KR101341732B1 - 난소암 진단을 위한 콜라겐 유형 ⅵ 알파 １의 신규한 용도 - Google Patents

난소암 진단을 위한 콜라겐 유형 ⅵ 알파 １의 신규한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난소암 진단을 위한 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1의 신규한 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 산화된 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드 또는 이에 대한 결합물질, 이를 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물. 상기 조성물을 함유한 키트, 이를 이용한 진단 방법, 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드의 난소암 특이적 산화 부위에 대한 다형성 폴리펩티드 및 이에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 난소암을 진단할 수 있는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드는 난소암에서 특이적으로 산화 변형을 보이므로 이를 검출하는 경우 난소암의 진단의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

난소암 진단을 위한 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 １의 신규한 용도 {Novel use of collagen type VI alpha 1 for diagnosing ovarian carcinoma}
본 발명은 난소암 진단을 위한 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1의 신규한 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 산화된 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드 또는 이에 대한 결합물질, 이를 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물, 상기 조성물을 함유한 키트, 이를 이용한 진단 방법, 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드의 난소암 특이적 산화 부위에 대한 다형성 폴리펩티드 및 이에 대한 항체에 관한 것이다.
암은 형질전환(形質轉換)된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환으로서, 대부분의 암은 환경적 요인, 유전적 요인 등의 여러 원인에 의해 발암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)에 변이가 일어나 발생한다. 암세포는 초기에는 증식하여 인접한 조직에 침투하여 이를 파괴하다가, 점점 순환계를 침범하여 암 발생부위로부터 멀리 떨어진 신체의 다른 부위로 전이되어 결국 개체를 죽게 한다.
그 중, 난소암은 난소에 발생하는 악성 종양으로 50~70세 사이에 제일 많이 발생한다. 2002년 우리나라 통계에 의하면 매년 약 1,000~1,200명 정도가 새로 발병하고 있으며, 자궁 경부암에 이어 두번째로 흔한 부인과 암이다.
난소암은 증상이 미미하여 약 60%정도가 이미 상당히 진행된 상태에서 병원을 찾게 되므로, 증상이 없더라도 1년에 한 번 정도는 반드시 정기적인 부인암 검진을 받는 것이 조기진단의 지름길이다. 산부인과 의사가 내진을 하여 난소가 커져 있는지 혹이 만져지는지 등을 확인하고 필요하다고 여겨지면 초음파 검사로 난소의 혹을 검사한다. 또한 단순한 양성 물혹인지 암인지를 감별하기 위해 혈액검사로 CA125라는 종양 표지인자를 확인하기도 한다. 현재 난소암 진단용 마커로는 CA125가 알려져 있으며, 혈청 CA125는 난소암의 선별, 양성과 악성 난소 덩어리간의 구별 및 예후에 사용되어 왔다 (Zurawski, V. R. et al., Int J. Cancer, 42:677-80, 1988; Vasilev S.A et al., Obstet Gynecol. 71:751-6, 1988; Rubin S.C. et al., Am J Obstet Gynecol. 160:667-71, 1989; Bridgewater J.A. et al., J. Clin Oncol. 17:501-8, 1999). 그러나 상기 CA125는 단지 I기 난소암 여성의 약 1/2에서만 상승되는 경향이 있기 때문에 단일 마커로서 한계가 있다. 이에 일반적으로 초음파 검사와 CA125 검출의 두 검사를 병행하고는 있으나, 난소암을 진단하기 위한 효과적인 진단방법은 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.
이에 따라 CA15-3, CA19-9, OVX1, 리소포스파드산(LPA) 및 암배아 항원(CEA) 등과 같은 새로운 난소암 마커들이 제시되고 있으나, 이들 역시 난소암을 정확하게 진단하기에 충분하지 않기 때문에 현재에는 오직 CA125와 초음파 촬영술을 함께 병행하는 방법만이 이용되고 있다.
난소암으로 진단이 될 경우 대부분의 경우, 암이 많이 진행된 상태로 나타나기 때문에 예후가 좋지 않으며, 5년 생존율이 약 28%로 낮은 편에 속한다. 반면에 난소암이 조기 진단될 경우, 5년 생존율은 약 90%정도에 이른다. 따라서 난소암으로 인한 피해를 줄이기 위해서는 조기진단이 명백하게 필요하다.
난소암의 진단 결과로 나타난 확산 정도에 따라 치료 방법이 달라짐으로, 이러한 병기의 판단이 중요하다. 병기는 다음과 같이 분류된다. 1기, 암이 한쪽 또는 양쪽의 난소에만 머물러 있는 상태; 2기, 난소 주위 (난관, 자궁, 직장, 방광 등)의 복막으로 암이 전이한 상태; 3기, 난소 주의 (골반내)의 복막과 상복부와 후복막림프절로 전이한 상태; 4기, 암이 복강 밖으로 전이하거나 간장으로 전이한 상태. 1, 2기의 경우에는 수술로 완전히 절제할 수 있지만 3, 4기에는 수술말으로는 완전히 제거할 수 없으므로, 진행성 암으로 정의된다.
이와 같이 난소암은 조기에 발견될 경우 대부분 완치도 가능하지만, 대다수가 암이 많이 진행된 상태에서 진단되기 때문에 치료에 많은 어려움이 있다. 하지만, 난소암의 경우 다른 암보다 비교적 항암제가 잘 듣기 때문에 적절한 치료를 받는다면 상당기간 생명을 연장시킬 수 있고, 또한 최근 부작용이 적은 새로운 항암제나 면역요법, 분자치료요법 등이 개발되고 있으므로, 치료예후는 좋은 편이기 때문에 다른 어떤 암에 비해서 조기진단을 위한 새로운 마커의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 활성산소종 (ROS, reactive oxygen species)에 의하여 광범위하게 유발되는 생체내 지질 (lipid), 단백질 (protein) 및 DNA의 손상은 암과 같은 많은 질병의 원인이 된다고 알려져 있다. 특히, 활성산소종의 공격에 의한 단백질의 산화 변형은 구조의 변화를 유도하기 때문에 특정 단백질의 기능과 활성에 큰 변화를 가져온다 (Klamt, F. et al., Nat Cell Biol . 11:1241-6, 2009; Yan, Y. et al., Cell, 138:1209-21, 2009). 이러한 작용으로 단백질의 구조가 변화하여 소수성 내부가 노출되고 다중 유비퀴틴 분자의 부착 (ubiquitination)에 의한 표지에 의해 프로테아좀(proteasome)에 의한 인식 및 분해기작이 이루어진다. 이러한 단백질의 산화는 생물학적 기능과 병리적인 과정에서 중요한 역할을 하며 특히 활성산소종 중 하나인 과산화수소 (hydrogen peroxide)에 의한 시스테인 잔기인 치올 그룹(-SH, thiol group)의 산화는 유방암의 병리적인 환경에 관여한다고 알려져 있다(Young Ho Seo., et al., PNAS. 38:1616316168, 2009).
이에 본 발명자들은 난소암을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 새로운 진단 방법을 개발하고자 연구한 결과, 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드의 중요 시스테인 잔기의 형태가 난소암 조직에서 특이적으로 정상 조직과는 다른 산화 형태로 존재하므로 이를 검출하는 경우 난소암의 조기 진단 및 치료 전후의 예후를 판단하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 난소암 진단을 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 산화된 형태의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합물질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 콜라겐 유형 VI 알파 1(collagen type alpha 1) 폴리펩티드 또는 이에 대한 결합물질을 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드 또는 이에 대한 결합 물질을 포함하는 난소암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 594번째 시스테인, 604번째 시스테인, 606번째 시스테인, 607번째 시스테인 및 609번째 시스테인으로 이루어진 군에서 선택된 시스테인을 포함하는 10 내지 200 개의 폴리펩티드로 이루어진 난소암 진단용 폴리펩티드를 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2ded.1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered.,1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에서 폴리펩티드(polypeptide)는 폴리펩티드들(polypeptides)또는 단백질(들)과 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 콜라겐의 구성 단백질 중 하나이다. 콜라겐 유형 VI는 결합 조직(connective tissue)의 세포외 매트릭스(extracellular matrix; ECM)에서 주로 존재하며 (Timpl, R. and Engel J., New York : Academic Press p.105-43, 1987), 세 개의 다른 알파 체인인 알파 1(1), 알파 2(2), 알파 3(3)로 구성되는 테트라머릭 유니트(tetrameric unit)의 섬유질 (filamentous) 형태를 이룬다. 이러한 콜라겐 VI은 세포막과 함께 혹은 다수의 ECM 구성요소들과 높은 친화력을 가진다. 그러므로 콜라겐 유형 VI는 세포-매트릭스 상호작용 뿐만 아니라, 다양한 조직과 세포에서 분자간(intermolecular) 상호작용에 시발점이 되며, 세포내 신호전달에 중요한 역할을 한다 (Burg, MA. et al., J Biol Chem 271:26110-6, 1996). 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1은 대장암에서 종양이 이동, 전이의 과정에서 세포의 부착, 기능에 관여한다고 알려져 있으나(Havenith MG, et al., Cancer, 1988; 62 :2207-2211), 암과의 관련성에 있어서 그다지 알려진 바는 없다. 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(Genbank Accession No. NP_001839)을 가질 수 있다. 또한, 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 Genbank Accession No. NP_990438, NP_034063에 기재된 서열 또는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 세포외 매트릭스를 구성하는 활성을 보이는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 일부 화학 구조가 변형된 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 각각의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 따른 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction) 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 이때, 재조합된 폴리펩티드의 시스테인을 산화 변형 유도하기 위하여 기존의 당업계에서 발명된 방법을 통하여 산화변형된 시스테인을 가지는 폴리펩티드를 제조하여 항원으로 사용한다.
본 발명의 난소암 세포에서 특이적으로 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 산화부위는 정상 세포에서의 산화부위와 상이하다. 즉, 난소암 세포에서 특이적으로 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 산화부위는 예를 들어, 서열번호 1의 594번째 시스테인, 604번째 시스테인, 606번째 시스테인, 607번째 시스테인 또는 609번째 시스테인 단독이거나 또는 이들의 조합일 수 있으나, 정상세포에서의 산화부위는 서열번호 1의 34번째 시스테인일 수 있다.
상기에서 시스테인은 단독 또는 둘 이상이 산화된 형태일 수 있으며, 산화는 시스테인이 산소 분자의 결합으로 인하여 시스테인 잔기의 -SH(thiol)형태가 S-S(disulfide)/-SOH(sulfenic)/-SOOH(sulfinic)/-SOOOH(sulfonic)의 형태로 변형된 것을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 물질을 제공한다.
상기 결합물질은 이에 제한되지는 않으나, 항체, 앱타머(aptamer), 펩티도 미메틱스(peptido mimetics)를 의미하며, 이로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명에서 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대한 항체는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같은 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법은 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 파지 항체 라이브러리 방법은 세포내에 존재하는, 다양한 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대한 항체 유전자(Single chain fragmentvariable, scFv형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
바람직하게는 본 발명의 항체의 제조에 있어서 항원으로 이용되는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 산화되지 않거나 산화된 형태의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드일 수 있다. 단백질의 산화 변형은 단백질 분자내의 설프히드릴 (sulfhydryl)계의 산화 또는 이황화물의 환원, 아미노산 잔기의 산화적 변형, 알데하이드 (aldehyde)와의 반응, 단백질간의 교차 연결 (cross-link) 그리고 펩티드 손상 등이 일어나는 것을 말한다. 이러한 산화 변형은 특정 단백질의 구조와 활성화에 중요한 구조적 변화를 가져옴으로, 단백질의 세포내 신호전달에 중요한 역할을 한다.
또한, 상기 결합물질로서 앱타머(aptamer)는 특정 단백질에 높은 특이성으로 결합하는 단일 가닥의 핵산으로, 면역반응(immunogenesity)이 거의 없고, 짧은 기간 내에 화학적 합성 및 변형이 용이하다. 한편, 또 다른 결합물질로서 펩티도 미메틱(peptido mimetic)은 세포 단백질 기능을 대체하는 미세 화합물을 의미하며, 본 발명의 상기 결합물질에는 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1과 특이적으로 결합하는 앱타머 및 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 난소암 조직과 정상 조직에서의 산화 민감성 정도 차이를 확인하고 난소암 조직에서 특이적으로 산화된 타깃 단백질을 동정하기 위해, 환원 친화성 케미컬 (chemical)인 BIAM (Biotinylated iodoacetamide)를 시료에 결합시켜 2차원 전기영동을 수행하여 난소암 조직과 정상 조직간의 차이가 있음을 확인하였다. 그 후 샷건(Shotgun) 프로테오믹스 기법을 이용하여 콜라겐 유형 알파 1의 산화 민감성 서열을 분석하였으며, 이를 바탕으로 항체를 제조하여 콜라겐 유형 알파 1의 암환자 시료내에서의 산화 변형을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1(collagen type VI alpha 1) 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 상기 진단이라는 용어는 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.
한편, 본 발명은 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 대한 결합물질을 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 결합물질은 이에 제한되지는 않으나, 항체, 앱타머, 펩티드 미메틱스에서 선택될 수 있다.
한편, 본 발명은 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 또는 이에 대한 결합물질을 단독으로 또는 2 이상 포함하는 난소암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 난소암 진단용 키트는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 또는 이의 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에 포함되는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 또는 이의 항체는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 -글루쿠로니다제, -D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 난소암 진단 키트는 종래에 알려진 난소암 진단 마커를 추가로 포함할 수 있다. 종래에 알려진 난소암 진단 마커는 이에 한정되지는 않으나, CA125, CA15-3, CA19-9, OVX1, 리소포스파드산(LPA) 및 암배아 항원(CEA)일 수 있다.
아울러, 본 발명은 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료에 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 산화 여부를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 난소암 조직에서 보다 산화된 형태로 존재하며, 이는 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 항원-항체 반응 등을 통해 이를 검출하는 것에 의해 확인될 수 있다.
또한, 콜라겐 유형 알파 1 폴리펩티드의 산화 여부는 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합물질을 이용하여 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드는 난소암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드를 이용한 난소암의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 산화된 형태의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드를 검출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 난소암 진단 마커란 난소암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 난소암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상 조직과 난소암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명에서 암 진단 마커는 난소암 조직 및 세포에서만 특이적으로 보다 더 산화된 형태로 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드이며, 이를 공지된 검출방법, 예를 들어, 등전점에 따른 단백질 분리 및 확인 방법을 통해 확인함으로써 난소암을 진단할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 생물학적 시료또는 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 검출은 표적 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드 또는 이의 단편, 그의 서브유닛의 존재 또는 부재를 분석, 영상화, 확인, 확립하는 것을 말한다.
본 발명에서 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드를 등전점에 따라 분리하는 방법 및 이를 검출하는 방법은 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 등전점 전기영동(Isoelectric focusing)을 거쳐 등전점에 따라 분리하고 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 생물학적 시료 중의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드와 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에서 핵산, 서열또는 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
한편, 본 발명의 난소암 세포에서 특이적으로 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 산화부위는 정상 세포에서의 산화부위와 상이하다. 즉, 난소암 세포에서 특이적으로 존재하는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드의 산화부위는 예를 들어, 서열번호 1의 594번째 시스테인, 604번째 시스테인, 606번째 시스테인, 607번째 시스테인 또는 609번째 시스테인 단독이거나 또는 이들의 조합일 수 있으나, 정상세포에서의 산화부위는 서열번호 1의 34번째 시스테인일 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 594번째 시스테인, 604번째 시스테인, 606번째 시스테인, 607번째 시스테인 및 609번째 시스테인으로 이루어진 군에서 선택된 시스테인을 포함하는 10 내지 200개의 폴리펩티드로 이루어진 난소암 진단용 폴리펩티드를 제공한다.
상기에서 시스테인은 단독 또는 둘 이상이 산화된 형태일 수 있으며, 산화는 시스테인이 산소 분자의 결합으로 인하여 시스테인 잔기의 -SH(thiol)형태가 S-S(disulfide)/-SOH(sulfenic)/-SOOH(sulfinic)/-SOOOH(sulfonic)의 형태로 변형된 것을 나타낸다.
아울러, 본 발명은 상기 난소암 진단용 폴리펩티드에 특이적인 항체를 제공하며, 상기 항체는 난소암 세포의 산화 변형 부위를 특이적으로 검출할 수 있으므로 본 발명은 상기 항체를 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
한편, 본 발명에서 사용된 단백질 작업(protein work)은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다: Rebecca, LC. et al., Mol Cell Proteomics 6:1473-84, 2007; Chung, Y. et al., J Am Soc Mass Spectrom . 20:751-4, 2009;Lu, B. et al., Methods Mol Biol . 566:229-259, 2009; Qin, G. et al., J Proteome Res . 8:2449-62, 2009.
본 발명의 일 실시예에서는 난소암 조직과 정상 조직에서의 산화 스트레스 정도를 확인하였다. 그 결과 난소암 조직에서는 정상 조직에 비해서 활성산소군(ROS)의 생성과 같은 산화 정도가 정상 조직에 비해서 변형되어 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 난소암 및 정상 조직간의 프로테옴 프로파일 분석을 2차원 전기영동 기법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 정상조직과 난소암조직 샘플간의 단백질의 발현 패턴이 다르며, 특히 BIAM과의 결합을 통해 시스테인에 산화 민감성을 가지는 단백질들에 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 그리고, 상기 방법을 통하여 39개의 단백질을 MALDI-TOF를 통해 동정하였으며, 이 중 26개의 단백질만이 정상조직과 난소암조직에서 산화 민감성의 차이를 보이는 것으로 동정되었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 샷건 프로테오믹스를 이용하여 산화변형을 보이는 펩티드의 서열을 정보를 확인하였다. 정상조직과 암조직에서 IAM의 결합이 특이적으로 차이를 보이는 펩티드를 비교해 본 결과, 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1이 서열의 차이를 보임을 확인하였다.
이차원 전기영동을 통해서는 산화 유무 정도의 시간적인 것과 어떤 단백질인지 정도만 확인 가능하며 산화 변형된 형태의 단백질의 시퀀스를 확인할 수 없어 직접적으로 어떤 시스테인이 산화변형되었는지 알 수 없으므로, 산화 변형된 특정 단백질의 서열을 분석하여야 한다. 샷건 프로테오믹스는 너무나 방대한 양의 펩티드 정보와 펩티드 수치로 인한 분석으로 인하여 다른 방법으로의 검증작업이 필요하다. 그러므로 본 발명에서는 프로테오믹스를 다른 두 가지 방법(이차원 전기영동, 샷건 프로테오믹스)을 병행하여 수행하여 이를 보완하였다. 두 데이터 중 공통적으로 일치하는 데이터를 가지는, 즉 산화 변형의 시스테인을 가지는 단백질을 일차적으로 선별하였고(표 1 참조), 정상조직이나 난소암조직 어느 한쪽에서만 펩티드가 나온 것들은 실질적으로 조직샘플에서 일치하지 않는 가능성이 있으므로 그 중에서 정상조직과 난소암조직에서 펩티드가 모두 분석되어진 단백질인 콜라겐 유형 VI 알파 1을 선별하였다. 양쪽의 샘플 군에서 산화변형된 시퀀스가 다르다는 것은 산화 변형으로 인하여 기본적으로 단백질 구조상의 변화를 가져와 노출된 시스테인의 위치가 다를 수 있음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드에 대한 현재 상업적으로 판매되는 항체 (Santa Cruz Biotechnology, INC., cat No. sc-20649)를 이용하여 난소암 조직에서 산화 변형을 확인하였다. 난소암 환자 시료에 대해서 2차원 전기영동을 수행하고, 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 암조직에서는 산화적 변형을 보이는 패턴을 확인할 수 있었다. 이와는 대조적으로 표 1에 기재된 콜라겐 VI 알파 2 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 동일한 실험을 수행해본 결과, 프로테오믹스 데이터와는 일치하지 않았으며, 산화적 변형도 확인할 수 없어 위양성 결과임을 확인할 수 있었다.(결과미도시)
따라서, 본 발명은 난소암을 진단할 수 있는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드는 난소암에서 특이적으로 산화 변형을 보이므로 이를 검출하는 경우 난소암의 진단의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 난소암 조직 및 정상 조직에서의 단백질 카르보닐화(A), 글루타치온 환원효소 활성(B) 및 티오레독신 환원효소 활성(C)를 분석한 것이다.
도 2는 난소암 환자의 정상조직과 암조직에서의 단백질 산화를 2차원 전기영동 방법으로 확인한 것이다.
도 3은 난소암 특이적 산화 변형을 보이는 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1의 정상조직과 암조직에서의 변형을 비교한 사진이다. 붉은 색 화살표 표시한 부분은 암조직 특이적 변형을 의미한다.
도 4는 난소암 환자 단계별 변형정도를 비교한 사진이다. 1기에서보다 3기에서 변형정도가 더 크다는 것을 알수 있다. 붉은 색 화살표로 표시한 부분은 암조직 특이적 변형을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
난소암 조직의 특이적 산화 민감성 확인
<1-1> 시료 준비
난소암 조직은 삼성병원과 중앙대학교 병원의 윤리 위원회의 승인하에 얻었다. 삼성병원으로부터 난소암 3기 또는 4기 여성 환자에게서 3개의 난소암조직과 1개의 정상 샘플을 얻었으며, 중앙대학교 병원으로부터 1기와 3기 환자의 조직을 각각 3개씩 얻었다. 모든 시료는 외과적 절제 직후에 얻었다.
<1-2> 단백질-카르보닐화 분석(protein-carbonylation assay)
단백질 카르보닐화 분석은 상용의 키트(Protein Carbonyl ELISA kit, cat No. NWK-PCK01, Northwest Life Science Specialties)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 수행하였다:
조직을 차가운 용해 버퍼(50mM 인산칼륨, 1mM EDTA, pH 7.4)에서 분쇄하고(homogenized), 20ug의 단백질이 함유되도록 각각 새로운 튜브에 넣었다. 모든 시료는 증류수로 동일한 부피가 되도록 하였다. 여기에 28%(w/v) TCA를 0.8배 부피로 첨가하고 혼합한 다음 얼음 속에서 10분간 두었다. 그리고나서 1000rpm에서 3분간 원심분리를 하였다. 상등액을 따라낸 다음, 각각의 샘플 튜브에 5l EIA 버퍼와 15l 희석 DNP-용액을 넣고 볼텍싱하고, 상온에서 45분간 놓아 두었다. 시료와 표준 및 대조군으로 1.5ml 튜브 세트를 준비한 다음, EIA 버퍼 1ml를 각각의 튜브에 첨가하고, 5l의 DNP-처리 시료를 첨가하여 잘 혼합하였다. 이 중 200l를 ELISA 플레이트에 옮기고, 플레이트를 실링 테이프로 덮었다. 이를 4에서 밤새 놓아두고, 플레이트를 EIA 버퍼(5x, 약 300l)로 세척하였다. 250l의 블로킹 버퍼를 첨가하고 실온에서 30분간 놓아둔 다음 EIA 버퍼(5x, 약 300l)로 세척하였다. 각각의 웰에 희석된 항-DNP-바이오틴-항체 200l를 넣고 37에서 1시간 동안 반응시킨 다음 EIA 버퍼(5x, 약 300l)로 세척하였다. 희석된 스트렙타비틴-HRP(horseradish peroxidase) 200l를 각각의 웰에 넣고 시료를 실온에서 1시간 동안 반응시키고 EIA 버퍼(5x, 약 300l)로 세척하였다. 크로마틴 시약 200l을 첨가하고 발색 반응이 일어나도록 약 4-7분간 놓아 두었다. 100l의 종료 시약을 첨가한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1A에서 보듯이, 난소암 조직에서의 단백질 카르보닐화 수준은 정상 조직에 비해서 감소되어 있음을 알 수 있었다.
<1-3> 항산화 효소 활성 분석
조직을 차가운 용해 버퍼(50mM 인산칼륨, 1mM EDTA, pH 7.4)에서 분쇄하고(homogenized), 70g의 단백질이 함유되도록 상등액을 준비하여 티오레독신 환원효소 분석 키트(Cayman, USA) 및 글루타치온 환원효소 분석 키트(Cayman, USA)를 각각 이용하여 제조사의 지침에서 따라서 수행하였다. 분석의 최종 부피는 각 웰 당 200l이었으며, 분석은 22에서 수행되었다. 흡광도는 405nm에서 1분당 1회씩 하여 적어도 5회 동안 측정되었다.
그 결과, 도 1B 및 도 1C에서 보듯이, 난소암 조직에서는 정상 조직에 비해서 글루타치온 환원효소(glutathione reductase, 도 1B)의 활성은 감소하고, 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase; 도 1C)의 활성은 증가함을 알 수 있었다. 글루타치온 환원효소 및 티오레독신 환원효소는 모두 항산화 효소로서, 두 효소는 산화된 항산화물인 글루타치온과 티오레독신을 환원시킴으로써 세포내 산화환원 평형(redox homeostasis)을 유지한다고 알려져 있다. 따라서, 상기와 같은 결과는 난소암 조직에서의 활성산소군(ROS)의 생성과 같은 산화 정도가 정상 조직에 비해서 변형되어 있음을 암시하고 있다.
<실시예 2>
난소암 및 정상 조직간의 프로테옴 프로파일 분석
<2-1> 조직 시료에서 멤브레인 분획의 준비
정상조직과 난소암 조직 샘플을 질소가 충진된 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 3회 세척과 13000rpm, 4에서 원심분리를 반복한 후 상층액을 제거한다. 40BIAM (biotinylated iodoacetamide)이 포함되어 있는 용액(1PBS pH 7.4, 1mM EDTA, proteinase inhibitors)에서 샘플들을 5분간 분쇄하였다. 상기에서 사용한 모든 완충용액들은 질소 (N2) 로 충진하여 공기 중의 산화의 영향을 최소화 하였다. 분쇄된 샘플은 BIAM이 충분히 결합하도록 상온에서 3시간 반응(incubation)한 후, 반응을 중단하고 BIAM의 비특이적인 결합을 막기 위하여, 4mM DTT(dithiothreitol)을 첨가하였다. 13000rpm, 4에서 30분간 원심분리를 수행하여 상층액은 제거하고, 하층의 펠렛인 막단백질만 남겨두었다. 하층의 막단백질을 PBS용액으로 세척과 원심분리를 반복한 후, 200l 유레아 버퍼(7M Urea, 2M Thio Urea and 0.49 % CHAPS pH 7.5)에 녹여 브레드포드 법으로 정량화 하였다.
<2-2> 2차원 겔 전기영동(2DE) 및 웨스턴 블럿
실험에 사용한 BIAM (Invitrogen, Molecular Probes, B-1591)은 biotin이 결합된 변형된 형태의 iodoacetamide (IAM)으로, 단백질을 구성하는 아미노산 중 시스테인 (cysteine)의 구조 가운데 치올(-SH, 환원된 형태) 잔기에 결합하는 특징을 가진다. 이러한 원리를 이용하여 시스테인 잔기의 산화 유무를 확인 할 수 있다. 바이오틴 (biotin)은 스트렙타비딘 (streptavidin)과 특이적으로 결합하는 특성을 가지고 있어 이를 이용하여 스트렙타비딘에 HRP (horseradish peroxidase)가 붙은 항체를 이용하여 웨스턴블럿 (western blotting)방법을 수행하여 산화민감성 여부를 확인할 수 있다(JOE C., et al., JHC. 40:1457-1463. 1992).
정상조직과 난소암조직 막단백질 샘플 300g을 각각 18cm의 pH 3-10 스트립(Strip)에 분주한 뒤 등정점에 따라 분리되는 등전점 전기영동(IEF, isoelectric focussing)을 수행한 후 8-15% gradient SDS-PAGE 젤에서 전기영동을 하였다. 이후 젤 상에 있는 단백질을 PVDF 멤브레인(Polyvinylindene Difluoride Membrane)에 옮긴 후 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이는 바이오틴(Biotin)과 특이적으로 결합하는 특징을 가지는 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-horseradish Peroxidase, 1:10000, Sigma, USA)에 결합되어 있는 항체와 반응시켰다(Joe C., et al., JHC. 40:1457-1463. 1992). HRP(Horseradish Peroxidase)과 반응을 통해 빛에 노출된 단백질이 필름으로 현상되는 원리를 이용한 ECL (Enzyme Coupled Immunoluminescence, iNtRON, Korea)로 발광시키고, 하이퍼 필름 (hyper film; Amersham, USA)에 감광시켜 LAS4000(FUJIFILM, USA)으로 검출하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, 정상조직과 난소암조직 샘플간의 단백질의 발현 패턴이 다르며, 특히 BIAM과의 결합을 통해 시스테인에 산화 민감성을 가지는 단백질들에 차이가 있음을 확인 할 수 있었다.(노란색으로 표시된 각각의 스팟은 각 스팟들의 비교분석을 위하여 프로테오믹스용 스캔 작업을 하여 스팟으로 인식된 것들을 표시한 것임) 그리고, 상기 방법을 통하여 39개의 단백질을 MALDI-TOF를 통해 동정하였으며, 이 중 26개의 단백질만이 정상조직과 난소암조직에서 산화 민감성의 차이를 보이는 것으로 동정되었다.
<실시예 3>
샷건 프로테오믹스 기법을 이용한 난소암 특이적 산화 민감성 시스테인을 가지는 단백질 동정
<3-1> 조직 시료에서 멤브레인 분획의 준비
정상조직과 난소암 조직 샘플을 질소가 충진된 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 3회 세척과 13000rpm, 4에서 원심분리를 반복한 후 상층액을 제거한다. 110IAM (iodoacetamide)이 포함되어 있는 용액(1PBS pH 7.4, 1mM EDTA, proteinase inhibitors)에서 샘플들을 5분간 분쇄하였다. 상기에서 사용한 모든 완충용액들은 질소 (N2)로 충진하여 공기 중의 산화의 영향을 최소화 하였다. BIAM은 바이오틴의 결합으로 질량의 변화가 생긴 상태이며 샷건 프로테오믹스의 전하값에 영향을 줌으로, 샷건 프로테오믹스에서는 사용이 불가능하다. 그러므로, 변형이 안된 IAM은 무게가 가볍고, 질량값으로 IAM의 결합여부를 구분할 수 있기 때문에 샷건 프로테오믹스에는 IAM를 사용하였다. 분쇄된 샘플은 IAM이 충분히 결합하도록 상온에서 3시간 반응(incubation)한 후, 13000rpm, 4에서 30분간 원심분리를 수행하여 상층액은 제거하고, 하층의 펠렛인 막단백질만 남겨두었다. 하층의 막단백질을 PBS용액으로 세척과 원심분리를 반복한 후, 200l 유레아 버퍼(7M Urea, 2M Thio Urea and 0.49 % CHAPS pH 7.5)에 녹여 브레드포드 법으로 정량화 하였다. 정량화한 정상조직과 난소암조직 막단백질 샘플 1mg을 각각 8% SDS-PAGE 젤에서 전기영동을 전기하였다. 젤을 적당한 크기로 잘라 트립신 (Trypsine) 처리를 하여 펩티드를 추출하였다.
<3-2> 샷건 프로테오믹스 방법을 이용한 난소암 특이적 산화 민감성 단백질 확인
샷건(Shotgun) 프로테오믹스는 복합된 샘플내에서 적용할 수 있으며, 단백질간의 상호작용 네트워크 (Foster LJ., et al, CELL, 125: 187-199, 2006, Kislinger T., et al, CELL, 2006)와 질병의 바이오마커의 발견 (Decramer S., et al., Nat Med 12:398-400)에 관여하는 단백질들의 동정을 위한 강력한 기술이다. 샷건 프로테오믹스 실험에서, 서열 특이적 효소들과 그 결과로 나오는 펩티드를 탠덤 매스 스펙트로메트리 (tandem mass spectrometry; MS/MS)로 분석하여 복합체 혼합물에서 원하는 서열만을 분류할 수 있다. 이러한 파편들을 분석하여 IAM이 결합된 펩티드를 동정하였고 MASCOT (version 2.1) 데이터베이스 (database; DB) 검색엔진 (Matrix Science, London, UK)와 IPI_human_ver 2.34, www. ebi. ac. uk 이용하여 펩티드를 그룹화하고 단백질의 정보를 확인할 수 있다.
nano-ACQUITY Ultra Performance LC chromatography System (Waters Corporation, MA, USA)을 이용한 액체 크로마토그라피를 수행하였다. 칼럼은 75 m 250 mm nano-ACQUITY UPLC 1.7 m BEH300 C18 RP 칼럼과 180 m 20 mm Symmetry C18 RP 5 m 프리칼럼을 사용하였으며, LC 그레디언트 프로그램과 실험방식은 이전 논문을 참고 하였다.(Xu, D., et al,.Mol Cell Proteomics7, 2215-2228. 2008 & Chung, Y., et al., J Am Soc Mass Spectrom20, 751-754. 2009) 연속성 있는 LC/MSE 데이터는 PLGS(ProteinLynx GlobalServer) version 2.3.3 (Waters Corporation)을 이용하여 질량 분석 및 펩티드의 정보 조사를 하였다.
단백질 동정은 IPI 인간 데이터 베이스 (version 3.44)를 검색하여 얻었고, 단백질 동정은 적어도 2개의 펩티드의 정렬에 근거하여도 얻었다. 단백질 양의 양적 변화의 분석은 ExpressionTM 소프트웨어(version 2)를 사용하여 수행되었으며, 이는 low collision 에너지 모드(MS)에서 3회 반복 수행으로 얻어진 펩티드 이온 피크의 세기를 측정하는 것에 근거하였다. 비교 프로테오믹 데이터의 표준화를 위하여 PLGS의 자동 표준화 기능이 사용되었다. 모든 단백질은 95%이상의 신뢰도로 동정되었다. 마지막으로 expression 소프트웨어는 EMRT(exact mass retention time) 표로 결과를 생성하였으며, 이는 단백질 펩티드 정보 및 이의 양적 수치를 가지는 것이다.
이와 같이 하여 상기의 결과를 난소암 특이적 산화 민감성 단백질 동정을 위해서 MASCOT (version 2.1) 데이터베이스 (database; DB) 검색엔진(Matrix Science, London, UK)과 IPI_human_version 2.33(www. ebi. ac. uk)을 이용하여 수행한 결과, 총 3,503개의 펩티드 정보를 확인 할 수 있었다.
<3-3> 바이오인포메틱스를 이용한 난소암 특이적 산화 민감성 단백질 동정
실시예 <3-1>에서 확인된 단백질들을 IPA (Ingenuity Pathway Analysis, Ingenuity Systems Inc., www.ingenuity.com) 프로그램을 이용하여 상호연관성 여부를 판단하였다. 상기의 상호연관성 여부를 확인한 단백질 군들의 세포내 네트워크를 분석하여 세포내 미치는 영향을 IPA 프로그램을 이용하여 분석, 예측하였다.
그 결과 정상조직에서는 2281개, 암조직에서는 155개의 단백질을 그룹화 하였다. 이 중에서 61개의 단백질이 공통적으로 동정이 되었고, 이 중에 시스테인의 산화 민감성 패턴에 차이를 보이는 14개의 단백질을 선정할 수 있었다.(표 1) 그 중 콜라겐 유형 알파 1(COL6A1, No. IPI00291136, MW 108,53kDa, pI 5.26)의 정상조직과 암조직에서 산화 민감성을 나타내는 펩티드 부위의 서열이 다른 것을 확인하였다.
BIAM 결합에 따른 난소암 특이적 산화민감성 단백질들의 정보
IPI No. 유전자명 분자량
(Da)		 단백질 명칭 IAM 특이적 결합 펩티드*
IPI00010951 EPPK1 555,621 Epiplakin ON-DCLCQMLD
IPI00013079 EMILIN1 106,667 EMILIN-1 precursor OT-VAYKTVTDMEWRCCQGYGG
OT-DEGCGACGGVQEELGRLRDGVER
IPI00021033 COL3A1 138,564 Isoform 1 of Collagen alpha-1(III) chain precursor ON-IICDD
IPI00025276 TNXB 464,456 Isoform XB of Tenascin-X precursor ON-CRGHGLCEDGVCVCDCSTRTCPRDCRGR
OT-AGQCVCVEGFR
IPI00216230 TMPO 75,492 Lamina-associated polypeptide 2 isoform alpha OT-DLALCRAYEAAASALQIATHTAFVAKAMQA
IPI00291136 COL6A1 108,529 Collagen alpha-1(VI) chain precursor ON-ECEILDIIMKMCSCCECK
OT-AVAFQDCPVD
IPI00298994 TLN1 269,767 Talin-1 OT-AIADMLRACKEAAYHPEVAP
OT-DSINQLITMCTQQAPGQKECD
IPI00302592 FLNA 280,018 Filamin A OT-MSCMDNK
OT-CSKAGNNMLLVGVHGPRTPCEEILVKHVGSRLYSVSYLLK
IPI00304840 COL6A2 108,579 Isoform 2C2 of Collagen alpha-2(VI) chain precursor OT-TINRIIKVMKHEAYGECYK
IPI00305166 SDHA 72,688 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit ON-CCCVADR
IPI00337335 MYH14 228,002 Isoform 1 of Myosin-14 ON-ACRVAEQAAND
IPI00387144 TUBA1B 57,760 Tubulin alpha-1B chain ON-DICRRNL
IPI00472724 EEF1AL3 50,185 Elongation factor 1-alpha OT-CILPPTRPTDKPLR
IPI00076042 Hsp60s2 27,096 Short heat shock protein 60 ON-IAECKKQILQAKR
*ON: 난소암 정상조직에서 BIAM이 결합하고 있는 펩티드 서열
*OT: 난소암 암조직에서 BIAM이 결합하고 있는 펩티드 서열
COL6A1: 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1
<실시예 4>
난소암 조직에서의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1의 산화 확인
균질화된 정상조직과 난소암조직 샘플을 4시간 동안 BIAM과 반응시킨 후, 4mM DTT (Dithiothreitol)를 처리하여 비특이적인 결합을 중단시킨 다음, 원심분리를 통해 하층의 막단백질을 회수하여 브레드포드법으로 양을 측정하였다. 30㎍의 정상조직과 난소암조직 샘플을 pH 3에서 10인 7cm 스트립(Strip)을 이용하여 등전점 전기영동을 실시하였다. 등전점 전기영동 후 10% SDS-PAGE 젤로 2차원 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 젤에 있는 단백질을 PVDF 멤브레인에 옮긴 후 웨스턴 블랏을 수행하였다. 1차 항체로 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 (sc-20649, SantaCruz Biotechnology, INC.)을 1:1000으로 5% 탈지분유에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 2차 항체인 토끼 IgG-HRP(Horseradish Peroxidase)로 1시간 반응시킨 후 ECL로 발광시켰다.
그 결과 도 3에서 보듯이, 삼성병원과 중앙대학교 병원의 난소암 환자의 정상조직과는 달리 암조직에서만 산화된 패턴을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 4에서와 같이 1기 (stage I)에서 보다 3기 (stage III)로 갈수록 변형이 정상조직과는 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해서 확인된 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1은 산화 변형 시스테인을 가진 펩티드를 항원으로 사용하여 항체를 제작, 생산 할 수 있고, 바이오마커로써의 의학적인 진단용 항체로 이용할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 난소암을 진단할 수 있는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드는 난소암에서 특이적으로 산화 변형을 보이므로 이를 검출하는 경우 난소암의 진단의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드(collagen type Ⅵ alpha 1)내의 시스테인 잔기에서 산화가 일어난 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화된 형태의 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드내의 시스테인 잔기에서 산화가 일어난 난소암 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화는 시스테인 잔기의 -SH(thio)이 S-S(disulfide), -SOH(sulfenic), -SOOH(sulfinic), -SOOOH(sulfonic)에서 선택된 어느 하나의 형태로 변화된 것임을 특징으로 하는 난소암 진단용 조성물.
  4. 제1항의 산화된 형태의 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합물질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결합물질은 항체, 앱타머(aptamer), 펩티도 미메틱스(peptido mimetics)에서 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 결합물질.
  6. 삭제
  7. 제4항에 따른 결합물질을 유효성분으로 포함하는 난소암 진단용 조성물.
  8. 제7항에 따른 조성물을 포함하는 난소암 진단용 키트.
  9. 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료에 존재하는 콜라겐 유형 Ⅵ 알파 1 폴리펩티드의 시스테인 산화 여부를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 시료는 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 콜라겐 유형 VI 알파 1 폴리펩티드내의 시스테인 잔기에서의 산화 여부를 검출함을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
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