CN112415200B - 一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于分子生物的技术领域，尤其涉及一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合及应用，本申请能在胃炎患者中检测胃癌病人血清中自身抗体。本申请提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合，包括解聚素‑金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白‑1β和基质金属蛋白酶‑7。本申请提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合，能有效解决现有的标记物检测胃癌自身抗体的特异性、灵敏性和准确性不高的技术缺陷。
Description
技术领域
本申请属于分子生物的技术领域，尤其涉及一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合及应用。
背景技术
胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。大多数胃癌患者确诊时已错失最佳诊断和治疗时机，导致疾病进展、肿瘤转移，甚至步入终末期。从胃癌的TMN分期角度来统计，胃癌5年存活率，第一期前期为97.6％，第一期后期为94.9％，第二期为70.49％，第三期前期为56.7％，第三期后期为31.9％，第四期为6.5％。可见早期胃癌诊断是必要的。
内窥镜(胃镜)是目前诊断胃癌最有利的工具。早期胃癌在内窥镜下的表现包括黏膜颜色的异常、黏膜表面血管的消失、黏膜层凹陷或凸起增厚、不规则的结接节、溃疡周边不正常的黏膜皱折。必要时，可切取部分组织做切片活检。内窥镜检查后进行活组织检查是检测胃癌的金标准，但是，这种方法具有侵入性，会引起患者的不适和恐惧。此外，无症状患者通常不接受内窥镜检查。
理想状态下，临床筛查癌症的方法要求简单、快捷、准确且收费合理，目前通过检测组织或者血液中的蛋白标志物可以作为诊断胃癌的参考。胃癌常用的蛋白肿瘤标志物包括：如癌胚抗原(CEA)，糖类抗原19-9(CA19-9)，糖类抗原72-4(CA72-4)和糖类抗原50(CA50)以及胃蛋白酶原等。但是现有众多的标记物对诊断胃癌的特异性、灵敏性和准确性不高。这可能与胃癌细胞的异质性有关，即处于不同细胞系、不同分化阶段的胃癌细胞表达的表面分子可能存在差异。也可能是很多肿瘤标志物仅在疾病晚期时才能检测到血液中浓度升高，致使错失了治疗的最佳时机。因此，寻找临床早期可行、有效、特异的诊断胃癌及预后标志物成为目前肿瘤分子生物学研究的热点。
临床证明，大多数的胃癌患者是从胃炎中逐步发展起来的，在癌症产生的初期，机体的免疫系统就可识别肿瘤细胞表达的少量异常蛋白(即肿瘤特异性抗原)，产生针对这些抗原的自身抗体。癌症自身抗体是免疫系统针对癌细胞产生的特异性反应，具有高灵敏和高特异性等特点，但是，目前未发现可以从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的标志物。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合，能填补现有的从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的标志物的空缺。
本申请第一方面提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合，包括解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7。
其中，ADAM17属于解聚素-金属蛋白酶(ADAM)家族成员之一，解聚素-金属蛋白酶(ADAM)家族是近年来新发现的一类具有多功能的细胞膜表面糖蛋白，有40多种类型，ADAM17因其可水解细胞膜上的肿瘤坏死因子，又称肿瘤坏死因子转换酶(TACE)。
巨噬细胞炎症蛋白-1β(Macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β)，是一类CC家族的趋化因子，主要由单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等产生，它可以特异性趋化淋巴细胞、单核细胞向炎症部位迁移。
基质金属蛋白酶-7(MMP-7，Matrix metallopeptidase 7)属于基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)家族。主要功能是降解和重塑细胞外基质(extracellularmatris)的动态平衡。MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。
本申请第二方面公开了所述的生物标志物组合在制备诊断胃癌疾病产品中的应用。
作为优选，本申请的生物标志物组合在制备在胃炎患者中诊断胃癌疾病的产品中的应用。
具体的，所述胃炎患者为慢性胃炎患者或萎缩性胃炎患者。
具体的，所述胃癌疾病为弥漫型和肠型胃癌。
作为优选，所述诊断胃癌疾病的检测样品为血清中抗人-IgG的自身抗体和血清中抗人-IgA的自身抗体。
本申请第三方面提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的蛋白芯片，包括载体、解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7、所述解聚素-金属蛋白酶17、所述巨噬细胞炎症蛋白-1β、所述基质金属蛋白酶-7作为抗原以矩阵形式固定在所述载体上。
本申请第四方面提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的蛋白芯片试剂盒，包括所述的蛋白芯片、偶联有可检测的标记成分的anti-human-IgG的抗体、偶联可检测的标记成分的anti-human-IgA的抗体和用于蛋白芯片的检测试剂。
作为优选，所述可检测的标记成分选自酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质中的一种。
具体的，本申请的生物标志物组合基于基因工程通过真核表达平台生产得到，真核系统表达平台表达的蛋白具有天然蛋白的功能，对抗体有很好很特异的识别度，应用在蛋白芯片上可以极大地提高检测的灵敏度和精确性。
癌症自身抗体是免疫系统针对癌细胞产生的特异性反应，具有高灵敏和高特异性等特点，使用本申请的诊断胃癌的蛋白芯片可更容易的检测血清中的自身抗体，从而更好的对胃癌进行诊断。
本申请第五方面提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的ELISA试剂盒，包括解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7、偶联有可检测的标记成分的anti-human-IgG的抗体、偶联可检测的标记成分的anti-human-IgA的抗体和和用于酶联免疫吸附反应的试剂。
作为优选，所述可检测的标记成分选自酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质中的一种。
本申请第六方面公开了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的方法，包括以下步骤：将胃炎患者的血清孵育蛋白芯片，所述蛋白芯片包括所述的生物标志物组合，检测所述胃炎患者的解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7的表达量。
具体的，检测所述胃炎患者的解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7的表达量之后，判断所述胃炎患者的解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7的表达量是否落在胃癌患者的对应的蛋白表达量范围内，输出结果。
本申请第七方面公开了一种所述的生物标志物组合筛选方法，包括以下步骤：
分别将人血清孵育蛋白芯片，使人血清中自身抗体与蛋白芯片上固定的蛋白结合，经过洗脱步骤，洗掉非特异性结合的抗体；
分别将生物素耦合的抗人IgG抗体(即biotin-conjugated anti-human-IgG)和生物素耦合的抗人IgA抗体(即biotin-conjugated anti-human-IgA)孵育所述蛋白芯片进行免疫反应，得到第一反应芯片和第二反应芯片；
分别将偶联有荧光染料的可识别生物素的链霉亲和素试剂孵育所述第一反应芯片和所述第二反应芯片，得到第一检测芯片和第二检测芯片；
根据所述第一检测芯片的第一响应信号，得到对应各自生物标志物的IgG响应信号，根据所述第二检测芯片的第二响应信号，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号，其中，所述蛋白芯片固定有多个生物标志物，所述人血清为确诊胃癌患者和健康对照组的血清；
将各所述IgG响应信号值与各所述IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的IgG/IgA比值的log2转化值，得到所有的生物标志物的IgG/IgA比值进行log2对数转化后形成的计算集合log2(IgG/IgA)；
以所述计算集合log2(IgG/IgA)为预置模型的输入参数，使得所述预置模型计算所述计算集合的所有的生物标志物的log2(IgG/IgA)的总分，输出筛选结果。
优选的，采用上述筛选方法筛选得到的结果为解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7。
具体的，本申请创造性的采用对应各自生物标志物的log2(IgG/IgA)作为模型参数，建模以得到ROC曲线，通过比较各集合的AUC数值可筛选得到高准确性、高特异性和高灵敏性的诊断胃癌的生物标志物组合。
具体的，所述的生物标志物组合筛选方法中采用的蛋白芯片为人蛋白芯片。
自身抗体是包括癌症的许多疾病的可靠的生物标志物，特别是在癌症的早期阶段，当肿瘤非常小，只有很微量的肿瘤特异性标志物由癌症细胞分泌并释放到血液中。因此，使用直接检测方法非常难以发现这些生物标志物的变化。然而，即使是很少量抗原(生物标志物)就可以刺激免疫系统，针对单一抗原生产出许多抗体。因此，这是一个信号放大过程。此外，抗体一般比大多数抗原稳定。自身抗原的生产可能还包括针对癌细胞独特的抗原。此外，检测自身抗体水平比检测蛋白质需要的血清少很多(约1/50-1/200th)。因此，本申请以解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7作为抗原，检测血清中的自身抗体，而血清中的抗体数量较多，容易与本申请的抗原(生物标志物)发免疫反应，可在胃炎患者中检测胃癌自身抗体，进而可在早期特异性、高灵敏性和高准确性诊断出胃癌。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为利用His-标签抗体检测本申请实施例的蛋白芯片的结果图。
具体实施方式
本申请提供了一种在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合及应用，用于解决现有的标记物在胃炎患者对诊断胃癌的特异性、灵敏性和准确性不高的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施所用原料和试剂均为市售或自制。
实施例1
本申请实施例提供了从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合的筛选试验，具体步骤如下：
一、从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的检测蛋白质芯片的构建
1、本实施例采用基因工程手段，利用原核及真核表达平台生产和鉴定多种人源蛋白质。利用RT-PCR扩增靶基因、并克隆到细菌表达载体，经DNA测序验证基因克隆载体的正确性后，再将该重组质料转化到感受态表达菌。基因诱导表达后，从裂解液或包涵体中进行亲和层析高效液相色谱纯化分别得到多种蛋白质。
3、将多种蛋白质作为抗原固定在载体上，形成特定的阵列点，制备成蛋白芯片，这些蛋白质为人源蛋白，作为以下蛋白芯片待筛选的生物标志物。图1为利用His-标签抗体检测本申请实施例的蛋白芯片的结果图。
二、胃炎患者与胃癌患者血清样本间差异表达蛋白的筛选
1、试验样本选自胃炎患者(117例，其中，慢性胃炎患者为77例，萎缩性胃炎患者为40例)和胃癌患者(124例，其中，弥漫型胃癌患者为47例，肠型胃癌患者为77例)，将选取的241个样本的血清，用封闭液将(blocking buffer)其稀释200倍，每一份血清分为两份，同时进行检测；将稀释后的血清100μl跟胃癌自身抗体检测蛋白芯片进行免疫反应，然后经过洗涤，洗去非特异性结合的抗体后，分别将生物素耦合的抗人IgG抗体(即biotin-conjugated anti-human-IgG)和生物素耦合的抗人IgA抗体(即biotin-conjugated anti-human-IgA)分别对应孵育上述芯片，检测得到241个样本的血清的IgA和IgG分别对上述的蛋白芯片的生物标志物(下称靶标)的响应情况，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号值和对应各自生物标志物的IgG响应信号值。胃炎和胃癌组间差异表达蛋白定义为：错误发生率(FDR,false discovery rate)<0.2和绝对log2差异倍数(fold change)>0.263的蛋白。
计算集合中的各蛋白质的log2(IgG/IgA)比值为输入参数，计算集合的蛋白质的log2(IgG/IgA)比值的总分，筛选出解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和基质金属蛋白酶-7(MMP-7)为在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合。
实施例2
本申请实施例提供了从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合ADAM17、MIP-1β和MMP-7的验证性试验，具体步骤如下：
1、试验样本选自慢性胃炎患者(共77例)、弥漫型胃癌患者(共47例)，抽取以上样本的血清，获得以上124个样本的血清的IgA和IgG。
2、将步骤1中124个样本的血清的IgA和IgG分别与实施例1的胃癌诊断的蛋白芯片进行免疫反应，然后，分别将偶联有可检测的生物素的抗IgG的抗体和抗IgA的抗体分别对应孵育上述芯片，检测得到124个样本的血清的IgA和IgG分别对胃癌诊断的蛋白芯片的生物标志物(下称靶标)的响应情况，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号值和对应各自生物标志物的IgG响应信号值。
3、将步骤2中的对应各自生物标志物的IgG响应信号值与对应各自生物标志物的IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的log2(IgG/IgA)比值。
4、采用ROC曲线验证ADAM17、MIP-1β和MMP-7灵敏性和特异性，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的灵敏性为0.883，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的特异性为0.612，ROC曲线结果如表1所述：
表1
实施例3
本申请实施例提供了从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合ADAM17、MIP-1β和MMP-7的验证性试验，具体步骤如下：
1、试验样本选自慢性胃炎患者(共77例)、肠型胃癌患者(共77例)，抽取以上样本的血清，获得以上154个样本的血清的IgA和IgG。
2、将步骤1中154个样本的血清的IgA和IgG分别与实施例1的胃癌诊断的蛋白芯片进行免疫反应，然后，分别将偶联有可检测的生物素的抗IgG的抗体和抗IgA的抗体分别对应孵育上述芯片，检测得到154个样本的血清的IgA和IgG分别对胃癌诊断的蛋白芯片的生物标志物(下称靶标)的响应情况，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号值和对应各自生物标志物的IgG响应信号值。
3、将步骤2中的对应各自生物标志物的IgG响应信号值与对应各自生物标志物的IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的log2(IgG/IgA)比值。
4、采用ROC曲线验证ADAM17、MIP-1β和MMP-7灵敏性和特异性，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的灵敏性为0.87，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的特异性为0.634，ROC曲线结果如表2所述：
表2
实施例4
本申请实施例提供了从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合ADAM17、MIP-1β和MMP-7的验证性试验，具体步骤如下：
1、试验样本选自萎缩性胃炎患者(共40例)、弥漫型胃癌患者(共47例)，抽取以上样本的血清，获得以上87个样本的血清的IgA和IgG。
2、将步骤1中87个样本的血清的IgA和IgG分别与实施例1的胃癌诊断的蛋白芯片进行免疫反应，然后，分别将偶联有可检测的生物素的抗IgG的抗体和抗IgA的抗体分别对应孵育上述芯片，检测得到87个样本的血清的IgA和IgG分别对胃癌诊断的蛋白芯片的生物标志物(下称靶标)的响应情况，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号值和对应各自生物标志物的IgG响应信号值。
3、将步骤2中的对应各自生物标志物的IgG响应信号值与对应各自生物标志物的IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的log2(IgG/IgA)比值。
4、采用ROC曲线验证ADAM17、MIP-1β和MMP-7灵敏性和特异性，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的灵敏性为0.7，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的特异性为0.694，ROC曲线结果如表3所述：
表3
实施例5
本申请实施例提供了从胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合ADAM17、MIP-1β和MMP-7的验证性试验，具体步骤如下：
1、试验样本选自萎缩性胃炎患者(共40例)、肠型胃癌患者(共77例)，抽取以上样本的血清，获得以上117个样本的血清的IgA和IgG。
2、将步骤1中117个样本的血清的IgA和IgG分别与实施例1的胃癌诊断的蛋白芯片进行免疫反应，然后，分别将偶联有可检测的生物素的抗IgG的抗体和抗IgA的抗体分别对应孵育上述芯片，检测得到117个样本的血清的IgA和IgG分别对胃癌诊断的蛋白芯片的生物标志物(下称靶标)的响应情况，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号值和对应各自生物标志物的IgG响应信号值。
3、将步骤2中的对应各自生物标志物的IgG响应信号值与对应各自生物标志物的IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的log2(IgG/IgA)比值。
4、采用ROC曲线验证ADAM17、MIP-1β和MMP-7灵敏性和特异性，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的灵敏性为0.875，ADAM17、MIP-1β和MMP-7组合的特异性为0.564，ROC曲线结果如表4所述：
表4
可见，本申请实施例验证试验说明本申请提供的生物标志物组合：ADAM17、MIP-1β和MMP-7确实具有良好的准确性、敏感性和特异性。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (7)
1.生物标志物组合在制备诊断胃癌疾病产品中的应用；
所述生物标志物组合由解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7组成；
所述诊断胃癌疾病的检测样品为胃炎患者血清中抗人-IgG的自身抗体和胃炎患者血清中抗人-IgA的自身抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断胃癌疾病产品为胃炎患者中检测胃癌自身抗体的蛋白芯片，所述蛋白芯片由载体、解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7组成；
所述解聚素-金属蛋白酶17、所述巨噬细胞炎症蛋白-1β和所述基质金属蛋白酶-7作为抗原以矩阵形式固定在所述载体上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断胃癌疾病产品为在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的蛋白芯片试剂盒，所述蛋白芯片试剂盒包括权利要求2所述的蛋白芯片、偶联有可检测的标记成分的anti-human-IgG的抗体、偶联可检测的标记成分的anti-human-IgA的抗体和用于蛋白芯片的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述可检测的标记成分选自酶、辅基、荧光物质、发光物质或放射活性物质中的一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断胃癌疾病产品为在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒由解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7、偶联有可检测的标记成分的anti-human-IgG的抗体、偶联可检测的标记成分的anti-human-IgA的抗体和用于酶联免疫吸附反应的试剂组成。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述可检测的标记成分选自酶、辅基、荧光物质、发光物质或放射活性物质中的一种。
7.生物标志物组合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别将人血清孵育蛋白芯片，使人血清中自身抗体与所述蛋白芯片上固定的蛋白结合，经过洗脱后，洗掉非特异性结合的抗体；
分别将生物素耦合的抗人IgG抗体和生物素耦合的抗人IgA抗体孵育所述蛋白芯片进行免疫反应，得到第一反应芯片和第二反应芯片；
分别将偶联有荧光染料的可识别生物素的链霉亲和素试剂孵育所述第一反应芯片和所述第二反应芯片，得到第一检测芯片和第二检测芯片；
根据所述第一检测芯片的第一响应信号，得到对应各自生物标志物的IgG响应信号，根据所述第二检测芯片的第二响应信号，得到对应各自生物标志物的IgA响应信号，其中，所述蛋白芯片固定有多个生物标志物，所述人血清为确诊胃癌患者和胃炎患者的血清；
将各所述IgG响应信号值与各所述IgA响应信号值相比，得到对应各自生物标志物的IgG/IgA比值的log2转化值，得到所有的生物标志物的IgG/IgA比值的log2转化值形成的计算集合log2（IgG/IgA）；
以所述计算集合log2（IgG/IgA）比值为预置模型的输入参数，使得所述预置模型计算所述计算集合的所有的生物标志物的log2（IgG/IgA）比值的总分，输出筛选结果；
所述筛选结果为在胃炎患者中检测胃癌自身抗体的生物标志物组合，所述生物标志物组合由解聚素-金属蛋白酶17、巨噬细胞炎症蛋白-1β和基质金属蛋白酶-7组成。
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