CN101670117B - miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非编码小RNA基因miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用，所述胃炎可以是由幽门螺杆菌感染引起。本发明所述的miR-146a在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株和人胃粘膜组织中高表达，且分别给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体或miR-146a抑制剂后，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8、巨噬细胞炎症蛋白3α和生长相关癌基因α的蛋白分泌水平和巨噬细胞炎症蛋白3α的蛋白分泌水平，表明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应。

Description

miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用 

技术领域

本发明涉及非编码小RNA基因miR-146a的应用，特别涉及miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用，尤其是miR-146a在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎药物中的应用。 

背景技术

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长度约为20～25nt的内源性非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA(mRNAs)3′非翻译区互补结合，诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调控作用。许多证据表明，miRNAs在细胞增殖、发育、分化等多种生物学过程中发挥重要的调节作用，且与肿瘤发生密切相关。 

近年来，miRNAs与免疫系统的关系越来越受重视，miRNAs已被证实参与了淋巴细胞的发育与分化、抗体的产生及固有性免疫应答调控等过程。在某些病毒感染过程中，病毒可以通过自身合成的或利用宿主的特定miRNAs，调控病毒或宿主的基因表达，利于病毒的生存、传播，或者调控机体的抗病毒免疫反应。此外，在一些炎症性疾病中，如类风湿关节炎和银屑病，miRNAs也参与了疾病的发生与发展。因此，miRNAs在病原体感染的诊断及相关炎症疾病中的治疗中可能具有极为广阔的应用前景。 

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的重要致病菌，世界人群Hp感染率超过50％。Hp与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和胃癌等多种疾病相关，对人类健康构成严重危害，世界卫生组织(WHO)将其列为一类致癌因子。人体对于Hp感染的免疫反应十分复杂，虽 然机体对于Hp感染能够引发强烈的细胞与体液免疫，但是并不能够有效地清除细菌，感染状态常常持续存在。因此，Hp感染常常引起慢性胃炎，这也是Hp的重要致病因素之一。临床治疗Hp感染相关胃炎首先要采用抗生素三联或四联疗法，在一定程度上能清除Hp，但疗效不稳定，停药后易复发、副反应严重，并且耐药问题口趋严峻。 

经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关miRNAs与Hp感染相关炎症的诊断和治疗的研究报道。 

发明内容

本发明公开了小分子RNA基因miR-146a在制备胃炎药物中的应用，该miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应。本发明所述的miR-146a在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株和人胃粘膜组织中高表达，且分别给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体或miR-146a抑制剂后，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8、巨噬细胞炎症蛋白3α和生长相关癌基因α的蛋白分泌水平，表明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应。 

本发明所述的应用中为治疗胃炎的药物；该治疗胃炎的药物为治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎的药物。 

本发明提供的miR-146a  由以下核苷酸组成：5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′ 

本发明利用miRNAs微阵列芯片对幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株GES-1及未感染的GES-1细胞的miRNAs的表达情况进行了分析，结果表明，Hp感染促进了GES-1细胞中miR-146a的表达，上调达2.46倍。进一步通过实时定量PCR(real-time PCR)和Northern杂交(Northern blot)技术对miR-146a的表达进行分析，结果与miRNAs微阵列芯片相吻合，Hp感染能够诱导胃上皮细胞miR-146a的表达上调。 

其次，本发明选取了33例Hp阳性的慢性胃炎患者与15例Hp阴性的正常对 照，利用real-time PCR技术对患者胃粘膜组织的miR-146a的水平进行检测，结果表明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜组织中，miR-146a的表达量也要显著高于Hp阴性的正常胃粘膜组织，这对于Hp感染的慢性胃炎的临床诊断和预后判断具有重要的参考意义。 

同时，本发明中分别给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体(miR-146amimics)后，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、生长相关癌基因α(growth-related oncogene-α，GRO-α)和巨噬细胞炎症蛋白3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)的蛋白分泌水平，这表明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应，因此，miR-146a在制备治疗胃炎药物方面，特别是在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎药物方面有广泛前景。 

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 

附图说明

图1：miRNAs芯片检测Hp感染胃上皮细胞miRNAs表达谱的变化； 

图2A-2B：Hp感染促进胃上皮细胞miR-146a的表达；其中，图2A，real-timePCR技术检测Hp感染胃上皮细胞GES-1、AGS和MKN45后miR-146a的表达；图2B，Northern blot鉴定Hp感染诱导miR-146a的高表达； 

图3：Hp感染胃炎患者和正常对照胃粘膜组织miR-146a的表达分析； 

图4：miR-146a模拟体抑制Hp感染炎症因子IL-8、GRO-α和MIP-3α的表达。 

具体实施方式

实施例1：Hp感染胃上皮细胞模型的建立 

Hp 26695标准菌株培养至对数生长期，5000×g离心收集细菌，用无抗生 素RPMI 1640培养基制备Hp细菌悬液，通过测定A600吸光度值调整细菌浓度(1A600＝1×108cfu/ml)。以含10％小牛血清的RPMI 1640(青霉素100U/ml；链霉素100U/ml)为完全培养基，培养人胃上皮细胞株GES-1，贴壁生长至80％时，弃掉培养基。按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)(细菌数∶细胞数)为100∶1加入Hp，37℃、5％CO₂的条件下共培养24小时。 

实施例2：miRNAs芯片检测Hp感染胃上皮细胞miRNAs表达谱的变化 

Trizol法抽提细胞总RNA，1×10⁷细胞加入1ml Trizol，用枪头反复剧烈吹打，漩涡器上充分振荡使细胞完全裂解，室温静置5min；按0.2ml氯仿/1mlTrizol的比例加入氯仿，充分漩涡，室温静置10min；4℃，12000×g离心15min，取上层无色液体于新的1.5ml离心管中；按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例加入异丙醇，充分混合，室温放置5-10min，以形成RNA沉淀；4℃，12000×g离心10min，弃上清；加至少1ml 75％乙醇/1ml Trizol，悬浮RNA沉淀；4℃，7500×g离心5min，弃上清；空气干燥5-10min后，用30μl无RNA酶的水溶解。紫外吸收测定法和甲醛变性电泳检测总RNA的纯度与完整性。 

胃上皮细胞miRNAs表达谱的检测采用博奥公司的miRNAs V3.0芯片，共含有924条探针，包括人、大鼠和小鼠的成熟miRNAs的互补序列，同时还包括122条预测的人miRNAs探针。把这些探针用芯片点样仪SmartArray^TM(博奥公司)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括人的U6-tRNA作为内标；8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，50％DMSO作为杂交阴性对照。 

采用miRCURY ARRAY标记试剂盒，用标记酶将CY3或CY5荧光基团标记细胞总RNA，制备荧光标记探针。将标记的RNA溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt′s)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗涤4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗涤4分钟。玻片甩干后即可用于扫描。 

芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行扫描，采用LuxScan 3.0图像分析软件(博奥公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。将负值信号校正到10，如果基因在所有样品中的信号值都小于300，则判断为弱点，删除弱点和坏点。数据预处理以后，再根据各张芯片的全局均值(global mean)进行片间校正，使得各张的全局均值相同。最后GenePix Pro 5.0和BIOCONDUCTOR软件进行数据归一化处理，SAM 2.1软件进行统计学分析，筛选差异表达基因。为避免假阳性和假阴性，本次实验共检测5对感染前后的样品。 

5组样品经过上述miRNAs芯片分析表明，Hp感染引起胃上皮细胞miR-146a的高表达，上调达2.46倍(图1)。 

实施例3：Real-time PCR技术检测miRNAs的表达 

本实施例采用TaqMan miRNA Assay试剂盒(Applied Biosystems)进行miRNAs的Real-time PCR检测。 

首先按照实施例1中所述的Trizol法提取细胞总RNA，分别取上述总RNA各10ng为模板，然后利用试剂盒自带的miRNAs特异引物合成cDNA，反应体系如下：dNTPs(100mM)0.15μl；MultiScribe逆转录酶1μl；10×RT缓冲液1.5μl；RNase抑制剂(20U/μl)0.19μl；RT引物3μl；总RNA 5μl；DEPC H₂O 4.16μl。反应条件：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟反应，4℃保存。 

再以cDNA为模板，利用试剂盒自带的miRNAs的特异引物和反向引物进行TaqMan探针法Real-time PCR。体系如下：2×PCR mix 10μl；cDNA 2μl；Probe0.4μl；DEPC H₂O 7.6μl。反应条件：95℃反应2分钟，95℃15秒，60℃30秒反应40个循环。以U6小RNA为内参对照，采用2^-ΔΔCT相对定量法处理数据。 

Real-time PCR结果表明，Hp感染引起胃上皮细胞株GES-1、MKN45和AGS中miR-146a的高表达，分别上调达8.04、7.46和2.81倍(图2A)。 

实施例4：Northern blot鉴定miR-146a的表达 

采用mirVana^TM miRNA提取分离试剂盒(Ambion)，收集细胞中小于200nt的miRNA。取5μg左右的miRNA，15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。 

切下要检测的凝胶部分，放入0.5×TBE漂洗；将Hybond N+membranes切成稍大于凝胶大小，在DEPC水中短暂浸润10～15秒，然后在0.5×TBE的转印液中平衡10-15分钟；将5-6张滤纸同样用转印液浸泡后，按照滤纸-凝胶-纤维膜-滤纸从上至下的顺序依次组好，放置于半干转移装置，玻璃棒各层排空气泡，胶面向阴极，膜面向阳极，装好电源装置；保持20V电压，电转移30-35分钟； 

转移完成后，移去凝胶，取出膜并标记好凝胶方向，放入紫外交联仪下交联30秒(120mJ/cm²)；80℃烤膜30分钟。 

miR-146a的Northern blot采用的是美国Signosis公司的MiRNA Northern Blot试剂盒。按照每cm²膜1ml的量添加预杂交液，42℃预杂交1小时；弃去预杂交液，更换新的杂交液4ml后，添加试剂盒自带的生物素标记的miR-146探针10μl，42℃杂交过夜；倒掉杂交液，用NB洗涤液42℃洗膜30分钟；室温下加入15ml封闭液封闭30分钟后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和显色液进行显色。 

通过Northern blot分析，结果表明Hp感染后胃上皮细胞miR-146a的表达明显上调(图2B)。 

实施例5：Hp感染胃炎患者胃粘膜组织miR-146a的表达分析 

为了确定Hp感染患者的胃粘膜组织miR-146a表达是否上调，选取了33例Hp阳性的慢性胃炎患者与15例Hp阴性的正常对照。Trizol法提取组织总RNA后，按照实施例3所述的方法，检测两组患者胃粘膜组织miR-146a的表达情况，结果表明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜组织中，miR-146a的表达量也要显著高于Hp阴性的正常胃粘膜组织(上升达4.29倍，P＜0.05)(图3)。 

实施例6：miR-146a抑制Hp感染炎症因子IL-8、MIP-3α和GRO-α的分泌 

miR-146a模拟体由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下： 

5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′ 

5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′ 

将miR-146a模拟体转染至GES-1细胞采用的是美国Promega公司的Lipofectamine^TM 2000试剂，转染前24h接种0.5-2×10⁵细胞在500μl培养基中(24-well)，当生长至90-95％密度时开始转染。稀释适当体积的miR-146a模拟体或抑制剂在50μl 

I Reduced Serum Medium培养基中，轻柔混和，使其终浓度为50nM。使用前先混合Lipofectamine^TM 2000，然后用50μl 

I Reduced Serum Medium培养基稀释适当体积的Lipofectamine^TM2000，轻柔混合，室温放置5分钟。将稀释后的小分子RNA和转染试剂进行混合，室温孵育20分钟。将100μl小分子RNA-转染试剂混合物加至含细胞和培养基的培养孔，轻柔的来回摇动培养板。37℃孵育细胞18-48小时，4-6小时后可以更换含10％胎牛血清的1640培养基。 

小分子RNA转染GES-124小时后，按照实施例1所述的方法用Hp 26695感染细胞12h后，收集上清，ELISA检测炎症因子IL-8、MIP-3α和GRO-α的表达水平，具体步骤参照美国R&D公司的DuoSet ELISA Development System试剂盒，结果表明，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子IL-8、GRO-α和MIP-3α的蛋白分泌水平(P＜0.05)(图4)。 

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国人民解放军第三军医大学 

<120>miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用 

<130> 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>22 

<212>DNA 

<213>miR-146a的核苷酸序列 

<400>1 

ugagaacuga auuccauggg uu                                            22 

<210>2 

<211>44 

<212>DNA 

<213>miR-146a的模拟体序列 

<400>2 

ugagaacuga auuccauggg uucccaugga auucaguucu cauu                    44 

Claims (2)

1.miR-146a在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎的药物中的应用。

2.根据权利要求1述的应用，其特征在于所述miR-146a由以下核苷酸组成：5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′。

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