KR101237943B1

KR101237943B1 - 단백질 시스테인의 새로운 산화적 변형물인 단백질 시스테인-(ｓ)-티오설폰산 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101237943B1
Application number: KR1020100136805A
Authority: KR
Inventors: 정재호; 나승진; 백은옥; 이희윤; 이공주
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2013-02-28
Also published as: KR20120074843A

Abstract

본 발명은 단백질 시스테인의 새로운 산화적 변형물인 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산 및 이를 유효성분으로 함유하는 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질의 활성 시스테인-(S)-티오설폰산은 단백질의 산화 및 환원에 관련되어 중요한 역할을 맡고 있는 시스테인에서의 기존 변형과는 차별되는 비가역적 경로의 산물이며 추가적인 반응을 통해 기존 아미노산으로서의 특성을 잃게 되어 다른 특성을 나타낼 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산은 질환관련 단백질의 산화정도 측정에 활용할 수 있고, 이에 따라 활성 산소종과 관련된 다양한 질환(염증질환, 암, 심혈관계, 면역계, 뇌질환 등)의 바이오마커로 사용할 수 있으며, 이를 분석할 수 있는 항체는 임상분석에 사용할 수 있다.
[화학식 1]
Protein-Cys-SO₂-SH

Description

단백질 시스테인의 새로운 산화적 변형물인 단백질 시스테인-(Ｓ)-티오설폰산 및 이의 용도{Protein Cysteine-(S)-thiosulfonic acid as a novel oxidative modification in protein redox-active cysteine residues and use thereof}

본 발명은 단백질 시스테인의 새로운 산화적 변형물인 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산 및 이의 용도에 관한 것이다.

단백질의 변형(Protein modification)은 천연의 단백질이 가지고 있던 원래의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산으로 치환됨으로써 그 생리적 특성이 변화되는 것을 말하며, 이러한 단백질의 변형은 단백질이 갖고 있던 원래의 특성을 상실하고 새로운 단백질의 창출을 의미한다.

활성 산소종(ROS)은 시스테인(Cysteine)의 티올기에 산화적 변형을 야기함으로서 세포의 증식, 사멸, 세포 이동 및 염증 등에 관여하게 된다(Berlett, B. S., and Stadtman, E. R. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J. Biol. Chem. 272, 20313-20316). 시스테인은 낮은 산해리상수(pKa)를 갖는 경우, '산화환원 활성 시스테인(redox-active Cys)'이라 일컬어지며 ROS에 의해 쉽게 산화되는 특성으로 인해, 단백질의 기능을 조절하는 인자로서 역할을 수행한다. 산화적으로 활성화된 시스테인의 가역성과 산화적 변형 정도는 주변의 환경에 의해 결정되며, 퍼옥시리독신(PRX), 설피리독신(SRX) 및 티오리독신(TRX) 등의 환원력을 가진 효소들(reducing enzymes)에 의해 조절되기도 한다.

설펜산(Cys-SOH), 설핀산(Cys-SO₂H), 설폰산(Cys-SO₃H) 및 디설파이드 결합(Cys-SS-Cys) 등은 잘 알려져 있는 시스테인의 산화적 변형물(oxidative modifications)들이며, 현재는 고감도의 질량분석법(mass spectrometry)을 통해 새로운, 알려지지 않은 시스테인의 변형물들이 보고 되고 있다(Orsatti, L., Innocenti, F., Surdo, P. L., Talamo, F., and Barbato, G. (2009) Mass spectrometry study of PRL-3 phosphatase inactivation by disulfide bond formation and cysteine into glycine conversion. Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 2733-2740.; Bar-Or, R. et al., (2008) Dehydroalanine derived from cysteine is a common post-translational modification in human serum albumin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 711-716).

ROS에 의한 시스테인의 첫 번째 산화적 변형 산물은 설펜산(Cys-SOH)이라 불리며 하전 되어 반응성이 큰 상태로 존재하게 된다. 세포 내 몇몇 단백질에서 상기 설펜산의 반응성을 구조적 보완되어 안정한 상태로 유지시킬 수 있다는 것이 발견되어 최근에 보고 되고 있다(Seo Y. H., 및 Carroll, K, S. (2009) Profiling protein thiol oxidation in tumor cells using sulfenic acid-specific antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16163-16168.; Salsbury, JR. F. R., Knutson, S. T., Poole, L. B., 및 Fetrow, J. S. (2008) Functional site profiling and electrostatic analysis of cysteines modifiable to cysteine sulfenic acid. Protein Sci. 17, 299-312.; Shetty, V., 및 Neubert, T. A. (2009) Characterization of novel oxidation products of cysteine in an active site motif peptide of PTP1B. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1540-1548).

시스테인 설펜산은 비교적 안정한 환경 하에서도 반응성을 가지거나 불안정하여 쉽게 설핀산(R-SO₂H), 설폰산(R-SO₃H)을 형성하거나 또는 유리 설퍼하이드릴(R-SH)과의 반응을 통하여 디설파이드 결합(Cys-SS-Cys)으로 산화될 수 있다.

설핀산은 ATP-의존 설핀산 환원효소인 설피리독신(SRX)의 발견 전까지 비가역적 반응이라 생각되었으나, 최근 퍼옥시리독신의 시스테인 설핀산이 SRX에 의해 환원될 수 있다는 사실이 밝혀졌다(Biteau, B., Labarre, J., 및 Toledano, M. B. (2003) ATP-dependent reduction of cysteine-sulphinic acid by S. cerevisiae sulphiredoxin. Nature 425, 980-984.; Woo H. A., Jeong W., Chang T. S., Park K. J., Park S. J., Yang J. S., 및 Rhee S. G. (2005) Reduction of cysteine sulfinic acid by sulfiredoxin is specific to 2-cys peroxiredoxins. J. Biol. Chem. 280, 3125-3128).

설펜산과 비교하여 설핀산은 상대적으로 안정한 중간 산물로서 설폰산으로 변형될 수 있으며, 설폰산은 티올기의 가장 산화된 비가역적 변형물이다(Aversa, M. C., Barattucci, A., Bonaccorsi, P., 및 Giannetto, P. (2007) Recent advances and perspectives in the chemistry of sulfenic acids. Curr. Org. Chem. 11, 1034-1052.; Poole, L. B., 및 Nelson, K. J. (2008) Discovering mechanisms of signaling mediated cysteine oxidation. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 18-24.; Reddie, K. G., 및 Carroll, K. S. (2008) Expanding the functional diversity of proteins through cysteine oxidation. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 746-754).

디설파이드 결합은 설펜산과 유리 설퍼하이드릴의 반응에 의해 형성될 수 있으며 가역적으로 유리 설퍼하이드릴화 되어 세포 내 신호전달 경로에서 중요한 역할을 담당하고 있다(Walsh, C. T. (2006) Posttranslational modification of proteins expanding nature’s inventory. Roberts and Company Publishers 95-120). 또한, 디설파이드 결합 상태에서 더욱 산화된 형태로 티오설피네이트(thiosulfinate), 티오설포네이트(thiosulfonate), 디설파이드 트리오사이드(disulfide trioside)와 디설폰(disulfone) 등을 형성할 수도 있다. 하지만 단백질 상에서의 디설파이드 결합보다 더 산화된 형태의 변형물들에 대한 연구는 많이 되어 있지 않다.

시스테인의 변형물들(post-translational modifications; PTMs)은 다양한 단백질에서 특별한 기능적 역할들이 밝혀져 있으며 단백질 기능 조절에 대한 이해에 상당히 중요하다.

이에, 본 발명은 단백질 시스테인의 변형물들의 연구에서, 질량분석법을 통하여 확인(또는 규명)한 새로운 시스테인 변형물 구조적으로 안정하고 다양한 단백질에서 탐지하여 이를 활성 산소종과 관련된 다양한 질환(특히, 염증과 관련된 질환, 암, 심혈관계, 면역계, 뇌질환 등)의 바이오마커로 사용하는 것을 요지로 한다.

본 발명의 목적은 새로운 단백질 시스테인의 변형물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 새로운 단백질 시스테인의 변형물을 이용한 바이오마커를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새로운 단백질 시스테인의 변형물인 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산을 제공한다.

[화학식 1]

Protein-Cys-SO₂-SH

또한, 본 발명은 상기 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산을 이용한 활성 산소종 관련 질환의 진단용 바이오마커를 제공한다.

본 발명에 따른 단백질의 활성 시스테인-(S)-티오설폰산은 단백질의 산화 및 환원에 관련되어 중요한 역할을 맡고 있는 시스테인에서의 기존 변형과는 차별되는 비가역적 경로의 산물이며 추가적인 반응을 통해 기존 아미노산으로서의 특성을 잃게 되어 다른 특성을 나타 낼 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산은 질환관련 단백질의 산화정도 측정에 활용할 수 있고, 이에 따라 활성 산소종과 관련된 다양한 질환(염증질환, 암, 심혈관계, 면역계, 뇌질환 등)의 바이오마커로 사용할 수 있으며, 이를 분석할 수 있는 항체는 임상분석에 사용할 수 있다.

도 1a 내지 1c는 질량 분석기를 이용한 본 발명에 따른 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산의 발견을 나타내는 도면이다.
도 2a 내지 2d는 NDPK A를 모델 단백질로 이용하여 +64 Da과 디설파이드 결합의 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산(Cys +64 Da)의 구조적 안정성을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새로운 단백질 시스테인의 변형물인 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산을 제공한다.

[화학식 1]

Protein-Cys-SO₂-SH

본 발명에 따른 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산은 단백질 시스테인의 새로운 산화적 변형물로서 질량 분석법(Mass spectrometry)에 의해 확인되었으며, 시스테인의 질량 차 +64 Da을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산은 디설파이드 결합을 가지는 단백질의 산화에서 유도되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면 글리세랄알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH), 뉴글레오사이드 디포스페이트 키나아제 A(NDPK A), 퍼옥시레독신 6(PRDX6), 마우스 미토콘드리아 단백질 등에서 유도된다.

질량 분석법(Mass spectrometry)은 고효율, 고감도의 기술로서 단백질의 변형물의 발견에 있어 유용하다[Aebersold, R., and Mann, M. (2003) Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198-207].

본 발명에서 고감도의 질량분석법인 "SEMSA" 방식, 분석된 데이터의 새로운 디설파이드 결합의 해석방식인 "Dbond" 알고리즘과 알려지지 않은 단백질의 변형물 확인이 가능한 "MODi"와 "MODmap"의 알고리즘을 사용하였다[Seo J., Jeong J., Kim Y. M., Hwang N., Paek E., and Lee K. J. (2008) Strategy for comprehensive identification of post-translational modifications in cellular proteins, including low abundant modifications: application to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Proteome Res. 7, 587-602.; Choi S., Jeong J., Na S., Lee H. S., Kim H. Y., Lee K. J., and Paek E. (2010) New algorithm for the identification of intact disulfide linkages based on fragmentation characteristics in tandem mass spectra. J. Proteome Res. 9, 626-635.; Na S., Jeong J., Park H., Lee K. J., and Paek E. (2008) Unrestrictive identification of multiple post-translational modifications from tandem mass spectrometry using an error-tolerant algorithm based on an extended sequence tag approach. Mol. Cell. Proteomics 7, 2452-2463.; Na S., and Paek E. (2009) Prediction of novel modifications by unrestrictive search of tandem mass spectra. J. Proteome Res. 8, 4418-4427].

다양한 단백질을 대상으로 질량분석을 실시 한 결과, 글리세랄알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH), 뉴글레오사이드 디포스페이트 키나아제 A(NDPK A), 퍼옥시레독신6(PRDX6), 마우스 미토콘드리아 단백질 등에서 질량 차 +63.97(+64) Da을 가지는 기존에 알려져 있지 않은 시스테인 변형물을 확인, 검출하였다(도 1a-c 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산은 하기 반응식 1에 나타낸 경로로 생성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

[반응식 1]

질량 차 +64 Da이 가능한 원소 조성(MassLynx^TM V.4.1) 분석을 통해 시스테인에 이산화황(-SO₂)의 결합이 확인되며, 그것의 유래는 디설파이드 결합이 가능하다. 디설파이드 결합 유래의 물질임을 확인하기 위해, 디설파이드 결합을 형성하는 단백질로서 잘 알려진 NDPK A의 시스테인을 N-에틸말레이미드(NEM)를 이용하여 알킬화하여 디설파이드 결합 형성을 방지한 NDPK A와 일반 반응 조건에서 디설파이드 결합을 유도한 NDPK A를 비환원 1D SDS 겔로 확인하였다(도 2a). NDPK A의 산화된 혹은 환원된 형태를 질량분석기로 분석하여 질량 차 +64 Da을 가지는 전구체 질량 값을 크로마토그램 상에서 추출하였고, 산화된 NDPK A에서 존재하는 것을 확인하였다(도 2b). 또한 산화된 NDPK A에서 4C과 109C의 디설파이드 결합과 티오설포네이트를 검출할 수 있다(도 2c, 2d). 종합하여 볼 때 +64 Da을 가지는 시스테인 변형물이 디설파이드 결합을 가지는 단백질에서 유도됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산을 유효성분으로 함유하는 바이오마커를 제공한다.

NDPK A 분석을 통해 검출된 티오설포네이트를 통하여 이것의 C-S 결합의 절단으로 본 발명에 따른 Cys-SO₂-SH(+64 Da, cysteine-(S)-thiosulfonic acid)이 생성되며, 이는 티오설포네이트의 다양한 생리적 염기 조건에서 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 상보적 형태인 시스테인 디하이드로알라닌(DHA)의 검출을 정량 분석(NMR yield)함으로써 증명하였다(표 1 참조).

NDPK A의 에너지 최소화된 모델에 근거하여 Cys109번에서의 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 음전하는 주변에 위치한 Arg18과 ~1.8 A의 거리 내에서 염 다리를 형성함으로써 구조적 안정성을 확보하는 것으로 나타났다(도 3 참조).

단백질 내에서의 구조적 조건이 위에서 언급된 화학적 반응조건과 일치하는지 인간 NDPK A의 잘 알려져 있는 결정구조분석을 통해 확인하였다. NDPK A의 Cys109은 인접한 Cys109' 번과 함께 단백질간 디설파이드를 형성하는 것으로 알려져 있으며 Cys4와는 단백질내 디설파이드 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다. NDPK A의 에너지 최소화 모델에 근거하여 Cys109 번에서의 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 음전하는 주변에 위치한 Arg18과 ~1.8 A의 거리 내에서 염 다리를 형성함으로써 구조적 안정성을 확보하는 것으로 나타났다(도 3 참조).

따라서, 본 발명에 따른 단백질 시스테인-(S)-티오설폰산은 디설파이드 유래의 비가역적 산물임을 다시 한번 확인 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)이 단백들의 보편적인 변형물인지를 확인하고자 B16F10 흑색종 세포와 마우스 간에서의 미토콘드리아 단백질을 분리하여 2D 전기영동을 수행하였고 질량분석법을 이용하여 여러 단백질에서의 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 존재를 확인하였다.

구체적으로, B16F10 흑색종 세포내 산화환원효소인 퍼옥시리독신 6(O08709) 의 활성 시스테인 잔기인 Cys47에서 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)이 발견되었고, 마우스 간 미토콘드리아 내 설파이트 옥시다아제(Q8R086), 단백질 ETHE1(Q9DCM0), 카바모일 포스페이트 신타아제(Q8C196)등의 단백질에서도 발견되었다. 이로부터, 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)은 시스테인을 함유한 산화 환원을 하는 단백질에서 보편적으로 가질 수 있는 변형물임을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산은 단백질의 산화 및 환원에 관련되어 중요한 역할을 맡고 있는 시스테인에서의 기존 변형과는 차별되는 비가역적 경로의 산물이며 추가적인 반응을 통해 기존 아미노산으로서의 특성을 잃게 되어 다른 특성을 나타낼 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 시스테인-(S)-티오설폰산은 활성 산소종 관련 질병 단백질의 산화정도 측정에 활용할 수 있고, 이에 따라 활성 산소종과 관련된 질환인 염증질환, 암, 심혈관계, 면역계, 뇌질환 등의 바이오마커로 사용할 수 있으며, 이를 분석할 수 있는 항체는 임상분석에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 단백질 시스테인-(S)- 티오설폰산의 제조

(1) 단백질 변형

37 ℃ 및 5% CO₂에서 인간 배아 신장 상피 세포(HEK293T)를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 고(high) 글루코스 둘베코 변성 이글스 배지(DMEM)에서 배양 및 유지시켰다. 모든 실험은 50% 융합 세포 배양에서 수행되었다. 상기 세포들(1.5 × 10⁶)을 10 cm 플레이트에 씨드하고, 칼슘 포스페이트법에 의해 6 μg의 Flag-GAPDH 발현 플라스미드로 감염 및 단기 복제시켰다. 상기 배지는 복제 후 6시간 후에 교체 한 다음 추가 19시간 동안 배양시키고, HBSS(Hanks balanced salts)에서 1 mM H₂O₂로 37 ℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 면역 침강(immunoprecipitation) 연구를 위해, 상기 세포들은 얼음에서 30분 동안 pH 8.0이고 50 mM Tris 염기, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 5 μg/mL 아프로티닌, 1 μg/mL 류펩틴 및 5 mM NaF를 함유하는 완충액에 용해시켰다. 용해물을 20,000 × g에서 1시간 동안 원심분리하고 상등액을 모노클론 항-Flag M2-친화성 아가로스 비드와 함께 4 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 비드는 1 mL의 용해 완충액으로 3번 세척하였다. 석출된 면역 복합체는 프로테아제 저해제(9.5 M 우레아, 2% Triton X-100, 5% β-머캅토에탄올, 1 mM PMSF, 5 μg/mL 아프로티닌, 10 μg/mL 펩스타틴 A, 10 μg/mL 류펩틴, 1 mM EDTA, 10 mM Na₃VO₄, 10 mM NaF)를 함유하는 시료 완충액에 넣고 상온에서 30분 동안 방치하였고, 산 말단기에 컵 로딩을 적용하여 Amersham IPGphor를 이용하여 7 또는 18 cm Immobiline DryStrip(pH 3-10)들에 전기포커싱을 수행하였다. 상기 스트립들을 다음으로 평형 완충액(1.5 M Tris-Cl, pH 8.8, 6 M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 및 10 mg/mL 디티오트레이톨)에 넣고 15분 동안 교반시킨 후, 2차원 SDS-PAGE을 수행하였다.

문헌[Sabio, G., Arthur, J. S. C., Kuma, Y., Peggie, M., Carr, J., Murray-Tait, V., Centeno, F., Goedert, M., Morrice A. N. and Cuenda, A. (2004) p38γ regulates the localisation of SAP97 in the cytoskeleton by modulating its interaction with GKAP free Guadalupe. EMBO J. 24, 1134-1145]에 개시된 방법대로 Subcellular Proteome Extract kit(Calbiochem)을 이용하여 마우스 간으로부터 미토콘드리아 단백질을 분리하였다. 상기 단백질은 용해 완충액에서 용해시켰으며, 문헌[Kim Y. M., Seo J., Kim Y. H., Jeong J., Joo H. J., Lee D. H., Koh G. Y., and Lee K. J. (2007) Systemic analysis of tyrosine phosphorylated proteins in angiopoietin-1 induced signaling pathway of endothelial cells. J. Proteome Res. 6, 3278-3290; Seo J., Jeong J., Kim Y. M., Hwang N., Paek E., and Lee K. J. (2008) Strategy for comprehensive identification of post-translational modifications in cellular proteins, including low abundant modifications: application to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Proteome Res. 7, 587-602]에 개시된 대로 2D PAGE에서 분리시켰다.

(2) 나노 UPLC - ESI -q- TOF 텐덤 질량 분광 분석을 이용한 단백질 변형물의 분석

트립신을 이용하여 겔 밴드 또는 스팟(In gel digestion)에서 단백질을 펩티드화 하여 문헌[Seo J., Jeong J., Kim Y. M., Hwang N., Paek E., and Lee K. J. (2008) Strategy for comprehensive identification of post-translational modifications in cellular proteins, including low abundant modifications: application to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Proteome Res. 7, 587-602]에 기재된 대로 추출하였다. 용액 내(In solution digestion)에서의 트립신 처리를 통한 펩티드 분해를 위해서는 초음파처리법을 사용하였다. 구체적으로, 초음파로 5분간 단백질을 처리한 후 트립신 첨가 하여 37 ℃에서 교반 배양기를 이용하여 펩티드화 하였다. 펩티드 추출물은 SpeedVac 내에서 증류시켜 건조한 후 0.1% 포름산이 함유된 10% ACN 내에서 재용해 시켰다. 용해된 펩티드는 문헌[Lee E., Jeong J., Kim S. E., Song E. J., Kang S. W., and Lee K. J. (2009) Multiple functions of Nm23-H1 are regulated by oxido-reduction system. PLoS ONE 4 (11), e7949]에 개시된 대로, nanoAcquity^TM/ESI/MS(SYNAPT^TMHDMS^TM, Waters Co., UK)을 이용하여 트랩 컬럼(ID 180 μM × 20 mm, Symmetry　C18) 카트리지를 사용하여 탈염 후 C18 역상 75 μm i.d. × 200 mm 분석 컬럼(1.7 μm 입자 크기, BEH130 C18, Waters Co. UK)를 사용하여 분리, 집적된 전기분사이온화 장치인 PicoTip^TM(±10 μm i.d., New Objective, USA)을 이용하여 이온화 후 분석하였다.

(3) 데이터베이스 검색( Database search )

상기 질량 분광분석으로부터 얻은 미가공 데이터는 ProteinLynx Global Server 데이터 가공 소프트웨어(PLGS^TM, version 2.3, Waters Co. UK)를 이용하여 .pkl 파일로 변환시켰다. 이후, Mascot 검색(version 2.2.06) 프로그램을 이용하여 SwissProt human 데이터베이스(version 57.8., 20401 entries)에서 상기 MS/MS 스펙트럼을 아미노산 서열과 매치해보았다.

이때 검색 파라미터는 하기와 같다:

- 펩티드 및 조각 이온의 매치 질량 오차 범위는 0.3 Da까지 허용;

- miss-cleavage 범위는 1개까지 허용.

아세틸화(N-말단), 포르밀화(Lys), 탈아미드화(Asn 및 Gln), 산화(Met), 인산화(Ser, Thr, 및 Tyr), 파이로-Glu 변형(N-말단 Glu 및 N-말단 Gln) 및 프로피온 아미드화 또는 카바미도 메틸화(Cys)가 검색된 변형이었다. 상기 Mascot 검색에 의해 가능성 있는 단백질 변형물의 수 및 형태를 결정한 후, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)에서 다운로드 받은 각 단백질의 FASTA 파일에 대하여 MODⁱ, DBond 및 MODmap 프로그램(http://prix.uos.ac.kr/)[Choi S., Jeong J., Na S., Lee H. S., Kim H. Y., Lee K. J., and Paek E. (2010) New algorithm for the identification of intact disulfide linkages based on fragmentation characteristics in tandem mass spectra. J. Proteome Res. 9, 626-635]을 이용하여 추가 검색을 수행하였다.

단지 MASCOT probability analysis(Mowse 점수 p<0.05에 기초한 확률)에 의해 제시된 중요 히트(significant hits)만이 고려되었다. 추가적으로, 최소 20 이상의 Mascot score의 펩티드 매치를 포함하는 단백질 score 50 이상을 허가 한계점으로서 책정되었다.

모든 보고 된 배열은 스펙트럼의 자동적 및 매뉴얼 설명서에 의해 증명되었다. 각 변형은 측정된 질량 이동에 의해 배열되었다.

그 결과를 도 1a~1c에 나타내었다.

도 1a~1c에 나타낸 바와 같이, 질량분석 결과 글리세랄알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH), 퍼옥시레독신6(PRDX6), 마우스 미토콘드리아 단백질에서 질량 차 +64 Da을 가지는 기존에 알려져 있지 않은 시스테인 변형물을 발견하였다.

<조성 분석>

실시예에서 발견된 질량 차 +64 Da의 시스테인 변형물의 원소 조성를 확인하기 위하여 질량 차 +64 Da이 가능한 원소 조성(MassLynx^TM V.4.1) 분석을 수행하였다.

분석 결과, 시스테인에 이산화황(-SO₂)의 결합이 질량값 5 ppm내의 가장 유력한 후보였으며, 그것의 유래는 디설파이드 결합으로 예상되었다.

< 실험예 1> +64 Da 을 가지는 시스테인 변형물이 디설파이드 결합을 가지는 단백질에서 유도됨을 확인

상기 실시예에서 발견된 질량 차 +64 Da의 시스테인 변형물(시스테인-(S)-티오설폰산)이 디설파이드 결합을 가지는 단백질에서 유도됨을 확인하기 위하여 디설파이드 결합을 형성하는 단백질로서 잘 알려진 NDPK A의 시스테인을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

재조합형 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 A(NDPK A, Nm23-H1) 및 이의 C4S 변종은 nm23-H1 코딩 영역을 함유하는 pET-3c 발현 플라스미드로 전사된 대장균(E. coli) 스트레인 BL21(DE3)의 시토졸 부분으로부터 분리하고, 하기와 같이 ATP 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

구체적으로 시토졸 분획은 각각 완충액 A(20 mM 트리스-아세테이트, 20 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂, pH 7.4)로 평형화된 2 ~ 4 mL의 ATP-세파로스 컬럼에 유속 3 mL/min으로 적용하였다. 상기 컬럼은 이후 완충액 A 및 0.25 M NaCl을 함유한 동일한 완충액 A로 세척하여 비특이적 결합된 단백질을 제거하고, 1 mM ATP를 함유하는 완충액 A로 용출시켰다. 다음으로 상기 재조합된 NDPK A를 1 또는 5 mM H₂O₂로 30분 동안 처리하고, 이후 PBS 또는 알킬화제인 20 mM N-에틸말레이미드(NEM)로 30분 동안 37 ℃에서 처리하여 디설파이드 결합 형성을 방지한 NDPK A와 일반 반응 조건에서 디설파이드 결합을 유도한 NDPK A를 제조하였다. 마지막으로 상기 NDPK A에 비환원 조건하에서 12% SDS-PAGE를 수행하여 산화/환원 상태를 확인하기 위해 coomassie blue로 염색하여 겔 상에서 확인하였다.

그 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, NDPK A의 디설파이드 결합의 형성을 확인할 수 있다.

이후, NDPK A의 산화된 혹은 환원된 형태를 질량분석기로 분석하여 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)을 가지는 전구체 질량을 크로마토그램 상에서 추출하고 정량한 결과를 도 2b에 나타내었다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 상기 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)을 가지는 물질은 산화된 NDPK A에서 존재하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 산화된 NDPK A의 질량분석결과를 도 2c 및 도 2d에 나타내었다.

도 2c 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, 산화된 NDPK A에서 4C과 109C의 디설파이드 결합과 티오설포네이트가 검출되었다.

종합하여 볼 때, 이로부터 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)을 가지는 시스테인 변형물이 디설파이드 결합을 가지는 단백질에서 유도됨을 알 수 있다.

< 실험예 2> 티오설포네이트로부터 Cys - SO ₂ - SH (+64 Da ) 생성 확인

NDPK A 분석을 통해 검출된 티오설포네이트로부터 Cys-SO₂-SH(+64 Da, cysteine-(S)-thiosulfonic acid)가 생성됨을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

당 학계에서 통상적으로 사용되는 유기합성 방법을 이용하여 N,N'-디-Cbz-L-시스테인 디메틸에스테르[Liu, L., Tanke, R. S., and Miller, M. J. (1986) Electrophilic sulfur transfer reactions in organic synthesis. Preparation of a diastereomer of the key macrocyclic component of griseoviridin. J. Org. Chem. 51, 5332-5337]에 m-CPBA 산화반응을 이용하여 티오설포네이트를 합성하였다.

상기 티오설포네이트와 디설파이드 결합을 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 다양한 염기 조건에서 변환시켜 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 상보적 형태인 시스테인 디하이드로알라닌(DHA)의 검출을 정량 분석(NMR yield)하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[반응식 2]

Entry	Substrate	conditions	Product (NMR yield)
1	2	이미다졸(1 eq).CH₂Cl₂, 상온, 2일	1.6%
2	2	이미다졸(2 eq).H₂O, 상온, 3일	0%
3	3	이미다졸(1 eq).CH₂Cl₂, 상온, 2일	18.5%
4	3	이미다졸(2 eq).H₂O, 상온, 3일	2.9%
5	3	NaHCO₃.H₂O/MeOH. 상온, 2일	34.2% 및 Serine

표 1에 나타낸 바와 같이, 염기 조건하에서 티오설포네이트가 분해하여 DHA를 생성함을 확인할 수 있으며, 5번의 조건하에서 +64 Da의 상보적인 형태인 세린(Serine)이 발견 되었다. 이로부터 세포 내에서 티오설포네이트를 통하여 DHA와 세린을 형성하는 것이 가능함을 알 수 있다.

< 실험예 3> 모델링을 통한 Cys - SO ₂ - SH (+64 Da )의 안정성 확인

sybylx1.1 프로그램(CERTARA, Missouri, USA)의 에너지 최소화 프로토콜의 MMFF94를 사용하여 인간 NDPK A의 알려진 구조(PDB ID: 1JXV)를 기초로 하여 Cys109가 Cys-SO₂-SH로 변형된 인간 NDPK A의 에너지 최소화된 모델을 제작하여 도 3에 나타내었다.

상기 최적화된 구조의 입체화학성은 PROCHECK[Laskowski R. A., Macarthur M. W., Moss D. S., and Thornton J. M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 283-291]에 의해 평가하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, NDPK A 단백질 내에서 Cys109 번에서의 시스테인-(S)-티오설폰산(+64 Da)의 음전하는 주변에 위치한 Arg18과 ~1.8 A의 거리 내에서 염 다리를 형성함으로써 구조적 안정성을 갖는 것으로 나타났다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 새로운 단백질 시스테인의 변형물.
[화학식 1]
Protein-Cys-SO₂-SH
제1항에 있어서, 상기 단백질 시스테인의 변형물은 시스테인의 질량 차 +64 Da을 가지는 것을 특징으로 하는 변형물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 시스테인의 변형물은 디설파이드 결합을 가지는 단백질의 산화에서 유도되는 것을 특징으로 하는 변형물.
제3항에 있어서, 상기 단백질은 글리세랄알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH), 뉴글레오사이드 디포스페이트 키나아제 A(NDPK A), 퍼옥시레독신 6(PRDX6) 및 마우스 미토콘드리아 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 변형물.
제1항의 단백질 시스테인의 변형물을 유효성분으로 함유하는 활성 산소종 관련 질환 진단용 바이오마커.
제5항에 있어서, 상기 활성 산소종 관련 질환은 암 및 뇌질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커.