JP2014518080A - 細胞のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、例えば、機能的活性及び／又は多抗原特異性を有する目的の抗体を分泌する細胞を同定、単離及び回収するためのハイスループットスクリーニング法に関する。本発明は更に、該抗体のＶＨ／ＶＬ配列のクローニング、及び、目的の特徴を有する、それらから由来する組換えモノクローナル抗体の生成のための方法を提供する。

Description

本発明は、免疫学の分野に関し、より詳細には、例えば、所望の機能的活性及び／又は多抗原特異性を有する目的の抗体を分泌する細胞を同定、単離、及び回収するための、ハイスループットスクリーニング法に関する。更に、本発明は、目的の特徴を有する組換えモノクローナル抗体を生成するための、該抗体のＶＨ／ＶＬ配列を回収及びクローニングするための方法に関する。更に、本発明は、そのようなモノクローナル抗体を生成する細胞を取得する方法、並びに、この細胞を用いてモノクローナル抗体を生成するための方法に関する。

発明の背景
ヒト疾患のための新しく強力且つ安全な抗体ベースの治療法の設計は、製薬会社の主要な目標である。このことは、所望の生物学的活性及び／又は標的抗原に対する特定の結合プロファイルを有する抗体を同定するために、多くのセットのモノクローナル抗体のスクリーニング、生成及び特徴付けを行うことを意味する。

一部の人々は、疾患関連抗原又は自己抗原に対して強い抗体応答を自然に発現する。

従って、既にインビボで生物学的に活性であることが示されている天然のヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞を、同定、単離及び回収可能とすることが適切であると考えられる。目的の抗体分泌細胞を単離できれば、公知のインビトロでの組換えＤＮＡ技術及び細胞培養法を用いることにより、前記抗体をコードする遺伝子のその後のスクリーニング及び組換えモノクローナル抗体の生成が可能となる。

この特定のアプローチの難しさは、所望のプロファイルを有する抗体（結合特性だけではなく、生物学的活性も有する）をコードする抗体分泌細胞が、多くの場合、血液細胞の総数に対して、更にはＢ細胞の総数に対して存在頻度の非常に低い（１／１０００未満〜１／２０００００未満）メモリＢ細胞であるという点である。

従って、抗原特異的抗体を分泌する細胞のうち、そのような生物学的に活性な抗体を分泌するＢ細胞の頻度は一般に非常に低いため、ヒトのドナーの生物学的試料（例えば、血液試料）からの生物学的に活性な抗体を分泌する細胞の同定、単離及び回収は、特に困難である（例えば、ＰｉｎｎａらのＥｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，３９：１２６０−１２７０（非特許文献１）を参照）。従って、目的の抗体を生成するＢ細胞は、循環する細胞の間で非常に低い頻度で存在する非常に稀な細胞であると考えることができる。

更に、これらのメモリＢ細胞は、（特定の抗原又は他の刺激因子を用いた）刺激がない場合には目的の抗体の生成も分泌も行わず、且つメモリＢ細胞は、抗体を分泌するために活性化されると寿命が非常に短い。

抗体分泌細胞を検出するためのいくつかの方法が、当該技術分野で知られている。単一の抗体を分泌する細胞を同定する代表的な方法は、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）法を含む（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），Ｖｏｌｕｍｅ： ４５，Ｉｓｓｕｅ：２，Ｐａｇｅｓ： １６９−１７１（非特許文献２））。最近では、細胞アレイを使用して抗体分泌細胞のハイスループットスクリーニングをするステップを含む、Ｂ細胞の同定及び単離のための新規の方法が、例えば、米国特許第７，７７６，５５３号（特許文献１）、欧州特許第１５６６６３５号（特許文献２）、又は欧州特許第２１８４３４５号（特許文献３）及びＪｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６（非特許文献３））に記載のＩＳＡＡＣ技術において記載されており、希少且つ頻度の低い抗体生成分泌細胞を同定する問題を解決することを目指している。

しかしながら、目的とする生物学的活性及び／又は多抗原特異性を有する抗体を生成するこれらの希少な抗体分泌細胞の同定のための、並びに、該抗体の更なるクローニングのための利用可能な方法の感度及び効率は、依然として向上されるべきである。これは、選択した特徴を示す新しい抗体の同定のために必要な、作業負荷、コスト及び時間の軽減を可能にする。

所望の特徴を示す新たな組換え抗体の回収率は、（ｉ）所望の機能的活性を示す、及び／又は結合プロファイルを示すＢ細胞を（直接的に、又は分泌された抗体の検出により）同定し、（ｉｉ）他の細胞から前記Ｂ細胞を選別／単離して、（ｉｉｉ）生存可能なＢ細胞及び／又は対応する免疫グロブリン可変重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を回収するための方法の効率に依存する。

上記の観点から、目的の結合及び／又は機能的プロファイルを有する抗体を生成する希少な抗体分泌細胞の同定のための、改良された方法又は代替の方法を見つける必要がある。特に、高い生物学的活性又は特定の多抗原結合プロファイルなどの厳しい要件を満たす高品質の抗体を発現する、希少な、低い頻度のＢ細胞を識別できるようにする方法を提供する必要がある。

米国特許第７，７７６，５５３号 欧州特許第１５６６６３５号 欧州特許第２１８４３４５号

Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，３９：１２６０−１２７０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），Ｖｏｌｕｍｅ： ４５，Ｉｓｓｕｅ：２，Ｐａｇｅｓ： １６９−１７１ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６

本発明は、例えば、所望の生物学的活性及び／又は多抗原特異性を有する目的の抗体を分泌する細胞の同定及び単離のための改良された方法を提供することにより、これらの問題のいくつかに対処する。この方法は続いて、目的の特徴を有する、それに由来する組換えモノクローナル抗体を生成するために、前記細胞の回収を可能にし、且つ、前記抗体のＶＨ／ＶＬ配列のクローニングを可能にする。

所望の生物学的活性及び／又は特定の結合プロファイルを有する新規なモノクローナル抗体の生成のための本発明の方法を、図１に概略的に示す。

本発明の方法は、選択されたエピトープ／抗原に対する、生物学的活性及び／又は結合プロファイルの事前に画定された要件を満たす抗体を分泌するＢ細胞を含む、細胞プールの早期同定及び選択により、続いて処理すべき細胞の数を減らすことによって、選択されたプロファイルを有するモノクローナル抗体の生成のための迅速且つ効率的な方法を提供する、ということを示した。特に、細胞スクリーニング及びその後のクローニングステップは、抗体発見キャンペーンの目的として画定された生物学的活性／結合の要件を満たすために選択された細胞プール（ヒット）に由来する細胞に対してのみ行われる。

更に、本発明の方法は、アレイを用いる抗原特異的抗体分泌細胞のスクリーニングにおいてヒットとして選択された、対応する抗体分泌細胞からの、目的のモノクローナル抗体のＶＨ／ＶＬ遺伝子対の回収率を増加させる、ということを実証し、特に、これはＪｉｎらにおいて記載されたＩＳＡＡＣ法に対して利点を有する（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６）。

従って、第一の態様において、本発明は、抗体分泌細胞を含む細胞集団において、標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するための方法に関し、該方法は、
（ａ）前記細胞集団の細胞をインビトロで刺激して増殖させ、複数の細胞プールを得るために細胞を採取するステップと、
（ｂ）１つ以上の抗原に結合する及び／又はある機能的活性を示す細胞を同定するために、前記細胞プールの上澄み液をスクリーニングするステップと、
（ｃ）最大３つの細胞がアレイの各ウェル中に存在するような条件下で、複数のウェルを含むアレイ中に、前記同定された細胞プールの細胞を付着させるステップと、
（ｄ）前記抗原に対する抗体を分泌する細胞を含むウェルを同定するために、前記アレイのウェル中の細胞を培養し、それらのスクリーニングを行うステップと
を含む。

第二の態様において、本発明は、
（ａ）上述の方法のステップ（ｄ）の同定されたウェル中に存在する細胞から、又は、該細胞の１つから得られた細胞培養物からｍＲＮＡを単離するステップと、
（ｂ）該ｍＲＮＡの逆転写を行い、対応するｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を介して増幅するステップと、
（ｃ）定常領域ＣＨ及びＣＬをコードする対応する配列を含有する適切な発現ベクターにおいて、ＶＨ領域及びＶＬ領域に対応するＤＮＡ配列をクローニングし、そのようにして、完全長の重鎖及び軽鎖の状態で、該ＶＨ領域及びＶＬ領域の発現を可能にするステップと
を含む、モノクローナル抗体を生成する細胞を得るための方法を提供する。

異なる細胞から単離され、異なるウェルから採取されたｍＲＮＡから、ＶＨ領域及びＶＬ領域をクローニングすることができることに留意すべきである。実際、以下に記載するように、アレイには複数のウェルがあり、そのそれぞれが、目的の抗体を分泌する細胞を含んでいる。本発明の方法の設計により（特に、細胞が刺激されて増殖しているという点により）、検出されたウェル中の細胞は、ステップ（ａ）の刺激に続くクローン増殖によって、全て同じ元の細胞から発生する。

別の態様において、本発明は、モノクローナル抗体を生成するための方法に関し、該モノクローナル抗体を発現するような条件下で、本発明の第二の態様において提供された細胞又は該細胞に由来する細胞を培養するステップを含む。

更なる態様において、本発明は、
（ａ）本発明の第一の態様に記載の方法を用いることにより、標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を、抗体分泌細胞を含む細胞集団から同定するステップと、
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲにより、前記同定した細胞から抗体のＶＨ及び／又はＶＬ配列を得るステップと
を含む、モノクローナル抗体のＶＨ及び／又はＶＬ配列の回収のための方法に関する。

本発明による方法は、その方法の実施の前に個体から得られた生物学的試料から得られた抗体分泌細胞を含む細胞集団に対して行われる。従って、本発明による方法は、インビトロで行われ、個体に対し実行されるいかなるステップも含まない。

本発明のＢ細胞スクリーニング法の概略図。本発明のスクリーニング法は、（ａ）標的ドナー又は患者を選択及び抽出するステップと、好ましくはその後、（ｂ）ドナーからの一次（primary）Ｂ細胞の大集団を活性化し増殖させるステップと、（ｃ）単一抗原特異性若しくは多抗原特異性を有する及び／又は生物学的活性を有する抗体を分泌するＢ細胞プールを、ハイスループットスクリーニングにより選択するステップと、（ｄ）単一細胞マイクロアレイを使用して、ステップ（ｃ）において選択されたＢ細胞プールから単一Ｂ細胞をスクリーニング及び検出するステップと、（ｅ）単一Ｂ細胞を回収し、回収された単一Ｂ細胞のそれぞれから、ＶＨ／ＶＬ遺伝子対を単離するステップと、（ｆ）標的とする単一抗原特異的若しくは多抗原特異的プロファイル及び／又は生物学的活性を有する組換えモノクローナル抗体候補を生成するステップと、を含む。 本発明の方法を用いる、グラム陽性菌毒素２に対する完全ヒト抗体の発見の２つのキャンペーンの概要。 本発明の方法に係る、機能的なヒットの高効率クローニング（キャンペーン＃１）。 細菌毒素２に結合する、精製された６個の組換えモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる力価測定。６個全てのｍＡｂは、細菌毒素２に結合する。このうち４個（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５）は毒素２に強く結合している一方、２個は、より弱く結合している（ｍＡｂ７及び８）。現在、後期臨床開発にある基準モノクローナル抗体は、陽性対照（基準ｍＡｂ）として使用される。 細菌毒素２を中和する、精製された６個の組換えモノクローナル抗体の細胞毒性アッセイによる力価測定。６個全てのｍＡｂは毒素２の細胞毒性を中和し、それらのうちの３個は、陽性対照として使用され且つ現在後期臨床開発にある、強力な毒素２を中和する基準抗体（基準ｍＡｂ）よりも優れていた。 本発明の方法に係る、機能的なヒットの高効率クローニング（キャンペーン＃２）。 細菌毒素２に対する、完全ヒトモノクローナル抗体を発見する２つのＩＳＡＡＣキャンペーンの概要。 ＩＳＡＡＣ技術及び本発明の方法により得られた、細菌毒素２に対する完全ヒトモノクローナル抗体の、結合活性及び中和活性の比較。示された抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする発現ベクターを用いて形質移入されたＣＨＯ細胞の未精製上澄み液を、それらの毒素２に対する結合についてＥＬＩＳＡにより試験し、それらの毒素２に対する中和活性について機能的アッセイにより試験した。アッセイにおいて、０．３μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの最終濃度に到達するために、各試料の希釈を適合させた。陰性対照：形質移入していないＣＨＯ細胞の上澄み液。陽性対照：現在臨床開発中の、細菌毒素２に対する基準抗体（基準ｍＡｂ）のＨ鎖及びＬ鎖をコードする発現ベクターを用いて形質移入したＣＨＯ細胞の上澄み液。 比較可能な作業負荷（同じドナーを用いた、１０週間の抗毒素２キャンペーン）について、ＩＳＡＡＣ技術に対して本発明の方法を用いた場合の、生物学的に活性な完全ヒトモノクローナル抗体の発見の結果の比較。 同一のＢ細胞プールから回収された単一細胞からのＶＨとＶＬの対又は組み合わせによる、ＶＨ及びＶＬ遺伝子回収の例。 標的とする多抗原特異性を有する完全ヒトモノクローナル抗体の生成。 本発明の方法により得られた、標的多抗原特異性を示す、精製された組換えモノクローナル抗体＃１。

定義
生物学的試料
抗体を発現及び分泌する細胞を、個体から得た異なる組織、器官及び生体液から単離する。細胞は、胸腺及び骨髄などの、未熟な前駆細胞からリンパ球を生成する中枢リンパ器官又は一次リンパ器官から単離することができる。あるいは、細胞を、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）に関連する、リンパ節、扁桃中のリンパ濾胞、パイエル板、脾臓、アデノイド、皮膚などの、リンパ球と抗原とが相互作用するための環境を提供する二次リンパ組織から単離することもできる。

脾臓中の単核細胞は、ＩｇＧを分泌する細胞を高い割合で含むことに留意されたい。細胞はまた、血液、脳髄液又は胸水などの生体液から単離することができる。あるいは、腫瘍浸潤リンパ球は、慢性感染症及び／又は炎症部位から単離することができる。

ヒト一次Ｂ細胞の最良の供給源は、脾臓単核細胞、扁桃腺及び抹消血単核細胞である（ＯｌｓｓｏｎらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６１：１７−３２（１９８３）；Ｋａｒｐａｓ Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１７９９−１８０４（２００１））。

末梢血は、ドナーから取得すること、貯蔵すること、及び、画定された期間にわたって、抗原に対する血清学的応答を監視することが、通常比較的容易である。例えば、５〜５０ｍＬの末梢血から開始し、約１，０００万〜１億のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を精製することができ、本発明の方法を用いて不死化された後、抗体分泌細胞の十分に大きな集団を得ることができる複数の細胞がスクリーニングされる。

ドナーから得られた生物学的試料及び特に血液は、目的の抗原に結合する能力を有する抗体の存在について、及び／又は、目的の抗原に対する機能的な抗体の存在について、通常スクリーニングされる。

完全ヒト抗体として治療又は診断の用途を有する、ヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞培養物を生成するために、ヒト由来の細胞が好ましい。ただし、本方法は、遺伝的に改変されたか異種移植された細胞、あるいは野生型動物の細胞などの、ヒト由来ではない抗体分泌細胞にも適用することができる。例えば、これらの動物細胞は、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥）、ラクダ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ又はサルに由来する細胞である。これらの供給源から単離された抗体は、その後、ヒト化することができるか、又は、診断方法に用いることができる。

「個体」、「ドナー」、「患者」
抗体を発現し、分泌する細胞は、ヒト又は非ヒトのドナーから得られる。ドナーは、生物学的試料を供与する個体である。この個体はヒトでもヒト以外でもよい。ヒト以外のドナーは、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥）、ラクダ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ又はサルなどの、遺伝的に改変されたか異種移植された動物又は野生型動物であり得る。

ｍＡｂは自然に選択され、従って、高い親和性を有し、安定しており、ヒト抗原に対するオフターゲットの反応性を欠いているため、完全ヒトｍＡｂは、マウス由来の製品に比べて、優れた治療候補であることがますます認識されている。従って、好ましくは、ドナーはヒトである。

有利には、ドナーは、目的の結合特性を有する抗体を提示するために選択される。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試験を行うことにより、又は、ドナーの生物学的試料中の１つ以上の標的抗原に結合する抗体の存在を決定するための同等のアッセイを行うことにより、ドナーの選択を行うことができ、このような方法は当技術分野において周知である。

ドナーは、感染性病原体による感染又は慢性疾患にかかっておらず、又は、抗体が所望される特定の感染因子にもヒトの疾患にも影響を受けていないことを意味する、「健康」「未処置」又は「無感作」の個体であり得る。

あるいは、ドナーは、一般的な治療用又は予防用のワクチンに供されているか、あるいは、特定の感染因子又はヒトの疾患を対象とする抗体を所望する。

第三の選択肢は、ドナーは「患者」である。従って、ドナーは、疾患に罹患する若しくは罹患している、又は感染している、又は一般的な感染因子に対してワクチン接種された集団について選択される。

一実施形態において、患者は、特定の疾患にかかっているか／これに罹患し、特に体液性応答により前記疾患から回復している。別の実施形態において、患者は、感染因子に曝露されたが、疾患を発症しておらず、同じ疾患の軽い症例も発症していない。

好ましい実施形態において、患者は、例えば、感染性因子に対する抗体応答を中和する、標的抗原に関連する疾患に対する機能活性を有する抗体を有することが示されている。

好ましい一実施形態において、ドナーは、以下の群から選択された少なくとも１つの疾患に罹患している／発症している患者である。
・ 感染性疾患：例えば、インフルエンザウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、チクングニヤウイルス感染症、狂犬病、Ａ型肝炎又はＣ型肝炎ウイルス感染症などの他の肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、アウレウスではないスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｎｏｎ−ａｕｒｅｕｓ）感染症、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症などのシュードモナス感染症、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染症、クロストリジウム ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、プロピオニバクテリウム アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）感染症、ポルフィロモナス ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）感染症、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染症、及び、特に、腸管出血性大腸菌感染症、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）感染症、レプトスピラ パトク（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐａｔｏｃ）感染症又はクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）感染症、
・ 喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの呼吸器疾患、
・ 虚弱、悪液質、筋肉減少症、肥満症、脂質異常症、メタボリックシンドローム、心筋梗塞（ＭＩ）、慢性腎不全（ＣＲＦ）、骨粗鬆症などの代謝障害、
・ 過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、脂肪肝疾患、線維症、薬剤誘発性肝疾患などの消化器疾患、
・ アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病）などの神経疾患、
・ 乳房、腎臓、胃、メラノーマ、膵臓、肺、結腸、神経膠腫、膠芽細胞腫、リンパ腫、白血病及び前立腺癌などのガン、
・ 関節リウマチ、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫リンパ増殖性症候群及び他の自己免疫疾患などの自己免疫疾患。

標的抗原
本発明の方法を、インターロイキン１α、インターロイキン１７、血小板ＧＰｌａ／ＩＩｂ、及び増殖因子受容体などの膜貫通タンパク質の細胞外部分、細胞内タンパク質、又は膜貫通タンパク質全体由来の抗原などの、自己抗原に対して使用することができる。

標的抗原の性質は特に限定されず、タンパク質、糖、脂質、核酸、有機化合物、無機化合物及びそれらの組み合わせ（細胞を含む）からなる様々な所望のメンバーを、適宜選択することができる。

好ましい実施形態によれば、目的の抗体を選択するために使用される抗原は、可溶性である（例えば、細菌毒素、ウイルスタンパク質、サイトカインなど）。好ましい実施形態によれば、目的の抗体の選択のために使用される抗原は、その天然の立体配座の状態にある抗原である。

結合物質
結合物質は、目的の免疫グロブリンの少なくとも一部に結合する能力を有する。結合物質は、従って、免疫グロブリンに対して反応することができる、標的抗原又は抗免疫グロブリン抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体）であり得る。使用可能な結合物質の種類については、後述する。目的の抗体の結合の検出を可能にするために結合物質が改変されること（一部分の移植）は、除外されない。

標識物質
標識物質により、目的の抗体の生成を検出することができる。

標識物質は、一般的に、検出可能な部分、特に蛍光部分に架橋されるように改変されたか、あるいは、それらだけで検出可能であるように設計された（即ち、蛍光性である）、タンパク質又は小分子である。しかしながら、それは蛍光剤に限定されず、他の種類の検出可能な標識（例えば、放射性標識部分など）も可能である。蛍光部分を用いた抗原又は抗体などのタンパク質の標識は、通常の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ検出のためにタンパク質を標識するために使用されるものなど）により行うことができる。

標識物質は、更に説明されるように、目的の抗体又は結合物質のいずれかに結合することができる。標識物質は、結合物質の存在又は非存在を検出することができるようにする部分を含む。この部分は、蛍光（結合物質が適切に標識されている場合の、直接検出又はＦＲＥＴによる検出用）、又は、放射性標識された部分であり得る。

本発明は、異なる抗原に結合する抗体を発現する抗体分泌細胞を同時に検出するために行うことができる（明確に言うと、特定の抗体分泌細胞からの抗体は、特定の抗原、又は（エピトープに関して）密接に関連する抗原のみに結合する）。その場合、標識物質として異なる標的抗原を使用し、そのそれぞれは、各標的抗原に対する抗体を発現する細胞を選択的に同定することができるように（即ち、多重抗体スクリーニング）、異なって標識されている。これはまた、密接に関連する標的抗原に反応する抗体を発現する細胞の同定を可能にすることができる。

抗体
本明細書で使用する用語「抗体」は、モノクローナル抗体、その断片及びそれらの免疫学的結合同等物を指す。モノクローナル抗体は、選択的に、標的抗原又はエピトープに結合することが可能である。用語「抗体」は、抗体の天然に存在する形態（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）、並びに、単鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体、及び多特異性抗体などの組換え抗体を、広く包含する。用語「抗体」はまた、前述の全ての断片及び誘導体を指し、更に、特異的にエピトープに結合する能力を保持する、任意のそれらの改変された又はそれらに由来する変異体を含むことができる。抗体誘導体は、抗体に結合したタンパク質又は化学的部分を含み得る。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化又はキメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）_２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、合成抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含み得るが、それらに限定されない。用語「抗体」はまた、免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む、融合タンパク質を指す。しかしながら、当業者には明らかであるように、ドナーからの生体試料に由来する抗体生成細胞により分泌された抗体は、抗体の天然に生じる形態であろうことに、留意すべきである。

ベクター／発現ベクター
ベクターは、自律的に複製し得るか、又は、ベクターが組み込まれている染色体と共に複製し得る。核酸分子は、制御配列に機能的に連結することができる。更に、ベクターは、複製開始点又は選択マーカー遺伝子を含み得る。

好ましくは、前記ベクターは真核細胞において、好ましくは哺乳動物細胞において、使用される。真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。このような配列は、５'及び時には３'の、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの非翻訳領域から、一般的に入手可能である。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号、及び同文献に開示されている発現ベクターを参照されたい。

宿主細胞
宿主細胞は、哺乳類、植物、昆虫、真菌又は細菌起源の細胞を含むが、それらに限定されない。形質転換は、例えば、ウイルス中（又はウイルスベクター中）にポリヌクレオチドをパッケージングし、このウイルス（又はベクター）を用いて宿主細胞に形質導入を行うことを含む、宿主細胞中へポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって、あるいは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号及び米国特許第４，９５９，４５５号により例示されるような、当該技術分野で公知の形質移入手順によって、行うことができる。特に、宿主細胞へ異種ポリヌクレオチドを導入する方法は当該技術分野で公知であり、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入、及び核へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションを含む。

本発明に従って使用することができる宿主細胞の例は、例えば、ハムスター、ウサギ、ラット、ブタ、マウスなどの哺乳動物の細胞；例えば、アヒル、ニワトリ、ウズラなどの鳥類の細胞；昆虫細胞又は他の動物細胞；例えば、トウモロコシ、タバコなどの、植物の細胞、及びサッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア パトリス（Pichia pastoris）などの真菌の細胞；大腸菌などの原核細胞；並びに、抗体及び他の結合タンパク質の生成のための、当該技術分野において使用される他の細胞を含む真核細胞を含むが、それらに限定されない。特に発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、並びに、多数の他の細胞株を含むが、それらに限定されない、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけ、ＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＰｅｒ．Ｃ６（登録商標）細胞である。別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、不死化されていない細胞株である。

あるいは、前記宿主細胞は鳥類細胞である。鳥類細胞は、胚、ヒヨコ及び成鳥を含む、様々な発達段階に由来してもよい。鳥類細胞株は、遺伝的に改変してもしなくてもよい。好ましくは、細胞株は、胚性幹細胞、胚性繊維芽細胞、生殖細胞などの胚細胞、又は神経細胞、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉を含む個々の器官、又は胚を保護する胚外組織及び膜に由来する。鳥類細胞株の例は、鳥類の胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号）、不死化アヒル網膜細胞（国際公開第２００５／０４２７２８号）及び、テロメラーゼ逆転写酵素を発現している遺伝的に改変された鳥類細胞（国際公開第２００７／０７７２５６号及び国際公開第２００９／００４０１６号）を含む。適切な鳥類の胚に由来する幹細胞は、ＥＢ４５、ＥＢ１４及びＥＢ１４−０７４などのニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株（国際公開第０３／０７６６０号及び国際公開第２００６／１０８８４６号）、又はＥＢ６６、ＥＢ２６、ＥＢ２４などのアヒル胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株（国際公開第２００８／１２９０５８号及び国際公開第２００８／１４２１２４号）を含む。より好ましくは、アヒル細胞株は、ＥＢ６６細胞株である。

培養培地
「細胞増殖培地」、「細胞培養培地」又は「培養培地」又は「培地調合物」は、細胞を培養する又は増殖させるための栄養液を意味する。そのような培地を構成する成分は、培養される細胞の種類によって変化し得る。栄養組成物に加えて、オスモル濃度及びｐＨは、培養培地の重要なパラメータと考えられている。

細胞増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、有機及び無機塩、炭水化物源、脂質、微量元素（ＣｕＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＺｎＳＯ_４など）を含む、当業者に周知の複数の成分を含み、各成分は、インビトロでの細胞の培養（即ち、細胞の生存及び増殖）をサポートする量で存在する。成分は、緩衝物質（重炭酸ナトリウム、ヘペス、トリスなど）、酸化安定剤、機械的ストレスに対抗する安定剤、プロテアーゼ阻害剤、動物の成長因子、植物の加水分解物、抗凝集剤、消泡剤などの、異なる補助物質も含むことができる。必要であれば、ポリプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を、消泡剤として細胞増殖培地に添加することができる。

細胞増殖培地は、好ましくは動物無血清培地（ＳＦＭ）であり、これはその細胞増殖培地がそのまますぐに使用できることを意味し、換言すると、細胞の生存及び細胞増殖を可能にする血清添加を必要としないことを意味している。細胞増殖培地は、好ましくは、化学的に定義されているが、それはまた、例えば、植物由来などの様々な起源の加水分解物を含有していてもよい。好ましくは、前記細胞増殖培地は、「非動物起源」の要件を満たし、換言すると、細胞増殖培地は動物起源の成分もヒト起源の成分も含まない（ＦＡＯ状態：「動物起源のものを含まない（ｆｒｅｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ）」）。ＳＦＭにおいて、天然の血清タンパク質は、組換えタンパク質によって置換されている。あるいは、本発明によるＳＦＭ培地は、タンパク質を含まず（ＰＦ培地：「無タンパク質培地（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）」）、及び／又は、それらは化学的に定義される（ＣＤＭ培地：「化学的に画定される培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」）。細胞増殖培地は、細菌汚染を防止するために、抗生物質などの規定の補助剤が補充されてもよいことは当技術分野において周知である。抗生物質の例は、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む。ゲンタマイシンは、通常、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで使用され、ペニシリンは最終濃度１００Ｕ／ｍＬで使用され、かつストレプトマイシンは最終濃度１００μｇ／ｍＬで使用される。細胞増殖中の異なる時期に、ビタミン、糖又はアミノ酸などの規定の補助剤を細胞増殖培地に補充してもよい。

タンパク質変異体
本明細書で使用する用語「変異体」は、用語「改変された」、「変異した」、「多型性」又は「突然変異体」を包含し、それらの用語は交換可能である。基準の遺伝子産物（即ち、抗原又は標的タンパク質）と比較した場合、用語「変異体」は、配列及び／又は機能的特性における改変（即ち、変化した特徴）を示す、遺伝子産物（即ち、抗原又は標的タンパク）を指し、通常、基準の遺伝子産物は、野生型の遺伝子産物である。用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合、その遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察され、従って、任意に遺伝子の「正常」又は「野生型」形態を設計されたものである。天然に存在する変異体を単離することができ、これらは、野生型遺伝子産物と比較した場合、それらが変化した特徴を有するという事実によって同定されるということに留意されたい。

第一の態様において、本発明は、標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するための方法に関し、この方法は、
（ａ）インビトロで集団の細胞を刺激して増殖させ、複数の細胞プールを得るために細胞を採取するステップと、
（ｂ）１つ以上の抗原と結合する及び／又はある機能的活性を示す細胞を同定するために、前記細胞プールの上澄み液をスクリーニングするステップと、
（ｃ）統計上、最大３つの細胞がアレイの各ウェル中に存在するような条件で、複数のウェルを含むアレイ中に、同定された細胞プールの細胞を付着させるステップと、
（ｄ）前記抗原に対する抗体を分泌する細胞を含むウェルを同定するために、前記アレイのウェル中の細胞を培養し、それらのスクリーニングを行うステップと
を含む。

用語「１つの（ａ）」は、「１つ又は複数」を意味するものであると解釈されるべきであることに留意されたい。従って、前記方法はまた、１つの特定の抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するだけではなく、複数抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定することも可能である。細胞プール上澄み液は、必要に応じて、例えば、９６ウェルプレート中のウェルなどの、細胞プール容器から回収される。

ステップ（ａ）における抗体分泌細胞集団の刺激、及びステップ（ｂ）における細胞採取は、任意の順序にすることができる。このように、細胞をまず刺激し（増殖につながる）、次に増殖した細胞を採取することができる。この代替は好ましい。

代替として、まず細胞を採取し、次に、細胞の増殖を導くためにそれらを刺激することができる。

いずれの場合においても、ステップ（ａ）の後に、増殖した細胞クローンを含む、複数の細胞プールが得られるであろう。

好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）を行う場合、同定された各細胞プールの細胞を、アレイ内の全ての細胞が同じ細胞プールに対応するような方法で、少なくとも１つのアレイ内に付着させる。

特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）ａ１．抗体分泌が開始されかつ／又は増加している刺激された抗体分泌細胞を得るために、少なくとも１種の刺激剤を用いて細胞の集団内の細胞を刺激し、複数の細胞プールを得るために、前記刺激された抗体分泌細胞を採取するステップ、又は、
ａ２．複数の細胞プールを得るために細胞の集団を採取し、プール中に存在する抗体分泌細胞からの抗体分泌を開始及び／又は増加させるために、少なくとも１種の刺激剤を用いて前記各プール中の細胞を刺激するステップと、
（ｂ）所望の機能的活性及び／又は抗原結合特異性を有する少なくとも１種類の抗体を含有する培養培地試料を同定するために、各プール由来の培養培地試料と標的抗原とを接触させ、それによって、標的抗原に対する機能的活性を示す抗体を分泌する少なくとも１つの細胞を含有するプールを同定する、及び／又は、標的抗原に対する結合活性を示す抗体を分泌する少なくとも１つの細胞を含有するプールを同定するステップと、更に
（ｃ）統計上、最大３つの細胞がアレイの各ウェル中に存在するような条件で、複数のウェルを含むアレイ上に、前記同定したプールからの細胞を付着させるステップと、
（ｄ）前記アレイのウェル中の細胞を培養し、前記アレイ中の各ウェルの上澄み液と、前記標的抗原とを接触させ、それによって、該標的抗原に結合する、該上澄み液中に存在する抗体に結合する該標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を含有するウェルを同定するステップと
を含む、抗体分泌細胞を含む集団において、１つ以上の標的抗原に対する生物学的活性を示す抗体を分泌する細胞を同定するための方法に関する。

抗体を分泌する細胞集団の選択
単核細胞（ＭＣ）は、当該技術分野で公知の方法により生物学的試料から単離される。好ましくは、前記生物学的試料が由来するドナーは、上述のように、その血清中の、目的の抗原と結合する免疫グロブリンの存在について、陽性であると事前にスクリーニングされている。血液試料について、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は典型的に、遠心分離により、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配分離を使用して単離される。

生物学的試料からのＰＢＭＣの単離後、特定の抗体アイソタイプの発現及び／又は細胞表面上の細胞表面マーカー、及び、適切な場合には、他のタンパク質の発現、並びに細胞の増殖活性、代謝及び／又は形態学的状態に基づいて、文献に記載された多くの方法のうちの１つを使用して、抗体分泌細胞の特異的選択を行うことができる。

特に、ヒト試料からの抗体分泌細胞の精製のための様々な技術は、陽性又は陰性選択について、異なる手段及び条件を利用する。これらの細胞は、抗体を発現及び分泌する細胞（例えば、ヒトＢ細胞）について特異的な細胞表面マーカーを発現するものを物理的に分離することによって、より容易に効果的に選択される。特定のプロトコルを、文献中に見出すことができる（Ｃａｌｌａｒｄ Ｒ及びＫｏｔｏｗｉｃｚ Ｋ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｂａｌｋｗｉｌｌ Ｆ．（ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００，中の"Ｈｕｍａｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ"ｐｇ．１７−３１を参照）。

特定の実施形態において、抗体分泌細胞を含む細胞の集団は、細胞表面における特定のマーカーを用いることによる抗体分泌細胞の陽性又は陰性選択によって得られた、血液試料からの亜集団である。例えば、リンパＢ細胞を、Ｔリンパ球（即ち、ＣＤ２＋細胞）などの他のＰＢＭＣの枯渇により、又は、以下に提供するようにＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２２などの特異的表面マーカーの存在について、選択することができる。前記亜集団はまた、特定のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤなど）の抗体を発現する細胞の能力に基づいて選択することができる。多くの場合、ＩｇＧ分泌細胞の亜集団を選択することが好ましい。別の実施形態において、亜集団を、スクリーニングプロセスを妨害し得る及び／又は下流のプロセスの有効性を制限し得る特定のアイソタイプを分泌する細胞で枯渇させてもよい。好ましい実施形態において、細胞集団は、ＩｇＭ発現細胞及び／又はＩｇＤ発現細胞の枯渇によりＩｇＧ分泌細胞が濃縮されている。好ましくは、細胞集団は、ＩｇＭ発現細胞及びＩｇＤ発現細胞が枯渇している。

有利には、抗体分泌細胞集団は、少なくとも細胞表面マーカーの発現に基づいて選択される。従って、選択は、通常、これらの細胞表面タンパク質のうちの１つに特異的に結合し、かつ固体支持体（例えば、マイクロビーズ又はプラスチックプレート）に連結可能な又はフローサイトメトリーにより検出することができる蛍光色素を用いて標識可能な抗体を用いることにより行われる。例えば、ヒトＢ細胞は、支持体（マイクロビーズなど）に結合するＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２２抗体に対する親和性に基づいて、又は、特定のアイソタイプに特異的な抗体に対する結合親和性を欠如していることについて、選択されている。好ましくは、この選択ステップは、例えば、ＥＢＶによる不死化などのリンパ球向性ウイルスを用いた形質転換前に、行われる（Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ａｕｇ；１０（８）：８７１−５．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊｕｌ １１）。

しかしながら、おそらく、選択プロセスによりトリガーされ、細胞増殖及び生存を変化させ得る細胞内シグナルのために、細胞マーカーの選択は、不死化プロセスの効率に関連し得る。Ｂ細胞限定的貫通タンパク質であるＣＤ２２は、抗原認識及びＢ細胞活性化に関連するシグナル伝達経路を制御し（Ｎｉｔｓｃｈｋｅ Ｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｊｕｎ；１７（３）：２９０−７）、初期のＢ細胞選択のための好ましい分子として現れる。ＣＤ２２陽性集団は、異なるアイソタイプ及び特異性を有する抗体を発現する細胞を含んでいるため、刺激段階の前又は後のいずれかによっては、細胞を選択するために他の細胞表面マーカーを用い得る。

上記に代えて、あるいは上記に加えて、ＣＤ２２に基づく選択に加えて、ＣＤ２７に基づく選択を適用することにより、抗体分泌細胞の特異的濃縮を得ることができる。ＣＤ２７は、体細胞の可変領域遺伝子が変異したヒトメモリＢ細胞によって優先的に発現されるマーカーであることが知られている（Ｂｏｒｓｔ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｊｕｎ；１７（３）：２７５−８１）。ＣＤ５、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ８６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７０、ＣＤ１５８又はＣＤ６９などの追加のマーカーを、細胞の所望の集団を枯渇又は濃縮のいずれかのために用いることができた。従って、抗原（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）に曝露されたドナーの病歴、抗体価に応じて、全体を使うか、ＣＤ２２濃縮Ｂ細胞を使うか、又は、ＣＤ２７陽性Ｂ細胞などの更に濃縮したＢ細胞亜集団を使うかの決定を行うことができる。従って、好ましい実施形態において、特に、選択された細胞集団は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＳ１９及びＣＤ２７からなる群より選択された少なくとも１つの細胞表面マーカーを含む、Ｂリンパ球で構成される。

アイソタイプの選択
抗原分泌細胞を、細胞を刺激する前又は後に、発現した抗体のアイソタイプに基づいて選択することができる。好ましくは、前記選択ステップは、抗体分泌細胞集団の刺激及び、ステップ（ａ）の増殖前に、行われる。

細胞のアイソタイプに基づく選択は、陽性選択（特定の細胞の単離を可能にする）又は、陰性選択又は濃縮選択（不溶な細胞の排除を可能にする）のいずれかのための手段を適用することにより、行われるべきである。例えば、医薬品の使用について承認されたほとんどの治療用抗体はＩｇＧである（Ｌａｆｆｙ Ｅ ａｎｄ Ｓｏｄｏｙｅｒ Ｒ，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２００５；１４（１−２）：３３−５５）ことを考えると、刺激されたＩｇＧ陽性細胞の集団のみが、（ＦＡＣＳ又は磁気細胞分離器により）又は、細胞の集団からＩｇＭなどの他のアイソタイプを発現する細胞を枯渇させることにより、積極的に選択することができ、その結果、ＩｇＧを発現する細胞が濃縮される。好ましい実施形態によれば、抗体分泌細胞を含む細胞の集団は、ＩｇＭ及び／又はＩｇＤを発現する細胞を枯渇させた、好ましくはＩｇＭ及びＩｇＤ発現細胞の両方を枯渇させた、細胞の亜集団である。ＩｇＭ枯渇は、好ましくは刺激の前に行われる。別の実施形態によれば、刺激前に不死化が行われた場合、ＩｇＭ枯渇は、好ましくは不死化の前に行われる。あるいは、ＩｇＭ枯渇は、国際公開第２００７／０６８７５８号に記載のように、刺激（例えば、ＣｐＧ−２００６及びインターロイキン２）及び、（例えば、エプスタイン・バーウイルスによる）不死化の間に行われる。

蛍光活性化又は磁気細胞分離器を用いた、抗体分泌細胞についての分離技術は、文献（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ）中で既知である。抗体分泌細胞の供給源及びその最終用途に応じて、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡ発現細胞の枯渇（又は濃縮）もまた所望され得る。

そのような正確な選択が所望される場合、同様の手法を、特定のサブクラスに基づいて細胞を単離するために使用することができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体を発現するヒトＢ細胞を区別するなど）。

細胞の不死化
特定の実施形態において、抗体分泌細胞（Ｂ細胞）を、ステップ（ａ）の前、間又は後に、形質転換／不死化することができる。

ウイルス性の形質転換剤は、細胞の無期限な自己再生、即ち、細胞の不死化につながる細胞プロセスを誘発する可能性があることに留意すべきである。用語「形質転換された」又は「不死化した」の使用は、時間に関連する問題である。従って、本発明における、用語「形質転換された」又は「不死化した」及びそれらの派生語は、同じ意味を有し、同様に使用することができる。特に、これは、抗体分泌細胞が、刺激されて増殖した後に、まだ生きているという事実を表している。

後述するように、形質転換は、好ましくは、ウイルス性の形質転換剤を用いて行われ、より好ましくは、ステップ（ａ）の前又は間に、抗体分泌細胞にリンパ球向性ウイルスを感染させる。好ましい実施形態において、不死化は、エプスタイン・バーウイルスを用いて行われる。

別の技術を、Ｂ細胞を不死化するために用いることができる。
（１）ハイブリドーマを生成するための、Ｂ細胞と、マウス、ヒト及びマウス×ヒト起源の骨髄腫細胞との融合。国際公開第２００９／１０５１５０号： ＩＩ−４、ＩＩ−１０及びＣＤ４０Ｌの存在下で培養されたＣＤ２７＋Ｂ細胞は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマを生成するために、融合パートナーと融合させることができる。処理したＣＤ２７＋Ｂ細胞をハイブリドーマの生成に使用する利点は、ハイブリドーマ中のより高い割合の細胞が、ＩｇＧ抗体を分泌したことである。
（２）エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を用いた、Ｂ細胞のウイルス形質転換（後述）。
（３）米国特許第４，９９７，７６４号又は米国特許第５，７９８，２３０号に記載のような、形質転換遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを用いたＢ細胞の形質導入。

ウイルス性の形質転換
好ましい実施形態によれば、抗体を発現する、選択され且つ刺激された細胞集団は、ウイルス性の不死化剤を用いて不死化することができる。文献は、不死化した抗体分泌細胞を得るために、異なる不死化剤を抗体分泌細胞へ使用することができ、時には、単一プロセスで組み合わせることができることを示している。

ウイルス性の不死化剤の中でも、抗体分泌細胞に感染しかつそれを不死化するウイルスを、好ましくは本発明の方法において使用すべきである。そのような選好性を有するウイルスは、リンパ球向性ウイルスとして一般的に知られており、ヘルペスウイルスのγクラスにグループ化されている。

このウイルスファミリーのメンバーは種特異的な方法でリンパ球に感染し、リンパ球増殖性疾患及びいくつかの悪性腫瘍の発生に関連している。ＥＢＶ（ヘルペスウイルス４としても知られる、エプスタイン・バーウイルス）、及びＨＨＶ−８（ＫＳＨＶ、カポジ肉腫に関連するヘルペスウイルスとしても知られる、ヒトヘルペスウイルス８）は、ヒトのリンパ球に感染し、不死化する。ＭＨＶ−６８（マウスヘルペスウイルス６８）、ＨＶＳ（ヘルペスウイルス サイミリ）、ＲＲＶ（アカゲザル ラジノウイルス）、ＬＣＶ（霊長類 リンホクリプトウイルス）、ＥＨＶ−２（ウマへルペスウイルス２）、ＨＶＡ（ヘルペスウイルス アテレス）、及びＡＨＶ−Ｉ（アルセラフィン ヘルペスウイルス１）は、それらの中に保存されたいくつかの共通の遺伝子的特徴及び異なる哺乳動物宿主細胞内で同様の病原作用を有する、他の、発がん性でリンパ球向性のヘルペスウイルスである。本発明の方法が哺乳動物から得られた抗体分泌細胞へ適用される場合は常に、これらのウイルスを使用することができる。

しかしながら、Ｂ細胞を不死化することができる完全なウイルスだけではなく、そのような特定のウイルスにより得られる特定のウイルス性タンパク質を含む組換えＤＮＡ構築物及び他のウイルスが、Ｂ細胞を不死化するためにうまく使用されている（Ｄａｍａｎｉａ Ｂ Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；８０：５１−８２；Ｋｉｌｇｅｒ Ｅ ｅｔ ａｌ．，、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８ Ｍａｒ １６；１７（６）：１７００−９）。ウイルス遺伝子を含む類似のベクターを細胞へ導入することができ、時には、レトロウイルスシステムの利用、又はパッケージング細胞株中への、粒子の形成のためにトランスで必要な全ての因子を提供するウイルス様粒子の利用を、本発明の方法においても使用することができる。

ＥＢＶの場合には、不死化フェーズを１時間〜数時間、最大で２〜４日間継続でき、不死化した抗体分泌細胞を提供するリンパ芽球のポリクローナル集団（顕微鏡検査及び又はＦＡＣＳにより測定される、大型の生存細胞）を確立するためには少なくとも４時間あれば十分である。

ＥＢＶが媒介するＢ細胞の不死化は、主なＥＢＶ受容体として考えられる細胞表面受容体ＣＤ２１の存在下で実行される。ＣＤ２１は、ほとんどのＢ細胞亜集団に存在し、ＣＤ１９とＢ細胞抗原受容体との複合体を形成することにより、Ｂ細胞応答を調節する（Ｆｅａｒｏｎ Ｄ ａｎｄ Ｃａｒｒｏｌｌ Ｍ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８：３９３−４２２）。しかしながら、細胞の広範な活性化後に、それらは形質細胞へ形質転換されるため、ＣＤ２１は細胞表面から失われる。従って、ＥＢＶを用いて細胞を形質転換する能力は、Ｂ細胞刺激剤の添加によって補助することができるが、その条件として、ＣＤ２１を細胞表面上に維持し、ＥＢＶが高効率で不死化を可能にすることを確実にすることが好ましい。

不死化した抗体分泌細胞集団を、効率的に得ることができる。実際に、潜伏し、溶菌しない状態でＥＢＶウイルスを用いて不死化する場合、選択されかつ不死化されたＢ細胞が豊富な細胞培養集団は、増殖する能力を維持しつつ、有用な治療用抗体を生成する大きな可能性を有する。不死化のプロセスは、高い増殖能及びＩｇＧ分泌能の状態で、集団を「捕獲」することができる。

ＥＢＶが媒介する不死化は、ＥＢＶにより発現されるタンパク質によるＢ細胞の不死化を含む複雑なプロセスであり、不死化に続いて、ＥＢＶと宿主細胞タンパク質との間の相互作用によって調節される（Ｂｉｓｈｏｐ ＧＡ ａｎｄ Ｂｕｓｃｈ ＬＫ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ． ２００２ Ｊｕｌ；４（８）：８５３−７）。

細胞培養物に添加するＥＢＶ上澄み液の量は、一般に、文献に記載されている量（１０％、２０％、３０％又はそれ以上）にすることができるが、この方法は、ＥＢＶの上澄み液の量が比較的高い（５０％容積／容積）条件で、曝露が比較的短い（約４〜約２４時間）場合に正しく働くことができるようである。

必要に応じてではあるが、好ましくは、ウイルス性の不死化剤は、例えば、細胞集団を洗浄及び培養することによって、新鮮な細胞培養培地中から除去される。

ＥＢＶを用いたインビトロでのＢ細胞不死化は、シクロスポリンＡ及び過酸化水素（それぞれ、約５００ｎｇ／ｍｌ及び約１００μＭの濃度で使用される）により誘導されたものなどの酸化ストレスによっても促進することができることに留意されたい。

細胞の刺激
このステップの目的は、培養培地中へ、細胞に抗体を分泌させることである。上述のように、目的の抗体を生成することができる細胞は、メモリＢ細胞及び／又は、任意の抗体分泌細胞であり得、従って、検出可能な量が存在するように、効率的に抗体を分泌させるために、細胞は刺激される必要がある。刺激は、集団の細胞のクローン増殖につながる。刺激剤として標的抗原を使用することによってこの刺激は特異的であり得るが、好ましくは、非特異的である（即ち、全ての抗体分泌細胞が刺激されている）。

目的の抗原に結合する抗体を発現する、メモリＢ細胞及び／又は抗体分泌細胞を検出するのに必要且つ十分な時間の間、培養培地中の細胞の増殖を誘導するのに十分な時間、又は好ましくは十分な時間、生存可能な抗体分泌細胞を維持すること、及び／又は、以下に記載の細胞を採取するステップの間、機能的活性を維持することも、本ステップの目的である。

本発明において、用語「刺激」及び「活性化」は、同じ意味を有し、同等に使用することができる。

刺激剤は、以下の化合物から選択することができる。
（ａ）Ｂ細胞により発現されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対する、少なくとも１つのアゴニスト。発現した異なるＴＬＲのうち、ＴＬＲ９及びＴＬＲ７が好ましい。ＴＬＲ９は、オリゴヌクレオチドを認識し、より具体的には、ＣｐＧベースのオリゴヌクレオチドを認識する。ＴＬＲ７は、一本鎖ＲＮＡ、グアノシン類似体並びに、イミキモド及びレシキモド（Ｒ８４８）などのイミダゾキノリン化合物を認識する。好ましい実施形態によれば、刺激剤は、ＣｐＧ−ベースのオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、ヒトＢ細胞についてのＣｐＧ２００６、又はＲ８４８である。

（ｂ）インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）などの、免疫刺激活性を有することが知られている、少なくとも１つのサイトカイン。

好ましい実施形態によれば、Ｂ細胞の刺激は、ＣｐＧ−ベースのオリゴヌクレオチド又はＲ８４８（それぞれ、ＴＬＲ９又はＴＬＲ７を刺激する）及び、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γなど）を用いた刺激を組み合わせることにより、より好ましくは、ＣｐＧ２００６及びＩＬ−２を組み合わせることにより行われる。

（ｃ）少なくともＴＮＦ受容体ファミリーの細胞膜受容体のアゴニスト、特に、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ又はＣＤ４０Ｌなどの、Ｂ細胞におけるＮＦ−ＫＢ経路及び増殖を活性化するもの。好ましい実施形態によれば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に対するＦｃ受容体を発現するために安定に形質転換されたマウスＬ細胞の表面を修飾する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を用いて、Ｂ細胞表面ＣＤ４０を架橋することにより、Ｂ細胞は同時に刺激される（欧州特許第０５０５３９７）。別の好ましい実施形態によれば、マウスＬ細胞の表面を修飾するＣＤ４０リガンドを用いて、Ｂ細胞表面ＣＤ４０を架橋することにより、Ｂ細胞は同時に刺激される。可溶性ＣＤ４０リガンド又は、ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体の使用が報告されている（国際公開第９１／０９１１５号；国際公開第９４／２４１６４号；Ｔｓｕｃｈｉｙａｍａ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． １９９７；８（１）：４３−７；Ｉｍａｄｏｍｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｎ ２４；１００（１３）：７８３６−４０．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｎ １２）。

別の好ましい実施形態によれば、ＴＮＦ受容体ファミリーの細胞膜受容体のアゴニスト及びサイトカインを組み合わせることによりＢ細胞の刺激を行う。

他の既知の刺激剤は、ＰＷＭ（ポークウィードマイトジェン）、ＬＰＳ（リポ多糖類）又は黄色ブドウ球菌Cowan（ＳＡＣ）である。

刺激剤の組み合わせは、不死化フェーズの前に培養培地に添加することができ、もしあれば、同時又は連続的に培養培地に添加することができ（例えば、初回細胞選択の直後に第一の刺激剤を加え、数時間又は数日後に第二の刺激剤を加える）、又は、抗体分泌細胞からのよりよい反応を得るのに有用であることが証明される場合は不死化フェーズの後に培養培地に添加することができる。

細胞は、そのＣＤ４０抗原を架橋することができる薬剤の存在下で、好ましくは培養される。ＥＢＶによる不死化を行う場合、ＣＤ４０架橋刺激が特に好ましい。好ましくは、架橋剤は、ＣＤ４０に対して特異的な固定化モノクローナル抗体である。マイクロスフェア、リポソーム又は細胞膜などの、固相又は非水相液体基体上に、それを固定化することができる。更に、サイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）及びインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の、単独又は組み合わせのいずれかを存在させ、培養増殖速度を向上させることができる。ＣＤ４０特異的抗体及び、この抗体を固定化するために使用される基体の詳細な説明は、欧州特許第５０５３９７に見出すことができる。あるいは、マウスＬ細胞（即ち、ＣＤ４０Ｌを発現するフィーダー細胞）の表面を修飾するＣＤ４０リガンドを用いてＢ細胞表面ＣＤ４０を架橋することによって、Ｂ細胞は同時刺激される。

エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を細胞に感染させることにより、細胞を不死化することができる（Ｊａｍｅｓ，Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ． ２９，ｐｇ．２５７；１９８９）。欧州特許第５０５３９７に示されるように、ＣＤ４０架橋剤の存在は、ＥＢＶによるＢ細胞感染の効率、従って、不死化細胞の数を増加させる。通常、まずＥＢＶでＢ細胞を不死化させ、次に、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後など、最大１日後、２日後、３日後に、Ｂ細胞はＣＤ４０架橋剤を用いて刺激される。

ＥＢＶで不死化を行う場合、細胞は、好ましくは、ＣｐＧ−ベースのオリゴヌクレオチド、より好ましくはＣｐＧ２００６と、サイトカイン、より好ましくはＩＬ−２との組み合わせの存在下で培養される。その刺激特性に基づいて、ＣｐＧ２００６及びＩＬ−２は、不死化ヒトＢ細胞を生成するためにＥＢＶを用いて同時に使用されている（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；国際公開第０４／７６６７７号）又は、ＥＢＶ不死化の前に使用されている（国際公開第２００７／０６８７５８号）。

刺激剤は、希釈されたストック溶液から細胞培養培地へ直接的に、又は、適切に調剤された後に、例えば、それらの取り込み及び免疫刺激活性を向上することができるリポソーム又は他の化合物を用いて添加することができる（Ｇｕｒｓｅｌ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。刺激剤はまた、固体マトリックス（マイクロビーズ又は直接的に細胞培養プレート上）に結合することができ、より効率的な除去も可能にする。

刺激の後は、刺激剤の性質を考慮して、後の不死化及び細胞培養条件の維持に対するいかなる負の影響をも回避するために、刺激剤を効率的に除去する方法で、抗体分泌細胞を続いて好ましく処置する。

従って、刺激剤の残りの任意の影響を更に弱めて排除するために、細胞を新鮮な培地を用いて１回以上洗浄し、必要に応じて、通常の細胞培養培地中で維持することができ（例えば、１〜６日）、細胞培養中に特定の化合物を添加することによっても阻害することができる。

細胞の採取
上述のように、目的の抗体を分泌する細胞は、生物学的試料中に存在する細胞の総数に対して、非常に低い数である頻度が高い。

従って、本発明による方法は、複数の細胞プールを得るために、細胞の採取／分割ステップを含む。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される各細胞プールは、１０，０００〜１，０００，０００個の抗体分泌細胞、５０，０００〜９００，０００個の抗体分泌細胞、８０，０００〜６００，０００個の抗体分泌細胞、１００，０００〜８００，０００個の抗体分泌細胞を含む。好ましい実施形態において、各細胞プールは、５００，０００個の抗体分泌細胞±１０％、より好ましくは約１００，０００〜３００，０００個の細胞を含む。

細胞は、刺激後に採取してもよいことに留意されたい。この場合、プールは、１０，０００〜１，０００，０００個の抗体分泌細胞、１００，０００〜８００，０００個の抗体分泌細胞、２００，０００〜７００，０００個の抗体分泌細胞、３００，０００〜６００，０００個の抗体分泌細胞を含む。最も好ましい実施形態において、各細胞プールは、５００，０００個の抗体分泌細胞±１０％を含む。この場合、細胞の培養培地は、そのプールに入っていない細胞によって生成されたであろういくつかの抗体を含むことを避けるために、採取後に変更され得る。

採取後に刺激を行った場合、プールは、好ましくは、１０〜５０００個の抗体分泌細胞、２０〜２０００個の抗体分泌細胞、５０〜１０００個の抗体分泌細胞、５０〜５００個の抗体分泌細胞を含む。最も好ましい実施形態において、各細胞プールは、１００個の抗体分泌細胞±１０％を含む。刺激／活性化は抗体分泌細胞のクローン増殖を導き得、それによってステップ（ｂ）の前にプール中の細胞の数を増加させる。

各プール中に導入された細胞の総数は、細胞集団内の抗体分泌細胞の割合に依存するであろう。

概して、異なるプールは、マイクロタイタープラーク、通常９６ウェル又は３８４ウェルプラークのウェル中に存在する。

好ましくは、細胞採取の後、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中などの、細胞が培養培地中に抗体を分泌する条件下で、前記細胞プールが該培養培地において培養される。適切な培養細胞培地は、上述されている。その結果、上記の刺激剤のいくつかが、培養培地中に存在し得る。この操作の目的は、抗体の活性をステップ（ｂ）において評価し得るように、培養培地が十分な抗体を確実に含むようにすることである。

理想的には、刺激された抗体分泌細胞は、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間及びそれ以上、培養されるべきである。

好ましい実施形態において、それらは、約１４〜１５日間培養される。

所望の活性及び／又は結合プロファイルを有する抗体を分泌する細胞を少なくとも含むプールの同定
ステップ（ｂ）において、各プールの培養培地のいくらかを採取する。この培養培地は、プール中に存在する細胞から分泌された異なる抗体の混合物を含む。細胞プールは、インビトロでの刺激及びステップ（ａ）の細胞増殖に続く、増殖した細胞クローンの混合物であることを留意されたい。

所望の結合活性及び／又は機能的活性を提示する任意の抗体を含むかどうかを識別するために、これらの抗体混合物を次に評価する。

従って、抗体分泌細胞プールの選択は、所望の結合特性及び／又は生物学的活性の特性を有する抗体が、対応する細胞培養上澄み液中に存在していることを決定することに基づいて実施される。

好ましくは、１つ以上の抗原に結合する抗体が対応する細胞培養上澄み液中に存在していること、及び特定の生物学的活性が示されることによって、細胞プールが選択される。

特に、二重の選択が行われる場合、即ち、１つ以上の抗原への結合、及び生物学的活性の存在に基づく場合、これらの試験は、任意の順序で行うことができる。例えば、これらは、２つの連続した選択項目として、即ち順々に行うことができ、あるいは両方の試験が並行して行われる。好ましくは、目的の結合特性を有する抗体の存在について、細胞プールについて第一の試験を行い、その後、所望の生物学的活性の存在に基づく選択を行う。

多くのアッセイを行うことができ、特に、結合又は機能的アッセイを行うことができる。

１回のアッセイで、培養培地が、標的抗原に結合することができる任意の抗体を含むかどうかを決定し得る。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降、フローサイトメトリー又はビーズベースのスクリーニング技術などの種々の技術が、当業者に周知である。複数の結合試験が有利に実施される。好ましくは、この結合試験は、ＥＬＩＳＡ試験である。

目的の結合プロファイルを有する抗体の細胞プール上澄み液中の存在を決定するために、１つ以上のＥＬＩＳＡ試験を行うことができる。特定の実施形態において、例えば、異なるタンパク質変異体との異なる結合又は架橋を有するなどの、目的の結合プロファイルを有する抗体分泌細胞を選択するために、複数のＥＬＩＳＡアッセイを行う。用語、タンパク質変異体は、上述されている。これらの複数のＥＬＩＳＡ試験を、連続的、即ち順々に、あるいは並行して、行うことができる。

目的の特定の結合プロファイル及び、それらの同定のために、複数のＥＬＩＳＡ試験がどのように行われるのかの例を、本明細書において提供する。複数のＥＬＩＳＡアッセイを、例えば、一般的な保存されたモチーフを有する、タンパク質変異体又はタンパク質と交差反応する抗体を同定するために、使用することができる。特に、複数のＥＬＩＳＡ試験を、種（例えば、ヒト／マウス）間、又は同じ種のサブグループ間（例えば、インフルエンザウイルスの、赤血球凝集素又はノイラミニダーゼタンパク質の多岐にわたるサブタイプ（Ｃｌｅｍｅｎｔｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１２）：ｅ２８００１）の、特定のタンパク質に対して交差反応するモノクローナル抗体の選択のために実施することができる。あるいは、複数のＥＬＩＳＡ試験を、リン酸化されたエピトープを認識するが、対応する非リン酸型は認識しない抗体を分泌するＢ細胞を含有する選択された細胞プールを選択するために実施することができる。例えば、リン酸化型について特異的な抗体を提示する細胞プールを選択するために、まずＥＬＩＳＡを実施し、その後、同じエピトープであるがリン酸化されていないものを認識するモノクローナル抗体を選択しないようにするために、第二のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、対抗選択することによって行われる。

更に、特定のタンパク質の特定のエピトープを認識するモノクローナル抗体をその上澄み液中に含む細胞プールを選択するために、複数のＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。一実施形態において、ＥＬＩＳＡ試験を、前記特定のタンパク質に対するモノクローナル抗体を選択するために実施し、次に、これらの抗体が前記タンパク質の特定のエピトープを認識するかどうかを決定するために、１つ又は複数のペプチド配列に対する第二の選択を行う。

当業者は、目的の結合プロファイルに従って行われる結合試験（即ち、ＥＬＩＳＡアッセイ）を決定するであろう。

多くの種類の機能的アッセイが存在する。当業者は、標的抗原のために適切なものを決定することができると考えられる。従って、選択された標的抗原に従って特定の生物学的活性が試験され、この生物学的活性試験は、中和活性、細胞増殖抑制作用、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性、直接的細胞死滅、食作用などの決定によって構成され得る。機能的アッセイは、特定の抗原に対する抗体を同定するために、常に発展し、利用可能であり、及び／又は実行可能であるわけではない。以下は、機能的アッセイの非限定的な例である。
・ 抗体無し又は様々な量の抗体存在下で、標的の生物学的活性を評価するためのアッセイ。
・ 抗体無し又は様々な量の抗体存在下で、標的の生物学的活性を中和するためのアッセイ。この機能的アッセイは、通常、ウイルス抗原又は細菌抗原に対するモノクローナル抗体を同定するために用いられる（例えば、国際公開第２００４／０７６６７７号中の抗ＳＡＲＳ抗体中和アッセイを参照）。細菌抗原のための更なるアッセイは、血清細菌抗体（ＳＢＡ）及びオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）であり得る（例えば、Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７ ｖｏｌ．４ Ｎ°４ ｐｐ４１５−４２２を参照）。
・ 標的細胞の活性化又は阻害を決定するためのアッセイ。読み出しは、シグナル経路及び／又はアポトーシスの活性化又は阻害であり得る。

特定の実施形態において、細胞上澄み液の機能的活性（即ち、生物学的活性）を、ステップ（ｂ）において、標的タンパク質又は有機体を中和するために、細胞上澄み液中の抗体の能力を測定する試験を用いて決定する。ウイルスに対する中和アッセイの例は、ウイルスの感染力価を減少させる、即ち、ウイルス感染性を中和する抗体の検出を含む。中和試験の他の例は、細胞毒性毒素の細胞毒性活性の中和を決定する際に、構成される。

特定の実施形態において、所望の生物学的活性は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を刺激する能力である。

従って、所望の生物学的活性を有する抗体を分泌する少なくとも１つの細胞を含むプールは、採取されたそのような抗体を含む培地由来のプールである。

これらのプールを次に、これらのプール（上記で見られるように、５０，０００〜８００，０００個、好ましくは約５００，０００個の抗体分泌細胞を含む）の複雑さの低減を図ることができるステップを含む、本発明の方法の次のステップのために使用し、これにより、前記抗体を生成する特定の単一細胞が単離される。

ほとんどの場合、プールは、特定の標的に対する抗体を分泌する複数の細胞を含むことに留意されたい。実際に、細胞のクローン増殖につながる抗原の分泌を可能にする培養条件が存在し、それによってプール内のこれらの細胞の数を増加させる。

しかしほとんどの場合、これらの細胞はプール内で少数派である。

所望の生物学的活性及び／又は結合プロファイルを有する抗体を生成する細胞を含むものとして同定された細胞プールのハイスループットスクリーニング
目的の抗体を特に分泌する細胞を同定するために、同定されたプールからの細胞を、統計上、最大で３つの細胞が前記マイクロウェルアレイの各ウェル中に存在するような条件で、複数のウェルを含むアレイ上に付着させる。好ましくは、前記アレイは、前記マイクロウェルアレイのウェルのサイズ及び形状が、ウェル当たり細胞を１つだけ入れることができるようなマイクロウェルアレイである。

プールの細胞をアレイへ適用する前に、任意の以前の溶液を交換するため及び／又は適切に不純物、特に、結合物質のコーティング層を形成する過程で（例えば、以下に見られるように、コーティング層がアレイへ加えられている場合）表面に付着し得る不純物を除去するために、アレイのウェル及びそれらの周囲の領域を、生理学的溶液、好ましくは培養培地を用いて洗浄し、検出の精度を向上させるのが望ましい。

上述したように、ウェル中に導入された細胞は、標的抗原に対する所望の生物学的活性及び／又は結合プロファイルを有する目的の抗体を分泌する少なくとも１つの細胞を含むことが同定されているプールの一部である。

マイクロウェルアレイ
好ましい実施形態において、複数のマクロウェルを、マイクロウェルアレイチップ上に等間隔の行又は列で配置する。本発明において、用語「チップ」、「アレイ」、「マイクロアレイ」及び「マイクロウェルアレイ」は、同じ意味を有し、交換可能に使用することができる。

マイクロウェルの形状もサイズも、特に制限されていない。しかしながら、例えば、マイクロウェルの形状は、円筒形とすることができる。また、マイクロウェルの形状は、複数の面で構成された多面体（例えば、平行六面体、六角柱、又は八角柱）、逆円錐、逆ピラミッド（逆三角錐、倒立角錐、逆五角錐、逆六角錐、又は、７つ以上の角を有する逆多角錐）又は、これらの形状を２つ以上組み合わせた形状などの、非円筒形とすることができる。例えば、部分的に円筒形であり、残りは逆円錐の形状であってもよい。マイクロウェルの底部は、通常は平坦であるが、曲面（凸状又は凹状）であってもよい。

好ましくは、前記アレイは、マイクロウェルアレイであり、前記マイクロウェルアレイのウェルのサイズ及び形状は、各ウェルに細胞が１つだけ入ることができるように設定されている。適切な単一細胞マイクロウェルアレイは、例えば、欧州特許第１５６６６３５号、欧州特許第１６９１１９６号及び欧州特許第２１８４３４５号に記載されている。円筒形のマイクロウェルについて、寸法は、例えば、３〜１００マイクロメートルの直径とすることができる。Ｂリンパ球を検出するためには、直径は、望ましくは４〜１５マイクロメートルである。

深さは、３〜１００マイクロメートルとすることができ、Ｂリンパ球を検出するためには、望ましくは、４〜４０マイクロメートルである。

当業者は、１つのマイクロウェルが１つのＢリンパ球細胞のみを含んでいるならば、マイクロウェルの他の形状及びサイズを決定することができる。

マイクロウェル当たりにＢリンパ球細胞が確実に含まれるよう、Ｂリンパ球の直径の０．５〜２倍、望ましくは０．８〜１．９倍、好ましくは０．８〜１．８倍の範囲内に、最大の円の直径を選択することができる。不死化した及び／又は活性化したＢ細胞の直径が、不死化していないＢリンパ球の直径よりも大きいかどうかを考慮するべきである。

更に、マイクロウェルの深さは、好ましくは、マイクロウェルに含まれるＢリンパ球細胞の直径の、０．５〜４倍、望ましくは０．８〜１．９倍、好ましくは０．８〜１．８倍の範囲とする。

単一のマイクロウェルアレイチップ内に存在するマイクロウェルの数は、特に限定されるものではない。しかしながら、１０^５個の細胞当たりの所定の抗原特異的リンパ球の頻度が、上限で１〜約５００個である場合、マイクロウェルの数は、１ｃｍ^２当たり、約２，０００〜１，０００，０００個の範囲であろう。

マイクロウェルアレイ内の細胞の付着
特定の実施形態において、各ウェル内に複数の細胞が入ることが可能となるように、マイクロウェルのサイズが選択されてもよい。この実施形態において、アレイに提供される試料中の細胞の濃度が、各アレイの各ウェル中に加えた培地の量が（統計上）最大３つの細胞を含むようなものであるように、プール中の細胞が希釈される。

９６ウェルアレイを使用し、５００μｌを各ウェルに添加する場合、例示として、細胞を、約６細胞／ｍＬの濃度まで希釈する。２５０μＬを各ウェルに添加する場合、細胞を、約１２細胞／ｍＬの濃度まで希釈する。３８４ウェルアレイを使用し、４０μＬを各ウェルに添加する場合、細胞を約７５細胞／ｍＬの濃度まで希釈する。

好ましい実施形態において、希釈は、各アレイの各ウェルが（統計上）最大２つの細胞を含むように行う。

好ましい実施形態において、希釈は、各アレイの各ウェルが（統計上）最大１つの細胞を含むように行う。

この実施形態において、アレイのウェル中の細胞の分布（ウェル当たりの細胞数）は、概して、各ウェルにおいて所望される細胞の（統計上）最大数を中心とする正規分布である。いくつかのウェルは、この数よりも多い又は少ない細胞を含み得るが、ウェルの大半はその数を含む。

好ましい実施形態において、単一細胞マイクロウェルアレイが使用され、このアレイは、ウェルのサイズ及び形状が、ウェル当たり細胞を１つだけ入れることができるようなマイクロアレイである。細胞プールは、上述のように希釈され得るが、好ましくは、細胞は希釈せずに付着に供される。ほとんどのウェル中に１つの細胞が確実に存在するように、良好な充填率、即ち、細胞が極めて過剰（マイクロウェル数を超える細胞数）であることが特に好ましい。

アレイでの細胞の培養
典型的に、細胞の懸濁液がアレイの表面上に供され、細胞は重力によってウェル内に入る。細胞プール中の細胞は、培養培地中又は生理的緩衝液中（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に懸濁され得る。好ましくは、例えば、培養培地又は生理的緩衝液を含むアレイ中に細胞を付着させる前及び／又は後に、洗浄ステップを行う。

目的の抗体分泌細胞を含むウェルを特定する（即ち、「スポット」の同定）前に、抗体の分泌が可能な期間、細胞をアレイ内に維持する。マイクロアレイでの細胞の培養は、細胞が増殖することを意図するものではなく、むしろ、細胞が抗体を分泌することを可能にすることを意図することに、留意すべきである。

好ましくは、細胞の生存率と、検出可能な量の抗体分泌との両方を確実にするために、細胞を適切な培地中で培養する。結合物質に結合する、生成された抗体の検出可能な量を得るために、培養期間を適宜決定することができる。培養は、数分〜数時間、又は最大２４時間続き得る。有利には、マイクロウェルアレイは、３０分〜５時間、より好ましくは１〜３時間維持され、特に好ましいのは、２時間又は３時間のインキュベーション時間である。

培養培地を用いてアレイを覆うことにより、培養を行うことができる。結合物質のコーティング層を含むマイクロアレイを使用する場合（以下に説明するように）、細胞によって分泌された抗体がコーティング層中へ拡散可能であるように、細胞を培養する。分泌される抗体は、このように、ウェルから、ウェルの周囲のコーティング層へ拡散する。拡散してコーティング層に到達するこれらの抗体は、このように、コーティング層に含まれる結合物質に結合する。

特定の実施形態において、結合物質のコーティング層を備えるマイクロウェルアレイを使用する場合、以下のステップを細胞付着の前に行う。
・ ０日目：抗原溶液を用いてチップを一晩インキュベーションし、チップ表面をコーティングさせる（残存する空気が抗原溶液の物理的障害となっているため、ウェルはコーティングされない）。
・ １日目：各ウェルの内部に存在する空気を除去するために、チップを洗浄し、飽和（saturation）溶液（例えば、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液）を分注し、かつ減圧する。注目すべきことに、空気が除去されるとすぐに飽和溶液でウェルの表面が有効になり、細胞はウェルへ入ることができる。飽和させる。
・ １日目：チップを洗浄し、抗体分泌細胞プールをチップ上に分注する。

好ましくは、上記は、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６）の記載のように行う。

培養期間を過度に長くすると、生成された抗体が広く拡散して、時には、生成された物質を生成する細胞を含むウェルを特定することが困難になる。培養期間は、望ましくは、生成された抗体を生成する細胞を含むウェルの容易な特定を可能にする範囲内の、適切な値に決定される。

所望の生物学的活性及び／又は結合プロファイルを有する抗体を生成する特定の細胞のアレイからの単離
以下のステップは、特定の生物学的活性及び／又は結合プロファイルを有する抗体を生成する細胞を含む、アレイのウェルを同定することである。

アレイ上のコーティング層の使用
一実施形態において、アレイは、少なくともウェルの周囲の主表面の少なくとも一部の上に、分泌された抗体の少なくとも一部に結合する能力を有する、結合物質のコーティング層を含み、そこでは、分泌された抗体が拡散し、前記結合物質に結合できるようになっている。好ましくは、ステップ（ｄ）は、分泌された抗体が拡散し、ウェルの周囲のコーティング層中に含まれる結合物質に結合するように、培養培地で前記マイクロウェルアレイを被覆するステップを含む。

欧州特許第２１８４３４５号に示されているように、結合物質を含むコーティング層を形成するために、基板の主表面をシランカップリング剤で処理して主表面上の結合物質の結合を確実にしてもよい。

次に、コーティング層を形成するために、シランカップリング剤を用いて処理された表面に結合物質を含む溶液を適用する。コーティング層中の結合物質の量は、結合物質の種類、及び標識物質の種類に基づいて決定される。

主表面に対する結合物質の結合を確実にするための表面処理は、シランカップリング剤による処理に限定されるものではなく、タンパク質などで構成される結合物質の、基板の表面への結合を促進する、無機材料（シリコン材料など）又は有機材料（ポリマー材料など）で構成される任意の物質を、使用のために適切に選択することができる。

結合物質で被覆された表面上には、結合物質が密集して存在できない場合がある空間が存在し得、塗布量に応じて、覆われていない表面の部分が残っている。そのような場合、特に、表面を上述のようにシランカップリング剤を用いて処理する場合、細胞によって生成された抗体が基板の表面へ非特異的に結合する場合がある。そのような非特異的結合は、検出感度の精度の低下を引き起こす。

従って、本発明において、結合物質を用いたコーティング層で覆われていない主表面を被覆するために、マイクロウェルアレイ上にブロッキング剤を塗布することが好ましい。ブロッキング剤の例は、細胞膜を構成するホスファチジルコリンの極性ベースと同じ構造を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）の形態の構造単位を有する、水溶性ポリマーであるＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）である。

固体支持体上のアレイのインプリントの作製
別の実施形態において、前記ステップ（ｄ）は、固体支持体上でマイクロウェルアレイのインプリントを作製し、固体支持体上の抗原結合抗体の存在を検出するステップを含む。

この方法は、特に、国際公開第２００７／０３５６３３号、及びＬｏｖｅら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；２４（６）：７０３−７．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｍａｙ １４）に記載されている。

要約すると、この方法は、フォトリソグラフィ及びレプリカ成型を用いて、マイクロウェルのアレイを作製することによって行われ得る。ウェルの直径及び深さは、典型的に５０μｍ／１００μｍである。アレイは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、生体適合性材料で作製することができる。

プールからの細胞はアレイ上に付着させられ、過剰量の培地は除去される。各ウェル中の細胞の数は、細胞の濃度、適用する量、時間、ウェルのサイズ及びマイクロアレイのサイズに依存する。上述のように、これらのパラメータは、細胞プール及び活性化手順によって、０〜３つの細胞が１０〜９０％のウェル中に存在するように調整することができる。次に、培養培地中に存在する分泌された抗体に結合する結合物質を用いて前処理された固体支持体上にアレイを配置する。

ウェル中の抗体生成の測定
代替の実施形態において、特定のコーティングが施されていないマイクロウェルアレイが使用され、好ましくは、このマイクロウェルは、例えば、欧州特許第１５６６６３５号又は欧州特許第１６９１１９６号に記載のものなどの、単一細胞マイクロアレイである。抗原特異的抗体が培養培地中へ分泌されたそれらのウェルは、免疫化学的測定により検出される。特定の場合において、例えば、前記結合物質が標識された標的抗原であるように、マイクロウェルアレイを、目的の抗体に対する結合物質を含む溶液を用いてインキュベートする。

所望の細胞を含むウェルの特定
結合物質がアレイ上のコーティング層に存在するか、又は固体支持体上に存在するか、又はマイクロウェル中に存在するかどうかにかかわらず、結合物質は、分泌された抗体に結合する。

結合物質は、標的抗原に結合する抗体に特異的に結合し得るか、又は任意の抗体に非特異的に結合し得る。それはまた、免疫グロブリンの特定のアイソタイプのみに特異的に結合することができる（標的抗原に結合する抗体に特異的ではない）。

次のステップは、所望の抗体を生成する細胞を含むウェルの所在を明らかにする標識物質を使用することである。この標識物質を使用する検出の原理は、結合物質への結合に関して目的の抗体との競合によるものであり得、又はＥＬＩＳＡと同様の「サンドイッチ」検出により得る。

特に、コーティング層を含むアレイを使用する場合、標識物質を次に、コーティング層へ供給する（好ましくは、培養液を除去した後）。

実際のところ、標識物質を供給する前に、培養培地を除去することが望ましい。実際に、ウェル中に含まれる免疫グロブリン生成細胞について、多量の抗体が培養培地中に分泌される。抗免疫グロブリン抗体を標識物質として加える場合、チップ表面上の抗体に結合する前に、培養培地中の抗体に結合し、アレイ表面に結合した抗体の検出を妨げることがある。

しかしながら、培養液を除去せずに、標識物質がコーティング層へ供給される場合であっても、細胞及び結合物質の組み合わせによる問題を引き起こすことなく、検出を行うことができる場合もある。

次に標識シグナルを検出し、目的の抗体を生成又は分泌するウェルの所在を同定することができるようになる。

結合物質／標識物質
結合物質を、目的の免疫グロブリンに結合させることができる。

特異的結合
この場合、結合物質は、標的抗原であり得る。この場合、標識物質は、生成された免疫グロブリンに対する抗体でなければならない。

非特異的結合
第一の実施形態において、結合物質は、免疫グロブリンの定常鎖に対する抗体などの、抗免疫グロブリン抗体であり得る。この場合、標識物質は、目的の抗原でなければならない。

以下の表は、欧州特許第２１８４３４５号の表１から示唆を受け、以下の例を提供する。
（１）細胞によって生成される物質の少なくとも一部に結合する能力を有する物質（結合物質）、
（２）細胞によって生成され、同定される必要がある物質（同定するための物質）、及び
（３）生成された物質を同定するための、標識物質（必要な標識物質）。

以下に説明するように、標識物質が目的の抗体に特異的に結合する（かつ、この抗体の存在が、放出された蛍光などの、標識の検出により検出される）場合、標識物質は結合物質に特異的に結合する（かつ、生成された物質の存在は、蛍光の欠如など、標識がないことによって検出される）。

（表１）結合物質及び標識物質の結合の例

特定の実施形態において、結合物質は目的の標的抗原であり、標識物質は抗ＩｇＧ抗体である。

別の実施形態において、結合物質は抗ＩｇＧ抗体であり、標識物質は目的の標的抗原である。

結合物質が抗原である場合
結合物質が抗原である場合、目的の抗体を生成する細胞を含有しないウェルの周囲のコーティング層上では、結合が行われない。

インプリントを行う場合、目的の抗体を生成する細胞を含まないウェルのインプリント上では、抗体は結合しない。

一方、分泌された目的の抗体は、この抗体が生成されたウェルの周囲の結合物質に結合する（又は、それが生じるウェルの場所で、固体支持体上の結合物質に結合する）。

コーティング層中（又は、固体支持上）の結合物質に結合する、標的細胞により生成された標的抗体は、この標的細胞を含むウェルの所在を可能にする標的物質を用いて検出される。

標識物質が蛍光部分を含む場合、アレイ上又は固体支持体上の蛍光の有無の検出は、蛍光顕微鏡、蛍光イメージスキャナ、イメージリーダーなどを用いて行う。

コーティング層を有するマイクロウェルアレイの場合には、（その周囲が標識物質に結合する）標識されたウェルは、所望の抗体を分泌する細胞を含む。

インプリント法の場合には、標識シグナルのスポット（「スポット」とも呼ばれる）を、所望の抗体を分泌する細胞を含むウェルと関連づけることができる。

特に好ましい手法は、複数抗原に対して反応するモノクローナル抗体が検出される、いわゆる「マルチプレックス」法である。一実施形態において、結合物質は、抗免疫グロブリン抗体であり、スポットは、標識された様々な抗原を標識物質として用いて特定され、この手法は、以前、Ｊｉｎら（Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００９ Ｓｅｐ；１５（９）：１０８８−９２；（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５） ６６８−７６）によるＩＳＡＡＣ法を用いて説明された。別の実施形態において、いくつかの非標識抗原が結合物質として使用され、スポットは、標識された抗免疫ブログリン抗体を用いて特定されている。

本発明の方法は、従って、標的抗原に対する所望の生物学的活性及び／又は結合プロファイルを有する抗体を生成する、細胞の同定を可能にした。

細胞の回収
また、本方法は、ステップ（ｄ）の同定されたウェル中に存在する細胞を更に独立して採取するステップなどの、他のステップを含んでもよい。好ましくは、蛍光ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）プローブなどの標識方法が細胞の所在に関して使用され、このようにして、同定されたウェル中に含まれる細胞の回収を容易にする。プローブからのシグナルは、典型的に、蛍光顕微鏡を用いて監視される。

従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｄ）の同定されたウェルから単一細胞を独立して回収するステップを更に含む。好ましくは、細胞回収を、例えば、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５） ６６８−７６）により以前記載されるように、当業者に周知の顕微操作により行う。

所望の場合、前記細胞は、更に、細胞培養物を得るために培養することができる。この細胞培養物は、同定されたウェル中に存在する単一細胞のクローン性増殖を介して得られる。単一細胞マイクロアレイが細胞スクリーニングのために使用されておらず、同定されたウェルが複数の細胞を含んでいた場合、細胞培養物は、複数のクローンを含み得ることに留意されたい。この場合、この細胞培養物に関して、マイクロアレイ中の細胞スクリーニングステップを繰り返すことができる。これらのステップの繰り返しは任意であり、この場合、ウェルが最初に単一細胞のみを含んでいたかのように、細胞培養物を処理することができる。

ＶＨ配列及びＶＬ配列回収及びクローニング
本方法は、更に、前記細胞培養物から、標的に対する抗体をコードする遺伝子を単離する（クローニングする）ステップを含んでもよい。

選別された単一細胞由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子の単離は、単一Ｂ細胞由来のＩｇ遺伝子の分析と、組換えｍＡｂの生成を可能にする。好ましくは、本方法は更に、ステップ（ｄ）の同定されたウェル中に存在する細胞から、標的に対する抗体をコードする遺伝子を独立して単離するステップを含み得る。これは、従って、細胞培養物を得るステップ無しで行われるであろう。

従って、更なる態様において、本発明は、
（ａ）本発明の第一の態様において記載された方法を用いて、抗体分泌細胞を含む細胞の集団から、１つ以上の標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するステップと、
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲにより、前記細胞から抗体ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を得るステップと
を含む、モノクローナル抗体のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を回収するための方法に関する。

本発明の方法の利点の１つは、目的の細胞クローンを含む（即ち、目的の結合活性／生物学的活性を有する）抗体分泌細胞の予め選択された細胞プールから、目的の抗体を高い収率で回収することを可能にすることである。

上述したように、本発明の方法は、複数のウェルを含むアレイにおいて、同定された細胞プール由来の細胞を付着させるステップを含む。好ましい実施形態において、同定された各細胞プールの細胞は、アレイ中の全ての細胞が同じ細胞プールに対応するように、少なくとも１つのアレイ中に付着させる。言い換えると、指定されたアレイ中に存在する全ての細胞は、同じ細胞プールに由来する。

必要に応じて、目的の抗体分泌細胞を含むものとして同定されたプールからの細胞（即ち、所望の結合特性／生物学的活性を有する）を、１つ以上のアレイ中に付着させる。このマイクロアレイは、従って、目的の標的抗原に対する、モノクローナル抗体を分泌する細胞を含むウェルを同定するために、スクリーニングされる。

本発明の本実施形態において、各マイクロアレイは、その抗原特異性及び機能的活性について選択された抗体分泌細胞（即ち、Ｂ細胞）のプール（１つのヒット）由来の細胞を含む。

従って、マイクロアレイにおいて、抗原に対して特異的であると認識される細胞（陽性スポット）は、固有なＢ細胞クローンを起源とする可能性が高い。実際に、本発明の目的は、非常に稀なＢ細胞クローンを同定することであることに留意されたい。細胞を刺激する（従って、増殖する）ことにより、試料中に存在する細胞の数を増加させる。増殖した細胞は全て、クローン増殖による、元の非常に稀なＢ細胞クローンに由来する。

マイクロアレイ中の陽性細胞は、同じ起源のＢ細胞に由来する可能性が高いという事実のため、ＶＨ及びＶＬ遺伝子対の両方が、単一ウェル由来の細胞から取得できない場合、同じＢ細胞クローンに由来する、異なるウェル由来の細胞から、ＶＨ及びＶＬ鎖をクローニングすることが可能となる。いくつかの場合において、１つのヒットは、所望の結合特性及び／又は生物学的活性を有する、１つ以上の抗体（ＶＨ／ＶＬ対）を含むことが可能であることに注意が必要である。

従って、一実施形態において、抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列は両方とも、ステップ（ｄ）において同定された単一ウェル中に含まれる細胞から得られる。別の実施形態において、抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列は、ステップ（ｄ）において同定された複数のウェル中に含まれる細胞から得られる。この別の実施形態において、ＶＨ領域のＤＮＡは、本発明の方法のステップ（ｄ）において同定されたウェルから単離された細胞から得られ、ＶＬ領域のＤＮＡは、同じアレイ上で同定された別のウェルから単離された細胞から単離される。

単一のアレイにおいて、目的の単一Ｂ細胞クローン由来の多くの単一細胞をスクリーニングするという事実は、選択されたＢ細胞プールから目的の抗体を回収する機会を増大させるため、本発明の方法の重要な強みである。

対照的に、従来技術の方法において（Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６）において記載されたＩＳＡＡＣ法）、アレイ中の単一細胞は、固有のクローンであると考えられ、従って、同定されたヒットからＶＨ及びＶＬ遺伝子対の両方を取得するための機会はただ一度きりである（実施例、及びＩＳＡＡＣ対本発明の方法の比較表を参照のこと）。

目的の抗体をコードする遺伝子の単離を、当該技術分野で公知の方法を用いて行う。
Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎら、（１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．１８ Ｎ^ｏ５ ｐｐ８６２−８６９）、
Ｌａｒｒｉｃｋら、（１９８９，ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．７ ｐｐ９３４−９３８）、
Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ｖｏｌ．８６ ｐｐ３８３３−３８３７）。

更に、選別された単一細胞からのＶＨ及びＶＬ遺伝子の単離は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２３；９３（１５）：７８４３−８．）又はＴｉｌｌｅｒら（２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，３２９（１−２）：１ １２−２４）により、以前に記載されている。好ましい実施形態によれば、単一Ｂ細胞から抗体の重鎖及び軽鎖可変遺伝子配列を増幅させて単離するために使用される方法は、Ｏｚａｗａらの方法のうちの１つである（２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｖｏｌ． ４０ ｐｐ４６９−４７０，４７２，４７４）。

実際、免疫グロブリンをコードする遺伝子の全て又は一部の配列は、当該技術分野において常套の方法により、クローニングすることができる。

示されるように、回収された単一細胞の増殖後に得られたか、又は、同定されたウェル中に存在する細胞から直接得られた（同じＢ細胞クローンから由来する単一細胞由来又はいくつかの細胞由来の）細胞培養物から、抗体遺伝子はクローニングされ得る。

遺伝子が単離されると、適切な細胞において抗体を生成することが可能である。

同定されたウェルが、ｎ個の細胞を含む場合、ｎ^２個の可能な抗体を得られることに留意すべきである。その結果、同定されたウェルが複数の細胞を含み、（かつステップ（c）及びステップ（ｄ）が繰り返されない場合、）ｎ^２個の抗体全てを生成して、それらの生物学的活性の評価に関してそれらのそれぞれを試験する必要がある。しかしながら、単一細胞マイクロアレイが使用されている場合にはそうはならない。

１つ以上の標的抗原に対し、モノクローナル抗体を生成する細胞を得るための方法
また、本発明は、
（ａ）上述のように、本方法のステップ（ｄ）の同定されたウェル中に存在する細胞から、又は、前記細胞のうちの１つから得られた細胞培養物からｍＲＮＡを単離するステップと、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの逆転写を行い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて対応するｃＤＮＡを増幅するステップと、
（ｃ）定常領域ＣＨ及びＣＬをコードする対応する配列を含む、適切な発現ベクター中に、ＶＨ領域及びＶＬ領域に対応する前記ＤＮＡ配列をクローニングし、そのようにして、完全長の重鎖及び軽鎖の状態で、前記ＶＨ領域及びＶＬ領域の発現を可能にするステップと
を含む、モノクローナル抗体を生成する細胞を得るための方法を含む。

特定の実施形態において、ＶＨ領域のＤＮＡは、本発明のステップ（ｄ）において同定されたウェルから単離された細胞から単離され、ＶＬ領域のＤＮＡは、本発明の方法のステップ（ｄ）における同じアレイ上で同定された別のウェルから単離された細胞から単離されている。

また、本発明は、ほとんどの場合、自然に対になった免疫グロブリンが生成されるように、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の状態において、前記ＶＨ領域及びＶＬ領域を発現するような条件下で、前の実施形態（又は、前の実施形態による細胞に由来する）による細胞を培養するステップを含む、モノクローナル抗体を生成するための方法を含む。得られた組換え抗体は、回収された抗体分泌細胞が由来する選択されたヒット中に存在する、結合活性特性／機能的活性特性によって特徴付けられる場合、「自然に対になった免疫グロブリン」であると考えられる。

また、上記の２つの方法は、標的抗体を分泌する細胞を同定するための方法を実施するステップも含む。

本明細書において想定されるように、前の実施形態による細胞に由来する細胞は、（ｉ）前の実施形態の細胞の継代培養により得られた細胞、（ｉｉ）前の実施形態の細胞で最初にクローニングされたＶＨ及びＶＬに対応するＤＮＡのサブクローニング（及び必要に応じて継代培養）によって得られた細胞である。

好ましい実施形態において、前記細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、ＰｅｒＣ６、ニワトリの胚由来の幹細胞又は、アヒル胚芽由来の幹細胞、及び、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株などの鳥類細胞株から選択された細胞株からの細胞である。

組換えタンパク質を発現させるための、遺伝的に改変された細胞の生成は、当業者に周知である。当業者に周知であり、当業者によって実施される方法は、目的のタンパク質及びポリペプチドだけではなく、適切な転写及び翻訳制御要素をコードする配列を含む発現ベクターを構築するために、使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボでの遺伝子組換えを含む。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。以下の調製及び実施例は、当業者により明確に理解され、本発明を実施させるために与えられる。本発明は、しかしながら、例示した実施形態によって範囲が限定されるものではなく、単に本発明の一態様の例示として意図され、機能的に等価である方法は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な改変が前述の説明及び添付図面から、当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。

特に、実施例は、従来技術の方法に対して、本方法の利点を説明することを意図している。この方法は、細菌性及びウイルス性病原体に対する抗体を同定するために使用した。標的の名称は、機密保持上の理由から開示されていない。更に、本発明の目的は、様々な標的について使用することができる実施例に記載の方法であるので、標的の名称は、この方法の説明には関連がない。

実施例１：材料及び方法
細菌毒素１及び毒素２ ＥＬＩＳＡ
グラム陽性細菌の毒素１又は毒素２に特異的に結合するヒトＩｇＧを、ＥＬＩＳＡにより検出した。前記グラム陽性細菌は、病原性細菌であり、その名称は機密保持上の理由から開示しない。この目的のために、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ＧＲＥＩＮＥＲ）を、炭酸緩衝液ｐＨ９．６中、０．５μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）の精製した毒素１又は毒素２を用いて、＋４℃で一晩コーティングした。次に、プレートを、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いて２回洗浄し、２００μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＢＳＡ（ＭＰ−Ｂｉｏ）を用いて、室温で２時間飽和させた。次に、プレートを、試験対象の試料を加える前に、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて２回洗浄した。

活性化されたＢ細胞プールから回収した上澄み液中のＩｇＧの検出のために、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡで１／２に希釈した１００μＬの上澄み液を、毒素１又は毒素２でコーティングしたプレート上で、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ抱合型ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）を加えた。室温で１時間おいた後、プレートを、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ基質（ＴＭＢ、ＫＰＬ）を加えた。３０分のインキュベーション後、酵素反応を、１００μＬ／ウェル、１Ｎのオルトリン酸（Ｍｅｒｋ）を加えることにより停止させた。ウェル中の毒素１又は毒素２に結合するＩｇＧの存在は、次に、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を読み取ることによって測定した。

組換えモノクローナル抗体（以下、「ｍＡｂｓ」）の力価測定のために、未精製上澄み液、又は試験されるｍＡｂｓのＨ鎖及びＬ鎖をコードするプラスミドを用いて形質移入されたＣＨＯ細胞から精製されたヒトＩｇＧ１の、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＢＳＡ中の１００μＬの連続希釈物を、毒素１又は毒素２でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。実質的に上述のようにＥＬＩＳＡを実施した。試料を二つ組みで試験し、結果を平均ＯＤとして表した。

細菌毒素１及び毒素２ 細胞毒性アッセイ
細菌毒素１又は毒素２の、インビトロでの機能的活性を中和するための抗体の能力を、ヒトＩＭＲ−９０細胞を用いた、細胞ベースの細胞毒性アッセイを用いて測定した。抗体検査の前の日、平底９６ハーフウェル培養プレート（ＧＲＥＩＮＥＲ）中１０，０００細胞／ウェルで、ＩＭＲ−９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６）を１ウェルあたり５０μＬ未満播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でインキュベートした。中和抗体の存在について試験される試料（活性化Ｂ細胞プールの未精製上澄み液、抗体重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖をコードするプラスミドを用いて形質移入されたＣＨＯからの未精製又は精製抗体）を、事前に細胞毒性アッセイにおける最適下限であると決定した濃度の毒素１又は毒素２と共に、３７℃で１時間プレインキュベートした。機能的ヒットのスクリーニングのために、Ｂ細胞プールの上澄み液を、１／２の最終希釈で試験した。抗体の中和効力を測定するために、ＣＨＯ細胞からの組み換え未精製又は精製ｍＡｂｓの連続希釈物を試験した。１時間のプレインキュベーション後、抗毒素混合物を、ＩＭＲ−９０細胞を含有するプレートのウェル中に移し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、毒素の細胞毒性活性を、顕微鏡下でＩＭＲ−９０細胞を検査し（丸い細胞は死亡しており、接着性細胞は生きている）、死滅した細胞の割合（％）を数えることにより評価した。試料を二つ組みで試験し、結果を細胞死の平均％として表した。

ＥＬＩＳＡによる、多抗原結合特性を有する抗体の検出
ウイルスタンパク質Ｘ変異体Ａ、ウイルスタンパク質Ｘ変異体Ｂ及び、ウイルスタンパク質Ｘ変異体の両方の、２つの部分的に重複する領域にまたがる４つのペプチド（即ち、ペプチド１、変異体Ａ；ペプチド２、変異体Ａ；ペプチド１、変異体Ｂ；ペプチド２、変異体Ｂ）に結合するヒトＩｇＧを、ＥＬＩＳＡにより検出した。ウイルスＸは、病原性ウイルスを意味し、その名称は機密保持上の理由から開示しない。

この目的のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒnｉｎｇ）を、０．５μｇ／ｍＬ精製ウイルスタンパク質Ｘ変異体Ａ若しくはウイルスタンパク質Ｘ変異体Ｂを用いて、又は、５μｇ／ｍＬのペプチド１、変異体Ａ；ペプチド２、変異体Ａ；ペプチド１、変異体Ｂ若しくはペプチド２、変異体Ｂを用いて、１００μＬ／ウェルで、炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中、一晩、＋４℃の条件下でコーティングした。次に、プレートを、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）で４回洗浄し、２００μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、３％のＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）を用いて、室温で２時間飽和させた。次に、プレートを、試験される試料を加える前に、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて４回洗浄した。

活性化されたＢ細胞プールから回収した上澄み液中のＩｇＧの検出のために、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＢＳＡ中で１／２に希釈された１００μＬの上澄み液を、タンパク質又はペプチドでコーティングしたプレート上で、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを、２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた。室温で１時間おいた後、プレートを２５０μＬ／ウェルの、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＫＰＬ）を加えた。１時間のインキュベーション後、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ基質（ＴＭＢ、ＫＰＬ）を加えた。１０分のインキュベーション後、酵素反応を、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ）を加えることにより停止させた。ウェル中のタンパク質及び／又はペプチドに結合するＩｇＧの存在を、次に、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより測定した。

組換えｍＡｂの力価測定のため、試験するｍＡｂのＨ鎖及びＬ鎖をコードするプラスミドを用いて形質移入されたＣＨＯ由来の精製されたヒトＩｇＧ１のＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＢＳＡ中の連続希釈物１００μＬを、タンパク質又はペプチドでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。実質的に上述のようにＥＬＩＳＡを行った。試料を二つ組みで試験し、結果を平均光学密度（ＯＤ）として表した。

実施例２：本発明のＢ細胞のスクリーニング法を用いた、細胞毒素２を中和するヒトモノクローナル抗体の同定及び生成
血液ドナー、特に、グラム陽性細菌の毒素２への結合と、毒素２の細胞毒性活性の中和に関する血清ＩｇＧの存在について陽性であると事前にスクリーニングされたドナーから、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（リンパ球分離媒体、Ｅｕｒｏｂｉｏ）を用いる遠心分離により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。約７％のＢ細胞を含有する、６５００万個のＰＢＭＣ、つまり、約４６０万個のＢ細胞を、第一のスクリーニングキャンペーン（図２中のキャンペーン＃１）において使用した。この集団中のＢ細胞を、マウス抗ヒトＩｇＭ＋抗ヒトＩｇＤ抗体混合物（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、その後に、抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされた磁気ビーズを用いて、ＩｇＭ／ＩｇＤ−発現Ｂ細胞を枯渇させることによって更に濃縮した。ＩｇＭ／ＩｇＤ＋Ｂ細胞が枯渇した、得られたＰＢＭＣ集団は、約４０万個のＩｇＧ＋Ｂ細胞を含んでいた。

ＩｇＧ＋の濃縮したＢ細胞には、ＣＤ４０Ｌ刺激の前に、４５分間、Ｂ９５−８細胞株（ＥＣＡＣＣ ８５０１１４１９）から調製されたエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）（Ｖｉｖａｌｉｓ）を感染させた。細胞を、２００個のＩｇＧ＋Ｂ細胞／ウェルの細胞密度で播種し、９６ウェル平底培養プレート中で１４日間培養した。その期間、Ｂ細胞は、１００，０００〜５００，０００個の細胞／ウェルに至るように増殖し、培養上澄み液中、５〜２０μｇ／ｍＬの発現レベルで、ＩｇＧ抗体を分泌した。

１４日目に、上澄み液を各培養ウェルから採取し、細菌毒素２に結合するＩｇＧを検出するために、ＥＬＩＳＡにより試験した。合計では、２５８個の上澄み液が、ＥＬＩＳＡにより陽性であることが見出され、更に、機能的アッセイで、毒素２の細胞毒性を中和するためのそれらの能力について試験した（図２）。１８個の上澄み液は機能的アッセイにおいて陽性と判明し、８個は強力な中和活性を示した。これらの結果は、所望の特異性及び機能性を有する抗体を生成するＢ細胞プールは、それらのインビトロ活性化及びＥＢＶ／ＣＤ４０Ｌの組み合わせを用いた増殖後に識別することができることを示す。

８個の強陽性培養ウェルからの細胞試料を、次に、各単一の陽性培養ウェルが、１つの単一マイクロアレイに対応するように、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−７６）に記載のＩＳＡＡＣ技術を用いて、細胞毒素２に対する単一細胞スクリーニングのために、マイクロアレイ上にのせた。これらのマイクロアレイは、それらがウェルごとに１つの単一細胞の最大値を含むような大きさ及び形状のウェルを有することを特徴とし、この特定の場合、マイクロウェルの周囲の表面は、細菌毒素２でコーティングされていた。３時間のインキュベーション後、特異的に毒素２に結合するＩｇＧの存在が、Ｃｙ３−結合抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いた染色及び、蛍光顕微鏡検査（適切な蛍光フィルターを装備したＮＩＫＯＮエクリプス９０ｉ）によって特定された。毒素２に対するＩｇＧを分泌する単一Ｂ細胞を、従って、マイクロアレイのウェルの周囲の蛍光スポットの存在によって同定した。

１４日間行ったインビトロでのＢ細胞刺激に関連した細胞の増殖が理由で、９６ウェル平底培養プレートの各陽性培養ウェルは、１４日間の長い培養の最後には、目的の抗体を発現している細胞を約０．５％〜２％を含んでいることに留意すべきである。マイクロアレイは、６２，５００個のウェルを有する。ウェルのうち少なくとも５０％が１つの細胞を含むと仮定すると（即ち、平均的な充填率）、約３０，０００個の細胞を、目的の抗体を分泌する能力について評価することができる。従って、目的の抗体を発現する約１５０〜６００個の細胞が、マイクロアレイ上に存在することが期待される。この数は、更に前記抗体の配列を同定することが可能であるよう保証される（単一細胞の回収中及び／又は抗体の配列のクローニング中の、任意の損失を考慮に入れる）必要がある。

抗原−抗体相互作用を明らかにするスポットが、８つのマイクロアレイ上、つまり、先に選択された８つのＢ細胞プールのそれぞれについて、検出された。抗 毒素２ ＩｇＧを生成する６〜１３個の単一細胞は、８つのマイクロアレイのそれぞれから、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−６７６）により記載されるように、マイクロマニュピレーションによって取得される（図３）。選択された単一細胞によって生成された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−６７６）にも記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによって得た。ＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡ配列を、全長ＩｇＧ１ Ｈ鎖及びＬ鎖の生成のための発現ベクターにおいて個々にクローニングし、ＣＨＯ細胞中へ同時導入した。Ｈ及びＬ発現プラスミドを用いて一過的に同時導入された前記ＣＨＯ細胞の上澄み液を収集し、毒素２に対する結合に関して、及び毒素２による細胞毒性の中和に関して、それらの能力について試験した。図３に示すように、８個の上澄みのうちの６個が、毒素２に結合する組換えヒトＩｇＧを含有することがＥＬＩＳＡで確認された。同じ上澄み液はまた、機能的アッセイにより毒素２の毒性の中和が可能であることがわかった。

更に６個の中和抗体を、ＣＨＯ細胞中の形質移入により生成し、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。６個の精製された組換えモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる力価測定は、それらのうちの４個が強く毒素２に結合し、２個はより弱く結合していることを示した（図４）。同様に、実施例１に記載したように、６個の精製した抗体の細胞毒性活性は、細胞毒性アッセイにより測定した。力価測定結果は、６個のｍＡｂ全てが、毒素２の細胞毒性を強く中和し、それらのうちの３個は、現在後期臨床開発にある毒素２を強く中和する基準抗体よりも優れていることを示した（図５）。従って、この実施例において、本発明の方法は、目的の生物学的活性を有するＢ細胞プールの選択と、単離された機能的抗体の数との間で、７５％の効率、即ち、８個の選択されたＢ細胞プール（ヒット）のうちの６個を有効とする。

同じドナーからの４１０万個のＢ細胞を用いて行われる第二のキャンペーンにおいて（キャンペーン＃２、図２）、毒素２に対して強い中和活性を示す１２個のＢ細胞プールから開始して、１０個の中和組み換え抗体を生成した（図６）。１０個の中和抗体のうち、８個は強く毒素２の細胞毒性を中和した（図２、最後の行）。注目すべきことに、異なるＶＨ配列及びＶＬ配列を有する２つの中和抗体を、同じＢ細胞プール（ヒット１５）からクローニングした（図６）。

全体として（キャンペーン＃１及び＃２）、本発明の方法は、目的の生物学的活性を有するＢ細胞プールの選択と、単離された機能的抗体の数との間で、８０％の効率、即ち、２０個の選択されたプール（ヒット）のうちの１６個を有効とする。

実施例３：ＩＳＡＡＣ技術を用いた、細菌毒素２を中和する、ヒトモノクローナル抗体の同定及び生成
毒素２に対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成するために、単一細胞スクリーニングのためのＩＳＡＡＣ技術を、実質的にＪｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５） ６６８−６７６）に記載のように使用した。従って、実施例２のように同じドナーから精製した２１４０万個のＰＢＭＣ（Ｂ細胞を７％、つまり１４９万個のＢ細胞を含む）を、Ｒ−８４８（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の混合物を用いて、２つのキャンペーンにおいてバルクで活性化した。５日間の培養後、活性化させたＢ細胞を収集し、Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−６７６）に記載のように、毒素２を用いてコーティングされた３４個のマイクロアレイ上にのせた（図７）。３時間のインキュベーション後、毒素２に特異的に結合するＩｇＧの存在を、Ｃｙ３−共役抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて染色することにより、及び、蛍光顕微鏡検査により特定した。毒素２に対して特異的であるＩｇＧを分泌する単一Ｂ細胞を、従って、マイクロアレイのウェルの周囲の蛍光スポットの存在によって同定した。

図７に示すように、分析した３４個のマイクロアレイで、１１８３個の抗毒素２スポットが、検出された。Ｂ細胞は、９６ウェルプレート中で事前に採取されておらず、インビトロで増殖されていないため、ＩＳＡＡＣ法を用いた各単一細胞は１つのヒットに対応する。検出された１１８３個のヒットのうち、７２８個の単一細胞を回収し、ＶＨ配列及びＶＬ配列の単離及びクローニングのために処理した。１１５個のＶＨ／ＶＬ対の配列を回収し（図７）、個別に、全長ＩｇＧ１ Ｈ鎖及びＬ鎖の生成のための発現ベクターにクローニングし、Ｈ及びＬ発現プラスミドの対を用いて、ＣＨＯ細胞に一過性に同時導入した。ＣＨＯ上澄み液を更に回収し、毒素２への結合に関して、及び毒素２の細胞毒性の中和に関して、それらの能力について試験した図７に示すように、１１５個の上澄み液のうちの３５個は、毒素２に結合する組換えヒトＩｇＧを含むことがＥＬＩＳＡで見出された。また、同じ１１５個の上澄み液のうち１５個は、毒素２の毒性を中和することもできた。

毒素２に結合する３５個の抗体は、マイクロアレイ上での結合のみによって選択された７２８個の単一Ｂ細胞（ヒット）から生成することができる（４．８％効率）ことをこれらの結果は示す。しかしながら、３５個の抗毒素２ ｍＡｂのうちの１５個は中和活性を示し、２つのｍＡｂ（ＩＳＡＡＣ−２及びＩＳＡＡＣ−１４）のみが、現在後期臨床開発にある、毒素２を強く中和する基準抗体と比較して、強力な中和活性を示した（図８）。対照的に、同じ条件で試験した場合、本発明の方法により得られた２つの機能的ｍＡｂ（ｍＡｂ１２及びｍＡｂ１４）を除く全の抗体は、基準のｍＡｂに匹敵するか又はこれより優れた中和活性を示した（図８）。

従って、この特定の実施例において、ＩＳＡＡＣの方法論は、毒素２を中和する活性を有する抗体の、単一細胞スクリーニングを介して、選択過程で２．１％の効率を可能にする、すなわち、７２８個の単一細胞（ヒット）のうちの合計１５個が、結合アッセイにおいて特異的に毒素２に対する抗体を生成するものとして同定される。

従って、同じドナーからのＰＢＭＣを用いたＩＳＡＡＣキャンペーンに対する本発明のスクリーニング法を用いて得られたデータを要約する図９に示すように、強力な機能活性を有するモノクローナル抗体を同定しクローニングする確率は、第一の増殖ステップ（それによって、採取したＢ細胞は増殖し、抗体を生成する）と、所望の特異性及び機能性を有する抗体を生成するＢ細胞プールの初期選択とを含む本発明のスクリーニング方法によって大きく向上する。更に、強力な機能的活性を有する抗体を得る確率は、本発明のスクリーニング方法によって得られる最強の生物学的活性を有する抗体を生成するＢ細胞プールを初期に選択することによって、大いに増強されている。

実施例４：本発明のＢ細胞スクリーニング方法を用いた、細菌毒素１を中和するヒトモノクローナル抗体の同定及び生成
上述の実施例２において記載したように、本発明の方法を用いたＢ細胞スクリーニングキャンペーンを行い、ＥＬＩＳＡにより決定される、活性化されたＢ細胞上澄み液中の、毒素１に結合するヒトＩｇＧの存在に基づいて、実施例２と同じグラム陽性菌の毒素１に対する２個のＢ細胞プール（ヒット）、即ち、ヒット２１番及びヒット２２番の同定が可能であり、かつ毒素１の細胞毒性に対する活性の中和が可能であった。

これらのＢ細胞プールのそれぞれは、ウェルの周囲の表面を毒素１でコーティングした単一細胞マイクロアレイ上に付着させ、毒素１に対する特定のヒトＩｇＧを分泌する単一Ｂ細胞を、実質的に実施例２において記載するように、検出及び回収した。

ヒット２１番：８個の陽性単一細胞を、ヒット２１番のマイクロアレイから回収した。８個の細胞のうち、５個の単一細胞から、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＶＨ及びＶＬ遺伝子対を正常に増幅した（図１０Ａ）。５つのＶＨ／ＶＬ遺伝子対を発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞に形質移入した。形質移入されたＣＨＯ細胞の上澄み液は全て、毒素１に対してＥＬＩＳＡで陽性であった。固有のＶＨ及びＶＬコンセンサス配列、すなわち、γ鎖３Ｇ番及びκ鎖３Ｋ番は、陽性ＥＬＩＳＡシグナルと関連する５個の単一細胞から発見され、これらの単一細胞のうち１個由来の対応するプラスミドを、ＣＨＯ細胞でｍｇスケールで組換え抗体を生成するために使用した。精製された組換え体の候補は、ＥＬＩＳＡにより毒素１に結合することが確認され、細胞毒性中和機能的アッセイにより毒素１を中和することが確認された。

ヒット２２番：このヒットについて、３個の細胞のみ、マイクロアレイから回収することができた。この場合、ＶＨ遺伝子を単一細胞２番から増幅し、一方、ＶＬ遺伝子を細胞１番及び３番から増幅することができた（図１０Ｂ）。従って、ヒット２１番とは対照的に、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の対は、３個の単一細胞のいずれからも回収されなかった。従って、そのヒットからＶＨ及びＶＬ対を回収するために、発現ベクターにクローニングした後、細胞＃１及び細胞＃３由来のＶＬ配列を含む軽鎖の両方と組み合わせて、細胞＃２由来のＶＨ配列を含むγ鎖を試験した。図１０Ｂに示すように、単一細胞２番から単離したγ鎖（γ鎖２Ｇ番）及び、単一細胞３番から単離した軽鎖（軽鎖３Ｌ番）を用いて形質移入したＣＨＯ細胞の上澄み液は、毒素１に対してＥＬＩＳＡで陽性であった。対応するプラスミドを、ＣＨＯ細胞で、組換え抗体をｍｇスケールで生成するために使用した。精製した組換えｍＡｂは、毒素１に結合することがＥＬＩＳＡで確認され、毒素１の毒性を中和することが確認された。

従って、マイクロアレイ中の全ての細胞が、以前に選択されたＢ細胞の１つのプール（１ヒット）に対応するため、本発明のスクリーニング方法は、マイクロアレイ中の複数の細胞由来のＶＨ配列及びＶＬ配列を組み合わせることにより、ＶＨ／ＶＬ対の取得を可能にする。

Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５）６６８−６７６）に記載のＩＳＡＡＣ法では、マイクロアレイ中の各スポットは、固有の抗体を生成する単一細胞に対応しており、従って、ＶＨ配列及びＶＬ配列の両方が１つの細胞から回収された場合にしか、抗体の単離を行うことができない。

しかしながら、本発明の細胞スクリーニング方法では、各マイクロアレイは、その抗原特異性及び機能的活性について選択されたＢ細胞プール（１ヒット）由来の細胞を含む。従って、抗原に特異的であると同定されたマイクロアレイ中の単一細胞（陽性スポット）は、固有のＢ細胞クローンに属する高い確率を有する。従って、ヒット２２番について上に示したように、不完全なＶＨ／ＶＬ増幅（１つの細胞由来のＶＨ又はＶＬ）であったとしても、候補抗体配列を回収することが可能となる。従って、本発明の細胞スクリーニング法は、標的Ｂ細胞クローン由来のＶＨ配列及びＶＬ配列の両方の回収効率を増加させる。

実施例５：本発明のＢ細胞スクリーニング法を用いた、多抗原結合特性を提示するヒトモノクローナル抗体の同定及び生成
明確な多抗原結合プロファイルを示すヒトモノクローナル抗体を生成するために、ウイルスタンパク質Ｘ変異体Ａ及びＢに結合する血清ＩｇＧの存在について、事前に陽性であるとスクリーニングされた２人のドナー（Ｉ及びＩＩ）由来の６０００万個のＰＢＭＣを、実施例２において上で開示したように、マウス抗ヒトＩｇＭ＋抗ヒトＩｇＤ抗体混合物を用いて、その後に、抗マウスＩｇＧ抗体でコーティングした磁性ビーズを用いて、Ｂ細胞を発現するＩｇＭ／ＩｇＤを枯渇させることにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を濃縮した。

次に、ＩｇＧ＋の濃縮Ｂ細胞をＥＢＶ／ＣＤ４０Ｌによって刺激し、２００個の ＩｇＧ＋Ｂ細胞／ウェルの細胞密度で播種し、９６ウェル培養プレートで１４日間培養した。１４日目に、各培養ウェルから上澄み液を採取し、目的の抗原に結合するＩｇＧの検出についてＥＬＩＳＡで試験した。Ｂ細胞プール由来の上澄み液を、タンパク質Ｘ変異体Ａ及びＢ、並びに、両方のタンパク質Ｘ変異体の２つの部分的に重複する領域にまたがる４つのペプチド（即ち、ペプチド１、変異体Ａ；ペプチド２、変異体Ａ；ペプチド１、変異体Ｂ；ペプチド２、変異体Ｂ）に対して、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。３８個のＢ細胞プール（ドナーＩ）及び１７個のＢ細胞プール（ドナーＩＩ）からの上澄み液は、タンパク質Ｘ変異体を認識する抗体の存在について陽性であることが見出された。５５個の候補全てを、ペプチドＥＬＩＳＡによって更に試験した。これらの候補のうち、２個のヒットは標的結合プロファイルを用いて発見され、（ｉ）タンパク質Ｘ変異体Ａ、並びに変異体Ａのペプチド１及び２；及び（ｉｉ）タンパク質Ｘ変異体Ａ及びＢ、並びに両方の変異体についてのペプチド２である。結果を図１１に示す。

Ｊｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１，６（５） ６６８−６７６）に記載のように、これらの２個の陽性培養ウェル由来の細胞の試料を、次に、タンパク質ＸのＡ及びＢ変異体の混合物でコーティングされたマイクロアレイ上にのせ、従って各単一陽性Ｂ細胞プールが、単一細胞スクリーニング用の１つのマイクロアレイにおかれた。３時間のインキュベーション後、タンパク質ＸのＡ及びＢ変異体に特異的に結合するＩｇＧの存在が、Ｃｙ３共役 抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた染色、及び蛍光顕微鏡検査によって明らかになった。タンパク質ＸのＡ及びＢ変異体に特異的なＩｇＧを分泌する単一Ｂ細胞は従って、マイクロアレイのウェルの周囲の蛍光スポットの存在により同定された。

ヒットと、発現ベクターへクローニングされた対応する配列との両方から単離された、単一細胞由来のＶＨ／ＶＬ遺伝子対を、ＲＴ−ＰＣＲにより得た。次に、モノクローナル抗体生成及び特徴付けのためにＣＨＯ細胞に形質移入した。形質移入の６日後、ＣＨＯ上澄み液をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。図１１に示すように、２個の組換え抗体は、目的の初期Ｂ細胞プールにより生成された、対応する抗体のものと区別ができない、結合プロファイルを示した。

ヒット１番の組換え抗体を、ＣＨＯ細胞中で生成してプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、次に、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析した。その抗原特異性を、次に、６個の抗原に対してＥＬＩＳＡで評価した。図１１に示すように、精製したＩｇＧ１は、選択されたヒットのプロファイルと一致して、ペプチド１に対してではなくペプチド２に対して強力な結合を伴って、ウイルスタンパク質Ｘの両方の変異体に結合することが示された（図１１）。

従って、本発明の細胞スクリーニング方法の使用は、非常に特異的な標的プロファイル伴うヒットの早期選択と、対応するＶＨ配列及びＶＬ配列のその後の単離とを可能にする。

Claims (21)

1. 抗体分泌細胞を含む細胞集団において、標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するための方法であって、
   （ａ）前記集団の細胞をインビトロで刺激して増殖させ、複数の細胞プールを得るために細胞を採取するステップと、
   （ｂ）１つ以上の抗原に結合する及び／又はある機能的活性を示す細胞を同定するために、前記細胞プールの上澄み液をスクリーニングするステップと、
   （ｃ）最大３つの細胞がアレイの各ウェル中に存在するような条件で、複数のウェルを含むアレイ中に、前記同定された細胞プールの細胞を付着させるステップと、
   （ｄ）前記抗原に対する抗体を分泌する細胞を含むウェルを同定するために、前記アレイのウェル中の細胞を培養し、それらのスクリーニングを行うステップと
   を含む、方法。
2. 前記細胞集団が、特定のアイソタイプの抗体を発現する前記細胞の能力に基づいて、ステップ（ａ）の前又は後において、抗体分泌細胞を選択することにより得られた亜集団である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞集団が、少なくとも１つの特異的な細胞表面マーカーを発現する前記細胞に基づいて、抗体分泌細胞を選択することにより得られた亜集団である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞集団が、Ｂ細胞の集団である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細胞集団が、ステップ（ａ）の前又は間に、リンパ球向性ウイルスに感染している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ウイルスが、エプスタイン・バーウイルスである、請求項５に記載の方法。
7. 細胞採取の後、前記細胞が培養培地中に抗体を分泌する条件下で、前記細胞プールが該培養地において培養される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップ（ｂ）において、前記細胞プールの上澄み液が、１つ以上の抗原に結合する抗体の存在について、及び、生物学的活性の提示について選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ステップ（ｂ）において、前記細胞プールの上澄み液が、複数の結合アッセイを行うことにより、目的の結合プロファイルを有する抗体の存在について選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. ステップ（ｃ）における前記アレイのウェルのサイズ及び形状が、ウェル当たり１つの細胞のみを入れることを可能にする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ステップ（ｃ）における前記アレイが、前記ウェルの周囲の少なくとも表面上に結合物質のコーティング層を含み、該結合物質が、分泌された抗体の少なくとも一部に結合する能力を有し、且つ該分泌された抗体が、拡散すること及び該結合物質に結合することが可能である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ステップ（ｄ）が、固体支持体上にアレイのインプリントを作製するステップと、該固体支持体上で抗原結合抗体の存在を検出するステップとを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 抗体分泌細胞を含む細胞の前記集団がヒト由来である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記結合物質が１つ以上の標的抗原である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記結合物質が抗免疫グロブリン抗体である、請求項１１に記載の方法。
16. ステップ（ｄ）の前記同定されたウェルから単一細胞を独立して回収するステップを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. （ａ）標的抗原に対する抗体を分泌する細胞を同定するために、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を実行するステップと、
    （ｂ）ＲＴ−ＰＣＲにより、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｄ）において同定されたウェルから単離された細胞から、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のＤＮＡを得るステップと
    を含む、抗原特異的モノクローナル抗体のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のＤＮＡを回収する方法。
18. 前記ＶＨ領域のＤＮＡが、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｄ）において同定されたウェルから単離された細胞から得られ、且つ、前記ＶＬ領域のＤＮＡが、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｄ）において、同じアレイ上の同定された別のウェルから単離された細胞から単離されている、請求項１７に記載の方法。
19. （ａ）請求項１〜１６記載の方法のステップ（ｄ）の前記同定されたウェル中に存在する細胞から、又は、そのような細胞から得られた細胞培養物から、ｍＲＮＡを単離するステップと、
    （ｂ）該ｍＲＮＡの逆転写を行い、対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲを介して増幅するステップと、
    （ｃ）適切な発現ベクター中で、ＶＨ領域及びＶＬ領域に対応するＤＮＡ配列をクローニングするステップと
    を含む、抗原特異的モノクローナル抗体を生成する細胞を得るための方法。
20. 前記ＶＨ領域のＤＮＡが１つの単一細胞から単離され、且つ前記ＶＬ領域のＤＮＡが、マイクロアレイ上に付着した同じ抗体分泌細胞プール由来の別の単一細胞から単離されている、請求項１９に記載の方法。
21. モノクローナル抗体を発現するような条件下で、請求項１９若しくは２０において得られた細胞又は該細胞に由来する細胞を培養するステップを含む、モノクローナル抗体を生成するための方法。

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