JP4148367B1 - 細胞のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであるマイクロウェルアレイ。ウェルの周辺の主表面に、ウェルに格納される細胞が産生する物質と結合性を有する物質の被覆層を有する。上記マイクロウェルアレイのウェルに、被検体細胞を細胞の培養液とともに格納し、被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養し、被検体細胞に含まれる目的細胞よって産生される物質に特異的に結合する標識物質を、被覆層に供給し、被覆層の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、標識物質により検出して、目的細胞を特定する、目的細胞のスクリーニング方法。
【選択図】なし
Description
[1]基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであり、少なくとも前記ウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有するマイクロウェルアレイであって、
前記マイクロウェルアレイは、
前記マイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、細胞の培養液とともに細胞を格納し、
前記被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから前記被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
前記培養後の培養液を除去した後に、
ウェル中に格納された細胞の少なくとも一部から産生される物質と、前記被覆層の物質との結合の有無を検出するために用いられること
を特徴とする前記マイクロウェルアレイ。
[2]前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部は、免疫グロブリン産生細胞またはサイトカイン産生細胞である[1]に記載のマイクロウェルアレイ。
[3]前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、免疫グロブリン産生細胞であり、免疫グロブリン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗免疫グロブリン抗体または抗原である[1]に記載のマイクロウェルアレイ。
[4]前記結合の有無の検出は、産生される免疫グロブリンに対する抗体または抗原を用いて行う[3]に記載のマイクロウェルアレイ。
[5]前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、サイトカイン産生細胞であり、サイトカイン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗サイトカイン抗体、またはサイトカイン受容体である[1]に記載のマイクロウェルアレイ。
[6]前記結合の有無の検出は、産生されるサイトカインに対する抗体またはサイトカイン受容体を用いて行う[5]に記載のマイクロウェルアレイ。
[7]前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、免疫グロブリン産生細胞であり、免疫グロブリン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、サイトカイン受容体または受容体である[1]に記載のマイクロウェルアレイ。
[8]前記結合の有無の検出は、サイトカインまたはリガンドを用いて行う[7]に記載のマイクロウェルアレイ。
[9]免疫グロブリン産生細胞およびサイトカイン産生細胞は、天然型細胞またはハイブリドーマである[1]〜[8]のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
[10]基体が板状である[1]〜[9]のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
[11]ウェルに格納される細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有さない前記主表面の少なくとも一部は、ブロッキング剤でコートされている、[1]〜[10]のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
[12]基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであり、かつ少なくとも前記ウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有するマイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、被検体細胞を細胞の培養液とともに格納し、
前記被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから前記被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
培養液を除去した後に、被検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質、又は、目的細胞によって産生される物質と結合性を有する物質の被覆層に特異的に結合する標識物質を、前記被覆層に供給し、
前記被覆層の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、前記標識物質により検出して、目的細胞を特定することを含む、
目的細胞のスクリーニング方法。
[13]前記被検体細胞を含む細胞は、予め所望の抗原で刺激を与え、物質を産生し得る状態にある細胞を含む[12]に記載のスクリーニング方法。
[14]前記被検体細胞は、免疫グロブリン産生細胞、またはサイトカイン産生細胞を含む[12]または[13]に記載のスクリーニング方法。
[15]前記被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗免疫グロブリン抗体または抗原であり、目的細胞が抗原特異的免疫グロブリン産生細胞である[12]または[13]に記載のスクリーニング方法。
[16]前記結合の有無の検出は、産生される免疫グロブリンに対する抗体または抗原を用いて行う[15]に記載のスクリーニング方法。
[17]前記被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、サイトカイン受容体または受容体であり、目的細胞が抗原特異的免疫グロブリン産生細胞である[12]または[13]に記載のスクリーニング方法。
[18]前記結合の有無の検出は、サイトカインまたはリガンドを用いて行う[17]に記載のスクリーニング方法。
[19]前記被検体細胞が、サイトカイン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗サイトカイン抗体、またはサイトカイン受容体であり、目的細胞がサイトカイン産生細胞である[12]または[13]に記載のスクリーニング方法。
[20]前記結合の有無の検出は、産生されるサイトカインに対する抗体またはサイトカイン受容体を用いて行う[19]に記載のスクリーニング方法。
[21]免疫グロブリン産生細胞およびサイトカイン産生細胞は、天然型細胞、ハイブリドーマ、または細胞株である[12]〜[20]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[22][12]〜[21]のいずれかに記載のスクリーニング方法で特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の製造方法。
[23]目的細胞が特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である[22]に記載の製造方法。
本発明のマイクロウェルアレイは、基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであるマイクロウェルアレイである。このような構造を有するマイクロウェルアレイは、例えば、上記特許文献1〜3に記載されているものをそのまま用いることができる。
(2)ウェルに格納される細胞(被検体細胞)、
(3)細胞が産生する物質(産生物質)および
(4)産生物質を同定するための標識物質(標識物質)
の例を以下の表1に示す。
**リガンドの結合をブロックする抗体の検出
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明のマイクロウェルアレイを用い、被検体細胞を含む細胞群から、目的細胞スクリーニングする方法であり、以下の工程を含む。
(1)マイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、被検体細胞を、細胞の培養液とともに格納する。
(2)被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから被覆層への拡散が可能な状態で細胞を任意の時間培養する。
(3)培養液を除去した後に、被検体細胞に含まれる目的細胞よって産生される物質に特異的に結合する標識物質を、被覆層に供給する。
(4)被覆層の物質に結合した、目的細胞によって産生または分泌された物質を、標識物質により検出して、目的細胞を特定する。
マイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、被検体細胞を含む細胞(細胞群)を、細胞の培養液とともに格納する。細胞を格納する前には、マイクロウェルアレイのウェルとその周辺を培地で洗浄して、結合性物質の被覆層を形成した際に表面に付着した不純物を十分に除去することが、精度よく検出するために好ましい。細胞は、培養液とともにウェルに格納する。ウェルに格納される被検体細胞は、免疫グロブリン産生細胞、またはサイトカイン産生細胞を含む細胞群であることができ、さらに、免疫グロブリン産生細胞およびサイトカイン産生細胞は、天然型細胞またはハイブリドーマであることが出来る。これらの細胞群は、公知の方法を用いて得ることが出来る。
被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養する。培養によって細胞が物質を産生し、産生された物質が培養液に放出され、ウェルからウェル周辺の被覆層に拡散する。拡散し、被覆層に到達した産生物質は、被覆層を構成する結合性物質と結合する。培養条件は、細胞の種類に応じて適宜決定でき、培養時間は、被覆層を構成する結合性物質と結合した産生物質の量が、検出可能なレベルになるように適宜決定できる。物質を産生しない細胞を格納したウェル周辺の被覆層では産生物質と結合性物質との結合は生じない。尚、培養時間が長くなりすぎると、産生物質が広く拡散しすぎて、産生物質を産生する細胞を格納したウェルの特定が困難になる場合があるので、培養時間は、産生物質を産生する細胞を格納したウェルの特定が容易に行なえる範囲で適宜決定することが好ましい。
上記培養終了後、任意で培養液を除去した後に、被検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質を、被覆層に供給する。目的細胞によって産生される物質は、培養中に拡散し、被覆層を構成する結合性物質と結合しており、この段階で上記標識物質を供給することで、標識物質は、被覆層に結合した産生物質と結合するか、あるいは、被覆層に結合した産生物質でブロックされていない被覆層と結合する。前者の場合は、標識物質は産生物質と結合性を有する場合であり、後者の場合は、標識物質は産生物質とではなく、被覆層を構成する結合性物質と結合性を有する場合である。この点の詳細については、後述する。
被覆層の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、標識物質により検出して、目的細胞を特定する。標識物質は、被覆層に結合した産生物質と結合しており、そこで標識物質を検出することで、被覆層に結合する産生物質を産生する細胞(目的細胞)を特定することが出来る。
ウェルに格納される被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞を含む場合、細胞は培養することにより免疫グロブリンを産生し、抗免疫グロブリン抗体または抗原を結合性物質とした被覆層を用いれば、産生した免疫グロブリンは被覆層と結合し、産生され被覆層と結合した免疫グロブリンは、この免疫グロブリンに対する抗体または抗原を用いて検出することができる。免疫グロブリンを産生しない細胞、即ち、与えられた抗原刺激では免疫グロブリンを産生しない細胞を格納したウェルの周辺には、このウェルから拡散した免疫グロブリンはなく、免疫グロブリンを産出する細胞を格納したウェルと識別できる。こうして、目的細胞である抗原特異的免疫グロブリン産生細胞を特定することができる。
(A)チップ表面に抗免疫グロブリン(Ig)抗体を結合させたシリコン製マイクロウェルアレイチップの各ウェルに抗体分泌細胞を分注する。
(B)細胞を培養し、抗体を分泌させる。細胞から分泌された抗体はウェル周囲の抗Ig抗体に結合する。
(C)そこに蛍光標識された抗原を添加すると抗原はウェル周囲にトラップされた抗原特異的抗体に結合する。
(D)蛍光顕微鏡、スキャナー等で観察すると抗原特異的抗体がウェル周囲にドーナツ状に広がっていることが観察される。
ウェルに格納される被検体細胞が、サイトカイン産生細胞である場合、細胞は培養することによりサイトカインを産生し、抗サイトカイン抗体、またはサイトカイン受容体を結合性物質とした被覆層を用いれば、産生したサイトカインは被覆層と結合し、産生され被覆層と結合したサイトカインは、このサイトカインに対する抗体またはサイトカイン受容体を用いて検出することができる。サイトカインを産生しない細胞、即ち、与えられた抗原刺激ではサイトカインを産生しない細胞を格納したウェルの周辺には、このウェルから拡散したサイトカインはなく、サイトカインを産出する細胞を格納したウェルと識別できる。こうして、目的細胞としてサイトカイン産生細胞を特定することができる。
ウェルに格納される被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞である場合、細胞は培養することにより免疫グロブリンを産生し、サイトカイン受容体または受容体を結合性物質とした被覆層を用いれば、産生した免疫グロブリンの一部は被覆層と結合し、産生され被覆層と結合した免疫グロブリンの一部は、サイトカイン受容体または受容体と標識物質であるサイトカインまたはリガンドとの結合をブロックし、標識物質は免疫グロブリンを産生する細胞を格納するウェルの周囲には結合しない。免疫グロブリンを産生しない細胞、即ち、与えられた抗原刺激では免疫グロブリンを産生しない細胞を格納したウェルの周辺には、このウェルから拡散した免疫グロブリンはなく、サイトカイン受容体または受容体とサイトカインまたはリガンドとの結合はブロックされず、また、免疫グロブリンは産生するが当該免疫グロブリンがサイトカイン受容体ないし受容体に結合しない細胞を格納したウェルの周辺、また、免疫グロブリンを産生し当該免疫グロブリンがサイトカイン受容体ないし受容体に結合するがサイトカイン受容体または受容体とサイトカインまたはリガンドとの結合をブロックしない細胞を格納したウェルの周辺には、ウェルから拡散した免疫グロブリンが結合しているが、サイトカイン受容体または受容体とサイトカインまたはリガンドとの結合はブロックされず、免疫グロブリンを産出する細胞を格納したウェルと識別できる。こうして、目的細胞として抗原特異的免疫グロブリン産生細胞を特定することができる。
(A)受容体をチップ表面にコートする。
(B)抗体分泌細胞をマイクロウェルに添加し、培養する。分泌された抗体は拡散する。受容体特異的抗体はウェル周囲の受容体に結合する。
(C)受容体に結合した抗体が受容体上のリガンド結合部位に結合した場合には蛍光標識リガンドは受容体に結合できない。
(D)受容体に結合した抗体が受容体上のリガンド結合部位以外に結合した場合には蛍光標識リガンドは受容体に結合できる。
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法で特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の製造方法を包含する。目的細胞は、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞であることができる。
マイクロウェルアレイチップの製作例を示す。
シリコン基板を用いた製作例を示す。図4-1は、製作例1によるマイクロウェルアレイチップの例である。また、図4-2にその製作工程例を示す。
(1)シリコン基板1-bに酸化膜1-aを形成する。
(2)基板上にフォトレジスト1-c、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行う。
(3)フォトレジスト1-cより露出した酸化膜1-aを緩衝フッ酸にてエッチングする。
(4)ドライエッチング、ウエットエッチングにて深さ10〜20ミクロンのマイクロウェル1-dを形成する。フォトレジスト1-cはエッチング方法により適宜取り除く。
(5)抗体がむら無く結合する表面とするため、プライマーで処理する。例えばシリル化処理によって、表面、ウェル内壁にシリル基1-eを形成する。なお、本処理における材料、手段は、様々なものがあり、本製作例の処理に限定されるものではない。
(6)本発明による抗体分泌細胞の検出を行う。
細胞より分泌された抗体をより鮮明にモニタリングするために、ウェル周囲に隔壁を設けることも可能である。図5-1にその外観、図5-2にその製作例を示す。
(1)シリコン基板2-b上に酸化膜2-aを形成する。
(2)基板上にフォトレジスト2-c、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行う。
(3)フォトレジスト2-cより露出した酸化膜2-aを緩衝フッ酸にてエッチングする。
(4)フォトレジスト2-cを取り除き、エッチングにて深さ1〜5ミクロンの凹形状2-dを作製する。
(5)基板上に再度フォトレジスト2-e、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行う。凹形状が深い時は、東京応化工業(株)OMR-85などのネガレジストを使用してもよい。
(6)ドライエッチング装置にて深さ10〜20ミクロンのウェル2-fを形成する。
(7)抗体がむら無く結合する表面とするため、プライマーで処理する。例えばシリル化処理によって、表面、ウェル内壁にシリル基2-gを形成する。なお、本処理における材料、手段は、様々なものがあり、本製作例の処理に限定されるものではない。
(8)本発明による抗体分泌細胞の検出を行う。本例では、ウェル回りに抗体の拡散抑制壁が形成されるため、抗体拡散によるボケが抑制され、画像認識が容易になる。
図5-3は本製作例により試作したものである。
ウェル周囲の表面積を増やすことで、分泌された抗体をより明確に観測することも可能である。表面積は、例えばポーラスシリコン構造や凹凸構造を形成することによって増加することが可能である。ポーラスシリコンの作製方法は、例えば特開平6−21509に記載されている。凹凸構造は、例えばエッチング、蒸着などによって作製可能である。図6-1にその外観、図6-2にその製作例を示す。
(1)シリコン基板3-b上に酸化膜3-aを形成する。
(2)基板上にフォトレジスト3-c、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行う。
(3)フォトレジスト3-cより露出した酸化膜3-aを緩衝フッ酸にてエッチングする。
(4)露出部分の開口表面積を増やすために、例えばポーラス構造3-dを作製する。ポーラス構造は、陽極化成処理などにより形成される。フッ酸と硝酸の混酸によって表面にナノ構造を作製してもよい。
(5)基板上に再度フォトレジスト3-e、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行い、ドライエッチングにより深さ10〜20ミクロンのウェル3-fを形成する。
(6)抗体がむら無く結合する表面とするため、プライマーで処理する。例えばシリル化処理によって、表面、ウェル内壁にシリル基3-gを形成する。なお、本処理における材料、手段は、様々なものがあり、本製作例の処理に限定されるものではない。
(7)本発明による抗体分泌細胞の検出を行う。本例では、ウェル回りの表面積が増加するため、蛍光標識結合密度も増加するため、蛍光の画像認識が容易になる。
ウェル周囲にのみに局在させて抗体を結合することにより、抗体分泌をより明確に観測することも可能である。本方法は、ウェル周囲のみに抗体に対して結合手となる物質を、パターングなどによって終端することによって実現される。図7-1にその外観、図7-2にその製作例を示す。シリコン基板4-b上に酸化膜4-aを形成する。
(1)基板上にフォトレジスト4-c、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布、露光機にてパターン転写を行う。
(2)フォトレジスト4-cより露出した酸化膜4-aを緩衝フッ酸にてエッチングする。
(3)ここで抗体がむら無く結合する表面とするため、プライマー4-dで処理する。例えばシランカップリング剤であり、ヘキサメチルジシラザンなどで、表面を終端する。なお、本処理における材料、手段は、様々なものがあり、本製作例の処理に限定されるものではない。
(4)この上に、さらにフォトレジスト4-e、例えば東京応化工業(株)OFPR-800を塗布する。
(5)フォトレジスト4-eを露光機により、抗体結合パターンを形成する。抗体結合パターン寸法は、ウェルよりも大きくする必要があり、1ミクロン〜隣り合うウェル間隔の1/2以下である。
(6)さらに、フォトレジスト4-eを露光機により、ウェルパターンに加工する。
(7)ドライエッチングにより、ウェルパターンを深さ10〜20ミクロンのウェル4-fを形成する。ウェル形成の際、フォトレジスト4-eより保護されていない抗体と結合する物質4-dは、同時に除去される。酸素プラズマなどにより、取り除いてもよい。
(8)アセトンなとの有機溶剤などにより、フォトレジスト4-eを除去する。ここで、ウェル周囲のみに抗体結合する物質が存在するため、抗体の結合範囲を局在化することが可能となる。
(9)以上の工程は、感光性を有するシランカップリング剤を使用することで、簡素化することが可能である。具体的には、製作例1に従い加工を行った後、感光性シランカップリング剤を塗布、所望のパターンに露光することで本製作例と同様の結果を得ることが可能である。
抗Ig抗体をムラ無く結合させるために、以下の方法にて表面処理を行う。
1.基板5-a表面の油分など汚れを取り除く。汚れを取り除く方法は、例えば、有機溶剤、酸及びアルカリ洗浄であり、酸素プラズマなどのドライ洗浄である。基板材料、汚れによって適宜選択可能である。
2.ここで基板と抗体などを結合するプライマーの表面結合密度を向上させるために、基板表面にプライマーと置換する水酸基5-bを形成してもよい。基板表面に水酸基の形成と表面の微粒子を除去するために、例えば1%程度のアンモニア水洗浄を行う。その後、水で十分にリンスする。シリコンの場合は、RCA洗浄のうちSC-1洗浄に代替を行ってもよい。ただし、1において十分なプライマー結合に適した表面形成が可能であれば、2については省略可能である。
3.プライマー5-cを表面に結合させる。シランカップリング剤などに浸し、表面の水酸基と十分に置換させる。プライマーは、例えばヘキサメチルジシラザンであり、表面を疎水化する。なお、本処理におけるプライマー材料、手段は、様々なものがあり、本表面処理例に限定されるものではない。
実験方法(プロトコールI)
1.[抗ヒトIgGのチップへのコート]シランカップリング処理済シリコン製マイクロウェルアレイチップに抗ヒトIgG抗体を10μg/mLになるようにPBSに希釈したものを80μL添加し、チップ上の液が乾燥しないようにチップの湿度を保つ保湿箱(図9)に入れ、室温(15−25℃)で1時間静置し、シリコンチップ表面に抗IgG抗体を結合させた。この場合、下記工程2と異なり、減圧による脱気しておらず、ウェルの中に抗体は入っていかず、ウェル周囲に抗体が分布する。(以後、チップをインキュベーションするときは常に上記保湿箱に入れて乾燥を防いだ。)
2.[ブロッキング]抗体溶液をチップから除き、PBSをチップに100μL添加し、その後除くという洗浄の操作を3回繰り返した後、0.2%(v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL-B03リピジュア(5wt%))を含むPBSをチップに100μL添加し、真空ポンプを利用して減圧することによりマイクロウェル内の気泡を完全に除くことで、チップ表面およびウェル内にリピジュア液を満たした。15分間室温(15−25℃)で静置することによりブロッキングを行った。
3.[細胞の添加]チップを10% FCSを含むRPMI1640培地100 μLで3回洗浄後、10% FCSを含むRPMI1640培地で2回に洗浄したX63/116 細胞(B型肝炎ウイルス表面抗原(HBs抗原)に対するヒトIgGを分泌) あるいはHyHEL10 110TC細胞(鶏卵リゾチーム(HEL)に対するマウス/ヒトキメラ抗体を分泌) をチップに添加し、細胞がウェル内に入るようおよそ10分間室温にて静置した。
4.[細胞の培養]ウェル内に入らなかった細胞を10% FCSを含むRPMI1640培地で数回(余分な細胞が除去されるまで)洗浄・除去後、チップ上に10% FCSを含むRPMI1640培地80μLを加え、チップをCO2インキュベータ(37℃, 5% CO2)内に入れ、細胞をチップ上で2〜3時間培養した。
5.[ビオチン標識抗原の結合]細胞がウェルから出ないように注意しながら、チップ表面のバッファーを除去し、PBS約100μLをチップ表面に添加しさらに除去することを数回繰り返しチップを洗浄後、1μg/mLビオチン標識HELあるいはビオチン標識HBs抗原を80μLチップに添加し、室温で30分間静置した。
6.5と同様にチップをPBSで洗浄後、原液を1,000倍希釈したCy3標識ストレプトアビジン(SIGMA,S-6402)を80μLチップに添加し、同様に室温で30分静置した。
7.5と同様にチップをPBSで洗浄後、チップにPBSを添加し蛍光顕微鏡下でCy3の蛍光を観察し、ウェル周囲にドーナツ状にCy3の蛍光が広がっていることを指標に抗原特異的抗体を分泌している細胞が入っているウェル位置を確認した(図10)。
8.1μg/mL Oregon Green 80μLをチップに添加し3分間室温で静置することにより細胞をOregon Greenで標識した。5と同様にチップをPBSで洗浄後、新しいPBSをチップに加え、Oregon Greenの蛍光を指標に細胞を観察しながら、目的の抗原特異的抗体を分泌している細胞をマイクロマニピュレータにて回収した。
HyHEL10 110TC細胞、X63/116細胞、110TC細胞(陰性コントロール、抗体を分泌していない)を抗IgG抗体をコートしたシリコン製マイクロウェルアレイチップ上で培養後、抗原特異的抗体の分泌をビオチン標識HELあるいはビオチン標識HBs抗原及びCy3標識ストレプトアビジンを用いて検出した(図11A)。図11Aのように分泌された抗体がウェル周囲にドーナツ状に検出された。抗体を分泌していない110TCを添加したチップではシグナルは検出されなかった。その後Oregon Greenで細胞を染色し細胞を確認した(図11B)。
HEL蛋白にて免疫したBALB/cマウスより脾細胞を調製し、通常のポリエチレングリコールを用いた方法によりX63.Ag8.653ミエローマ細胞と融合しハイブリドーマを作製した。 HAT選択培地にてハイブリドーマを選択後、ハイブリドーマを抗マウスIgG抗体をコートしたマイクロウェルアレイチップに添加し、ウェルに入らなかった細胞を洗浄にて除去後、チップ上で1時間30分培養した。HELに対する抗体を分泌しているハイブリドーマをビオチン標識HELとPE標識ストレプトアビジンを用いて検出した(図11A)。次にOregon Greenを細胞に添加して細胞位置を確認した(図11B)。(図11C)AとBの組み合わせ。
実験方法(プロトコール II)
マウスCD138陽性細胞(抗体分泌細胞)の調製
1.マウス脾細胞を調製した。
2.細胞懸濁液100μLに抗マウスCD138抗体を106細胞あたり<1μgの量加え4℃、15分インキュベーションした。
3.細胞を10mLのPBSで2回洗浄後、100μLのPBSに細胞を懸濁し、細胞懸濁液に抗ラットκ鎖抗体結合マイクロビーズを106細胞あたり<1μgの量添加し4℃、15分インキュベーションした。
4.細胞を10mLのPBSで2回洗浄後、1000μLのPBSに細胞を懸濁して、AutoMACSにてCD138陽性細胞を回収した。
1.ヒト末梢血より定法(フィコールを用いた比重遠心法)によりリンパ球を分離した。
2.Fc受容体ブロッキング試薬(ミルテニーバイオテク(株))を107細胞あたり20μL添加後、抗CD138抗体結合マイクロビーズを106細胞あたり<1μgの量添加し4℃、15分インキュベーションした。
3.細胞を10mLのPBSで2回洗浄後、1000μLのPBSに細胞を懸濁してAutoMACSにてCD138陽性細胞を回収した。
1.以下の実験もチップをインキュベーションする際にはプロトコールIと同様に乾燥を防ぐ措置をとった。
2.シランカップリング処理済シリコン製マイクロウェルアレイチップにPBSに希釈した10μg/mLロバ由来抗ヤギIgG抗体80μLを添加し、チップ上の液が乾燥しないようにチップを保湿箱(図1)に入れ、室温(15〜25℃)で1時間静置し、シリコンチップ表面にロバ由来抗ヤギIgG抗体を結合させた。
3.抗体溶液をチップから除き、PBS 100μLで3回洗浄後、0.2%(v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL-B03リピジュア(5wt%))を含むPBSを100μLチップに添加し、減圧することによりマイクロウェル内の気泡を除くことで、チップ表面およびウェル内にリピジュア液を満たした。15分間室温にて静置することによりブロッキングを行った。
4.チップを10% FCSを含むRPMI1640培地100μLで3回洗浄後、PBS 10mLで1回洗浄したCD138陽性抗体分泌細胞(1〜2x106個の細胞をPBSで30μlに懸濁)をチップに添加し、細胞がウェル内に入るようおよそ10分間室温にて静置した。
5.ウェル内に入らなかった細胞を10% FCSを含むRPMI1640培地で洗浄・除去後、チップ上に10μg/mLヤギ由来抗ヒト(or マウス) IgG 80μLを添加し室温で30分間静置することにより、抗体をチップ表面のロバ由来抗ヤギIgG抗体に結合させた。
6.細胞がウェルから出ないように注意しながらチップを10% FCSを含むRPMI1640培地で洗浄後、再び10% FCSを含むRPMI1640培地80μLをチップに添加し、細胞をCO2インキュベータ内(37℃, 5% CO2)にて3時間培養した。
7.以後のステップは、プロトコールIのステップ5以下を続けて行う。
鶏卵リゾチーム(HEL)を免疫したBALB/cマウスの脾細胞よりCD138陽性細胞を調製し、プロトコールIIに従って細胞をロバ由来抗ヤギIgG抗体を結合させたシリコン製マイクロウェルアレイチップに細胞を添加し、その後プロトコールに従ってヤギ由来抗マウスIgG抗体をチップに結合させた後、約3時間細胞を培養した。その後、ビオチン標識HELおよびCy3標識ストレプトアビジンを加えて蛍光顕微鏡下にてHEL特異的IgG抗体を分泌している細胞を検出した(図12)。その後マイクロマニピュレータにて細胞を回収し、抗体遺伝子を増幅した。その結果作製した7個のIgGのうち6個がHELに結合した(データは示していない)。
HBs抗原ワクチンにてブーストした健常人末梢血よりプロトコールIIに従ってCD138陽性細胞を調製した。プロトコールIIに従ってロバ由来抗ヤギIgG抗体を結合させたシリコン製マイクロウェルアレイチップにCD138陽性細胞を添加し、その後プロトコールに従ってヤギ由来抗ヒトIgG抗体をチップに結合させた後、約3時間細胞を培養した。その後、ビオチン標識HBs抗原およびCy3標識ストレプトアビジンを加えて蛍光顕微鏡下にてHBs抗原特異的IgG抗体を分泌している細胞を検出した(図13)。
実験方法(プロトコールIII)
1.シランカップリング処理済シリコン製マイクロウェルアレイチップに抗原(HEL蛋白)を10μg/mLになるようにPBSに希釈したものを80μL添加し、チップ上の液が乾燥しないようにチップを保湿箱(図9)に入れ、室温(15〜25℃)で1時間静置し、シリコンチップ表面にHEL蛋白を結合させた。(以後、チップをインキュベーションするときは常に上記箱に入れて乾燥を防いだ。)
2.抗原溶液をチップから除き、100μL PBSで3回洗浄後、0.2%(v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL-B03リピジュア(5wt%))を含むPBSを100μLチップに添加し、減圧することによりマイクロウェル内の気泡を除くことで、チップ表面およびウェル内にリピジュア液を満たした。15分間室温静置することによりブロッキングを行った。
3.HELを免疫したマウスの脾細胞よりCD138陽性細胞をプロトコールIIに従って調製した。
4.チップを10% FCSを含むRPMI1640培地で洗浄後、10mL PBSで1回洗浄したCD138陽性細胞(1〜2x106個の細胞を PBS 30μLに懸濁)をチップに添加し、細胞がウェル内に入るよう約10分間静置した。
5.ウェル内に入らなかった細胞を10% FCSを含むRPMI1640培地で洗浄・除去後、チップ上に10% FCSを含むRPMI1640培地80μLを添加し、チップをCO2インキュベータ(37 ℃, 5% CO2)内に入れ、細胞をチップ上で3時間培養した。
6.細胞がウェルから出ないように注意しながら、チップ表面のバッファーを除去しPBS 100μLをチップ表面に添加することを数回繰り返し、チップを洗浄後、1μg/mL Cy3標識抗マウスIgG 80μLをチップに添加し、室温で30分間静置した。
7.6と同様にチップをPBSで洗浄後、チップにPBSを添加し蛍光顕微鏡下でCy3の蛍光を観察し、ウェル周囲にドーナツ状にCy3の蛍光が広がっていることを指標に抗原特異的抗体を分泌している細胞が入っているウェル位置を確認した(図14)。
8.Oregon Green 80μLをチップに添加し3分間室温で静置することにより細胞をOregon Greenで標識した。上記6と同様にチップをPBSで洗浄後、新しいPBSをチップに加え、Oregon Greenの蛍光を指標に細胞を観察しながら、目的の抗原特異的抗体を分泌している細胞をマイクロマニピュレータにて回収した。
実験方法(プロトコールIV 応用)
蛍光標識抗原あるいは蛍光標識抗体の代わりに酵素を標識した抗原ないし酵素を標識した抗体を用いる。
1.酵素標識抗原あるいは酵素標識抗体を作用させた後、酵素の基質を加えたバッファーをチップに添加し室温でインキュベーションする。
2.基質が酵素により変化した産物がウェルの周囲にリング状に沈着する。それを光学顕微鏡で観察し、抗体分泌細胞を検出する。
酵素:アルカリフォスファターゼ、基質:BCIP/NBT
1.抗IgG抗体をチップに結合させる代わりに、抗サイトカイン抗体をチップに結合させ、サイトカインを分泌しているT細胞等をチップに播種し、サイトカインを産生させる。
2.分泌されたサイトカインがウェル周囲の抗サイトカイン抗体に結合する。
3.次に、蛍光あるいは酵素標識抗サイトカイン抗体を加えると、ウェル周囲に結合したサイトカインのリングを検出でき、サイトカイン分泌T細胞等が検出される。
サイトカイン分泌細胞の検出
方法
1.ヒト末梢血よりリンパ球を調製し、10ng/mL phorbol myristate acetate (PMA),1μM ionomycineの存在下CO2 インキュベータ内(37 ℃, 5% CO2)にて一晩刺激した。
2.リンパ球を回収・洗浄後、抗ヒトIFNγ抗体をコートしたマイクロウェルアレイチップに細胞を加え、乾燥を防ぐために保湿箱(図9)に入れた後、CO2 インキュベータ内(37 ℃, 5% CO2)にて5時間培養した。
3.チップをPBS-Tween20にて洗浄後、ビオチン標識抗ヒトIFNγ抗体をチップに添加し、保湿箱内にて室温にて30分インキュベーションした。
4.チップをPBS-Tween20にて洗浄後、Cy3標識streptavidinを添加し、保湿箱内にて室温で30分インキュベーションした。
5.チップをPBS-Tween20にて洗浄後、蛍光顕微鏡下で分泌されたサイトカインのシグナルを観察した。(2秒露光)
1.以下の実験もチップをインキュベーションする際にはプロトコールIと同様に乾燥を防ぐ措置をとった。
2.シランカップリング処理済シリコン製マイクロウェルアレイチップにPBSに希釈した10μg/mL TRAIL-R1/Fc80μLを添加し、チップ上の液が乾燥しないようにチップを保湿箱(図9)に入れ、室温(15〜25℃)で1時間静置し、シリコンチップ表面にTRAIL-R1/Fcを結合させた。
3.抗体溶液をチップから除き、PBS 100μLで3回洗浄後、0.2%(v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL-B03リピジュア(5wt%))を含むPBSを100μLチップに添加し、減圧することによりマイクロウェル内の気泡を除くことで、チップ表面およびウェル内にリピジュア液を満たした。15分間室温にて静置することによりブロッキングを行った。
4.チップを10% FCSを含むRPMI1640培地100μLで3回洗浄後、10mLで1回洗浄したCD138陽性抗体分泌細胞さらに10% FCSを含むRPMI1640培地1000μLで2回洗浄後(1〜2x106個の細胞を10% FCSを含むRPMI1640培地で30μlに懸濁)をチップに添加し、細胞がウェル内に入るようおよそ10分間室温にて静置した。
5.細胞がウェルから出ないように注意しながらチップを10% FCSを含むRPMI1640培地で洗浄後、再び10% FCSを含むRPMI1640培地80μLをチップに添加し、細胞をCO2インキュベータ内(37 ℃, 5% CO2)にて3時間培養した。
6.細胞がウェルから出ないように注意しながら、チップ表面のバッファーを除去し、PBS約100μLをチップ表面に添加しさらに除去することを数回繰り返しチップを洗浄後、1μg/mLビオチン標識TRAILを80μLチップに添加し、室温で30分間静置した。
7.6と同様にチップをPBSで洗浄後、原液を1,000倍希釈したCy3標識ストレプトアビジン(SIGMA,S-6402)を80μLチップに添加し、同様に室温で30分静置した。
8.6と同様にチップをPBSで洗浄後、チップにPBSを添加し蛍光顕微鏡下でCy3の蛍光を観察し、Cy3の蛍光でまっ赤のチップの表面にウェル周囲にCy3の蛍光が結合していないところが黒いドーナツ状になることを指標にTRAIL-R1/FcとそのリガントであるTRAILの間にブロックするものを分泌している細胞が入っているウェル位置を確認した。
9.1μg/mLOregon Green 80μLをチップに添加し3分間室温で静置することにより細胞をOregon Greenで標識した。6と同様にチップをPBSで洗浄後、新しいPBSをチップに加え、Oregon Greenの蛍光を指標に細胞を観察しながら、目的の抗原特異的抗体を分泌している細胞をマイクロマニピュレータにて回収した。
受容体蛋白をチップ表面にコートし、受容体蛋白で免疫したマウスの脾細胞より調製したCD138細胞をチップ上に播種した。細胞を培養後、ビオチン標識リガンドおよびCy3標識ストレプトアビジンを添加した。チップのほぼ全面にビオチン標識リガンド/Cy3標識ストレプトアビジンが結合しているが、受容体のリガンドの結合をブロックするような機能的抗体を産生している細胞のウェル周囲はビオチン標識リガンド/Cy3標識ストレプトアビジンの結合が阻害されるため、暗くなっている。結果を図16に示す。左:ビオチン標識リガンド/Cy3標識ストレプトアビジンによる検出結果。中:細胞をOregon Greenにより標識し観察した。右:左と中の図を重ね合わせたもの。
Claims (23)
- 基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであり、少なくとも前記ウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有するマイクロウェルアレイであって、
前記マイクロウェルアレイは、
前記マイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、細胞の培養液とともに細胞を格納し、
前記被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから前記被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
前記培養後の培養液を除去した後に、
ウェル中に格納された細胞の少なくとも一部から産生される物質と、前記被覆層の物質との結合の有無を検出するために用いられること
を特徴とする前記マイクロウェルアレイ。 - 前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部は、免疫グロブリン産生細胞またはサイトカイン産生細胞である請求項1に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、免疫グロブリン産生細胞であり、免疫グロブリン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗免疫グロブリン抗体または抗原である請求項1に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記結合の有無の検出は、産生される免疫グロブリンに対する抗体または抗原を用いて行う請求項3に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、サイトカイン産生細胞であり、サイトカイン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗サイトカイン抗体、またはサイトカイン受容体である請求項1に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記結合の有無の検出は、産生されるサイトカインに対する抗体またはサイトカイン受容体を用いて行う請求項5に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記ウェルに格納される細胞の少なくとも一部が、免疫グロブリン産生細胞であり、免疫グロブリン産生細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、サイトカイン受容体または受容体である請求項1に記載のマイクロウェルアレイ。
- 前記結合の有無の検出は、サイトカインまたはリガンドを用いて行う請求項7に記載のマイクロウェルアレイ。
- 免疫グロブリン産生細胞およびサイトカイン産生細胞は、天然型細胞またはハイブリドーマである請求項1〜8のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
- 基体が板状である請求項1〜9のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
- ウェルに格納される細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有さない前記主表面の少なくとも一部は、ブロッキング剤でコートされている、請求項1〜10のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
- 基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさであり、かつ少なくとも前記ウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質の被覆層を有するマイクロウェルアレイの少なくとも一部のウェルに、被検体細胞を細胞の培養液とともに格納し、
前記被覆層およびウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルから前記被覆層への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
培養液を除去した後に、被検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質、又は、目的細胞によって産生される物質と結合性を有する物質の被覆層に特異的に結合する標識物質を、前記被覆層に供給し、
前記被覆層の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、前記標識物質により検出して、目的細胞を特定することを含む、
目的細胞のスクリーニング方法。 - 前記被検体細胞を含む細胞は、予め所望の抗原で刺激を与え、物質を産生し得る状態にある細胞を含む請求項12に記載のスクリーニング方法。
- 前記被検体細胞は、免疫グロブリン産生細胞、またはサイトカイン産生細胞を含む請求項12または13に記載のスクリーニング方法。
- 前記被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗免疫グロブリン抗体または抗原であり、目的細胞が抗原特異的免疫グロブリン産生細胞である請求項12または13に記載のスクリーニング方法。
- 前記結合の有無の検出は、産生される免疫グロブリンに対する抗体または抗原を用いて行う請求項15に記載のスクリーニング方法。
- 前記被検体細胞が、免疫グロブリン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、サイトカイン受容体または受容体であり、目的細胞が抗原特異的免疫グロブリン産生細胞である請求項12または13に記載のスクリーニング方法。
- 前記結合の有無の検出は、サイトカインまたはリガンドを用いて行う請求項17に記載のスクリーニング方法。
- 前記被検体細胞が、サイトカイン産生細胞を含み、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する物質が、抗サイトカイン抗体、またはサイトカイン受容体であり、目的細胞がサイトカイン産生細胞である請求項12または13に記載のスクリーニング方法。
- 前記結合の有無の検出は、産生されるサイトカインに対する抗体またはサイトカイン受容体を用いて行う請求項19に記載のスクリーニング方法。
- 免疫グロブリン産生細胞およびサイトカイン産生細胞は、天然型細胞、ハイブリドーマ、または細胞株である請求項12〜20のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 請求項12〜21のいずれかに記載のスクリーニング方法で特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の製造方法。
- 目的細胞が特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である請求項22に記載の製造方法。
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