CN112834748B - 一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用。其中，所述生物标志物组合包含PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53和MAGEA1。本发明的生物标志物组合在诊断早期肺癌或其预后时或不确定性肺小结节良恶性鉴别时，具有较高的敏感性和/或特异性，适用于临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及癌症诊断和治疗领域，尤其是涉及一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用。
背景技术
肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症之一，近年来肺癌发病率逐步升高，尽管肺癌的治疗手段日新月异，其5年生存率仅14.1%，60%的患者在诊断后1年内死亡。统计资料显示肺癌的预后与诊断时的临床分期密切相关。0期肺癌患者术后的5年生存率可达90%以上，Ia期患者术后5年生存率为60%，而Ⅱ-Ⅳ期患者总的5年生存率则从40%下降到5%以下。由此可见肺癌早期诊断直接影响着患者的预后。然而令人遗憾的是，目前肺癌早期诊断率仅15%，0期患者一般没有任何症状，确诊时还不到肺癌患者总数的0.6%。故提高肺癌早期诊断率，争取“早期发现、早期诊断、早期治疗”，是降低患者死亡率的重要措施。
肿瘤早期诊断目的在于能够在临床体征出现之前准确的诊断出尚处于发展早期的癌症。随着医学影像技术的发展，低剂量螺旋CT被广泛用于检测肺部早期结节，是肺癌早期筛查的有效手段。但低剂量螺旋CT的问题在于其检测结果的高假阳性，而且多次CT检测还有可能加速肺癌的恶化。其他的早期肺癌检查方法包括PET、核磁共振、支气管内镜，针吸活检等检查存在无法早期筛查、有创伤、价格昂贵等问题。而CEA、CYFRA21-1、NSE等传统常规肿瘤标志物，在肿瘤早期血液中含量非常低甚至没有，目前主要用于恶性肿瘤患者病情的动态监测，不能作为早期诊断或确诊依据。病理检测是手术或活检获得病灶组织进行病理学染色分析，是目前唯一能确诊肿瘤的金标准。但这种侵入性检查手段还无法作为癌症早期诊断与筛查的检测手段。在肺癌的临床研究中，通过EGFR、KRAS、ALK、BRAF等基因突变检测，对肺癌靶向治疗药物的个性化治疗取得了重大突破。然而，这些基因突变检测无法用于肺癌早期诊断或肺癌高危人群的筛查。使用DNA甲基化检测来进行结直肠癌的早期诊断已经有一些商业化的产品，但用于肺癌早期诊断的产品还没有上市。循环肿瘤细胞（CTC）可由肿瘤细胞自发或受外界因素干扰而从肿瘤原发病灶脱离进入外周血循环，是评价化学疗法效果，肺癌预后、病情监测的一个特别有希望的技术领域。
肺癌自身抗体谱检测具有更多优势，肿瘤特异性抗原是肿瘤发生、进展过程中细胞坏死后释放、脱落或者外分泌的特异蛋白产物。在癌症初期，机体免疫系统可识别肿瘤细胞表达的肿瘤特异性抗原，产生针对这些抗原的自身抗体。在早期肺癌及癌前患者血液中，自身抗体水平远高于抗原水平，自身抗体具有免疫监视、免疫放大、循环扩散的特点，并且自身抗体相对于其他肿瘤抗原标志物及DNA标志物具有：在血清中出现的时间早、血液检测时间窗长、血液信号强度高、早期检测灵敏度高等特点。因此将多个自身抗体标志物联合检测是获取高敏感性和高特异性检测的手段。
目前市场上，Oncimmune公司的EarlyCDT®-Lung产品及杭州凯保罗生物科技有限公司的自身抗体检测试剂盒（酶联免疫法）是由一组7个或8个相关自身抗体肿瘤标志物联合检测的产品，采用酶联免疫（ELISA）检测方法，用于肺癌的辅助检测。该产品采用ELISA检测方法不具有高通量的特点，而且此2个产品用于早期肺癌的检测时的敏感性或特异性有待提高。
发明内容
为解决现有技术中早期肺癌诊断或其预后的生物标志物组合或试剂盒敏感性和特异性低的技术问题，提供一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种用于早期肺癌诊断或其预后的生物标志物组合，其中，所述生物标志物组合包含PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53和MAGEA1。
较佳地，所述生物标志物组合还包含CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1和/或MAGEA4；任选地，所述生物标志物组合还包含GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2和/或ELAVL3；任选地，所述生物标志物组合还包含ANXA1、S100A10、HNRPA1、MUC1和/或CRYAA。
更佳地，所述生物标志物组合选自：PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2和ELAVL3中的七种或七种以上优选十种以上更优选十三种以上生物标志物组合；
或，所述生物标志物组合选自：PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10和HNRPA1中的七种或七种以上优选十种以上更优选十三种以上生物标志物组合；
或，所述生物标志物组合选自：PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1和CRYAA中的七种或七种以上优选十种以上更优选十三种以上生物标志物组合；
或，所述生物标志物组合选自：PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、MUC1、PGAM1、UBQLNl、CDK2、CTAG1B、CRYAA和DNAJB1中的七种或七种以上优选十种以上更优选十三种以上生物标志物组合；
或，所述生物标志物组合选自：PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、ANXA1和/或HNRPA1中的七种或七种以上优选十种以上更优选十三种以上生物标志物组合。
进一步更佳地，所述生物标志物组合选自以下组：
1）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、SOX1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、MUC1、PGAM1、UBQLNl、ANXA2、CDK2、CTAG1B、CRYAA、DNAJB1；
2）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、MUC1、PGAM1、UBQLNl、ANXA2、CDK2；
3）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、MAGEA1、CDKN2A；
4）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1；
5）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、MAGEA1、CDKN2A、SOX2；
6）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1；
7）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A
8）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9
9）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1
10）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4
11）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7
12）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2
13）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF
14）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE
15）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5
16）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2
17）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2
18）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3；
19）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10；
20）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1；
21）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1；
22）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA；
23）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1；
24）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1
25）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1；
26）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7；
27）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2；
28）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD；
29）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1；
30）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2；
31）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2；
32）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、PGAM1；
33）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、PGAM1、UBQLNl；
34）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、PGAM1、UBQLNl、CDK2；
35）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、PGAM1、UBQLNl、CDK2、CTAG1B；
36）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、HNRPA1、MUC1、CRYAA、SOX1、ANXA1、ENO1、BIRC7、ZIC2、HUD、CCNB1、IGFBP2、EFHD2、PGAM1、UBQLNl、CDK2、CTAG1B、DNAJB1；
37）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、S100A10、MUC1；
38）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、HNRPA1、MUC1、CRYAA；
39）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3、CRYAA；
40）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、S100A10；
41）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、HNRPA1；
42）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、CRYAA。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种用于早期肺癌诊断或其预后或不确定性肺小结节良恶性鉴别的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包含PLG、PGP9.5、TP53、SPAG9、NY-ESO-1、BRAF、GBU4-5、SOX2、GAD2和/或ELAVL3；优选地，还包含ANXA1、CAGE、MAGEA1和/或MAGEA4；更优选地，还包括PARP1、APEX1和/或HNRPA1；进一步更优选地，所述生物标志物组合选自以下组：
1）PLG、PARP1、PGP9.5、TP53、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA1、ANXA1、BRAF、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3；
2）PLG、PGP9.5、TP53、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、ANXA1、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3；
3）PLG、APEX1、PGP9.5、TP53、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3；
4）PLG、PGP9.5、TP53、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA1、ANXA1、BRAF、HNRPA1、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3。
在上述技术方案之一与之二的一些较佳的实施例中，所述生物标志物含有标签肽；优选地，所述标签肽包括：His标签、streptavidin标签、avidin标签、生物素标签、GST标签、C-myc标签、Flag标签和HA标签中的一种或多种；优选地，所述生物标志物可由大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞表达；和/或，所述生物标志物通过Ni亲和层析、离子交换层析、分子筛、透析、超滤或疏水层析纯化。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种用于诊断早期肺癌或其预后或不确定性肺小结节良恶性鉴别的试剂盒，其包含上述任一项所述的生物标志物组合；较佳地，还包括检测所述生物标志物的引物或抗体，所述抗体优选hIgG或hIgM；更佳地，还包含校准品，优选为重组人抗标签肽免疫球蛋白G和重组人抗标签肽免疫球蛋白M，更优选为9E10嵌合抗体hIgG或9E10嵌合抗体hIgM。
较佳地，所述试剂盒还包括藻红蛋白标记的抗人免疫球蛋白G及其片段、藻红蛋白标记的抗人免疫球蛋白M及其片段、血清稀释缓冲液、洗涤液、分析缓冲液中的一种或多种。
更佳地，所述的生物标志物固定于固相载体上；优选地，所述固相载体包括：微球、酶标板微孔、亲和膜或液相芯片。
进一步更佳地，所述生物标志物与微球直接或间接偶联，所述标签肽为His6 tag和/或C-Myc tag；
优选地，所述生物标志物与微球的直接偶联为：微球-CO-NH-（C-Myc tag）- G4S -（His6 tag）- G4S -生物标志物的氨基酸序列；或微球-CO-NH-（C-Myc tag）- (G4S)2-生物标志物的氨基酸序列-（His6 tag）。微球与标签肽之间形成酰胺键，其中“-CO”由微球提供，“NH-”由标签肽提供。
所述间接偶联的步骤包括：
（1）微球与生物素化牛血清白蛋白（BSA-biotin）偶联，生物标志物与Streptavidin结合；
（2）biotin与Streptavidin结合，从而使生物标志物特异的结合到微球。
更优选地，所述血清稀释缓冲液为NaCl 300mM，KCl 2.7mM，Na2HPO48.1 mM，KH2PO41.5 mM，5%驴血清或5 w/v%BSA，0.05% prcolin300或0.05 w/v%叠氮钠，pH 7.0-8.0；所述洗涤液为NaCl 0.137M，KCl 2.7mM，Na2HPO48.1 mM，KH2PO41.5mM，0.05%吐温-20，0.03%prcolin300，pH 7.6；所述分析缓冲液为NaCl 300mM，KCl 2.7mM，Na2HPO48.1mM，KH2PO41.5mM，1% 驴血清或1 w/v %BSA，0.05% prcolin300或0.05 w/v %叠氮钠；其中所述%为体积百分比，所述w/v%为质量体积比
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：提供一种所述的生物标志物组合在制备诊断或辅助诊断早期肺癌试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明提供了一种生物标志物组合、含其的试剂盒及其应用，所述检测试剂盒包含一组经过优化重组的36个自身抗原蛋白中的任意6种、7种或以上，优选13种及以上的组合；所述的自身抗原组合中的每一种自身抗原均可检测相应IgG型或IgM型自身抗体，抗原蛋白的氨基酸序列为全长或经异位剪切的序列；抗原蛋白均接有标签肽，所述标签肽可以选自：His标签、streptavidin标签、avidin标签，c-Myc标签、Flag标签、HA标签和生物素标签，阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G和重组人抗标签肽免疫球蛋白M，或者是它们的片段。
本发明利用自身抗体谱在肺癌早诊及筛查中和不确定性肺结节良恶性判断中的优势，利用抗原-抗体反应的高特异性和高敏感性特点，采用液态悬浮芯片技术，通过流式荧光进行肺癌自身抗体谱高通量检测，优于传统检测技术，且本发明的生物标志物组合具有以下优势：高敏感性和/或高特异性。
附图说明
图1为pET-30a-BRAF质粒Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定；
图2为BRAF蛋白在E. coli表达的SDS-PAGE分析（左）和Western blot分析（右，使用抗-His抗体）；
图3为BRAF蛋白的SDS-PAGE检测；其中，泳道M: 蛋白marker，泳道1: 蛋白BRAF；
图4为pET-30a- hnRPA1质粒Hind Ⅲ和NdeI双酶切鉴定；
图5为hnRPA1蛋白在E.coli表达的SDS-PAGE分析（左）和Western blot分析（右，使用抗-His抗体）；
图6为hnRPA1蛋白的SDS-PAGE检测；其中泳道M: 蛋白marker，泳道1: 蛋白hnRPA1；
图7为本发明所述各抗原标志物在不同检测人群的含量差异（单位: U/mL）。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
1、PBS：NaCl 137mM；KCl 2.7mM；Na2HPO4 8.1mM；KH2PO4 1.5mM；pH 7.6，0.22μm滤膜过滤；
2、血清/抗体稀释缓冲液：NaCl 300mM；KCl 2.7mM；Na2HPO 48.1mM； KH2PO41.5mM；5%驴血清（体积比）；0.05% proclin300（体积比）；pH7.6； 0.22μm滤膜过滤。
3、5×洗液：NaCl 685mM；KCl1 3.5mM；Na2HPO4 40.5mM；KH2PO4 7.5mM；2.5%驴血清（体积比），0.25%吐温-20（体积比），0.25% proclin300（体积比），pH7.6；0.22μm滤膜过滤；
4、5×分析缓冲液：NaCl 685mM；KCl1 3.5mM；Na2HPO4 40.5mM；KH2PO4 7.5mM；5%驴血清（体积比）；0.25% proclin300（体积比）；pH7.6；0.22μm 滤膜过滤。
下表为本发明采用的生物标志物（抗原）的uniprot登录号信息。
表1
实施例1重组含Streptavidin标签 BRAF的表达及纯化
（一）含Streptavidin标签 BRAF 重组工程菌的构建
1. 按照序列1人工合成目的基因BRAF（Myc tag+Linker+His tag+ Linker +BRAF + Linker + Streptavidin）至PUC-57载体中。此处的linker为柔性连接肽(Gly4Ser)3。
2. 取测序正确的5μL PUC-57-BRAF重组菌接种于含30mg/mL Amp+的液体培养基，37℃ 200r/min培养过夜。
3. 取PUC-57-BRAF重组菌进行质粒提取。取1.5ml的重组菌液使用QIAGEN质粒提取试剂盒（LOT:154014885）提取质粒。
4. 各取1.5ug的PUC-57-BRAF质粒与pET-30a载体用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ内切酶37°C1h进行酶切。 用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段与载体：首先在紫外灯下依据PCR产物的大小进行切胶。将切下来的胶快放在1.5或2.0mL的离心管中，与呈黄色的Binding Buffer在70℃左右的水浴锅中作用至胶块全部融化（期间不时摇晃）。融化的液体转移至吸附柱中，使胶块中的基因片段结合到吸附柱上。在用洗脱液进行冲洗杂质，保证所有杂质都被去除之后用去离子水进行洗脱目的基因。
PUC-57-BRAF质粒酶切反应体系如下：
PUC-57-BRAF质粒 5 μl
Hind Ⅲ内切酶 1 μl
EcoR Ⅰ内切酶 1 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 11 μl
Total 20 μl
5. 取回收目的片段与载体，摩尔比为5:1，在T4连接酶作用下16 ℃连接4 h，构建原核表达载体，转化至BL21（DE3）感受态细胞中，于-70 ℃冰箱中取出一支100 µl的感受态细胞，手心融化后立即放入冰盒中，把连接产物全量加入到100 µl感受态细胞中，轻旋混匀，置冰上放置30 min，然后42 ℃热休克90 s，注意不要摇动，立即冰浴5 min，在超净工作台中向上述管中加入1 ml事先37 ℃水浴的LB液体培养基中，然后固定到空气摇床的弹簧架上37 ℃震荡1 h。孵育结束后，3000rpm、5 min离心收集菌体，将上清液留约200 µl，其余倒掉，旋涡震荡混匀菌体，将其涂布于终浓度为Amp+ 0.1 mg/ml 的LB/琼脂平板培养基上，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，37 ℃温箱中培养过夜，挑单菌落培养，并进行质粒的提取，Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定（图1），筛选阳性克隆。阳性的重组质粒pET-30a-BRAF（DE3）送金斯瑞公司进行测序。
pET-30a-BRAF连接酶催化反应体系如下：
pET-30a载体 4 μl
BRAF目的基因片段 1 μl
T4 DNA连接酶 0.5 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 2.5 μl
Total 10 μl
pET-30a-BRAF双酶切鉴定反应体系如下：
pET-30a-BRAF质粒 5 μl
Hind Ⅲ内切酶 1 μl
EcoR Ⅰ内切酶 1 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 11 μl
Total 20 μl
测序结果验证了序列1的序列与设计是一致的：Myc tag+Linker+His tag+ Linker+BRAF P15056+ Linker+Streptavidin。
（二）重组BRAF基因工程菌的培养表达
1. 取20 μl重组BRAF基因工程菌接种于100mL含0.1% 氨苄青霉素的灭菌LB液体培养基。
2. 37℃，220 rpm培养16h，后接入1L含0.1% 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220 rpm扩大培养3h。
3. 加入1mL IPTG，继续37℃,220rpm诱导表达4小时。
4. 诱导表达结束后，将菌液进行离心5000rpm，15mim收集菌体。
5. 取未诱导及诱导后的菌液，用SDS-PAGE和Western blot分析BRAF蛋白的表达（如图2所示）。诱导前后，菌体蛋白电泳有较大差异，（图中箭头所示为目的蛋白）。重组蛋白表达约占菌体总蛋白量40%。
图2说明.BRAF蛋白在E.coli表达的SDS-PAGE分析（左）和Westernblot分析（右，抗-His抗体，）其中泳道M1:蛋白marker泳道M2:Westernblot marker
泳道PC1:BSA (1μg)；泳道PC2:BSA (2μg)；泳道NC:未诱导的全细胞裂解液；泳道NC1:未诱导的细胞裂解液上清；泳道NC2:未诱导的细胞裂解液沉淀；泳道1:37°C诱导4小时的全细胞裂解液；泳道2:37°C诱导4小时的细胞裂解液上清；泳道3:37°C诱导4小时的细胞裂解液沉淀。
（三）重组BRAF的纯化
1. 菌体超声破碎
向离心收集菌体中加入50ml裂解缓冲液（3g Tris-base，14.61g氯化钠，0.74gEDTA二钠，溶于450mL ddH2O，调pH至8.0，补水定容至500mL，0.45um滤膜过滤），将菌体混匀后，冰浴条件下超声破碎菌体（功率300W超声4S,间歇4S,超声25min）。菌体超声破碎后于4℃ 10000rpm离心15min，弃上清，收集包涵体沉淀。
2. 包涵体清洗
按照包涵体：包涵体清洗缓冲液=1:10（g:ml）的比例, 加入包涵体清洗液（20mMPBS, pH 8.0）。4℃ 充分振荡混匀清洗后，10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。重复一次。
3. 包涵体溶解
向离心收集的包涵体沉淀中加入100ml 包涵体溶解液（7.8g二水合磷酸二氢钠，29.22g氯化钠，573g urea，1.4g咪唑，溶解于800mL ddH2O，调pH至8.0，定容至1000mL，0.45um滤膜过滤），充分重悬沉淀，冰浴条件摇床摇动3h。把充分溶解后的包涵体在4℃10000rpm离心30min，收集包涵体上清。
4. 蛋白纯化
a）装填Ni‐NTA填料10ml于色谱柱（色谱柱规格：16mm×20cm）。
b）采用包涵体溶解缓冲液平衡色谱柱2个柱体积。
c）把收集的包涵体溶溶解上清上样至平衡好的 Ni-NTA 色谱柱，上样流速为1ml/min。
d）上样完成后采用4倍柱体积洗涤缓冲液（50 mM Na2HPO4，10 mM Tris∙Cl，10 mMimidazole，8 M Urea，pH 8.0）洗涤填料，直到紫外检测A280 值稳定。
e）用洗脱缓冲液（50 mM Na2HPO4，10 mM Tris∙Cl，250 mM imidazole，8 M Urea，pH 8.0）洗脱色谱柱上目的蛋白，根据紫外检测A280 值收集色谱峰。
5. 蛋白复性
将纯化收集的目的蛋白样品对PBS溶液进行4℃透析10h。将透析后的样品，用超滤法或PEG20000进行浓缩。获得复性后的目的蛋白。使用Folin-酚法对BRAF进行定量,测得蛋白浓度为0.5mg/ml。
（四）重组BRAF的SDS-PAGE检测
将纯化所得目的蛋白经复性后，采用SDS-PAGE检测，结果如图3所示，测得纯度大于90%。
实施例2 重组无Streptavidin标签hnRPA1的表达及纯化
（一）hnRPA1重组工程菌的构建
1. 按照序列1人工合成目的基因（NdeI‐Myc tag-Linker-His tag-Linker-HNRPA1-Stop codon‐HindIII）BRAF至PUC-57载体中。此处的linker为柔性连接肽(Gly4Ser)3。
2. 取测序正确的5 μL PUC-57- hnRPA1重组菌接种于含30mg/mL Amp+的液体培养基，37°200r/min培养过夜。
3. 取PUC-57- hnRPA1重组菌进行质粒提取。取1.5ml的重组菌液使用QIAGEN质粒提取试剂盒（LOT:154014885）提取质粒。
4. 各取1.5ug的PUC-57- hnRPA1质粒与pET-30a载体用Hind Ⅲ和NdeI内切酶37°1h进行酶切。 用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段与载体：首先在紫外灯下依据PCR产物的大小进行切胶，切胶的时候要注意不能切的过大或者过小，过大过小都会导致回收率的下降。将切下来的胶快放在1.5或2.0mL的离心管中，与呈黄色的Bingding Buffer在70℃左右的水浴锅中作用至胶块全部融化（期间不时摇晃）。融化的液体转移至吸附柱中，使胶块中的基因片段结合到吸附柱上。在用洗脱液进行冲洗杂质，保证所有杂质都被去除之后用去离子水进行洗脱目的基因。
PUC-57- hnRPA1质粒酶切反应体系如下：
PUC-57- hnRPA1质粒 5 μl
Hind Ⅲ内切酶 1 μl
NdeI内切酶 1 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 11 μl
Total 20 μl
5. 取回收目的片段与载体，摩尔比为5:1，在T4连接酶作用下16 ℃连接4 h，构建原核表达载体，转化至BL21（DE3）感受态细胞中，于-70 ℃冰箱中取出一支100 µl的感受态细胞，手心融化后立即放入冰盒中，把连接产物全量加入到100 µl感受态细胞中，轻旋混匀，置冰上放置30 min，然后42 ℃热休克90 s，注意不要摇动，立即冰浴5 min，在超净工作台中向上述管中加入1 ml事先37 ℃水浴的LB液体培养基中，然后固定到空气摇床的弹簧架上37 ℃震荡1 h。瞬时放在离心机上3000rpm离心5 min，将上清液留约200 µl，其余倒掉，旋涡震荡混匀菌体，将其涂布于终浓度为Amp+ 0.1 mg/ml 的LB/琼脂平板培养基上，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，37 ℃温箱中培养过夜，挑单菌落培养，并进行质粒的提取，Hind Ⅲ和NdeI双酶切鉴定（如图4），筛选阳性克隆。阳性的重组质粒pET-30a-hnRPA1（DE3）进行测序确认无误。
pET-30a- hnRPA1连接酶催化反应体系如下：
pET-30a载体 4 μl
hnRPA1目的基因片段 1 μl
T4DNA连接酶 0.5 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 2.5 μl
Total 10 μl
pET-30a- hnRPA1双酶切鉴定反应体系如下：
pET-30a- hnRPA1质粒 5 μl
Hind Ⅲ内切酶 1 μl
NdeI内切酶 1 μl
Buffer 2 μl
ddH2O 11 μl
Total 20 μl
（二）重组hnRPA1基因工程菌的培养表达
1. 取20 μl重组hnRPA1基因工程菌接种于100mL含0.1% 氨苄青霉素的灭菌LB液体培养基。
2. 37℃,220 rpm培养16h，后接入1L含0.1% 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220 rpm扩大培养3h。
3. 加入1mL IPTG，继续37℃，220rpm诱导表达4小时。
4. 诱导表达结束后，将菌液进行离心5000rpm，15mim收集菌体。
5. 未诱导及诱导后的菌液，用SDS-PAGE和Western blot分析hnRPA1蛋白的表达（如图5所示）。图5中，电泳泳道M1: 蛋白marker；泳道PC1: BSA (1 μg) ；泳道PC2: BSA (2μg) ；泳道M1: 蛋白marker；泳道NC: 未诱导的全细胞裂解液；泳道1：37℃诱导4小时的细胞裂解液；泳道2：16℃诱导4小时的细胞裂解液；泳道NC1: 未诱导的细胞裂解液上清； 泳道NC2: 未诱导的细胞裂解液沉淀；泳道3:16°C诱导4小时的细胞裂解液上清； 泳道4: 16°C诱导4小时的细胞裂沉淀；泳道5: 37 °C诱导4小时的细胞裂解液上清；泳道6: 37 °C诱导4小时的细胞裂解液沉淀；图5中结果显示诱导前后，菌体蛋白电泳有较大差异，（图5中箭头所示为目的蛋白）。表明重组蛋白表达有表达，表达蛋白量约占菌体总蛋白量40%。
（三）重组hnRPA1的纯化及SDS-PAGE检测
重组hnRPA1的纯化方法同实施例一 “重组BRAF的纯化”，将纯化所得目的蛋白经复性后，采用SDS-PAGE检测，测得纯度大于90%，结果如图6所示。
实施例3间接偶联抗原蛋白微球的制备方法
本发明中，先将生物素标记的BSA（BSA-biotin）直接偶联至微球表面，利用生物素-链霉亲和素高亲和力和高特异性的特征，再将接有streptavidin标签的抗原蛋白包被至偶联有BSA-biotin的微球表面。抗原蛋白能够特异地结合并俘获肺癌血清中相应的抗体，藻红蛋白标记的抗c-Myc人免疫球蛋白G或抗c-Myc人免疫球蛋白M能够特异地与被俘获的抗体结合，最终形成针对肺癌血清自身抗体的“BSA-biotin+生物素-抗原蛋白+血清抗体+荧光二抗（藻红蛋白标记的抗c-Myc人免疫球蛋白G或抗c-Myc人免疫球蛋白M，以及它们的片段）”的复合物，藻红蛋白标记的荧光二抗，可被液态芯片仪的报告激光激发出荧光并被报告分子检测器接收，血清样本的荧光与标准品荧光生成的标准曲线进行换算，可检测PE标记荧光二抗结合的血清中肺癌自身抗体的含量。
1. 微球的激活
a）取出MagPlex®微球 (Luminex公司)，涡旋震荡及超声约20s，使微球充分混匀重悬。根据偶联所需微球数量，吸取微球混悬液适量体积（约5×106个微球）于偶联反应管。
b）将偶联反应管放置在磁性分离器上30-60s，使微球与液体分离。用移液器小心移除上清，避免吸走微珠沉淀。
c）移走磁力分离器，往反应管管内加入500μL激活缓冲液 (0.1M NaH2PO4,pH6.2)，涡旋震荡及超声重悬微球。将反应管放在磁力分离器上磁性分离微球，用移液器小心移除上清。重复此步骤洗涤微球1-2次。
d）向清洗后的微球中加入激活缓冲液 480μL，涡旋震荡及超声混匀，依次向微球中依次加入10 μL NHS及10 μL EDC，涡旋震荡混匀后，将反应管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育20-30分钟。
2. 载体蛋白(生物素标记BSA)偶联至微球
a）将激活后的微球反应管放在磁性分离器上磁性分离30-60s，用移液器小心移除上清后，移走磁力分离器，向反应管中加入400μL的偶联缓冲液（50 mM MES，pH6.0），涡旋震荡及超声20s重悬微球。
b) 按载体蛋白biotion-BSA：微珠数目= 5μg：1×106个的比例加biotion-BSA到悬浮的微球溶液中。涡旋震荡及超声后。将反应管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育1-2h。然后将反应管放在磁力分离器上30-60s分离微球。用移液器小心移除上清。
3. 微球的清洗
向反应管中加入500μL的洗涤液(10mM PBS，0.05%吐温-20)，涡旋震荡及超声重悬偶联载体蛋白后的微珠。然后将反应管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，用移液器小心移除上清。
4. 微球的封闭
向清洗后的微球中加入500μL的封闭缓冲液(10mM PBS，5%驴血清，0.03%Proclin300)，涡旋震荡及超声重悬微球。将反应管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育30min。
5. 抗原蛋白的偶联
a）将封闭微球的反应管置于磁性分离器30-60s，用移液器小心移除上清，往反应管中加入500μL洗涤液，振荡及超声洗涤约20s重悬微球后，将反应管置于磁性分离器上，用移液器小心移除上清。
b）往反应管中加入200μL包被缓冲液（10mM PBS，1%驴血清，0.03% Proclin300），旋涡振荡20s，根据待包被抗原：微球数量=40μg：1×106个的比例加入待包被抗原。涡旋震荡及超声约20s重悬微球后，将反应管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育60min。
c）将反应管置于磁性分离器，用移液器小心移除上清后，往反应管中加入500μL洗涤液，涡旋震荡及超声约20s后将反应管置于磁性分离器上，用移液器小心移除上清，重复此洗涤步骤将微球洗涤1-2遍。最后用1mL微球保存液 (10mM PBS，3%驴血清，5%海藻糖，0.03%Proclin300)将微球重悬，在2-8℃避光保存。
6. 偶联后微球计数
微球偶联完毕后，在显微镜下用血球计数器对其进行计数，以确定其浓度，并计数偶联过程的得率与损耗；血球计数器计算是使用下面的公式：微球总数＝4×4分格中的微球数×（1×104）×稀释倍数×悬浮体积。
实施例4 直接偶联抗原蛋白微球的制备方法
本实施例是直接将抗原蛋白（即实施例1、2制备的标签肽）包被至微球表面。每个微球（xMAP ®微球）上有大约1×109个羧基基团，直接偶联的过程是抗原蛋白上的氨基和微球上的羧基形成酰胺健。抗原蛋白的偶联是两步酰胺反应：第一步是微球表面的羧基被EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）活化，反应在Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)存在的条件下形成Sulfo-NHS-酯过渡态产物。第二步反应的过渡态就与抗原蛋白的伯胺形成共价酰胺键。具体制备方法包括以下步骤：
1.微球的激活
同实施例3中，“1. 微球的激活”
2. 抗原蛋白偶联至微球
1）用100 μL的50 mM MES, pH 5.0溶液，振荡及超声约20秒重悬活化并清洗后的微球。加抗原蛋白 50μg到悬浮的微球溶液中。用50 mM MES，pH 5.0的溶液将总体积增至500 μL，振荡混匀进行偶联反应。在室温中边翻转混合边孵育2个小时。
2）将离心管放在磁力分离器上30－60秒分离微球。将离心管保持在磁力分离器上，用移液器将上清液移除，注意不要搅动微球。
3）移走磁力分离器并用500 μL的PBST溶液，振荡及超声约20秒重悬偶联后的微球。将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球。将离心管保持在磁力分离器上，用移液器将上清液移除，注意不要搅动微球。
4）移走磁力分离器并用1 mL的PBST溶液，振荡及超声约20秒重悬微球。重复此步。用总共1mL PBST溶液两次清洗。
5）在2-8℃的黑暗环境中保存偶联后的微球。
3. 抗原蛋白偶联后微球计数
微球偶联完毕后，在显微镜下用血球计数器对其进行计数，以确定其浓度，并计数偶联过程的得率与损耗；血球计数器计算是使用下面的公式： 微球总数＝4×4分格中的微球数×（1×104）×稀释倍数×悬浮体积。
实施例5 32种抗原蛋白在E.coli的表达分析
本研究对100多种肿瘤相关标志物抗原进行了E.coli基因工程菌重组表达，现列出以下32种抗原蛋白的重组表达分析结果，将ANXA1、CAGE、GBU4-5、HNRPA1、TP53、PGP9.5、ZIC2、GAGE7、EEF2、S100A10、ELAVL4、MAGEA4、MAGEA1、UBQLN1、SOX1、APEX1、CCNB1、CDKN2A、ELAVL3、ENO1、SPAG9、CRYAA、DNAJB1、EFHD2、IGFBP2、NPM1、PARP1、PLG、GAD2、MUC1、NY-ESO-1、SOX2等32个抗原蛋白在E. coli表达方法同实施例1，SDS-PAGE分析结果说明各个抗原按照实施例1方式进行表达，可以获得稳定表达的基因工程菌种，经进一步纯化获得可用于分析检测的目的蛋白。
实施例6 用于检测自身抗体的流式免疫荧光法试剂盒的制备及流式荧光检测
1 用于检测自身抗体的流式免疫荧光试剂盒的组成
用于检测自身抗体的流式免疫荧光试剂盒（固定抗原）包括以下成分:
1）包被不同抗原蛋白的一组检测微球；
2）藻红蛋白标记的驴抗人免疫球蛋白G和藻红蛋白标记的驴抗人免疫球蛋白G，浓度为50μg/ml；
3）阳性质控品（标准品）：人抗c‐Myc标签免疫球蛋白G和人抗c‐Myc标签免疫球蛋白M；
4）阴性质控品；
5）血清稀释缓冲液；
6）20×洗涤液；
7）分析缓冲液；
8）96孔圆底板（Corning公司）。
9）封板膜
2检测微球的制备及流式免疫荧光检测
2.1检测微球的制备：
微球的制备同实施例3：间接偶联抗原蛋白微球的制备方法。
将载体蛋白(BSA-biotin-3)偶联至激活后的微球，将每个抗原蛋白分别偶联至不同编码的微球。制备偶联不同抗原的一组微球。
2.2微球的流式免疫荧光检测方法
（一）微球分装至96孔板及微球的洗涤
1. 将偶联包被抗原的一组待检测微球加入96孔板（2500个/种/孔），并向每孔内加入120 μl洗涤液，将96孔板置于旋转混合仪，室温条件下，1000rpm、震荡混合1min，将96孔板置于磁力板上静置1min，保持96孔板固定于磁力板并向上，迅速有力向下翻转磁力板，甩掉孔内液体，保持磁力板向下，垂直向下快速扣甩3~4次，直至反应板内无液体滴落。
2. 将反应板从磁力板上取下，往反应板各孔加入120 μl洗涤液，将96孔板置于旋转混合仪，室温、1000rpm、1min；将反应板移出旋转混合仪，扣好磁力板，静置1min后甩掉孔内液体。
（二）微球与待检测血清孵育
1. 研究血清对象：本研究包括 135例1A期经病理确诊的肺癌血清（包含肺鳞癌，肺腺癌，小细胞肺癌）。25例经病理确诊的良性肺结节血清（包含错构瘤、慢性炎性病变、结核、硬化性血管瘤等），71例健康人对照血清。2. 将标准品，质控品，已经稀释后的血清样本加入96孔板相应位置，每孔加样100 μl；将96孔板置于旋转混合仪，室温，1000rpm，震荡混合1min，贴上封板膜，放入37℃恒温孵箱，静止孵育90min；将96孔板置于磁力板上，静置1min后甩掉孔内液体。
3. 将96孔板从磁力板上取下，往反应板各孔加入120 μl洗涤液，将96孔板置于旋转混合仪，室温、1000rpm，震荡混合1min；将反应板移出旋转混合仪，置于磁力板，静置1min后，甩掉孔内液体。重复此步骤，将微球洗涤2次。
（三）二抗孵育
1. 将藻红蛋白标记的荧光二抗工作液加入各孔，将96孔板置于旋转混合仪，室温条件下1000rpm震荡混合1min，贴上封板膜，放入37℃恒温孵箱，静止孵育60min；
2. 将96孔板从磁力板上取下，往反应板各孔加入120 μl洗涤液，将96孔板置于旋转混合仪，室温、1000rpm，震荡混合1min；将反应板移出旋转混合仪，置于磁力板，静置1min后，甩掉孔内液体。重复此步骤，将微球洗涤2次。
（四）血清自身抗体表达水平检测
血清自身抗体含量检测采用美国 Luminex 200(Luminex公司) ，各指标在血清中的浓度由中位荧光强度( median fluorescent intensities，MFI) 直接反映。往二抗孵育后各孔内加入100 μl分析缓冲液，置于旋转混合仪，1000rpm、3min，立即上机读板。
（五）统计学分析
统计学分析采用 Graph Pad 6 及 Medcalc 软件进行数据分析。受试者工作特征(ROC) 曲线用于指标临床诊断最佳切点即 Cut-off 值，以及相应敏感性和特异性等的分析。
实施例7 各抗原标志物对应自身抗体在肺癌人群中表达水平的检测
将实施例1及实施例5中重组表达的肿瘤相关抗原按照实施例6中微球的流式免疫荧光检测方法，检测肺癌患者血清中相应自身抗体表达水平。
各抗原标志物包括CAGE、ANXA1、GBU4-5、PGP9.5、ZIC2、ELAVL3、ENO1、SOX1、SPAG9、PLG、HNRPA1、DNAJB1、EFHD2、GAD2、NPM1、APEX1、TP53、NY-ESO-1、SOX2、GAGE7、MAGEA1、S100A10、MAGEA4、PARP1、CRYAA、BIRC7、BRAF、CDKN2A、CCNB1、IGFBP2、MUC1、EEF2、PGAM1和CDK2。检测135例确诊的未经治疗的早期肺癌患者人群、71例肺部良性结节人群及25例健康体检人群共三组血清标本，各标志物自身抗体在肺癌人群、良性结节人群、以及健康人群的浓度分别如附图7所示，各标志物敏感性和特异性分析如本发明所述的表2所示。
表2 各抗原标志物的临床诊断价值敏感性特异性分析
其中TP53、SOX2、ESO-1、PGP9.5、CAGE、GAGE7等6个标志物，肺癌组测定值显著高于健康体检组和结节组，提示这6个标志物在肺癌筛查鉴别的重要性，其中TP53、SOX2、ESO-1、CAGE四种标志物在肺癌中的检出浓度相比良性结节和健康组高，常常出现强阳性信号，提示这四种标志物具有较高的特异性。
GBU4-5、MAGEA1、ANXA1三个抗原标志物在肺癌中的检出敏感性与两组对照组差异不显著，与国外的研究报道有较大出入，考虑到国内、外研究所采用的患者人种不同，提示GBU4-5、IGFBP2、ELAVL3（HuC）用于中国人种的检测不能取得满意效果，必须针对性得对于中国人种群的大规模检测，才能筛选出更适合的标志物。
MAGEA4、CDKN2A、UBQLN1、GAD2、DNAJB1、EFHD2在肺癌组中的分布水平显著高于健康组，但与结节组相比，两组间差异小于健康组，提示这七个标志物对于健康人群具有较高的鉴别能力，但对于肺部良性病变患者较差，需要联合其他指标，才能提高检测的准确度。
ZIC2、ANXA1、NPM1在健康组中有时出现强阳性信号，但其浓度中位数与肺癌组有较大差异，提示这三种标志物虽然具有较高的敏感性，但特异性不足。
本发明还筛选到PARP1、APEX1、PLG、SOX1四个未经报道用于肺癌筛查的标志物，因此具有非常高的诊断价值，PARP1在三组检测人群中，检测14例肺癌阳性，6例结节假阳性，灵敏度10.4%，特异性93.8%；APEX1检出13例肺癌阳性，4例结节及1例健康假阳性，灵敏度9.6%，特异性94.8%；PLG检出16例肺癌阳性，4例结节及2例健康假阳性，敏感度11.9%，特异性93.8%；SOX1检出14例肺癌阳性，6例结节假阳性，敏感度10.4%，特异性93.8%。
此外，本发明创新性的对筛选的标志物进行了相应的IgM型自身抗体检测，突破性地筛选到了CRYAA、S100A10、MUC1、HNRPA1四个标志物的IgM型自身抗体具有较好的临床诊断意义，其中CRYAA检出13例肺癌阳性，3例结节及1例健康假阳性，敏感度9.6%，特异性95.8%；S100A10检出15例肺癌阳性，3例结节假阳性，敏感度11.1%，特异性96.9%；MUC1检出12例肺癌阳性，4例结节及1例健康假阳性，敏感度8.9%，特异性94.8%；HNRPA1检出9例肺癌阳性，1例健康假阳性，敏感度6.7%，特异性99.0%。本发明所做的研究表明，对同一标志物可分别进行相应的IgG与IgM型自身抗体的检测，为今后类似产品的开发，提供了更加宽广的思路。
实施例8 抗原组合及临床意义
1.选取的不同抗原标志物的组合如下：
对照组合01：P53、MAGEA1、GAGE7、PGP9.5、MAGEA4、Annexin1、SOX2、GBU4-5（参考文献：CN103869086B，文献报道该组合采用ELISA检测方法的敏感性62.5%、特异性87.3%）；
对照组合02：p53、MAGEA1、GAGE7、PGP9.5、MAGEA4、NY-ESO-1、Annexin1（参考文献：CN103869086B，文献报道该组合采用ELISA检测方法的敏感性47.5%、特异性92.7%）；
对照组合03：p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, MAGE A4, HuD, SOX2-B（参考文献: CJ. Chapman, GF. Healey, A Murray, et al. EarlyCDT®-Lung test: improvedclinical utility through additional autoantibody assays [J]. Tumour Biol.2012 Oct; 33(5): 1319-1326，该文献报道的此组合的敏感性为41 %，特异性为91 %，该组合也是采用ELISA检测方法）。
2.选取的不同标志物抗原组合的敏感性（真阳性率）与特异性（真阴性率），其测试结果具体见表3：
表3 各生物标志物组合的检测效果
利用本发明的自身抗体谱液态芯片检测平台，本发明所述的46种不同组合，其敏感性介于46.7%~87.4%，特异性介于74.0%~93.8%之间。对照组合01、对照组合02以及对照组合03，其分别为国内外两个类似产品的抗原组合，其也通过本发明所述的检测平台及检测方法，均为通过检测一组7-8个标志物，来评估患者患肺癌的风险，其敏感性41.5~46.7%，特异性86.5~87.5%；本发明通过不断优化标志物组合，检测性能相较于国内外的两个类似产品，在敏感性及特异性上，均有了大幅提高。例如通过减少标志物数量（组合03，共计6个标志物），获得了比对比组合更高的敏感性和特异性。进一步增加标志物数量，检测的敏感性有所提高，但同时，由于标志物数量的增加，使得检出的假阳性出现明显的累加效应，特异性出现下降，这提示我们单靠通过堆砌标志物数量的方法并不能有效提高试剂盒性能，应将标志物数量控制在合理范围，通过优化标志物的组合，才能取得敏感性和特异性的平衡，获得满意的结果。本发明所述的组合18，其检测的特异性达到89.6%，敏感性达到80.0%。本发明所述的组合42，其检测的特异性达到89.6%，敏感性达到81.5%。本发明所述的组合44，采用了较少的标志物，降低了检测成本，其检测的特异性达到91.7%，敏感性达到73.3%。另外本发明采用液态悬浮芯片检测平台可以高通量的对多标志物进行联检，比传统的ELISA方法具有高通量检测的优势。
Claims (13)
1.一种生物标志物组合在制备早期肺癌诊断或不确定性肺小结节良恶性鉴别的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物组合选自以下组：
1）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、ELAVL3；
2）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、HNRPA1；
3）PLG、APEX1、PARP1、PGP9.5、TP53、MAGEA1、CDKN2A、SPAG9、NY-ESO-1、MAGEA4、GAGE7、EEF2、BRAF、CAGE、GBU4-5、SOX2、GAD2、CRYAA；
所述生物标志物用于检测IgG型或IgM型自身抗体，以用于早期肺癌诊断或不确定性肺小结节良恶性的鉴别。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物含有标签肽。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标签肽包括：His标签、streptavidin标签、avidin标签、生物素标签、GST标签、C-myc标签、Flag标签和HA标签中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物标志物由大肠杆菌、酵母或昆虫细胞表达；和/或，所述生物标志物通过Ni亲和层析、离子交换层析、分子筛、透析、超滤或疏水层析纯化。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含校准品。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述校准品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G和重组人抗标签肽免疫球蛋白M。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述校准品为9E10嵌合抗体hIgG或9E10嵌合抗体hIgM。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括藻红蛋白标记的抗人免疫球蛋白G及其片段、藻红蛋白标记的抗人免疫球蛋白M及其片段、血清稀释缓冲液、洗涤液、分析缓冲液中的一种或多种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物固定于固相载体上。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述固相载体包括：微球、酶标板微孔或亲和膜。
11. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物标志物与微球直接或间接偶联，所述标签肽为His6 tag和/或C-Myc tag。
12. 如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述生物标志物与微球的直接偶联为：微球- CO-NH -（C-Myc tag）- G4S -（His6 tag）- G4S -生物标志物的氨基酸序列；或微球-CO-NH -（C-Myc tag）- (G4S)2 -生物标志物的氨基酸序列-（His6 tag）；所述间接偶联的步骤包括：
（1）微球与生物素化牛血清白蛋白偶联，生物标志物与Streptavidin结合；
（2）生物素与Streptavidin结合，从而使生物标志物特异的结合到微球。
13. 如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述血清稀释缓冲液为NaCl 300mM，KCl2.7mM，Na2HPO4 8.1 mM，KH2PO4 1.5 mM，5 v/v%驴血清或5 w/v%BSA，0.05 v/v%prcolin300或0.05 w/v%叠氮钠，pH 7.0-8.0；所述洗涤液为NaCl 0.137M，KCl 2.7mM，Na2HPO4 8.1 mM，KH2PO4 1.5mM，0.05 v/v%吐温-20，0.03 v/v% prcolin300，pH 7.6；所述分析缓冲液为NaCl 300mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 8.1mM，KH2PO4 1.5mM，1 v/v% 驴血清或1 w/v %BSA，0.05 v/v% prcolin300或0.05 w/v %叠氮钠；其中所述v/v%为体积百分比，所述w/v%为质量体积比。
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