JP6756611B2 - 中和抗体を検出するための競合リガンド結合アッセイ - Google Patents
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Description
本願発明は、生物学上の生物学的治療物質に対する中和抗体(NAb)の存在を検出するためのアッセイ方法に関する。
中和抗体(Nab)などの抗体の検出は、生物学的治療剤で処置された患者について実施される免疫原性評価の一部である。中和抗体は、薬物の機能を中和し、それによって薬物の効果に負の影響を及ぼす。特定の生物学的治療剤で処置された患者におけるNAbの存在は、いくつかの免疫アッセイ方法、たとえば比色分析酵素結合免疫吸着法(ELISA)、免疫蛍光ベースの受容体結合アッセイ、可溶性固相放射免疫測定法、およびセンサーベースのアッセイなどを使って検出できる。
臨床試料のNab活性を検出する高感度かつ再現可能なアッセイを開発することが、規制上必要である。NAbを検出するための細胞ベースのアッセイは当技術分野で知られているが、細胞ベースでない競合リガンド結合(CLB)アッセイは、より優れたダイナミックレンジと感度を提供するので、より良い代替手段として機能することができる。しかしながら、CLBアッセイは、さまざまなアッセイおよびマトリックス成分からの干渉に関わる問題も有している。出願人は、患者における生物学的治療薬分子に対する中和抗体(NAb)応答を検出可能である、高感度で信頼性の高いCLBアッセイを開発した。
[本発明1001]
以下の段階を含む、必要とする患者に投与された生物学的治療タンパク質に対する中和抗体の存在を検出するための方法:
(a)患者試料を捕捉試薬と混ぜ合わせる段階、および
(b)検出試薬を加える段階であって、対照試料と比較して低いシグナルが、生物学的治療剤に対する中和抗体の存在を示す、段階。
[本発明1002]
前記生物学的治療タンパク質がモノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記生物学的治療タンパク質が抗インターロイキン-6受容体α(IL-6Rα)モノクローナル抗体である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記生物学的治療タンパク質がサリルマブまたはトシリズマブである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記生物学的治療タンパク質がサリルマブである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記患者がIL-6依存性疾患について処置される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記IL-6依存性疾患が、関節リウマチ、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、結合組織障害、キャッスルマン病、および前立腺がんのうちの一つである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記IL-6依存性疾患が関節リウマチである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記捕捉試薬が、標識された生物学的治療タンパク質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記捕捉試薬が、標識されたサリルマブである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記標識されたサリルマブがビオチン化サリルマブである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記ビオチン化サリルマブがアビジンコーティングプレートに結合している、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記検出試薬が、標識された可溶性IL-6受容体αである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記検出試薬が、ルテニウム標識された可溶性IL-6受容体αである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記患者試料が、段階(b)の前に低pHによる処理に供される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記患者試料が、段階(b)の前に酢酸による処理に供される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記低pHによる処理の後に中和が続く、本発明1015または1016の方法。
[本発明1018]
前記アッセイが、約150ng/mLの感度公差、約500ng/mLの薬物耐容性、および約1μg/mLの標的干渉耐容性を示す、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
以下の段階を含む、必要とする患者に投与されたサリルマブに対する中和抗体の存在を検出するための方法:
(a)患者の血清試料を、ビオチン化サリルマブを含む捕捉試薬と混ぜ合わせる段階、および
(b)混ぜ合わせた血清試料と捕捉試薬を低pHによる処置に供した後、中和段階を行う段階、
(d)検出試薬を加える段階であって、該検出試薬が、標識された可溶性IL-6受容体αを含み、対照試料と比較して低いシグナルが、生物学的治療剤に対する中和抗体の存在を示す、段階。
[本発明1020]
前記検出試薬が、ルテニウム標識された可溶性IL-6受容体αである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記患者が関節リウマチに罹患している、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記アッセイが、約150ng/mLの感度公差、約500ng/mLの薬物耐容性、および約1μg/mLの標的干渉耐容性を示す、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記本発明のいずれかの捕捉試薬および検出試薬、並びに使用のための指示書を含む、キット。
本願発明を説明する前に、方法や条件は変更されうるので本発明は特定の方法や詳述する実験条件に限定されないことが、理解されるべきである。また、本願発明の範囲は、添付の特許請求の範囲だけに限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを記載する目的であり、制限を意図するものではないということも理解されるべきである。
感度=約150ng/mL、薬物耐容性=約500ng/mL、標的干渉=約1μg/mL。
「中和抗体(NAb)」とは、生物学的治療分子を中和する能力を有する抗薬物抗体である。一つの態様において、生物学的治療分子は抗IL6Rα抗体サリルマブであり、NAbはIL6Rα抗体と結合して、それがIL6Rαに結合することを妨げる。
REGN88は、ヒトインターロイキン-6受容体α(IL-6Rα)に特異的なヒトモノクローナル抗体(IgG1サブクラス)である。競合リガンド結合アッセイ形式を用いた抗REGN88中和抗体(NAb)を検出するための方法は、次のように開発された。
試薬:マウス抗REGN88モノクローナル抗体(Regeneron、REGN575)、抗REGN88mAbとも呼ばれる;ビオチン化REGN88(ビオチン-REGN88またはビオチニル化REGN88);ルテニウム標識されたhIL-6Rα(Ru(bpy)3 REGN78またはルテニウム-REGN78);マウス抗ヒトIL-6Rαモノクローナル抗体(抗hIL-6Rα mAbとも呼ばれる);hIL-6Rα(REGN78);5% BSAブロッキング緩衝液;pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(1×PBS);アビジンコーティングマイクロプレート−MULTI-ARRAY(登録商標)96ウェルアビジンゴールドプレート;300mM酢酸;1.5Mトリズマ塩基溶液(トリスまたはトリスベース);リード緩衝液−界面活性剤含有MSDリード緩衝液T(4×)(4×リード緩衝液);1×洗浄緩衝液;精製水;プールされたヒト血清。
96ウェルポリプロピレンプレート(ディープウェルプレートまたはブロック);Sector Imager 2400(Meso Scale Discovery、モデル1250)MSDディスカバリーワークベンチアプリケーション付き;マイクロソフトエクセル;SoftMax(登録商標)Proアプリケーション、バージョン5.2またはそれ以上(Molecular Devices)。
インキュベーション段階の間、プレート振とうを実施した。すべての体積移動には最低限10μLが使用された。ヒト血清を扱うときには、バイオセーフティーレベル2の予防策に準拠した。品質対照(QC):QCは、最大10サイクルの凍結融解、室温での少なくとも4時間(4時間32分)の保存、または4℃冷蔵室での最長23時間(23時間20分)の保存で安定であることが示された。QC安定性は試験試料安定性の代理として使用された。陰性品質対照(NQC):市販の正常ヒト血清プールが、NQCとして使用するのに適切であった。ヒト血清プール(NQC)のアリコートを-80℃冷凍庫に保管する。
調製日以降の試料分析における使用を目的とする場合、PQCが適切であった。NQCにマウス抗REGN88モノクローナル抗体(REGN575)を添加することにより、下記の表に列挙された濃度で20×PQCを調製した。各PQCの調製のための一つの例として、次のものを使用してもよい:例:10μlのREGN575(0.88mg/mL)を、166μLのNQCに加えて混合し、50μg/mL REGN575溶液(QC前駆物質A)を得た。10μLの50μg/mL REGN575溶液を、490μLのNQCに加えて混合し、1μg/mLのREGN575溶液(QC前駆物質B)を得た。PQCは同日に使用してもよいし、等分割して-80℃冷凍庫に保管してもよい。
SNQCは、調製日以降の試料分析における使用のために適切であった。0.6μg/mLのhIL-6Rα(REGN78)の溶液をNQCで調製した。SNQCの調製のための一つの例として、次のものを使用してもよい:例:10μlのREGN78(2.3mg/mL)を、220μLのNQCに加えて混合し、100μg/mLのREGN78溶液を得た。10μLの100μg/mL REGN78溶液を90μLのNQCに加えて混合し、10μg/mL REGN78溶液を得た。30μLの10μg/mL REGN78溶液を470μLのNQCに加えて混合し、0.6μg/mLのREGN78溶液(SNQC)を得た。該SNQCは同日に使用されたか、または等分割されて-80℃冷凍庫に保管された。
QCを取り出して解凍し、試験試料を氷上または4℃冷蔵室で保存した。ディープウェルポリプロピレンプレート(試料プレート)中で、各QCおよび試験試料の10倍希釈物を300mM酢酸で調製し、混合した。例:10μLの各QC/試料を90μLの300mM酢酸に加えて混合した。試料プレートに蓋をして、室温で45±15分間インキュベートした。1% BSAを含む1×PBS溶液を調製して混合した。例:8mLの5% BSAブロッキング緩衝液を32mLの1×PBSに加えて混合した。10ng/mLのビオチニル化REGN88および50μg/mLのREGN17および0.2Mトリスを含有する1% BSAを含む溶液を調製し、混合した。例:10μLのビオチニル化REGN88(3.8mg/mL)を、370μLの1% BSAに加えて混合し、100μg/mLビオチニル化REGN88溶液を得た。10μLの100μg/mLビオチニル化REGN88を190μLの1% BSAに加えて混合し、5μg/mLビオチニル化REGN88溶液を得た。15μLの5μg/mLビオチニル化REGN88、19.3μLの19.5mg/mL REGN17、および1mLの1.5M トリズマ塩基を、6.5mLの1% BSAに加えて混合し、10ng/mLビオチニル化REGN88および50μg/mL REGN17および0.2Mトリスを含有する1% BSA溶液を得た。ディープウェルポリプロピレンプレート(試料プレート)中で、QCと試験試料の最終2倍希釈物(合計で20倍希釈)を、10ng/mLビオチニル化REGN88および50μg/mL REGN17および0.2Mトリスを含有する1% BSA溶液で調製し、混合した。例:10ng/mLビオチニル化REGN88および50μg/mL REGN17および0.2Mトリスを含有する1% BSA溶液100μLを、100μLの酸性化したQC/試料に加えて混合した。試料プレートに蓋をして、400rpmで振とうしながら室温で60±15分間インキュベートした。アッセイプレート3×を、MSDプレート3×洗浄プログラムを用いて、300μL/ウェルの1×洗浄緩衝液で洗浄した。50μLのQCおよび試験試料それぞれを試料プレートからアッセイプレートに2つ組で加えた。アッセイプレートに蓋をして、400rpmで振とうしながら室温で60±15分間インキュベートした。2μg/mLルテニウム-REGN78含有1% BSAを含む溶液を調製し、混合した。例:10μLのルテニウム-REGN78(2.9mg/mL)を280μLの1% BSAに加え、混合して、100μg/mLルテニウム-REGN78溶液を得る。140μLの100μg/mLルテニウム-REGN78を7mLの1% BSA中に移し、混合して、2μg/mlルテニウム-REGN78含有1% BSA溶液を得た。アッセイプレート3×を、MSD_プレート_3×洗浄プログラムを用いて、300μL/ウェルの1×洗浄緩衝液で洗浄した。50μL/ウェルの2μg/mlルテニウム-REGN78含有1% BSA溶液をアッセイプレートに加えた。アッセイプレートに蓋をして、400rpmで振とうしながら室温で60±15分間インキュベートした。
300μL/ウェルの5% BSAブロッキング緩衝液をアビジンコーティングマイクロプレート(アッセイプレート)に加えた。該マイクロプレートを密封し、1〜4時間、室温でインキュベートした。2×リード緩衝溶液を調製し、混合した。例:10mlの4×リード緩衝液を10mLの精製水に加えて混合した。アッセイプレート3×を、MSD_プレート_3×洗浄プログラムを用いて、300μL/ウェルの1×洗浄緩衝液で洗浄した。150μL/ウェルの2×リード緩衝溶液をアッセイプレートに加えた。アッセイプレートを、2×リード緩衝液を加えた後10分以内に、Sector Imager 2400での読み取りに供した。
プレートの読み取りデータをSoftMax Proファイルフォーマットに転送した。SoftMaxファイルでは、マスクウェルが必要な場合、ウェルは変換データ区画でマスクされた。これにより、マスクされた値を見ることができるようになったが、計算には使用しなかった。次に、平均カウント、阻害%、およびCV%カウントを各QCと試験試料について計算した。
阻害%=100×[(NQCの平均カウント−PQCまたは試料の平均カウント)/NQCの平均カウント]
LQC阻害%はカットポイントを上回らなければならない;SNQC阻害%はカットポイント未満でなければならない;HQC阻害%はMQC阻害%を上回らなければならない;MQC阻害%はLQC阻害%を上回らなければならない;各PQCおよびSNQCのCV%カウントは20%以下でなければならない;NQCのCV%カウントは15%以下でなければならない。
アッセイ性能−すべてのアッセイ性能基準値が満たされ、そうでなければ試験試料を再度作成して再分析した。精度−CV%カウントは20%以下でなければならず、そうでなければ試験試料を再度作成して再分析した。カットポイントより高い阻害%を有する任意の試験試料は、陽性と報告された。カットポイントより低いまたは等しい阻害%を有する任意の試験試料は、陰性と報告された。
薬物捕捉形式および標的捕捉形式の両方で薬物耐容性に対する低pH処理の効果を調べるために実験が実施された。1μg/mLのサリルマブを、ヒト血清に、陽性対照の示された濃度で添加した。これらの試料を、両方のアッセイ形式において低pH処理あり又はなしで調べた。QCおよび試料は、作業ストック濃度の酢酸で希釈し、インキュベートした。これらを次に適切なルテニウム化検出試薬を含有するトリス中和緩衝液で希釈した。結果を図3および図4に示す。
低pH処理は過剰な薬物からの干渉を効果的に軽減し、それにより両方のアッセイ形式においてNAbの検出を改善する。
薬物がNAb非存在下で偽陽性応答を生じる能力は、薬物干渉として定義される。両アッセイ形式におけるNAbの非存在下での薬物の干渉を比較するために試験が実施された。
正常ヒト血清に、示された濃度のサリルマブを添加した。すべての試料を、低pHで処理し、薬物捕捉形式および標的捕捉形式の両方で調べた。
標的捕捉形式: より高濃度の遊離サリルマブは、ビオチニル化IL6Rαとの結合に関してルテニウム化サリルマブを打ち負かし、これが偽陽性応答をもたらす(図5)。
薬物捕捉形式: NAb非存在下のサリルマブは、プレート上で捕捉用サリルマブに結合することができず、したがってこれはアッセイにおいて干渉することができない(図6)。
次に、RF+血清を低pH中で処理し、薬物捕捉形式でスクリーニングした。選択された高シグナルRF+個体 対 正常シグナルRF+個体の間での比較を行った。LQCレベルの陽性対照をこれらの薬物未処理血清に添加した後に低pH処理を行い、次にアッセイで実験した。
特定のRF+個体により生じたシグナルはNQCのシグナルより強く、高い負の阻害%を生じた。これらの個体においては、陽性対照を添加してもなお偽陰性の結果が生じた(図9および10)。
高シグナルRF+個体は、高結合アビジンコーティングプレートに変えることにより標準化することができた(図11)。シグナルを標準化することにより、これらのプレートは、これら「高シグナル」RF+個体中のNAbの検出を可能にした(図12)。
Claims (26)
- 生物学的治療タンパク質を投与された患者における前記生物学的治療タンパク質に対する中和抗体の存在を検出するための方法であって:
(a)前記患者からの試料を酸性条件での処理に供する段階、
(b)段階(a)の試料を、前記生物学的治療タンパク質の標的に結合する抗体、および標識された生物学的治療タンパク質を含む捕捉試薬と混ぜ合わせる段階:
ここで、前記標識は、固相基板への結合を促進するものである、および
(c)前記生物学的治療タンパク質の、標識された標的を含む検出試薬を加える段階、
を含み、対照試料と比較して低いシグナルが、生物学的治療剤に対する中和抗体の存在を示す、方法。 - 前記生物学的治療タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的治療タンパク質が、抗インターロイキン-6受容体α(IL-6Rα)モノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生物学的治療タンパク質が、サリルマブまたはトシリズマブである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的治療タンパク質が、サリルマブである、請求項4に記載の方法。
- 前記患者が、IL-6依存性疾患について処置されている、請求項1〜5に記載の方法。
- 前記IL-6依存性疾患が、関節リウマチ、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、結合組織障害、キャッスルマン病、および前立腺がんのうちの一つである、請求項6に記載の方法。
- 前記IL-6依存性疾患が、関節リウマチである、請求項7に記載の方法。
- 前記捕捉試薬が、標識されたサリルマブである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識されたサリルマブが、ビオチン化サリルマブである、請求項9に記載の方法。
- 前記固相基板が、アビジンコーティングプレートである、請求項1に記載の方法。
- 前記検出試薬が、標識された可溶性IL-6受容体αである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出試薬が、ルテニウム標識された可溶性IL-6受容体αである、請求項12に記載の方法。
- 前記患者試料が、段階(a)において酢酸による処理に供される、請求項1に記載の方法。
- 前記酸性条件での処理の後に中和が続く、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、約150ng/mLの感度公差、約500ng/mLの薬物耐容性、および約1μg/mLの標的干渉耐容性を示す、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照試料が、分析物を欠いている、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物が、純ヒト血清である、請求項17記載の方法。
- 前記生物学的治療タンパク質の標的に結合する抗体が、段階(a)における酸性条件での処理により解放された遊離標的に結合し、標的干渉を軽減する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- サリルマブを投与された患者における前記サリルマブに対する中和抗体の存在を検出するための方法であって:
(a)前記患者の血清試料を、ビオチン化サリルマブを含む捕捉試薬と混ぜ合わせる段階、
(b)混ぜ合わせた血清試料と捕捉試薬を酸性条件での処理に供した後、抗IL-6受容体α抗体の添加を含む中和段階を行う段階、および
(c)標識された可溶性IL-6受容体αを含む検出試薬を加える段階、
を含み、対照試料と比較して低いシグナルが、サリルマブに対する中和抗体の存在を示す、方法。 - 前記検出試薬が、ルテニウム標識された可溶性IL-6受容体αである、請求項20に記載の方法。
- 前記患者が、関節リウマチに罹患している、請求項20または21に記載の方法。
- 前記方法が、約150ng/mLの感度公差、約500ng/mLの薬物耐容性、および約1μg/mLの標的干渉耐容性を示す、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗IL-6受容体α抗体が、酸性条件での処理により解放された遊離IL-6受容体αに結合させるために用いられる、請求項20に記載の方法。
- 前記抗IL-6受容体α抗体が、酸性条件での処理により解放された遊離IL-6受容体αに結合し、標的干渉を軽減する、請求項24に記載の方法。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載の捕捉試薬および検出試薬、並びに使用のための指示書を含む、キット。
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