CN116444680B - 一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

一种ralgds-krt8-aif1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RALGDS‑KRT8‑AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用，通过分别筛选RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白中的具有强抗原决定簇的抗原片段，并化学合成RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段、AIF1抗原片段串联的编码基因，制备融合蛋白，用于自身抗体检测，提高了肿瘤患者样本中的自身抗体检出率，可以高效预测个体是否肺癌患者，具有高灵敏度，高特异性的优点，降低了临床漏检现象的发生，具有重要的科学意义和临床应用价值。

Description

一种RALGDS-KRT8-AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种RALGDS-KRT8-AIF1融合肿瘤抗原蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70％～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。
自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。在癌症发生早期，肿瘤相关抗原的暴露即可被人体免疫系统识别，产生肿瘤相关自身抗体，甚至在外周血中也可维持高水平的自身抗体，可被本领域常规技术手段(例如酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked Immunosorbent Assay，ELISA))灵敏地检测到。本领域公认，肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的较好指标，利用肿瘤诱导产生的自身抗体来反应患者肿瘤发生机疾病进展过程，正成为寻找用于肿瘤早期诊断及预后判断新靶标的重要方向。
但是，由于肿瘤的异质性和不同个体间免疫系统反应的不同，单个肿瘤自身抗体在肿瘤患者中的敏感性不够高(通常为5％～20％)。因此，单一的自身抗体生物标志物不足以提供肺癌发生、进展的信息，联合使用多个不同的肿瘤自身抗体更能增加检测敏感性，但是这样检测具有步骤繁多且花费较高，效率低，特异性不足，时间长等缺点。因此，急需提供一种能够提高肺癌自身抗体的检出率，增加检测敏感性的方法。
RALGDS、KRT8、AIF1是三个肺癌相关肿瘤自身抗原。RALGDS是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活RalA或RalB的GTP酶活性并在细胞内转运中发挥重要作用，也是KRAS信号通路的重要效应分子。KRAS作为肺癌的一种驱动基因，对肺癌的进程起着至关重要的作用，而RALGDS的水平正是KRAS基因功能的体现。KRT8被发现在包括肺癌的多种癌症中都有高表达现象，并且它的高表达对于肺癌患者来说是个预后不良信号。AIF1分子是一种肺癌预后相关分子，曾被选入GBOCRL-IIPr分子组合中，用于泛癌种预后情况的评估。单独使用它们作为肺癌自身抗体检测的抗原分子时，都有一定的漏检率。因此有必要制备融合这三种抗原的表位研制融合抗原，来实现高敏感性和特异性的肺癌早期检测。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种筛查早期肺癌的融合蛋白，通过分别筛选RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白中的具有强抗原决定簇的抗原片段，并化学合成RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段、AIF1抗原片段串联的编码基因，制备融合蛋白，用于自身抗体检测，可以高效预测个体是否肺癌患者，提高肺癌早期筛查的特异性和敏感性，降低了临床漏检现象的发生，具有重要的科学意义和临床应用价值。
一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段，以及连接这三种抗原片段的连接肽。
本发明综合大量公共数据，比较肺癌患者和正常人群血清中的自身抗体，筛选获得系列能较好地区分肺癌患者正常人群的系列抗原蛋白，并从中进一步筛选到能用于组合制备融合蛋白的RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白。
所述RALGDS抗原片段为从RALGDS蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段；所述KRT8抗原片段为从KRT8蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段；所述AIF1抗原片段为从AIF1蛋白氨基酸序列中挑选获得的，能引起最强抗原反应的抗原片段。
所述RALGDS蛋白具有如序列表Seq ID NO.6所示的氨基酸序列，KRT8蛋白具有如序列表Seq ID NO.7所示的氨基酸序列，AIF1蛋白具有如序列表Seq ID NO.7所示的氨基酸序列。
本发明采用RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段制备的融合蛋白，作为肺癌肿瘤生物标志物进行检测，其肺癌患者的检出率明显高于单一蛋白时的检出率。
进一步地，所述RALGDS抗原片段具有如序列表Seq ID NO.1所示的氨基酸序列；所述KRT8抗原片段具有如序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列；所述AIF1抗原片段具有如序列表Seq ID NO.3所示的氨基酸序列。
所述的RALGDS蛋白片段为RALGDS蛋白中第210个氨基酸至第390个氨基酸；所述的KRT8蛋白片段为KRT8蛋白中第252个氨基酸至第483个氨基酸；所述的AIF1蛋白片段为AIF1蛋白中第1个氨基酸至第147个氨基酸。
进一步地，所述RALGDS抗原片段分布在融合蛋白的N端、AIF1抗原片段分布在融合蛋白的C端、KRT8抗原片段分布在RALGDS抗原片段和AIF1抗原片段之间。
本发明经研究证明，RALGDS、KRT8和AIF1三种抗原片段在不同排列顺序组合的融合蛋白，检测性能也存在区别，优选采用RALGDS抗原片段分布在融合蛋白的N端、AIF1抗原片段分布在融合蛋白的C端、KRT8抗原片段分布在RALGDS抗原片段和AIF1抗原片段之间，这样的排列顺序制备的RALGDS-KRT8-AIF1融合蛋白，免疫原性更强，在肺癌检测中具有更好的敏感性。
进一步地，所述融合蛋白具有如序列表Seq ID NO.4所示的氨基酸序列。
进一步地，所述的RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段之间均通连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列为谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸(该连接肽能尽量让抗原表位充分暴露)。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白的编码基因，所述基因能够编码如上所述的融合蛋白。
进一步地，所述基因具有如序列表Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。
在一些方式中，所述基因序列前后两端分别有Ncol和Ndel两种限制性内切酶。
再一方面，本发明提供了一种用于预测个体是否肺癌患者的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的融合蛋白，或如上所述的编码基因编码的融合蛋白。
再一方面，本发明提供了如上所述的融合蛋白用于制备预测个体是否肺癌患者的试剂的用途。
再一方面，本发明提供了如上所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选出RALGDS抗原蛋白中含有强抗原决定簇的RALGDS抗原片段，筛选出KRT8抗原蛋白中含有强抗原决定簇的KRT8抗原片段；筛选出AIF1抗原蛋白中含有强抗原决定簇的AIF1抗原片段；
(2)化学合成RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段串联的编码基因，所述编码基因具有如序列表Seq ID NO.5所示的核苷酸序列；
(3)构建含有编码基因的重组质粒；
(4)重组质粒转化大肠杆菌，挑选阳性表达菌。
在一些方式中，步骤(1)利用在线分析工具分析，筛选出RALGDS蛋白片段(RALGDS蛋白中含有较强抗原决定簇的第210个氨基酸至第390个氨基酸)、KRT8蛋白片段(KRT8蛋白中含有较强抗原决定簇的第252个氨基酸至483个氨基酸)、AIF1蛋白片段(AIF1蛋白中含有较强抗原决定簇的第1个氨基酸至第147个氨基酸)。
进一步地，步骤(3)为：提取PGEM-5zf，用Ncol和Ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用Ncol和Ndel双酶切化学合成的编码基因，电泳回收双酶切的基因片段；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用T4连接酶连接。
在一些方式中，提取PGEM-5zf，用Ncol和Ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用Ncol和Ndel双酶切化学合成的所述融合蛋白基因片段，电泳回收双酶切的基因片段，-20℃备用；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒为PGEM-5zf-RALGDS+KRT8+AIF1。
进一步地，步骤(4)为：将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)涂布含氨苄青霉素的LB平板上恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落，提取质粒，分别用Ndel和Ncol双酶切，酶切后跑电泳，看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌。
在一些方式中，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素(60ug/ml)的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落(质粒PGEM-5zf转化菌)，分别提取质粒，分别用Ndel和Ncol双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌。
进一步，所述的制备方法还包括步骤(5)：阳性表达菌表达目的蛋白。
将上述阳性表达菌接种至2ml LB培养基(60ug/ml氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5mmol/l IPTG，37℃继续诱导6h，离心收集沉淀菌体，将沉淀菌体进行破碎，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，上清中得到表达的目的蛋白。
进一步，所述的制备方法还包括步骤(6)：亲和层析柱分离纯化。
挑选高效表达的重组蛋白工程菌单菌落，接种到含100ml LB液体培养基的三角瓶中，加氨苄青霉素至终浓度60ug/ml，置37℃摇床内过夜。次日按菌液和LB培养基1:10接种至1000ml LB(氨苄青霉素60ug/ml)培养液的三角瓶中，培养4h，加IPTG(终浓度为0.5mmol/l)，37℃条件下继续诱导6h，将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心，高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mM Tris-Hcl、10mMEDTA、15mM NaCL、10mM DTT)内，冰浴超声菌体，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，收集菌液上清。
用平衡液(20mM PB PH7.4)冲洗平衡镍离子亲和层析柱后，将超声收集的菌液上清直接上柱，上样流速1.5ml/min，上样结束后用平衡液洗涤柱子，依次用含20、50、100、200、500mM浓度咪唑的洗脱液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白。
再一方面，本发明提供了一种预测个体是否肺癌患者的系统，所述系统包括数据分析模块；所述数据分析模块用于分析生物标志物的检出情况，所述生物标志物为如上所述的融合蛋白的自身抗体。
本发明所述的生物标志物为自身抗体，进一步，所述的自身抗体为抗RALGDS抗体、抗KRT8抗体和抗AIF1抗体。
进一步地，所述系统还包括生物标志物检测模块、数据输入/输出界面；所述生物标志物检测模块用于通过融合蛋白检测血清中的自身抗体含量，获得检测值；数据输入界面用于输入融合蛋白自身抗体检测值，待数据分析模块分析后，数据数据输出界面用于输出肺癌的筛查结果。
进一步地，所述数据分析模块的分析方法为：用融合蛋白作为抗原，检测血清中是否存在高于阈值的RALGDS、KRT8和/或AIF1自身抗体，存在即判断为潜在肺癌患者，不存在判断为正常人群。
本发明提供的用于预测个体是否肺癌患者的融合蛋白具有以下有益效果：
1、挑选RALGDS蛋白、KRT8蛋白和AIF1蛋白制备融合蛋白，其用于筛查早期肺癌时的检出率明显高于单一蛋白的检出率；
2、筛选出的RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段为抗原性强的片段，通过甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸将三个抗原性比较强的片段连接后，提高了肿瘤患者样本中的抗RALGDS抗体、抗KRT8抗体和抗AIF1抗体的检出率，降低了临床漏检现象的发生；
3、可高效预测个体是否肺癌患者，明显具有高灵敏度，高特异性的优点，具有重要的科学意义和临床应用价值。
详细说明
(1)筛查或者检测
这里的筛查或者检测是指对于样本中的生物标志物进行检测或者化验，或者目的生物标志物的含量，例如绝对含量或者相对含量，然后通过目标标志物是否存在或者数量的多少来说明提供样本的个体是否可能具有或患某种疾病，或者具有某种疾病的可能性。这里的筛查与检测的含义可以互换。这种检测的结果或者筛查的结果是不能直接作为患病的直接结果，而是一种中间结果，如果获得直接的结果，还需通过病理学或者解剖学等其它辅助手段才能确认患有某种疾病。例如，本发明提供了一种与个体是否肺癌患者具有关联性的生物标志物，这些标志物含量的变化与个体是否肺癌患者具有直接的关联性。
(2)标志物或生物标志物与个体是否肺癌患者有效的联系
标志物和生物标志物在本发明中具有相同的含义。这里的联系是指某种标志物在样本中出现或者含量的变化与特定治疗方法的疗效具有直接的关联性，例如含量的相对升高或者降低，表示该种治疗方法的具有有益效果的可能性更高或更低。
针对本发明提供的肺癌患者的融合蛋白自身抗体生物标志物，其有无或含量的升高或者降低与该个体是否肺癌患者有着直接联系。
(3)在本发明中，术语“抗原”或术语“抗原蛋白”可互换使用。术语“抗体”和“自身抗体”在本发明中可以互换。
附图说明
图1为实施例1中抗原蛋白Claudin2用于肺癌诊断的ROC曲线；
图2为实施例1中抗原蛋白MAGEA3用于肺癌诊断的ROC曲线；
图3为实施例1中抗原蛋白RALGDS用于肺癌诊断的ROC曲线；
图4为实施例1中抗原蛋白KRT8用于肺癌诊断的ROC曲线；
图5为实施例1中抗原蛋白AIF1用于肺癌诊断的ROC曲线；
图6为实施例1中抗原蛋白RALGDS、KRT8与AIF1组合用于肺癌诊断的ROC曲线；
图7为实施例2中RALGDS蛋白中不同片段用于临床样品中自身抗体含量检测评价散点关系图；
图8为实施例2中KRT8蛋白中不同片段用于临床样品中自身抗体含量检测评价散点关系图；
图9为实施例4中RALGDS、KRT8和AIF1三种抗原片段不同排列顺序制备的融合蛋白检测临床样品的对比图；
图10为实施例5中采用融合蛋白分别检测肺癌人群血清和正常人血清的结果图；
图11为实施例5中采用分别采用融合蛋白和独立的RALGDS、KRT8或AIF1蛋白检测临床样品的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1抗原蛋白的筛选
本实施例通过汇总综合大量公共数据统计的与肺癌相关的抗原蛋白169种，并对92例诊断为肺癌患者的血清和92例正常人群的血清进行针对纯化的抗原蛋白的自身抗体检测，希望找到与筛查肺癌患者的更具相关性的自身抗体生物标志物。经初筛(通过寻找正相关和负相关抗原，寻找与肺癌诊断性能具有好和差的预测效果的相关性抗原)，共找到如表1所示的20种自身抗体的抗原蛋白，这20种自身抗体与判断个体是否为肺癌患者具有较显著的相关性。其中Uniprot数据库的网址为www.uniprot.org。
表1、初筛获得的20种自身抗体的抗原蛋白
抗原蛋白 Uniprot数据库序列号 抗原蛋白 Uniprot数据库序列号
CIP2A Q8TCG1 TXNDC2 Q86VQ3
CTAG2 O75638 RASSF7 Q02833
KRT8 P05787 LIN28B Q6ZN17
SS18 Q15532 Claudin2 P57739
NPM1 P06748 Livin-1 Q96CA5
MAGEB1 P43366 MAGEA3 P43357
CDK2 P24941 BARD1 Q99728
PBRM1 Q86U86 PAGE3 Q5JUK9
RALGDS Q12967 CT47A Q5JQC4
Trim21 P19474 AIF1 P55008
对参与研究的92例肺癌患者和92例正常人群的血清进行检测，检测患者血清中的20种候选自身抗体分子。同时根据实体肿瘤的疗效评价标准1.1版(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors RECIST Version 1.1，RECIST v1.1)，对这些抗原蛋白的肺癌诊断性能进行评估。分别检测20种候选自身抗体在肺癌患者血清和正常人群血清中的含量，自身抗体含量通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行检测，检测的OD值，绘制了每种自身抗体水平与是否为肺癌血清的评价散点关系图，结果发现，20种候选自身抗体分子中，有5种自身抗体，在肺癌患者血清中的检测OD值，有明显高于正常人群血清的趋势，差异十分显著；而其余15种自身抗体的差异明显不如该5种自身抗体。
该5种自身抗体的抗原蛋白分别为Claudin2、MAGEA3、RALGDS、KRT8、AIF1抗原蛋白，其用于诊断是否为肺癌的敏感性、特异性、AUC值见表1，ROC曲线见图1～图5。
表1、筛选出5种抗原蛋白的肺癌诊断性能
为了制备融合蛋白，本实施例还对筛选获得的5种抗原蛋白进行两重或三重组合，挑选最合适的多重组合抗原蛋白用于制备早期肺癌高诊断性能的融合蛋白。5种抗原蛋白进行多重组合后，用于诊断是否为肺癌的敏感性、特异性、AUC值见表2。
表2、抗原蛋白多重组合后的肺癌诊断性能
序号 抗原蛋白组合 敏感性(％) 特异性(％) AUC值
1 Claudin2+MAGEA3 40.43 89.36 0.7082
2 Claudin2+RALGDS 32.72 89.14 0.6837
3 Claudin2+KRT8 36.15 90.28 0.6923
4 Claudin2+AIF1 37.22 86.73 0.6752
5 MAGEA3+AIF1 31.54 87.38 0.6107
6 MAGEA3+RALGDS 36.26 88.69 0.6385
7 MAGEA3+KRT8 29.37 84.01 0.6298
8 RALGDS+KRT8 33.28 88.34 0.6853
9 RALGDS+AIF1 32.15 86.77 0.6324
10 KRT8+AIF1 35.86 85.21 0.6197
11 Claudin2+MAGEA3+RALGDS 46.25 92.37 0.7659
12 Claudin2+MAGEA3+KRT8 42.78 90.54 0.7119
13 Claudin2+MAGEA3+AIF1 43.82 91.36 0.7324
14 Claudin2+RALGDS+KRT8 49.29 92.55 0.8022
15 Claudin2+RALGDS+AIF1 37.78 93.26 0.7109
16 MAGEA3+RALGDS+KRT8 45.88 93.68 0.7431
17 MAGEA3+RALGDS+AIF1 38.63 91.87 0.7045
18 RALGDS+KRT8+AIF1 54.57 94.12 0.8131
由表2可以看出，采用RALGDS抗原蛋白、KRT8抗原蛋白与AIF1抗原蛋白进行三重组合时，其对于肺癌的诊断性能最佳，敏感性达到54.57％，特异性达到94.12％，AUC值达到0.8131，ROC曲线如图6所示。因此优选采用RALGDS抗原蛋白、KRT8抗原蛋白与AIF1抗原蛋白进行组合用于融合蛋白的制备。
实施例2RALGDS、KRT8和AIF1抗原片段的筛选
本实施例还分别制备RALGDS蛋白(Seq ID NO.6)、KRT8蛋白(Seq ID NO.7)中的不同片段(制备方法同实施例3，先合成编码基因，再构建含有编码基因的重组质粒，转化大肠杆菌，挑选阳性表达菌表达蛋白)，用于92例肺癌患者血清和92例正常人群血清的自身抗体检测(检测方法同实施例5，采用抗原蛋白间接酶联免疫法检测)，检测自身抗体的OD值，结果如图7和图8所示，其中图7为RALGDS蛋白中不同片段用于临床样品中自身抗体含量检测评价散点关系图，图8为KRT8蛋白中不同片段用于临床样品中自身抗体含量检测评价散点关系图。
根据图7可以看出，RALGDS蛋白片段中位于第210个氨基酸至第390个氨基酸的片段是能够引起更强抗原反应的片段，因此优选采用该片段来制备融合蛋白。
根据图8可以看出，KRT8蛋白片段中位于第252个氨基酸至第483个氨基酸的片段是能够引起更强抗原反应的片段，因此优选采用该片段来制备融合蛋白。
AIF1蛋白由于本身序列较短，而且全长序列都具有较强抗原决定簇，因此本实施例未对AIF1蛋白进行筛选，也就是说AIF1抗原片段就是全长的AIF1蛋白(Seq ID NO.3)，直接可用于制备融合蛋白。
实施例3融合蛋白的制备
本实施例制备的融合蛋白为包含RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段的融合蛋白，中间由连接肽连接。其中RALGDS蛋白片段分布在融合蛋白的氨基端，KRT8蛋白片段分布在中间，AIF1蛋白片段分布在融合蛋白的羧基端，且RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段之间通过谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸连接。其中RALGDS蛋白片段为RALGDS蛋白中第210个氨基酸至第390个氨基酸，KRT8蛋白片段为KRT8蛋白中第252个氨基酸至第483个氨基酸，AIF1蛋白片段为AIF1蛋白中第1个氨基酸至第147个氨基酸。连接肽的氨基酸序列为谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸。该融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示，编码基因序列如Seq ID NO.5所示，具体制备方法为：
(1)采用DNA固相合成法，化学合成该融合蛋白的编码基因序列(Seq ID NO.5)。
(2)表达RALGDS蛋白片段、KRT8蛋白片段和AIF1蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建
提取PGEM-5zf，用Ncol和Ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用Ncol和Ndel双酶切化学合成的自身抗原融合蛋白基因片段，电泳回收双酶切的基因片段，-20℃备用；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒为PGEM-5zf-RALGDS+KRT8+AIF1。
(3)重组质粒的筛选和鉴定
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素(60ug/ml)的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落(质粒PGEM-5zf转化菌)，分别提取质粒，分别用Ndel和Ncol双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌。
(4)重组蛋白工程菌高效表达
将阳性表达菌接种至2ml LB培养基(60ug/ml氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5mmol/l IPTG，37℃继续诱导6h，离心收集沉淀菌体，将沉淀菌体进行破碎，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，上清中得到表达的目的蛋白。
(5)表达蛋白的纯化
挑选高效表达的重组蛋白工程菌单菌落，接种到含100ml LB液体培养基的三角瓶中，加氨苄青霉素至终浓度60ug/ml，置37℃摇床内过夜。次日按菌液和LB培养基1:10接种至1000ml LB(氨苄青霉素60ug/ml)培养液的三角瓶中，培养4h，加IPTG(终浓度为0.5mmol/l)，37℃条件下继续诱导6h，将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心，高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mM Tris-Hcl、10mMEDTA、15mM NaCL、10mM DTT)内，冰浴超声菌体，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，收集菌液上清。
用平衡液(20mMPB PH7.4)冲洗平衡镍离子亲和层析柱后，将超声收集的菌液上清直接上柱，上样流速1.5ml/min，上样结束后用平衡液洗涤柱子，依次用含20、50、100、200、500mM浓度咪唑的洗脱液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白。制得融合蛋白，纯度达90％以上。
实施例4RALGDS、KRT8和AIF1抗原片段组合顺序的筛选
本实施例采用实施例3提供的方法制备融合蛋白，其中RALGDS、KRT8和AIF1三种抗原片段在组合成融合蛋白时，还考察了三种不同的组合排序，分别为：1、AIF1-KRT8-RALGDS；2、RALGDS-KRT8-AIF1；3、KRT8-AIF1-RALGDS。制备的三种融合蛋白分别用于92例肺癌患者血清和92例正常人群血清的自身抗体检测(检测方法同实施例5，采用抗原蛋白间接酶联免疫法检测)，检测自身抗体的OD值，结果如图9所示。
由图9可以看出，RALGDS、KRT8和AIF1三种抗原片段在不同排列顺序组合的融合蛋白，检测性能也存在区别，优选采用RALGDS-KRT8-AIF1融合蛋白，免疫原性更强，在肺癌检测中具有更好的敏感性。
实施例5融合蛋白的检测性能
本实施例采用实施例3纯化制得的融合蛋白，用碳酸盐缓冲液(50mM，PH9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的PBS37℃水浴封闭2h，洗涤后4℃备用。
采用融合蛋白间接酶联免疫法检测抗肺癌自身抗原阳性血清(即肺癌人群血清)及正常人血清，具体检测方法为：间接酶联免疫法检测肺癌患者及健康人血清中自身抗体的反应性。血清或血浆样本用磷酸盐缓冲稀释1:110倍，加入微孔进行反应(50毫升/孔)。用洗液冲洗未结合的血清或血浆成分后，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-人IgG进行反应。然后加入反应底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色。加入终止溶液(1NHCl)，吸亮度为450nm单光谱进行酶标仪进行读值(OD)。结果如图10所示。由图10显示，融合蛋白与肺癌人群血清反应的免疫原性较强，不与正常人血清反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
再利用此融合抗原和独立的RALGDS、KRT8和AIF1蛋白作比较，结果如图11所示，可以看出，融合蛋白的免疫原性要显著强于单独蛋白分子，证明融合蛋白在肺癌检测中具有更好的敏感性，经检测，其敏感性达到59.21％，特异性达到96.34％，AUC值达到0.8364，明显高于独立RALGDS、KRT8或AIF1蛋白时的检测性能，而且比RALGDS、KRT8和AIF1全长组合时(0.8131)还有进一步提高。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
Seq ID NO.1
RALGDS抗原片段：
EDFCQPPDFPCLKQLVAYVQLNMPGSDLERRAHLLLAQLEHSEPIEAEPEALSPVPALKPTPELELALTPARAPSPVPAPAPEPEPAPTPAPGSELEVAPAPAPELQQAPEPAVGLESAPAPALELEPAPEQDPAPSQTLELEPAPAPVPSLQPSWPSPVVAENGLSEEKPHLLVFPPDLV
Seq ID NO.2
KRT8抗原片段：
RSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYAGGLSSAYGGLTSPGLSYSLGSSFGSGAGSSSFSRTSSSRAVVVKKIETRDGKLVSESSDVLPK
Seq ID NO.3
AIF1抗原片段：
MSQTRDLQGGKAFGLLKAQQEERLDEINKQFLDDPKYSSDEDLPSKLEGFKEKYMEFDLNGNGDIDI
MSLKRMLEKLGVPKTHLELKKLIGEVSSGSGETFSYPDFLRMMLGKRSAILKMILMYEEKAREKEKPTGPPAKKAISELP
Seq ID NO.4
融合蛋白的氨基酸序列：
EDFCQPPDFPCLKQLVAYVQLNMPGSDLERRAHLLLAQLEHSEPIEAEPEALSPVPALKPTPELELALTPARAPSPVPAPAPEPEPAPTPAPGSELEVAPAPAPELQQAPEPAVGLESAPAPALELEPAPEQDPAPSQTLELEPAPAPVPSLQPSWPSPVVAENGLSEEKPHLLVFPPDLVEAAAKEAAAKEAAAKRSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYAGGLSSAYGGLTSPGLSYSLGSSFGSGAGSSSFSRTSSSRAVVVKKIETRDGKLVSESSDVLPKEAAAKEAAAKEAAAKMSQTRDLQGGKAFGLLKAQQEERLDEINKQFLDDPKYSSDEDLPSKLEGFKEKYMEFDLNGNGDIDIMSLKRMLEKLGVPKTHLELKKLIGEVSSGSGETFSYPDFLRMMLGKRSAILKMILMYEEKAREKEKPTGPPAKKAISELP
Seq ID NO.5
融合蛋白的基因序列：
GAGGATTTCTGTCAACCTCCGGACTTTCCCTGCCTCAAGCAGCTGGTGGCCTACGTGCAGCTCAACATGCCAGGCTCAGACCTGGAGCGCCGTGCCCACCTTCTCCTGGCCCAGCTGGAGCACTCGGAACCCATTGAGGCAGAGCCTGAGGCTCTGTCACCAGTGCCAGCTCTAAAACCAACTCCAGAGCTCGAGCTAGCTCTAACACCAGCTCGAGCACCCAGCCCAGTGCCGGCTCCAGCCCCGGAGCCAGAGCCAGCTCCAACACCAGCTCCAGGTTCAGAGCTAGAAGTAGCTCCAGCACCAGCTCCGGAGCTCCAGCAGGCTCCAGAGCCAGCTGTGGGACTAGAATCGGCTCCAGCGCCAGCTCTGGAACTAGAGCCAGCTCCAGAACAGGATCCAGCTCCCTCACAAACTCTAGAGCTGGAGCCAGCTCCAGCACCAGTTCCATCATTACAGCCTTCCTGGCCTTCACCTGTGGTTGCAGAGAACGGGCTGAGTGAGGAGAAGCCTCACCTCTTGGTGTTCCCTCCAGATCTGGTGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGCGCTCCCTGGACATGGACAGCATCATTGCTGAGGTCAAGGCACAGTACGAGGATATTGCCAACCGCAGCCGGGCTGAGGCTGAGAGCATGTACCAGATCAAGTATGAGGAGCTGCAGAGCCTGGCTGGGAAGCACGGGGATGACCTGCGGCGCACAAAGACTGAGATCTCTGAGATGAACCGGAACATCAGCCGGCTCCAGGCTGAGATTGAGGGCCTCAAAGGCCAGAGGGCTTCCCTGGAGGCCGCCATTGCAGATGCCGAGCAGCGTGGAGAGCTGGCCATTAAGGATGCCAACGCCAAGTTGTCCGAGCTGGAGGCCGCCCTGCAGCGGGCCAAGCAGGACATGGCGCGGCAGCTGCGTGAGTACCAGGAGCTGATGAACGTCAAGCTGGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTGGAGGGCGAGGAGAGCCGGCTGGAGTCTGGGATGCAGAACATGAGTATTCATACGAAGACCACCAGCGGCTATGCAGGTGGTCTGAGCTCGGCCTATGGGGGCCTCACAAGCCCCGGCCTCAGCTACAGCCTGGGCTCCAGCTTTGGCTCTGGCGCGGGCTCCAGCTCCTTCAGCCGCACCAGCTCCTCCAGGGCCGTGGTTGTGAAGAAGATCGAGACACGTGATGGGAAGCTGGTGTCTGAGTCCTCTGACGTCCTGCCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGATGAGCCAAACCAGGGATTTACAGGGAGGAAAAGCTTTCGGACTGCTGAAGGCCCAGCAGGAAGAGAGGCTGGATGAGATCAACAAGCAATTCCTAGACGATCCCAAATATAGCAGTGATGAGGATCTGCCCTCCAAACTGGAAGGCTTCAAAGAGAAATACATGGAGTTTGACCTTAATGGAAATGGCGATATTGATATCATGTCCCTGAAACGAATGCTGGAGAAACTTGGAGTCCCCAAGACTCACCTAGAGCTAAAGAAATTAATTGGAGAGGTGTCCAGTGGCTCCGGGGAGACGTTCAGCTACCCTGACTTTCTCAGGATGATGCTGGGCAAGAGATCTGCCATCCTAAAAATGATCCTGATGTATGAGGAAAAAGCGAGAGAAAAGGAAAAGCCAACAGGCCCCCCAGCCAAGAAAGCTATCTCTGAGTTGCCC
Seq ID NO.6
RALGDS:
MVQRMWAEAAGPAGGAEPLFPGSRRSRSVWDAVRLEVGVPDSCPVVLHSFTQLDPDLPRPESSTQEIGEELINGVIYSISLRKVQLHHGGNKGQRWLGYENESALNLYETCKVRTVKAGTLEKLVEHLVPAFQGSDLSYVTIFLCTYRAFTTTQQVLDLLFKRYGRCDALTASSRYGCILPYSDEDGGPQDQLKNAISSILGTWLDQYSEDFCQPPDFPCLKQLVAYVQLNMPGSDLERRAHLLLAQLEHSEPIEAEPEALSPVPALKPTPELELALTPARAPSPVPAPAPEPEPAPTPAPGSELEVAPAPAPELQQAPEPAVGLESAPAPALELEPAPEQDPAPSQTLELEPAPAPVPSLQPSWPSPVVAENGLSEEKPHLLVFPPDLVAEQFTLMDAELFKKVVPYHCLGSIWSQRDKKGKEHLAPTIRATVTQFNSVANCVITTCLGNRSTKAPDRARVVEHWIEVARECRILKNFSSLYAILSALQSNSIHRLKKTWEDVSRDSFRIFQKLSEIFSDENNYSLSRELLIKEGTSKFATLEMNPKRAQKRPKETGIIQGTVPYLGTFLTDLVMLDTAMKDYLYGRLINFEKRRKEFEVIAQIKLLQSACNNYSIAPDEQFGAWFRAVERLSETESYNLSCELEPPSESASNTLRTKKNTAIVKRWSDRQAPSTELSTSGSSHSKSCDQLRCGPYLSSGDIADALSVHSAGSSSSDVEEINISFVPESPDGQEKKFWESASQSSPETSGISSASSSTSSSSASTTPVAATRTHKRSVSGLCNSSSALPLYNQQVGDCCIIRVSLDVDNGNMYKSILVTSQDKAPAVIRKAMDKHNLEEEEPEDYELLQILSDDRKLKIPENANVFYAMNSTANYDFVLKKRTFTKGVKVKHGASSTLPRMKQKGLKIAKGIF
Seq ID NO.7
KRT8:
MSIRVTQKSYKVSTSGPRAFSSRSYTSGPGSRISSSSFSRVGSSNFRGGLGGGYGGASGMGGITAVTVNQSLLSPLVLEVDPNIQAVRTQEKEQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKMLETKWSLLQQQKTARSNMDNMFESYINNLRRQLETLGQEKLKLEAELGNMQGLVEDFKNKYEDEINKRTEMENEFVLIKKDVDEAYMNKVELESRLEGLTDEINFLRQLYEEEIRELQSQISDTSVVLSMDNSRSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYAGGLSSAYGGLTSPGLSYSLGSSFGSGAGSSSFSRTSSSRAVVVKKIETRDGKLVSESSDVLPK

Claims (7)

1.一种融合蛋白，其特征在于，包括RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段，以及连接这三种抗原片段的连接肽；所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.4所示。
2.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，能够编码如权利要求1的融合蛋白。
3.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表SeqID NO.5所示。
4.一种用于预测个体是否为肺癌患者的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的融合蛋白，或如权利要求3所述的编码基因编码的融合蛋白。
5.如权利要求1所述的融合蛋白用于制备预测个体是否为肺癌患者的试剂的用途。
6.如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选出RALGDS抗原蛋白中含有强抗原决定簇的RALGDS抗原片段，筛选出KRT8抗原蛋白中含有强抗原决定簇的KRT8抗原片段；筛选出AIF1抗原蛋白中含有强抗原决定簇的AIF1抗原片段；
(2)化学合成RALGDS抗原片段、KRT8抗原片段和AIF1抗原片段串联的编码基因，
所述编码基因的核苷酸序列如序列表Seq ID NO.5所示；
(3)构建含有编码基因的重组质粒；
(4)重组质粒转化大肠杆菌，挑选阳性表达菌。
7.一种预测个体是否为肺癌患者的系统，其特征在于，所述系统包括数据分析模块和权利要求1所述的融合蛋白；所述数据分析模块用于分析生物标志物的检出情况，所述生物标志物为如权利要求1所述的融合蛋白的自身抗体。
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