JP2021504415A - 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents
二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021504415A JP2021504415A JP2020529483A JP2020529483A JP2021504415A JP 2021504415 A JP2021504415 A JP 2021504415A JP 2020529483 A JP2020529483 A JP 2020529483A JP 2020529483 A JP2020529483 A JP 2020529483A JP 2021504415 A JP2021504415 A JP 2021504415A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- double
- nucleotide
- nucleotide sequence
- stranded oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
Abstract
Description
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
文脈において、特に説明がない限り、大文字C、G、U、Aは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、5’−リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又は5’−チオリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)を指す。
1つの側面において、本開示は、遺伝子発現を調節できる二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
前記センス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間。
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号3に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号4に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号5に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号6に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号7に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号8に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号9に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号10に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号11に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号12に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号13に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号14に示される配列である。
5’−UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGm−3’(配列番号2)
5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号3)
5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAm−3’(配列番号4)
5’−UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm−3’(配列番号5)
5’−UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAm−3’(配列番号6)
5’−CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm−3’(配列番号7)
5’−UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGm−3’(配列番号8)
5’−GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm−3’(配列番号9)
5’−UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCm−3’(配列番号10)
5’−CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm−3’(配列番号11)
5’−UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGm−3’(配列番号12)
5’−CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm−3’(配列番号13)
5’−UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGm−3’(配列番号14)
いくつかの実施形態におけるsiRNA配列
1つの側面において、本開示は、活性成分として上述した二本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
X101及びX102はそれぞれ独立してO、S、N−A又はC−Aであり、Aは水素又はC1−C20炭化水素鎖であり、
Y及びZはそれぞれ独立してC=O、C=S、S=O、CH−OH又はSO2であり、
R101、R102、R103、R104、R105、R106及びR107はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
Xが1〜10の整数であり、
nが1〜3の整数であり、mが0〜20の整数であり、pが0又は1であり、ここで、m及びpがいずれも0である場合、R102は水素であり、
n又はmの少なくとも1つが2である場合、R103と式(201)における窒素とが、式(202)又は式(203)に示される構造を形成する。
前記PEG化脂質は、1,2−ジパルミトアミド−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]−2000である。
1つの側面において、本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体を提供する。
LAは、式(302)に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記LAは、その両端でそれぞれ1つの前記標的基及び前記LC部にエーテル結合により結合される。
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3’末端に結合される。
*は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
#は、リンカーにおいてリン酸エステル結合により二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される部位を表す。
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3’末端に結合される。
m1、m2及びm3は独立して、2〜10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して、Hであり、又はC1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3は式A59に示される構造の基である。
R’はC1−C10のアルキル基であり、
Raは、式A27〜A45の基から選択される1つである。
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。
R4は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、共有結合により本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、反応させてリン酸ジエステル結合により二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各S1は、独立してM1において全ての活性ヒドロキシ基がYCOO−基で置換された基であり、各Yは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される1つである。
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。いくつかの実施形態において、q1は1又は2である。いくつかの実施形態において、q2は1〜5の整数である。いくつかの実施形態において、R4は、式(B9)又は(B10)に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、R4は、式(B11)又は(B12)に示される構造を含む。
(1)式(321)の化合物(式(321)の化合物は、R4に、保護されたヒドロキシ基ORkを含む第1の官能基、及び式(C1’)又は(C3’)に示される構造を有する第2の官能基が含まれる化合物である)におけるヒドロキシ保護基Rkを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合基により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’−5’の方向に従い、ホスホルアミダイト固相合成方法により二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖を合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成すること、
(4)二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を得ることを含む。
R6は、式(321)におけるR4を提供する基である。いくつかの実施形態において、R6は、式(A61)に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び/又はオリゴヌクレオチド複合体の、細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝細胞に異常に発現する遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓で繁殖する病原体遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP−1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子又はアポリポタンパクC3遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
本開示は、上述した二本鎖オリゴヌクレオチド、上述した薬物組成物及び/又は上述したオリゴヌクレオチド複合体を含むキットを提供する。
(発明の効果)
C57BL/6Nマウス:6〜8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入、以下単にC57マウスという。
SDラット:北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6−HBV:品種名:B6−Tg HBV/Vst(1.28copy、genotype A)、北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にCOI>104のマウス(以下単に1.28copyマウスともいう)を選択した。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/J:北京大学医学部実験動物科学部から購入する。
HBVトランスジェニックマウス:M−TgHBVと命名され、上海市公衆衛生センター動物部から購入し、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ren J.ら、J. Medical Virology. 2006,78:551〜560に記載されている。
AAV−HBVトランスジェニックマウス:文献の方法(董小岩ら、Chin J Biotech 2010,May 25,26(5):679〜686)によりAAV−HBVモデルを作製し、rAAV8−1.3HBV、D型(ayw)、北京五加和分子医学研究所有限公司から購入し、1×1012ウイルスゲノム(v.g.)/mL、ロット番号2016123011。実験前を無菌PBSで5×1011v.g./mLに希釈した。マウス1匹あたり200μL注射し、即ち、マウス1匹あたり1×1011v.g.注射した。ウイルスを注射した後の28日目に、全てのマウスに対して眼窩採血(約100μL)を行い、血清を回収してHBsAg及びHBV DNAを検出するために用いられる。
低濃度AAV−HBVトランスジェニックマウス:実験前にウイルスを無菌PBSで1×1011v.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLのウイルスを注射し、即ち、マウス1匹あたり1×1010v.g.注射したこと以外、上記と基本的に同じモデリング方法を採用した。
BALB/cマウス:6〜8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ob/obマウス:6〜8週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス:B6、CBA−Tg(APOC3)3707Bres/J、米国Jackson Laboratoryから購入する。
メタボリックシンドロームサル:北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターにより提供される。
で表され、データ分析では、Graphpad prism5.0統計分析ソフトウェアを採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす(p>0.20)とともに分散が等しい(p>0.10)場合、複数の群間の比較では、一元配置分散分析によるLSD法により多重比較し、p<0.05である場合、統計学的に有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるKruskal−Wallis H方法を採用し、Kruskal−wallis H検定結果が有意(p<0.05)である場合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、p<0.05である場合、統計学的に有意であるとみなした。
本調製例では、以下の方法に従い、表2のsiRNAを合成した。
注釈:大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、dTは、デオキシチミンヌクレオチドを表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、VPは、当該文字VPの右側の1つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Pは、当該文字Pの右側の1つのヌクレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Psは、当該文字Psの右側の1つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表す。
汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life Sciences社)を出発として循環させ、上記配列並び順に従い3’−5’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定された。
本工程において、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life Sciences社)により、siRNAのアンチセンス鎖ASを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化及び/又は硫化反応条件、脱保護と切断、単離条件は、センス鎖の合成と同じであった。
以下の方法に従い、VP−U−2分子を合成した。
S鎖とAS鎖を等モル比で混合し、注射用水に溶解させ95℃に加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。
本調製例では、以下の方法に従い、表4Aにおいて番号が複合体A1であるsiRNA複合体を合成した。
以下の方法に従い、L−10化合物を合成した。
100.0gのGAL−1(N−アセチル−D−ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:1772−03−8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000mlの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL−2を得た。
工程(1−1a)で得られたGAL−2(35.1g、90.0mmol)を213mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gのTMSOTf(CAS番号:27607−77−8、マックリン社から購入、108.0mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
工程(1−1b)で得られたGAL−3(26.9g、81.7mmol)を136mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.0gの5−ヘキセン−1−オール(CAS番号:821−41−0、Adamas−beta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL−4を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1−1c)に記載された方法により得られたGAL−4(14.9g、34.7mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番号:7790−28−5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898−67−0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、システム温度を30℃以下に制御し、室温で一晩反応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを約7.5に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.5gの白色泡状固形製品GAL−5を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO) δ 12.01 (br,1H),7.83 (d,J =9.2 Hz,1H),5.21 (d,J =3.2 Hz,1H),4.96 (dd,J =11.2,3.2 Hz,1H),4.49 (d,J =8.4 Hz,1H),4.07 − 3.95 (m,3H),3.92 − 3.85 (m,1H),3.74 − 3.67 (m,1H),3.48 − 3.39 (m,1H),2.20 (t,J =6.8 Hz,2H),2.11 (s,3H),2.00 (s,3H),1.90 (s,3H),1.77 (s,3H),1.55 − 1.45 (m,4H).
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたL−10化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い3’−5’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を含む。2個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を含む。2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップリング、キャッピング、硫化の4つの反応を行った。上記反応の条件は、前述した調製例1でセンス鎖を合成する際に用いられる条件が同じであった。
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life Sciences社)を出発として循環させ、複合体1のアンチセンス鎖ASを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、前述した調製例1でアンチセンス鎖を合成する際に用いられる条件と同じであった。
S鎖とAS鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、40mg/mLの溶液を得、等モル比で混合し、50℃で15min加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水(Milli−Q超純水装置で自作、抵抗率18.2MΩ*cm(25℃))を用いて複合体を濃度が0.2mg/mLになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC−MS、Liquid Chromatography−Mass Spectrometry、Waters社から購入、型番:LCT Premier)により分子量を検出した。その結果、理論値S:7516.37、AS:7061.57、実測値S:7516.6、AS:7060.49であり、分子量の実測値が理論値と一致しており、式(403)に示される構造の目的複合体A1を得たことを示した。
前記複合体のsiRNA配列が、それぞれ表4A〜4Gに示される対応する配列であったこと以外、調製例2と同じ方法により、表4A〜4Gにおける複合体A2〜A7、B1〜B2、C2、C12〜C13、D2、D12〜D13、E1〜E4、F1〜F3、G1〜G3及び比較複合体A2、C1、D1、E1、F1、G1を合成し、表4A〜4Gに示される複合体A8〜A11、B3〜B7、C1、C3、D1、D3、E5〜E9、F4〜F11、G4〜G9を製造できると予期した。合成を完成した後、調製例2と同じ検出方法により得られた複合体を確認した。そのうち、
複合体A2の理論値S:7516.37、AS:7065.58、実測値S:7516.6、AS:7064.5、
複合体A3の理論値S:7504.34、AS:7139.68、実測値S:7515.6、AS:7138.9、
複合体A4の理論値S:7516.37、AS:7081.64、実測値S:7515.6、AS:7080.9、
複合体A5の理論値S:8218.83、AS:7703.05、実測値S:8218、AS:7702.5、
複合体A6の理論値S:7516.37、AS:6985.58、実測値S:7516.5、AS:6984.9、
複合体B1の理論値S:7407.22、AS:7208.77、実測値S:7406.4、AS:7208.1、
複合体B2の理論値S:7407.22、AS:7170.72、実測値S:7406.5、AS:7170.1、
複合体C2の理論値S:7485.3、AS:7161.7、実測値S:7484.4、AS:7160.9、
複合体D2の理論値S:7423.22、AS:7207.78、実測値S:7422.6、AS:7207.2、
複合体F2の理論値S:7649.55、AS:6995.47、実測値S:7648.8、AS:6994.8、
複合体F3の理論値S:7649.55、AS:7011.53、実測値S:7648.8、AS:7010.9、
複合体E1の理論値S:7584.5、AS:7007.46、実測値S:7584、AS:7006.2、
複合体E2の理論値S:7584.5、AS:7011.47、実測値S:7584、AS:7011.3、
複合体E4の理論値S:7572.47、AS:6907.41、実測値S:7571.8、AS:6906.9。
siRNA複合体
注釈:大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、VPは、当該文字VPの右側の1つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Pは、当該文字Pの右側の1つのヌクレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Psは、当該文字Psの右側の1つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表す。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A12、B8、C4、D4、E10、F12及びG10(以下、ともいうP−10複合体)を合成できると予期した。
以下の方法に従い、P−10化合物を合成した。
40mlのN,N−ジメチルホルムアミドに上記工程(2−1−1)に記載された方法により得られたGAL−5(13.43g、30.0mmol)、4−アミノ酸tert−ブチルエステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させた後に室温で5時間攪拌反応させた。反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5−C4−1を得、そのまま次の反応を行った。
工程(4−1−1)で得られたGAL5−C4−1粗製品(30.3g、30mmol)を180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィーにより精製し(200〜300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5−C4−2を得た。
工程(2−1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)と工程(4−1−2)で得られたGAL5−C4−2(8.24g、15.48mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。20mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋なP−6を得た。
上記(4−1−3)で得られたP−6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP−7を得た。MS m/z:C78H127N10O33、[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
P−7(2.653g、1.532mmol)とA−1(2.342g、4.596mmol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT)(1.375g、4.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5〜1:1:1:0.6で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計2.793gの純粋なP−8を得た。
P−8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに100mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、80gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋なP−9複合分子を得た。MS m/z:C106H153N10O41、[M−DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。
L−9複合分子の代わりにP−9複合分子を用い、固相担体に結合されたP−9複合分子を得たこと以外、調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、P−10を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにP−10化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、複合体を調製した。構造が式(404)に示される複合体A12、B8、C4、D4、E10、F12及びG10を得ることができると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A13、B9、C5、D5、E11、F13及びG11(以下、R5複合体ともいう)を合成できると予期した。
以下の方法に従い、R−5化合物を合成した。
工程(2−1−1b)に記載された方法により得られたGAL−3(26.4g、80.2mmol)を134mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩粉を加え、さらに7−オクテン−1−オール(11.3g、88.2mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を100mlのジクロロメタンで1回抽出し、有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL−C7−1を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(5−1−1)で得られたGAL−C7−1(33.3g、72.8mmol)を160mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。反応液に200mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.5に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで3回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL−C7−2を得た。MS m/z:C21H32NO11、[M+H]+、理論値:476.50、実測値:475.94。
工程(2−1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)とGAL−C7−2(7.36g、15.48mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して7.82gの純粋なR−1を得た。
R−1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋なR−2を得た。
R−2(2.391g、1.532mmol)とA−1(2.342g、4.596mmol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT)(1.375g、4.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5〜1:1:1:0.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋なR−3を得た。
R−3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.8148mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して505mgの純粋なR−4複合分子を得た。
L−9複合分子の代わりにR−4複合分子を用い、固相担体に結合されたR−4複合分子を得たこと以外、調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、R−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにR−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、R5複合体を調製した。構造が式(407)に示される複合体A13、B9、C5、D5、E11、F13及びG11を得ることができると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A14、B10、C6、D6、E12、F14及びG12(以下、LA5複合体ともいう)を合成できると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A15、B11、C7、D7、E13、F15及びG13(以下、LB5複合体ともいう)を合成できると予期した。
以下の方法に従い、LB−5化合物を合成した。
工程(2−1−6)に記載された方法により得られたL−8(5.0g、3.386mmol)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、2.2g、16.931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。70mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1:1:0.2〜1:1:1:1で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.267gの純粋なLB−1を得た。
工程(7−1−1)に記載された方法により得られたLB−1(4.697g、2.753mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3−アミノ−1,2−プロパンジオール(313mg、3.442mmol)、4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及びN−メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を順に30mlのアセトニトリルと3mlのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.07〜1:0.5で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB−2を得た。
LB−2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた。さらに4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。カラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.05〜1:0.2で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647gの目的生成物LB−3を得た。
LB−3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(270mg、2.075mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を3回洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、5wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:20で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの純粋なLB−4複合分子を得た。
L−9複合分子の代わりにLB−4複合分子を用い、固相担体に結合されたLB−4複合分子を得たこと以外、調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、LB−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにLB−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、LB5複合体を調製した。構造が式(413)に示される複合体A15、B11、C7、D7、E13、F15及びG13を得ることができると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A16、B12、C8、D8、E14、F16及びG14(以下、V8複合体ともいう)を合成できると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A17、B13、C9、D9、E15、F17及びG15(以下、W8複合体ともいう)を合成できると予期した。
以下の方法に従い、W−8化合物を合成した。
W−0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷水浴で0℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで18h発泡乾燥させ、5.835gの固形粗製品W−1を得た。
W−1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。20mlの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を2回洗浄し、20mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W−2を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
W−2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、さらに100mlのメチルアミン水溶液(40wt%)を加え、50℃で23h攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、200mlの体積比1:1のDCM−メタノール混合溶剤を加え、50mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=1:1:0.05〜1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋なW−3を得た。
W−3(0.675g、1.517mmol)とGAL−C7−2(2.60g、5.46mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、1.816g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋なW−4を得た。
W−4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させた。150mlのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋なW−5を得た。
W−5(1.25g、0.793mmol)及び工程(2−1−7a)に記載された方法により得られたA−1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、185gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1〜1:1:0.7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋なW−6を得た。
W−6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.89mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mmol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋なW−7複合分子を得た。MS m/z:C101H146N7O38、[M−DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。
L−9複合分子の代わりにW−7複合分子を用い、固相担体に結合されたW−7複合分子を得たこと以外、調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、W−8を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにW−8化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、W8複合体を調製した。構造が式(415)に示される複合体A17、B13、C9、D9、E15、F17及びG15を得ることができると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A18、B14、C10、D10、E16、F18及びG16(以下、X8複合体ともいう)を合成できると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合体A19、B15、C11、D11、E12、F14及びG12(以下、Z5複合体ともいう)を合成できると予期した。
以下の方法に従い、Z−5化合物を合成した。
工程(9−1−3)に記載された方法により得られたW−3(1.50g、3.37mmol)と工程(4−1−2)に記載された方法により得られたGAL5−C4−2(7.18g、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、最後に3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=30:1〜15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋なZ−1を得た。MS m/z:C98H143N10O33、[M+H]+、理論値:1987.98、実測値:1987.90。
Z−1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1h反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。220gの200〜300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10:1〜2:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して3.49gの純粋なZ−2を得た。MS m/z:C79H129N10O33、[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
Z−2(3.49g、2.0mmol)と工程(2−1−7a)に記載された方法により得られたA−1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、200gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=25:1〜15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.2gの純粋なZ−3を得た。MS m/z:C103H151N10O38、[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
Z−3(2.10g、0.983mmol)をDIEA(0.635g、4.915mmol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、188gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1〜3:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの純粋なZ−4複合分子を得た。MS m/z:C107H155N10O41、[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
L−9複合分子の代わりにZ−4複合分子を用い、固相担体に結合されたZ−4複合分子を得たこと以外、調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、Z−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにZ−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、Z5複合体を調製した。構造が式(422)に示される複合体A19、B15、C11、D11、E17、F19及びG17を得ることができると予期した。
本調製例では、表4A〜4Gに示される複合体A20〜A23、B16〜B17、C14、D14、E18〜E20、F20及び比較複合体A1、B1(以下、FIN複合体ともいう)を合成した。これらの複合体に複合されたsiRNAの配列は、表4A〜4Gにおける対応する配列に示される。
Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903−908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN−2複合分子を合成した。
2.93gのPRO−6(L−ヒドロキシプロリン、CAS番号:51−35−4、Energy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4−dioxane(1,4−ジオキサン、CAS番号:123−91−1)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を加え、懸濁液状態にし、6.95gのFmoc−Cl(クロロギ酸−9−フルオレニルメチル、CAS番号:28920−43−6、Energy社から購入、26.8mmol)を34mlの1,4−dioxaneに溶解させ、氷浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert−ブチルエーテルで1回あたり100mlで3回抽出し、有機相を捨て、水相を濃HClでpH≦5になるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状固形製品PRO−7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J =7.2 Hz,2H),7.67 (d,J =7.5 Hz,2H),7.48 − 7.39 (m,2H),7.38 − 7.27 (m,2H),5.17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23 − 4.11 (m,2H),3.55 − 3.41 (m,3H),2.31 − 2.10 (m,1H),2.08 − 1.88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for) C20H19NO5 [M−H]−352.1190、実測値:352.1033.
7.83gのPRO−7(22.2mmol)を80mlのTHF(CAS番号:109−99−9)に溶解させ、油浴で65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3−Me2SのTHF溶液(CAS番号13292−87−0、J&K Scientific社から購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後石油エーテルで3回精製して7.1gの白色固形生成物PRO−8を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J =6.7 Hz,2H),7.67 (d,J =7.2 Hz,2H),7.49 − 7.39 (m,2H),7.38 − 7.26 (m,2H),5.18 (dd,J =6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s,2H),4.23 − 4.13 (m,2H),3.55 − 3.38 (m,2H),2.32 − 2.11 (m,1H),2.08 − 1.89 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値 C20H21NO4 [M+Na]+362.1368、実測値:362.1012.
7.1gのPRO−8(21mmol)を100mlのピリジンに溶解させ、14.2gのDMTr−Cl(4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr−Clを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO−9を得た。HRMS (ESI) m/z 理論値 C41H39NO6 [M+Na]+664.2675、実測664.2348,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160324−1)純度94.20%。
8.2gのPRO−9(12.8mmol)を64mlのDMF(N,N−ジメチルホルムアミド)に溶解させ、40mlのピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を300mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、4.65gの白色固形生成物PRO−10を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.40 (d,J =7.2 Hz,2H),7.35 − 7.18 (m,7H),6.93 − 6.84 (m,4H),4.56 (d,J =3.9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46 − 3.37 (m,1H),2.88 (ddd,J =18.5,10.0,5.5 Hz,2H),2.75 (dd,J =8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,J =11.0,2.7 Hz,1H),1.74 − 1.65 (m,1H),1.40 (ddd,J =12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI) m/z 理論値 C26H29NO4 [M+Na]+442.1994、実測442.1999,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160329−1)純度97.07%。
核酸固相合成方法により、工程(12−1−3)で得られたFIN−2複合分子を3回循環させることにより、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports)に結合し、複合基(FIN_FIN_FIN)のRNAセンス鎖の3’末端への結合を実現した。
1)工程(12−2)で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、2)複合siRNAが、表4A〜4Gに示される複合体A20〜A23、B16〜B17、C14、D14、E18〜E20、F20及び比較複合体A1、B1に対応する配列を有すること以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、表題複合体を調製した。
本調製例で比較複合体A3、E2、F2を合成し、これらの複合体に複合されたsiRNAの配列は、表4A、4E及び4Fに示される。
WO2014025805A1に記載された調製方法により化合物30、即ち、以上のようなリンカー−(LA)3トリヒドロキシメチルアミノメタン−LB−及び標的基であるN−アセチルガラクトサミン分子(ここで、各LAに1つのN−アセチルガラクトサミン分子が結合されてもよいので、1つのリンカーに3個のN−アセチルガラクトサミン分子が結合できる)を含む複合分子((GalNAc)3複合分子ともいう)を合成し、前記化合物30の構造は、下式に示される。
調製例2における工程(2−1−9)と同じ方法により、(GalNAc)3複合分子を固相担体に結合し、固相担体に結合された(GalNAc)3複合分子を得た。
1)工程(13−2)で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、2)複合siRNAが表4A、4E、4Fにおいて番号A3、E2、F2に示される配列を有すること以外、調製例2における工程(2−2)、(2−3A)、(2−4)と同じ方法により、比較複合体A3、E2、F2を調製した。
C57BL/6Jマウスにおいて、各マウス1匹あたり100mg/kg又は200mg/kg(siRNAとして計算)の複合体A1をそれぞれ単回皮下投与し(0.9%塩化ナトリウム水溶液、濃度がそれぞれ10mg/mL及び20mg/mLであり、投与体積が10mL/kgであり、濃度ごとに雌雄マウス各3匹に投与した)、その間に臨床観察を行ったところ、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められておらず、投与した24h後、血液サンプルを採取して臨床病理学的検査を行い、動物を解剖した。その結果、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
(実験例2−1)siRNA複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:比較複合体A1及び複合体A21(それぞれsiRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり6μl)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのトリトソーム(Xenotech社から購入、番号R0610LT、ロット番号1610069)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0h、1h、2h、4h、6h、8h、24h、48hに5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
被験サンプルが複合体A1、A6及び比較siRNA1であり、トリトソームとの培養時間がそれぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8hであったこと以外、実験例2−1と同じ方法を採用した。
複合体A1、A6及び比較siRNA2(それぞれsiRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間で10μLのサンプルを取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、各サンプルを10μLずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル(2μM、2μl)を8μlの1×PBS(pH7.4)と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない10μLのサンプルとして調製し、Conと記した。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後イメージングを行った。結果を図3に示した。
複合体A1、A6及び比較siRNA2(それぞれsiRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)を、108μLの90%カニクイザル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物から購入、HQ70082、PBSで希釈)とそれぞれ均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、各サンプルを10μLずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル(2μM、2μl)を8μlの1×PBS(pH7.4)と均一に混合し、10μLサル血漿処理されていないサンプルとして調製し、Conと記した。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後イメージングを行った。結果を図4に示した。
1)マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:各6μlの複合体A2及び比較siRNA2(20μM)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウス由来のリソソーム溶解液(Rat Liver Tritosomes、Xenotech社、番号R0610.LT、ロット番号1610069)と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が0.2mU/μLであった。37℃で恒温培養した。それぞれ0、1、2、4、6、24時間でそれぞれ混合液を5μl取り出し、15μLの9M尿素溶液に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液(Human Liver Lysosomes、Xenotech社、番号H0610.L、ロット番号1610316)に変更したこと以外、1)と同じ方法により比較siRNA2及び複合体A2のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図6に示した。
本実験例では、それぞれ各実験群のラット(1群あたり10匹のラットであり、雌雄がそれぞれ半分であった)に皮下注射により複合体A1を単回投与し、10mg/kg及び50mg/kgの用量で実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、腎臓組織の薬物濃度を検出した。
(2)細胞を破砕するために組織ホモジネートを超音波(150W、30s)処理した。
(3)組織サンプルについては、組織サンプル75μLを96ウェルのPCRプレートに加え、5μLのプロテアーゼK(供給者:Invitrogen、番号:25530−015)、10μLの10wt%アセトニトリル及び0.01wt%ツウィーン20の混合水溶液を加え、血漿サンプルについては、血漿20μLを96ウェルのPCRプレートに加え、45μLの組織と細胞溶解液、5μLのプロテアーゼK、20μLの10wt%アセトニトリル及び0.01wt%ツウィーン20の混合水溶液を加えた。
(4)プレートをシールし、PCR器(供給者:Applied Biosystems、型番:GeneAmp(登録商標) PCR system 9700)に放置し、65℃で45分間培養した。
(5)培養終了後、10μLの3M KClの水溶液(供給者:Sigma−aldrich、番号:60135−250ML)を加え、振とうして均一にし、4℃、3200rcfで15分間遠心した。
(6)組織サンプルに対して、上清液80μLを120μLのハイブリッド混合液に加え(ハイブリッド混合液の調製:0.5mLの6μM PNAプローブ(供給者:杭州泰禾生物科技有限公司)、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、3.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)、
血漿サンプルに対して、上清液40μLを160μLのハイブリッド混合液に加えた(ハイブリッド混合液の調製:0.5mLの6μM PNAプローブ、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、7.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)。
(7)プレートをシールし、PCR器に放置し、95℃で15分間培養し、直ちに氷の上に5分間放置した。
(8)別の円錐底96ウェルプレートに移し、振とうして均一にした。3200rcfで1分間遠心した。
(9)サンプルを負荷して検出し、HPLC−FLDにより分析して定量した(液相系供給者:Thermo Fisher、クロマトグラフ型番:ultimate 3000)。
図7は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体A1のラット血漿におけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/Jにおいて複合体A5及びA7によるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
AAV−HBVマウスを用い、動物のモデリングに成功した後、血清におけるHBsAgの含有量別にランダムに分け(5匹/群)、それぞれ複合体A1、比較複合体A2、比較複合体A3投与及びNSブランク対照とした。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は3mg/kg及び1mg/kgであり、濃度がそれぞれ0.3mg/ml及び0.1mg/mlの複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与前(D0と記した)及び薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、112、140、154、168、182日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。その間、検出結果から、血清におけるHBsAgの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を停止させた。
psiCHECKTM−2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、被験複合体(本例では複合体A1)におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、複合体A1におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に一致している目的配列を含む。
(3)GSSMは、複合体A1においてアンチセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体1においてアンチセンス鎖の5’端から9〜21位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体1においてアンチセンス鎖の5’端から9〜21位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。
(4)PSSMは、複合体A1においてセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体A1においてセンス鎖の5’端から9〜19位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的でない、即ち、複合体A1においてセンス鎖の5’端から9〜19位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。GSSM標的配列の長さに等しくするために、目的配列の3’末端に2つのCCを加えた。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen社)の使用説明書に従って、siRNAと上記各プラスミドをそれぞれコトランスフェクションし、プラスミドごとにいくつかのグループの特定の濃度の複合体1が対応している。プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、0.2μLのLipofectamineTM 2000を用いた。GSCMオンターゲットプラスミドに対して、複合体A1の最終濃度(siRNAの濃度として算出される)が100nMから、0.0001nMまで11個の濃度に4倍希釈した。1群あたり3個の複製ウェルがあった。
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書に従ってHEK293A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照(con)とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル(Fir)に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル(Ren)で標準化した。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションされたsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが最低と最高との間の半分にある場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きである。
(実験例B1−1)体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いられるHEK293A細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、20%のウシ胎児血清(FBS、Hyclone社)及び0.2体積%のペニシリン−ストレプトマイシン(Penicillin−Streptomycin、Gibco、Invitrogen社)を含むDMEM完全培地(Hyclone社)で細胞を37℃で5%CO2/95%空気含有インキュベーターにおいて培養した。
psiCHECKTM−2(PromegaTM)プラスミドにより、被験複合体(複合体B16又は複合体B17)におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含むオンターゲットプラスミドを構築した。目的配列をpsiCHECKTM−2プラスミドのXho I/Not I部位にクローニングした。
[2]トランスフェクション
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen社)の使用説明書に従って、siRNA複合体及び上記プラスミドをそれぞれコトランスフェクションし、プラスミドはウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、0.2μLのLipofectamineTM 2000を用い、複合体の最終濃度(siRNAの濃度として算出)は順に0.1nM、0.05nM及び0.01nMであった。各群では、複合体処理なしを対照とした。1群あたり3個の複製ウェルがあった。
NCは、GenePharma社からの、目的遺伝子配列と相同性のない汎用の陰性対照B01001であった。
[3]検出
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書に従ってHEK293A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。結果を図21に示した。
本実験例では、複合体B2の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べた。
(実験例B2−1)siRNA複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:複合体B1及び複合体B2(それぞれsiRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり6μl)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのトリトソーム(Xenotech社から購入、番号R0610LT、ロット番号1610069)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8hに5μlの試料(サンプル)を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
複合体B1、複合体B2(それぞれsiRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後各サンプルを10μLずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のsiRNA複合体(siRNA濃度は2μM、2μl)を8μlの1×PBS(pH7.4)と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない10μLのサンプルとして調製し、Conと記した。
他の実験において、実験例2−2と同じ方法により複合体B1、B2のサル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物から購入、HQ70082、PBSで希釈)における安定性を検出した。結果を図25に示した。
本実験例では、複合体B1によるHBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/JにおけるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
投与するsiRNA複合体を複合体B1、複合体B2に変更して試験を行い、複合体B1について、それぞれ1mg/kg及び0.1mg/kgの2つの用量で投与し、複合体B2を1mg/kgの用量で投与し、検出配列を表5Cに示される配列に変更し、結果を図28に示したこと以外、上記と同じ方法を採用した。
AAV−HBV低濃度モデルマウスに対して、血清におけるHBsAgの含有量別にランダムに分け(5匹/群)、それぞれ複合体B2及びNSブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は3mg/kg及び1mg/kgの2群であり、濃度がそれぞれ0.6mg/ml及び0.2mg/mlの複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、98、112、126、140日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
(実験例C1−1)siRNA複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:複合体C2(siRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり6μl)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのトリトソーム(Xenotech社から購入、番号R0610LT、ロット番号1610069)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8hに5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
複合体C2(siRNA濃度20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、各サンプルを10μLずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のsiRNA複合体(siRNA濃度は2μM、2μl)を8μlの1×PBS(pH7.4)と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない10μLのサンプルとして調製し、Conと記した。
他の実験において、実験例C1−2と同じ方法により複合体C2のサル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物から購入、HQ70082、PBSで希釈)における安定性を検出した。結果を図34に示した。
(実験例C2−1)体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性
複合体C14の配列により目的配列を構築したこと以外、実験例B1−2の方法により複合体C14を検出した。結果を図35に示した。結果から明らかなように、複合体C14は、良好な体外抑制活性を有している。
複合体C2の配列により目的配列を構築し、試験濃度が0.1nMから0.0001nMに倍加希釈し、各群の配列を11個の濃度で測定したこと以外、実験例A6の方法により複合体C2を検出した。結果を図36に示した。
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/Jにおいて複合体C2によるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
HBVトランスジェニック(M−TgHBV)マウス(上海市公衆衛生センター動物部から購入)を血清におけるHBsAgの含有量別にランダムに分け(6匹/群、いずれも雄性)、それぞれ生理食塩水(NS)対照群、複合体C2 1mg/kg及び3mg/kg群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が10ml/kgであり、単回皮下投与した。薬剤投与前(D0と記した)及び薬剤投与後の第7、14、21、28、42、56、70、85日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量(UI)で表される。
(実験例D1−1)siRNA複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
実験例C1−1の方法に基づいて、複合体D2の体外リソソーム溶解液における安定性に対して試験を行った。結果を図40に示した。
実験例C1−2、C1−3の方法に基づいて、複合体D2の体外でのヒト血漿、体外でのカニクイザル血漿における安定性に対してそれぞれ試験を行った。結果を図41、図42に示した。
(実験例D2−1)体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いたHEK293A細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、20%のウシ胎児血清(FBS、Hyclone社)及び0.2体積%のペニシリン−ストレプトマイシン(Penicillin−Streptomycin、Gibco、Invitrogen社)を含むDMEM完全培地(Hyclone社)で細胞を37℃で5%CO2/95%空気含有インキュベーターにおいて培養した。
本実験例では、複合体D2の体外psiCHECK系におけるIC50を調べた。
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/Jにおいて複合体D2によるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
HBVトランスジェニック(M−TgHBV)マウス(上海市公衆衛生センター動物部から購入)を血清におけるHBsAgの含有量別にランダムに分け(6匹/群、いずれも雄性)、それぞれ生理食塩水(NS)対照群、複合体D2 1mg/kg及び3mg/kg群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が10ml/kgであり、単回皮下投与した。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、42、56、70、85日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
本実験例では、siRNA E1、E4及び比較siRNA3の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、それぞれ3本のsiRNAが、完全マッチングした目的配列又はシード領域がマッチングした目的配列を標的する活性を測定した。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションされたsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが最低と最高との間の半分にある場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きである。
(実験例E2−1)siRNAのHuh7細胞におけるANGPTL3 mRNA発現量に対する抑制効率の検出。
LipofectamineTM 2000を用いて被験siRNA(siRNAE1、E2、E4)をヒト肝癌細胞株Huh7にトランスフェクションし、siRNAの最終濃度はそれぞれ5nM、0.25nM及び0.05nMであった。各濃度につき2つの複製ウェルがあった。いかなるsiRNA処理も施していない細胞をブランク対照(Blank)とした。
被験サンプルが複合体E18、E19であり、複合体の最終濃度(siRNAの量として)がそれぞれ50nM及び5nMであったこと以外、実験例2−1と同じ方法により検出した。各複合体による体外での抑制活性は、図50Bに示すとおりである。
被験サンプルが複合体E18、E19であり、複合体の最終濃度(siRNAの量として)が50nMから、0.016nMに5倍希釈し、最低濃度を0.00001nMとし、計7個の濃度であり、1群あたり3個の複製ウェルがあったこと以外、実験例E2−1と同じ方法により検出した。
(実験例E3−1)siRNAのリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、siRNA E1、E2、E4のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
本実験例では、複合体E1とE4のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
本実験例では、複合体E1とE4のヒト血漿における安定性を調べた。
(実験例E4−1)正常マウスC57体内でのsiRNA複合体のANGPTL3 mRNAに対するED50の測定。
本実験例では、複合体E18とE19の正常マウスC57体内での抑制活性を調べた。
本実験例では、複合体E18、E20による正常マウスBALB/c体内での肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
本実験例では、複合体E18によるob/obマウス体内での肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
本実験例では、ヒトAPOC3トランスジェニックマウス体内での複合体E1による肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
メタボリックシンドロームのサル12匹(全て雄性)をランダムに分け、8匹に複合体E2を投与し、4匹に比較複合体E1を投与した。各siRNA複合体をそれぞれ注射用生理食塩水で溶解させ、薬物濃度(siRNAの量として)が100mg/mlであった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、用量はいずれも9mg/kgであり、注射量は0.09ml/kgであり、各注射点は2ml以下であった。
脂質レベルの抑制率=(1−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
(実験例F1−1)体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性
本実験例では、複合体F20の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性を調べ、即ち、複合体F20が、完全マッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である)を標的する活性を測定した。
本実験例では、複合体F1の体外psiCHECK系におけるIC50を調べた。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションされたsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが最低と最高との間の半分にある場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きである。
本実験例では、複合体F2による体外Huh7細胞におけるAPOC3 mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
(実験例F2−1)本実験例では、ヒトAPOC3トランスジェニックマウス体内での複合体F1による肝臓組織におけるAPOC3 mRNA発現レベルに対する抑制率を調べた。
(実験例F3−1)本実験例では、複合体F1によるヒトAPOC3トランスジェニックマウス体内での血清中総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量に対する影響を調べた。
1)マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:各6μlの複合体G2及び比較siRNA1(20μM)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウス由来のリソソーム溶解液(Rat Liver Tritosomes、Xenotech社、番号R0610.LT、ロット番号1610069)と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が0.2mU/μLであった。37℃で恒温培養した。それぞれ0、1、2、4、6、24時間でそれぞれ混合液を5μl取り出し、15μLの9M尿素溶液に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液(Human Liver Lysosomes、Xenotech社、番号H0610.L、ロット番号1610316)に変更したこと以外、1)と同じ方法により比較siRNA1及び複合体G2のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図65に示した。
1)本実験例では、複合体G1及び複合体G2によるHBVモデルマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/JにおけるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
HBV遺伝子発現残量=(試験群HBV遺伝子のコピー数/試験群β−アクチンのコピー数)/(対照群HBV遺伝子のコピー数/対照群β−アクチンのコピー数)×100%。
本実験例に用いられるHBVモデルマウスC57B/6N−Tg(1.28HBV)/Vst(遺伝子型A型)は、北京維通達生物技術有限公司から購入された。0.9%塩化ナトリウム水溶液で複合体1を濃度0.6mg/ml及び0.2mg/ml(siRNAの濃度として算出される)の溶液として調製した。
被験指標の抑制率=(1−被験指標の標準化レベル)×100%。
で表され、データ分析では、Graphpad prism5.0統計分析ソフトウェアを採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす(p>0.20)とともに分散が等しい(p>0.10)場合、複数の群間の比較では、一元配置分散分析によるLSD法により多重比較し、p<0.05である場合、統計学的に有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるKruskal−Wallis H方法を採用し、Kruskal−wallis H検定結果が有意(p<0.05)である場合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、p<0.05である場合、統計学的に有意であるとみなした。
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたL−10化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い3’−5’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を含む。2個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を含む。2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の4つの反応を行った。上記反応の条件は、前述した調製例1でセンス鎖を合成する際に用いられる条件が同じであった。
(実験例E2−1)siRNAのHuh7細胞におけるANGPTL3 mRNA発現量に対する抑制効率の検出。
LipofectamineTM 2000を用いて被験siRNA(siRNAE1、E2、E4および比較siRNA4)をヒト肝癌細胞株Huh7にトランスフェクションし、siRNAの最終濃度はそれぞれ5nM、0.25nM及び0.05nMであった。各濃度につき2つの複製ウェルがあった。いかなるsiRNA処理も施していない細胞をブランク対照(Blank)とした。
本実験例に用いられるHBVモデルマウスC57B/6N−Tg(1.28HBV)/Vst(遺伝子型A型)は、北京維通達生物技術有限公司から購入された。0.9%塩化ナトリウム水溶液で複合体G1を濃度0.6mg/ml及び0.2mg/ml(siRNAの濃度として算出される)の溶液として調製した。
Claims (70)
- センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレオチド配列1を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列2を含み、前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2の長さがいずれも19ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列2が、第1のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第1のヌクレオチド配列断片が、標的mRNAにおけるヌクレオチド配列断片であり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列1の第7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列1の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの1つであり、前記ヌクレオチド配列2の5’末端の1番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列2の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの1つである、二本鎖オリゴヌクレオチド。 - ヌクレオチド配列2は、第1のヌクレオチド配列断片と基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項1に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2の少なくとも第2〜19位のヌクレオチドは、第1のヌクレオチド配列断片と相補的である、請求項2に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2の第1位のヌクレオチドは、A又はUである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖は、ヌクレオチド配列3をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列4をさらに含み、ヌクレオチド配列3とヌクレオチド配列4の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの1つであり、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4の長さがそれぞれ1〜4ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列3は、前記ヌクレオチド配列1の5’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4は、前記ヌクレオチド配列2の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4は、第2のヌクレオチド配列断片と基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第2のヌクレオチド配列断片とは、標的mRNAにおいて第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列4と同じヌクレオチド配列を指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間に1つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列5をさらに含み、前記ヌクレオチド配列5の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの1つであり、前記ヌクレオチド配列5は、長さが1〜3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の3’オーバーハング末端を構成する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列5の長さが2ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列5は、連続した2個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した2個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は第3のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、前記第3の配列断片とは、標的mRNAにおいて第1のヌクレオチド配列断片又は第2のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列5に等しいヌクレオチド配列を指す、請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される1つである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、2’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシヌクレオチドから選択される1種であり、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、LNA、ENA、cET、UNA及びGNAから選択される1つである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の2’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチドを指す、請求項1〜10のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも1本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも1個は、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも1つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項12に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式(121)に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項12又は13に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド:
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、チオリン酸エステルは、
前記センス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも1つに結合されて存在する、請求項13又は14に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。 - 前記アンチセンス鎖の5’末端のヌクレオチドは、5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式(122)〜式(126)の1つに示されるヌクレオチドである、請求項16に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド:
- saRNAである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- siRNAである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記標的mRNAは、遺伝子のApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP−1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCVが対応するmRNAから選択される1つである、請求項19に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記標的mRNAは、B型肝炎ウイルスのmRNA、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子により発現されたmRNA、又はアポリポタンパクC3遺伝子により発現されたmRNAから選択される、請求項19に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列1は、配列番号1に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号2に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号3に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号4に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号5に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号6に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号7に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号8に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号9に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号10に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号11に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号12に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列1は、配列番号13に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列2は、配列番号14に示される配列である、請求項21に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド:
5’−CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm−3’(配列番号1)
5’−UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGm−3’(配列番号2)
5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号3)
5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAm−3’(配列番号4)
5’−UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm−3’(配列番号5)
5’−UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAm−3’(配列番号6)
5’−CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm−3’(配列番号7)
5’−UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGm−3’(配列番号8)
5’−GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm−3’(配列番号9)
5’−UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCm−3’(配列番号10)
5’−CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm−3’(配列番号11)
5’−UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGm−3’(配列番号12)
5’−CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm−3’(配列番号13)
5’−UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGm−3’(配列番号14)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。 - 請求項1〜22のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が1:(1〜500)である、請求項23に記載の薬物組成物。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が1:(1〜50)である、請求項23又は24に記載の薬物組成物。
- 前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びPEG化脂質を含み、前記有機アミンが、式(201)に示される化合物及び/又はその薬学的に許容できる塩である、請求項23〜25のいずれか1項に記載の薬物組成物:
X101及びX102はそれぞれ独立してO、S、N−A又はC−Aであり、Aは水素又はC1−C20炭化水素鎖であり、
Y及びZはそれぞれ独立してC=O、C=S、S=O、CH−OH又はSO2であり、
R101、R102、R103、R104、R105、R106及びR107はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
xは1〜10の整数であり、
nは1〜3の整数であり、mは0〜20の整数であり、pは0又は1であり、m及びpがいずれも0である場合、R102は水素であり、
n又はmの少なくとも1つが2である場合、R103と式(201)における窒素とが、式(202)又は式(203)に示される構造を形成し、
- 前記有機アミンが、式(214)に示される有機アミン及び/又は式(215)に示される有機アミンであり、
前記PEG化脂質が1,2−ジパルミトアミド−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]−2000である、請求項26に記載の薬物組成物。 - 前記有機アミン、前記補助脂質及び前記PEG化脂質のモル比が(19.7〜80):(19.7〜80):(0.3〜50)である、請求項26又は27に記載の薬物組成物。
- 前記有機アミン、前記補助脂質及び前記PEG化脂質のモル比が(50〜70):(20〜40):(3〜20)である、請求項26〜28のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体。
- 前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合又は非共有結合的に結合される、請求項30に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合される、請求項31に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 前記リンカーが式(301)に示される構造を有し、
LAは、式(302)に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記LAは、その両端でそれぞれ1つの前記標的基及び前記LC部にエーテル結合により結合され、
- 前記リンカーが前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5’又は3’末端に結合される、請求項31〜33のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 式(305)に示される構造を有し、
前記リンカーが前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5’又は3’末端に結合される、請求項30〜34のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。 - 前記リンカーが式(306)に示される構造を有し、
*は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
#は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される部位を表す、請求項31又は32に記載のオリゴヌクレオチド複合体。 - 前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3’末端に結合される、請求項36に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 式(307)に示される構造を有し、
前記リンカーは、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3’末端に結合される、請求項31〜32及び36〜37のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。 - 式(308)に示される構造を有し、
m1、m2及びm3は独立して、2〜10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して、Hであるか、又はC1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3が式A59に示される構造の基であり、
R2は、長さ1〜20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、R2は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロアルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロアルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、M1は標的基を表す、請求項31に記載のオリゴヌクレオチド複合体。 - 各L1が、式A1〜A26の基から独立して選択される1又は複数の結合の組合せである、請求項39に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
R’はC1−C10のアルキル基であり、
Raは、式A27〜A45の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
- L1が、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13から選択される1又は複数の結合の組合せである、請求項40に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- L1が、A1、A4、A8、A10及びA11から選択される少なくとも2つの結合の組合せである、請求項41に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- L1が、A1、A8、A10から選択される少なくとも2つの結合の組合せである、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- L1の長さが3〜25個の原子である、請求項39〜43のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- L1の長さが4〜15個の原子である、請求項44に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- j1は2〜10の整数であり、j2は2〜10の整数であり、R’はC1−C4のアルキル基であり、Raは、A27、A28、A29、A30及びA31の1つであり、RbがC1−C5のアルキル基である、請求項40〜45のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- j1は3〜5の整数であり、j2は3〜5の整数であり、R’はメチル基、エチル基及びイソプロピル基の1つであり、RaはA27又はA28であり、Rbは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の1つである、請求項46に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- n1及びn2がそれぞれ独立して1又は2である、請求項39〜47のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- n1+n3=2〜3である、請求項39〜48のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 各m1、各m2及び各m3がそれぞれ独立して2〜5の整数から選択される、請求項39〜51のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- m1=m2=m3である、請求項45〜55のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 各前記標的基は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される、請求項31〜34、36〜37及び39〜51のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基は、哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドから選択される、請求項52に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項53に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基が、D−マンノピラノース、L−マンノピラノース、D−アラビノース、D−キシロフラノース、L−キシロフラノース、D−グルコース、L−グルコース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、α−D−マンノフラノース、β−D−マンノフラノース、α−D−マンノピラノース、β−D−マンノピラノース、α−D−グルコピラノース、β−D−グルコピラノース、α−D−グルコフラノース、β−D−グルコフラノース、α−D−フルクトフラノース、α−D−フルクトピラノース、α−D−ガラクトピラノース、β−D−ガラクトピラノース、α−D−ガラクトフラノース、β−D−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、N−トリフルオロアセチルガラクトサミン、N−プロピオニルガラクトサミン、N−n−ブチリルガラクトサミン、N−イソブチリルガラクトサミン、2−アミノ−3−O−[(R)−1−カルボキシエチル]−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース、2−デオキシ−2−メチルアミノ−L−グルコピラノース、4,6−ジデオキシ−4−ホルムアミド−2,3−ジ−O−メチル−D−マンノピラノース、2−デオキシ−2−スルホアミノ−D−グルコピラノース、N−グリコリル−α−ノイラミン酸、5−チオ−β−D−グルコピラノース、メチル2,3,4−トリス−O−アセチル−1−チオ−6−O−トリチル−α−D−グルコピラノシド、4−チオ−β−D−ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−1,5−ジチオ−α−D−グルコヘプトピラノシド、2,5−アンヒドロ−D−アロニトリル、リボース、D−リボース、D−4−チオリボース、L−リボース、L−4−チオリボースから独立して選択される1つである、請求項58に記載のsiRNA複合体。
- 前記標的基の少なくとも1つ又は各々がガラクトース又はN−アセチルガラクトサミンGalNAcである、請求項55に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- 各R10、R11、R12、R13、R14及びR15が独立してH、メチル基又はエチル基である、請求項39〜56のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- R2が前記窒素含有骨格上のNとアミド結合を形成する、請求項39〜57のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
- R2がB5、B6、B5’又はB6’から選択され、
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、q2は1〜10の整数である、請求項58に記載のオリゴヌクレオチド複合体。 - 式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)又は(422)に示される構造を有する、請求項39〜59のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体:
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項23〜29のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項30〜60のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の、遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の調製への使用。
- 前記遺伝子は、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子或いはアポリポタンパクC3遺伝子から選択される、請求項61に記載の使用。
- 前記疾患は、慢性疾患、炎症、線維性疾患、過形成性疾患又は脂質異常から選択される、請求項61又は62に記載の使用。
- 前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項63に記載の使用。
- 遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療方法であって、それを必要とする被験体に請求項1〜22のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項23〜29のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項30〜60のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の有効量を投与することを含む、方法。
- 前記遺伝子は、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子或いはアポリポタンパクC3遺伝子から選択される、請求項65に記載の方法。
- 前記疾患は、慢性疾患、炎症、線維性疾患、過形成性疾患又は脂質異常から選択される、請求項65又は66に記載の方法。
- 前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項67に記載の方法。
- 遺伝子発現の抑制方法であって、請求項1〜22のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項23〜29のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項30〜60のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の有効量を、前記当該遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項23〜29のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項30〜60のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド複合体を含む、キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023114124A JP2023134615A (ja) | 2017-12-01 | 2023-07-12 | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 |
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711249356 | 2017-12-01 | ||
CN201711249333 | 2017-12-01 | ||
CN201711249333.8 | 2017-12-01 | ||
CN201711249356.9 | 2017-12-01 | ||
CN201711249345 | 2017-12-01 | ||
CN201711249345.0 | 2017-12-01 | ||
CN201711479058.9 | 2017-12-29 | ||
CN201711479058 | 2017-12-29 | ||
CN201810951752.4 | 2018-08-21 | ||
CN201810951752 | 2018-08-21 | ||
CN201811165363.5 | 2018-09-30 | ||
CN201811165363 | 2018-09-30 | ||
PCT/CN2018/118212 WO2019105418A1 (zh) | 2017-12-01 | 2018-11-29 | 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023114124A Division JP2023134615A (ja) | 2017-12-01 | 2023-07-12 | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021504415A true JP2021504415A (ja) | 2021-02-15 |
Family
ID=66663811
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020529483A Pending JP2021504415A (ja) | 2017-12-01 | 2018-11-29 | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 |
JP2023114124A Pending JP2023134615A (ja) | 2017-12-01 | 2023-07-12 | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023114124A Pending JP2023134615A (ja) | 2017-12-01 | 2023-07-12 | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11492620B2 (ja) |
EP (1) | EP3719128A4 (ja) |
JP (2) | JP2021504415A (ja) |
KR (1) | KR20200091414A (ja) |
CN (1) | CN110997919B (ja) |
AU (1) | AU2018374219C1 (ja) |
CA (1) | CA3083968A1 (ja) |
TW (1) | TWI791696B (ja) |
WO (1) | WO2019105418A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021533800A (ja) * | 2018-08-21 | 2021-12-09 | スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用 |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3719128A4 (en) | 2017-12-01 | 2021-10-27 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND USE THEREOF |
US11660347B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-05-30 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof |
CN110959011B (zh) | 2017-12-29 | 2023-03-28 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 缀合物及其制备方法和用途 |
CN111655297A (zh) | 2018-09-30 | 2020-09-11 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途 |
US20220062427A1 (en) * | 2018-12-28 | 2022-03-03 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method therefor and use thereof |
CN113795582A (zh) * | 2019-05-24 | 2021-12-14 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 |
IL296045A (en) * | 2020-03-06 | 2022-10-01 | Aligos Therapeutics Inc | Modified sina molecules and their uses |
CN114632089A (zh) * | 2020-12-16 | 2022-06-17 | 北京瑞博开拓医药科技有限公司 | 含酰基糖胺基团化合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用及疾病的治疗方法 |
CN114686482A (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-01 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 |
KR20240028502A (ko) * | 2021-07-02 | 2024-03-05 | 투오지에 바이오텍 (상하이) 컴퍼니 리미티드 | 핵산 리간드 및 이의 접합체, 및 이를 위한 제조 방법 및 이의 용도 |
CN117580952A (zh) * | 2021-07-16 | 2024-02-20 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
KR20240034787A (ko) | 2021-07-16 | 2024-03-14 | 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 | 핵산, 이를 함유하는 조성물 및 접합체, 제조 방법 및 용도 |
WO2023116764A1 (zh) * | 2021-12-23 | 2023-06-29 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及其用途 |
WO2023198201A1 (zh) * | 2022-04-14 | 2023-10-19 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 适配体、缀合物与组合物及制备方法和用途 |
WO2023198202A1 (zh) * | 2022-04-14 | 2023-10-19 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 缀合物与组合物及制备方法和用途 |
WO2024002093A1 (zh) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 大睿生物医药科技(上海)有限公司 | 抑制载脂蛋白C3表达的siRNA |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120184595A1 (en) * | 2009-01-26 | 2012-07-19 | Protive Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
WO2016077321A1 (en) * | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis b virus (hbv) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016081444A1 (en) * | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016168286A1 (en) * | 2015-04-13 | 2016-10-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016206626A1 (zh) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用 |
WO2017023660A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES |
WO2017035340A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating a proprotein convertase subtilisin kexin (pcsk9) gene-associated disorder |
WO2017184689A1 (en) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | High density lipoprotein binding protein (hdlbp/vigilin) irna compositions and methods of use thereof |
Family Cites Families (124)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030206887A1 (en) | 1992-05-14 | 2003-11-06 | David Morrissey | RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA) |
ATE383331T1 (de) | 1998-11-12 | 2008-01-15 | Invitrogen Corp | Transportreagentien |
WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
EP2305813A3 (en) | 2002-11-14 | 2012-03-28 | Dharmacon, Inc. | Fuctional and hyperfunctional sirna |
CN1257284C (zh) | 2003-03-05 | 2006-05-24 | 北京博奥生物芯片有限责任公司 | 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法 |
EP2669377A3 (en) | 2003-04-17 | 2015-10-14 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Modified iRNA agents |
KR20070085113A (ko) | 2004-05-11 | 2007-08-27 | 가부시키가이샤 알파젠 | Rna간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한유전자발현억제 방법 |
US8394947B2 (en) * | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
WO2006020768A2 (en) | 2004-08-10 | 2006-02-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chemically modified oligonucleotides |
CN101142316A (zh) | 2005-03-09 | 2008-03-12 | 牧岩生命工学研究所 | 小干扰rna和包含它的用于治疗乙型肝炎的药物组合物 |
EP3249052B1 (en) | 2006-05-11 | 2019-04-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene |
CN102124107A (zh) | 2006-07-17 | 2011-07-13 | 瑟纳治疗公司 | 使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)基因表达的抑制 |
WO2008109369A2 (en) | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof |
AU2014208251B2 (en) | 2007-12-04 | 2016-07-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
EP2229186A2 (en) | 2007-12-04 | 2010-09-22 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
CA2713379A1 (en) * | 2008-01-31 | 2009-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene |
WO2009102427A2 (en) * | 2008-02-11 | 2009-08-20 | Rxi Pharmaceuticals Corp. | Modified rnai polynucleotides and uses thereof |
CN101603042B (zh) | 2008-06-13 | 2013-05-01 | 厦门大学 | 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点 |
WO2010012244A1 (zh) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用 |
DK2379084T3 (en) | 2008-10-15 | 2018-01-22 | Ionis Pharmaceuticals Inc | MODULATION OF FACTOR 11 EXPRESSION |
BRPI0923005A2 (pt) | 2008-12-17 | 2015-08-04 | Commw Scient Ind Res Org | Metodos para modulacao dos exo de aves |
CA2753975C (en) | 2009-03-02 | 2017-09-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid chemical modifications |
US20120083522A1 (en) | 2009-04-15 | 2012-04-05 | Isis Pharmaceuitcals, Inc. | Modulation of inflammatory responses by factor xi |
KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2013-01-22 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
WO2010147992A1 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna |
CA2764832A1 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene |
US20140099666A1 (en) | 2009-07-06 | 2014-04-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing production of a biological product |
WO2011038031A1 (en) | 2009-09-22 | 2011-03-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Dual targeting sirna agents |
JP5822845B2 (ja) | 2010-01-08 | 2015-11-25 | アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | アンジオポエチン様3発現の調節 |
CN102140459B (zh) * | 2010-01-29 | 2013-04-03 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
CN102140461B (zh) | 2010-01-29 | 2012-12-05 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
CN102140458B (zh) | 2010-01-29 | 2013-05-22 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
CN102140460B (zh) * | 2010-01-29 | 2012-12-12 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
CN102869774B (zh) | 2010-02-24 | 2018-02-09 | 箭头研究公司 | 用于靶向递送siRNA的组合物 |
WO2011126974A1 (en) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides |
US8993738B2 (en) | 2010-04-28 | 2015-03-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modified nucleosides, analogs thereof and oligomeric compounds prepared therefrom |
WO2011154331A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polymers for delivery of nucleic acids |
CN102344477B (zh) | 2010-07-27 | 2015-04-08 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法 |
CA2807307C (en) | 2010-08-17 | 2021-02-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
US9290760B2 (en) | 2010-09-15 | 2016-03-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified iRNA agents |
WO2012058693A2 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibition of pcsk9 genes |
EP2640700B1 (en) | 2010-11-15 | 2018-10-31 | Life Technologies Corporation | Amine-containing transfection reagents and methods for making and using same |
US8501930B2 (en) | 2010-12-17 | 2013-08-06 | Arrowhead Madison Inc. | Peptide-based in vivo siRNA delivery system |
KR20130108655A (ko) | 2010-12-29 | 2013-10-04 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 핵산의 세포내 전달을 위한 소분자 접합체 |
CA2823776A1 (en) | 2011-01-06 | 2012-07-12 | Dyax Corp. | Plasma kallikrein binding proteins |
SG193923A1 (en) | 2011-03-29 | 2013-11-29 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for inhibiting expression of tmprss6 gene |
CN102719434A (zh) | 2011-03-31 | 2012-10-10 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制rna干扰脱靶效应的特异性修饰 |
CN102727907B (zh) | 2011-04-13 | 2015-03-11 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种小干扰rna药物的给药系统和制剂 |
EP2701713B1 (en) | 2011-04-27 | 2018-02-07 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of apolipoprotein ciii (apociii) expression |
SG10201800715PA (en) | 2011-06-21 | 2018-02-27 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof |
AU2012275355B2 (en) | 2011-06-30 | 2017-05-11 | Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting gene expression of Hepatitis B virus |
CN103073726B (zh) | 2011-10-26 | 2015-09-23 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 嵌段共聚物与液体组合物和核酸制剂及其制备方法和应用 |
KR102272498B1 (ko) | 2011-10-27 | 2021-07-06 | 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, n-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체 |
AU2012327227A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Administration of Factor XI antisense oligonucleotides |
AR090905A1 (es) | 2012-05-02 | 2014-12-17 | Merck Sharp & Dohme | Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica |
CN104717982B (zh) | 2012-08-06 | 2018-08-28 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 碳水化合物共轭物及其制备改进工艺 |
MX363068B (es) | 2012-11-15 | 2019-03-07 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | Conjugados de oligonucleotido. |
FR2998748B1 (fr) | 2012-11-23 | 2015-04-10 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif et procede de retransmission de donnees dans un commutateur reseau |
KR102096014B1 (ko) | 2012-12-05 | 2020-04-03 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | PCSK9 iRNA 조성물 및 그 사용 방법 |
AU2014211406B2 (en) | 2013-01-30 | 2019-07-18 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | LNA oligonucleotide carbohydrate conjugates |
SI2970974T1 (sl) | 2013-03-14 | 2017-12-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Komplementarna komponenta C5 sestavkov IRNA in postopki njene uporabe |
BR112015027322A8 (pt) | 2013-05-01 | 2018-01-02 | Isis Pharmaceuticals Inc | Compostos antissenso conjugados e sua utilização |
EP2994167B1 (en) | 2013-05-06 | 2020-05-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules |
CN104107437B (zh) | 2013-06-09 | 2015-08-26 | 厦门成坤生物技术有限公司 | 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法 |
JP2016528890A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | CRISPR/Cas系を用いるゲノム編集の治療用の使用 |
EP4039278A1 (en) | 2013-07-11 | 2022-08-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation |
WO2015015496A1 (en) | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Qbi Enterprises Ltd. | Sphingolipid-polyalkylamine-oligonucleotide compounds |
KR102365486B1 (ko) | 2013-08-28 | 2022-02-18 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 프리칼리크레인 (pkk) 발현의 조절 |
CN106232831B (zh) | 2013-11-06 | 2021-02-26 | 美国卫生和人力服务部 | 通过表达谱分析对淋巴瘤类型进行亚型分类的方法 |
CN105814204B (zh) | 2013-12-24 | 2020-04-28 | Ionis制药公司 | 促血管生成素样3表达的调节 |
JP6845012B2 (ja) | 2014-01-21 | 2021-03-17 | ダイアックス コーポレーション | 遺伝性血管浮腫の治療における血漿カリクレイン結合タンパク質およびその使用 |
JP2017505623A (ja) | 2014-01-30 | 2017-02-23 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 生物切断性コンジュゲートを有するポリオリゴマー化合物 |
AU2015236215B2 (en) | 2014-03-25 | 2020-03-19 | Arcturus Therapeutics, Inc. | UNA oligomers having reduced off-target effects in gene silencing |
CA2943705A1 (en) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating pkk expression |
CN111961669A (zh) | 2014-05-01 | 2020-11-20 | Ionis制药公司 | 用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法 |
AU2015269053A1 (en) | 2014-06-06 | 2016-12-22 | Solstice Biologics, Ltd. | Polynucleotide constructs having bioreversible and non-bioreversible groups |
EP3736334A1 (en) | 2014-07-16 | 2020-11-11 | Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. | Rnai compositions to treat apoc3-related diseases |
SG10201903290YA (en) | 2014-08-20 | 2019-05-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Modified double-stranded rna agents |
CN104232644B (zh) | 2014-09-03 | 2016-10-12 | 浙江大学 | 一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用 |
CA2969372C (en) | 2014-12-15 | 2023-05-16 | Emory University | Phosphoramidates for the treatment of hepatitis b virus |
US10036017B2 (en) | 2015-02-17 | 2018-07-31 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the specific inhibition of complement component 5(C5) by double-stranded RNA |
MX2017011422A (es) | 2015-03-17 | 2017-11-10 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc | Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen del factor xii. |
WO2016154127A2 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia |
WO2016179342A2 (en) | 2015-05-06 | 2016-11-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Factor xii (hageman factor) (f12), kallikrein b, plasma (fletcher factor) 1 (klkb1), and kininogen 1 (kng1) irna compositions and methods of use thereof |
CN104922141B (zh) | 2015-05-28 | 2016-05-25 | 厦门成坤生物技术有限公司 | 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物 |
US20170016000A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-19 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and agents against hepatitis b virus and uses thereof |
US20180216114A1 (en) | 2015-07-27 | 2018-08-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Xanthine dehydrogenase (xdh) irna compositions and methods of use thereof |
EP3329003A2 (en) | 2015-07-29 | 2018-06-06 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression |
US10130651B2 (en) | 2015-08-07 | 2018-11-20 | Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. | RNAi Therapy for Hepatitis B Virus Infection |
WO2017055627A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Apoc3 mutations for the diagnosis and therapy of hereditary renal amyloidosis disease |
JP2018536689A (ja) * | 2015-12-10 | 2018-12-13 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. | ステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)シャペロン(SCAP)iRNA組成物およびその使用方法 |
US10883107B2 (en) | 2016-01-08 | 2021-01-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotide agents targeting factor XII (hageman factor) (F12) and methods of use thereof |
KR20190003679A (ko) | 2016-04-28 | 2019-01-09 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 가족성 고콜레스테롤혈증을 지닌 환자를 치료하는 방법 |
JOP20170161A1 (ar) | 2016-08-04 | 2019-01-30 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc | عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب |
WO2018035380A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Solstice Biologics, Ltd. | Polynucleotide constructs |
JP6989521B2 (ja) | 2016-09-02 | 2022-01-05 | アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 標的化リガンド |
CN110088283A (zh) | 2016-10-18 | 2019-08-02 | 医药公司 | 通过降低前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)蛋白质预防心血管事件的方法 |
CN108220293B (zh) | 2016-12-21 | 2021-09-24 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 |
CN108239644B (zh) | 2016-12-23 | 2021-05-28 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 |
CN108265052B (zh) | 2016-12-30 | 2021-05-28 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 |
WO2018140920A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for inhibition of factor xii gene expression |
EP3607069B1 (en) | 2017-04-05 | 2022-11-02 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
CA3059426A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Arbutus Biopharma Corporation | Targeted compositions |
CN108929870B (zh) | 2017-05-19 | 2020-01-24 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制HBV的siRNA分子及其应用 |
TW201908483A (zh) | 2017-06-02 | 2019-03-01 | 新加坡商波濤生命科學有限公司 | 寡核苷酸組合物及其使用方法 |
EP3718572A4 (en) | 2017-12-01 | 2021-09-08 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, METHOD OF PREPARATION AND USE |
US11660347B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-05-30 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof |
EP3719128A4 (en) | 2017-12-01 | 2021-10-27 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND USE THEREOF |
JP7261494B2 (ja) | 2017-12-01 | 2023-04-20 | スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド | 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 |
AU2018377716A1 (en) | 2017-12-01 | 2020-04-09 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, and preparation method and use |
WO2019105403A1 (zh) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
CN111050807A (zh) | 2017-12-01 | 2020-04-21 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
CN110959011B (zh) | 2017-12-29 | 2023-03-28 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 缀合物及其制备方法和用途 |
JP2021533800A (ja) | 2018-08-21 | 2021-12-09 | スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用 |
CN111655297A (zh) | 2018-09-30 | 2020-09-11 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途 |
CA3118305A1 (en) | 2018-11-02 | 2020-05-07 | Arbutus Biopharma Corporation | Bivalent targeted conjugates |
WO2020135581A1 (zh) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
US20220062427A1 (en) | 2018-12-28 | 2022-03-03 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method therefor and use thereof |
WO2020147847A1 (zh) | 2019-01-18 | 2020-07-23 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
CN111979237A (zh) | 2019-05-22 | 2020-11-24 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 |
CN111973618B (zh) | 2019-05-23 | 2024-02-02 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 |
CN111973617A (zh) | 2019-05-23 | 2020-11-24 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 |
CN111973619B (zh) | 2019-05-23 | 2024-01-30 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 |
CN113795280B (zh) | 2019-05-24 | 2024-04-05 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 |
-
2018
- 2018-11-29 EP EP18884492.2A patent/EP3719128A4/en active Pending
- 2018-11-29 CA CA3083968A patent/CA3083968A1/en active Pending
- 2018-11-29 US US16/758,720 patent/US11492620B2/en active Active
- 2018-11-29 CN CN201880049586.7A patent/CN110997919B/zh active Active
- 2018-11-29 WO PCT/CN2018/118212 patent/WO2019105418A1/zh unknown
- 2018-11-29 JP JP2020529483A patent/JP2021504415A/ja active Pending
- 2018-11-29 AU AU2018374219A patent/AU2018374219C1/en active Active
- 2018-11-29 KR KR1020207015744A patent/KR20200091414A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-11-30 TW TW107142924A patent/TWI791696B/zh active
-
2022
- 2022-10-03 US US17/937,639 patent/US20230132756A1/en active Pending
-
2023
- 2023-07-12 JP JP2023114124A patent/JP2023134615A/ja active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120184595A1 (en) * | 2009-01-26 | 2012-07-19 | Protive Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
WO2016077321A1 (en) * | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis b virus (hbv) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016081444A1 (en) * | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016168286A1 (en) * | 2015-04-13 | 2016-10-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof |
WO2016206626A1 (zh) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用 |
WO2017023660A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES |
WO2017035340A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating a proprotein convertase subtilisin kexin (pcsk9) gene-associated disorder |
WO2017184689A1 (en) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | High density lipoprotein binding protein (hdlbp/vigilin) irna compositions and methods of use thereof |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021533800A (ja) * | 2018-08-21 | 2021-12-09 | スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3083968A1 (en) | 2019-06-06 |
WO2019105418A1 (zh) | 2019-06-06 |
JP2023134615A (ja) | 2023-09-27 |
AU2018374219A1 (en) | 2020-05-21 |
US20230132756A1 (en) | 2023-05-04 |
TWI791696B (zh) | 2023-02-11 |
CN110997919B (zh) | 2024-04-02 |
AU2018374219B2 (en) | 2022-12-15 |
TW201925469A (zh) | 2019-07-01 |
AU2018374219C1 (en) | 2023-05-11 |
US11492620B2 (en) | 2022-11-08 |
KR20200091414A (ko) | 2020-07-30 |
EP3719128A1 (en) | 2020-10-07 |
CN110997919A (zh) | 2020-04-10 |
EP3719128A4 (en) | 2021-10-27 |
US20220049249A1 (en) | 2022-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2021504415A (ja) | 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 | |
JP7365052B2 (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 | |
TWI810226B (zh) | 核酸、含有該核酸的藥物組合物、綴合物及其用途 | |
JP7360716B2 (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 | |
JP7273417B2 (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 | |
JP2021509402A (ja) | 複合体及びその調製方法と使用 | |
JP2022515503A (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 | |
WO2020135581A1 (zh) | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
WO2020233655A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
TW201925473A (zh) | 核酸、含有該核酸的藥物組合物、綴合物、試劑盒及其用途 | |
WO2020238766A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
WO2020238763A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
WO2020238758A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
JP2022533722A (ja) | 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 | |
WO2020233651A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200803 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211125 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20220902 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221026 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230314 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230712 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230731 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20230922 |