JP6818348B2 - シスタチンａをマーカーとして用いる癌の検出 - Google Patents
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Description
本発明は、膵癌又は大腸癌を検出する癌の検査に関する。
膵癌は日本人で部位別がん死亡数（男女計）順位が5番目の消化器系悪性腫瘍であり、厚生労働省調べでは年間2万3千人の患者が死亡する。癌の発見が非常に難しく、早期に発見されることは稀である。膵癌と診断された75％の症例は既に手術不能例であり、発見後１〜２年以内に死亡する極めて予後不良の消化器癌である（国立がんセンターがん対策情報センター調べhttp://ganjoho.jp/public/cancer/data/pancreas.html）。膵癌の診断技術の進歩が望まれてから久しく未だ有用な特異的な早期診断法は確立されていない（非特許文献１）。
K. Satake et al., Int J Panceatol 1990, 7, 25-36
本発明は膵癌又は大腸癌に特異的な腫瘍マーカーを用いて膵癌又は大腸癌を検出する方法及び該方法を行うための検査試薬の提供を目的とする。
本発明者らは、膵癌又は大腸癌患者の血液中で上昇するタンパク質について鋭意検討を行った。その結果、シスタチンAが膵癌又は大腸癌患者の血液中で有意に濃度が上昇し、膵癌又は大腸癌検出のための有用な腫瘍マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 被験体より採取した血液中のシスタチンAを測定することを含む、膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[２] 被験体より採取した血液中のシスタチンAを測定することを含む、[１]の膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[３] 被験体の血液中のシスタチンA濃度が健常人の血液中のシスタチンA濃度よりも高い場合に、被験体が膵癌又は大腸癌に罹患していると判断する、[１]又は[２]の膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[４] [１]〜[３]のいずれかの膵癌又は大腸癌を検出する方法に用いる検査試薬であって、抗シスタチンA抗体を含む検査試薬。
[１] 被験体より採取した血液中のシスタチンAを測定することを含む、膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[２] 被験体より採取した血液中のシスタチンAを測定することを含む、[１]の膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[３] 被験体の血液中のシスタチンA濃度が健常人の血液中のシスタチンA濃度よりも高い場合に、被験体が膵癌又は大腸癌に罹患していると判断する、[１]又は[２]の膵癌又は大腸癌を検出する方法。
[４] [１]〜[３]のいずれかの膵癌又は大腸癌を検出する方法に用いる検査試薬であって、抗シスタチンA抗体を含む検査試薬。
シスタチンAの血中濃度は膵癌又は大腸癌患者で有意に増加し、膵癌又は大腸癌を高い感度及び特異性で検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、シスタチンA（Cystatin A）をマーカーとして用いて、膵癌又は大腸癌を検出する方法である。
シスタチンAは、生体内において、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫を誘導し得る。該Ｔ細胞依存性腫瘍免疫はCD4細胞及びCD8細胞を介した腫瘍免疫である。
本発明は、シスタチンA（Cystatin A）をマーカーとして用いて、膵癌又は大腸癌を検出する方法である。
シスタチンAは、生体内において、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫を誘導し得る。該Ｔ細胞依存性腫瘍免疫はCD4細胞及びCD8細胞を介した腫瘍免疫である。
ヒトシスタチンAをコードするDNAの塩基配列は、配列番号１に表される。また、ヒトシスタチンAタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表される。
本発明においては、ヒト生体試料中のヒトシスタチンAを測定する。生体試料としては、血液試料、例えば血清又は血漿を用いればよい。
シスタチンAの測定方法は限定されないが、好ましくは抗シスタチンA抗体を用いた免疫学的方法により測定する。免疫学的方法としては、例えば、固相免疫測定法（RIA、EIA、FIA、CLIA等）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などが挙げられる。
この中でも、定量性の観点からEIA(Enzyme Immunoassay)法の１種であるELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法が好ましい。ELISA法では、抗シスタチンA抗体を固相化したマイクロタイタープレートに検体を添加し、抗原・抗体反応を行わせ、さらに酵素標識した抗シスタチンA抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して検体中のシスタチンAを検出すると共に、その測定値から検体中のシスタチンA濃度を算出することができる。また、蛍光標識した抗シスタチンA抗体を用いて、抗原抗体反応をさせた後に蛍光を測定してもよい。抗原抗体反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。
免疫学的手法において用いられる抗シスタチンA抗体は、シスタチンAを検出し得る抗体であればよい。抗シスタチンA抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体のFab、F(ab')、F(ab')2等の結合活性断片を用いることもできる。
本発明は抗シスタチンA抗体を含む、膵癌又は大腸癌検出用検査試薬又はキットをも包含する。
本発明においては、健常人から採取した検体を陰性対象として同時に測定してもよい。この場合、被験体が膵癌又は大腸癌に罹患している場合、被験体の検体中のシスタチンA濃度が健常人に比べて上昇するので、被験体におけるシスタチンAの濃度が健常人よりも高い場合、シスタチンAは陽性と判断され、被験体が膵癌又は大腸癌に罹患していると判断することができる。例えば、被験体の検体中のシスタチンA濃度が健常人の検体中の濃度の1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは2.0倍以上の場合に被験体は膵癌又は大腸癌に罹患していると判断することができる。
また、あらかじめ健常人の検体中のシスタチンAを測定しておき、該測定値に基づいてシスタチンAの濃度測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、膵癌又は大腸癌に罹患していると判断することができる。
カットオフ値は、例えば、ROC（receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線）解析により定めることができる。また、ROC解析により本発明の方法による診断精度（感度及び特異性）を決定することができる。ROC解析は、試料として膵癌又は大腸癌患者から採取した試料と健常人から採取した試料についてシスタチンAを測定し、各カットオフ値での感度（sensitivity)及び特異性(specificity)を算出し、横軸を特異性とし、縦軸を感度とした座標上にプロットする。本発明の方法の測定結果についてROC解析により診断精度を解析した場合の、曲線下面積（AUC：area under the curve）は0.9以上と高く、感度は80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上であり、特異性は75％以上、好ましくは80％以上である。本発明の方法により、非常に高い精度で癌を検出することができる。
例えば、血清中のシスタチンA濃度のカットオフ値として、0.25〜0.35ng/mLと設定することができ、好ましくは0.31ng/mLと設定することができる。このカットオフ値は、好ましくはELISAで測定したときの値である。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
無治療の膵癌患者（PDAC)36名、大腸癌（CRC)患者6名及び健常者（Healthy)37人の血清を採取した。
USCN社のシスタチンA ELISA kit (Product No. SEA476Hu, detection range 0.312-20 ng/mL)を用いて、血清中のシスタチンA濃度を定量化した。
結果を図１に示す。縦軸にシスタチンA(CSTA)濃度を示す。図１に示すように、膵癌患者及び大腸癌患者で血清中シスタチンA濃度は健常者よりも有意に高かった。そのカットオフ値は0.312ng/mlであった。
血清中シスタチンA濃度を指標に膵癌又は大腸癌を検出することができる。
Claims (1)
- 被験体より採取した血液中のシスタチンAをELISAにて測定することを含む、膵癌又は大腸癌を検出するための補助的方法であって、血液中のシスタチンA濃度が0.31ng/mLより大きい場合に被験体は膵癌又は大腸癌に罹患していると検出する、補助的方法。
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