CN1289681C - 乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用 - Google Patents
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Abstract
乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用，本发明属基因工程技术领域。本发明根据siRNA的设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt-87nt，聚合酶(P)编码区708nt-726nt，核心蛋白(C)编码区2052nt-2070nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体。上述表达载体通过阳离子脂质体介导与HBV真核表达载体pHBV共转染肝癌细胞HepG2后，采用免疫荧光和Abbott实验均证实HBV siRNA具有较强抑制病毒复制和表达的作用。
Description
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
目前，乙型肝炎(HBV)抗病毒治疗方案还处于不断探索和实践的过程，已有的核苷类似物和干扰素均不能从根本上解决抗病毒问题，因此迫切需要从全新的角度思考抗病毒治疗的措施。近年来基因阻断技术在基因功能研究中有很大进展，临床治疗研究也显示了良好的前景，为我们设计HBV抗病毒治疗方案提供了可借鉴的技术手段。目前通过寻找HBV病毒复制环节中关键的酶或RNA分子并加以阻断(knockdown)，进而达到抑制病毒复制的基因阻断技术，正成为众多学者关注的焦点。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是最近几年来发现和发展起来的新兴基因阻断技术。自RNAi现象报道以来，科学家对其作用机制进行了大量的研究，目前认为涉及包括Rnase III内切酶Dicer等多步骤过程，最终产生有活性的21-23nt小干扰性RNA(shortinterfering RNA，siRNA)，介导与其互补同源mRNA序列的特异性降解。其作用具有高效、特异的特点，比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更好。从目前的研究报道来看，RNAi技术现在主要用于基因功能和抗肿瘤研究，而抗病毒治疗研究才刚刚起步，但已显示了良好的前景和巨大潜力。
国内外有关RNAi抗病毒治疗的相关报道仅抗艾滋病毒(HIV)有4-5篇，从体外实验结果证实抑制作用特异、高效，但运用RNAi阻断技术设计针对HBV基因不同编码区的siRNA序列，进一步构建HBV siRNA表达载体，至今未见国内外相关报道。同时在体外HBV转染的HepG2细胞模型中运用微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对HBV siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行研究；运用Cy-3标记的抗体对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，实现直观、定位观察，至今亦未见报道。因此，本技术的理论意义和实际意义都将是十分重大的。
发明内容：
本发明的目的是为了设计针对HBV不同靶基因区siRNA序列，并以pTZU6+1为表达载体，构建一系列HBV siRNA重组体，在体外实验中系统研究其抑制HBV复制、转录的作用，为进一步在体内抗病毒研究打下良好的实验基础。
本发明包括三对HBV siRNA序列(HBV MS、HBV P、HBV C)的设计，序列详见“HBVsiRNA序列的设计和合成”部分。
本发明还包括独特的茎环结构HBV siRNA的设计，即正向和反向重复19nt单链DNA通过中间折叠结构的间隔，同时设计在一条核苷酸链上。
本发明还包括HBV siRNA表达载体pSIHBV MS、pSIHBV P、pSIHBV C的构建。
本发明还包括在体外HBV转染的HepG2细胞模型中运用微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对HBV siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行研究。
本发明还包括运用Cy-3标记的抗体对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，实现直观、定位的观察。
本发明所构建的HBV siRNA表达载体经酶切鉴定、序列测定表明构建成功，在体外转染HBV的细胞模型中，通过免疫荧光和Abbott实验均证实能较为明显地抑制病毒复制和病毒抗原的表达。
本发明的具体技术方案为：制备一种用于构建靶向乙型肝炎病毒的小干扰性RNA分子的表达载体，其特征在于该表达载体含有下述三对序列中的一对：
(1)上游序列：5’-TCGAGCTCCAGTTCAGGAACAGTATTCGTACTGTTCCTGAACTGGAGTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAACTCCAGTTCAGGAACAGTACGAATACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’
(2)上游序列：5’-TCGAGTCACCATACTGCACTCAGGTTCGCCTGAGTGCAGTATGGTGATTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAATCACCATACTGCACTCAGGCGAACCTGAGTGCAGTATGGTGAC-3’
(3)上游序列：5’-TCGAGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTCGGATGCTGTACAGACTTGGCTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAAGCCAAGTCTGTACAGCATCCGAAGATGCTGTACAGACTTGGCC-3’。
本发明所制备的表达载体，其特征在于上述(1)的序列作用于HBV包膜蛋白编码区69-87位核苷酸CTCCAGTTCAGGAACAGTA，上述(2)的序列作用于HBV核心蛋白编码区2052-2070位核苷酸TCACCATACTGCACTCAGG，上述(3)的序列作用于HBV聚合酶编码区708-726位核苷酸GCCAAGTCTGTACAGCATC。
本发明的另一个技术方案是该表达载体在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
附图说明：
图1是含独特茎环结构的HBV siRNA的设计图
图2是pSIHBV表达载体的构建示意图
图3是转染HBV的HepG2细胞中，免疫荧光结果显示HBV siRNA能抑制病毒抗原的表达。
A HepG2细胞HBcAg表达 B HepG2细胞HBsAg表达
1pHBV转染对照
2pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶5
3pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶10
4pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶20
具体实施方式：
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
本发明根据siRNA的设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt-87nt，聚合酶(P)编码区708nt-726nt，核心蛋白(C)编码区2052nt-2070nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体。上述表达载体通过阳离子脂质体介导与HBV真核表达载体pHBV共转染肝癌细胞HepG2后，采用免疫荧光和Abbott实验均证实HBV siRNA具有较强抑制病毒复制和表达的作用。具体
实施方案如下：
1.HBV siRNA序列的设计与合成
根据siRNA设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt-87nt，聚合酶编码区708nt-726nt，核心蛋白编码区2052nt-2070nt的核苷酸序列，设计下列相应的siRNA序列。
HBV-MS siRNA
上游序列：5’-TCGAGCTCCAGTTCAGGAACAGTATTCGTACTGTTCCTGAACTGGAGTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAACTCCAGTTCAGGAACAGTACGAATACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’
HBV-C siRNA
上游序列：5’-TCGAGTCACCATACTGCACTCAGGTTCGCCTGAGTGCAGTATGGTGATTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAATCACCATACTGCACTCAGGCGAACCTGAGTGCAGTATGGTGAC-3’
HBV-P siRNA
上游序列：5’-TCGAGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTCGGATGCTGTACAGACTTGGCTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAAGCCAAGTCTGTACAGCATCCGAAGATGCTGTACAGACTTGGCC-3’
上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守后，采用化学合成方法合成单链寡核苷酸。
2.DNA片段退火变为双链
取等量100mmol/L的DNA合成片段，在退火缓冲液(100mmol/L NaCl)中于95℃保温5min后，缓慢降至室温，然后用DNA纯化试剂盒进行纯化。
3.构建pSIHBV表达载体
将纯化的DNA片段分别与Sal I和Xba I双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化JM109大肠杆菌，经Amp抗性筛选，用Sal I或Hind III和EcoR I酶切鉴定，分别筛选出含HBV MS、HBV C、HBV P目的基因的阳性克隆，并进行DNA序列分析加以确定。
4.pSIHBV体外对HBV复制的抑制作用
将pHBV与三种不同的pSIHBV按照不同的比例共转染HepG2细胞，同时设仅含随机序列的pSI对照。转染后48小时收集细胞，用4％多聚甲醛固定15分钟，采用免疫荧光法对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行观察。结果显示随着pSIHBV比例升高，对病毒复制的抑制作用也随之增加，当两者比例为1∶20时，红色荧光标记的病毒抗原检出最少，siRNA对照组中抗原表达阳性细胞未减少，证明了HBV siRNA对HBV基因有明显的抑制作用，同时也证明了其抑制作用具有高度的序列特异性。
随后用Abbott试剂检测了转染细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达水平，每一样品均做3个复孔。实验结果表明：转染后48小时pHBV与pSIHBV共转染组HBsAg为2.87±0.05，pSI对照组为12.86±0.10；72小时pHBV与pSIHBV共转染组HBsAg为4.94±1.12，pSI对照组为22.89±1.49，两组比较有显著性差异(p＜0.01)。转染后48小时pHBV与pSIHBV共转染组HBeAg为1.48±0.08，pSI对照组为4.13±0.25；72小时pHBV与pSIHBV共转染组HBeAg为2.44±0.32，pSI对照组为3.72±0.03，两组比较也有显著性差异(p＜0.05)。实验再次证实HBV siRNA对HBV的抑制作用具有高效、特异的特点。
在本发明中，运用分子生物学相关技术，设计了三对HBV siRNA序列并成功构建了pSIHBV表达载体，在进一步的体外实验研究中，运用免疫荧光方法和Abbott实验初步显示了具有较强、特异的抗病毒效应。
本发明的优点在于：
(1).本发明设计了独特的、具有茎环结构的HBV siRNA，即同一条siRNA序列包含了siRNA折叠体的两条互补链。从5’端开始先为siRNA作用链序列(即对应目的基因序列的互补序列)，长度为19nt，中间以4nt的TTCG间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用链的反向重复序列。
(2).本发明采用了pTZU6+1表达载体，该载体含RNA pol III启动子U6，能介导HBVsiRNA在体内的正确转录并根据目的序列的TTTTT末端适时终止，尤其适合靶基因siRNA在体内表达的需要，克服了以往siRNA体外合成耗时、昂贵的缺点，使siRNA的构建更加简捷、快速，也为今后siRNA在功能基因和抗病毒基因治疗上的研究领域更为广阔打下良好的基础。
(3).将上述表达载体与HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞，采用Abbott试剂检测转染细胞上清中HBsAg和HBcAg的表达，通过微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对病毒不同靶区siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行了深入、细致的研究。
(4).在体外实验研究中，采用了新一代的免疫荧光标记物Cy3标记的二抗对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，由于Cy3在荧光显微镜下激发为鲜亮的红色荧光，尤其适合细胞内抗原量较少的检出，信噪比大大增加，实现了对目标抗原的直观、定位观察，显然比普通的DAB法更灵敏、更有说服力。
核苷酸序列表
<110>重庆医科大学
<120>乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用
<140>031173292
<160>6
<210>1
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>构建HBV包膜蛋白siRNA表达载体的DNA上游序列
<222>(1)...(52)
<400>1
tcgagctcca gttcaggaac agtattcgta ctgttcctga actggagttt tt 52
<210>2
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>构建HBV包膜蛋白siRNA表达载体的DNA下游序列
<222>(1)...(52)
<400>2
ctagaaaaac tccagttcag gaacagtacg aatactgttc ctgaactgga gc 52
<210>3
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>构建HBV核心蛋白siRNA表达载体的DNA上游序列
<222>(1)...(52)
<400>3
tcgagtcacc atactgcact caggttcgcc tgagtgcagt atggtgattt tt 52
<210>4
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>构建HBV核心蛋白siRNA表达载体的DNA下游序列
<222>(1)...(52)
<400>4
ctagaaaaat caccatactg cactcaggcg aacctgagtg cagtatggtg ac 52
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>构建HBV聚合酶siRNA表达载体的DNA上游序列
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<400>5
tcgaggccaa gtctgtacag catcttcgga tgctgtacag acttggcttt tt 52
<210>6
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<213>人工序列
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<221>构建HBV聚合酶siRNA表达载体的DNA下游序列
<222>(1)...(52)
<400>6
ctagaaaaag ccaagtctgt acagcatccg aagatgctgt acagacttgg cc 52
Claims (3)
1.一种用于构建靶向乙型肝炎病毒的小干扰性RNA分子的表达载体，其特征在于该表达载体含有下述三对序列中的一对：
(1)上游序列：5’-TCGAGCTCCAGTTCAGGAACAGTATTCGTACTGTTCCTGAACTGGAGTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAACTCCAGTTCAGGAACAGTACGAATACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’
(2)上游序列：5’-TCGAGTCACCATACTGCACTCAGGTTCGCCTGAGTGCAGTATGGTGATTTTT-3’
下游序列：5’-CTAGAAAAATCACCATACTGCACTCAGGCGAACCTGAGTGCAGTATGGTGAC-3’
(3)上游序列：5’-TCGAGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTCGGATGCTGTACAGACTTGGCTTTTT-3’
下游序列：5’-CTAG AAA GCCAAGTCTGTACAGCATCCGAAGATGCTGTACAGACTTGGCC-3’。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述(1)的序列作用于HBV包膜蛋白编码区69-87位核苷酸CTCCAGTTCAGGAACAGTA，所述(2)的序列作用于HBV核心蛋白编码区2052-2070位核苷酸TCACCATACTGCACTCAGG，所述(3)的序列作用于HBV聚合酶编码区708-726位核苷酸GCCAAGTCTGTACAGCATC。
3.权利要求1或2所述的表达载体在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
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