WO2010012244A1

WO2010012244A1 - 乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用

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Publication number: WO2010012244A1
Application number: PCT/CN2009/073049
Authority: WO
Inventors: 梁子才; 张鸿雁
Original assignee: 苏州瑞博生物技术有限公司
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-08-03
Publication date: 2010-02-04
Also published as: CN102083983B; CN102083983A

Description

乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和

小干扰核酸及组合物和应用技术领域

本发明是关于乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用，更确切地说，本发明涉及乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列，用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小核酸，以及含有该小干扰核酸的药物组合物和该小干扰核酸在制备用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。背景技术

乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV)引起的传染病。据世界卫生组织（WHO) 统计，全球乙肝病毒携带者超过了 20亿人，其中 3.6亿乙肝慢性患者的病情正在恶化，每年约有 100万人死于 HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。中国是世界范围内感染 HBV人数最多的国家，乙型肝炎病毒 (HBV) 感染率高达 57.63%。全国现有慢性乙肝病人 2000万，每年乙肝新发病人数约 50万，每年有 23.7万人死于乙型肝炎相关的疾病，其中有 15.6万人死于肝癌。据中国肝炎防治基金会 2006年报道，我国每年用于治疗慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费约 300亿元人民币， HBV造成的直接经济损失约为 3600亿元 /年。每人年均医疗花费高达 28864.89元人民币，是我国 2005年人均 GDP的 2.12倍。由此可见，乙型肝炎不仅严重危害我国人民的健康，而且还为国家带来严重的社会经济负担。

治疗乙肝的方法主要包括抗病毒复制、提高机体免疫功能、保护肝细胞、促进肝细胞再生以及中医药治疗、基础治疗及心理治疗等综合治疗。全球公认的防治乙型肝炎的药物主要可分为干扰素、核苷类似物 2大类。干扰素作为乙肝治疗药物已使用了较长时间，其治疗终末应答率只有 30%，即使和其他抗病毒药物联合使用或增加剂量后，其治疗终末应答率也只有 50%，且停药、减量或减少注射次数后易复发，不良反应明显增加。另外，长期使用会诱发干扰素抗体，失去药效。核苷类似物起效快，但终末应答率也不高，且核苷类似物只抑制肝细胞质内的病毒，对肝细胞核内的 CCC-DNA没有作用，需要长期维持用药。长期用药面临的最主要问题是病毒变异而引发的耐药性，以及停药后也易出现病毒反弹、复发率高。更为严重的是少数病人停药后出现肝功能急剧恶化，甚至死亡。从基因水平抑制 HBV的生成和复制来降低病毒代谢和对肝细胞的侵染无疑将是乙肝最为理想的治疗手段。

因此，开发出一种新型的能够预防和 /或治疗乙型肝炎的产品成为迫切需要解决的问题。发明内容本发明的第一个目的是提供乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸。本发明的第三个目的是提供一种含有所述小干扰核酸的药物组合物。

本发明的第四个目的是提供所述小干扰核酸在制备用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。

小核酸干扰也可称 RNA干扰 (RN A interference, RNAi), 是由双链 RNA

(double-stranded RNA, dsRNA)分子在 mRNA水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的过程。 RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低（knock-down) 或基因沉默（gene silencing), 是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS)。最早有关 RNA干扰的报道出现在 1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的 RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA干扰现象。 1999年， Hamilton和 Baulcombe在发生 RNA干扰的植物中检测到了长度为 21-25个核苷酸的 RNA片段，这些 RNA片段被证明是 RNA干扰所必需的，称为小干扰核酸（siRNA, Small interfering RNA )。小干扰核酸

( siRNA) 与细胞源性的相关酶和蛋白质形成 RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC )。在 RNA干扰过程中，小干扰核酸（siRNA) 中的正义链被排除出复合体，反义链指导 RISC结合到靶 mRNA的相应位点，然后由复合物中的核糖核酸酶 III降解靶 mRNA，从而关闭靶基因的表达。

近年来， RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。小干扰核酸（siRNA) 抑制基因表达的效率比现在临床使用的方法（抗体或反义寡合苷酸）高 1000倍以上，且具有安全、特异、高效的特性。因而利用小干扰核酸（siRNA) 药物治疗乙肝，具有常规药物无法比拟的优势。

乙型肝炎病毒（HBV) 属嗜肝 DNA

基因组长约 3.2kb，为部分双链环状 DNA; 乙型肝炎病毒基因组含有 4个开放读码框 (ORF， S基因区、 C基因区、 P基因区和 X基因区）。

S基因区包括 S基因、前 S1基因和前 S2基因，它们分别编码 S蛋白、 M蛋白和 L蛋白；其中， S蛋白和 M蛋白与乙型肝炎病毒的嗜肝性、基因免疫及转录激活密切相关。

C基因区包括前 C基因和 C基因，它们分别编码核壳蛋白 HBeAg和 HBcAg, 该核壳 HBeAg和 HBcAg是组成乙型肝炎病毒核心部分的重要组成部分，是病毒复制的主体。

P基因区包括 P基因，编码 P蛋白， P蛋白含 816个氨基酸，具有 4个功能结构域，包括具有反转录酶活性的 DNA聚合酶、 RNA酶 H等，参与 HBV复制的全过程。

X基因区包括 X基因，是 HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，位于 HBV基因组的 1374-1838 bp处，全长约 435-462 bp，编码长度为 154个氨基酸的蛋白，该蛋白能够直接或间接地对病毒自身的复制与增殖产生影响，并且能够对宿主细胞中被感染的细胞的调亡和癌变过程产生影响。

为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列，其中，该干扰靶位点序列包括 SEQ ID Nos : 2-11中之一所示的核苷酸序列，并且所述干扰靶位点序列的长度为 15-27个核苷酸。

为了实现本发明的第二个目的，本发明还提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸为双链 RNA分子，包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链的长度为 15-27个核苷酸，所述正义链和反义链各自的 3'端均为两个连续的脱氧胸苷酸，所述正义链和反义链中除去 3'端的两个连续的脱氧胸苷酸以外的其他核苷酸互补形成双链，其中，所述小干扰核酸的反义链能够与本发明提供的小核酸干扰靶位点序列碱基互补，以抑制乙型肝炎病毒基因的表达。

为了实现本发明的第三个目的，本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。

为了实现本发明的第四个目的，本发明还提供了所述的小干扰核酸在制备用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。

本发明通过特异性地抑制乙型肝炎病毒基因组中的 S基因区、 C基因区、 P基因区和 X基因区中的一个或几个基因的表达，从而降低病毒载量，在基因水平对侵入机体的乙型肝炎病毒起作用，达到预防与治疗乙型肝炎病的目的。特别是，本发明提供的小干扰核酸对乙型肝炎病毒基因表达的抑制活性高，能够有效的预防和 /或治疗乙型肝炎。具体实施方式

本发明提供了乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列，其中，该干扰靶位点序列包括 SEQ ID Nos : 2-11中之一所示的核苷酸序列，优选包括 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 4、 SEQ ID No: 8、或 SEQ ID No: 10所示的核苷酸序列，并且所述干扰靶位点序列的长度为 15-27个核苷酸，优选为 19-21个核苷酸。

所述小核酸干扰靶位点是指在使用小干扰核酸来抑制基因表达的过程中，该基因的 mRNA序列中能够与所述小干扰核酸的反义链互补的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述干扰靶位点序列如 SEQ ID Nos : 12-21中之一所示，进一步优选为，所述干扰靶位点序列如 SEQ ID No: 12、 SEQ ID No: 14、 SEQ ID No: 18、或 SEQ ID No: 20所示。

本发明还提供了一种小干扰核酸（siRNA ), 其中，该小干扰核酸为双链 RNA分子，包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链的长度为 15-27个核苷酸，所述正义链和反义链各自的 3'端均为两个连续的脱氧胸苷酸，所述正义链和反义链中除去 3'端的两个连续的脱氧胸苷酸以外的其他核苷酸互补形成双链，其中，所述小干扰核酸的反义链能够与本发明提供的小核酸干扰靶位点序列碱基互补，以抑制乙型肝炎病毒基因的表达。本发明提供的小干扰核酸为包括正义链和反义链的双链分子，所述正义链和反义链的长度分别为 15-27个核苷酸；优选情况下，所述正义链和反义链的长度分别为 19-21 个核苷酸。

在本发明此方面的优选实施方式中，所述小干扰核酸具有 HBV-X1、 HBV-X2, HBV- X3、 HBV- X4、 HBV- PI、 HBV- P2、 HBV-PSK HBV- PS2、 HBV- CI或 HBV- C2所示的核苷酸序列，或者具有对 HBV-X1、 HBV-X2、 HBV-X3、 HBV-X4、 HBV-P1 HBV-P2、 HBV-PS1、 HBV-PS2、 HBV-Cl或 HBV-C2所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，

HBV-X1 正义链: 5，- CGACCGACCUUGAGGCAUAdTdT-3'

反义链： 5，- UAUGCCUCAAGGUCGGUCGdTdT-3'；

HBV-X2 正义链: 5，- CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3 '

反义链： 5，- UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3 '；

HBV-X3 正义链: 5，- GCGGGACGUCCUUUGUUUAdTdT-3 '

反义链： 5'- UAAACAAAGGACGUCCCGCdTdT-3'；

HBV-X4 正义链: 5'- CUAGGAGGCUGUAGGCAUAdTdT-3 '

反义链： 5'- UAUGCCUACAGCCUCCUAGdTdT-3'；

HBV-P1 正义链： 5'- GGAACAAGAUCUACAGCAUdTdT-3'

反义链： 5，- AUGCUGUAGAUCUUGUUCCdTdT-3'；

HBV-P2 正义链： 5，- G A AAGU AUGUC A ACG A AUUdTdT -3，

反义链： 5，- A AUUCGUUG AC AU ACUUUCdTdT -3 '；

HBV-PS1 正义链： 5' - GAUCCAGCCUUCAGAGCAAdTdT-3'

反义链： 5，- UUGCUCUGAAGGCUGGAUCdTdT-3'；

HBV-PS2 正义链： 5' - CGUCAAUCUUCUCGAGGAUdTdT-3'

反义链： 5，- AUCCUCGAGAAGAUUGACGdTdT-3'；

HBV-C1 正义链： 5，- GGGUGUUAAUUUGGAAGAUdTdT-3'

反义链： 5，- AUCUUCCAAAUUAACACCCdTdT-3'；

HBV-C2 正义链： 5，- GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3 '

反义链： 5，- UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3'。

优选情况下，所述小干扰核酸具有 HBV-X1、 HBV-X3, HBV-PS1或 HBV-Cl所示的核苷酸序列。

根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

( 1 ) 对所述 siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2) 对所述 siRNA的核苷酸序列中核糖的 2'-OH的修饰；

(3 ) 对所述 siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式 1所示；和硼垸化磷酸盐修饰，如式 2所示。两种修饰都能稳定小干扰核酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

(1) (2)

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中 2'-OH的修饰， gp，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如， 2'-氟代修饰，如式 3所示； 2'-氧甲基修饰，如式 4所示； 2'-氧亚乙基甲氧基修饰，如式 5所示； 2,4'-二硝基苯酚修饰，如式 6所示；锁核酸 (LNA)，如式 7所示; 2'-氨基修饰，如式 8所示； 2'-脱氧修饰，如式 9所示。

H，

(3) (4)

Ζ〇 DHP

(c) 2-Ο-ΜΟΕ

(5) (6)

(7) (8) (9) 所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如， 5'-溴尿嘧啶修饰，如式 10所示; 5'-碘尿嘧啶修饰，如式 11所示； N-甲基脲嘧啶修饰，如式 12所示； 2,6—二氨基嘌呤修饰，如式 13所示。

(12) (13)

优选情况下，所述修饰使修饰后的小干扰核酸在细胞内抵抗核酸酶水解的能力增强。此外，为了促进小干扰核酸进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团，亲脂性的基团包括以共价键与小干扰核酸结合，如末端引入胆固醇、脂蛋白、维生素 E等，以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的 mRNA发生作用。同时，小干扰核酸也可以进行非共价键修饰，如通过疏水键或离子键结合磷脂分子、多肽、阳离子聚合物等增加稳定性和生物学活性。

本发明提供的小干扰核酸的制备方法包括小干扰核酸序列的设计和小干扰核酸的制备。

所述小干扰核酸的设计是指选择序列相对保守的乙型肝炎病毒株（Genbank登记号为 U95551 ) 为模板。分别针对乙型肝炎病毒的 X、 P、 S、 C基因的保守区，选取 19bp 的核苷酸序列，设计相应的小干扰核酸。

所述 X、 P、 S、 C基因的保守区在 HBV基因组（Genbank登记号为 U95551)相对位置分别为 1376-1820bp、 2309bp-1625bp, 2848-837bp、 1816bp-2454bp。

所述针对 X、 P、 S、 C基因的小干扰核酸序列设计按以下原则进行：

在乙型肝炎病毒 U95551株基因组的 1376-1820bp、 2309bp-1625bp, 2848-837bp、 1816bp-2454bp的范围内选取 19bp长度的核苷酸序列。 19bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：（1 ) GC含量在 35-55 %之间，（2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，（3 ) 避免出现 4个以上的连续碱基序列，（4) 避免含有单核苷酸多态性位点，（5) 避免处于读码框起始密码和终止密码的 50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过 BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性（16个以上碱基）的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对乙型肝炎病毒基因具有特异的抑制作用。

最后将这样获得的 19bp核苷酸序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此 19bp核苷酸序列的互补序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。

根据本发明，所述小干扰核酸的制备方法为本领域技术人员所公知，例如，所述小干扰核酸可以通过化学合成得到，或者通过质粒和 /或病毒载体的表达而得到。

所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海 GenePharma公司进行合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：（1 )寡聚核糖核苷酸的合成； (2) 脱保护；（3) 纯化分离；（4) 脱盐。

例如，具有 HBV-X1所示的核苷酸序列的小干扰核酸的化学合成的具体步骤如下： ( 1 )寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动 DNA/RNA合成仪（例如， Applied Biosystems EXPEDITE8909) 上进行，根据 HBV-X1所示的核苷酸序列的顺序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于小干扰核酸是由一段 19个寡聚核糖核苷酸和 2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的 5'-0-对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上 5'位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂 S-乙基四唑的作用下，将 5，-0-对二甲氧基三苯甲基- 胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间、偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成;第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在 0.05M 碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团（例如，羟基和胺基）在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2) 脱保护

将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入 1毫升的乙醇 /胺 (体积比为 1 : 3), 然后密封，置于 55-7CTC温箱中，孵育 2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水洗脱，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入 1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液（1M)，室温放置 4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。

(3 ) 纯化分离

将小干扰核酸的粗产物溶解于 2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应 C18高压液相色谱的分离，运用梯度洗脱的方法，收集小干扰核酸主产物（洗脱液 A: 0.1M乙酸铵；洗脱液 B: 20%的 0.1M乙酸铵和 80 %的乙腈），除去主产物中的溶剂，并加入 5毫升 80 %的乙酸水溶液，在室温静置 15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离 (DEAE-5PW, 阴离子交换柱），即可得到纯度在 90 %以上的小干扰核酸（梯度洗脱，洗脱液 A: 0.025M 的 Tris-HCl' 0.025M的 NaCl, pH=8, 5 %的乙腈; 洗脱液 B: 0.025M的 Tris-HCl， 2.0M 的 NaCl， pH = 8， 5 %的乙腈）。

(4) 脱盐

纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸,其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在 1-2毫升的缓冲液中（ 10mM Tris, pH=7.5-8.0, 50mM NaCl),将此溶液加热至 95°C , 然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在 4°C冰箱中保存，以备随时使用。

除化学合成外，小干扰核酸还可通过质粒和 /或病毒载体的表达而得到，得到具有发夹结构的 shRNA, 其长度为 50-90个核苷酸。 shRNA的结构为：

两端为酶切位点（例如 BamH?和 EcoR?)，中间为一段 loop序列（例如 GAAGCTTG), 通过克隆技术将其插入到用相应内切酶酶切过的载体中，再整合到染色体中，即可稳定表达小干扰核酸。

例如： 5，-GATCCG-正义链 GAAGCTTG-反义链 TTTTTTGGAATT-3'

本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗乙型肝炎病的药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。

根据本发明，所述药物组合物可以为注射液。

本发明中，所述注射液含有药学上可接受的载体和本发明提供的小干扰核酸，所述小干扰核酸与药学上可接受的载体的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于 100重量份的小干扰核酸，所述药学上可接受的载体的含量为 100-10000000重量份。

本发明中，对所述药学上可接受的载体没有特别的限制，可以是 pH值为 4.0-9.0的磷酸缓冲液、 pH值为 7.5-8.5的三羟甲基胺基甲垸盐酸盐缓冲液、生理盐水或 pH为 5.5-8.5 的磷酸盐缓冲液，优选情况下，所述药学上可接受的载体为 pH值为 4.0-9.0的磷酸缓冲液。

根据本发明，所述注射液还可以含有保护剂和 /或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为 0.01-30重量％,所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为 200-700毫渗摩尔 /千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和 /或氯化钾。

当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症的严重程度来确定。

本发明还提供了所述的小干扰核酸在制备用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。实施例 1

小干扰核酸的合成

选择序列相对保守的乙型肝炎病毒基因组（Genbank登记号为 U95551 ) ( SEQ ID NO. 1 )为模板。分别针对乙型肝炎病毒 U95551基因的保守区，选取 19bp的核苷酸序列，设计小干扰核酸。

所述针对 X、 P、 s、 C基因小干扰核酸序列设计按以下原则进行：

在乙型肝炎病毒 U95551株基因组的 1376-1820bp、 2309bp-1625bp、 2848-837bp 1816bp-2454bp的范围内选取 19bp长度的核苷酸序列。 19bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：（1 ) GC含量在 35-55 %之间，（2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，（3 ) 避免出现 4个以上的连续碱基序列，（4) 避免含有单核苷酸多态性位点，（5) 避免处于读码框起始密码和终止密码的 50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过 BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性（16个以上碱基）的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对乙型肝炎病毒基因具有特异的抑制作用。

最后将这样获得的 19bp核苷酸序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此 19bp核苷酸序列的互补序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。本实施例中设计的小干扰核酸所攻击的靶位点序列包括 SEQ ID Nos: 2-11中之一所示的核苷酸序列，具体的小核酸干扰靶位点序列如 SEQ ID Nos: 12-21中之一所示（长度为 19个核苷酸）。

设计好的小干扰核酸经上海吉玛（GenePharma) 公司进行化学合成，得到小干扰核酸 HBV- XI至 HBV- X4、 HBV-P1至 HBV- P2、 HBV-PS1至 HBV- PS2以及 HBV- C1至 HBV-C2, 它们的核苷酸序列如表 1所示。表 1

所述攻击范围是指该小干扰核酸在 SEQ ID: NO.l中的相对应位置。实施例 2

对乙型肝炎病毒基因表达的抑制活性检测

( 1 ) HepG2.2.15细胞的培养

用含有 10 %胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 380ug/ml G418的 DMEM完全培养基，在 24孔细胞培养板上以 lxlO⁵个细胞 /孔的密度接种 HepG2.2.15细胞（源自北京大学人民医院），在温度为 37 °C及 C02含量为 5 %的培养箱中进行培养，每 72小时传代、更换新鲜培养基。在转染前 24小时，用 0.25%的胰酶消化细胞，计数，然后以 lxlO⁵个细胞 /ml的浓度接种到 24孔板，每孔 1000μ1。

(2) 小干扰核酸的转染

使用 Invitrogen公司的 Lipofectamine™2000脂质体对实施例 1得到的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV- X4、HBV- P1至 HBV- P2、HBV- PS1至 HBV- PS2以及 HBV- C1至 HBV- C2 分别进行转染，以不添加小干扰核酸作为空白对照。

具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无 RNA酶的无菌水中，配制成浓度为 2( mol/L的小干扰核酸溶液。吸出每孔细胞中的上清，加入 0.5ml的 OptiMEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062)。分别将 3μ1 小干扰核酸溶液（20μηιο1/ω 稀释于 50μ1 Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062)中，将 1 .Ομΐ Lipofectamine™ 2000脂质体稀释于 50μ1 Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985Ό62)中，然后将上述两种溶液在室温下孵育 5分钟后混合，混合溶液于室温静置 20分钟后，把 ΙΟΟμΙ 该混合溶液加到接种有细胞的所述 24孔板中。小干扰核酸的最终浓度是 100 ηΜ。细胞 37°C培养 4小时，再加入 lml含 10%胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 100U/ml青霉素、 10(^g/ml链霉素的 MEM完全培养基，然后在 37°C下再培养 48小时。

(3 ) 荧光定量 PCR法检测小干扰核酸对乙型肝炎病毒 mRNA表达的抑制作用通过 Real Time-PCR分别检测（2) 中转染了小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、小干扰核酸 HBV-P1至 HBV-P2、小干扰核酸 HB V-PS 1至 HB V-PS2以及小干扰核酸 HBV-C1 至 HBV-C2的 HEPG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒基因 mRNA的表达量，以未转染小干扰核酸的 HEPG2.2.15细胞作为对照。

具体歩骤为：用 lml Tri_Z0l(GIBCOL公司)裂解转染小干扰核酸的持续表达乙型肝炎病毒的 HepG2.2.15细胞，并提取总 RNA，提取总 RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在温度为 37°C及 C0₂含量为 5 %的培养箱中培养 48小时，然后离心收集细胞，并用预冷的 2ml PBS洗一遍；所述 PBS的组成为： NaCl 137mmol/L, KC1 2.7mmol/L, Na₂HP0₄ 4.3mmol/L, KH₂P0₄ 1.4mmol/L; 每孔加入 lml Trizol, 室温放置 5分钟，细胞发生裂解；将裂解物转移到 1.5ml EP管中；加入 200μ1氯仿，用手剧烈震荡 15秒，室温放置 3分钟； 14000rpm 4°C离心 15分钟；取液相上清约 500μ1放于一新的 ΕΡ管中，加入 500μ1异丙醇，室温放置 10分钟； 12000 rpm， 4°C 离心 10分钟，除去上清，用 1 ml浓度为 75%的乙醇将沉淀物洗一次； 7600 rpm， 4°C 离心 5分钟；除去上清，室温干燥 RNA沉淀 10分钟；加入 20μ1 ddH₂0溶解 RNA。

将 2单位的 DNase I (RNase-free) ( TakaRa公司）加入至上述溶解有 RNA的 DEPC水中，并在 37 °C条件下静置 30分钟，以除去总 RNA中残留的 DNA。经过 DNase I处理后，采用 Invitrogen公司的 PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit对总 RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：在总 RNA中加入 20μ1的浓度为 70%的乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，加入 700μ1清洗缓冲液 I (TakaRa 公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，加入 500μ1清洗缓冲液 II ( TakaRa公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，再加入 500μ1清洗缓冲液 II (TakaRa公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃过滤液，室温 12000rpm离心 1分钟，将纯化柱转移至 RNA收集管上，加入 3CV1 DEPC水，室温放置 1分钟，室温 13000rpm离心 2分钟，将 RNA样品置于 -80°C 保存。

对提纯后得到的总 RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为 Promega公司的 M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将 lug提纯后的总 RNA 与 lul ( 0.5ug) 的 Oligo dT在试管中进行混合，用 DEPC水将总体积补足至 16.25μ1, 将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为 70°C，加热时间为 5分钟；然后将试管迅速冷却至 0°C，并加入缓冲液 ( 5xMLV buffer 5μ1， 10mM Dntp 1.25μ1， RNasin 0.5μ1， M-MLV 1μ1)，在 42°C条件下孵育 1小时，得到 cDNA。

将得到的 cDNA作为 PCR反应的模板，进行 Real-time PCR反应。 Real-time PCR 反应体系为： <1(1Η₂0 17.5μ1， 10mM Dntp 0.5μ1, lOxTaq buffer 2.5μ1, Τ 0.5μ1 , F primer 0.5μ1， R primer 0.5μ1 , Syber Green I Ιμΐ , οϋΝΑ 2μ1; PCR反应的条件为： 94°C2分钟， 94°C 15秒， 60°C 30秒，共 40个循环。同时设立 GAPDH作为内参基因，根据下式计算小干扰核酸抑制活性，结果如表 2所示。

Realtime PCR引物共三对，根据所加小干扰核酸样品分别选取针对 C基因、 X基因、 S和 P基因的引物。序列如下表：

小干扰核酸抑制活性 = [1- (小干扰核酸转染后的乙型肝炎病毒基因的拷贝数 /小干扰核酸转染后的 GAPDH拷贝数） I (对照孔乙型肝炎病毒基因的拷贝数 /对照孔 GAPDH拷贝数) ]χΐοο %。

GAPDH: 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因。 3-憐酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量 PCR反应的内参照。

表 2

HBV-PS2 51 %

HBV-C1 91 %

HBV-C2 46%

从上表 2可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2. HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够抑制乙型肝炎病毒基因的表达，特别是 HBV-X1、 HBV-X3. HBV-PS1 ¾ HBV-C1的抑制率都在 80%以上。实施例 3

对乙型肝炎病毒 s抗原 (HBsAg)、 e抗原 (HBeAg)表达的抑制活性检测

( 1 ) HepG2.2.15细胞的培养

用含有 10 %胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 380ug/ml G418的 MEM完全培养基，在 24孔细胞培养板上以 lxlO⁵个细胞 /孔的密度接种 HepG2.2.15细胞 (源自北京大学人民医院），在温度为 37 °C及 C02含量为 5 %的培养箱中进行培养，每 72小时传代、更换新鲜培养基。在转染前 24小时，用 0.25%的胰酶消化细胞，计数，然后以 lxlO⁵个细胞 /ml 的浓度接种到 24孔板，每孔 lml。

(2) 小干扰核酸的转染

使用 Invitrogen公司的 Lipofectamine™2000脂质体对实施例 1得到的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、HBV-P1至 HBV-P2、HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2 分别进行转染，以不添加小干扰核酸作为空白对照。

具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无 RNA酶的无菌水中，配制成浓度为 2( mol/L的小干扰核酸溶液。吸出每孔细胞中的上清，加入 0.5ml的 OptiMEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062)。分别将 3μ1 小干扰核酸溶液（20μηιο1/ω 稀释于 50μ1 Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062)中，将 1 .Ομΐ Lipofectamine™ 2000脂质体稀释于 50μ1 Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985Ό62)中，然后将上述两种溶液在室温下孵育 5分钟后混合，混合溶液于室温静置 20分钟后，把 ΙΟΟμΙ 该混合溶液加到接种有细胞的所述 24孔板中，轻轻摇匀。小干扰核酸的最终浓度是 100 ηΜ。细胞 37 °C培养 4小时，再加入 lml含 10 %胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 100U/ml 青霉素、 10(^g/ml链霉素的 MEM完全培养基，然后再培养 48小时。

(3 ) 检测培养上清液 s抗原 (HBsAg)的含量

为了确定小干扰核酸对 HBV蛋白表达的影响，使用 ELISA试剂盒对收集的细胞上清的 HBsAg的含量进行检测。该试剂盒购自上海科华生物，操作按说明书进行，结果以 P/N 值 (?/1^值=样品的光吸收值 /对照的光吸收值)表示，并按下列公式计算小干扰核酸对两者的抑制率。

光吸收值为检测样本在 450nm处的吸光值减去样品在 630nm处的吸光值所得的差值。抑制率（％) = (空白对照孔 P/N值-实验孔 P/N值) /(空白对照孔 P/N值 -2.1) X 100%，结果如表 3所示。

(4) 检测培养上清液 e抗原 (HBeAg)的含量

为了确定小干扰核酸对 HBV蛋白表达的影响，使用 ELISA试剂盒对收集的细胞上清 HBeAg的含量进行检测。该试剂盒购自上海科华生物，操作按说明书进行，结果以 P/N值 (P/I^t=样品的光吸收值 /对照的光吸收值)表示，并按下列公式计算小干扰核酸对两者的抑制率。

光吸收值为检测样本在 450nm处的吸光值减去样品在 630nm处的吸光值所得的差值。抑制率（％) = (空白对照孔 P/N值-实验孔 P/N值) /(空白对照孔 P/N值 -2.1)xl00% , 结果如表 4所示。表 3

从上表 3可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2、 HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够抑制乙型肝炎病毒 S抗原的表达；特别是小干扰核酸 HBV-X1、 HBV-X3 HBV-PS1和小干扰核酸 HBV~C1的抑制率都在 85%以上。表 4

HBV-PS2 45 %

HBV-Cl 66%

HBV-C2 53 %

从上表 4可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2. HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够抑制乙型肝炎病毒 E抗原的表达；特别是 HBV-X1、 HBV-X3 , HBV-PSl禾口 HBV-Cl的抑制率都在 65%以上。实施例 4

乙型肝炎病毒转基因小鼠实验

实验动物： C57BL/6j-TgN(AlblHBV)44Bri乙型肝炎病毒基因小鼠，雄性， 7-8周龄， 20-25g, 购自北京大学医学部实验动物科学部；动物许可证号： SCXK (京） 2006-0008; 饲养条件按照 SFP级动物标准执行。

眼眶内眦采血，离心分离血清，筛选出血清 HBsAg强阳性， HBV DNA阳性的转基因小鼠。选择各项指标相近的小鼠随机分组，每组 6只。重复 3次。

分别对实施例 1得到的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2、 HBV-PSl至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2进行化学修饰，其中，化学修饰是指对小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2、 HBV-PSl至 HBV-PS2以及 HBV-C1 至 HBV-C2的正义链的 U、 C和 G核苷酸戊糖的 2'-OH进行了 2'-氟代修饰，反义链 U 和 C核苷酸戊糖的 2'-OH进行了 2'-氧甲基修饰。之后分别将修饰后的小干扰核酸 1.2mg (0.09μηιο1)溶解于 1.5ml无 RNA酶的无菌生理盐水中，配制成浓度为 6(^mol/L的小干扰核酸溶液，并与脂质体以 1 : 1的体积比混合。用脂质体包裹后的小干扰核酸加入到 5ml 无 RNA酶的无菌生理盐水（小干扰核酸浓度为 0.25mg/ml ) 中，得到注射液。

分别使用注射液通过常规的尾静脉注射对小鼠进行注射，注射的体积为 20ml的注射液 / kg体重，空白对照组注射相同体积的生理盐水，均只注射 1次。主要观察指标：小鼠注射后第 3、 5、 7天，从眼眶内眦取血，常规离心得到血清， -20°C备检，并于给药后 7天摘眼球取血后处死小鼠，在冰盒上剖腹取肝组织，匀浆备检。

( 1 ) 血清蛋白检测

小鼠注射后第 3、 5、 7天，从眼眶内眦取血，常规离心得到血清，利用丙氨酸氨基转移酶 /谷草转氨酶试剂盒 (ALT/ AST, IFCC推荐法，北京中生北控生物科技股份有限公司产品），应用日立 7170A全自动生化分析仪检测生化指标。具体操作严格按照试剂盒说明书。结果如表 5和表 6所示。表 5

HBV-X1 135 mmol/L

HBV-X2 247 mmol/L

HBV-X3 148 mmol/L

HBV-X4 240 mmol/L

实施例 4 HBV-P1 185 mmol/L

HBV-P2 192 mmol/L

HBV-PSl 174 mmol/L

HBV-PS2 223 mmol/L

HBV-Cl 168 mmol/L

HBV-C2 246 mmol/L 从上表 5可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV-X1至 HBV-X4、 HBV-P1至 HBV-P2. HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够降低血清中 ALT (丙氨酸氨基转移酶）的含量，其中 HBV-X1、 HBV-X3 , HBV-PSl和 HBV-Cl的作用最为明显。

表 6

从上表 6可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV- XI至 HBV- X4、 HBV- PI至 HBV-P2、 HBV-PSl至 HBV-PS2以及 HBV-Cl至 HBV-C2均能够降低血清中 AST (谷草转氨酶）的含量，其中 HBV-X1、 HBV-X3、 HBV-PSl禾 B HBV-Cl的作用最为明显。

(2) 血清 HBsAg检测

小鼠注射后第 14天，摘眼球取血，常规离心分离得到血清，使用 ELISA试剂盒对血清中 HBsAg的含量进行检测。该试剂盒购自法国生物梅里埃有限公司，操作按说明书进行。结果以 P/N值 (P/f^S=样品的光吸收值 /对照光吸收值)表示，并按下列公式计算小干扰核酸对 HBsAg含量的抑制率。

光吸收值为检测样本在 450nm处的吸光值减去样品在 630nm处的吸光值所得的差值。抑制率（％ ) = (空白对照孔 P/N值-实验孔 P/N值) /(空白对照孔 P/N值 -2.1) X 100%, 结果如表 7所示。表 7 实施例编号小干扰核酸编号对转基因小鼠血清中的 HBsAg含量的抑制率

( )

HBV-X1 81 %

HBV-X2 22%

HBV-X3 75 %

HBV-X4 15 %

实施例 4

HBV-P1 61 %

HBV-P2 20%

HBV-PS1 77 %

HBV-PS2 23 %

HBV-C1 76%

HBV-C2 19%

从上表 7可以看出，本发明提供的小干扰核酸 HBV- XI至 HBV- X4、 HBV- PI至

HBV-P2、HBV-PS1至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够抑制血清中 HBsAg的含量。其中 HBV-X1、 HBV-X3、 HBV-PS1和 HBV 1对血清 HBsAg含量的抑制率更是高达 75%以上。

(3 ) 肝组织 HBV-mRNA的检测

小鼠注射后第 3、 5、 7天，摘眼球放血处死后，取出肝脏，切取成约 lOOmg的组织块，放入匀浆器充分研磨，然后按照 Trizol(GIBCOL公司)的说明，使用 Trizol抽提肝组织总 RNA，提取的总 RNA经 DNase酶消化去除 DNA后，逆转录为 cDNA, 接着用荧光定量 PCR法检测小干扰核酸对乙型肝炎病毒 mRNA表达的抑制作用

具体步骤为：

① Trizol(GIBCOL公司)提取总 RNA。脱臼处死小鼠，在冰盒上剖腹取肝组织，切取约 lOOmg的肝脏组织块，加入 lml Trizol试剂，用玻璃 -Teflon或电动匀浆器匀浆；匀浆后室温放置 30min，以保证核蛋白复合体完全分离。；将裂解物转移到新的无 RNase的 1.5ml EP管中，加入 20( L氯仿 /lmL Trizol试剂，用手剧烈震荡 15s，室温放置 3min， 12000_g 4°C离心 lOmin; 取上清放于一新的 EP管中，加入 1/2体积的异丙醇，室温放置 lOmin; 2000 g, 4°C 离心 lOmin; 吸去上清，用等体积冰冷 75%的乙醇洗一次， 10000 g， 4°C离心 5min，吸去上清；无 RNase环境室温干燥 RNA沉淀 10min，加入 2(^1 DEPC 水溶解 RNA。

② RNA的纯化。将 2单位的 DNase I (RNase -free) (TakaRa公司）加入至总 RNA中，并在 37°C条件下静置 30min，以除去总 RNA中残留的 DNA; 在总 RNA中加入等体积的浓度为 70%的乙醇，振荡混合均匀；将混合物转移至纯化柱上，室温 12000g离心 15s，弃过滤液；加入 700μί清洗缓冲液 I，室温 12000g离心 15s，弃过滤液；加入 500μί清洗缓冲液 II，室温 12000g离心 15s，弃过滤液；再加入 50( L清洗缓冲液 II，室温 12000g 离心 15s，弃过滤液；室温 12000g离心 lrnin,将纯化柱转移至 RNA收集管上；加入 30μ1 DEPC水，室温放置 lrnin; 室温 13000g离心 2min，丢弃纯化柱，将 RNA样品至于 -80°C 保存。

③ RNA逆转录。将 1μ_β (2 L)提纯后的总 RNA在 EP管中 70°C加热 5min; 微型离心机瞬时离心后将 EP管迅速放到冰上；依次加入 25mM的 MgCl₂ 4 L， 10x逆转录 buffer lOmM的 dNTP Mixture 2 L， RNase抑制剂 0.5 L，逆转录酶 15U ( l g)， Oligo 弓 I物 0.5 g，用无 RNase水定容至 2( L;在 42 °C条件下孵育 15min， 95 °C加热 5min， 5 °C 孵育 5min，得到 cDNA。

将得到的 cDNA作为 PCR反应的模板，进行 Real-time PCR反应。 PCR试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司。 Real-time PCR反应体系为： ddH₂0 17.5μ1, 10mM Dntp 0.5μ1， lOxTaq buffer 2.5μ1, Taq 0·5μ1， F primer 0·5μ1， R primer 0.5μ1, Syber Green I Ιμΐ, εϋΝΑ 2μ1_; PCR反应的条件为： 94°C2分钟， 94°C 15秒， 60°C 30秒，共 40个循环。同时设立 GAPDH作为内参，根据下式计算小干扰核酸抑制活性，结果如表 8所示。

Realtime PCR引物共四对，根据所加小干扰核酸样品分别选取针对 C基因、 X基因、 S和 P基因的引物，序列如下表：

小干扰核酸的抑制活性 = [1- (给药组乙肝病毒基因的拷贝 ¾/给药组 GAPDH的拷贝数） I (空白对照组乙肝病毒基因的拷贝数 /空白对照组 GAPDH的拷贝数 )]χ100 %。

表 8

HBV-PSl至 HBV-PS2以及 HBV-C1至 HBV-C2均能够抑制转基因小鼠肝脏中 HBV基因的表达。其中 HBV-X1、 HBV-X3、 HBV-PSl和 HBV-Cl对肝脏中 HBV基因表达的抑制率在 70%以上。

Claims

权利要求书

1、乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列，其特征在于，该小核酸干扰靶位点序列包括 SEQ ID Nos : 2-11中之一所示的核苷酸序列，并且所述小核酸干扰靶位点序列的长度为 15-27个核苷酸。

2、根据权利要求 1所述的小核酸干扰靶位点序列，其中，该小核酸干扰靶位点序列的长度为 19-21个核苷酸。

3、根据权利要求 1所述的小核酸干扰靶位点序列，其中，该小核酸干扰靶位点序列包括 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 4、 SEQ ID No: 8、或 SEQ ID No: 10所示的核苷酸序列。

4、根据权利要求 1或 2所述的小核酸干扰靶位点序列，其中，该小核酸干扰靶位点序列如 SEQ ID Nos: 12-21中之一所示。

5、根据权利要求 4所述的小核酸干扰靶位点序列，其中，该小核酸干扰靶位点序列如 SEQ ID No: 12、 SEQ ID No: 14、 SEQ ID No: 18、或 SEQ ID No: 20所示。

6、一种小干扰核酸，其特征在于，该小干扰核酸为双链 RNA分子，包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链的长度为 15-27个核苷酸，所述正义链和反义链各自的 3' 端均为两个连续的脱氧胸苷酸，所述正义链和反义链中除去 3'端的两个连续的脱氧胸苷酸以外的其他核苷酸互补形成双链，其中，所述小干扰核酸的反义链能够与权利要求 1 或 4所述的小核酸干扰靶位点序列碱基互补，以抑制乙型肝炎病毒基因的表达。

7、根据权利要求 6所述的小干扰核酸，其中，所述正义链和反义链的长度分别为

19-21个核苷酸。

8、根据权利要求 7所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有 HBV-X1、HBV-X2、 HBV-X3、 HBV-X4、 HBV-Pl、 HBV-P2、 HBV-PSK HBV-PS2、 HBV-Cl或 HBV-C2所示的核苷酸序列，或者具有对 HBV-X1、 HBV-X2、 HBV-X3、 HBV-X4、 HBV-Pl HBV-P2、 HBV-PS1、 HBV-PS2, HBV-Cl或 HBV-C2所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，

HBV-X1 正义链： 5'- CGACCGACCUUGAGGCAUAdTdT-3'

反义链： 5'- UAUGCCUCAAGGUCGGUCGdTdT-3'； HBV-X2 正义链: 5， '- CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3' 反义链： 5， - UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3'；

HBV-X3 正义链: 5， '- GCGGGACGUCCUUUGUUUAdTdT-3 '

反义链： 5， - UAAACAAAGGACGUCCCGCdTdT-3'；

HBV-X4 正义链: 5， '- CUAGGAGGCUGUAGGC AUAdTdT-3 '

反义链： 5， - UAUGCCUACAGCCUCCUAGdTdT-3'；

HBV-P1 正义链： 5， - GGAACAAGAUCUACAGCAUdTdT-3'

反义链： 5， - AUGCUGUAGAUCUUGUUCCdTdT-3'；

HBV-P2 正义链： 5， - GAAAGUAUGUCAACGAAUUdTdT-3'

反义链： 5， - AAUUCGUUGACAUACUUUCdTdT-3'；

HBV-PS1 正义链： 5， - GAUCCAGCCUUCAGAGCAAdTdT-3 '

反义链： 5， - UUGCUCUGAAGGCUGGAUCdTdT-3'；

HBV-PS2 正义链： 5， - CGUCAAUCUUCUCGAGGAUdTdT-3'

反义链： 5， - AUCCUCGAGAAGAUUGACGdTdT-3'；

HBV-C1 正义链： 5' - GGGUGUUAAUUUGGAAGAUdTdT -3 '

反义链： 5， - AUCUUCCAAAUUAACACCCdTdT-3'；

HBV-C2 正义链： 5， - GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3 ' 反义链： 5， - UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3'

9、根据权利要求 8所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有 HBV-X1、HBV-X3、

HBV-PS1或 HBV-C1所示的核苷酸序列。

10、根据权利要求 8所述的小干扰核酸，其中，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

( 1 ) 对所述小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2) 对所述小干扰核酸的核苷酸序列中的核糖的 2'-OH的修饰；

( 3) 对所述小干扰核酸的核苷酸序列中的碱基的修饰。

11、一种用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求 6-10中的任意一项所述的小干扰核酸作为活性成分。

12、根据权利要求 11所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液还含有药学上可接受的载体，相对于 100重量份的小干扰核酸，所述药学上可接受的载体的含量为 100-10000000重量份。

13、根据权利要求 12所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为 pH值为 4.0-9.0的磷酸缓冲液、 pH值为 7.5-8.5的三羟甲基胺基甲垸盐酸盐缓冲液、生理盐水或 pH为 5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。

14、根据权利要求 12所述的药物组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和 /或渗透压调节剂；以所述注射液的总重量为基准，所述保护剂的含量为 0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为 200-700毫渗摩尔 /千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和 /或氯化钾。

15、权利要求 6-10中的任意一项所述的小干扰核酸在制备用于预防和 /或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。