигуре 6.
Пример 4.
Тестируемый препарат
Тестировали эффект однократной инъекции последовательности дцРНК по изобретению на уровень белка ANGPTL3. Используемая в экспериментах последовательность дцРНК представляла собой конъюгированную с GalNac AD-52981 ("ANG", смысловая последовательность: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO:657), антисмысловая последовательность: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO:842)). В качестве отрицательного контроля использовали PBS.
Экспериментальный способ
Последовательности дцРНК тестировали на мыши, трансгенной по PCS человека, характеризующейся специфической для печени экспрессией полноразмерного гена PCSK9 человека. Трансгенным мышам по PCS человека дозировали AD-52981 или PBS однократной подкожной инъекцией. Мышей разделяли на четыре группы, где каждая группа состояла из двух самцов и двух самок. Каждая группа получала инъекцию PBS или AD-52981 в дозе 5 мг/кг, 20 мг/кг или 60 мг/кг. Образцы крови собирали на сутки 1 и сутки 0 до дозирования и через 72 часа после дозирования. Уровни белка ANGPTL3 измеряли ELISA и сравнивали с уровнями на сутки 1 и сутки 0 до дозирования.
Результаты
На фигуре 7 представлены уровни белка ANGPTL3 мыши (mANGPTL3), измеренного у мышей, трансгенных по PCS человека. Приведенные данные выражены относительно контроля PBS и представляют собой среднее значение для 2 самцов и 2 самок в каждой группе. Величины ошибок представляют собой стандартное отклонение. Данные свидетельствуют о том, что введение однократной инъекции AD-52981 снижает уровни белка ANGPTL3 у мышей зависимым от дозы способом, где доза 60 мг/кг снижает уровни белка ANGPTL3 более чем в пять раз (см. фигуру 7).
Последовательности
SEQ ID NO:1
>gi|41327750|ref|NM_014495.2| Сходный с ангиопоэтином 3 (ANGPTL3) Homo sapiens, мРНК
TTCCAGAAGAAAACAGTTCCACGTTGCTTGAAATTGAAAATCAAGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATCATTTGATTCTCTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACGAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCGCTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGAAACTCCAGAACACCCAGAAGTAACTTCACTTAAAACTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACCGTGGAAGACCAATATAAACAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAGGACTAGTATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAATTTAAACATTAACCTCATTCCAAGTTAATGTGGTCTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAAGCTTGAGAAATAGATTTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCTATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCGTTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTATAATACTATTTGTTTTAAATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCACAATCTAGATTATAATCAATAGGTGAACTTATTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAATTTAGAGACTTTTATTTTAAAAGGCATCATATGAGCTAATATCACAACTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTACTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATACAGAGGACTGGTAATTGTACAGTTCTTAAATGTTGTAGTATTAATTTCAAAACTAAAAATCGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATACAAATTTTTAAACTGATGCTTCATTTTGCTACAAAATAATTTGGAGTAAATGTTTGATATGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGAATTAAATACTGTATTAAAATAAGTTCGCTGTCTTTAAACAAATGGAGATGACTACTAAGTCACATTGACTTTAACATGAGGTATCACTATACCTTATT
SEQ ID NO:2
>gi|297278846|ref|XM_001086114.2| Теоретически рассчитанный: сходный с ангиопоэтином 3 (ANGPTL3) Macaca mulatta, мРНК.
ATATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGTTGCTTGAAATTGAAAATCAGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGACCAAGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGAAACTCCAGAACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCACAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTGGCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTATCAGGTAAAACCTGTCTAAGGAGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATCTAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAAATTAAACATTAAACTCATTCCAAGTTAATGTGGTTTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAGGCTTGAGAAATAGATTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCAATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCATTTACATTTCTCAATCAAAATTCCTACAACACTATTTGTTTTATATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCGCAATCTAAATTATAATCAACAGGTGAACTTACTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAACTTAGAGACTTTAATTTTAAAAGTCATCATATGAGCTAATATCACAATTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTTTTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATAAAGAGGACTGATAATTATACAGTTCTTAAATTTGTTGTAATATTAATTTCAAAACTAAAAATTGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATATAAATTTTTAAACTGATGCCTCATTTTGCTACAAAATAATCTGGAGTAAATTTTTGATAGGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGGATTAAATACTGTATTAAAATAGGTTCGCTGTCTTTTAAACAAATGGAGATGATGATTACTAAGTCACATTGACTTTAATATGAGGTATCACTATACCTTA
SEQ ID NO:3
>gi|142388354|ref|NM_013913.3| сходный с ангиопоэтином 3 (ANGPTL3) Mus musculus, мРНК.
CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTCCTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACTACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGAGTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATTCTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAAAAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGCCGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCCAAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCCTGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATC
SEQ ID NO:4
>gi|68163568|ref|NM_001025065.1| сходный с ангиопоэтином 3 (ANGPTL3) Rattus norvegicus, мРНК.
GACGTTCCAAATTGCTTGAAATTGAATAATTGAAACAAAAATGCACACAATTAAGCTGCTCCTTTTTGTTGTTCCTCTAGTAATTTCGTCCAGAGTTGATCCAGACCTTTCGCCATTTGATTCTGTACCGTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGTCTTAAAGATTTTGTCCATAAGACAAAGGGACAAATTAATGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTGTTTTTATGACCTATCACTTCAAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACCACATCTAAACTACAAGTTAAAAACGAAGAGGTGAAGAATATGTCACTTGAACTGAACTCAAAGCTTGAAAGTCTACTGGAGGAGAAGATGGCGCTCCAACACAGAGTCAGGGCTTTGGAGGAACAGCTGACCAGCTTGGTTCAGAACCCGCCTGGGGCTCGGGAGCACCCAGAGGTAACGTCACTTAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGATAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAATATAAACAACTAAGTCAACAGCACATTCAGATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAAGACTGGCATTCAAGAACCCACTGAAAATTCTCTTTATTCTAAACCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCATCTGAAGGAAGCAAAAAATATAGAACAAGATGATCTGCCTGCTGACTGCTCTGCCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCGTGTATACTATTAGACCAAGCAGCTCTCAAGTGTTTAATGTCTACTGTGACACCCAATCAGGCACTCCACGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCTCAAAACTTCAACCAAACGTGGGAAAACTACGAAAAGGGTTTTGGGAGGCTTGATGGTAAAGTGATTTCCTTGCATCACTCACTTATCTGTTGATTTAATAGTATTAGTTGGGTGTGTTGACACAGGCCTGAGACCATAGCGCTTTTGGGCAAGGGGGGAGGAGGAGCAGCAGGTGAATTGAAAGTTCAAGACCAGTCTGGGCCACACATTGATACTCCTTCTCGACATTAAGAATTATAAATTAAGCAGCAATTATAAAATGGGCTGTGGAAATGTAACAATAAGCAAAAGCAGACCCCAGTCTTCATAAAACTGATTGGTAAATATTATCCATGATAGCAACTGCAATGATCTCATTGTACTTATCACTACTGCATGCCTGCAGTATGCTTGTTGAAACTTAATTCTATAGTTCATGGTTATCATAAGTCTTATTAAGGAACATAGTATACGCCATTGGCTCTAGTGAGGGGCCATGCTACAAATGAGCTGCAAAGATAGCAGTATAGAGCTCTTTCAGTGATATCCTAAGCACAACGTAACACAGGTGAAATGGGCTGGAGGCACAGTTGTGGTGGAACACGCGGCCAGCAGGACACTGGGACTGATCCCCAGCAGCACAAAGAAAGTGATAGGAACACAGAGCGAGAGTTAGAAGGGACAGGGTCACCGTCAGAGATACGGTGTCTAACTCCTGCAACCCTACCTGTAATTATTCCATATTATAAACATATACTATATAACTGTGGGTCTCTGCATGTTCTAGAATATGAATTCTATTTGATTGTAAAACAAAACTATAAAAATAAGTAAAAAAATAAAAAATAAACAGATACTTAAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:5 Обратный комплемент SEQ ID NO:1
AATAAGGTATAGTGATACCTCATGTTAAAGTCAATGTGACTTAGTAGTCATCTCCATTTGTTTAAAGACAGCGAACTTATTTTAATACAGTATTTAATTCTGCTTCATTAGGTTTCATAAATAAATCATATCAAACATTTACTCCAAATTATTTTGTAGCAAAATGAAGCATCAGTTTAAAAATTTGTATTACAGATTTTTACACATACTCTGTGCTGACGATTTTTAGTTTTGAAATTAATACTACAACATTTAAGAACTGTACAATTACCAGTCCTCTGTATTTAGTCAAGTTTAGAGTTTTAACAAGAGTACTAGTTTTTTAAACTGGGAAAGTTGTGATATTAGCTCATATGATGCCTTTTAAAATAAAAGTCTCTAAATTTTTTATTTAGAAAAGTTATTTAATAAGTTCACCTATTGATTATAATCTAGATTGTGACCATCTAAAATTGATTCCCACATCACAAAATTTAAAACAAATAGTATTATAAGAATTTTGATTGAGAAATGTAAACGGTATTCTTTAAGGTTATGTGATTGTATGTTTAATCTTAAATAGACAGTGACTTTAAGATAAAAAAAATCTATTTCTCAAGCTTTCTCTTAAGGATTTAATACCAGATTATTAGACCACATTAACTTGGAATGAGGTTAATGTTTAAATTATTGCCTTTTAAATTTGCCTCAGTTCATTCAAAGCTTTCTGAATCTGTTGGATGGATCAACATTTTGGTTGATTTTATAGAGTATAACCTTCCATTTTGAGACTTCCAAGATAATCCTCTTCTCCTCTCTGGCTTAGATTTTGCTCTTGGTTTGTTATATTTACCATTTAGGTTGTTTTCTCCACACTCATCATGCCACCACCAGCCTCCTGAATAACCCTCTGGACAGTTGAAGTGTCCTTTTGCTTTGTGATCCCAAGTAGAAAACACCAAATCTTTGTTTTCCGGGATTGCATTGGGGACATTGCCAGTAATCGCAACTAGATGTAGCGTATAGTTGGTTTCGTGATTTCCCAAGTAAAAAGAATATTCAATATAATGTTTGTTGTCTTTCCAGTCTTCCAACTCAATTCGTAAAACATAATTAGATTGCTTCACTATGGAGTATATCTTCTCTAGGCCCAACCAAAATTCTCCATCAAGCCTCCCAAAACCATATTTGTAGTTCTCCCACGTTTCATTGAAGTTTTGTGATCCATCTATTCGATGTTGAATTAATGTCCATGGACTACCTGATATAACATCACAGTAGACATGAAAAACTTGAGAGTTGCTGGGTCTGATGGCATACATGCCACTTGTATGTTCACCTCTGTTATAAATGGTGGTACATTCAGCAGGAATGCCATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAACTGAAGAAAGGGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGCTTGGAAGATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATACTAGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATTTGACTATGCTGTTGGTTTAATTGTTTATATTGGTCTTCCACGGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATCTTGTTTTTCTACAAAAGTTTTAAGTGAAGTTACTTCTGGGTGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTAAGTTAGTTAGTTGCTCTTCTAAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCAAGTTTTGAGTTGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGTAGTTCTTCTCAGTTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGCGATAGATCATAAAAAGACTGATCAAATATGTTGAGTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTCGTCTTATGGACAAAGTCTTTAAGACCATGTCCCAACTGAAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATCGTCTAACATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGGAGATAGAGAATCAAATGATGAATTGTCTTGATCAATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGAGCTTAATTGTGAACATTTTTATCTTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTTTTCTTCTGGAA
SEQ ID NO:6 Обратный комплемент SEQ ID NO:2
TAAGGTATAGTGATACCTCATATTAAAGTCAATGTGACTTAGTAATCATCATCTCCATTTGTTTAAAAGACAGCGAACCTATTTTAATACAGTATTTAATCCTGCTTCATTAGGTTTCATAAATAAATCCTATCAAAAATTTACTCCAGATTATTTTGTAGCAAAATGAGGCATCAGTTTAAAAATTTATATTACAGATTTTTACACATACTCTGTGCTGACAATTTTTAGTTTTGAAATTAATATTACAACAAATTTAAGAACTGTATAATTATCAGTCCTCTTTATTTAGTCAAGTTTAGAGTTTTAACAAGAAAACTAGTTTTTTAAACTGGGAAAATTGTGATATTAGCTCATATGATGACTTTTAAAATTAAAGTCTCTAAGTTTTTTATTTAGAAAAGTTATTTAGTAAGTTCACCTGTTGATTATAATTTAGATTGCGACCATCTAAAATTGATTCCCACATCACAAAATATAAAACAAATAGTGTTGTAGGAATTTTGATTGAGAAATGTAAATGGTATTCTTTAAGGTTATGTGATTGTATGTTTAATCTTAAATTGACAGTGACTTTAAGATAAAAAAATCTATTTCTCAAGCCTTCTCTTAAGGATTTAATACCAGATTATTAAACCACATTAACTTGGAATGAGTTTAATGTTTAATTTATTGCCTTTTAAATTTGCCTCAGTTCATTCAAAGCTTTCTGAATCTGTTGGATGGATCAACATTTTGGTTGATTTTATAGAGTATAACCTTCCATTTTGAGACTTCCAGGATAATCCTCTTCTCCGCTCTGGCTTAGATTTTGTTCTTGGTTTGTTATATTTACCATTTAGGTTGTTTTCTCCACACTCATCATGCCACCACCAGCCTCCTGAATAACTCTCTGGACAGCTGAAGTGTCCTTTTGCTTTGTGATCCCAAGTAGAAAACACCAAATCTTTGTTTTCCGGGATTGCATTGGGGACATTGCCAGTAATCTTAACTACATGTAGCGTATAGTTGGTTTCGTGATTTCCCAAGTAAAAAGAATATTCAATATAATGTTTGTTGTCTTTCCAGTCTTCCAACTCAATTCGTAAAACGTAATTAGATTGCTTCACTATGGAGTATATCTTCTCTAGGCCCAACCAGAATTCTCCATCAAGCCTCCCGAAACCATATTTGTAGTTCTCCCACGTTTCATTGAAGTTTTGTGATCCATCTATTCTCCTTAGACAGGTTTTACCTGATACAACATCACAGTAGACATGAAAAACTTGAGAGTTGCTGGGTCTGATGGCATACATGCCACTTATATGTTCACCTCTATTGTAAATGGTGGTACAATCAGCAGGAATGCCATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAGCTGAAGAAAGGGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGCTTGGAAGATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATATTAGTCATTCTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATTTGACTGTGCTGTTGGTTTAATTGCTTATATTGTTCTTCCACAGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATCTTGTTTTTCTACAAAACTTTTAAGTGAAGTTACTTCTGGATGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTAAGTTAGTTAGTTGCTCTTCTAAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCAAGTTTTGAGTTGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGTAGTTCTTCTCAGTTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGTGATAGATCATAAAAAGACTGATCAAATATGTTGAGTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTAGTCTTATGGACAAAGTCTTTAAGACCATGTCCCAACTGAAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATCGTCTAACATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGGAGATACAGAATCAAATGATGAATTGTCTTGGTCAATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGAGCTTAATTGTGAACATTTTTATCCTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTGTTCTTCTGGAAGCAGACCTAGACTTCTTAACTCTATATAT
SEQ ID NO:7 Обратный комплемент SEQ ID NO:3
CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTCCTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACTACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGAGTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATTCTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAAAAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGCCGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCCAAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCCTGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATC
SEQ ID NO:8 Обратный комплемент SEQ ID NO:4
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATTTTAAGTATCTGTTTATTTTTTATTTTTTTACTTATTTTTATAGTTTTGTTTTACAATCAAATAGAATTCATATTCTAGAACATGCAGAGACCCACAGTTATATAGTATATGTTTATAATATGGAATAATTACAGGTAGGGTTGCAGGAGTTAGACACCGTATCTCTGACGGTGACCCTGTCCCTTCTAACTCTCGCTCTGTGTTCCTATCACTTTCTTTGTGCTGCTGGGGATCAGTCCCAGTGTCCTGCTGGCCGCGTGTTCCACCACAACTGTGCCTCCAGCCCATTTCACCTGTGTTACGTTGTGCTTAGGATATCACTGAAAGAGCTCTATACTGCTATCTTTGCAGCTCATTTGTAGCATGGCCCCTCACTAGAGCCAATGGCGTATACTATGTTCCTTAATAAGACTTATGATAACCATGAACTATAGAATTAAGTTTCAACAAGCATACTGCAGGCATGCAGTAGTGATAAGTACAATGAGATCATTGCAGTTGCTATCATGGATAATATTTACCAATCAGTTTTATGAAGACTGGGGTCTGCTTTTGCTTATTGTTACATTTCCACAGCCCATTTTATAATTGCTGCTTAATTTATAATTCTTAATGTCGAGAAGGAGTATCAATGTGTGGCCCAGACTGGTCTTGAACTTTCAATTCACCTGCTGCTCCTCCTCCCCCCTTGCCCAAAAGCGCTATGGTCTCAGGCCTGTGTCAACACACCCAACTAATACTATTAAATCAACAGATAAGTGAGTGATGCAAGGAAATCACTTTACCATCAAGCCTCCCAAAACCCTTTTCGTAGTTTTCCCACGTTTGGTTGAAGTTTTGAGAGCCATCTTTCCGGTGTTGAATTAATGTCCGTGGAGTGCCTGATTGGGTGTCACAGTAGACATTAAACACTTGAGAGCTGCTTGGTCTAATAGTATACACGCCACTTGTATGTTCACCTCTGTTATAAATGGCAGAGCAGTCAGCAGGCAGATCATCTTGTTCTATATTTTTTGCTTCCTTCAGATGAAGAGGGGGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGTTTAGAATAAAGAGAATTTTCAGTGGGTTCTTGAATGCCAGTCTTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATCTGAATGTGCTGTTGACTTAGTTGTTTATATTGTTCTTCCACACTCTGGAGGAGTTCTCTTATGCTGTTATCTTGCTGTTCTACAAAACTTTTAAGTGACGTTACCTCTGGGTGCTCCCGAGCCCCAGGCGGGTTCTGAACCAAGCTGGTCAGCTGTTCCTCCAAAGCCCTGACTCTGTGTTGGAGCGCCATCTTCTCCTCCAGTAGACTTTCAAGCTTTGAGTTCAGTTCAAGTGACATATTCTTCACCTCTTCGTTTTTAACTTGTAGTTTAGATGTGGTTCTTCTTAGCTCCTTTTCCTCTTCTTTGATTTCATTGGTTTGAAGTGATAGGTCATAAAAACACTGATCAAATATGTTGAGCTTCTGAAATATGTCATTAATTTGTCCCTTTGTCTTATGGACAAAATCTTTAAGACCATGACCCAGCTGCAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTGACATCATCCAACATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGACGGTACAGAATCAAATGGCGAAAGGTCTGGATCAACTCTGGACGAAATTACTAGAGGAACAACAAAAAGGAGCAGCTTAATTGTGTGCATTTTTGTTTCAATTATTCAATTTCAAGCAATTTGGAACGTC
SEQ ID NO:9
сходный с ангиопоэтином 3 (ANGPTL3) Macaca fascicularis, мРНК.
GGgTAgTATATAGAGTtAAGAAGTCTAGgTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGCTGCTTGAAATTGAAAATCAGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGACCAAGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGCAACTCCAGAACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTGGCACGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATCTAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAAATTAAACATTAAACTCATTCCAAGTTAATGTGGTTTAATAATctGGTATTAAATCCTTAAGAGAAGGCTTGAGAAATAGATTTTTTtATCTtAAAGTCACTGTCAATTTAAGATTAAaCATACAaTCACATAACCTTAAAGAATACCATTTACATTtCTCAaTCAAAaTTCTtACAaCaCTATTtGTTTTaTAttttgtgatgtgggaatcaattttagATGGTCGCAATCTAAATTATAATCAACAGgTGAaCTTACTAAATAaCTTTtCTAAaTAAAAAaCTTAGAGACTTtAATTTtAAAAGTCATCATATGAGCTAATGtCACAaTTTtCCcAGTTtAAAAAaCTAGTTTtCTTGTTAAAACTCTAAACTTGaCTAAATAAAGAGGACTGATAATTATACAGTTCTTAAATTTGTTGTAATATTAATTtCAAAACTAAAAATtGTCagCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATATAAATTTTtAAACTGaTGCCTCATTTTGCTACAAAATAATCTGGAGTAAATTTTtGATAGGATTTATTTATGAAaCCTAATGAAGCAGGATTAAaTACTGTATTAAAATAGGTTCGCTGTCTTTTAAACAAATGGaGATGATGATTACTAAGTCACATTGACTTTAATAtGAGGTATCACTATACCTTAACATaTTtGTTAAaaCGTAtAcTGTATACATTTtgtGt

Claims (20)

1. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК) для ингибирования экспрессии ANGPTL3, где указанная дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная смысловая цепь содержит смысловую нуклеотидную последовательность, отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от 5’-AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3’ (SEQ ID NO:657), и указанная антисмысловая цепь содержит антисмысловую нуклеотидную последовательность, отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от 5’-aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg–3’ (SEQ ID NO:842),
где a, g, c и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) A, U, C или G; Af, Cf, Gf или Uf представляют собой 2'-фтор A, G, C или U; и s представляет собой фосфоротиоатную связь;
и где смысловая цепь содержит лиганд, и указанный лиганд представляет собой производное N-ацетилгалактозамина (GalNAc).
2. ДцРНК по п. 1, в которой указанная смысловая цепь отличается не более чем на 2 нуклеотида от 5’-AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf–3’ (SEQ ID NO:657) и указанная антисмысловая цепь отличается не более чем на 2 нуклеотида от 5’–aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg–3’ (SEQ ID NO:842).
3. ДцРНК по п. 1, в которой указанная смысловая цепь отличается не более чем на 1 нуклеотид от 5’-AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3’ (SEQ ID NO:657) и указанная антисмысловая цепь отличается не более чем на 1 нуклеотид от 5’-aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg–3’ (SEQ ID NO:842).
4. ДцРНК по п. 1, в которой указанная смысловая цепь включает нуклеотидную последовательность 5’-AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf–3’ (SEQ ID NO:657) и указанная антисмысловая цепь включает нуклеотидную последовательность 5’-aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg-3’ (SEQ ID NO:842).
5. ДцРНК по п. 1, в которой указанная смысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности 5’-AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3’ (SEQ ID NO:657) и указанная антисмысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности 5’-aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg-3’ (SEQ ID NO:842).
6. ДцРНК по любому из пп. 1-4, где длина каждой цепи составляет не более 30 нуклеотидов в длину.
7. ДцРНК по любому из пп. 1-4, где по меньшей мере одна цепь содержит 3'-липкий конец по меньшей мере 1 нуклеотида.
8. ДцРНК по любому из пп. 1-4, где по меньшей мере одна цепь содержит 3'-липкий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов.
9. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, содержащая эффективное количество дцРНК по любому из пп. 1-8.
10. Способ ингибирования экспрессии ANGPTL3 в клетке, где способ включает:
a) приведение клетки в контакт с дцРНК по любому из пп. 1-8; и
b) поддержание клетки, полученной на стадии a), в течение периода времени, достаточного для получения деградации транскрипта мРНК гена ANGPTL3, таким образом ингибируя экспрессию гена ANGPTL3 в клетке.
11. Способ по п. 10, где экспрессию ANGPTL3 ингибируют по меньшей мере приблизительно на 30%.
12. Способ лечения индивидуума с нарушением, на которое окажет благоприятное действие снижение экспрессии ANGPTL3, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества дцРНК по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 9, таким образом, проводя лечение указанного индивидуума.
13. Способ по п. 12, где нарушение представляет собой нарушение метаболизма липидов.
14. Способ по п. 13, где нарушение метаболизма липидов представляет собой гиперлипидемию или гипертриглицеридемию.
15. Способ по п. 12, где введение дцРНК индивидууму вызывает снижение одного или более липидов сыворотки и/или снижение накопления белка ANGPTL3.
16. Способ по п. 12, где дцРНК вводят в дозе приблизительно от 0,01 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг или приблизительно от 5 мг/кг приблизительно до 50 мг/кг.
RU2014101627A 2011-06-21 2012-06-20 КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3(ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ RU2711799C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161499620P 2011-06-21 2011-06-21
US61/499,620 2011-06-21
US201261638288P 2012-04-25 2012-04-25
US61/638,288 2012-04-25
PCT/US2012/043378 WO2012177784A2 (en) 2011-06-21 2012-06-20 Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019138721A Division RU2774821C2 (ru) 2011-06-21 2012-06-20 КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3 (ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014101627A RU2014101627A (ru) 2015-07-27
RU2711799C2 true RU2711799C2 (ru) 2020-01-22

Family

ID=47423191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014101627A RU2711799C2 (ru) 2011-06-21 2012-06-20 КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3(ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Country Status (14)

Country Link
US (16) US9322018B2 (ru)
EP (4) EP4092120A1 (ru)
JP (5) JP6110372B2 (ru)
KR (4) KR102395085B1 (ru)
CN (3) CN107287202B (ru)
AU (5) AU2012272970A1 (ru)
BR (2) BR112013033260B1 (ru)
CA (1) CA2839573A1 (ru)
ES (1) ES2923573T3 (ru)
HK (1) HK1199457A1 (ru)
MX (4) MX345095B (ru)
RU (1) RU2711799C2 (ru)
SG (2) SG10201800715PA (ru)
WO (1) WO2012177784A2 (ru)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR087329A1 (es) 2011-06-17 2014-03-19 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra proteina 3 de tipo angiopoietina humana
KR102395085B1 (ko) 2011-06-21 2022-05-09 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) iRNA 조성물 및 그 사용 방법
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013173789A2 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
RU2686080C2 (ru) 2013-05-01 2019-04-24 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы
BR112015029276B1 (pt) * 2013-05-22 2022-07-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Agente de irna fita dupla capaz de inibir a expressão de tmprss6, composição farmacêutica e uso dos mesmos
WO2015100394A1 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of angiopoietin-like 3 expression
RS59182B1 (sr) 2014-05-01 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa
KR102356388B1 (ko) * 2014-05-01 2022-01-26 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP7289610B2 (ja) 2014-08-20 2023-06-12 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 修飾二本鎖ｒｎａ剤
JOP20200115A1 (ar) * 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016081444A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
TWI723986B (zh) * 2015-04-13 2021-04-11 美商阿尼拉製藥公司 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法
CA2999341A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
RU2754188C2 (ru) 2015-12-07 2021-08-30 Джензим Корпорейшн Способы и композиции для лечения ассоциированного с serpinc1 расстройства
JP2018536689A (ja) * 2015-12-10 2018-12-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CA3054031A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
SG11201912188RA (en) * 2017-09-14 2020-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Rnai agents and compositions for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (angptl3), and methods of use
JP2021504415A (ja) 2017-12-01 2021-02-15 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドＳｕｚｈｏｕ Ｒｉｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
AU2018377716A1 (en) * 2017-12-01 2020-04-09 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Nucleic acid, composition and conjugate containing same, and preparation method and use
CN110997917B (zh) * 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN111050807B (zh) * 2017-12-01 2024-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN110945131B (zh) * 2017-12-01 2024-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3719126A4 (en) * 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, ASSOCIATED PREPARATION PROCESS AND USE
CN110944675B9 (zh) * 2017-12-01 2024-08-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CA3087106A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
JP2021533800A (ja) * 2018-08-21 2021-12-09 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用
CN110859969B (zh) * 2018-08-28 2022-01-11 上海市第十人民医院 聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂及其制备方法和应用
EP3862024A4 (en) * 2018-09-30 2022-08-17 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SHORT INTERFERENT RNA CONJUGATE, METHOD FOR PREPARATION AND USE THEREOF
CA3117750A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Lipigon Pharmaceuticals Ab Angptl4 oligonucleotides influencing the regulation of the fatty acid metabolism
CN118562796A (zh) * 2019-01-18 2024-08-30 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3974532A4 (en) * 2019-05-22 2024-01-24 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONJUGATE, PROCESS OF PREPARATION AND USE
CN111973617A (zh) * 2019-05-23 2020-11-24 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
MX2022011550A (es) * 2020-03-18 2023-01-04 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para inhibir la expresión de angptl3.
EP4133074A1 (en) * 2020-04-07 2023-02-15 uniQure IP B.V. Gene constructs for silencing angiopoietin-like 3 (angptl3) and uses thereof
EP4223875A1 (en) * 2020-09-30 2023-08-09 Nanopeptide (Qingdao) Biotechnology Ltd. Sirna of angiopoietin-like 3 (angptl3) and use thereof
EP4229200A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl3
WO2022159575A1 (en) 2021-01-20 2022-07-28 Bioentre Llc Ctla4-binding proteins and methods of treating cancer
IL305442A (en) * 2021-03-04 2023-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) IRNA compositions and methods of using them
BR112023022284A2 (pt) 2021-04-26 2023-12-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de protease transmembrana, serina 6 (tmprss6) e métodos de uso da mesma
CA3224904A1 (en) * 2021-06-21 2022-12-29 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Sirna inhibiting angptl3 gene expression and use thereof
CN115572241B (zh) * 2021-06-21 2024-08-30 润佳（苏州）医药科技有限公司 双价化合物、偶联物及其用途
MX2024003592A (es) * 2021-09-23 2024-04-10 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd Composiciones y metodos para inhibir la expresion de la proteina de tipo angiopoyetina 3 (angptl3).
WO2023092102A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Sanegene Bio Usa Inc. Double stranded rna targeting angiopoietin-like 3 (angptl-3) and methods of use thereof
US20230193271A1 (en) 2021-12-22 2023-06-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment Of Kidney Diseases With Angiopoietin Like 3 (ANGPTL3) Inhibitors
WO2023134705A1 (zh) * 2022-01-11 2023-07-20 上海金中锘美生物医药科技有限公司 抑制angptl3表达的rna干扰剂及其用途
WO2023166425A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions
WO2023240287A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Bioentre Llc Combinations of ctla4 binding proteins and methods of treating cancer
WO2024102913A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of kidney diseases with a combination of angiopoietin like 3 (angptl3) inhibitors and solute carrier family 5 member 2 (slc5a2) inhibitors

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255487A1 (en) * 2002-11-14 2005-11-17 Dharmacon, Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20090203135A1 (en) * 2007-04-23 2009-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA Interference Agents
RU2380411C2 (ru) * 2004-07-20 2010-01-27 Дженентек, Инк. Способ ингибирования пролиферации гепатоцитов, способ ингибирования клеточной адгезии гепатоцитов и способ ингибирования биологической активности angptl4 в гепатоцитах или предшественниках гепатоцитов

Family Cites Families (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon, Inc. Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
DE69233599T2 (de) 1991-12-24 2006-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Unterbrochene 2'-modifizierte Oligonukleotide
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
KR960705837A (ko) 1993-11-16 1996-11-08 라이오넬 엔. 사이몬 비포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기와 혼합된 비대칭적으로 순수한 포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 합성 올리고머(Synthetic Oligomers Having Chirally Pure Phosphonate Internucleosidyl Linkages Mixed with Non-Phosphonate Internucleosidyl Linkages)
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
WO1996037194A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0832271B8 (en) 1995-06-07 2005-03-02 INEX Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
DE69634606D1 (de) 1995-10-16 2005-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Neue expressionsvektoren und verfahren zu deren verwendung
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
BR9814484A (pt) 1997-12-24 2000-10-10 Vertex Pharma "pró-drogas de inibidores de aspartil protease"
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2335393C (en) 1998-07-20 2008-09-23 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US6319946B1 (en) 1999-02-12 2001-11-20 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of aspartyl protease
WO2000050050A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001053307A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
CZ308053B6 (cs) * 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
WO2003015698A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
EP2567693B1 (en) 2003-07-16 2015-10-21 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
JP4731324B2 (ja) 2003-08-28 2011-07-20 武 今西 Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
JP5336853B2 (ja) 2005-11-02 2013-11-06 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 修飾ｓｉＲＮＡ分子およびその使用法
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
US8178503B2 (en) * 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
AU2007227251A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to angiopoietin-like protein 4 and uses thereof
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
PL2121751T3 (pl) * 2006-12-08 2017-07-31 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Przeciwciała monoklonalne przeciwko ANGPTL3
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
CA2710713C (en) 2007-12-27 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
EP2245039A4 (en) * 2008-01-31 2012-06-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc OPTIMIZED METHODS FOR EXPORING DSRNA TO TARGET THE PCSK9 GEN
PT2279254T (pt) 2008-04-15 2017-09-04 Protiva Biotherapeutics Inc Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico
EP3584320A1 (en) * 2008-09-25 2019-12-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
EA029762B1 (ru) * 2008-10-20 2018-05-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
CA2746514C (en) 2008-12-10 2018-11-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
CA2764832A1 (en) * 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
ES2677969T3 (es) * 2010-01-08 2018-08-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulación de la expresión tipo angiopoyetina 3
KR102395085B1 (ko) 2011-06-21 2022-05-09 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) iRNA 조성물 및 그 사용 방법
KR102689177B1 (ko) 2011-11-18 2024-07-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 ＲＮＡｉ 제제
EP3919620A1 (en) 2012-05-02 2021-12-08 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
AU2013296321B2 (en) 2012-08-03 2019-05-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNAi agents
AU2013299717B2 (en) 2012-08-06 2018-06-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugated RNA agents and process for their preparation
WO2014182661A2 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
KR102356388B1 (ko) 2014-05-01 2022-01-26 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP7289610B2 (ja) 2014-08-20 2023-06-12 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 修飾二本鎖ｒｎａ剤
US20180245077A1 (en) 2015-03-20 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
TWI723986B (zh) 2015-04-13 2021-04-11 美商阿尼拉製藥公司 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法
SG11201912188RA (en) 2017-09-14 2020-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Rnai agents and compositions for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (angptl3), and methods of use
EP3719126A4 (en) 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, ASSOCIATED PREPARATION PROCESS AND USE
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit
IL305442A (en) 2021-03-04 2023-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) IRNA compositions and methods of using them

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255487A1 (en) * 2002-11-14 2005-11-17 Dharmacon, Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
RU2380411C2 (ru) * 2004-07-20 2010-01-27 Дженентек, Инк. Способ ингибирования пролиферации гепатоцитов, способ ингибирования клеточной адгезии гепатоцитов и способ ингибирования биологической активности angptl4 в гепатоцитах или предшественниках гепатоцитов
US20090203135A1 (en) * 2007-04-23 2009-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA Interference Agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID B.ROZEMA et al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes, PNAS, 2007, Vol.104, N.32, pp.12982-12987. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220073925A1 (en) 2022-03-10
US10550390B2 (en) 2020-02-04
AU2017206228A1 (en) 2017-08-10
MX2022012087A (es) 2022-11-30
AU2012272970A8 (en) 2014-02-27
BR112013033260A8 (pt) 2017-12-19
US20240175030A1 (en) 2024-05-30
US20220073928A1 (en) 2022-03-10
US20160186180A1 (en) 2016-06-30
KR20210035317A (ko) 2021-03-31
NZ620151A (en) 2016-04-29
US11130953B2 (en) 2021-09-28
MX2013014364A (es) 2014-07-30
US9322018B2 (en) 2016-04-26
BR112013033260A2 (pt) 2016-11-22
US11332743B2 (en) 2022-05-17
JP7245194B2 (ja) 2023-03-23
JP2019013252A (ja) 2019-01-31
MX2023000053A (es) 2023-04-10
CN112961855B (zh) 2024-08-09
AU2022201993B2 (en) 2024-08-29
KR20220063292A (ko) 2022-05-17
US20210171955A1 (en) 2021-06-10
US20190316137A1 (en) 2019-10-17
EP3656860A1 (en) 2020-05-27
EP2723758B1 (en) 2018-06-20
US9771591B2 (en) 2017-09-26
US10934545B2 (en) 2021-03-02
AU2021201547A1 (en) 2021-04-01
US20220073929A1 (en) 2022-03-10
AU2022201993A1 (en) 2022-04-14
US10557139B2 (en) 2020-02-11
US20220073927A1 (en) 2022-03-10
EP2723758A2 (en) 2014-04-30
CN107287202B (zh) 2021-03-16
US11525138B2 (en) 2022-12-13
JP2023052363A (ja) 2023-04-11
KR102395085B1 (ko) 2022-05-09
BR122019026068B8 (pt) 2022-10-18
CN107287202A (zh) 2017-10-24
EP4092120A1 (en) 2022-11-23
EP3656860B1 (en) 2022-04-20
SG10201913683WA (en) 2020-03-30
CN112961855A (zh) 2021-06-15
AU2019226296A1 (en) 2019-09-26
SG10201800715PA (en) 2018-02-27
US20220235358A1 (en) 2022-07-28
US20200140866A1 (en) 2020-05-07
KR102554896B1 (ko) 2023-07-12
MX345095B (es) 2017-01-17
US11306314B2 (en) 2022-04-19
AU2021201547B2 (en) 2022-04-07
US11840692B2 (en) 2023-12-12
AU2012272970A1 (en) 2014-02-06
US10337010B2 (en) 2019-07-02
BR112013033260B1 (pt) 2022-06-21
US11306315B2 (en) 2022-04-19
KR20230107908A (ko) 2023-07-18
JP6430559B2 (ja) 2018-11-28
MX360782B (es) 2018-11-16
HK1199457A1 (en) 2015-07-03
WO2012177784A3 (en) 2013-02-21
JP2014524738A (ja) 2014-09-25
JP2017148048A (ja) 2017-08-31
US11834662B2 (en) 2023-12-05
RU2019138721A3 (ru) 2021-12-02
US20170355994A1 (en) 2017-12-14
US20140179768A1 (en) 2014-06-26
US11866709B2 (en) 2024-01-09
WO2012177784A2 (en) 2012-12-27
KR20140044870A (ko) 2014-04-15
US20210171954A1 (en) 2021-06-10
CA2839573A1 (en) 2012-12-27
EP3444348A1 (en) 2019-02-20
US20220073924A1 (en) 2022-03-10
US20190352645A1 (en) 2019-11-21
RU2014101627A (ru) 2015-07-27
US11306316B2 (en) 2022-04-19
JP6110372B2 (ja) 2017-04-05
CN103890000A (zh) 2014-06-25
BR122019026068B1 (pt) 2022-09-20
JP2020174671A (ja) 2020-10-29
JP6698787B2 (ja) 2020-05-27
US20220073926A1 (en) 2022-03-10
ES2923573T3 (es) 2022-09-28
CN103890000B (zh) 2017-09-01
RU2019138721A (ru) 2021-04-26
EP2723758A4 (en) 2015-04-15
KR102232287B1 (ko) 2021-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7245194B2 (ja) アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
RU2702501C2 (ru) Композиции и способы ингибирования экспрессии гена tmprss6
JP2017012176A (ja) Ｐｃｓｋ９遺伝子の阻害のための組成物および方法
TWI669393B (zh) 抑制ｌｅｃｔ２基因表現之組合物及方法
TW202020157A (zh) 用於抑制lect2基因表現之組合物及方法
RU2774821C2 (ru) КОМПОЗИЦИИ иРНК ДЛЯ СХОДНОГО С АНГИОПОЭТИНОМ 3 (ANGPTL3) БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant
FA92 Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted)

Effective date: 20170720

FZ9A Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal)

Effective date: 20180726