CN110716050A - 抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法 - Google Patents

抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法，以能更准确地辅助早期肺癌筛查和诊断，其特征在于：该抗原组合包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：P53、SOX2、GBU4‑5、KRAS、P53‑95、CK8、HuD、SSX1、P62、EGFR‑vIII、P16、CK20、CAGE以及NY‑ESO‑1。

Description

抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用 途以及相应的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法。
背景技术
在肿瘤发展的早期，肿瘤细胞产生基因突变、异位或重组，相关蛋白释放后被免疫系统识别为“非自身蛋白”作为抗原(TAA)而发生免疫应答反应，产生针对该抗原的抗体，即肿瘤自身抗体(TAB)。自身抗体以游离或与相关抗原结合成抗原-抗体复合物的形式存在于体内循环。自身抗体用于癌症早期诊断、疗效评价及预测复发具有多种优势：自身抗体可以在癌症的无症状期被检测到；在癌症患者血清中含有针对肿瘤相关抗原的自身抗体，血清容易获得并用于癌症筛查；自身抗体不受多种蛋白酶解作用，可以在血清中稳定存在较长时间；免疫系统针对抗原产生免疫反应起到信号放大的作用，使自身抗体浓度较相应抗原浓度更高。多篇综述已经报道自身抗体的组合可以用作诊断早期癌症或区分良性良性结节与恶性肿瘤的血清生物标志物。自身抗体水平在疾病发展进程中也会发生波动，同样可以应用于监测疾病进展和复发。对于一些抗癌症治疗方法，自身抗体水平的提高与癌症完全缓解相关。在使用抗CTLA-4抗体治疗前列腺癌患者时，自身抗体水平提高提示患者对治疗具有较好的反应。某些自身抗体的测定也与不同疾病亚型相关，比如，在肺癌中一些自身抗体对小细胞肺癌更敏感，而另一些自身抗体对非小细胞肺癌更敏感。自身抗体同样应用于预示癌症的复发，乳头状甲状腺癌患者在接受治疗后一年内，甲状腺球蛋白自身抗体阳性提示疾病有较高的复发可能，而甲状腺球蛋白自身抗体阴性则指示患者有较好的治疗效果。因此，测定自身抗体水平可以鉴别癌症治疗对哪些群体更有效，在治疗期间和治疗后，监测这些自身抗体水平也可以辅助监测治疗效果并提早发现癌症复发。
利用肿瘤相关自身抗体对应的抗原来检测肿瘤自身抗体，比其他的诊断方法具有更高的特异性和敏感性，使在临床上早期筛查癌症成为可能。但不同个体免疫系统的反应有所差异，单个自身抗体难以准确推测所有癌症的发病情况。需要结合多个自身抗体的表达特征综合分析，才能够确定符合特定患者群体的肿瘤自身抗体标记物。
近年来已有部分技术采用ELISA同时检测多个自身抗体来进行肺癌的辅助诊断，例如采用6个(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5, SOX2,Annexin I)和7个(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5,MAGE-A4, SOX2,Hu-D)抗原分别组合进行检测，但由于亚洲人种和欧美人种间的差异，这些抗原组合并不适应于亚洲人群的肺癌早期检测，检测敏感度不足30％；再例如有采用P53、PGP9.5、SOX2、GAGE 7、 GBU4-5、MAGE A1和CAGE七个抗原组合进行检测的，此时虽然肺癌检测总体敏感度可达50％，但在早期肺癌检测中敏感度偏低(约 30％)，还存在特异度偏低(约80％)的问题，较高的假阳性将进一步增加后期随访监测的工作量及经济负担。
发明内容
本发明提供一种抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法，以能更准确地辅助早期肺癌筛查和诊断，为此，本发明提供了以下的技术方案。
本发明提供一种抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测以进行肺癌诊断的试剂盒中的用途，其特征在于：该抗原组合包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：P53、SOX2、GBU4-5、 KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62、EGFR-vIII、P16、CK20、 CAGE以及NY-ESO-1。
本发明提供的用途，还具有这样的用途，其中，组合为下述中的一种：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、SSX1、CAGE；
P53、SOX2、GBU4-5、HuD、SSX1、EGFR-vIII、NY-ESO-1；
SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、CK20、NY-ESO-1；
P53、GBU4-5、KRAS、P53-95、EGFR-vIII、CAGE、NY-ESO-1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、HuD、SSX1、NY-ESO-1；
P53、SOX2、P53-95、P16、CAGE、P62、CK20；
SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、SSX1、HuD、NY-ESO-1；
GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62。
本发明还提供一种肺癌相关自身抗体检测的试剂盒，其特征在于：以抗原组合作为检测肺癌相关自身抗体的靶标，其中，抗原组合包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、 P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE以及NY-ESO-1。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，组合为下述中的一种：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、SSX1、CAGE；
P53、SOX2、GBU4-5、HuD、SSX1、EGFR-vIII、NY-ESO-1；
SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、CK20、NY-ESO-1；
P53、GBU4-5、KRAS、P53-95、EGFR-vIII、CAGE、NY-ESO-1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、HuD、SSX1、NY-ESO-1；
P53、SOX2、P53-95、P16、CAGE、P62、CK20；
SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、SSX1、HuD、NY-ESO-1；
GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，还包括分别固定有组成抗原组合中的各个抗原蛋白的固相载体，其中，通过直接固定或间接固定将各个抗原蛋白固定至固相载体，直接固定指将抗原蛋白直接固定在固相载体上，间接固定指通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原蛋白间接固定于固相载体，所述固相载体为磁微粒、微球、塑料珠、液相芯片、微孔板(酶标板)、微流控芯片或亲和膜。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，抗原蛋白的包被浓度为50nM，每孔50μL。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，包被抗原蛋白的条件为：黑暗中，室温下，孵育14-18h。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，包被后，采用封闭缓冲液进行封闭，封闭缓冲液为：PBS中加1％BSA、0.02％ Tween-20和0.05％叠氮钠，pH 7.4。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，还包括：标准品、低浓度质控品、高浓度质控品以及酶标抗体，标准品用于得到不同浓度的检测标准品以用于形成相应的逻辑曲线。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，各个抗原蛋白为自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的重组蛋白，固相载体还固定自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的空载体蛋白，空载体蛋白的包被浓度和包被条件与对抗原蛋白的包被浓度和包被条件一致，空载体蛋白分别被固定在不同的孔中以分别用于对应血液样本、不同浓度的检测标准品、高浓度质控品以及低浓度质控品。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，标准品为对人源化Anti-His单抗经样本和抗体稀释液稀释得到的预定浓度为0.3333 μg/mL的人源化Anti-His抗体标准品，所述样本和抗体稀释液为含有按含量体积比质量体积比为0.1％酪蛋白的PBST缓冲液。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，高浓度质控品为对人源化Anti-His单抗经样本和抗体稀释液稀释得到的浓度为0.05 μg/mL的高浓度人源化Anti-His抗体质控品；低浓度质控品为对人源化Anti-His单抗经样本和抗体稀释液稀释得到的浓度为0.004μg/mL 的低浓度人源化Anti-His抗体质控品，所述样本和抗体稀释液为含有按含量体积比质量体积比为0.1％酪蛋白的PBST缓冲液。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，还包括：底物溶液、终止液、样本和抗体稀释液以及浓缩洗涤液。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，其中，底物溶液为 TMB底物溶液，终止液为浓度1mg/mL的NaF终止液，样本和抗体稀释液为含有按质量体积比为0.1％酪蛋白的PBST缓冲液；浓缩洗涤液为含有0.5％吐温-20的10×PBST缓冲液。
本发明还提供一种肺癌相关自身抗体的检测方法，其特征在于：采用上述的试剂盒对肺癌相关自身抗体进行检测。
本发明提供的检测方法，还具有这样的特征，包括：向各个固定抗原蛋白的孔中加经稀释的血液样本以得到与每个血液样本对应的不同抗原蛋白的各个检测样本OD650值，向对应血液样本的固定空载体蛋白的孔中加经稀释的血液样本以得到与各个血液样本对应的各个检测背景OD650值，向对应各个检测标准品的固定空载体蛋白的各个孔中加各个相应浓度的检测标准品以得到与各个浓度的标准品对应的检测标准OD650值，向对应高浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的高浓度质控品以得到高浓度质控品的OD650值，以及向对应低浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的低浓度质控品以得到低浓度质控品的OD650值；以各个检测标准品的浓度值取以10 为底的对数作为横坐标、各自的检测标准OD650值为纵坐标绘制逻辑曲线并计算标准曲线回归方程；同一血清样本中各个抗原蛋白检测的检测OD650值分别减去与该血清样本对应的检测背景OD650值，得到该血液样本的对应不同抗原蛋白的绝对OD650值，将单个绝对OD650值代入标准曲线回归方程计算得到血液样本中针对该抗原蛋白的自身抗体相对浓度值。
本发明提供的检测方法，还具有这样的特征，其中，血液样本采用样本和抗体稀释液按1:100倍进行稀释。
本发明提供的检测方法，还具有这样的特征，其中，共6个不同浓度的检测标准品，分别为检测标准品1、检测标准品2、检测标准品3、检测标准品4、检测标准品5以及检测标准品6，不同浓度的检测标准品如下得到：以试剂盒中的标准品作为检测标准品1，对该检测标准品采用样本和抗体稀释液梯度稀释分别得到检测标准品2-6，检测标准品2-6的浓度分别为：0.1111μg/mL、0.03704μg/mL、0.01235 μg/mL、0.004115μg/mL以及0.001372μg/mL。
发明作用与效果
本发明提供的的抗原组合，以及相应的试剂盒和检测方法，由于其中抗原组合由P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、 HuD、SSX1、P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE、NY-ESO-1 中的任意七个抗原蛋白组成，使得对肺癌相关自身抗体检测的总体敏感度能超过30％、而特异度能超过85％，总体远好于现有的几种抗原组合结果；并且，该任意七个抗原蛋白组成的抗原组合的假阳性低于15％，结果更可靠，更能用于早期肺癌的筛查和诊断。
附图说明
图1为本发明实施例1中的各个抗原蛋白和空载体蛋白固定在 96孔微孔板的布局图；
图2为本发明的实施例1中涉及的逻辑曲线图。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例，具体说明可用于辅助肺癌早期筛查和诊断的肺癌相关自身抗体联合检测的试剂盒以及相应的检测方法。
本实施例提供的试剂盒根据间接酶联免疫法的原理制备，具体是：将肺癌相关自身抗体对应的抗原蛋白连接到固相载体上，检测时，血液样品中的自身抗体与之结合成固相抗原-受检自身抗体复合物，再用酶标二抗(酶标抗体)与固相抗原-受检自身抗体复合物中的自身抗体结合，形成固相抗原-受检自身抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的吸光度，确定待测自身抗体水平。
本实施例提供的试剂盒，以抗原组合作为检测肺癌相关自身抗体的靶标，该抗原组合具体包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、 P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE、NY-ESO-1。
上述抗原蛋白的对应的氨基酸系列如表1所示。
Figure BDA0002272065090000091
Figure BDA0002272065090000101
本实施例中，提供的抗原组合为以下组合中的任意一种：
1：P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1；
2：P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、SSX1、CAGE；
3：P53、SOX2、GBU4-5、HuD、SSX1、EGFR-vIII、NY-ESO-1；
4：SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、CK20、NY-ESO-1；
5：P53、GBU4-5、KRAS、P53-95、EGFR-vIII、CAGE、NY-ESO-1；
6：P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、HuD、SSX1；
7：P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、HuD、SSX1、NY-ESO-1；
8：P53、SOX2、P53-95、P16、CAGE、P62、CK20；
9：SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、SSX1、HuD、NY-ESO-1；
10：GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62。
根据上述10种组合，可以形成10种包被不同抗原蛋白的试剂盒。
基于上述抗原组合，本实施例的试剂盒包括：酶标板，标准品、高浓度质控品、低浓度质控品、酶标抗体、底物溶液、终止液、样本和抗体稀释液、浓缩洗涤液以及封板膜。
酶标板，用于固定抗原蛋白，抗原蛋白固定包括直接固定和间接固定两种，直接固定指将抗原蛋白直接固定在酶标板上，间接固定指通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原蛋白间接固定于酶标板。本实施例中采用直接固定，酶标板为96孔微孔板。
本实施例中，固定的各个抗原蛋白为自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的重组蛋白，另外还固定了自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的空载体蛋白(Vector)。
具体如下固定：
将包被浓度50nM重组蛋白或空载体蛋白，50mL/孔加入至微孔板中，锡箔纸包裹微孔板后置于水平摇床，黑暗中室温孵育过夜 (14-18h)；使用PBST(PBS中加入0.2％Tween-20，pH 7.4)清洗四次，200μL封闭缓冲液(PBS-TBN，PBS中加入1％BSA，0.02％ Tween-20和0.05％叠氮钠，pH 7.4)于室温孵育1h，然后再用PBST 洗四次，在吸水纸上轻拍，除去孔中所有液体，于黑暗中2～8℃保存。
图1为本发明实施例1中的各个抗原蛋白和空载体蛋白固定在 96孔微孔板的布局图。
如图1所示，微孔板上，在1-10列，每行的各个孔对应包被抗原组合中的一个抗原蛋白或空载体蛋白；在11-12列，每行的各个孔都包被空载体蛋白。由此，每个血液样本加在1-10列，以对应不同的抗原蛋白，空载体蛋白分别被固定在不同的孔中以分别用于对应血液样本、不同浓度的标准品、高浓度质控品以及低浓度质控品，也即空载体固定在多个孔中，分别用来加血液样本、各个不同浓度的标准品、高浓度质控品以及低浓度质控品，以分别用于测定血液样本的背景OD650值、各个不同浓度标准品、高浓度质控品以及低浓度质控品的OD650值。
标准品，标准品为对人源化Anti-His单抗经PBS稀释得到的预定浓度为0.3333μg/mL的人源化Anti-His抗体标准品。标准品用于得到不同浓度梯度的标准品以用于形成相应的检测曲线；
高浓度质控品为对人源化Anti-His单抗经PBS稀释得到的浓度为0.05μg/mL的高浓度人源化Anti-His抗体质控品；
低浓度质控品为对人源化Anti-His单抗经PBS稀释得到的浓度为0.004μg/mL的低浓度人源化Anti-His抗体质控品。
低浓度质控品和高浓度质控品分别用于检测结果的质控：若低浓度质控品或高浓度质控品测定结果超出各自的预期范围，则提示本次检测结果不可靠。
酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体；
底物溶液为TMB底物溶液；
终止液为浓度1mg/mL的NaF终止液；
样本和抗体稀释液为含有0.1％(W/V)酪蛋白的PBST缓冲液；
浓缩洗涤液为含有0.5％吐温-20的10×PBST缓冲液。
利用上述的试剂盒，进行肺癌相关自身抗体的检测方法具体如下：
1.检测标准品和待检测样品准备
检测标准品准备：以上述的标准品作为检测标准品1，对该检测标准品采用样本和抗体稀释液梯度稀释分别得到检测标准品2-6，检测标准品2-6(C1-C6)的浓度分别为：0.1111μg/mL、0.03704μg/mL、 0.01235μg/mL、0.004115μg/mL以及0.001372μg/mL；
待检测样品(经稀释的血液样本)：取部分血清样本，使用样本和抗体稀释液按1:100倍稀释用于作为待检测样品。
2.检测自身抗体
2.1检测标准品及待检测样品的检测
向各个固定抗原蛋白的孔中加经稀释的血液样本(待检测样品) 以得到与每个血液样本对应的不同抗原蛋白的各个检测样本OD650值，向对应血液样本的固定空载体蛋白的孔中加经稀释的血液样本以得到与各个血液样本对应的各个检测背景OD650值，向对应各个检测标准品的固定空载体蛋白的各个孔中加各个相应浓度的检测标准品以得到与各个浓度的标准品对应的检测标准OD650值，向对应高浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的高浓度质控品以得到高浓度质控品的OD650值，以及向对应低浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的低浓度质控品以得到低浓度质控品的OD650值。
具体如下：
2.1.1加样
将微孔板于室温平衡2h后：
按图1分别在微孔板1～10列加入待检测样品各100μL，也即向各个固定抗原蛋白的孔中加经稀释的血液样本，也即列1-10中，固定P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1七种抗原蛋白的孔；且向对应血液样本的固定空载体蛋白的孔中加经稀释的血液样本，也即图1中，列1-10的固定空载体蛋白的孔；
按图1在11～12列加入检测标准品C1-C6、低浓度质控品和高浓度质控品各100μL，也即向对应各个检测标准品的固定空载体蛋白的各个孔中加各个相应浓度的检测标准品(也即图1中，列11-12的 C1-C6的孔)，向对应高浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的高浓度质控品(也即图1中，列11-12中的High control的孔)，以及向对应低浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的低浓度质控品(也即图1中，列11-12中的Low control的孔)。
本实施例中，每个血液样品对应同一个抗原蛋白孔两个，也即每个血液样品针对同一个抗原蛋白检测抗体进行两次重复，相应地，每个血液样本加在1-10列中的两个固定空载体蛋白的孔中作为背景检测。这样，本实施例中，一次可以检测5个血液样本的待检测样品(如图1中的Sample1、Sample2、Sample3、Sample4以及Sample5)，每个血液样本最终得到两个检测值，也即两个自身抗体相对浓度值，求平均得到一个检测结果。
2.1.2贴上封板膜，将微孔板放置于微孔板振荡器上，400rpm孵育90分钟(室温18-22℃)；
2.1.3小心地移除微孔板上的封板膜，甩去其中的液体，在干净的吸水纸上拍干，将微孔板放入自动洗板机中，用配制好的洗涤工作液洗板3次(300μL/孔)，最后在干净的吸水纸上拍干；
2.1.4采用8通道移液器，向每个反应孔中加入稀释好的二抗工作液(该二抗工作液通过样本和抗体稀释液稀释抗人IgG抗体100 倍得到)各100μL，贴上封板膜，将微孔板放置于微孔板振荡器上， 400rpm孵育60分钟(室温18-22℃)；
2.1.5移除微孔板上的封板膜，甩去其中的液体，在干净的吸水纸上拍干，将微孔板放入自动洗板机中，用配制好的洗涤工作液洗板 3次(300μL/孔)，最后在干净的吸水纸上拍干；
2.1.6采用8通道移液器，向每个反应孔中加入底物溶液各100μL；
2.1.7避光放置15分钟(室温18-22℃，需要准确计时)，期间轻柔晃动反应板，使显示的蓝色在反应孔内分布均匀；
2.1.8采用8通道移液器，向每个反应孔中加入终止液各100μL，终止显色反应；
2.1.9反应终止后，将微孔板放入酶标仪中，确保A1孔均位于左上角，读取各个孔的OD650值，保存OD650数据。
具体得到以下数据：
与每个血液样本对应的不同抗原蛋白的各个检测样本OD650值，也即列1-10中，固定P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1七种抗原蛋白的孔得到的各个OD650，每个血液样本对应两个重复，总共得到70个检测样本OD650值；
与各个血液样本对应的各个检测背景OD650值，也即图1中，列 1-10的固定空载体蛋白的孔得到的各个OD650值；
与各个浓度的标准品对应的检测标准OD650值，也即图1中，列 11-12的C1-C6的孔得到的各个OD650值；
与高浓度质控品对应的检测结果，也即图1中，列11-12中的 High control的孔得到的低浓度质控品的OD650值；
与低浓度质控品对应的检测结果，也即图1中，列11-12中的 Low control的孔得到的低浓度质控品的OD650值。
2.2绘制标准曲线并计算样本中自身抗体水平
图2为实施例1中涉及的逻辑曲线图。
以各个检测标准品的浓度值取以10为底的对数(log(con))作为横坐标，对应的OD650值为纵坐标，绘制如图2所示的检测标准品剂量-效应四参数逻辑曲线并计算标准曲线回归方程。
同一血清样本中各个抗原蛋白检测的OD650值分别减去与该血清样本对应的检测背景OD650值，得到该血液样本的对应不同抗原蛋白的绝对OD650值，将单个绝对OD650值代入标准曲线回归方程计算得到血液样本中针对该抗原蛋白的自身抗体相对浓度值(RU)。
实施例2
本实施例收集了148例早期肺癌患者的血清样本(肺癌组)，以及142例健康人的血清样本(对照组)。所有肺癌患者经CT检测显示结节小于20mm，经病理诊断确诊为早期肺癌(原位、I期和II期)，肺癌患者血清均在患者接受任何放化疗前采集。健康人血清来自健康体检人群，无任何恶性肿瘤相关疾病。
采用实施例1的试剂盒和检测方法分别对148例肺癌患者血清和 142例健康人血清中的肺癌相关自身抗体的水平进行检测，分别得到对照组和肺癌组的肺癌自身相关抗体的检测结果，利用模拟退火探索各肺癌相关自身抗体水平的截断值(Cut-off值)，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性，截断值再根据每个抗原组合中各个阳性和阴性结果综合评估上述每个抗原组合各自对早期肺癌诊断的特异性和敏感性。具体评估结果如表2。
Figure BDA0002272065090000171
表2中，每个抗原组合的敏感度如下得到：在肺癌组中，至少存在一个抗体浓度结果大于截断值的总个体人数占所有肺癌组人数的百分比。比如针对抗原组合1，148列肺癌患者中，至少有一个抗体浓度结果大于等于截断值的患者总共有约51个，所以敏感度为51/148*100，约为35％。
每个抗原组合的特异度如下得到：在对照组中，所有自身抗体浓度结果均小于等于截断值的总个体人数占所有对照组人数的百分比。比如针对抗原组合1，142个健康人群中，所有自身抗体浓度结果均小于等于截断值的个体总共有约127个，所以特异度为127/142*100，约为89％。
根据敏感度和特异度，计算得到Youden指数，Youden指数越高，表示抗原组合在肺癌早期的辅助诊断和筛查中的应用越可靠。
阳性似然比表示患者中得出阳性结果的概率除以非患者中得出阳性结果的概率，该值越大表示真阳性结果占比越高，检测越可靠；
阴性似然比表示患者中得出阴性结果的概率除以非患者中得出阴性结果的概率，该值越小表示真阴性结果占比越高，检测越可靠。
根据阳性似然比、阴性似然比以及Youden指数，特别是Youden 指数的大小，可以判断10个抗原组合对早期肺癌的筛查和诊断的可靠性大小，比如在表2中，抗原组合6的阳性似然比最大、阴性似然比最小，且Youden指数，由此认为抗原组合6对早期肺癌的筛查和诊断的可靠性最高，同样地，其次是抗原组合7对早期肺癌的筛查和诊断的可靠性较好，依次类推，可以大概对本实施例中验证的抗原组合对早期肺癌的筛查和诊断的可靠性作一个判断。
另外，根据表2的结果可知，表2中所有抗原组合的敏感度超过 30％、而特异度超过85％，假阳性小于15％，结果更可靠。
同样地，实际应用中，采用一个抗原组合对一个个体的血清进行检测时，当一个个体检测得到的与该抗原组合中的各个抗原蛋白对应的所有相关抗体的浓度中，存在至少一个抗体的浓度大于截断值，则提示该个体处于早期肺癌。具体就是对每个个体检测得到7个与抗原组合中的各个抗原蛋白相应的自身抗体浓度结果，当该个体的7个抗体浓度结果中，存在至少一个抗体浓度大于截断值，则提示该个体处于早期肺癌。
实施例作用与效果
实施例1提供的抗原组合，以及相应的试剂盒和检测方法，通过实施例2可以看出，由P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、 HuD、SSX1、P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE、NY-ESO-1中的任意七个组成的抗原组合，总体敏感度超过30％、而特异度超过 85％，总体远好于现有的几种抗原组合结果；并且，该任意七个组成的抗原组合的假阳性低于15％，结果更可靠，更能用于早期肺癌的筛查和诊断。
根据实施例2可知，本发明提供个10个抗原组合中，抗原组合 6和7的敏感度超过40％，而特异度超过90％，假阳性小于10％， Youden指数大于等于0.34，是用于早期肺癌筛查和诊断的优选抗原组合。
序列表
<110> 基因科技（上海）股份有限公司
<120> 抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 393
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
His Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Ser Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
340 345 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
370 375 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe
35 40 45
Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro
50 55 60
Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys
65 70 75 80
Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala Lys Arg
85 90 95
Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro
100 105 110
Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly Val Gly
130 135 140
Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp Ser Tyr
145 150 155 160
Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met Gln Asp
165 170 175
Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly Ala Ala
180 185 190
Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Ser
210 215 220
Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly Ser Met
225 230 235 240
Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val Val Thr
245 250 255
Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu Arg Asp
260 265 270
Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala
275 280 285
Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro
290 295 300
Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met
305 310 315
<210> 3
<211> 1177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Leu Gln Leu Leu Val Leu Lys Ile Glu Asp Pro Gly Cys Phe Trp
1 5 10 15
Val Ile Ile Lys Gly Cys Ser Pro Phe Leu Asp His Asp Val Asp Tyr
20 25 30
Gln Lys Leu Asn Ser Ala Met Asn Asp Phe Tyr Asn Ser Thr Cys Gln
35 40 45
Asp Ile Glu Ile Lys Pro Leu Thr Leu Glu Glu Gly Gln Val Cys Val
50 55 60
Val Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Cys Trp Cys Arg Ala Ile Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Thr Ser Ser Ala Asp Gln Tyr Leu Ala Glu Cys Phe Leu Val Asp
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Ile Pro Val Lys Ser Lys Asn Ile Arg Val Val Val
100 105 110
Glu Ser Phe Met Gln Leu Pro Tyr Arg Ala Lys Lys Phe Ser Leu Tyr
115 120 125
Cys Thr Lys Pro Val Thr Leu His Ile Asp Phe Cys Arg Asp Ser Thr
130 135 140
Asp Ile Val Pro Ala Lys Lys Trp Asp Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Phe
145 150 155 160
Gln Asn Leu Leu Lys Ala Thr Thr Gln Val Glu Ala Arg Leu Cys Ala
165 170 175
Val Glu Glu Asp Thr Phe Glu Val Tyr Leu Tyr Val Thr Ile Lys Asp
180 185 190
Glu Lys Val Cys Val Asn Asp Asp Leu Val Ala Lys Asn Tyr Ala Cys
195 200 205
Tyr Met Ser Pro Thr Lys Asn Lys Asn Leu Asp Tyr Leu Glu Lys Pro
210 215 220
Arg Leu Asn Ile Lys Ser Ala Pro Ser Phe Asn Lys Leu Asn Pro Ala
225 230 235 240
Leu Thr Leu Trp Pro Met Phe Leu Gln Gly Lys Asp Val Gln Gly Met
245 250 255
Glu Asp Ser His Gly Val Asn Phe Pro Ala Gln Ser Leu Gln His Thr
260 265 270
Trp Cys Lys Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg Pro Thr Ala Thr Ala Gln
275 280 285
Asp Lys Ala Val Lys Cys Asn Met Asp Ser Leu Arg Asp Ser Pro Lys
290 295 300
Asp Lys Ser Glu Lys Lys His His Cys Ile Ser Leu Lys Asp Thr Asn
305 310 315 320
Lys Arg Val Glu Ser Ser Val Tyr Trp Pro Ala Lys Arg Gly Ile Thr
325 330 335
Ile Tyr Ala Asp Pro Asp Val Pro Glu Ala Ser Ala Leu Ser Gln Lys
340 345 350
Ser Asn Glu Lys Pro Leu Arg Leu Thr Glu Lys Lys Glu Tyr Asp Glu
355 360 365
Lys Asn Ser Cys Val Lys Leu Leu Gln Phe Leu Asn Pro Asp Pro Leu
370 375 380
Arg Ala Asp Gly Ile Ser Asp Leu Gln Gln Leu Gln Lys Leu Lys Gly
385 390 395 400
Leu Gln Pro Pro Val Val Val Leu Arg Asn Lys Ile Lys Pro Cys Leu
405 410 415
Thr Ile Asp Ser Ser Pro Leu Ser Ala Asp Leu Lys Lys Ala Leu Gln
420 425 430
Arg Asn Lys Phe Pro Gly Pro Ser His Thr Glu Ser Tyr Ser Trp Pro
435 440 445
Pro Ile Ala Arg Gly Cys Asp Val Val Val Ile Ser His Cys Glu Ser
450 455 460
Asn Pro Leu Leu Tyr Leu Leu Pro Val Leu Thr Val Leu Gln Thr Gly
465 470 475 480
Ala Cys Tyr Lys Ser Leu Pro Ser Arg Asn Gly Pro Leu Ala Val Ile
485 490 495
Val Cys Pro Gly Trp Lys Lys Ala Gln Phe Ile Phe Glu Leu Leu Gly
500 505 510
Glu Tyr Ser Met Ser Ser Arg Pro Leu His Pro Val Leu Leu Thr Ile
515 520 525
Gly Leu His Lys Glu Glu Ala Lys Asn Thr Lys Leu Pro Arg Gly Cys
530 535 540
Asp Val Ile Val Thr Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Arg Leu Leu Ala Cys
545 550 555 560
Gln Ser Leu Leu Phe Leu Arg Leu Cys His Leu Ile Leu Asp Glu Val
565 570 575
Glu Val Leu Phe Leu Glu Ala Asn Glu Gln Met Phe Ala Ile Leu Asp
580 585 590
Asn Phe Lys Lys Asn Ile Glu Val Glu Glu Arg Glu Ser Ala Pro His
595 600 605
Gln Ile Val Ala Val Gly Val His Trp Asn Lys His Ile Glu His Leu
610 615 620
Ile Lys Glu Phe Met Asn Asp Pro Tyr Ile Val Ile Thr Ala Met Glu
625 630 635 640
Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val Val His Leu Cys Leu
645 650 655
Glu Cys Glu Lys Thr Ser Ser Leu Leu Gln Ala Leu Asp Phe Ile Pro
660 665 670
Ser Gln Ala Gln Lys Thr Leu Ile Phe Thr Cys Ser Val Ala Glu Thr
675 680 685
Glu Ile Val Cys Lys Val Val Glu Ser Ser Ser Ile Phe Cys Leu Lys
690 695 700
Met His Lys Glu Met Ile Phe Asn Leu Gln Asn Val Leu Glu Gln Trp
705 710 715 720
Lys Lys Lys Leu Ser Ser Gly Ser Gln Ile Ile Leu Ala Leu Thr Asp
725 730 735
Asp Cys Val Pro Leu Leu Ala Ile Thr Asp Ala Thr Cys Val Ile His
740 745 750
Phe Ser Phe Pro Ala Ser Pro Lys Val Phe Gly Gly Arg Leu Tyr Cys
755 760 765
Met Ser Asp His Phe His Ala Glu Gln Gly Ser Pro Ala Glu Gln Gly
770 775 780
Asp Lys Lys Ala Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Glu Lys Asp Ala Ser
785 790 795 800
His Ala Val Gly Val Leu Arg Tyr Leu Glu Arg Ala Asp Ala Lys Val
805 810 815
Pro Ala Glu Leu Tyr Glu Phe Thr Ala Gly Val Leu Glu Ala Lys Glu
820 825 830
Asp Lys Lys Ala Gly Arg Pro Leu Cys Pro Tyr Leu Lys Ala Phe Gly
835 840 845
Phe Cys Lys Asp Lys Arg Ile Cys Pro Asp Arg His Arg Ile Asn Pro
850 855 860
Glu Thr Asp Leu Pro Arg Lys Leu Ser Ser Gln Ala Leu Pro Ser Phe
865 870 875 880
Gly Tyr Ile Lys Ile Ile Pro Phe Tyr Ile Leu Asn Ala Thr Asn Tyr
885 890 895
Phe Gly Arg Ile Val Asp Lys His Met Asp Leu Tyr Ala Thr Leu Asn
900 905 910
Ala Glu Met Asn Glu Tyr Phe Lys Asp Ser Asn Lys Thr Thr Val Glu
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Lys Val Glu Lys Phe Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Glu Lys Thr Leu Phe
930 935 940
His Arg Val Gln Val Leu Glu Val Asn Gln Lys Glu Asp Ala Trp Ala
945 950 955 960
Leu Asp Asp Ile Leu Val Glu Phe Ile Asp Glu Gly Arg Thr Gly Leu
965 970 975
Val Thr Arg Asp Gln Leu Leu His Leu Pro Glu His Phe His Thr Leu
980 985 990
Pro Pro Gln Ala Val Glu Phe Ile Val Cys Arg Val Lys Pro Ala Asp
995 1000 1005
Asn Glu Ile Glu Trp Asn Pro Lys Val Thr Arg Tyr Ile His His Lys
1010 1015 1020
Ile Val Gly Lys Leu His Asp Ala Lys Val Ile Leu Ala Leu Gly Asn
1025 1030 1035 1040
Thr Val Trp Ile Asp Pro Met Val His Ile Thr Asn Leu Ser Ser Leu
1045 1050 1055
Lys Thr Ser Val Ile Asp Tyr Asn Val Arg Ala Glu Ile Leu Ser Met
1060 1065 1070
Gly Met Gly Ile Asp Asn Pro Glu His Ile Glu Gln Leu Lys Lys Leu
1075 1080 1085
Arg Glu Asp Ala Lys Ile Pro Ala Cys Glu Glu Ser Leu Ser Gln Thr
1090 1095 1100
Pro Pro Arg Val Thr Gly Thr Ser Pro Ala Gln Asp Gln Asp His Pro
1105 1110 1115 1120
Ser Glu Glu Gln Gly Gly Gln Gly Thr Pro Pro Ala Glu Asp Ala Ala
1125 1130 1135
Cys Leu Gln Ser Pro Gln Pro Glu Asp Thr Gly Ala Glu Gly Gly Ala
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Glu Ser Lys Thr Ser Ser Glu Asn Gln Lys Pro Gly Gly Tyr Leu Val
1155 1160 1165
Phe Lys Arg Trp Leu Ser Ser Asn Arg
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<210> 4
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 6
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser
85 90 95
<210> 6
<211> 483
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Ser Ile Arg Val Thr Gln Lys Ser Tyr Lys Val Ser Thr Ser Gly
1 5 10 15
Pro Arg Ala Phe Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly
35 40 45
Gly Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ala Ser Gly Met Gly Gly Ile Thr
50 55 60
Ala Val Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu Val Leu Glu Val
65 70 75 80
Asp Pro Asn Ile Gln Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys
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Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu
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Glu Gln Gln Asn Lys Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln
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Gln Lys Thr Ala Arg Ser Asn Met Asp Asn Met Phe Glu Ser Tyr Ile
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Asn Asn Leu Arg Arg Gln Leu Glu Thr Leu Gly Gln Glu Lys Leu Lys
145 150 155 160
Leu Glu Ala Glu Leu Gly Asn Met Gln Gly Leu Val Glu Asp Phe Lys
165 170 175
Asn Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Lys Arg Thr Glu Met Glu Asn Glu
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Phe Val Leu Ile Lys Lys Asp Val Asp Glu Ala Tyr Met Asn Lys Val
195 200 205
Glu Leu Glu Ser Arg Leu Glu Gly Leu Thr Asp Glu Ile Asn Phe Leu
210 215 220
Arg Gln Leu Tyr Glu Glu Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Ser
225 230 235 240
Asp Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu Asp Met
245 250 255
Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Asp Ile Ala Asn
260 265 270
Arg Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ser Met Tyr Gln Ile Lys Tyr Glu Glu
275 280 285
Leu Gln Ser Leu Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Arg Thr Lys
290 295 300
Thr Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Asn Ile Ser Arg Leu Gln Ala Glu
305 310 315 320
Ile Glu Gly Leu Lys Gly Gln Arg Ala Ser Leu Glu Ala Ala Ile Ala
325 330 335
Asp Ala Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys
340 345 350
Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Met Ala
355 360 365
Arg Gln Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys Leu Ala Leu
370 375 380
Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser
385 390 395 400
Arg Leu Glu Ser Gly Met Gln Asn Met Ser Ile His Thr Lys Thr Thr
405 410 415
Ser Gly Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Thr Ser
420 425 430
Pro Gly Leu Ser Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly
435 440 445
Ser Ser Ser Phe Ser Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Lys
450 455 460
Lys Ile Glu Thr Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val
465 470 475 480
Leu Pro Lys
<210> 7
<211> 380
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Val Met Ile Ile Ser Thr Met Glu Pro Gln Val Ser Asn Gly Pro
1 5 10 15
Thr Ser Asn Thr Ser Asn Gly Pro Ser Ser Asn Asn Arg Asn Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Met Gln Thr Gly Ala Thr Thr Asp Asp Ser Lys Thr Asn Leu
35 40 45
Ile Val Asn Tyr Leu Pro Gln Asn Met Thr Gln Glu Glu Phe Arg Ser
50 55 60
Leu Phe Gly Ser Ile Gly Glu Ile Glu Ser Cys Lys Leu Val Arg Asp
65 70 75 80
Lys Ile Thr Gly Gln Ser Leu Gly Tyr Gly Phe Val Asn Tyr Ile Asp
85 90 95
Pro Lys Asp Ala Glu Lys Ala Ile Asn Thr Leu Asn Gly Leu Arg Leu
100 105 110
Gln Thr Lys Thr Ile Lys Val Ser Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Ile Arg Asp Ala Asn Leu Tyr Val Ser Gly Leu Pro Lys Thr Met Thr
130 135 140
Gln Lys Glu Leu Glu Gln Leu Phe Ser Gln Tyr Gly Arg Ile Ile Thr
145 150 155 160
Ser Arg Ile Leu Val Asp Gln Val Thr Gly Val Ser Arg Gly Val Gly
165 170 175
Phe Ile Arg Phe Asp Lys Arg Ile Glu Ala Glu Glu Ala Ile Lys Gly
180 185 190
Leu Asn Gly Gln Lys Pro Ser Gly Ala Thr Glu Pro Ile Thr Val Lys
195 200 205
Phe Ala Asn Asn Pro Ser Gln Lys Ser Ser Gln Ala Leu Leu Ser Gln
210 215 220
Leu Tyr Gln Ser Pro Asn Arg Arg Tyr Pro Gly Pro Leu His His Gln
225 230 235 240
Ala Gln Arg Phe Arg Leu Asp Asn Leu Leu Asn Met Ala Tyr Gly Val
245 250 255
Lys Arg Leu Met Ser Gly Pro Val Pro Pro Ser Ala Cys Pro Pro Arg
260 265 270
Phe Ser Pro Ile Thr Ile Asp Gly Met Thr Ser Leu Val Gly Met Asn
275 280 285
Ile Pro Gly His Thr Gly Thr Gly Trp Cys Ile Phe Val Tyr Asn Leu
290 295 300
Ser Pro Asp Ser Asp Glu Ser Val Leu Trp Gln Leu Phe Gly Pro Phe
305 310 315 320
Gly Ala Val Asn Asn Val Lys Val Ile Arg Asp Phe Asn Thr Asn Lys
325 330 335
Cys Lys Gly Phe Gly Phe Val Thr Met Thr Asn Tyr Asp Glu Ala Ala
340 345 350
Met Ala Ile Ala Ser Leu Asn Gly Tyr Arg Leu Gly Asp Arg Val Leu
355 360 365
Gln Val Ser Phe Lys Thr Asn Lys Ala His Lys Ser
370 375 380
<210> 8
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Asn Gly Asp Asp Thr Phe Ala Lys Arg Pro Arg Asp Asp Ala Lys
1 5 10 15
Ala Ser Glu Lys Arg Ser Lys Ala Phe Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe
20 25 30
Ser Lys Lys Glu Trp Lys Lys Met Lys Tyr Ser Glu Lys Ile Ser Tyr
35 40 45
Val Tyr Met Lys Arg Asn Tyr Lys Ala Met Thr Lys Leu Gly Phe Lys
50 55 60
Val Thr Leu Pro Pro Phe Met Cys Asn Lys Gln Ala Thr Asp Phe Gln
65 70 75 80
Gly Asn Asp Phe Asp Asn Asp His Asn Arg Arg Ile Gln Val Glu His
85 90 95
Pro Gln Met Thr Phe Gly Arg Leu His Arg Ile Ile Pro Lys Ile Met
100 105 110
Pro Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Asn Asp Ser Lys Gly Val Ser Glu
115 120 125
Ala Ser Gly Pro Gln Asn Asp Gly Lys Gln Leu His Pro Pro Gly Lys
130 135 140
Ala Asn Ile Ser Glu Lys Ile Asn Lys Arg Ser Gly Pro Lys Arg Gly
145 150 155 160
Lys His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Ile
165 170 175
Tyr Glu Glu Ile Ser Asp Pro Glu Glu Asp Asp Glu
180 185
<210> 9
<211> 443
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln
20 25 30
Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro
50 55 60
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly
65 70 75 80
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys
85 90 95
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu
115 120 125
Ile Glu Lys Ile Gln Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn
130 135 140
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val
145 150 155 160
Leu Ile Pro Val Lys Gln Tyr Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys Ile
165 170 175
Leu Gly Pro Gln Gly Asn Thr Ile Lys Arg Leu Gln Glu Glu Thr Gly
180 185 190
Ala Lys Ile Ser Val Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys
195 200 205
Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn
210 215 220
Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala
225 230 235 240
Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val
245 250 255
Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gln Glu Gln Phe Leu Glu Leu Ser
260 265 270
Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val
275 280 285
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg
290 295 300
Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg
305 310 315 320
Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro
325 330 335
Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile
340 345 350
Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu
355 360 365
Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu
370 375 380
Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly
385 390 395 400
His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp
405 410 415
Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys
420 425 430
Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg Tyr
435 440
<210> 10
<211> 942
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu
915 920 925
Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
930 935 940
<210> 11
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu
20 25 30
Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro
35 40 45
Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu
50 55 60
Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg
65 70 75 80
Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val
85 90 95
Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg
100 105 110
Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg
115 120 125
Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg
130 135 140
Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Ala Gly Trp Thr Asn Leu Arg Ile
145 150 155 160
Ser Lys Pro Asn Cys Ala Trp His His Leu Glu Ile Ser Arg Ser Arg
165 170 175
Leu Phe Cys Thr Thr Gln Leu Ile
180
<210> 12
<211> 423
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Thr Arg Gly Pro Gly Leu Ala Val Arg Ala Glu Ser Arg Arg
1 5 10 15
Leu Val Gly Ile Gly Pro Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Gly Leu Gln
20 25 30
Pro Ser Gly Arg Leu Asp Arg Arg Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr
35 40 45
Lys Asp Asn Asp Gly Glu Glu Glu Glu Arg Glu Gly Gly Ala Ala Gly
50 55 60
Pro Arg Gly Ser Arg Leu Pro Pro Ile Thr Gly Gly Ala Ser Glu Leu
65 70 75 80
Ala Lys Arg Lys Val Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Lys Gly
85 90 95
Ser Gly Lys Gly Asp Asp Lys His Gln Ser Gln Ser Leu Lys Ser Gln
100 105 110
Pro Leu Ser Ser Ser Phe His Asp Ile Leu Ser Pro Cys Lys Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Lys Pro Glu His Arg Gln Ser Lys Val Glu Lys Lys His Leu
130 135 140
Pro Ser Asp Ser Ser Thr Val Ser Leu Pro Asp Phe Ala Glu Ile Glu
145 150 155 160
Asn Leu Ala Asn Arg Ile Asn Glu Ser Leu Arg Trp Asp Gly Ile Leu
165 170 175
Ala Asp Pro Glu Ala Glu Lys Glu Arg Ile Arg Ile Tyr Lys Leu Asn
180 185 190
Arg Arg Lys Arg Tyr Arg Cys Leu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp
195 200 205
Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Asp Ala Leu Lys Gly
210 215 220
Phe His Pro Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Glu
225 230 235 240
Ala Leu Lys Gly Ile His Pro Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His
245 250 255
Pro Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Glu Ala Leu
260 265 270
Lys Gly Phe His Thr Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Ile Asp
275 280 285
Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Lys Ala Leu Lys Gly
290 295 300
Phe His Pro Asp Pro Lys Ala Leu Lys Gly Phe His Thr Asp Pro Glu
305 310 315 320
Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Lys Ala Leu Lys Gly Phe His
325 330 335
Pro Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Glu Ala Leu
340 345 350
Lys Gly Phe His Pro Asp Pro Glu Ala Leu Lys Gly Phe His Thr Asp
355 360 365
Pro Asn Ala Glu Glu Ala Pro Glu Asn Leu Pro Tyr Leu Ser Asp Lys
370 375 380
Asp Gly Ser Ser Ser His Arg Gln Pro Thr Ser Lys Ala Glu Cys Pro
385 390 395 400
Asn Leu Cys Phe Glu Gly Asn Leu Thr Pro Lys Leu Leu His Ser Asp
405 410 415
Leu Ala Pro Thr Leu Leu Glu
420
<210> 13
<211> 631
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Ser His Trp Ala Pro Glu Trp Lys Arg Ala Glu Ala Asn Pro Arg
1 5 10 15
Asp Leu Gly Ala Ser Trp Asp Val Arg Gly Ser Arg Gly Ser Gly Trp
20 25 30
Ser Gly Pro Phe Gly His Gln Gly Pro Arg Ala Ala Gly Ser Arg Glu
35 40 45
Pro Pro Leu Cys Phe Lys Ile Lys Asn Asn Met Val Gly Val Val Ile
50 55 60
Gly Tyr Ser Gly Ser Lys Ile Lys Asp Leu Gln His Ser Thr Asn Thr
65 70 75 80
Lys Ile Gln Ile Ile Asn Gly Glu Ser Glu Ala Lys Val Arg Ile Phe
85 90 95
Gly Asn Arg Glu Met Lys Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ile Glu Thr Leu
100 105 110
Ile Arg Lys Gln Glu Ser Tyr Asn Ser Glu Ser Ser Val Asp Asn Ala
115 120 125
Ala Ser Gln Thr Pro Ile Gly Arg Asn Leu Gly Arg Asn Asp Ile Val
130 135 140
Gly Glu Ala Glu Pro Leu Ser Asn Trp Asp Arg Ile Arg Ala Ala Val
145 150 155 160
Val Glu Cys Glu Lys Arg Lys Trp Ala Asp Leu Pro Pro Val Lys Lys
165 170 175
Asn Phe Tyr Ile Glu Ser Lys Ala Thr Ser Cys Met Ser Glu Met Gln
180 185 190
Val Ile Asn Trp Arg Lys Glu Asn Phe Asn Ile Thr Cys Asp Asp Leu
195 200 205
Lys Ser Gly Glu Lys Arg Leu Ile Pro Lys Pro Thr Cys Arg Phe Lys
210 215 220
Asp Ala Phe Gln Gln Tyr Pro Asp Leu Leu Lys Ser Ile Ile Arg Val
225 230 235 240
Gly Ile Val Lys Pro Thr Pro Ile Gln Ser Gln Ala Trp Pro Ile Ile
245 250 255
Leu Gln Gly Ile Asp Leu Ile Val Val Ala Gln Thr Gly Thr Gly Lys
260 265 270
Thr Leu Ser Tyr Leu Met Pro Gly Phe Ile His Leu Asp Ser Gln Pro
275 280 285
Ile Ser Arg Glu Gln Arg Asn Gly Pro Gly Met Leu Val Leu Thr Pro
290 295 300
Thr Arg Glu Leu Ala Leu His Val Glu Ala Glu Cys Ser Lys Tyr Ser
305 310 315 320
Tyr Lys Gly Leu Lys Ser Ile Cys Ile Tyr Gly Gly Arg Asn Arg Asn
325 330 335
Gly Gln Ile Glu Asp Ile Ser Lys Gly Val Asp Ile Ile Ile Ala Thr
340 345 350
Pro Gly Arg Leu Asn Asp Leu Gln Met Asn Asn Ser Val Asn Leu Arg
355 360 365
Ser Ile Thr Tyr Leu Val Ile Asp Glu Ala Asp Lys Met Leu Asp Met
370 375 380
Glu Phe Glu Pro Gln Ile Arg Lys Ile Leu Leu Asp Val Arg Pro Asp
385 390 395 400
Arg Gln Thr Val Met Thr Ser Ala Thr Trp Pro Asp Thr Val Arg Gln
405 410 415
Leu Ala Leu Ser Tyr Leu Lys Asp Pro Met Ile Val Tyr Val Gly Asn
420 425 430
Leu Asn Leu Val Ala Val Asn Thr Val Lys Gln Asn Ile Ile Val Thr
435 440 445
Thr Glu Lys Glu Lys Arg Ala Leu Thr Gln Glu Phe Val Glu Asn Met
450 455 460
Ser Pro Asn Asp Lys Val Ile Met Phe Val Ser Gln Lys His Ile Ala
465 470 475 480
Asp Asp Leu Ser Ser Asp Phe Asn Ile Gln Gly Ile Ser Ala Glu Ser
485 490 495
Leu His Gly Asn Ser Glu Gln Ser Asp Gln Glu Arg Ala Val Glu Asp
500 505 510
Phe Lys Ser Gly Asn Ile Lys Ile Leu Ile Thr Thr Asp Ile Val Ser
515 520 525
Arg Gly Leu Asp Leu Asn Asp Val Thr His Val Tyr Asn Tyr Asp Phe
530 535 540
Pro Arg Asn Ile Asp Val Tyr Val His Arg Val Gly Tyr Ile Gly Arg
545 550 555 560
Thr Gly Lys Thr Gly Thr Ser Val Thr Leu Ile Thr Gln Arg Asp Ser
565 570 575
Lys Met Ala Gly Glu Leu Ile Lys Ile Leu Asp Arg Ala Asn Gln Ser
580 585 590
Val Pro Glu Asp Leu Val Val Met Ala Glu Gln Tyr Lys Leu Asn Gln
595 600 605
Gln Lys Arg His Arg Glu Thr Arg Ser Arg Lys Pro Gly Gln Arg Arg
610 615 620
Lys Glu Phe Tyr Phe Leu Ser
625 630
<210> 14
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp
1 5 10 15
Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly
20 25 30
Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
50 55 60
His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala
65 70 75 80
Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe
85 90 95
Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp
100 105 110
Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
115 120 125
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met
145 150 155 160
Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser
165 170 175
Gly Gln Arg Arg
180

Claims (10)

1.一种抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测以进行肺癌诊断的试剂盒中的用途，其特征在于：
该抗原组合包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE以及NY-ESO-1。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
其中，所述组合为下述中的一种：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、SSX1、CAGE；
P53、SOX2、GBU4-5、HuD、SSX1、EGFR-vIII、NY-ESO-1；
SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、CK20、NY-ESO-1；
P53、GBU4-5、KRAS、P53-95、EGFR-vIII、CAGE、NY-ESO-1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、HuD、SSX1、NY-ESO-1；
P53、SOX2、P53-95、P16、CAGE、P62、CK20；
SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、SSX1、HuD、NY-ESO-1；
GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62。
3.一种肺癌相关自身抗体检测的试剂盒，其特征在于：
以抗原组合作为检测肺癌相关自身抗体的靶标，
其中，所述抗原组合包括以下抗原蛋白中的任意七个或七个以上的组合：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62、EGFR-vIII、P16、CK20、CAGE以及NY-ESO-1。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：
其中，所述组合为下述中的一种：
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、SSX1、CAGE；
P53、SOX2、GBU4-5、HuD、SSX1、EGFR-vIII、NY-ESO-1；
SOX2、GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、CK20、NY-ESO-1；
P53、GBU4-5、KRAS、P53-95、EGFR-vIII、CAGE、NY-ESO-1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、HuD、SSX1；
P53、SOX2、GBU4-5、P53-95、HuD、SSX1、NY-ESO-1；
P53、SOX2、P53-95、P16、CAGE、P62、CK20；
SOX2、GBU4-5、P53-95、CK8、SSX1、HuD、NY-ESO-1；
GBU4-5、KRAS、P53-95、CK8、HuD、SSX1、P62。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，包括：
分别固定有组成所述抗原组合中的各个所述抗原蛋白的固相载体，
其中，通过直接固定或间接固定将各个所述各个抗原蛋白固定至所述固相载体，
所述直接固定指将所述抗原蛋白直接固定在所述固相载体上，
所述间接固定指通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将所述抗原蛋白间接固定于所述固相载体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：
标准品、低浓度质控品、高浓度质控品以及酶标抗体，
所述标准品用于得到不同浓度的检测标准品以用于形成相应的逻辑曲线。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：
其中，各个抗原蛋白为自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的重组蛋白，
所述固相载体还固定自大肠杆菌表达并纯化获得带有His标签的空载体蛋白，所述空载体蛋白的包被浓度和包被条件与对所述抗原蛋白的包被浓度及包被条件一致，
所述空载体蛋白分别被固定在不同的孔中以分别用于对应血液样本、不同浓度的检测标准品、高浓度质控品以及低浓度质控品。
8.一种肺癌相关自身抗体的检测方法，其特征在于：
采用权利要求3-7中任意一项所述的试剂盒对肺癌相关自身抗体进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括：
向各个固定抗原蛋白的孔中加经稀释的血液样本以得到与每个血液样本对应的不同抗原蛋白的各个检测样本OD650值，向对应血液样本的固定所述空载体蛋白的孔中加经稀释的血液样本以得到与各个血液样本对应的各个检测背景OD650值，向对应各个检测标准品的固定所述空载体蛋白的各个孔中加各个相应浓度的检测标准品以得到与各个浓度的标准品对应的检测标准OD650值，向对应高浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的高浓度质控品以得到高浓度质控品的OD650值，以及向对应低浓度质控品的固定空载体蛋白的孔中加相应的低浓度质控品以得到低浓度质控品的OD650值；
以各个检测标准品的浓度值取以10为底的对数作为横坐标、各自的所述检测标准OD650值为纵坐标绘制逻辑曲线并计算标准曲线回归方程；
同一所述血清样本中各个抗原蛋白检测的检测OD650值分别减去与该血清样本对应的检测背景OD650值，得到该血液样本的对应不同抗原蛋白的绝对OD650值，将单个绝对OD650值代入所述标准曲线回归方程计算得到所述血液样本中针对该抗原蛋白的自身抗体相对浓度值。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：
其中，共6个不同浓度的检测标准品，分别为检测标准品1、检测标准品2、检测标准品3、检测标准品4、检测标准品5以及检测标准品6，不同浓度的检测标准品如下得到：
以试剂盒中的标准品作为检测标准品1，对该检测标准品采用样本和抗体稀释液梯度稀释分别得到检测标准品2-6，检测标准品2-6的浓度分别为：0.1111μg/mL、0.03704μg/mL、0.01235μg/mL、0.004115μg/mL以及0.001372μg/mL，
所述标准品为对人源化Anti-His单抗经样本和抗体稀释液稀释得到的预定浓度为0.3333μg/mL的人源化Anti-His抗体标准品，
所述样本和抗体稀释液为含有按质量体积比为0.1％酪蛋白的PBST缓冲液。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112834748A (zh) * 2019-11-22 2021-05-25 广州市丹蓝生物科技有限公司 一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用
WO2022013321A3 (en) * 2020-07-14 2022-03-10 Oncimmune Limited Use of antigen combination for detecting autoantibodies in lung cancer
CN116444680A (zh) * 2022-12-28 2023-07-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用
CN116444680B (zh) * 2022-12-28 2024-05-03 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112834748A (zh) * 2019-11-22 2021-05-25 广州市丹蓝生物科技有限公司 一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用
CN112834748B (zh) * 2019-11-22 2024-03-12 广州市丹蓝生物科技有限公司 一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用
WO2022013321A3 (en) * 2020-07-14 2022-03-10 Oncimmune Limited Use of antigen combination for detecting autoantibodies in lung cancer
CN116444680A (zh) * 2022-12-28 2023-07-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用
CN116444680B (zh) * 2022-12-28 2024-05-03 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用

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