CN113189344B

CN113189344B - Pdlim4用作胃癌标志物的应用

Info

Publication number: CN113189344B
Application number: CN202110446527.7A
Authority: CN
Inventors: 吕文堂; 陈慕熙; 尤姝
Original assignee: Nanjing Ailan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Ailan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN113189345A; CN113189345B; CN113189344A; CN108872600B; CN108872600A

Abstract

本发明提供了PDLIM4作为胃癌诊断标志物的应用。本发明提供的PDLIM4的应用为PDLIM4作为检测胃癌的蛋白质分子标记。PDLIM4在胃癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在胃细胞中的表达量检测患者是否患有胃癌。

Description

PDLIM4用作胃癌标志物的应用

本申请是申请日为2018年7月9日的中国专利申请201810749863.7“PDLIM4用作胃癌标志物的应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及胃癌的筛查/检测技术领域，更具体地，涉及一种PDLIM4作为胃癌标志物的应用。

背景技术

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。

到目前为止，已有不下10种的基因异常表达被确定与胃癌的发生发展有关，但已确定的胃癌相关基因在胃癌中的异常表达率并不高，胃癌的发病机制至今仍未阐明，胃癌的早期诊断率仍有待提高。此外，在我国传统的胃癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高胃癌患者的生存率，因而寻找新的胃癌相关基因尤其是胃癌高表达基因对于探讨胃癌的发病机制和早期诊断具有重要意义。

PDLIM4(HGNC登录号16501；Entrez Gene登录号为8572；Ensembl登录号为ENSG00000131435；OMIM登录号为603422；UniProtKB登录号为P50479)属于FOZ/LIM蛋白家族，在发育过程中发挥重要作用。

发明内容

通过筛选在人类胃癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在胃癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为PDLIM4。免疫印迹实验证实，PDLIM4的确在胃癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。通过对55对人胃癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验进一步证实了PDLIM4在人类胃癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)，并且血清的免疫学实验也显示了PDLIM4在人类胃癌患者中高表达。

基于PDLIM4与胃癌的这种相关性，PDLIM4可以作为一种蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测胃癌。

因此，本发明的首要目的即在于提供PDLIM4用作检测胃癌的应用。

本发明提供的PDLIM4的应用为，作为用于检测胃癌的蛋白质分子标记物。

本发明提供的PDLIM4用于检测胃癌的蛋白质分子标记物的应用为制备定量蛋白质组技术的试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供PDLIM4的抗体的应用。

本发明提供的PDLIM4的抗体的应用为，用于制备检测胃癌的制剂和/或用于制备检测胃癌的试剂盒。

根据本发明，抗PDLIM4的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明的又一个目的在于提供一种体外检测胃组织中PDLIM4的表达是否异常的方法。

本发明提供的方法.为：检测待测胃组织/血清中PDLIM4的量，并与正常胃组织/血清中的PDLIM4的量进行比较。

鉴于到目前为止，还没有PDLIM4与胃癌的相关性报道。因此，本发明的这一发现将为胃癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。

此外，本发明还涉及以下实施方案：

1.诊断胃癌的方法，所述方法包括：

a)获得个体的疑似癌症组织，

b)测定其中的PDLIM4的表达水平，

c)获得正常个体的同一组织或同一个体的正常组织，和

d)测定其中的PDLIM4的表达水平作为对照表达水平，

e)将b)中获得的PDLIM4的表达水平与d)中获得的PDLIM4的对照表达水平进行比较，当b)中获得的PDLIM4的表达水平与d)中获得的PDLIM4的对照表达水平相比提高时，确定所述个体患有胃癌。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述组织为胃组织。

3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述表达水平通过选自以下的任一方法检测：

(a)检测编码PDLIM4的mRNA，和

(b)检测PDLIM4的蛋白质。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述PDLIM4的量通过采用抗PDLIM4的抗体进行测定。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述抗PDLIM4的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

6.诊断胃癌的方法，所述方法包括：

a)获得个体的血清，

b)测定其中的PDLIM4的表达水平，

c)获得正常个体的血清，

d)测定其中的PDLIM4的表达水平作为对照表达水平，和

7.根据实施方案6所述的方法，其中所述PDLIM4的表达水平通过采用抗PDLIM4的抗体进行测定。

8.根据实施方案6或7所述的方法，其中所述抗PDLIM4的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

9.抗PDLIM4的抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断个体的胃癌。

10.用于诊断个体的胃癌的试剂盒，所述试剂盒包含

a)用于测定PDLIM4的表达水平的试剂，和

b)使用说明书。

本发明的其它方面和优点可通过参阅以下具体实施方案的描述并结合附图来知晓。

附图说明

图1对PDLIM4的免疫印迹图谱进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图。

图2对PDLIM4免疫组织化学实验结果进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图。

图3对PDLIM4血清中蛋白质含量实验结果进行数据分析相对分布图。

具体实施方式

在一个优选的实施方案中，宜采用所述蛋白的片段。所述片段应当与样品中的蛋白或其经过酶解(如胰蛋白酶酶解)后得到的片段的序列完全一致。为方便操作，所述片段的长度宜为5-50个氨基酸，优选6-30个氨基酸，更优选为6-25个氨基酸。此外，所述片段的最佳Transition应有较好的信噪比。所述宜经过重同位素(例如13C，14N)标记，以便将其与未经标记的样品相区分。

表1.PDLIM4肽段序列。

对患有胃癌患者进行早期检测的步骤包括将一定量的经过重同位素标记的片段加入经酶(如胰蛋白酶)消化的患者血清样品中，用定量蛋白质组学的技术检测患者血清中所述片段的水平，从而确定血清中PDLIM4水平；将所测得的水平与根据正常人的水平确定的临界值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示胃癌患病几率大。

所述临界值可以由本领域技术人员根据常规手段来确定。例如，本领域技术人员可以根据测得的正常人(组)的血清蛋白质含量数据来绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，随后确定临界值(cut-off)。

在更优选的实施方案中，所述定量蛋白质组学技术可以和以合成肽段为基础的绝对定量技术(absolute quantification analysis,AQUA)相结合，这样就可以直接对多个样品中的PDLIM4直接进行绝对含量的检测。将所测得的水平与正常对照血清的水平比较，如果所测得的水平高于正常对照血清的水平，则表示该对象患有胃癌。

在另一个优选的实施方案中，所述与人PDLIM4蛋白特异性结合的物质是抗体。此处的术语“抗体”具有最广义地含义，其具体地包括:单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。术语“抗体”还包括完整分子的片段，例如能够结合响应抗原的Fab和F(ab')2。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗体的Fe片段，能够更迅速地从循环系统中清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合性。本发明中有用的Fab和F(ab')2以及其他抗体片段也可用于检测和定量测定人PDLIM4，只要它们表现出所需的特异性结合的活性。这些片段通常可用木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)通过蛋白酶水解切割产生。

用于本发明的多克隆抗体和单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行:将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐齐U)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。将免疫后的动物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育该血液I小时，然后4℃培育2-18小时，获得多克隆抗血清。单克隆抗体可用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256:495-96]或其改进方法制得。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。然而，并非是对动物取血然后抽提血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分散成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后对所得B细胞或所有解离的脾细胞进行诱导，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。

用抗体测定血清中抗原可用免疫荧光技术，利用荧光标记的抗体并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。试验方法例如包括使生物样品(如生物液体如血清)在能够鉴别可检测标记抗体存在下进行培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种方法检测抗体。

生物样品可以用固相支持物或载体(如硝酸纤维素)、或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体来处理。然后用合适的缓冲液洗涤支持物或载体，再根据本发明上述那样用可检测的标记的抗体处理。再用缓冲液第二次洗涤固相支持物或载体，除去未结合的抗体。然后可用常规方法检测所述固相支持物或载体上所结合的标记的量。熟知的支持物或载体包括:玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。支持物或载体的结构可以是球形(如在玻珠内)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、测试条带等。较佳的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员可知道用于结合抗体或抗原的其他许多合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。

在本发明中，可将抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析。然后，当该酶与合适的底物接触时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学物。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不局限于):苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、S-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较来实现。

检测可用其他各种免疫试验实现。例如,通过放射性标记抗体,就可以通过采用放射免疫分析(RIA)来检测。放射性同位素可用闪烁计数器等设备或通过放射性自显影来进行检测。

还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。抗体还可用发出荧光的金属(如152E或其他镧系金属)进行可检测地标记。这些金属可通过这些金属的螯合基团(如二乙三胺五乙酸(ETPA))与抗体连接。还可以将抗体偶联化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，检测在化学反应过程中发光的存在来检测带有化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶鎗酯、咪唑、吖啶鎗盐和草酸酯。同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过检测发光来确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

本发明的抗体也可用于免疫测定试验，如夹心试验。在典型的免疫测定试验中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相支持物或载体上，加入一定量的带可检测标记的可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。典型的且较佳的免疫测量试验包括“正向”试验，在该试验中与固相结合的抗体先与待测试样品接触，通过形成二元固相抗体-抗原复合物从而将抗原从样品中抽提出。在培育合适的时间后，洗涤固相支持物或载体以去除液体样品残余物(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知量的标记抗体的溶液接触。在第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固相支持物或载体上的抗原复合之后，第二次洗涤固相支持物或载体，除去未反应的标记抗体。

本发明第三方面提供了一种用于检测对象是否患有胃癌的试剂盒，所述试剂盒包含表1所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列还可携带标记。所述标记优选同位素标记。所述试剂盒还可包含说明书，该说明书提供了指导使用者如上所述应用上述多肽序列来检测对象是否患有胃癌的说明。

实施例

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3_胆酰胺丙基)_二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司；β-巯基乙醇等化学试剂购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin,sequencing grade)购自Promega公司；iTRAQ(isobaric tags for relative andabsolute quantitation)试剂购自AB SCIEX；SCX柱和SAX柱以及pH缓冲液试剂盒购自waters公司。

在本发明的下述实施例中，使用的溶液配方如下:

裂解液:8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmol/L DTT。

TBST：Tris 2.42g/L，氯化钠8g/L,Tween_201ml/L，用HCl调节pH到7.6。

实施例1、胃癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备。本发明人用酶解样品制备法(enzymatic sample preparation,ESP)制备的胃癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)差异蛋白质组学质谱定量。结果发现PDLIM4在胃癌癌组织中高表达。免疫印迹实验和免疫组织化学实验进一步证实PDLIM4的确在胃癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。在此基础上完成了本发明。

因此，以PDLIM4作为一个蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测胃癌，即PDLIM4可以用作检测胃癌的蛋白质分子。

4例胃癌患者的癌组织及癌旁组织，该4例患者，均由2名病理科医生确诊，患有胃癌，4例患者的病理资料如表2所示。

表2：4例胃癌患者的病理资料。

No.	性别	年龄	等级	肿瘤分型	肿瘤大小(CM)
						P1	男性	61	Ⅲ	胃癌	2.1X2.3
P2	男性	63	Ⅲ	胃癌	1.5X3.7
						P3	男性	48	Ⅲ	胃癌	2.8X5.2
P4	男性	55	Ⅲ	胃癌	3.3X3.5

以溶液内酶解样品制备法制备上述4例患者的胃癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品(所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一胃癌患者的成对样品)，具体过程如下:

手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的PBS溶液洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，然后将细胞沉淀分别溶于裂解液中，然后于冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪(Soniprep 150,英国，MSE公司)间歇超声破碎2min后，于15000g/min、4℃离心1h，取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量。

实施例2：癌组织及癌旁组织的差异表达蛋白的筛选

采用iTRAQ技术(参照Pichler P et al.Anal Chem.2010 Aug 1；82(15):6549-58.)结合溶液内酶解技术(参照William M.Old et al.Mol Cell Proteomics.2005；4:1487-1502)与阴阳多维液相色谱串联质谱技术(参照Jie Dai et al.JProteomeRes.2007；6(1)：250-262)进行差异表达蛋白的筛选，具体过程如下：

取实施例1中获得的4对胃癌组织及癌旁组织蛋白质样品各200ug，运用溶液内酶解技术将其酶解成肽段，然后置换成iTRAQ反应试剂。各取100ug分别与iTRAQ试剂混合，室温静置1hr。加入8uL羟胺，室温静置15min，终止反应。合并8个样品，震荡使充分混合，除去样品中的盐等杂质。

肽段混合物首先用SCX/SAX柱进行分析，然后用完全自动化的多维液相色谱串联质谱仪LTQ^TMQ-Exactive^TM(购自Thermo Fisher公司)进行分析，得到的原始数据采用Maxquant软件(德国马普研究所)进行数据库搜索，并对鉴定到的蛋白质进行定量分析，定量结果如表2所示。

表3：胃癌组织及癌旁组织中PDLIM4的定量结果：

No.	比率(肿瘤组织/癌旁组织)
		P1	1.51
P2	2.32
		P3	1.62
P4	2.55

根据表3的结果，PDLIM4在胃癌组织中的表达含量与癌旁组织相比，在胃癌组织中高表达2倍左右，胃癌组织中表达明显上调。

实施例3：PDLIM4的验证

取6对胃癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品，其病理资料如表4所示。

表4：6例胃癌标本的病理资料

No.	性别	年龄	等级	肿瘤分型	肿瘤大小(CM)
						P1	男性	57	Ⅲ	胃癌	2.7X3.3
P2	男性	59	Ⅲ	胃癌	3.2X3.2
						P3	男性	61	Ⅲ	胃癌	3.6X2.5
P4	男性	64	Ⅲ	胃癌	4.3X2.8
						P5	男性	55	Ⅲ	胃癌	3.7X4.0
P6	男性	65	Ⅲ	胃癌	2.8X3.1

使用购买的抗PDLIM4抗体对上述6对胃癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫印迹分析，过程如下:

每个样品取20ug蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自GEHealthcare公司)上；

一抗使用兔抗人PDLIM4多克隆抗体(购自Abcam公司，1:1000稀释)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次5分钟；

二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，I:10000稀释)，室温孵育I小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟；

加入ECL plus试剂(购自GE Healthcare公司)反应5分钟后，以X-光片曝光检测。

对免疫印迹图谱采用Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析软件(Media Cybernetic公司)进行数据分析，得出蛋白质表达量的相对分布图，结果如图1所示。

图1结果显示，在胃癌组织中的表达量明显高于相应的癌旁组织，其平均比值为2.56，P值(配对t检验)为0.002。

根据图1的结果，PDLIM4在胃癌组织存在高表达，该结果与质谱结果一致。

实施例4。为了进一步证实PDLIM4在胃癌组织和癌旁组织之间的表达差异，随机选取55对胃癌的癌组织和对应的癌旁组织样本，使用胃癌组织芯片，进行免疫组织化学研究，其中，选取的样本的具体资料分别如表5所示。

表5：胃癌组织芯片资料。

免疫组织化学研究的实验过程如下:

将组织切片置于60℃恒温箱烘烤约3个小时，取出后依次使用二甲苯、二甲苯/乙醇(I:I)、100％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇和水，进行脱蜡水化处理；

PBS洗3次，每次5分钟；0.3％H₂O₂(甲醇稀释)浸泡半小时，PBS洗3次，每次5分钟；

高压修复抗原，双蒸水洗2次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；10％血清室温封闭20分钟；

加入兔抗人PDLIM4多克隆抗体(购自Abcam公司，I:50稀释)，4℃过夜，PBST洗3次，每次5分钟；

加入生物素标记的羊抗兔抗体(来自ABC试剂盒，购自VECTOR公司)，室温孵育30分钟，PBST洗3次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；

加入ABC溶液(来自ABC试剂盒，购自VECTOR公司)，室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

DAB溶液(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)显色；苏木精(购自VECTOR公司，H3404)染色20秒；

组织切片依次使用:50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯/乙醇(I:I)、二甲苯，进行脱水透明处理。

然后使用中性树脂封片，于显微镜观察。对组织芯片进行评估，结果显示：组织芯片中共55对有效样本，并根据染色强度和阳性率打分，其中，染色强度打分标准为:阴性为O分、弱阳性为I分、中等阳性为2分、强阳性为3分；阳性率打分标准为:低于5％为O分，5％～30％为I分，31％～60％为2分，60％以上为3分。将染色强度的得分与阳性率的得分相加，获得组织切片的综合得分，得分情况如表6所示。

表6：胃癌组织芯片综合得分。

根据表6的结果计算得到图2:胃癌细胞癌组织的平均综合得分为3.27，癌旁组织的平均综合得分为2.25，两者具有极显著差异，P值为0.00002。统计发现，在超过73％(40对)的样本对中，PDLIM4在胃癌细胞癌中高表达。该结果与前面的质谱结果、免疫印迹结果相一致。

实施例5。为了进一步发现PDLIM4在胃癌血清和正常人血清之间的表达差异，随机选取30例胃癌患者的血清和30例正常人血清样本，进行酶联免疫吸附测定，其中，选取的样本的具体资料分别如表7所示。

表7：胃癌血清样本信息。

表7：正常血清样本信息。

根据酶联免疫吸附测定的结果得到图3:统计发现，PDLIM4在胃癌的患者血清中高表达。该结果与前面的质谱结果、免疫印迹结果以及免疫组化结果相一致。

综上所述，PDLIM4在胃癌的癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，并且在胃癌患者的血清中表达升高，显然与胃癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用于检测胃癌。相应的，特异性PDLIM4的抗体，包括各种PDLIM4的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测PDLIM4的表达量，因而可以用于检测胃癌，或者用于制备检测胃癌的制剂或试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

虽然有关PDLIM4动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将它作为检测胃癌的标记物却是肯定的。PDLIM4可作为胃癌的潜在标志，而它在胞内的生物学功能提示PDLIM4可能作为胃癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。

Claims

1.用于检测PDLIM4的抗体在制备试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒用于诊断胃癌的方法，所述方法包括：

a)获得个体的血清，

b)测定其中的PDLIM4的表达水平，

c)获得正常个体的血清，

d)测定其中的PDLIM4的表达水平作为对照表达水平，和

e)将b)中获得的PDLIM4的表达水平与d)中获得的PDLIM4的对照表达水平进行比较，当b)中获得的PDLIM4的表达水平与d)中获得的PDLIM4的对照表达水平相比提高时，诊断所述个体患有胃癌。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述PDLIM4的表达水平通过采用抗PDLIM4的抗体进行测定。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述用于检测PDLIM4的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。