KR101508945B1 - 불멸화 항체분비 세포를 수득하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 특이적 동소체의 항체를 분비하는 세포의 불멸화 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 세포의 다클론, 올리고클론 및 단클론 집단은 이들을 분비하는 항체의 작용 활성 및/또는 결합 활성에 근거하여 스크리닝 할 수 있다. 예를 들어, 세포배양 조건하에, 인간 또는 의학적 관심의 대상이 되는 바이러스 기원의 항원에 관한 것이다. 이 방법을 이용함으로써, 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스 심플릭스 바이러스 또는 HSP60 단백질과 결합하는 항체를 분비하는 인간 B 세포는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스를 이용하여 효율적으로 불멸화하였다.
세포배양물, 불멸화, DNA 라이브러리
Description
본 발명은 항체를 분비하는 불멸화 세포, 특히, 의학적 관심 대상인 항원에 대해 높은 특이성을 갖는 항체를 분비하는 인간 기원의 불멸화 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
항체는 감염과 싸우고 병리 요인을 제거하기 위해 면역계가 생성하는 자연 발생 단백질이다. 항체는 단백질 또는 비단백질 항원을 결합시켜 이들을 제거할 방어적 응답을 트리거(촉발)함으로써 그 기능을 수행한다.
근래에는, 거의 모든 치료적 접근 (수동적 면역요법 또는 수동적 혈청요법이라고 함)이 인간 또는 비인간형 분자에 대항하는 항체의 항원-결합 특징에 근거하여 이루어졌다. 수동적 면역요법은 병원성 분자 즉, 병원체(독소, 단백질, 바이러스, 기생충 또는 세포 등)에 대한 규정된 항원 특이성을 가진 치료 항체를 포함하는 약제학적 조성물을, 상기 병원체를 차단 및/또는 제거하는데 필요한 특이성 및/또는 적정량으로, 상기 항체를 생성할 수 없는 면역계를 가진 환자에게 투여하는 것이다(Dunman PM and Nesin M, 2003; Keller MA and Stiehm ER, 2000).
이러한 접근은 1980년대 초반 임상적 진료에 성공적으로 도입된 이래 치료 항체의 사용으로 감염성 질환, 면역조절형 질환 및 암 등을 포함한 광범위한 질환의 치료 기회가 급속히 확대되었으며, 그 결과 치료용 단클론 항체 부문이 꾸준히 성장하게 되었다(Chatenoud L, 2005; Pavlou A and Belsey M, 2005; Laffy E and Sodoyer R, 2005).
수동 면역요법에 적합한 치료 항체는 균질하고 한정된(well-defined) 특이성 및 활성을 갖는다. 이러한 성질은 다클론 항체(예, 항체분비 세포의 다수 클론으로부터 분비되는 항체들의 복합물)보다 단클론 항체(예, 항체분비 세포의 단일 클론에서 분비된 항체)에 있어서 훨씬 정확하고 신뢰성 있게 결정할 수 있다.
1970년대 이후 대형 세포주 집단을 분리, 전파 및 유지하기 위한 다양한 기술이 개발되었으며, 상기 집단은 각각 바람직한 특성을 갖고 있는지 확인하기 위한 적절한 분석법을 통해 시험 대상인 단클론 항체(mAb)를 분비하는 단일 단클론 세포 배양물에서 유래된다.
상술한 방법들은 공통적으로 다음과 같은 두가지의 중요한 기술적 과제를 안고 있다:
a) 어떤 체내 실험을 행하기에 앞서 항체를 확인 및 특징화하는데 필요한 기능적 분석을 위해 충분한 양의 항체를 확보하는 것; 및
b) 치료 항체의 제거 및/또는 면역 염증 반응을 촉발시키는 환자의 면역계에 의해 상기 치료 항체가 스스로 항원으로 인식되지 않도록 보장하는 것이다.
첫번째 과제는 생물학적 재료를 시험하기에 충분한 시간 동안 자연 항체분비 세포를 증식 및 유지하기가 곤란한 점에 관한 것이다. 이 난점은 항체를 코드화하 는 핵산이 초기 발생 및 발현된 1차 항체분비 세포를 불멸화 및 유지하거나 또는, 항체 코드화 핵산을 상기 세포로부터 분리하여 불멸화 세포에 전달함으로써 발현 및 유지될 수 있도록 하는 재조합 DNA 기술을 이용하여 해결해 왔다.
과거에는, 1차 항체분비 세포를 이미 불멸화된 세포에 융해시키거나(더욱 용이하게 유지될 수 있는 교잡 세포 또는 하이브리도마를 형성하거나) 또는, 세포가 거의 무제한적으로 증식하는 방식으로 1차 항체분비 세포의 세포 기구(cellular machinery)를 변경시키는 작용제(바이러스 등)을 이용함으로써 상기 1차 항체분비 세포를 세포배양 조건하에 불멸화시켰다.
환자의 안전을 보장하는 문제는, 항체 생산을 위한 인간 기원의 핵산 및 세포를 사용하거나, 또는 면역능이 있는 비인간 항체를 코드화하는 유전자를 인간 기원의 서열로 변형시키는 이른바, 재조합 DNA 기술을 이용하여 실시하는 "인간화" 법에 따라 해소하였다.
결론적으로, 수동 면역요법은 감염 및 기타 병리 소견에 대해 효과적이고도 신속한 방어 기능을 부여할 수 있다. 그러나, 인간 치료와 완전히 병용할 수 있는 단클론 항체의 분리, 스크리닝 및 생산 방법은 각각 하기에서 검토하는 바와 같이 여러가지 결점을 안고 있다.
하이브리도마 기술은 Kohler and Milstein(Kohler G and Milstein C, 1975)가 처음 소개한 것으로, 항체분비 세포의 지속성장하는 클론을 적절한 불멸화 세포종에 융해한 후 분리할 수 있게 했다. 하이브리도마는 인간 항체분비 세포로부터 유래된 것이나(Olsson L and Kaplan H, 1980), 적절한 인간 골수종 또는 임파양세 포 융해 파트너의 부족으로 인해, 또한 인간/인간 호모하이브리도마 및 인간/뮤린 헤테로하이브리도마의 불안정으로 인해, 하이브리도마의 생산 방법은 아직 확실하게 입증된 바가 없다.
뮤린 항체의 인간화는 인간 항체 분자의 주쇄 상에서 뮤린 단클론 항체의 항원-결합 영역을 그래프트하여 화학분자를 생성하고 또한, 특이적 뮤린 잔사를 다른 인간 아미노산으로 치환하여 분자학적 접근법으로 항원성을 감소시킴으로써 달성할 수 있다(Hwang W and Foote J, 2005: Carter P, 2006).
현재 수많은 "인간화된" 항체가 사용되거나 임상 실험 중에 있다. 그러나 이러한 항체는 여전히 5 내지 10% 뮤린(또는 불완전 인간) 단백질 서열을 함유하고 있으며 약물의 치료 효능 측면에 제약이 있는 면역 반응을 유도한다. 또한, 인간화법은 노동집약적이어서 때로 항체 결합의 변화를 가져오기도 한다.
그러므로, 대부분의 방법은 관련 항원으로 면역시킨 설치류를 기원으로 하는 항원 분비 세포를 이용해왔다. 그 결과로 얻은 mAbs는 약화된 항체의존적 세포 독성을 갖거나 및/또는 체내에서 신속히 제거되는 독성 인간 항-뮤린 반응을 유발할 수도 있다. 더욱이, 가변 영역 동정(variable region-identical) 항체는 상이한 기능성 및 면역성을 나타내기도 한다(Torres M et al., 2005).
완전 인간 단클론 항체 생산에 관한 대부분의 접근법은 클로닝 및, 재조합 DNA 기술을 이용한 인간 면역글로불린 유전자의 발현에 근거를 두고 있다.
첫번째 경우에서, 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편 코드화 DNA 서열의 라이브러리는 인간 조직으로부터 증폭되어 박테리아파지 속으로 삽입될 수 있으며 이에 따라, 항원 결합 단편을 파지의 표면에 "표시" 하고 후속으로 스크리닝할 수 있다. 인간 병원체에 대한 단클론 항체는, 클론화 및 파지 표시 기술을 이용하여 스크리닝한 환자로부터 유래된 대형 항체 레퍼터리로부터 출발하여 생성되었다(Macini N et al., 2004).
그러나, 면역계가 체내일 경우 항체 유전자는, 한편으로 면역 반응을 유발하는 인간 항체 레퍼터리에서 서열을 제거함에 있어서도, 다른 한편으로 친화도 증진 기술로 얻어지는 항체 서열을 선택함에 있어서도 선택되지 않기 때문에, 대부분의 이용 환경에서 상술한 라이브러리는 치료 항체를 동정하는데 무용하다. 따라서, 위와 같은 라이브러리로부터 항체를 개선하기 위해서는, 시험관내 친화도 증진기술 및 기타의 기술을 복합적으로 응용하여 직접 서열을 변화시키는 것이 요구될 때도 있다(Hoet R et al., 2005).
두번째 경우로서, 인간 항체 유전자 발현의 형질전환 생쥐는 완전 인간 항체를 발현하는 뮤린 세포를 생산하기 위하여 관심 대상인 항원으로 면역화시킬 수 있다(Kellermann S and Green L, 2002). 이 방법은 항체를 체내 선별하므로 전통적인 파지 표시 방법보다 유리한 장점이 있으며 또한 고친화성 항체의 빈도수가 증가하기도 한다. 그러나 생쥐 환경에서 작용하는 생쥐 면역계는 효과적인 치료 용도 측면에서 적합한 특이성을 가진 인간 항체를 발생하지 않을 수도 있다.
따라서, 수동 면역요법을 위한 이상적인 치료 항체는 인간 체내에서 성숙한 인간 면역 세포로부터 유래되는 인간 단클론 항체이다. 그러나, 이러한 항체의 선택 및 생산은, 세포배양 조건에서 항체를 분비하는 바이러스 불멸화 인간 세포의 집단을 생성 및 분리하는 종래의 방법이 무효하므로, 복잡하고 시간 소모가 큰 방법이다.
항원 특이성 및 장기 체내 반응을 유도하는 인간 B 세포의 개발 및 증식 방법 및, 면역계로부터 수득된 세포를 이용한 시험관내 방법 등에 대한 연구는 광범위하게 이루어져왔다(Banchereau J and Rousset, F, 1992; Crotty S and Ahmed R, 2004; Carsetti R, 2004; McHeyzer-Williams L and McHeyzer-Williams M, 2005). 그러나, 안정한 인간 항체분비 세포주에 관련한 결합성 또는 중화 활성을 검출할 수 있다고 해도, 상기 세포주의 생산 측면의 기술적인 불안정성은 mAbs 발현 인간 B 세포의 분리에 장애가 되었다.
다수의 항체분비 세포 집단은 특이적 프로파일을 갖춘 인간 공여체(예, 무처리, 백신처리, 최근 감염 및 혈청반응 양성의 개체)로부터, 또한 B 세포가 존재 및 활성을 나타내는 각종 조직(예, 혈액, 편도선, 비장, 림프절)으로부터 분리할 수 있다(Viau M and Zouali, 2005).
인간 단클론 항체의 동정은 불멸화 B 세포 집단의 광범위한 스크리닝을 필요로 하며, 이들 각 세포는 세포배양 조건에서 특징화에 충분한 양으로 특이적 단클론 항체를 분비한다(Cole S et al., 1984; James K and Bell G, 1987; Borrebaeck C, 1989). 그러나 항체 스크리닝 세포의 선택, 활성화 및 불멸화 기술은 아직 기술적 문제를 안고 있으며(항체 수율, 불멸화 효율, 특정 아이소타입(isotype)의 과다출현, 세포 안정성 및 성장), 이로 인해 스크리닝 분석에 이용되는 분비 항체 및 세포의 수가 부족하다.
인간 항체분비 세포로부터 안정한 하이브리도마를 수득하기 어려운 것으로서 인간 항체분비 세포를 생산 및 분리하는데 광범위하게 이용된 종래의 방법 중 하나는, 다클론 B 세포 활성화 및 증식을 유발하는 것으로 알려진 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV)를 이용하여 인간 B 세포를 불멸화하는 방법이다(Sugimoto M et al., 2004; Bishop G and Busch LK, 2002).
항체 스크리닝 세포는 각종 인간 B 세포 공급원, 예를 들어, 라벨화된 항원을 이용하여 사전선택한 건강한 대상자의 말초혈(Casali P et al. 1986), 림프절, 비장 또는 환자에게서 취한 말초혈(Yamaguchi H et al., 1987; Posner M et al., 1991; Raff H et al., 1988; Steenbakkers P et al., 1993; Steenbakkers P et al., 1994), 편도선(Evans L et al., 1988), 또는 늑막액(Wallis R et al., 1989) 등을 이용하여 EBV 불멸화법으로 생산해왔다.
그러나, 저변형성, 저클론성, EBV-감염된 인간 B 세포의 고유 불활성 및 이질성 등 때문에 시행 과정에서 유익한 항체 분비 B 세포가 소실되는 일이 잦고(Chan M et al., 1986; James K and Bell G, 1987) 따라서 EBV 감염후 추가적으로 세포 융해법이 요구되었다(Bron D et al., 1984; Yamaguchi H et al., 1987; Posner M et al., 1991). 실제로 일부 연구자는, 상술한 인간 하이브리도마 이용시의 기술적 난점에도 불구하고, 안정한 인간 IgG 항체 분비 인간 단클론 세포 배양물을 생산하는 가장 좋은 방법은 골수종 세포주를 이용한 인간 림프구 융해에 기초하는 것으로 판단했다(Niedbala W and Stott D, 1998; Li J et al., 2006).
불멸화 방법을 개선하기 위한 다양한 시도가 있었으며 예를 들면, 여러 접근 법을 단일 공정으로 조합(온코겐(발암) 바이러스를 이용한 불멸화 처리, 온코겐을 이용한 변형, 소전기융합, 생쥐-인간 이종융합 등)하여 이용했다(US 4997764; Steenbakkers P et al., 1993; Dessain SK et al., 2004). 인간 단클론 항체는 활성화 및 부동화된 B 세포로부터 분리되었으며(항원의 존재하 또는 존재하지 않는 조건하에), 또한 세포 배양시 각종 조작을 조합 응용하였다(Borrebaeck C et al., 1988; Davenport C et al., 1992; Laroche-Traineau J et al., 1994; Morgenthaler N et al., 1996; Niedbala W and Kurpisz M, 1993; Mulder A et al., 1993; WO 91/09115; Hur D et al., 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677; WO 88/01642; WO 90/02795; WO 96/40252; WO 02/46233).
전반적으로, 항체 특히 인간 기원의 항체를 분비하는 세포의 분리 및 불멸화 방법에 관한 공지 문헌은, 생물 시료에서 취한 항체 발현 세포의 정제에서 출발하여 배양물 조건하에 분비되는 항체의 스크리닝에 이르기까지, 불멸화된 항체분비 세포의 레퍼터리를 최대로 제공하는 전 공정을 어떻게 구상할 것인지에 대한 명확한 해법을 제시하지 못하였다.
따라서, 항원의존 방식으로(관심 대상인 특정 아이소타입을 가진) 항체분비 세포의 선별 및 이용성을 개선하기 위하여 세포 배양물에서 특별한 방법 및 조건을 적용함으로써, 세포배양 조건하에 유지되는 최대 크기의 불멸화된 항체분비 세포 집단에 대해서 분비 항체의 대용량(high-throughput) 분석을 실행할 수 있는 보다 최적화된 공정을 완수하기 위한 방법이 바람직할 것이다. 이러한 공정은 또한, 원하는 아이소타입을 가진 항체가 클론화되는 B 세포 집단을 반복적으로 분석하여 바람직한 활성을 가진 항체분비 세포를 검출하고 이를 추후 분석을 위해 살아있는 상태로 보관할 수 있으므로, 항체 유전자를 클론화하는 분자론적 응용 방법을 촉진한다.
본 발명은, 배양물 조건하에서의 세포의 생존력 및 불멸화제에 대한 이들의 감도를 개선하기 위해 공지 기술에 따른 방법에서 항체분비 세포의 선택, 자극 및 불멸화 방법과 조건을 선택 및 조합할 수 없었던 과거의 연구 관찰 결과에 근거한 것이다.
실제로, 이러한 조건 및 방법을 특이적으로 조합하면 세포 불멸화를 개선할 뿐만 아니라, 특정 아이소타입의 항체를 대량으로 분비하고 살아있는 상태로 보존할 수 있는 불멸화된 세포 집단을 항원의존 방식으로 생성하는 전체 공정의 재현성 및 규모를 크게 향상시킬 수 있다는 놀라운 사실을 발견하였다.
본 발명의 방법은 따라서 항체 분비, 아이소타입 특이적 세포의 라이브러리로 이용 및 유지될 수 있는 세포의 다클론 집단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 접근을 통해, 세포배양 조건에서 다양한 기능성 및/또는 결합 활성을 갖는 항체를 분비하는 세포의 특이적 올리고클론 또는 단클론 집단을 적절한 때에 검출 및 분리할 수 있다(도 1 참조).
본 발명은 하나 이상의 특이적 아이소타입 항체를 분비하는 세포 집단을 불멸화하는 방법으로서:
a) 적어도 하나의 세포면 마커의 발현에 근거하여 항원의존 방식으로 하나 이상의 생물 시료로부터 항체분비 세포 집단을 선택하는 단계;
b) 세포배양 조건하에 적어도 하나의 자극제를 함유한 상기 선택된 세포 집단을 자극하는 단계;
c) 상기 세포 배양물에서 상기 자극제를 제거하는 단계;
d) 상기 세포 배양물로부터 특이적 아이소타입의 항체를 발현하는 자극된 세포 집단을 선택하는 단계;
e) 세포배양 조건하에 상기 선택 및 자극된 세포 집단을 불멸화제에 노출시키는 단계; 및
f) 상기 불멸화제는 바이러스성 불멸화제이고, 상기 세포 배양물로부터 불멸화제를 제거하는 단계를 포함하는 불멸화 방법을 제공한다.
또한, 상기 단계 f) 이후에;
g) 세포배양 조건하에 상기 세포 배양물로부터 수득된 세포 집단을 유지하는 단계; 및
h) 상기 세포 배양물 내에 특이적 아이소타입의 항체를 분비하는 세포 집단의 수, 생존률, 및/또는 증식 활성을 측정하는 단계를 추가로 실행할 수 있다.
이 모식적인 과정은:
- 세포를 분리할 수 있는 공여체 또는 생물 시료의 동정;
- 항체분비 세포를 선택, 자극, 및/또는 불멸화하는 특정한 방법;
- 세포배양 조건하에 불멸화된 항체분비 세포의 집단을 유지, 성장 및 증식시킬 수 있는 적절한 세포배양 조건;
- 상기 세포 배양물 내의 상기 특이적 아이소타입 항체를 분비하는 세포 집단의 수, 생존률 및/또는 증식 활성을 측정하는 방법; 및
- 불멸화된 항체분비 세포를 스크리닝하기 위해 선택된 항체의 원하는 특성 및 관련된 분석법 등에 관련하여 추가적인 조건 및 방법을 적용하여 통합 및 조정할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포배양 조건하에 불멸화된 세포 집단 형태로 유지되는 최대의 다양성 및 세포의 수를 구하는 범위 내에서 항체분비 세포의 선택, 자극, 불멸화 및 클로닝을 최적화하는 방법 및 조건을 제공한다. 실제로, 결과로 얻은 세포 집단은, 본 발명의 방법에 따라 생성된 직후에 원하는 스크리닝 분석 대상이 될 수 있거나, 또는 부분적으로나 전반적으로 하나 이상의 스크리닝 분석에서 동결 및 추후 이용될 수 있는 항체를 분비하는 불멸화 세포 라이브러리로 생각할 수 있다.
본 발명의 방법으로 얻은 세포 집단은 세포배양 조건하에 항체를 분비하고, 그리고 특히 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 분비하는 다수의 올리고클론 또는 단클론 세포 집단으로 분리할 수 있다. 실제로, 상기 세포 배양물의 상층액은 상술한 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 항체를 함유하는 배양물을 검출하기 위해 이용된다. 이러한 항원 결합 특이성 및/또는 생물 활성은 인간, 포유류, 바이러스, 박테리아, 식물, 기생충, 연구 대상인 유기 또는 무기 항원 등에 관한 것이다.
상술한 세포 집단의 성공적인 분리는 상기 세포의 성장, 이들을 스크리닝하는데 이용한 분석법, 및 출발 물질(일반적으로 공여체나 공여체 풀에서 취한 말초혈) 내의 항원 특이적 B 세포의 빈도 등에 의존한다. 실제로, 불멸화된 항체분비 세포는, 원하는 활성을 검출하기 위해 세포 배양물 상층액을 직접 사용할 수 있을 뿐만 아니라 최대 세포증식 및 면역글로불린 분비를 가능하게 하는 조건하에 배양되어야 한다. 필요한 경우, 세포 상층액에서 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 분비하는 하나 이상의 세포 배양물이 각각 분리될 때까지, 세포 집단은 상기의 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 나타내는 세포 풀(pool)을 스크리닝하기 위해 분리되기도 한다.
원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체는, 그후 세포 배양물을 확대하고 상기 세포 배양물의 상층액으로부터 단클론 항체를 정제함으로써 생성할 수 있다. 또한, 단클론 항체의 DNA 코드화는 숙주 세포에서 항체의 재조합 발현을 위하여 분리하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 동정 및 제조하는데 이용할 수 있는 본 발명의 방법에 따라 수득되는 세포 배양물(특히 항체분비 세포의 다클론, 올리고클론 및 단클론 세포 배양물) 조건하에 유지된 불멸화된 항체분비 세포 집단을 제공하는 것이다. 항체는, 세포 배양물로부터 직접 정제되거나 또는 이들을 코드화하는 DNA 서열을 이용하는 재조합 단백질로서 생성되고 특정의 세포 배양물로부터 분리할 수 있다. 또한, 하나 이상의 특정 아이소타입의 항체 서열을 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 라이브러리는, 본 발명의 세포 집단 특히, 연구 대상이 되는 어떤 종류의 결합 및/또는 생물 활성을 가진 항체를 분비하는 것으로 확인된 세포 집단으로부터 분리되는 핵산을 이용하여 제조할 수 있다.
그 밖의 본 발명의 또다른 목적은, 세포 집단, 세포 배양물, 세포 배양물의 상층액, 및 단클론 항체를 동정 및 제조하기 위한 항체분비 세포로부터 본 발명의 방법에 따라 수득된 DNA 라이브러리의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 이들 생성물은 또한 원하는 항원 결합 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 동정 및 제조하거나, 또는 개체별로(또는 개체의 집단에서) 자가이식이나 이종이식 항원, 바이러스, 박테리아 세포, 독소, 기생충 세포 또는 백신에 대한 아이소타입 특이적, 면역 반응의 특징을 결정하는데 이용되는 키트에 포함할 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 세포 집단 및 세포 배양물은, 세포 배양물 상층액 내에서 단클론 항체를 분비하고, 단클론 항체의 정제 범위 내에서 확대 가능한 세포 배양물을 생성하는 방법에 따라 얻을 수 있다.
하기의 실시예는, 동일한 생물 시료로부터, 항원- 또는 바이러스- 특이적 인간 IgG 항체를 발현할 단클론 또는 올리고클론 세포 집단을 수득하기 위한 EBV-불멸화된 인간 B 세포 집단을 생성하는 범위 내에서 본 발명의 방법을 적용하는 방법과 조건에 관한 것이다.
도 1은 불멸화된 항체분비 세포를 수득하기 위한 본 발명의 방법을 포함하는 단클론 항체를 분리 및 발현하는 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 단독으로 또는 CpG2006, LPS, SAC 또는 CD40L과 결합된 IL-2(1000U/ml)의 존재하에 배양된 1차 B 세포의 증식 효과를 나타낸다. 여기서, 인간 CD22-양성 B 세포는 5개의 공여체에서 얻은 말초혈 단핵세포(Peripheral Blood mononuclear Cell, PBMC) 풀로부터 자기 분리법으로 정제했다. B 세포는 표시된 화합물 농도로 4일간 배양했다. 3H-티미딘을 배양 최종일에 첨가하고 세포를 라벨화된 뉴클레오티드로 8 내지 12시간 동안 배양했다. 모든 실험에서, 배지만 사용하여 배양한 시료, 배지와 IL-2, 또는 배지와 CpG2006을 이용하여 배양한 시료를 나타내었다. IL-2 및 자극제인 LPS(A), SAC(B) 및 CD40L(C)의 조합 효과를 지시에 따라 검사했다. 분당 계수(conuts per minute, cpm)값을 3중 웰법으로 기록한다. (A), (B) 및 (C)간의 절대 cpm값의 차이는 각 실험에서 이용한 3H-티미딘 뱃치의 특이적 활성 차이에서 기인한다.
도 3은 인간 CD22-양성 B 세포의 증식에 대한 CpG2006의 약량의존 효과를 나타낸다. 인간 CD22-양성 B 세포는 5개의 공여체에서 얻은 PBMC 풀로부터 자기 선택법으로 정제했다. B 세포를 지시 농도의 CpG2006 및 IL-2(1000 U/ml)로 2일간 배양했다. 생존 세포수(A)를 트리판 블루 염료배제 검정법으로 현미경 측정했다. 이와 더불어, 각 지시 배양 조건에서 일어나는 1만개의 양태를 유체 세포측정법(flow cytometry)(B)으로 분석하여, 생존 세포수(검정 막대) 및 블라스트 세포수(고전향성 및 직교 스캐터의 세포, 백색 막대)의 비율 모두를 측정하였다.
도 4는 5개의 공여체에서 얻은 PBMC 풀의 자기 분리법으로 정제한 CD22 또는 CD19 양성 B 세포의 블라스트 형성 및 생존율에 관한 형광활성 세포 분류기(Fluorescence-activated cell sorters, FACS) 기반 분석 결과를 나타낸다. 상기 분석은 CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000U/ml)(B)의 조합물로 4일간 배양하기 전(A) 및 후(B)에 수행했다. 각 패널에서, 10,000개의 양태를 전향 스캐터(수평축) 및 직교 스캐터(수직축)로 각각 분석하여 각각 크기 및 입도 측정치를 표시했다. 생존 B 세포는 R1 영역에 모인다. 하부 전향 스캐터의 죽은 세포들은 R1 외측에 수직축을 따라 배열된다. 블라스트 분화의 세포들은 더 큰 전향 및 직교 산란을 보인다.
도 5는 자극제(CpG2006 및 IL-2의 조합)로 자극시킨 B 세포에서 세포 증식 속도 및 세포 생존률을 나타낸다. 인간 CD22 양성 B 세포는 5개의 공여체에서 얻은 PBMC 풀의 자기 분리법을 통해 선택되었다. 세포는 지시 시점에서 CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000U/ml)의 존재하에 배양했다. 증식율을 3H-티미딘 첨가로 평가했다.
도 6은 인간 B 세포의 EBV-조절 불멸화에 미치는 CpG2006 및 IL-2 조합물의 영향을 나타낸다. (A) CD22 양성 B 세포는 자기 비드 선택법으로 5개의 공여체 풀로부터 정제한 후, 배지 단독(검정 막대) 또는 CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000U/ml)(백색 막대)를 함유하는 배지 내에서 2일간 배양했다. 세포를 세척한 후 IgM 양성 세포를 세포 분류로 분리했다. CD22 양성, IgM 음성 세포는 세포배양 배지에서 50% V/V의 EBV 함유 상층액으로 하룻밤 배양하여 불멸화했다. EBV를 함유한 세포배양 배지를 제거하고 세포를 다시 IL-2(1000U/ml)를 함유하는 배지에서, 조사처리된 알로젠 PBMC를 공급층으로 이용하여 지시한 일(日)수 동안 배양했다.(B) 5개의 공여체 풀로부터 CD22 양성 및 IgM 음성 B 세포를 자기 비드 선택법으로 정제한 후 CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-(1000U/ml)가 없는 조건 (검정 막대) 및 있는 조건(백색 막대)하에 EBV를 함유한 30% V/V 배양물 배지에서, 조사처리된 알로젠 PBMC를 공급층으로 이용하여 배양함으로써 불멸화시켰다. 상기 (A) 및 (B)에서, 생존하는 림프아세포(대형 세포)의 수를 트립판 블루 염료배제 검정법을 통해 현미경 관찰 평가하였다.
도 7은 CpG2006 및 IL-2를 이용한 2일간의 사전자극, EBV 불멸화 및 10일간 배양(EBV 및 CpG2006이 없는 조건하에 IL-2 및 조사처리된 알로젠 PBMC 공급층을 이용)하여 얻은 CD22 양성 및 IgM 음성 B 세포의 표현형을 나타낸다. (A) 1만개의 양태는, 수직축이 IgM 형광성을 표시하고 수평층이 전향 스캐터(세포 크기 측정값)를 가리키는 FACS 도트 그래프 분석법으로 분석하였다. 고레벨의 전향 산란을 나타내는 생존 블라스트 세포는 모두 우측의 4분면에 포함되어 있다. IgM 음성 세포는 하부의 양측 4분면에, IgM 항체를 발현하지 않는(또한 대부분 IgG 항체를 발현하는) 생존 블라스트 세포는 하단 우측의 4분면에 나타난다. (B) 상기 (A)에 따라 자극 및 선택된 EBV 불멸화된 CD22 양성 및 IgM 음성 B 세포의 상층액을 이용하여 면역확산 분석을 수행했다. 소비된 배지는 분석전 5배로 농축했다. 아이소타입 특이적 항체를 이용하여 분석한 결과, 세포 배양물 상층액 내에는 분비된 인간 면역글로불린(αhIg), 인간 IgM(αhIgM) 및 인간 IgG(αhIgG)가 모두 존재하는 것으로 평가되었다.
도 8은 기본, 조합 및 연속 방법에 따라 수득한 세포 집단을 서로 비교한 결과로서, (A) 기본, 조합 및 연속 방법에 따라 방법에 따라 세포의 다클론 집단을 제조하는 방법을 개괄적으로 나타낸다. (B) 상기 세포 집단을 총 세포수(유체 세포측정법에 의해 측정됨) 및 생존 세포율(하기의 재료 및 방법에 기술한 바와 같이, 요오드화 프로피듐 배제법 및 유체 세포측정법에 따라 측정됨)에 관하여 비교한다.
도 9는 도 8 및 실시예 2에서 기술한 바와 같이 기본, 조합 또는 연속 프로토콜을 이용하여 CD22 양성, IgG 양성 B 세포를 조제하고 이 결과로 얻은 세포 집단을 유체 세포측정법(요오드화 프로피듐 배제법; 좌측 패널)으로 분석했다. 특히, 10일간의 배양 종료시 CD23 발현(직접 면역형광법; 우측 패널)에 관하여 R2 속에 갇힌 세포들에 대해 분석했다. 생존 림프아세포가 주종인 이들 세포의 CD23 발현 레벨은 수평축에 로그 형광값으로 표시되고(상, 중), 주어진 량의 CD23을 발현하는 세포수는 상대값으로 수직축에 주어진다. 음성(neg)으로 판단되는 형광 레벨은 라벨화된 아이소타입 음성 대조군 항체를 이용하여 측정했다.
도 10은 기본, 조합 또는 순차적 방법을 이용하여 조제한 세포 배양물에서의 IgG 분비 분석값을 나타낸다. 무세포 상층액을 10일 배양 후 수득했고(도 8A 참조) IgG 농도는 전체 인간 IgG ELISA 상용 키트를 이용하여 일련의 상층액 희석물 내에서 측정했다. 각 상층액내의 IgG 절대량은 ELISA 키트 제작자가 제공한 정제된 인간 IgG에 대한 표준 곡선을 비교하여 측정했으며, 여기서 선형 범위는 150㎍/ml까지 상부의 편평한 부분에 도달했다. 연속 공정으로 얻은 상층액 희석물은 모두 표준 곡선의 선형 범위 아래의 측정값을 나타냈으며 총 IgG 농도가 200㎍/ml 이하인 상기 측정값을 외삽처리 할 수 있다. 이 때문에 결과치는 점선으로 나타난다.
도 11은 인간 B 세포 같은 항체분비 세포를 불멸화하는 본 발명의 방법을 포함하여, 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV)를 결합 및/또는 중화시키는 IgG 항체를 분비하는 인간 B 세포의 동정을 위한 일반적인 공정을 개략적으로 나타낸다.
도 12는 상이한 활성을 가진 IgG 항체를 분리하기 위해 도 11의 공정 흐름을 통해 수득된 EBV-불멸화 IgG 분비 인간 B 세포 배양물의 동정 방법을 개략적으로 나타낸다. (A) CMV 혈청양성 공여체에서 얻은 EBV 불멸화 B 세포의 배양물로부터 수득한 상층액을, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 표시 분리물로 배양한 뒤, 표시된 인간 세포에 가했다. AD 169는 인간 CMV의 연구실 균주이다. VR 1814는 인간 CMV의 임상 분리물이다. HELF는 인간 배아 폐 섬유아세포이며 HUVEC는 인간 제대혈 상피세포이다. 선택된 인간 IgG 항체를 함유하는 세포 배양물 상층액의 중화 활성은 CMV 감염 활성의 감소로써 발현된다(적어도 2가지 분석으로 표시됨). CMV 조기항원(IEA)에 대한 면역조직화학적 염색값을 측정하여 데이터를 얻었다. 음성 대조군은 세포배양 배지 단독을 사용하였다. EBV 불멸화된 인간 B 세포 배양물로부터 얻은 상층액을 수거(5가지 상층액/풀)하고 ELISA 시험으로 인간 HSP60 단백질에 대한 인간 IgG 항체 결합을 검출했다. 데이터는 2중 웰의 평균치를 나타낸다. 실선은 기준값(배양물 배지(RPMI-1640 및 10% FCS) 단독 시용시 관측된 레벨의 3배)을 가리킨다. 양성 대조군 시료(HSP60에 대한 시판 중인 마우스 항-인간 항체, 표시 농도에서) 및 음성 대조군 시료(mIgG, 비특이적 마우스 IgG)는 항마우스 IgG를 이용하여 나타냈다. 기타 다른 대조군 시료(배지 단독 또는 무관련 인간 IgG인 hlgG을 갖는 2가지 음성 대조군) 및 세포 배양물의 상층액을 함유한 시료를 시판중인 항-인간 IgG 항체를 이용하여 나타냈다.
도 13은 CMV 중화 활성을 나타내는 인간 공여체의 혈액에서 출발하여 본 발명의 방법에 따라 불멸화 항체분비 세포 집단을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸다. 불멸화된 올리고클론 및 단클론 세포 집단은 세포 배양물 상층액에서 확인된 항체의 특성에 따라 동정하였다: 총 CMV 단백질 추출물과 결합하거나(키트 BEIA-CMV ELISA로 시험시), 특이 항원과 결합하거나(CMV 단백질 gB 및 gH의 단편을 이용하여 시험시), 또는 시험관내 분석에서 CMV 감염을 중화시키는 항체를 분리한다.
도 14는 IgG 항체 결합 CMV 단백질을 분리하기 위하여, 도 13의 공정 흐름에 따라 수득한 EBV-불멸화 IgG-분비 인간 B 세포 배양물의 동정 결과를 나타낸다. 혈청 내에서 중화 활성을 갖는 CMV 공여체로부터 수득한 CD22 양성, IgG 양성 B 세포는 실시예 2에 기술된 바와 같은 순차적 프로토콜에 따라 제조했다. 결과로 나온 세포 집단을 이용하여 생성한 10일 세포 배양물(CMV5 벌크 배양물)에서 얻은 상층액을 수거하여 4℃에서 보관후, 재료 및 방법 단원에서 설명한 바와 같이 BEIA-CMV ELISA 키트를 이용하여 시험했다. 이어서, 세포 배양물을 20 세포/웰의 양으로 96-웰 플레이트에 분할 공급하고 조사처리된 알로젠 PBMC 공급 세포, CpG2006 및 IL-2의 존재하여 4주간 배양했다. 활성적으로 증식하는 세포 집단이 담긴 웰로부터 조제된 무세포 상층액을 BEIA-CMV ELISA 키트로 스크리닝했다. 양성 대조군(칼리브레이터 2, 10 AU/ml)를 ELISA 키트에 담아 제작자의 지시에 따라 이용했다. 음성 대 조군은 배지 단독(L-글루타민 함유 IMDM, NEAE, 10% FCS, CpG2006 및 IL-2)을 사용하였다. 20개의 대표적인 세포 배양물로부터 얻은 결과를 나타낸다. 수평선은 상기 분석에서 2배 컷오프 값을 나타낸다.
도 15는 웰 9G8에 담긴 세포에서 분비된 항체에(도 14 참조) 관하여 중사슬(A; VH; SEQ ID NO:3) 및 경사슬(B; VL; SEQ ID NO:8)의 변동 영역에 있는 단백질 서열을 나타낸다. 중사슬의 CDR 서열(HCDR1, SEQ ID NO: 4; HDCR2, SEQ ID NO: 5; HCDR3, SEQ ID NO: 6) 및 경사슬의 CDR 서열(LCDR1, SEQ ID NO: 9; LDCR2, SEQ ID NO: 10; LCDR3, SEQ ID NO: 11)은 모두 IMGT(Giudicelli V. et al., 2004; http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/index.html 에서 이용가능)가 제공하는 V-Quest 같은 공지의 항체 서열과 비교시 상이한 방법에 근거하여 예측되며 이들을 밑줄로 표시한다. 세포 배양물로부터 얻은 1만개의 세포를 표준 프로토콜에 따라 2개의 서열을 결정하는데 이용했다. 세포를 펠릿화하고 mRNA를 추출하여, 분해 VH 및 VL 프라이머를 이용한 5' RACE 증폭처리에 따라 cDNA를 생성하는데 이용했다. 이어서, 얻어진 서열은 박테리아 세포 변형에 이용되는 플라스미드에서 클론화했다. 중사슬 및 경사슬의 변동 영역에 코드화되는 공통 서열(SEQ ID NO: 2) 및(SEQ ID NO: 7)은 적어도 4개의 독립 박테리아 세포 클론으로부터 얻은 서열을 이용하여 측정했다.
본 발명은, 불멸화된 상체 분비 세포가 분비된 항체의 항원 특이성 및/또는 생물 활성에 근거하여 생산 및 스크리닝할 수 있는 효능을 개선하는 방법을 제공한 다.
특히, 하기의 실시예는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)를 이용하여 불멸화하는 세포배양 조건하에 인간 B 세포의 증식 활성, 생존성 및 항체 분비가 공여체에서 분리된 1차 세포에 대해 방법 및 조건의 적절한 조합을 적용함으로써 개선될 수 있음을 보여준다
세포 선택 및 자극에 관한 특정한 방법 및 조건을 선택할 경우, 살아있고, 항체분비 세포를 증식하고, 세포 배양물 상층액을 직접 이용하여 스크리닝할 수 있는 광범위한 종류와 수의 불멸화된 항체분비 세포에 기여하는, 예상외의 중요한 개선 효과를 발휘할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명의 실시예는 또한, 생물 시료에서 얻은 세포의 세포의 초기 선택은 하나 이상의 세포 표면 마커, 세포가 하나 이상의 자극제에 노출되는 뒤따른 자극 단계에 근거할 수 있음을 보여준다. 그러나, 자극제는 세포 생존률 및 증식에 영향을 미치지 않고, 적절한 기간 동안 특별히 선택된 세포 집단 상에서, 한정된 농도비로, 적용될 때에만, 최대 활성을 제공한다. 더욱이, 자극 및 불멸화 단계 간의 명확한 일시적 및 물리적 구별이 이루어지면, 자극제 및 불멸화제에 대하여 세포를 동시에 노출할 경우의 부정적 영향이 입증된다.
특히, 본 발병의 실시예는, 이들의 세포 배양물 상층액을 이용하고 이들이 생성하는 항체의 결합 특징 및/또는 기능적 특징에 따라서 추후 클론화 및 스크리닝 될 수 있는 인간 IgM 음성(또는 IgG 양성) B 세포의 EBV 부동화에 대한 효과적이고 재현가능한 방법을 달성하기 위하여 상기의 성분들이 조합될 수 있는 방법과, 마지막으로 재조합 단백질로서 항체의 특성화 및 생산을 위해 분리 및 클론화할 수 있는 방법을 보여준다.
불멸화에 앞서 세포 선택 및 활성화에 관한 개별 단계들을 수반하는 순차적 접근은, 보통 골수종 세포를 바이러스 불멸화제에 추가(또는 대체)하는 융해처리를 통해 시험관내 면역화된 항원-특이적 세포 집단과의 연계성에 관하여만 문헌에 공지되었다.
따라서, B 세포의 초기 집단은 세포독성제를 이용하여 특수 세포종으로부터 분리되고, 이어서 사이토킨 및 성장 인자와 결합된 항원에 노출되거나(Borrebaeck C et al., 1988; Davenport C et al., 1992; Laroche-Traineau J et al., 1994) 또는 항원 특이적 패닝(panning)법의 적용을 받아서, 선별에 앞서 공급 세포층으로 확대되었다(Steenbakkers P et al., 1993; Steenbakkers P et al., 1994).
항체분비 세포의 집단은 표준 EBV 불멸화 또는 EBV- 및 온코겐(oncogene) 조절 변형의 조합(US 4997764), EBV 불멸화 또는 비특이적 세포 활성 처리후 골수종 세포주와의 융해처리를 이용하거나(Niedbala W and Stott D, 1998; WO 02/46233), EBV 불멸화 후 특이적 아이소타입을 가진 항체를 발현하는 세포의 선택(Morgenthaler N et al., 1996), 또는 세포를 선택한 후 B 세포 활성화제 존재하의 EBV 불멸화 처리(WO 91/09115; Hur D et al., 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677) 를 이용하여 불멸화 처리해왔다.
그러나, 이러한 공지 기술은 불멸화에 앞서 세포 선택 및 활성화를 달성하기 위한 방법 및 조건, 또한 특히, 원하는 아이소타입 및 생물 활성을 가진 항체를 발 현하는 올리고클론 또는 단클론 세포 집단의 동정을 폭넓고 직접적으로 이용할 수 있는 다클론 세포 집단을 제공할 바이러스 불멸화 처리법의 효율성과 조건은 어느것도 제시하지 못하였다.
본 발명의 주요 목적은 하나 또는 그 이상의 특이적 아이소타입의 항체를 분비하는 세포 집단을 불멸화하는 방법에 있어서,:
a) 적어도 하나의 세포면 마커의 발현에 근거하여 항원의존 방식으로 하나 이상의 생물 시료로부터 항체분비 세포 집단을 선택하는 단계;
b) 세포배양 조건하에 적어도 하나의 자극제로 상기 선택된 세포 집단을 자극하는 단계;
c) 상기 세포 배양물에서 상기 자극제를 제거하는 단계;
d) 상기 세포 배양물로부터 하나 이상의 아이소타입의 항체를 발현하는 자극된 세포 집단을 선택하는 단계;
e) 세포배양 조건하에 상기 선택 및 자극된 세포 집단을 불멸화제에 노출시키는 단계; 및
f) 상기 불멸화제는 바이러스성 불멸화제이고, 상기 세포 배양물로부터 불멸화제를 제거하는 단계를 포함하는 불멸화 방법을 제공하는 것이다
상기 방법은 분석 및 상기 방법을 적용하여 수득한 세포 집단을 이용하는 것에 관련한 일련의 후속 단계를 더 포함할 수 있다(도 1 참조). 특히, 상기 세포 집단을 포함하는 세포 배양물을 완성시키는 데 중요한 것으로서, 상기 단계 f) 이후에 실행되는 하기와 같은 두 단계, 즉:
g) 세포배양 조건하에 상기 세포 배양물로부터 수득된 세포 집단을 유지하는 단계; 및
h) 상기 세포 배양물 내에 상기 특이적 아이소타입의 항체를 분비하는 세포 집단의 수, 생존률, 및/또는 증식 활성을 측정하는 단계를 포함하여 실행할 수 있다.
본 명세서 및 도면은 본 발명의 방법을 응용하는 것을 예시적으로 나타내며 특히, 연구 대상인 항체를 분비하는 단클론 세포 배양물을 제공하기 위하여, 말초혈 시료에서 분리한 인간 B 세포에 관하여 상세히 기술한다.
실제로 본 발명의 방법에 따르면, 항원의존 방식에 따라, 개인 대상에게서 취한 1차 세포에 발현되고 바이러스 불멸화 처리에 의해 캡쳐된 원하는 아이소타입의 항체 레퍼터리의 이질성을 효과적으로 표현하는 세포 집단을 수득할 수 있다.
한편, 더욱 균질한 생존성 및 본 발명의 방법에 의해 수득된 불멸화된 항체 분비세포의 집단의 고(高)증식성은, 세포배양 조건(예를 들면, 세포 집단, 항체 함량이 큰 세포 배양물 상층액)하에 수득되거나 또는 기타의 분자 성분들(예를 들면, 올리고클론 세포 집단으로부터 추출된 핵산을 이용하여 조제한 DNA 라이브러리)로서 수득할 수 있는 상이한 생물학적 생산물을 이용하여 상기와 같은 항체 레퍼터리를 더욱 심도깊게 분석할 수 있게 한다.
더욱이, 본 발명의 방법은 통계적으로 20 이하의 세포를 함유하는 풀(pool)과 표준화 조건하에서 성장한 불멸화 항체분비 세포(새롭게 조제되거나 또는 사전 조제, 동결 및 해동된)의 다클론 집단을 분할함으로써 세포 배양물에서 직접적으로 특징화되는 항체를 분비하는 충분한 항체 및 불멸화된 세포를 수득할 수 있게 한다. 클로닝 단계의 수가 적어지면(예를 들어, 통상 2 이상의 단계가 아닌 단일 단계), 연구 대상 항체를 분비하는 불멸화된 세포를 동정하는 시간도 짧아지며 따라서, 서브클로닝 단계에서 이들이 손실되는 위험을 줄이고 또한 시험관 분석 또는 체내 분석시 항체의 특징화를 신속히 진행할 수 있게 된다. 이점은 특히, 더욱 신속히 및 성공적으로 달성할 수 있는 치료 타겟에 대한 특이성을 가진 희귀한 항체를 분리함에 있어서 특히 중요하다.
따라서 본 발명의 방법은 명세서에 요약 기술되고 또한 도면에 예시된 바와 같이(도 1, 11 및 13 참조), 특이적 아이소타입의 단클론 항체를 동정 및 제조하는 보다 복합적인 방법으로 수정되어 통합할 수 있다(실시예 3 참조).
본 발명의 방법에 적용가능한 조건 및 방법에 관한 정의 및 세부 기술은 다음과 같으며, 이러한 방법 및 이에 의해 수득할 수 있는 생성물(세포 집단, 세포 배양물, 세포 배양물 상층액, 그리고 항체, 특히 인간 단클론 항체)의 바람직한 용도에 대해서도 상세히 기술한다.
세포의 "집단"이란 일반적으로 동일한 기준을 적용하여 분리하거나, 동일한 방법으로 생성된 세포군(본 발명의 경우는 항체분비 세포군)을 의미한다. 예를 들어, 세포 집단은 선택 단계(예를 들면, 세포 분류), 처리(예를 들면, 자극제 또는 바이러스형 불멸화제를 이용), 또는 배양물이나 세포 집단을 통계적으로 동일한 양의 세포를 함유한 소규모 세포 풀(pool)로 분리하는 단계로부터 얻어진다(예를 들면, 세포 배양물을 서브클로닝하거나, 장기간 유지되도록 동결되어 살아있는 불멸화된 세포를 조제할 경우). 세포 집단은 살아있지만, 세포배양 조건하에 일어나는 것과 같이, 특이적 생물활성(예를 들면, 성장, 증식, 또는 항체 분비)을 반드시 발휘할 필요는 없다.
세포의 "배양물"은 생물학적 활성을 나타내는 세포를 만들는 범위(예를 들면, 성장, 증식, 또는 항체의 분비), 및/또는 특정 화합물(예를 들면, 자극제 또는 바이러스 불멸화제)로 세포를 처리하는 범위에서 용기(예를 들면, 플레이트의 웰, 페트리 접시, 플라스크, 병)에 함유된 세포 집단을 말한다. 이러한 실험 조건(즉, 세포배양 조건)은 특정 온도 및 세포의 성장과 증식을 위해 적절히 선택된 분위기(세포배양 배지의 사용과 함께) 하에 유지된 배양기를 사용하는 것을 포함한다.
세포 배양물은 따라서 세포배양 배지(혈청, 성장 인자, 사이토킨, 영양소 등을 포함)와 세포 집단을 포함하며, 항체분비 세포의 경우, 세포 집단(소위 "공급 세포")의 성장 및 증식을 지원하기 위해 배양된 추가적인 세포를 더 포함한다. 수일 또는 수주일 후, 세포의 소비뿐만 아니라 세포를 분비하거나, 또는 세포사멸(apoptosis) 또는 자살에 이를 때 단순 방출하는 다양한 종류의 분자세포에 의해 세포배양 배지의 조성이 변화된다. 따라서, 세포배양 배지는 정기적으로 새로운 것으로 대체되거나, 또는 세포배양 배지의 함량을 분석하기 위하여 부분적으로 제거될 수 있다. 사용되는 세포배양 배지(공지 문헌에서는 "소비" 또는 "조절된" 세포배양 배지 뿐만 아니라, 세포 배양물의 "상층액"으로 정의됨)는 예를 들어, 세포배양 조건하에 세포 집단에 의해 분비된 항체의 활성 및 함량을 결정할 수 있는 소정 시점에서 수거될 수 있다. 상기의 정보는, 이러한 세포의 생존율 및 증식에 관한 데이터와 함께, 세포 배양물 상태 및 이의 용도를 한정하는데 이용한다(예를 들면, 스크리닝 분석시, mRNA 분리의 용도, 단클론 항체의 정제 용도, 동결된 세포의 수집용도, 등).
"다클론"이란 배양물 또는 집단내에서의 단일 세포 또는 세포군에 의해 발현되는 다수의 상이한 항체(예를 들면, 103, 104, 105 또는 그 이상)를 발현하는 배양물 또는 세포 집단을 말한다. 특히, 배양물 또는 세포 집단으로 분리되지 않거나, 또는, 본래의 다클론 배양물 또는 세포 집단의 희석물에 기초하여 통계적으로 측정할 수 있을 때 최대한, 50 또는 그 이상의 세포(예를 들면, 200, 500, 1000 또는 그 이상의 세포)로 이루어진 배양물 또는 세포 집단으로 분리되는, 본 발명의 방법(생물 시료에 존재하는 세포로부터 항원 독립적인 방식으로 생산)에 의해 수득된 배양물 또는 세포 집단에 적용된다.
"올리고클론"이란 배양물 또는 세포집단을, 본래의 배양물 또는 세포 집단의 희석물에 기초하여 통계적으로 측정할 수 있을 때, 50개 미만(예를 들면, 40, 20, 10, 5, 1 또는 1개 미만의 세포)를 초기에 함유하는 배양물 또는 세포 집단으로 분리하여 수득한 배양물 또는 세포 집단을 말한다.
배양물 또는 세포 집단을 20개 또는 그 이하의 세포를 초기에 함유하는 배양물 또는 세포 집단으로 분리하여 수득한 올리고클론 배양물 또는 세포 집단은 특히 중요하다. 실제로, 결과로 얻어진 세포 배양물(예, 생물 분석법을 이용하여 세포 배양물 상층액에 분비된 단백질 또는 RT-PCR법을 이용하여 배양물에서 분리된 mRNA 내에 전사된 유전자로서 동정된 항체)에서 단일 또는 다수의 우세한 생물 특성이 감지되는 경우, 이러한 세포 배양물을 단클론 세포 배양물이라고 볼 수 있다.
"단클론 세포 배양물"은, 적어도 세포 배양물을 선택할 때 이용된 특정의 생물 특성(예를 들면, 특정 항체의 분비)에 기초하여 평가할 수 있는 것처럼, 단일 세포(클론)의 증식(및 경우에 따라서는 분화)에 의해 기원된, 서로 동일한 세포만(또는 대부분의 세포)을 포함하는 세포 배양물이다. 따라서, 상기의 배양물에서 유래된 항체, 세포 집단, 또는 세포 배양물은, 보다 정확한 방식으로 클론성(clonality)을 달성하기 위해 요구될 수 있는 실험적 활성이라도 "단클론"으로 표시될 수 있다.
"불멸화"란 선택 및 자극된 세포 집단을 바이러스성 불멸화제에 노출한 후, 본 발명의 방법으로부터 수득된 배양물 및 세포 집단을 말한다. 바이러스성 불멸화가 특이적 바이러스성 생성물(예를 들면, 단백질, 전사물)과 연계될 수 있더라도, 상기 세포는 세포배양 조건하에 연속 성장 및 증식을 나타낼 때 불멸화되는 것으로 한정한다. 실시예에서 보는 바와 같이, 생물 시료로부터 수득되거나 항체를 발현하는 1차 인간 B 세포는 적어도 104 세포를 함유하는 올리고클론 세포 배양물을 생성하는데 이용했던 다클론 세포 집단을 수득하는데 성공적으로 이용되었다. 100, 50, 20 또는 심지어 5개의 세포로 배양을 시작했을 때, 상기의 총세포수는 일반적으로 불멸화 세포가 세포배양 조건하에 행하는 세포 분할수(10 이상의 세포 분할)에 대해서만 양립가능하다.
"항체분비 세포"는 항체를 발현하는 유전자를 함유하고 세포외 공간(예를 들면, 체내 혈액 또는 시험관내 세포 배양물 상층액 안)에 이들을 분비하는 능력을 가진 1차 세포를 말한다.
"불멸화된 항체분비 세포"는 바이러스성 불멸화제에 노출된 후, 세포배양 조건하에 무제한으로, 또는 적어도 소정기간동안 성장, 증식, 그리고 항체를 분비하는 항체분비 세포 및/또는 1차 세포가 바이러스성 불멸화제에 노출되지 않은 경웅 관찰될 수 있는 수보다 많은 분리된 세포를 말한다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 수득된 다클론 세포 집단은 세포배양 조건하에 올리고클론 및 단클론 세포 집단을 형성할 불멸화된 항체분비 세포인 살아있는, 성장형 림프아세포에 풍부하게 들어있다.
"자극제"는 증식 세포배양 조건하에 블라스트 상태의 세포를 증식하고 림프아세포(현미경 또는 FACS 상에서 전향/직교 스캐터에 의해 측정되는, 대형의 살아있는 세포)를 형성하는, 항체분비 세포에 의해 조절되는 자극 반응을 일으킬 수 있는, 화합물 또는 화합물들의 특정 조합체를 말한다.
"자극 단계"란 선별된 항체분비 세포가 자극제에 노출되는 기간을 말한다.
"바이러스성 불멸화제"란 바이러스형 입상체, DNA 또는 단백질의 일종으로서, 생물 시료에서 분리된 1차 세포로부터 불멸화 세포를 생성할 수 있는 작용제를 말한다. 본 발명에서 1차 세포는 항체 분비 세포인데, 특히 인간 B 세포에서, 다양한 바이러스성 불멸화제가 동종될 수 있는 것이다.
"불멸화 단계"는 선택 및 자극된 항체분비 세포가 바이러스성 불멸화제에 노출되는 기간을 말한다.
본 발명의 방법을 실행하기에 앞선 사전 단계는 분리되어야 하는 항체분비 세포가 함유된 생물 시료로부터 개체 또는 조직을 동정하는 것이다.
발명의 배경에서 기술된 바와 같이, 항체를 발현 및 분비하는 세포는 혈액, 편도선, 비장, 체액(척수액이나 늑막액 등), 림프절 및 기타 림프기관을 포함하는 다양한 조직 및 기관으로부터 분리 및 불멸화되었다.
본 발명의 방법에 따라 불멸화할 수 있는 세포는 포유류의 조직 및 기관에서 추출된다. 좀더 명확히, 인간 기원의 세포는 치료 또는 진단 용도의 인간 단클론 항체를 분비하는 세포 배양물을 생성하는데 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 비인간, 항체분비 세포(예를 들면, 설치류나 유인원 기원의 세포)에도 적용가능하다.
다양한 종류의 1차 항체분비 세포 집단은 추구해야할 항체의 아이소타입 및 활성 뿐만 아니라, 면역세포 공여체의 상태에 따라 바람직할 수 있는 프로파일을 가진 인간 공여체로부터 분리가능하다.
본 발명의 방법은 감염성 작용제에 노출된 환자 또는 암이나 자가면역 질환을 가진 환자와 같은, 공여체로부터 선택된 인간 B 세포에 의해 발현된 단클론 항체의 동정에 적용할 수 있다. 따라서, 상기 공여체는 무처리, 백신처리, 하나 또는 그 이상의 질병이나 감염의 영향을 받거나, 특정 치료에 대하여 노출 및/또는 내성을 가지거나, 특정의 임상 조건 또는 상태에 놓여있거나, 우연히 병균 등에 노출되 기도 한다.
면역 반응의 특이성 및 장기 지속(항원에 최종 노출된 후 수년간)시 공여체 선택에 충분한 정량 측정할 수 있기 때문에, 공여체의 혈청은 항원에 대한 혈청양성의 초기 결정에 사용될 수 있다. 스크리닝 분석의 특성 및 감도는 최적의 공여체를 확인하는데 있어서 중요하며, 바람직하게, 공여체 혈청을 스크리닝하는데 이용되는 분석법은, 불멸화된 항체분비 B 세포로부터 상층액을 스크리닝하는데 사용되고, 원하는 기능의 활성을 가진 항체를 검출하기 위해 고안된 방법과 동일해야 한다(예를 들면, 세포에 대한 바이러스 유입 방지, 또는 종양관련 항원에 대한 결합).
임상적 측면에서, 세포가 정제되는 조직 또는 기관의 선택은 전체 공정을 행하기에 충분한 양으로 세포를 이용함으로써 성취할 수 있다. 인간 임상 시료에서 수득하는 세포의 양이 소량인 경우 및/또는 불멸화법이 적용되는 여러 위치에서 세포가 조제되는 경우, 이 세포는 동결 시료 및/또는 충분한 양의 출발 물질을 제공하기 위해 수집된 다수의 개체로부터 얻은 시료에서 수득할 수 있다.
따라서, 항체분비 세포(전체 말초혈 또는 혈청과 같은 것)를 함유하는 시료를 이용하여, 시험 대상 공여체의 패널 상에서 사전 스크린 처리를 행할 수 있다. 특히, 구배형 원심분리와 같은, 말초혈 단핵세포(PBMCs)를 분리하는 표준 분리기술을 이용하여 혈액 또는 림프 조직으로부터 단핵세포를 분리할 수 있다. 상기 분리단계 후 및/또는 전에, 항체 및 항체분비 세포의 존재를 감지하기 위하여, 혈청(혈장), 세포 배양물 상층액, 또는 세포(다수 환자, 다양한 조직, 및/또는 다양한 시 점에서 수득됨)를 표준 기술을 통해 사전 스크린 처리할 수 있다(예를 들면, ELISA, BIACORE, 웨스턴 블롯, FACS, SERPA, 항원 어레이, 세포 배양물 시스템 내의 바이러스 감염의 중화, 또는 ELISPOT 분석).
공지 기술은, 예를 들어, 백신화된 공여체에서 면역 반응을 특징화하기 위한 ELISPOT(Crotty S et al., 2004)의 이용, 새로 감염된 환자를 위한 진단 툴로서 항원 마이크로어레이(Mezzasoma L et al., 2002)의 이용 및 항원특이적 면역 반응을 측정하기 위한 기타 기술들(Kern F et al., 2005) 의 이용 등, 다수 실시예를 소개한다. 공여체의 선택은 특정 바이러스에 대한 혈청양성을 온코겐화(oncogenesis) 관련 변화(Butel J, 2000)와 연계시키는 것에 근거할 수도 있다.
치료 타겟(전체 레벨 또는 아이소타입 특이적 활성 레벨에서 평가)에 대한 항체 반응을 사전에 정성 분석함으로써, 원하는 정제된 항원(예를 들면, 암에 관련된 특정의 인간 재조합 단백질 또는 특정 바이러스 단백질), 관련 항원의 혼합물(예를 들면, 부분적으로 정제된 바이러스 조제물로부터 수득된 것), 또는 생분석(예를 들면, 바이러스 감염의 중화)에 대해 높은 항체 역가를 발현하는 B 세포를 가진 공여체의 동정을 가능하게 한다.
하나 이상의 공여체를 선택할 때, B 세포의 공급원은 만성 감염/염증 부위로부터 취한 비장, 혈액, 림프절, 골수, 종양 침윤 림프구, 림프구가 될 수 있다. 그러나 공여체로부터 수득, 보관, 및 한정된 기간 동안 항원에 대한 혈청양성 반응을 관측하기 쉬운 것은 말초혈이다.
예를 들어, 5 내지 50 ml의 말초혈에서, 약 1천만 내지 1억개의 PBMC(말초혈 단핵세포)를 정제할 수 있으며, 상기의 세포수는 본 발명의 방법에 따른 불멸화 처리후 스크린 처리되는 항체분비 세포가 충분한 크기의 집단 형태로 얻어질 수 있는 정도이다.
생물 시료에서 PBMC를 분리한 후, 표면에 세포 표면 마커 및, 적절하다면, 증식 활성, 세포의 대사 및/또는 형태 뿐 만 아니라 다른 단백질의 발현에 근거하여, 공지 기술에서 제시된 다수의 방법 중 하나를 이용하여, 특정한 항체분비 세포를 선택할 수 있다.
특히, 인간 시료에서 얻은 항체분비 세포의 정제에 관한 다수 기술은 양성 또는 음성 선택을 위한 다양한 조건 및 방법을 이용한다. 이들 세포는 항체를 발현 및 분비하는 세포(예를 들면, 인간 B 세포)에 대해 특이적인 세포 표면 마커를 발현하는 것을 물리적으로 분리함으로써 용이하고 효과적으로 선택된다. 특이적인 프로토콜은 문헌 상에서 확인할 수 있다(Callard R and Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" Cytokin Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F.(ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31 참조).
선택은 세포 표면 단백질 중 하나에 특정하게 결합하고 고형 지지물(예를 들면, 마이크로비드 또는 플라스틱판)에 결합될 수 있거나 또는 형광활성 세포 분류기(FACS)로 검출가능한 형광색소로 라벨화할 수 있는 항체를 이용하여 실시하는 것이 보통이다. 예를 들어, 인간 B 세포는 CD19, CD27, 및/또는 CD22 마이크로비드에 결합된 지지물에 대한 친화성, 또는 EBV 불멸화에 앞서 특정 아이소타입에 대한 특이성이 있는 항체에 대한 결합 친화성이 부족한 점에 근거하여 선택된다(Li H et al., 1995, Bernasconi N et al., 2003; Traggial E et al., 2004).
그러나, 세포 마커의 선택은, 아마도 선택 과정에서 촉발되고 세포 성장 및 생존률을 변화시키는 세포내 신호에 기인한, 불멸화 공정의 효율과 관계가 있다. 실제로 본 발명의 실시예에서 CD22, 즉 항원 인식 및 B 세포 활성화에 관련된 신호 전달 경로를 제어하는 B-세포 제한 전달막 단백질(Nitschke L. 2005)은 초기 B 세포 선택에 바람직한 분자로서 역할을 한다. CD22 양성 세포 집단은 다양한 아이소타입 및 특이성을 가진 항체를 발현하는 세포를 함유하므로, 다른 세포 표면 마커는 자극 단계 전 또는 후에 세포를 선택하기 위해 이용될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, CD22에 기반한 선택과 함께 CD27에 기반한 선택을 적용하여 항체분비 세포의 농축물을 수득할 수 있다. CD27은 체강 돌연변이한 가변 영역 유전자를 가진 인간 B 세포의 마커로 알려져 있다(Borst J et al., 2005). CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, C70, 또는 CD69 와 같은 추가적인 마커는 원하는 세포 집단에 대해 분리 또는 농축을 위해 이용될 수 있다. 따라서, 공여체의 항원(예를 들면, 바이러스, 박테리아, 기생충) 노출 이력, 항원 역가에 따라서, CD22 농축된 B 세포 또는, CD27 양성 B 세포와 같은 더 농축된 B 세포 서브집단의 사용 여부를 결정할 수 있다.
세포 분리 후, 그러나 불멸화 단계 이전에, 세포 집단은 적절한 자극제에 노출되어야 한다. 본 발명에서, 3가지 카테고리의 화합물이 사용될 수 있는, 특히 조합하여 사용될 수 있는 자극제로 적용될 수 있음을 고안하였다.
제 1군의 자극제는 B 세포에서 발현되는 Toll형 수용체의 길항체처럼, 고유 면역 반응의 활성화제를 대표한다. Toll형 수용체(Toll-Like Receptor, TLR)는 박테리아 올리고누클레오티드와 선천 및 후천적 면역성에 모두 수반되는 다양한 종류의 세포의 다클론 활성화를 유발시키는 기타의 화합물을 인식하는데 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(Akira S and Takeda K, 2004; Peng S, 2005). Toll 수용체에 의해 일부 조절된 선천적 반응의 경로는 침입 유기물에 대한 몸의 최초 반응 중 하나로서, 특정 면역 반응의 B 및 T 세포에 의해 조절되는 잠재 및 특이적 반응을 유발시키는데 필요한 적절한 환경 및 사이토킨 환경을 창출하는데 중요한 역할을 한다(Gay et al., 2006). 인간 세포주 및 1차 세포의 반응성은 일부 Toll형 수용체(TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10)에 기인하며, 이들은 각각 특이적 발현 프로파일, 바람직한 리간드 및 인식 요건을 갖는다.
특히 인간 TLR9는 올리고누클레오티드, 특별히, CpG계 올리고누클레오티드를 인식한다(Hemmi H et al., 2000). CpG2006로 알려진 CpG계 화합물에 의한 TLR9 조절 활성은 세포 산화환원 평형의 변화, 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPKs) 및 NF kappa B를 포함하는 세포 신호 발생 경로의 유발에 변화를 유발하여, 프로염증성 사이토킨, 인터페론, 및 케모킨의 생성 등을 촉발한다(Takeshita F et al., 2001; Hartmann G et al., 2000; Hartmann G and Krieg A, 2000; Ulevitch R, 2004). 인간 무처리 및 기억 B-세포 서브군은, CpG 올리고누클레오티드 같은, 다클론 자극에 응답하여 특이적인 증식 및 분화 특성을 가지며, 그 결과 TLR 발현을 정확히 조절하게 된다(Bernasconi N et al, 2003; Bernasconi N et al, 2002; Bourke E et al., 2003). CpG 올리고누클레오티드는 선천적 면역의 활성을 유발하며 광범위한 병원균으로 일으킨 치사 챌린지를 방어할 수 있다(Krieg A, 2002). 예를 들어, CpG-B 라고 하는 모티프를 함유하는 올리고누클레오티드는 특히 1차 B 세포의 잠재적 활성체이다(Krieg A et al, 1995; Gursel M et al, 2002; Klinman D, 2004; Eaton-Bassiri A et al., 2004).
Toll형 수용체의 길항체 역할을 하는 각종 카테고리의 화합물이 이미 확인되었으며(Coban C et al., 2005; Kandimall ER et al., 2005; Hayashi E et al., 2005; Bourke E et al., 2003; Ambach A et al., 2004; Sen G et al., 2004), 특정한 스크리닝 기술은, 또한 면역글로불린 종류 및 서브종류의 분화를 결정하는데 이용된다(Henault M et al., 2005; Cognass F. et al., 2005).
두번째 그룹의 자극제는 사이토킨, 특히 면역자극 활성을 가진 것으로 알려진 인터루킨(IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13)이 대표적이며, 이는 문헌에 발표된 내용과 비교시 상이했다(Callard R and Kotowicz K "Human B-cell response to cytokine" in Cytokine Cell Biologoy; A practical Approach, Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31).
세번째 그룹의 자극제는 TNF 수용체종의 세포막 수용체 길항제, 특히 NF-kB 경로 활성화 및 APRIL, BAFF, 또는 CD40L 같은, B 세포의 증식시키는 길항제로 대표된다(Schneider P, 2005; He B et al., 2004; Craxton A et al., 2003; Tangye S et al., 2003).
항체분비 세포의 향상 및 불멸화를 위한 단백질의 세포자극 및 발현에서 최적의 효과를 얻기 위하여 자극 단계의 기간 뿐만 아니라, 자극제, 그 조합물의 선 택과 농도를 선택하는 것이 중요하다.
본 발명의 실시예는 바이러스성 불멸화제가 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스인 경우에, 바람직한 자극제는, 다음과 같은 화합물:
a) CpG계 올리고누클레오티드 및 사이토킨의 조합물;
b) TNF 수용체종에 속하는 세포막 수용체의 길항체 및 사이토킨의 조합물
의 조합으로부터 선택할 수 있음을 보여준다.
자극성에 근거하여, CpG2006은 가용성 CD40 리간드 또는 CD40에 대한 길항성 항체와 함께 사용했을 경우(WO 91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L et al., 1997; Imadome K et al., 2003), 불멸화된 인간 B 세포를 생산하는 EBV와 동시에 사용했다(Traggiai et al., 2004; WO 04/76677).
그러나, CpG2006과 같은 다클론 활성체가 세포 배양물에서 클로닝 및/또는 후속의 스크리닝 공정 동안 나타날 수 있는 다양한 세포 종류에 상당한 영향을 미친다고 알려져 있으므로(Hartmann G and Krieg A, 2000; Hartmann G et al., 2000), 상기와 유사한 접근은 불멸화된 B 세포의 유지 및 스크리닝에 부정적인 영향을 미친다. 특히, CpG 는 단핵세포에 의해 IL-12 및 IFN-감마 같은 사이토킨의 잠재적 유발자이며, 위와 같은 사이토킨은 후속의 생분석에서, 특히 항바이러스 항체의 스크리닝시에 존재하지 않아야 한다(Klinman D et al., 1996, Frearon K et al., 2003; Abel K et al., 2005).
본 발명의 실시예는 특정 농도의 화합물을 사용하여 CpG2006 및 IL-2의 조합에 대해 인간 CD22 양성 B 세포의 최적 반응을 얻을 수 있고, 기타 다수의 공지 자 극제(예를 들면, LPS 또는 SAC)가 위와 같은 반응을 제공하지 않는다는 사실을 보여준다.
선택된 항체분비 세포가 자극제에 노출되는 기간은 상기 세포의 불멸화하는 효과적인 방법을 달성하는데 매우 중요하다. 실제로 본 발명의 실시예는 자극제의 조합물(CpG2006 및 IL-2)이 특정 시간 프레임(예를 들어 2일 내지 4일간의 자극) 내에서 세포 생존 및 증식에 최대 효과를 발휘한다는 것을 보여준다. 그러나, 또다른 조합물의 자극제 및 시간 프레임은 EBV 불멸화, 또는 다른 바이러스성 불멸화제에 동등한 효과를 제공할 수 있다.
항체분비 세포로부터 더 바람직한 반응을 이끌어 내는데 유리하다고 확인될 경우, 불멸화 단계 전에, 자극제 조합물을 동시에 또는 순차로 세포배양 배지에 첨가할 수 있다(예를 들면, 최초의 세포 선택 직후 1차 자극제를 첨가하고 수시간 또는 수일 후 2차 자극제를 첨가한다).
자극제는, 예컨대 흡수 및 면역자극 활성을 개선할 수 있는 리포좀 또는 다른 화합물을 이용함으로써, 희석된 원액으로부터 세포배양 배지에 직접 또는 적절히 제형화한 후에 첨가할 수 있다(Gursel I et al. 2001). 자극제는 또한 고체 매트릭스에 부착되어(마이크로비드 또는 세포 배양판 상에 직접), 더 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명에 있어서, 특정 기간 및 특정 단계에서 자극제 부가에 대한 중요성을 관측한 결과, 세포배양 조건하에 후속의 불멸화 및 유지에 일어나는 부정적인 효과를 피하기 위하여, 항체분비 세포는 자극제가 효과적으로 제거되는 방식으로 조절되어야 한다.
따라서, 세포를 신선한 배지로 1회 또는 그 이상 세척하고, 필요할 경우, 자극제 잔류 영향을 약화 및 제거하기 위하여 보통의 세포배양 배지 안에서 소정 기간(예를 들면, 1 내지 6일간) 동안 유지하고, 특정 화합물을 세포 배양물에 첨가하여 억제하기도 한다.
본 발명의 방법은 세포를 자극한 후 및 선택 및 자극된 세포를 불멸화제에 노출하기 전에(예를 들면, 자극 단계 및 불멸화 단계의 사이) 발현된 항체의 아이소타입에 근거하여 선택된 세포에 적용된다.
아이소타입에 기반한 세포 선택은 양성(특정 세포의 분리가 가능한) 또는 음성(원치않는 세포의 제거가 가능한) 방법을 적용하여 실행한다. 예를 들어, 약제학적 용도로 허가된 대부분의 치료용 항체가 IgG인 경우(Laffy E and Sodoyer R, 2005), 자극된 IgG 양성 세포 집단은 양성적으로 선택하거나(FACS 또는 자기성 세포 분리체를 이용하여) 또는 세포 집단으로부터 IgM을 발현하는 세포를 분리함으로써 선택할 수 있으며, 따라서 IgG 발현 세포를 농축하게 된다. 형광활성 또는 자기성 세포 분리체를 이용한 항체분비 세포의 분리 기술은 문헌에 공지되어 있다(Li H et al., 1995; Traggiai E et al., 2004). 항체분비 세포의 공급원 및 이의 최종 용도에 따라, IgD 또는 IgA 발현세포 분리(또는 농축)가 바람직하다.
정밀한 선택이 요구될 경우(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체를 발현하는 인간 B 세포를 분리할 경우), 유사한 접근 방식이 특정 서브군에 근거하여 세포를 분리하는데 이용될 수 있다.
특이적 아이소타입을 가진 항체를 발현하는 선택 및 자극된 세포 집단은 바이러스성 불멸화제를 이용하여 불멸화 처리한다. 공지 문헌에 따르면, 다양한 불멸화제가 항체분비 세포에 이용될 수 있고, 불멸화된 항체분비 세포를 얻기 위하여 때로는 단일 공정에서 조합되기도 한다.
바이러스성 불멸화제 중에서, 항체분비 세포를 감염 및 불멸화하는 바이러스가 본 발명의 방법에 사용된다. 이러한 전제에 따른 바이러스는 일반적으로 림프성 바이러스로 알려져 있으며 감마형 헤르페스바이러스군으로 분류된다. 상기 바이러스종의 물질들은 종 특이성 방식에 따라 림프구를 감염시키며, 림프증식형 질환 및 여러 악성 종양의 발병과 관련이 있다(Nicholas J, 2000; Rickinson A, 2001).
EBV(엡스타인 바르(Epstein-Barr) 바이러스, 또한 헤르페스바이러스 4 라고도 함), 및 HHV-8(인간 헤르페스바이러스 8, 또한 KSHV 라고도 함, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스)는 인간 림프구를 감염 및 불멸화시킨다. MHV-68(뮤린 헤르페스바이러스 68), HVS(헤르페스 바이러스 사미리), RRV(레수스 라디노바이러스), LCV(1차 림포크립토바이러스), EHV-2(에퀸 헤르페스바이러스 2), HVA(헤르페스바이러스 아틀레스), 및 AHV-1(알셀라핀 헤르페스바이러스 1)은 다양한 포유류 숙주세포에서 유사한 병원성을 갖는 것으로서 공통적 유전성을 지닌 기타의 온코겐형(oncogenic), 림프성 헤르페스바이러스이다. 본 발명의 방법이 그러한 포유류로부터 얻은 항체분비 세포에 적용할 때마다 상기의 바이러스들을 이용할 수 있다.
그러나, 특정 바이러스 및 기타의 바이러스에 의해 수득되는 특정의 바이러스성 단백질을 함유하는 재조합 DNA 구조물이 B 세포를 불멸화하기 위하여 성공적 으로 이용되었으므로, 바이러스 전체가 B 세포를 불멸화할 수 있다(Damania B 2004; Kilger E et al., 1998). 바이러스 유전자를 함유한 유사한 벡터들이 세포에 전달되며, 때로는 레트로바이러스계 또는 바이러스성 입자를 이들 입자의 형성을 위한 트랜(tran)에 필요한 모든 변수를 제공하는 세포주 패키지에 이용하며, 상기 벡터들을 본 발명의 방법에 이용할 수도 있다.
불멸화 단계는 1 내지 수시간, 최고 2 내지 4일간 진행할 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 세포의 생존율을 위해 불멸화 단계의 기간을 더 연장하기도 하며, 특히 EBV의 경우, 불멸화된 항체분비 세포를 제공하는 림프아세포의 다클론 집단(대형 바이러스 세포, 현미경 또는 FACS로 측정됨, 도 9 참조)을 완성하기 위하여 최소한 4시간 동안 시행한다.
하기 실시예에서는, CD22 발현을 위해 먼저 선택한 후 적절한 시간동안 자극처리하고(약 2일 내지 4일간) 적절한 자극제 조합물(CpG2006 및 IL-2)을 사용하고, 적절한 아이소타입(IgG 양성 또는 농축물; IgM 음성 또는 분리물)에 근거하여 선택하면, EBV 상층액을 이용하여 인간 B 세포가 효과적으로 불멸화될 수 있다는 것을 보여준다.
B 세포의 EBV 조절 불멸화 처리에는 주요 EBV 수용체로 여겨지는 세포 표면 수용체 CD21의 발현이 필요하다. CD21은 대부분의 B 세포 서브집단에 존재하며 CD19 및 B 세포 항원 수용체와 복합체를 형성함으로써 B 세포 반응을 조절한다(Fearon D and Carroll M, 2000). 그러나, CD21은 세포의 광범위한 활성화 탓에 세포 표면으로부터 손실되며, 이는 플라스마 세포로 변형되기 때문이다. 따라서, EBV를 이용한 세포를 변형하는 능력은 B 세포 자극제의 첨가함으로써 더 커지지만, CD21가 세포 표면에 유지될 수 있는 조건이 요구되며, 이에 따라 EBV 불멸화 효율이 향상된다.
본 발명은 불멸화된 항체분비 세포 집단을 효율적으로 수득할 수 있는 방법을 설명한다. 실제로, 선택 및 불멸화되는 B 세포가 농축된 세포 배양물 집단은 유용한 치료 항체를 생성하기 위해 더욱 큰 유사성을 가지며, 한편으로는 잠재적인, 비융해 상태에서 EBV 바이러스를 이용하여 불멸화될 때 성장하는 능력을 그대로 유지한다. B 세포를 자극하여 IgG를 분비하는 다른 방법들과 달리, 본 발명에 따른 불멸화 방법은 세포 집단이 고증식 상태 및 IgG 분비 능력으로 "포집" 될 수 있도록 해준다. 불멸화된 B 세포 집단으로부터 얻은 상층액으로 원하는 활성을 가진 항체의 존재 여부를 분석한다. 이어서 불멸화된 B 세포 집단을 클론화 처리하여 항체분비 세포의 클론을 분리하고, 다시 분자 접근법에 따라 항체 유전자를 분리하거나 후속 분석에 이용하기 위해 동결 상태로 유지한다.
EBV 조절형 불멸화 처리는 EBV에 의해 발현되는 단백질에 기인하여 B 세포의 불멸화 및 후속으로 EBV 및 숙주세포 단백질 간의 상호 반응에 의해 불멸화가 조절되는 것을 수반하는 복잡한 공정이다(Sugimoto M et al., 2004; Bishop G e and Busch LK, 2002). 실제로, 불멸화 공정은 특정의 EBV 단백질과 EBNA2, EBNA1, LMP2, LMP1, 또는 EBER 같은 전사물의 발현을 측정함으로써 실현될 수 있다(Thorley-Lawson DA, 2001). 이들 단백질은 폴리머라제 사슬 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 면역형광, 웨스턴 블롯, 또는 기타의 방법에 따라 검출할 수 있으며, 이에 따라 감염된 세포 내의 EBV DNA 및 단백질을 검출할 수 있다(Schlee M et al., 2004; Part CH et al., 2004; Hummme S et al., 2003; Konishi K et al., 2001; Haan K et al., 2001).
세포 배양물에 첨가되는 EBV 상층액의 양은 종래 기술에서 통상적으로 제시하는 범위일 수 있으나(10%, 20%, 30%, 또는 그 이상), 본 발명의 방법은 EBV 상층액의 양이 비교적 크면서(50% V/V) 노출 시간은 비교적 짧은(약 4 내지 24 시간) 조건에서 적절히 행할 수 있다.
그러나, 바이러스성 불멸화제는, 예를 들어서, 세포 집단을 세척 및 신선한 세포배양 배지 내에서 배양함으로써 제거된다는 점(자극제에 대해 제시된 것과 마찬가지로)이 중요하다.
본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 EBV 상층액은, 인간 및 설치류 세포 배양물을 감염시키거나, 부분적으로 제거하거나, 또는 균주를 재조합(미니-EBV 및 기타의 EBV계 벡터와 함께)하는 통상의 기술을 이용하고, 그리고 EBV 농축 상층액으로부터 감염된 세포를 분리함으로써 제조할 수 있다(Speck P et al., 1999; Oh HM et al., 2003; Bass H and Darke C, 2004; Radons J et al., 2005; US 5798230).
본 발명의 실시예에 포함된 실험 결과로부터, 다른 불멸화제를 이용하여 유사한 접근이 가능한 것으로 확인된다. 생물 시료에서 얻은 항체분비 세포를 정제하는 선택 방법 및 세포배양 조건, 위에서 정의한 자극제, 및 수시간 내지 수일 범위로 유지된 자극 단계(단, 불멸화 단계로부터 분리됨) 등을 적절히 조합함으로써, EBV 뿐만 아니라 기타의 온코겐 바이러스 및/또는 온코겐에 의해 조절된 변형에 의해 감염된 것과 같은 다른 불멸화제에 의해 조절된 불멸화 처리 효과를 향상시킬 수 있다. 예컨대, 온코겐 바이러스를 이용한 감염 및/또는 온코겐에 의해 조절된 변형 처리를 개선할 수 있다.
세포 배양물에서 바이러스성 불멸화제를 제거한 후, 그 결과로 나온 세포 집단은 세포의 사멸 또는 분화 없이, 올리고클론 및 단클론 세포 배양물 형성에 무용할 뿐만 아니라 세포배양 배지 내에 물질을 방출하는 생존 및 증식형 림프아세포에 농축되며(다른 방법과 비교시)(도 9 참조), 상기 배지는 선택 및 자극된 세포의 성장, 증식, 및/또는 항체 분비에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
이 점에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 얻은 다클론 세포 집단은 다클론 집단을 분리하여 얻은 올리고클론 또는 단클론 세포 집단(불멸화된 항체분비 세포를 함유하는)과 마찬가지로 특히 유용하다.
세포 집단은 일련의 처리 과정 특히, 항체 분리, 특징화 및 생산 과정에 이용할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 특이적인 아이소타입의 항체를 코드화하는 DNA 서열을 가진 DNA 라이브러리로서 이 라이브러리는 세포 집단으로부터 분리된 핵산을 이용하여 제조한다. 통상의 분자 생물학적 기술을 이용하여 mRNA 또는 유전자 DNA를 세포 시료로부터 추출할 수 있다. 또한 면역 동물 또는 하이브리도마에 관한 공지 기술에서 기술한 바와 같이, 스크린될 재조합 단백질로서 상기 서열을 발현하는 범위에서 전체 또는 부분적으로(예, 항원을 결합하는 가변적 영역에서만), 항체를 코드화하는 시료에 존재하는 모든 서열을 역전사 처리(필요시) 및 증폭시킨 다(Gilliland LK et al., 1996; Lightwood D et al., 2006).
따라서, 본 발명의 방법은 바람직한 항원결합 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 확인 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포 집단, 세포 배양물, 세포 배양물 상층액 및 DNA 라이브러리를 제공한다.
대안적으로, 상기 생물학적 생성물은, 개체로부터 취한 항체분비 세포에서 수득한 경우, 특정의 개체에서 동종 또는 이종 항원, 바이러스, 박테리아 세포, 독소, 기생충 또는 백신에 대해 아이소타입 특이적 면역 반응성을 결정하는데 이용할 수 있다(예를 들어, 주로 생성되는 항체 및/또는 면역계에서 주로 인지되는 항원을 동정할 때).
광범위한 용도 및 안정성(동결 시료의 경우)을 위하여, 상기 생물학적 생성물(예를 들면, 본 발명에 따른 세포 집단, 세포 배양물, 세포 배양물 상층액 및 DNA 라이브러리)은 항원결합 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 동정 및 제조하기 위한 키트에 수용할 수 있다. 예를 들어, 키트 사용자는 실험실에서 세포 배양물 상층액 또는 DNA 라이브러리 패널을 원하는 특성을 가진 단클론 항체의 스크리닝에 사용할 수 있다.
본 발명은 상술한 방법을 이용하여 수득한 불멸화된 항체분비 세포의 다클론 집단을 제공한다. 이 세포 집단은 원하는 항체 특이성, 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 분비하는 세포 배양물을 제조하는 방법에 이용할 수 있으며, 상기 방법은:
a) 각각 50개 또는 그 이상의 세포를 함유하는 세포 배양물에서 제 5항에 따 른 세포 집단 또는 제 6항에 따른 세포 배양물을 분리하는 단계;
b) 원하는 항원결합 특이성 및/또는 생물 활성을 나타내는 세포를 검출하기 위한 세포 배양물의 상층액을 스크리닝하는 단계;
c) 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 나타내는 세포 배양물을 분리하는 단계; 및
d) 세포 배양물의 상층액 내에서 원하는 항원결합 특이성, 및/또는 생물 활성을 갖는 단클론 항체를 분비하는, 하나 또는 그 이상의 세포 배양물을 얻을 때까지 상기 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함한다.
대안적으로, 상기 세포 집단은 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 갖는 단클론 항체를 분비하는 세포 배양물을 제조하는 방법에 이용할 수 있으며 상기 방법은:
a) 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 갖는 항체를 분비하는 하나 또는 그 이상의 세포 배양물을 검출하기 위해 청구항 6에 따른 다수의 세포 집단으로부터 수득된 세포 배양물의 상층액을 스크리닝하는 단계;
b) 상기 상층액에서 상기 활성을 나타내는 각 세포 배양물이 분비하는 항체 서열을 결정하는 단계; 및
c) 상기 활성을 갖는 세포 배양물 상층액에서 단클론 항체를 분비하는 세포 배양물을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 방법을 실행하기 위하여, 다클론, 올리고클론 및 단클론 세포 집단은 세포 배양물 상층액 내에서 이들이 분비하는 항체의 특성 특히, 항원결합성 및/또는 기능적 활성을 측정하는 적절한 세포배양 조건으로 유지해야 한다.
이점에 있어서, 불멸화 단계 이후 세포배양 조건을 선택하는 것은 불멸화된 항체분비 세포의 생존, 증식 및 항체 분비를 지원함에 있어서 매우 중요하다.
본 명세서에서, 세포배양 조건의 선택은 올리고클론 및 단클론 세포 배양물을 형성, 선택 및 성장함에 있어서 매우 중요할 수 있다. 본 발명의 범위에서, 항체분비 세포의 풀(pool)은 B 세포 성장을 자극하는 하나 이상의 작용제를 포함하는 세포배양 배지에서 유지될 수 있다.
EBV 조절 불멸화에 있어서, EBV 감염은 세포의 생존율, 증식 및 IgG 생성을 향상하기 위해 잠복 단계로 유지된다. 그러나, 특정의 세포배양 조건을 선택함으로써, 과거의 연구에서 다룬 바와 같이 대상이 되는 단클론 세포 배양물의 선택 및 클로닝 효율을 개선할 수 있다(James K and Bell G, 1987).
본 발명의 중요한 제1 측면은 세포가 저밀도로 배양될 때 불멸화 단계에 따른 항체분비 세포를 배양하는데 이용되는 공급층을 제공하는 것이다. 공급층은 조사처리된 비/알로젠 말초혈 세포 조제물, 림프아세포형 또는 림프아세포 세포주, 척수혈 림프구 또는 각종 배아 세포로 구성될 수 있다. 상술한 특성을 가진 세포주의 예를 들면, EL4-B5 즉, B 세포의 성장 및 증식을 효과적으로 지원하는 돌연변이성 EL4 티로마 세포주이다(Ifversen P et al., 1993; Wen et al., 1987).
본 발명의 중요한 제2 측면은 용기를 사용하여 배양물에 세포를 유지하는 방법을 제공하는 것이다. 다양한 방법 및 재료를 이용할 수 있으며 고정 배양(웰 또는 플라스크), 균질한 현탁 배양(연속 교반 반응기 또는 롤러 병), 또는 부동화 배 양(중공형 섬유 또는 기타 지지물) 등이 여기에 포함된다.
본 발명의 중요한 제3 측면은 본 발명의 방법을 실행하고 또한, 불멸화 단계후 세포를 배양할 때 세포의 생존 및 성장을 유지할 수 있는 세포배양 배지를 선택하는 것이다. 특히 후자의 단계에서, 세포배양 배지(예, IMDM 또는 RPMI-1640) 및 세포 영양물(예, 아미노산, 혈청)의 선택은 올리고클론 세포 배양물과 같이 낮은 세포밀도로 시드처리한 경우에도 세포 집단의 성장 및 복제를 향상시키는데 중요하다.
마지막으로, 본 발명의 중요한 제4 측면은 상술한 바와 같이 자극 단계에 이용된 물질(예, CpG계 올리고누클레오티드, 인터레우킨) 또는 4-히드록시노네날(Ranjan D et al., 2005), 티오레독신(Wendel-Hansen V et al., 1994), 가용성 CD40 리간드 또는 CD40에 대한 길항성 항체(WO 91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L et al., 1997; Imadome K et al., 2003) 또는 시클로스포린(Tanner JE and Menezes J, 1994; Chen C et al., 2001) 같이, 특히 EBV 불멸화 처리후의 불멸화된 항체분비 세포에서 유사한 성장촉진 효과를 나타내는 것으로 알려진 기타의 화합물 등 특정의 B 세포 성장 촉진제를 세포배양 배지에 첨가하는 것이다(Ranjan D et al., 2005).
B 세포 성장촉진제, 촉진제가 가해지는 기간(예, 세포 불멸화 처리 직후 및 몇일 동안)을 선택하는 것은 후속 사용될 스크리닝 분석법의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 촉진제를 세포 분석시 타겟 세포의 반응을 변화시켜 차단할 경우, 특정의 작용제를 세포배양 배지로부터 제거 또는 다른 것으로 치환하지 않는 한 세포 반응물을 분석에 직접 응용할 수 없다. 또한, 항체는 세포 배양물 상층액으로부터 일부만 정제되기도 한다(예, 단백질 침전, 투석 및/또는 친화성 정제법에 의해). 그러나, 세포 풀(pool)을 시딩한 후 가능한 빨리 스크리닝 분석을 시행하는 것이 바람직하며, 이 때 B 세포 성장 촉진제(또는 세포 배양물 상층액에 존재하는 기타 성분들)는, 스크리닝 분석에서 문제를 일으키지 않는 적절한 조건 설정, 세포 세척 또는 세포배양 배지의 교체 등을 통해 제거할 필요가 없다.
항체 생성 세포는 본 발명의 방법에 따라 분리, 자극 및 불멸화되며 따라서, 여러개의 풀(pool)로 분할하기 전 수일간(예, 1 내지 10일, 또는 이보다 긴 2 내지 4주간) 벌크 배양물로 유지할 수 있다. 상기 풀(pool)은 각각 독립적으로 배양할 세포 집단을 나타낸다(예 6-, 12-, 24-, 32- 또는 96-웰 플레이트).
세포배양 조건 하에 존재하는 벌크형 다클론 세포 집단은 공여체를 선택하기 위해 이미 혈청에서 실시한 분석법 또는, 세포의 용도를 고려한 기타의 분석법을 통해 시험하여 세포의 존재를 확인할 수 있다. 더욱이, 다클론 세포 집단의 일부 분취물은 바이알에 넣어 동결 세포로 저장하고 (통상 형성된 포유류 세포주에 대하여 수행되) 추후 이용하기 위해 해동 및 배양한다.
세포 풀은 다수이며 이들은 10 내지 수백(또는 실시예 3에서 보는 바와 같이 수천)에 이르는 것으로, 각각 통계적으로 10, 102, 103, 104, 105 또는 그 이상의 세포를 갖는다. 본 실시예는 항체를 분비하는 세포 배양물을 5, 20, 50 및 100개의 세포를 통계적으로 함유하는 세포 집단으로부터 시작하여 형성하는 방법을 보여준 다. 수일후(예, 1 내지 10일, 또는 이보다 긴 2 내지 4주간), 상기 세포 풀은 세포 기반 분석 또는 결합 분석에서 세포 배양물 상층액을 사용하여(직접 또는 여기에 포함된 항체의 일부 정제후) 특징화하기에 충분한 양의 분비 항체를 포함한다.
적어도 103, 104 또는 105세포를 함유하는 세포 배양물은 세포 배양물 상층액에 축적된 소정량의 항체를 분비할 수 있으며(총량의 1 내지 30㎍/ml 또는 그 이상), 이는 ELISA 키트를 이용하여 쉽게 측정할 수 있으며 시험관내 분석에 충분한 양이다. 또한, 105, 104, 103 또는 그 미만의 세포도 이들 세포에서 mRNA를 추출, 증폭, 클로닝 및 서열화함으로써 분비된 항체의 서열을 얻는데 충분하다(실시예 3).
따라서, 세포 배양물 상층액의 분취물을 고처리방식으로 결합 및/또는 기능 활성을 스크리닝할 수 있으며 이 결과, 대등한 실험에서 일련의 희석된 배양물 상층액을 또는 부분 정제된 항체 조제물(예, 단백질 A 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 수득됨)을 이용하여 약량 반응 분석법을 통해 바람직한 활성을 나타내는 양성 웰을 동정할 수 있다.
양성 세포 풀(즉, 원하는 항원특이성 및/또는 생물 활성을 나타내는 풀(pool))은, 세포 배양물의 레벨로 스크리닝하는 것을 제한하기 위한 새로운 세포 풀군을 구성하고, 따라서 적어도 초기 스크리닝 분석 레벨에서, 바람직한 특이성 및 활성을 갖는 단클론 항체를 분비하는 세포 배양물을 분리하는데 이용할 수 있다. 선택된 단클론 항체는 다시 다른 더 바람직한 기능 분석법을 이용하여 재평가 하고 또한, B 세포에 응용하는 재조합 DNA 기술을 통해 안정한 EVB-불멸화된 클론으로부터 분리한 후, 아이소타입 및 VH/VL 서열의 레벨에서 특징화한다.
관련 모델 및 임상 실험을 통해 얻은 데이터에 의해 확증될 경우, 초기 특징화는 진단 및/또는 치료 용도로서 상기 상층액으로부터 정제된(또는 재조합 단백질로서 후에 발현될) 단클론 항체의 동정을 유도할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라불멸화된 초기 세포 집단이 인간 B 세포의 IgG 양성 집단인 경우, 상기 단클론 항체는 인간의 감염 및 질환을 치료하는데 직접 이용할 수 있는 인간 단클론 IgG 항체이다.
항체 제조는, 선택된 항체의 전체 중사슬 및 경사슬(또는 그들의 항체결합 영역만)을 코드화하는 클론화된 서열이 벡터를 이용하여 클론화 및 재조합 단백질로 발현되는 포유류, 박테리아, 또는 식물 세포계를 이용하여 확대할 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직한 항원 특이성 및/또는 생물 활성에 근거하여 분리될 수 있는 항체분비 세포의 불멸화된 올리고클론 및 단클론 세포 배양물을 제공하며, 상기 특성은 초기 다클론 항체분비 세포 집단 및 항체분비 세포의 올리고클론 또는 단클론 세포 배양물로부터 수득한 세포 배양물 상층액을 스크리닝함으로써 결정할 수 있다. 이들 세포는 바람직한 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 가진 단클론 항체를 동정 및 제조하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 범위에서, 특정의 기술을 수정하여 자동화하고 이에 따라 각종 단클론 세포 배양물로부터 항체의 생성이 크게 증가할 수 있다(Chambers R. 2OO5).
세포 배양물 상층액 및 정제된 조제물을 이용한 스크리닝 분석은 고도의 가 능한 정밀성으로 원하는 항체를 검출하기 위해 선택 및 실행된다. 스크리닝 분석은 적절한 양성 및 음성 대조군(예, 다른 스크리닝에 기원하거나 상용 원료로부터 얻은 다른 항체)를 포함하며 원하는 용도(예, 진단, 치료 또는 예방의 용도)에 적합한 농도 범위에서 결합 활성 및/또는 기능 활성을 측정하기에 충분한 감도를 가져야 한다.
예를 들어, 항체가 치료 조성물로 이용될 예정이면, 분석시 100, 10 또는 1㎍/ml(또는 그 이하)의 항체 농도로서 검출될 수 있는 최대 활성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 항체의 초기 특징화 단계에서, 분석 측정된 활성도는 통상, 치료에 유용한 활성도에 관하여 예측하기에 충분한 감도이다. 정제 또는 재조합 IgG에 대한 또다른 분석은 치료 효능 및 투여가능한 약량 측면에서 더욱 중요하다.
스크리닝 분석은, 항체의 항원 결합 특이성 및/또는 생물 활성을 측정하기 위한 것이며, 정제된 자가/알로항원(인간, 포유류, 박테리아, 바이러스, 기생충, 유기물, 화학물질 및 기타 다른 항원성/알러지성 화합물)을 이용할 수 있고 또한, 세포, 조직, 바이러스나 동물 모델에 대한 영향 또는 항원과의 상호작용의 특이성을 나타내기 위한 세포 분석법 또는 생화학 분석법에 포함된다.
대안적으로, 상기 분석은 세포나 조직같은 복합적인 생물학적 무정제 타겟 에 대한 항원 결합 특이성 및/또는 생물 활성을 측정하기 위한 것이다(예, 상피세포내의 이동, 온코겐 세포 성장 등).
세포배양 조건 하에 다클론 또는, 더 바람직하게는 올리고클론 세포 집단에서 실행한 이러한 분석의 결과를 냉동 바이알에 보관하거나 또는, 하나 이상의 특이적 아이소타입 항체를 코드화할 DNA 서열을 포함하는 DNA 라이브러리 구축을 위해 이용된다.
단클론 항체의 특정 용도와 연계할 수 있으며 또한 항체의 고 특징화 및 정밀도를 실현할 수 있는 시험관내 항체 스크리닝에 관한 공지 문헌에 다수의 기술이 개시되어 있다. 면역침전, 웨스턴 블롯, ELISA 및 면역형광 등의 전통적인 기술 이외에도, 소기관 세포/기관 배양물, 조각편 또는 다색의 나노입자 등에 대해 효과적인 스크리닝 분석으로서 보다 고도의 접근법이 있다(Bradbury A et al., 2003; Haab BB, 2005; Lal SP et al., 2002; Olivo P, 1996; Potera C, 2005; WO 05/82926; WO 05/003379; WO 05/83064; WO 05/76013).
항원분비 세포의 기원 및 특정의 단클론 세포 배양물을 선택하고 단클론 항체를 특징화하는 스크리닝 분석에 따라, 진단 툴(바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염, 종양 또는 세포 타이핑 등을 위한), 예방 또는 치료용 툴(특히, 악성종양, 감염, 면역조절 또는 염증성 질환의 치료나 이식 환자의 관리 등), 면역계 및 일반적으로 임상적 항원의 조사 등과 같이 상기 항체를 이용하는 다양한 방법을 구상할 수 있다. 따라서, 이들 항체 특히 인간 단클론 항체는, 단클론 항체 또는 항체 단편, 또한 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 조제하고, 환자 치료용 약제를 제조하고, 또한 인간에서 감염성, 온코겐, 자가면역 또는 알러지성 질환을 치료하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 다음과 같은 단계:
a) 상술한 방법에 의해 생성된 세포 배양물을 확대하는 단계; 및
b) 상기 세포 배양물의 상층액으로부터 단클론 항체를 정제하는 단계를 포함하는 단클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
특히, EBV 불멸화의 확실한 장점은 분비된 항체의 초기 특징화 및 효능화를 행한 후 세포 배양물을 직접 이용하여 충분한 양의 항체를 정제하고 (㎍ 단위에서 mg 단위의 범위까지), 따라서 시험관내 또는 체내 분석(추후의 생화학, 조직 또는 세포 분석법, 설치류에 대해 확립한 질병 모델, 친화성 측정을 위한 생물리학적 방법, 에피토프 매핑 등)을 통해 항체의 특징화 및 효능화를 더욱 확대할 수 있다.
본 발명의 범위에서, 상기 배양물의 클론성을 조절한 후, 초기의 세포 배양물은 세포 성장을 유지하고 항체 발현 및 분비를 개선하기 위한 배양물 배지 및 조건을 적절히 수정하여 최적화할 수 있다(Ling N, 2000). 항체는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 복합 단백질 혼합물로부터 항체를 분리하는 공지 기술을 적용하여 세포 배양물 상층액으로부터 정제할 수 있다(Nisnevitch M and Firer MA, 2001; Huse K et al., 2002). 이러한 항체 정제 방법은 단백질 A, 단백질 G 같은 기질 또는 합성 기질에 있어서 항체의 일반 친화성에 기초하며(Verdoliva A et al, 2002; Roque AC et al., 2004; Danczyk R et al., 2003), 또한 항원이나 에피토프계 친화성 크로마토그래피에 의해 수행된다(Murray A et al., 2002; Sun L et al., 2003; Jensen LB et al., 2004). 다른 항체 조제 분리 장치는 예를 들어 전기영동법에 기초하여 제작하였다(Thomas TM et al., 2003).
단클론 세포 배양물 역시, 적절한 숙주세포 내에서 재조합 항체의 발현을 행하기에 앞서 상기 세포 배양물을 벡터 내에서 증폭 및 클론화하여 단클론 항체를 코드화하는 DNA 서열을 동정하는데 이용할 수 있다. 선택된 클론 세포 배양물이 분비한 항체의 단백질 서열은, 상기 항체를 코드화하는 핵산을 공지의 재조합 DNA 기술로 분리함으로써 쉽게 결정할 수 있다(Poul MA et al., 1995; Jovelin F et al., 1995; Heinrichs A et al., 1995; Dattamajumdar AK et al., 1996; Norderhaug L et al., 1997; Chardes T et al., 1999; Jarrin A and Andrieux A, 1999; Essono S et al., 2003).
상기 기술들은 또한 치료 항체의 구조적 및 기능적 특징화와 최적화(Kim SJ et al., 2005), 또는 단클론 항체의 안정한 체내 전달을 가능하게 하는 벡터를 생성(Fang J et al., 2005)하는 데 이용할 수 있다.
요약하면, mRNA는 세포 배양물로부터 조제 및 cDNA 라이브러리로 역전사되어, 전체 중사슬 및 경사슬 또는 이들 사슬의 일부(가변 영역 등)만을 특이적으로 증폭시키는 프라이머 분해를 포함하여, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 템플레이트로 사용할 수 있다. (항원 결합에 응답하여) 가변 영역만 분리하는 경우, 이들 서열은 원하는 아이소타입의 소정 영역(Fc)에 대해 이 서열을 융합시킬 수 있는 벡터에 클론화할 수 있다(예를 들어, 인간 IgG 감마). PCR 증폭된 DNA 단편은 수정자 또는 제한 부위를 이용하여 재조합 단백질로서 항체를 발현하기 위한 다른 벡터에서 수정 및 재클론화할 수 있는 코딩 서열을 서열화하는 벡터 속으로 직접 서열화 또는 클론화할 수 있다.
다클론 또는 올리고클론 세포 집단의 mRNA는 또한 파지 표시 라이브러리, 박테리아 라이브러리, 이스트 라이브러리, 또는 DNA, 특히 단백질을 코드화하는 DNA 를 복제 및 유지하는데 이용할 수 있는 기타 다른 생물학적 라리브러리 포맷으로 활용될 수 있는 특정 아이소타입의 항체분비 세포에 대해 특이적인 cDNA 라이브러리를 구축하는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 올리고클론 세포 집단으로부터 추출된 mRNA를 이용하여 재조합 항체 서열 라이브러리를 생성할 수 있으며,이것을 이용하여 박테리아 또는 진핵 숙주세포에서 항체를 제조한 뒤, 원하는 항원 특이성 및/또는 생물 활성을 갖는 하나 이상의 항체를 동정하는 범위에서 항체를 스크리닝할 수 있다.
클론화 및 특징화 처리후, 항체는 원핵세포 기관 내에서(예, E. coli; Sorensen H and Mortensen K, 2005; Venturi et al., 2002), 또는 진핵세포 특히 인간, 설치류, 또는 전이 세포 또는 안정한 변형 세포로서 높은 발현 레벨을 가질 수 있는 기타의 진핵세포주 내에서(예, CHO, COS, HEK293) 재조합 단백질로 발현될 수 있다(Schmidt, 2004). 특히 체내 분석을 포함한 보다 고도한 분석법을 이용하여 항체의 특징화를 실행할 때 위와 같은 처리가 필요하다. 숙주 세포는 클론화된 단클론 항체의 재조합 발현 레벨에 기준하여 선택할 수 있다.
본 발명의 범위에서, 클론화된 항체 서열은 DNA 레벨 단독에서(예, 제한 부위의 소거 또는 추가, 코돈 용도로 최적화, 전사 및/또는 번역 조절 서열의 수정) 또는 DNA와 단백질 레벨에서(예, 기타 단백질 서열의 첨가 또는 내부 아미노산의 변형) PCR 또는 다른 재조합 DNA 기술을 이용하여 변형시킬 수 있다. 또한, 이들 항체에 근거한 융해 단백질 또는 단편(Fv, Fab, F(ab)' 또는 F(ab)")을 재조합 DNA 기술을 이용하여 조제할 수 있다.
예를 들어, 재조합 항체는 가변 영역에 융합될 특정 Fc를 선택하거나(Furebring C et al., 2002), 안정한 펩티드 서열을 추가하거나(WO 01/49713), 재조합 단일 사슬 항체 단편을 생성하거나(Gilliland LK et al., 1996), 또는 화학변성 잔사에 방사화학물 또는 고분자를 첨가하여 구조 및/또는 활성 레벨에서 변형시킬 수 있다(Chapman A et al., 1999).
다양한 벡터계를 이용하여 안정한 트랜스펙트 세포주의 풀을 형성하였다(Aldrich TL et al., 2003; Bianchi A and McGrew JT, 2003). 재조합 항체의 고레벨, 최적 및 안정한 발현은, 세포배양 조건의 최적화에 따라(Grunberg J et al., 2003; Yoon SK et al., 2004) 또한 항체 생산성이 고레벨인 클론을 선택 및 가공함으로써(Bohm E et al., 2004; Borth N, 2002; Chen K et al., 2001; Butler M, 2005) 달성되었다.
상술한 기술 및 기타 공지 기술에 따라(Hale G et al., 2004; Horenstein AL et al., 2003) 세포 배양물로부터 비/재조합 항체를 정제할 수 있다. 그러나 임상적 개발 및 용도는 항체에 관한 약동학 및 약력학에 따른 특징화에 근거하며(Lobo E et al., 2004), 치료 용도의 뮤린, 인간 및 가공된 단클론 항체 생산 및 품질 관리와 또한 인간에 대한 체내 진단 용도에 관한 국제적 조건을 준수하여야 한다(EUDRA 문서 3AB4a).
본 발명을 다음의 실시예에 대해 상세히 기술하나, 이들은 본 발명을 한정하기 위한 것으로 해석해서는 안된다.
실시예
실시예 1: 세포배양 조건 하에서 B 세포의 생존률 및 증식에 대한 자극 및 세포 정제 방법의 효과
재료와 방법
인간 B 세포의 분리 및 관리
신선한 말초혈 단클론 세포(PBMC)를 Ficoll/Hypaque 상에서 종래의 밀도구배 원심분리법에 의해 말초혈로부터 정제하였다. 실험에 따라, PBMC를 이용하여 단일 공여체로부터 세포를 가공하거나 서로 상이한 5개의 공여체로부터 얻은 PBMC 풀을 이용하여 가공했다. 그 결과, 상이한 실험 조건에 대한 평균적인 반응을 평가하고 공여체 변화도로 인해 그 상이성이 제한된다.
인간 B 세포는 제조자가 소개한 바와 같이 VarioMACS 기술을 이용하여(Miltenyi Biotec Inc.) 면역성 세포를 분류함으로써 PBMC로부터 분리되었다. 간단히 말하면, PBMC는 0.5% BSA(소혈청 알부민) 및 2mM EDTA(에틸렌-N,N,N',N'-테트라아세테이트)을 보충한 PBS(인산 완충 염수)에 현탁하고 (CD19, CD22 또는 CD27에 대한)상이한 마이크로비드 결합 항체로 배양했다. 마이크로비드 결합 세포는 세척후 자기장 하에 양성 선택용 컬럼(LS 컬럼; Miltenyi cod. 30-042-401)에 통과시켰다. 이 세포는 제조자의 지침에 따라 4℃ 에서 10분간 MACS MultiSort 유출 시약(20㎕/ml)를 이용하여 마이크로비드로부터 배출했다(Miltenyi Biotec Inc.).
IgG 양성 B 세포는 제조자의 지침에 따라, 세포 분류를 통한 IgM 양성 세포의 음성 선택 또는 VarioMACS 기술(Miltenyi Biotec Inc.)을 이용한 IgG 양성 세포의 자기성 선택에 의해 수득했다. 세포 분류에 있어서, CD22 양성 B 세포는(사전자 극이 있거나 없이) 1시간 동안 얼음상에서 항 인간 IgM-FITC(Becton Dickinson n.555782)의 최적 농도로써 배양되었다. 세포를 PBS로 충분히 세척한 후 멸균 조건 하에 고속 세포 분류기(MoFlo® 고성능 세포 분류기)를 이용하여 IgM 양성 및 IgM 음성 세포로 분류했다.
선택된 세포는 10%(V/V) 열적-비활성화 FCS(태아소 혈청), 1mM 피루브산 나트륨, 100 ug/ml의 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린으로 현탁처리한 RPMI-1640 세포배양 배지에 현탁 및 유지한 후, 37℃의 24-웰 플레이트에서 5% CO2 하에 배양되었다.
세포 배양중 B 세포의 자극
CpG2006(5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'; SEQ ID NO: 1)를 Coley Pharmaceutical Group 에서 구입했다. 재조합 인간 인터레우킨 2(IL-2)는 Roche 에서 구입했다. 재조합 인간 인터레우킨 4(IL-4)는 Peprotech 에서 구입했다. 재조합 인간 CD40 리간드(아미노산 108-261을 포함하는 가용성 단편)을 R & D 시스템에서 구입했다. 스트렙토코쿠스 아우레스 코완 균주(SAC) 및 지질다당류(LPS)는 Sigma 에서 구입했다.
3
H-
티미딘
흡수에 의한 B 세포 증식의 측정
96-웰 플레이트(50㎕/웰)에 지시된 배양물 조건하에 3중 시료로서 세포(2×106/ml)를 배양하고, 실험 종료 8 내지 16시간 전에(0.5μCi/웰) 첨가한 3H-티미딘(NET-0.27 X 티미딘, 메틸-3H; 비중 20 Ci/mmol; PerkinElmer)으로 라벨화했다. 세포를 유리 섬유 필터에 수득하여 베타 카운터(Wallach Instrument)를 이용하여 계수함으로써 3H-티미딘 흡수량을 측정했다.
FACS
를 이용한 표면
마커
발현의 분석
0.5% 소혈청 알부민을 함유한 PBS에 세포(3×105/시료)를 현탁하고 4℃에서 30분간, FITC로 라벨화된 CD22에 대한 단클론 항체로 배양했다. 세척후, FACSCalibur 유체 세포측정기 및 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 형광성을 분석했다. 단클론 항체의 백그라운드 결합 활성을 아이소타입을 만족하는 음성 대조군 단클론 항체로 계산했다. 분석한 세포수는 10,000 이었다.
FAC
기반 세포 분류
세포 분류는 MoFlo® 고성능 세포 분류기(Dako)를 이용하여 실행하고 IgG 발현 세포의 음성 선택은 항인간 단클론 IgM-FITC(10㎕/106 세포; Becon Dickinson Cat. No. 555782) 또는 항인간 다클론 IgM FITC(2㎕/106 세포; Jackson, Cat. No. 309-096-043)을 이용하여 4℃에서 1시간 동안 배양한 세포(107/ml)에서 출발하여 수행했다. 세포를 세척한 뒤 분류용 완충액(5mM EDTA, 25mM Hepes 및 1% FCS를 함유한 PBS)에 현탁했다(10-20×106/ml). 형태 변수(R1)에 근거하여 세포를 게이트하였다. R1 영역 내에서 CD22 양성, IgM 음성 B 세포를 선택했다.
결과
공지 문헌에는 세포배양 조건 하에 세포 생존 및 증식에 관하여 B 세포의 정제 및 자극을 위한 다각적인 접근 효과에 대한 비교 정보가 부족하다.
인터레우킨 2(IL-2)를 기준 화합물로 이용하여, 세포 배양물에서 1차 인간 B 세포에 대한 상기 사이토킨의 성장촉진 효과를 보다 구체적으로 나타내었다(Bancheareau J and Rousset F, 1992). 인간 PBMC에서 정제된 1차 B 세포를 이용하여 표면상에서 CD22 표면 발현에 근거하여 1차 비교하고, 공지의 다클론 B 세포 자극제, 즉, CpG2006, 지질다당류(LPS), 가용성 CD40 리간드(CD40L) 및 스타필로코쿠스 아우레스 코완 균주(SAC)로 공동 자극시켰다.
4일 3H 티미딘 흡수 분석법에서, LPS, SAC 및 CD40L를 IL-2와 함께 세포 배양물에 첨가했을 때 세포 증식에 대한 양성 약량 반응을 측정하였다. 그러나, 문헌(Bernasconi N et al., 2003; Traggiai E et al., 2004)에 기술된 농도와 함께 CpG2006의 조합은, IL-2와 조합시 이 화합물이 세포 배양물 내의 B 세포 증식을 유발하는 현저히 우수한 잠재력을 갖는 것을 보여준다(도 2). CpG2006 및 IL-2의 조합으로 얻은 바와 유사하게, 가용성 CD40L(최소 0.5㎍/ml의 농도)를 또다른 사이토킨 IL-4(최소 20ng/ml)과 조합하여 상기 분석법으로 증식 유발 효과를 확인하였고 이 결과는 IgG 분비에 대한 최적의 반응속도 및 효과 측정시 화합물의 조합이 본 발명의 방법에 자극제로 사용할 수 있음을 제안한다.
IL-2 및 CpG2006의 조합으로 효과 정도를 확인하고, IL-2의 농도를 일정하게 유지하면서 CpG2006 농도 0 내지 2.5㎍/ml의 범위를 이용하여 최적의 B 세포 증식 및 블라스트 형성에 대한 CpG2006의 적정을 실행하였다.
가능한 낮은 0.15㎍/ml의 농도에서 CD22 양성 인간 B 세포의 CpG2006 유발 증식이 현저한 것으로 검출되었으며, 0.3㎍/ml에서 고원 평탄부에 도달했다(도 3A). 동일한 세포 집단은 생존 세포 및 블라스트(고 전향 스캐터의 대형 세포)의 백분율에 대해 FACS로 분석했을 때, 상기 농도에서 블라스트 세포의 백분율이 상승한 이후 최적의 CpG2006 농도는 다소 높은 상태로 나타난다(0.6 내지 1.25㎍/ml)(도 3B).
이전의 결과를 확인하는 한편 CpG2006/IL-2 조합에 대한 상기와 같은 확인된 사실은 1㎍/ml 이하의 농도에서 CpG2006의 B 세포 자극 효과를 나타내는 것으로, CpG2006 농도(0.3 내지 1㎍/ml) 범위에서, 자극된 CD22 양성 B 세포의 증식 및 블라스트가 형성될 수 있음을 보여준다.
이들 실험에서 IL-2는 소정 농도(1000 U/ml)로 첨가하였으나, CpG2006의 존재하에 인간 B 세포 증식 및 블라스트 형성을 유발할 수 있는 IL-2의 최적 농도를 한정하기 위하여 CpG2006의 농도를 일정하게 유지하는 한편, 상이한 농도의 IL-2을 추가하는 경우에도 유사한 약량 반응을 행할 수 있다. 후속 실험에서도 마찬가지로 IL-2가 100 내지 1000 U/ml의 농도로 사용될 수 있음을 보여주었다.
따라서, 다클론 B 세포 자극제의 선택과 함께 특정 화합물의 첨가 농도(단독 또는 조합물 형태로)를 결정하는 것도 세포 증식에 대하여 바람직한 효과를 달성하는데 중요하다. CpG2006계 활성화제 및 사이토킨에 대한 B 세포의 반응성 및 증식 반응을 CD19/CD27 양성 세포에 대해 나타내었다(Bernasconi et al., 2002; Jung J et al., 2002). 그러나, 문헌(Hartmann et al., 2000; Klinmann D et al., 1996; Fearon K et al., 2003)에 공지된 B 세포 생존율에 대한 CpG2006의 음성 효과는 적어도 부분적으로 특정한 조건, 농도 및 화합물의 조합을 응용함으로써 저하되는 것으로 입증된다.
생물 시료로부터 1차 B 세포를 정제하는 방법은 상기 1차 B 세포의 생존 및 증식이 세포배양 조건 및 시험관내 조정에 의해 자극제의 존재하에 위험이 없는 공정을 완성하는 또다른 해법이 될 수 있다.
2개의 세포 표면 마커는 예를 들어, 고형 지지물 CD19 및 CD22를 이용하여 인간 B 세포를 양성적으로 선택하는데 유용한 것으로 문헌에 이미 공지되어 있다. IL-2 및 CpG2006을 조합하는 자극 프로토콜은 CD19 또는 CD22 특이적 마이크로비드로 정제한 인간 B 세포에 적용되었다.
세포 생존 및 블라스트 형성의 FACS계 분석은 자극 전후에 실행되었다. 두가지 접근법을 세포 정제에 관하여 비교한 결과, 정제 직후 CD22 양성 세포 집단이 CD19 양성 집단보다 더 균질한 것으로 확인되었다(도 4A). 정제에 대한 이 세포 반응 자극은, CD22 양성 세포 집단이 생존 세포의 빈도가 더 크며 또한, CD19 양성 집단보다 큰 활성화된 세포의 비율이 훨씬 많을 경우, 자극을 가한지 4일 후 더욱 명확히 나타난다(도 4B). CD19 특이 항체보다 CD22 특이 항체를 충전한 마이크로비드로 정제한 B 세포의 생존율은, 두개의 상이한 선택 방법에 의해 제공되는 이들 세포의 성장 잠재력에 대한 상이한 하류(downstream) 효과 때문일 수 있다.
더욱이, IgG 발현 세포 또는, CD27 양성 기억 B 세포처럼 다른 관련 B 세포 서브군의 양성 선택을 위한 마이크로비드 CD22와 같이 부가적인 선택 수단을 적용함으로써 CD22 양성 B 세포를 선택 및 자극할 수 있다.
일단 세포 자극 및 선택 모두를 위한 수단의 선택이 세포 생존 및 증식에 영향을 미치는 것을 보임에 따라서, 내포될 수 있는 또다른 요소로는 세포 생존의 반응속도 및 IL-2 및 CpG2006 각각 또는 조합에 의한 자극에 대한 CD22 양성 인간 B 세포의 증식 반응이 있다.
세포 생존 및 증식을 자극 개시후 2일, 4일 및 6일에 측정하였으며 이 결과, CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000 U/ml)의 조합 효과가 뚜렷한 운동을 제공하는 것으로 확인되었다. CpG2006 단독 유래의 최대 3H-티미딘 도입이 배양 2일 정도로 조기에 관측되며 그 후에는 훨씬 급격히 감소한다. IL-2 단독에 대한 세포 증식 반응의 운동은 최고 6일 배양까지 3H-티미딘 도입을 증가하는 동안 더욱 완만하다. 그러나, CpG2006 및 IL-2의 조합에 의한 자극은 CpG2006의 것과 유사한 3H-티미딘 도입의 운동을 제공하나, 2일째에 훨씬 향상된 효과를 나타내며, 이 효과는 배양 4일까지 지속되다가 6일째에 감소한다(도 5). 이와 함께, CpG2006 및 IL-2로 자극한 배양물에서 생존 세포의 총수를 측정했고, 이 결과 다시 2일 및 4일째에 생존 세포의 수가 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 특히 4일 배양시, 서로 상이한 방향의 운동을 갖는 IL-2 및 CpG2006을 별도로 이용하여 촉발한 효과 간에 평형이 달성될 때, 이들 두가지 자극제를 조합하여 얻어지는 유리한 장점이 훨씬 중요하다. 이러한 데이터는 동시 및 순차적으 로 자극제를 첨가함으로써(예, 한가지는 자극 단계 개시에 다른 한가지는 수시간 또는 수일 후에), 세포 증식 및 생존율에 대해 유사하거나 더 우수한 효과를 항체분비 세포에 대해 제공할 수 있는 것도 제시한다.
실시예
2:
EBV
를 이용하여
불멸화된
B 세포의 생존율, 증식 및 항체분비에 관한 세포 증식 및 자극 방법의 효과
재료와 방법
B 세포의 증식 및 생존율의 선택과 분석
인간 B 세포의 선택, 그들의 자극 및 그 결과의 분석은 별도의 지시가 없는 한 실시예 1에 기술된 바와 같이 실행했다.
FACS
에 의한 표면
마커
발현의 분석
CD21 양성 세포는, CD22DP 대해 상술한 바와 같이, 항-CD21-PE 결합물을 이용하여 면역형광 및 유체 세포측정법에 따라 검출했다(Caltag Laboratories, Cat. No. MHCD2104, batch 04061206).
엡스타인-
바르
바이러스(
EBV
)
상층액의
조제
EBV 조제용 B95-8 마모셋 림프종 세포(ATCC No. CRL-1612; 5×105/ml)를 10% FCS(완전 배지)를 보충한 RPMI-1640 세포배양 배지에서 4일간 성장시켰다.
B95-8 세포의 지수형 성장은 100nM 포르볼 에스테르(예, PMA; Sigma)로 2시간 동안 자극했고(Oh HM et al., 2003), 그 후 HBSS로 충분히 세척하여(Hank's 평형 염수액; Sigma) 용액에서 PMA를 제거했다. PMA 자극된 B95-8 세포는 10% FCS가 첨가된 완전 RPMI-1640 세포배양 배지에서 48시간 동안 배양되었으며, 상층액을 수거하여 원심분리 후 0.22㎛ 막을 통해 여과했다.
불멸화 효율은 상이한 혈액 공여체로부터 얻은 CD22 양성 B 세포의 3가지 조제물에 대해 평가했다. 모든 경우에서, 급속 불멸화를 관측하였으며 다클론 림프아세포주가 급속한 복제율로 수득되었다. PMA 자극없이 공지의 조건하에 조제된 바이러스 뱃치와 동시에 수행된 불멸화 처리시 복제율은 다소 낮아졌다.
인간
CD22
양성,
IgM
음성 자극된 B 세포의
EBV
조절형
불멸화
처리
IL-2(1000 U/ml) 및 CpG2006(1㎍/ml)을 이용한 4일간의 자극 후, CD22 양성, IgM 음성 세포를 신선한 배지로 충분히 세척하여 자극제가 EBV 상층액에 노출되기 전에 모두 제거하였다.
세포의 벌크 불멸화 처리는 세포(106/ml)를 EBV 상층액(10% FCS를 첨가한 RPMI-1640 내에 50% v/v)으로 최소 4시간 내지 최고 18시간 동안 배양하여 수행하고 이어서, 새 배지로 세척했다. 50% EBV 상층액으로 4시간 내지 18시간 동안 처리한 세포의 증식 및 생존율을 30% EBV 상층액으로 7일간 처리한 세포의 증식 및 생존율과 비교한다.
다시 세포를 농축하고 (10% FCS 및 IL-2(1000 U/ml)를 첨가한 RPMI-1640 내에 106/ml) 24-웰 플레이트 내의 웰 당 0.5×105 조사(3000 rad) 알로젠 PBMC에 8 내지 16일 동안 시드했다.
EBV
를 이용한 인간 B 세포
불멸화
방법의 결과에 대한 정성 및 정량 분석 비 교
실시예 1에서 설명한 바와 같이, 인간 B 세포는 자기성 선택에 의해 5개의 정상적인 공여체로부터 수집된 CD22 양성 말초혈 단핵구(PBMC)로서 분리되었으며 이를 각각 B 세포 불멸화를 위한 상이한 EBV에 기반한 방법에 노출된 3개의 세포 풀로 분할했다.
기본 방법에서, 상기 세포의 IgG 양성 분획물은 MoFlo 고속 세포 분류기(MoFlo 세포측정법) 및 항인간-IgG FITC(Becton Dickinson)을 이용한 세포 분류에 의해 선택하였다. 이어서, 8×105 CD22 양성, IgG 양성 세포는 (상술한 바와 같이 조제된)EBV 상층액으로 12시간 동안 배양한 후 세척하고, 다시 조사된 알로젠 PBMC 공급층의 존재하에, L-글루타민, 불필수 아미노산(NEAE) 및 10% FCS가 보충된 IMDM 배지(Gibco-BRL)내에서 37℃에서 10일간 1.5×106세포/ml 밀도로 배양했다.
조합 방법에서, 8×105 CD22 양성, IgG 양성 세포는 상기 기본 방법에서와 같이 분리한 뒤, CpG2006(1㎍/ml), IL-2(200 U/ml) 및 (상술한 바와 같이 조제된)EBV 상층액을 이용하고, 조사된 알로젠 PBMC 공급층의 존재하에, L-글루타민, NEAE 및 10% FCS가 보충된 IMDM 배지(Gibco-BRL)내에서 37℃에서 10일간 1.5×106세포/ml 밀도로 배양했다.
순차적 방법에서, 먼저 CD22 양성 PBMC는 CpG2006(1㎍/ml)와 IL-2(200 U/ml)의 조합물을 이용하여, L-글루타민, NEAE 및 10% FCS가 보충된 IMDM 배지(Gibco- BRL) 내에서 37℃에서 4일간 사전자극 처리했다. 이 세포를 PBS로 세척한 후 IgG 양성 세포를 자기성 선택으로 농축했다. 사전자극된 세포(8×105 CD22 양성, IgG 양성 PBMC)는 EBV 상층액으로(기본 방법에서와 같이) 37℃에서 12시간 동안 감염시킨 후, 조사된 알로젠 PBMC 공급층의 존재하에, 세척후 IMDM 배지(L-글루타민, NEAE 및 10% FCS 구비) 내에서 37℃에서 10일간 1.5×106세포/ml 밀도로 배양했다.
요오드화
프로피듐
및 유체 세포측정법에 의한
세포수
및 생존율의 측정
B 세포의 총수는 현미경으로 계수하여 측정하고, 또한 생존율은 FACSCalibur 벤치-탑 유동 세포측정기 및 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson Biosciences)를 이용하여 DNA 인터칼레이트 형광 염료의 제거율을 측정함으로써 확인하였다. 요약하면, 세포를 실온에서 요오드화 프로피듐에 대해 노출시키고(PI, Sigma; PBS에 용해된 2.5㎍/ml 최종 농도), 30분 이내에 유체 세포측정법으로 분석했다. 생존 세포를 높은 전향 및 직교 산란성의 특징을 갖는 것으로 한정하였고, 림프구 및 림프아세포 PI는 배제하였다. PI로 염색하고 낮은 전향 산란성을 가진 세포는 죽은 세포 및 조각을 나타낸다.
CD23
의 표면 발현의 분석
실시예 1에서 설명한 바와 같이, CD23 발현은 항인간 CD23-PE 결합체를 이용한 직접 면역형광(R2 영역) 및 유체 세포측정법을 이용하여 FACS에 의해 전자적으로 게이트 처리한 생존 림프아세포에서 측정하였다.
분비
IgG
의 측정
배양물 상층액에서 총 인간 IgG의 분비는 제조자의 지침에 따라 ELISA를 이용하여 측정했다(Immuno-Tek/Zeptometrics, cat. no. ZMC 0801182). 간단히, 배양물 상층액을 배양물로부터 수거한 후 4℃에서 보관했다. 상층액의 시료는 순차대로 희석하여 ELISA 키트에 포함된 정제된 인간 IgG 표준 곡선과 비교했다. 측정값은 10일간의 배양기간 동안 배양물에 축적된 IgG 총량을 반영한다.
결과
전 공정이 직접 방식으로 불멸화된 항체분비 인간 세포를 생성하므로, EBV를 불멸화제로 선택하였으며, 바이러스에 감염된 세포로부터 얻은 상층액을 이용하므로써 거의 직선방향으로 형성 및 적용되었다. 그러나, EBV에 노출된 세포의 분획물만은 아마도 세포 유입을 위해 바이러스가 이용하는 세포 표면에 존재하는 수용체인 CD21의 제한된 발현 탓에 실제로 감염되는 것으로 잘 알려져 있다(Jondal and Klein, 1973; Nemerow et al, 1985; Boyd and Fecondo, 1988). 따라서 CD21 발현이, 상술한 바와 같이 세포 자극 및 정제에 관한 선택된 방식 및 조건에 의해 양성 또는 음성적으로 감염되었는지 여부를 확인하는 것은 매우 중요하였다.
여기에서, 상이한 세포 마커에 근거하여 선택한 B 세포 집단의 증식 운동(CD22 양성 단독, CD22 양성 및 CD27 양성, CD22 및 IgG 양성, CD22 양성 및 IgM 음성)은 IL-2(1000 U/ml) 및 CpG2006(1㎍/ml)를 이용한 4일 자극에 따라 측정되며 또한 CD21 양성 세포의 비율은 다양한 시점에서 측정한다. 모든 실험에서, CD21은 생존 및 증식 세포의 90% 이상에서 발현하였으며 이는 본 발명의 방법에 관한 상세한 설명에서 이중 선택법에 대한 이용 가능성을 증명한다.
따라서, 세포 자극 및 정제에 관한 수단과 조건에 따라 제공된 세포 증식에 대한 강한 긍정적인 효과를 입증한 후, 이 접근법으로 불멸화제에 대한 B 세포 반응을 어떻게 향상시키는지 테스트했다. 실제로, EBV에 대한 B 세포의 노출에 따라, 대부분의 세포 분획물이 배양 첫주 내에 성장을 멈추고 사멸하며, EBV 불멸화 세포에 의한 증식 재개가 뒤따르는 것이 잘 알려져 있다(James K and Bell G, 1987). 따라서, 적절히 자극 및 선택된 인간 B 세포의 소정 비율은 EBV로 불멸화할 수 없는지 또한 불멸화된 B 세포가 EBV 불멸화 후 임계 기간을 극복할 수 있는지를 이해하는 것이 매우 중요하다.
인간 CD22 양성, IgM 음성 B 세포는 CpG2006 및 IL-2로 사전자극하거나 사전자극 없이, 하룻밤 동안 EBV 상층액에 노출 및 세척한 후, 조사된 알로젠 PBMC의 공급층 상에서 IL-2(1000 U/ml)을 함유하는 배지를 이용하여 시드 처리했다. 이들 세포의 증식을 몇일 후에 측정했다. 이 방식에서, CpG2006 및 IL-2로 B 세포를 사전처리하면 EBV 불멸화에 따라 B 세포의 증식 속도 및 정도에 큰 향상을 가져오는 것을 확인할 수 있다. 이 사실은 EBV 상층액에 대한 노출후 7일재 더욱 뚜럿이 나타나며, 이것은 사전자극되지 않았던 세포와 비교시 사전자극 배양물에 거의 50% 이상의 세포가 존재하는 경우이다(도 6A). 이 관찰에서 사전자극된 CD22 양성 B 세포에서 IgM 양성 세포가 추가로 제거되지 않았음을 확인했다.
상술한 과거 방법의 장점은 EBV 상층액을 이용한 불멸화 과정에서(불멸화 전과 함께) 다클론 B 세포 활성체가 갖는 장점을 기술하였으나, 세포 배양물로부터 활성체를 제거하는 단계를 갖지 않는다(WO 91/09115; Hur D et al., 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677). 따라서, CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000 U/ml)의 존재 또는 존재하지 않는 조건에서 7일간 EBV에 노출된 CD22 양성, IgM 음성 B 세포의 배양물 내의 세포수를 검사했다. 그러나, EBV 불멸화 동안 CpG2006(1㎍/ml) 및 IL-2(1000 U/ml)의 존재는 생존 B 세포수의 감소를 가져왔으며, 이것은 세포를 현미경 계수하여 확인 결정할 수 있다(도 6B). EBV 상층액 단독에 노출된 세포와 비교하면, 상기와 같은 세포수 감소는 상당히 중요하며, 또한 별도의 사전자극 단계에서 얻은 데이터를 고려할 경우 더욱 중요하다(도 6A).
이들 데이터로부터, 인간 B 세포의 배양물을 자극제(CpG2006 및 IL-2 각각 또는 그의 조합)로 처리하는 자극 단계가 EBV를 사용하는 B 세포 선택 및 불멸화의 전체 단계에 유리한 효과를 제공하는 것을 알 수 있다. 이와 같은 긍정적인 효과는 또한 자극제의 부가적인 조합물(저농도의 CpG2006 및/또는 IL-2)을 사용하거나 및/또는 B 세포가 최적의 증식 활성 및 관련 마커(CD21 등)의 발현을 나타내는 시기(예, 2 내지 4일)로 자극 단계를 한정함으로써 더 개선할 수 있다. 자극제를 불멸화 단계 전에 제거하는 것도 상기 방법에서 더 우수한 결과를 얻는 방편이 된다. EBV 상층액과 조합되어 연속 및 광범위하게 존재하는 자극제가 CD22 양성 B 세포의 성장 및 생존율에 부정적인 영향을 미친다.
상기 데이터는 또한, 세포 표면 마커(가령, CD21, CD23, CD24, CD27 및/또는 CD22)에 근거하여 결정되는 인간 B 세포의 특정 서브군에 본 발명의 방법을 적용할 가능성뿐만 아니라, B 세포에서 분비된 항체에 관련한 추가적인 선택 기준을 적용 하는 장점도 입증한다. 본 발명의 경우, 불멸화의 진행에 앞서 특이적 아이소타입(IgM)의 항체를 발현하는 세포를 제거하는 방법도 사용한다.
실제로, EBV 감염후 10일째에 행한 CD22 양성 CpG2006/IL-2 자극, IgM 분리, EBV 불멸화 B 세포의 FACS에 기반한 분석에서, 생존 세포의 총수(2개의 우측 4분면에 있는 고전향 산란)가 IgM 음성(하단 오른편 4분면)으로 이어지며, 이것의 표현형은 치료 항체 생성에 보다 바람직한 것이 확인되었다(도 7A). 또다른 확인 사실은, 본 발명의 방법을 이용하여 인간 불멸화, 아이소타입 특이적 B 세포 배양물이 생성 및 유지될 수 있는 것으로서, 면역확산처럼 종래 기술에서 행하는 바와 같이(Mancini G et al., 1965), 면역확산 분석에서 상술한 B 세포 상층액을 시험함으로써 수득된 결과이다. 여기서 상기 B 세포는 실질적으로 IgG 분비 세포임을 알 수 있다(도 7B).
B 세포 특이 자극 및 아이소타입계 B 세포 선택을 조합한 경우에 얻어지는 예기치 않은 긍정적인 효과는 B 세포 선택을 위한 다른 수단을 포함시키면 더욱 개선될 수 있다.
이 접근법의 효율은 CD22 양성, CG2006/IL-2 자극, IgM 음성 B 세포의 클로닝 효율에 근거하여 측정할 수 있다. 수득된 세포는 CpG2006 및 IL-2의 존재하에 2 내지 4일 동안 시험관내서 확장되고, 그 뒤 양성 또는 IgM계 음성 선택에 의해 IgG 양성 서브집단에 관하여 농축된다. CD22 양성, IgM 음성 B 세포는 감염후 1 내지 4주째에 96-웰 플레이트 내의 희석도를 제한함으로써 EBV로 감염 및 클로닝된다. 벌크 배양물로부터의 클로닝 효율은 벌크 배양물의 각 시험 희석도(예, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200) 또는 각 웰 당 세포의 농도(예, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200 또는 그 이상의 웰당 세포수)에서 성장 세포를 함유하는 웰의 갯수를 세어 평가할 수 있다.
EBV 불멸화 수행시에 가장 중요한 고려 사항 중 하나는, 후속의 클로닝에 이용될 세포의 생존율을 유지시키는 것이다. 이것은 특히, 말초혈에 극소 빈도(1:1000 이하)로 존재하는 항원 특이적 B 세포를 확인하기 위해 시도한 경우에 해당한다. EBV는 다클론 B 세포 자극제이지만, EBV에 대한 B 세포의 노출은 배양물 내에서의 세포사의 초기가 된다(Sugimoto M et al., 2004).
본 발명을 뒷받침하는 또다른 데이터는, 5개의 정상 공여체로부터 수집된 CD22 양성 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 동일 출발 집단상에 가해진 3가지의 EBV 조절형 세포 불멸화 처리 방법의 결과를 서로 비교하여 생성하였다(도 8A 참조).
기본 방법에서, CD22 양성, IgG 양성 세포가 EBV 함유 상층액에 12시간 동안만 노출시키고, 세척한 후에 적당한 세포배양 배지 내에서 또한 공급층 세포 상에서 10일간 배양하는 것이 가장 간단한 접근법이었다. 조합 방법에서, CD22 양성, IgG 양성 세포는 세포 배양시 10일간 EBV 및 다클론 활성제(CpG2005 및 IL-2)에 동시적에 노출되며 이는 동일한 화합물의 용도에 관하여 공지 문헌에 발표된 것과 거의 유사하다(Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997). 본 발명의 방법을 적용하는 하나의 가능한 방법인 순차적 방법에서, CD22 양성 세포는 우선 CpG2006 및 IL-2의 조합물에 노출된 후 세척하였다. 따라서, IgG 양성 세포를 정제하였고 EBV 함유 상층액에 12시간 동안 노출되었던 CD22 양성, IgG 양성 세포는 다시 세척 및 적절한 세포배양 배지와 적당한 공급층 세포에서 10일간 배양 처리했다.
CD22 양성, IgG 양성 세포의 절대수가 EBV에 노출된 초기에 모든 조건에 대해서 규정화되어 있으므로, 10일간의 배양 종료시 측정한 세포 배양물 및 상층액 분석으로 얻은 데이터는 상기 세가지 방법을 면밀하게 비교할 수 있도록 해준다. 실제로, 기본 및 순차적 방법은 세포 총수가 증가하여 개시 세포수의 거의 2배(200%)에 달하였으며 이는 조합 방법으로 얻은 1.5배(150%)보다 훨씬 큰 것이다. 더 중요한 사실은, 생존 세포의 수를 측정했을 때, 순차적 방법으로 얻은 세포 집단이 기본 방법 및 심지어 놀랍게도 조합 방법에서보다 향상된 갯수를 나타내는 것이다(도 8B).
따라서, 상기 3가지 방법으로 얻은 세포 집단을 상이한 기준을 이용하여 더 상세히 정성 분석하였다.
FACS 분석은 IgG를 발현하는 세포 집단과 별도로, 이들의 조성은 전체 면적 및 특히, 성장 및 분할이 이루어지는 생존 림프아세포와 상응하는 영역에서 상이하다(요오드화 프로피듐 염색에 음성이고 고전향 산란을 나타낸다; 도 9의 R2 영역). 순차적 방법을 이용하여 얻은 세포 집단은 상기 영역내에서, 기본 방법으로 얻은 것보다, 또한 심지어는 조합 방법으로 얻은 것보다 더 크게 농축되어 있는 것으로 나타났다. 요오드화 프로피듐의 축적 탓에 고 형광레벨을 갖는 세포는 죽거나 죽어가는 상태이며 기본 방법 및 조합 방법으로 얻은 세포 집단은 모두 훨씬 많은 세포가 축적되어 있다. 이러한 세포는 서브클로닝 또는 스크리닝 분석에 이용할 수 없 다(도 9, 좌측 패널).
시료에 존재하는 생존 림프아세포 집단을 CD23 즉, 가장 말초혈 B 세포에 의해 저레벨로 존재하지만, 이들의 발현이 통상적으로 활성에 의해 개선되는 특징의 세포 표면 마커의 발현에 대해 분석하였다. CD23 발현 및 IgG 분비 간의 직접적인 관계를 EBV 불멸화된 인간 B 세포 집단으로 표시했으므로 이와 같은 인덱스를 증거로 택하는 것이 중요하다(Wroblewski J et al., 2002). CD23의 발현 레벨은 수평축 상에 로그 스케일로 나타내며 소정량의 CD23을 발현하는 상대적인 세포수를 수직축에 나타내었다(도 9, 우측 패널). 기본 및 순차적 방법 모두는 조합 방법으로 얻은 세포 집단에서 관측된 것보다 훨씬 많은 세포의 비율로 세포 집단에서 고레벨의 CD23 발현을 유도하며, 상대적으로 상기 조합 방법의 경우, 고레벨 CD23을 발현하는 세포가 극소량임이 분명하며, CD23의 발현에 대한 음성 또는 낮은 세포의 축적이 일어난다.
동일한 1차 B 세포 풀을 이용하여 상술한 3가지 방법에 따라 조제한 세포 집단을 정성 분석한 결과, 본 발명의 방법이 가진 특별한 긍정적인 특징에 관하여 중요한 정보를 제공한다. 실제로, 두가지 종류의 작용제에 세포를 동시에 노출시키는 것 대신에, 다클론 자극을 통해 EBV 불멸화 분리를 행함으로써 개선된 생존률, CD23 발현 및 증식능력을 갖는 세포 집단을 제공한다. 더욱이, FACS 분석은 본 발명의 방법이 어떤 측면에서, BASIC 법으로 얻은 세포 집단과 유사한 반면, 생존 블라스트형 세포의 빈도가 높은 세포 집단을 제공하는 사실을 입증하였다(도 9, 좌측 패널).
이러한 측면은 상이한 방법을 서로 비교하기 위한 주요 요소에서, 비교적 단기간의 배양(8일 내지 10일)에서도 세포 배양물 상층액 내에 세포 집단이 축적되는 IgG 의 양과 같이, 추가적인 중요한 또는 놀라운 효과를 갖는 것으로 보인다. 상기 배양물로부터 얻은 상층액 내의 IgG 분비 레벨의 향상은 이들의 항체 스크리닝에 긍정적인 영향을 미치며 이는 상기 항체를 발현하는 단클론 또는 올리고클론 세포 배양물을 분리하는 기간이 단축될 수 있기 때문이다.
동일한 초기 세포 집단에서 상기의 3가지 방법을 이용하여 얻은 세포 배양물에 축적되는 총 IgG를 비교하여 본 발명의 방법에 근거한 순차적 방법의 장점을 확인할 수 있으며, 상기 총 IgG는 EBV에 노출되기 전에 정량적으로 표준화한 것이다. 실제로, 기본 및 조합 방법은 유사한 총 IgG(80-100㎍/ml)을 제공하며 순차적 방법에서 얻은 세포 상층액은 시험한 희석도-변수 모두에 있어서 ELISA 키트(∼150㎍/ml)의 선형 범위를 넘어 만족스런 레벨에서 총 IgG를 발현하는 세포를 제공한다(도 10A).
그러므로, 본 발명의 방법에 따라 수득한 다클론 세포 집단은 활성적으로 증식 및 생존하는 세포로 구성될 뿐만 아니라 많은 상이한 스크리닝 분석을 행하기에 충분한 레벨의 총 IgG를 발현하며, 다클론 자극제 같은 화합물의 방해가 없어 결과적으로 우리의 관심사인 IgG 항체를 발현하는 세포의 존재를 확인하는 과정을 더욱 촉진한다.
실시예
3: 치료
타겟을
결합 또는 중화하는
IgG
항체를 발현하는 인간 B 세포의 선택, 자극,
불멸화
및 스크리닝
재료 및 방법
IgG
항체를 발현하는 인간
불멸화
B 세포의 생성
이 방법의 개요는 도 11에서 보는 것과 같다. 실행 조건 및 방법은 실시에 1 및 2에서 정의한 바와 같다.
CMV
마이크로중화 분석
인간 배아 폐 섬유아세포(HELF)를 10% 태아소혈청(FCS), 1mM 피루브산나트륨(NaP), 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 10㎍/ml의 스트렙토마이신(GPS)이 보충된 100㎕의 이글(Eagle's) 최소 배지(MEM) 내에서 평탄 바닥 웰에 도말하고 (2,0-2.5×104/웰) 이것을 37℃에서 24시간 동안 배양했다.
각 B 세포 배양물/클론에서 얻은 50㎕의 상층액을 96웰 플레이트의 둥근 바닥 웰 내에서 실험실 균주 CMV(AD169; 5% FCS가 첨가된 50㎕의 MEM 내에서의 500 pfu; 화합물의 총 부피는 100㎕)로 37℃에서 1시간 동안 배양했다. HELF 배양물에서 취한 배지는 버리고 바이러스 혼합물로 대체했다. 플레이트를 2000g에서 30분간 원심분리한 후 37℃ 및 CO2 분위기에서 90분간 배양했다. 배지를 버리고 100㎕의 성장 배지를 첨가하여 배양물을 72시간 더 배양기 속에서 유지했다.
CMV 감염 활성에 대한 B 세포 상층액의 효과는 인간 CMV 중간 조기항원(IEA)를 HELF 세포의 간접 면역페록시다제 염색을 통해 염색함으로써 측정했다. 세포 단일층을 50% 아세톤 및 50% 메탄올(-20℃에서 보관) 용액으로 실온(RT)에서 1분간 고정시킨 뒤 PBS로 세척했다. 세포를 얼음 속에서 5분간 1% H2O2를 가한 0.1% 트리 톤 X-100 에 침투시킨 뒤 PBS로 세척했다. 내인성 페록시다제는 RT 및 어두운 곳에서 50% 메탄올 및 0.6% H2O2를 가한 PBS로 30분간 차단시킨 후 PBS로 세척했다. 50㎕의 단백질 차단제(Ultra Tech HRP 500-600 테스트; 스트렙타비딘-비오틴 유니버설 디텍션 시스템; PN IM2391)를 RT에서 10분간 첨가한 뒤 PBS로 세척했다. 최적 농도의 1차 항체(항인간 CMV IEA; Argene Biosoft; Ref No. 11-003)를 RT에서 60분간 웰에 첨가한다. 웰을 세척한 뒤 50㎕의 비오티닐화 2차 항체(Ultra Tech HRP 500-600 테스트; 스트렙타비딘-비오틴 유니버설 디텍션 시스템; Ref. No. PN IM2391)을 RT에서 10분간 웰에 첨가한다. 웰을 PBS로 충분히 세척하고 0.1% H2O2 에용해된 DAB 기질(MERCK; ref no. 1.02924.0001)을 RT 및 어두운 곳에서 30 내지 45분간 첨가했다. 반응은 PBS로 희석시켜 중단하고 IEA 양성 핵의 갯수를 현미경 검사로 계수하였다.
B 세포 상층액을 인간 제대 정맥 상피세포(HUVEC) 및 임상 CMV 균주 VR1814를 이용하여 시험했다.
음성 대조군으로서, 무관한 IgG 항체를 함유한 B 세포 상층액을 사용했다. 양성 대조군으로서 환자의 혈청에서 유래되고 CMV에 대한 특이성이 있는 인간 IgG 항체의 상용 조제물(Cytotect; Biotest)을 사용했다(125㎍/ml에서 출발하여 점차 희석도를 높임).
CMV
결합 단백질 검출을 위한
ELISA
기반 분석
1차 분석은 인간 혈청 또는 혈장 내의 CMV 단백질 추출물에 대한 특이적인 IgG 항체 결합을 검출하기 위한 상용의 정량적 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA)이었다. 상용 ELISA 키트(BEIA CMV IgG Quant Kit; Bouty)는 제조자의 지침에 따라 사용하였으며 또한 50U/ml 용량의 CMV(Cytotect; Biotest)에 대한 특이적인 IgG 항체의 상용 혼합물로 분석 결과를 검증하였다.
요약하면, 불활성 CMV 단백질 혼합물(실험실 균주 AD169에서 유래됨)로 덮인 깨지기 쉬운 스트립을 마이크로플레이트에 놓고 1:81로 희석된 B 세포 상층액(BEIA 시스템의 시료 희석물 800㎕에 대해 10㎕의 상층액을 첨가함)을 이용하여 실온에서 30분간 배양하였다. 1차 세척 후, 홍당무 과산화수소 효소(100㎕)와 공역결합된 것으로서 사전희석한 단클론 항인간 IgG 항체를 상기 배양물에 첨가하고 이 플레이트를 실온에서 다시 30분간 더 배양했다. 2차 세척 후, 사전희석된 기질-TMB 용액(100㎕)을 첨가한 뒤 플레이트를 실온에서 추가로 15분간 더 배양했다. 이 반응은 정지액(100㎕/웰)으로 중단시키고 450/520nm에서 이색시(bi-chromatism)법으로 광학 밀도를 측정했다.
고체면 상에 부동화된 특정의 펩티드 또는 재조합 CMV 단백질을 이용하여 실험실에서 완성된 ELISA을 통해 부가적인 분석을 행했다.
재조합 CMV 항원 gB 면역우세 영역이 글루타티오닌-S-트란스페라제(GST)와 함께 재조합 융해 단백질로 생성되었으며 이를 친화성 정제하거나(GST-친화성 정제; Biodesign Int, cat. No. R18102) 펩티드로 정제하였다. 재조합 CMV 항원 gH 면역우세 영역(VR1814 균주)은 대장균에서 충분한 양으로 생성되었으며, 이를 GST 친화성을 근거로 박테리아 세포 융해체로부터 정제하였다. ELISA는 96-웰 포맷 내 에서 통상의 ELISA 프로토콜에 소폭 변화를 가하여 실행했다. 요약하면, 항원을 PBS에 2㎍/ml의 농도로 희석하고 EIA 폴리스티렌 플레이트(Nunc, cat. No. 469949)의 각 웰을 상기 단백질액 50㎕으로 피복하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 단백질 용액을 제거하고 웰을 100㎕의 세척완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)로 4회 세척했다. 불특정 결합을 차단하기 위해 1% 우유를 섞은 100㎕의 PBS을 각 웰에 분무 첨가하고 이 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 150㎕의 세척완충액으로 4회 세척을 실행한 후, 세포 배양물에서 얻은 세포 배양 상층액의 50㎕의 분취물을 각 웰에 분무하고 이것을 세포 배양 배지의 50㎕/웰의 음성 대조군으로 이용했다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 50㎕의 홍당무 과산화수소 효소 라벨의 항인간 IgG 항체를 분무하기 전 플레이트를 150㎕의 세척완충액으로 4회 세척하였다. 상기 항인간 IgG 항체는(Fc-특이성, 염소 항인간 IgG 항체; Sigma. cat. No. A0170) 각 웰에서 세척완충액에 1:30000의 비로 희석한 것이다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 150㎕의 세척완충액으로 4회 세척한 뒤 50㎕/웰의 기질-TMB 용액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; Sigma, cat no. T0440)을 분무하였다. 실온에서 30분간 배양한 후, 발색 반응을 100㎕/웰의 정지액(1N 황산)으로 중지시키고 광학 밀도를 450nm에서 측정했다.
ELISA
기반
HSP60
결합 분석
HSP-60 결합 항체를 검출하기 위한 ELISA는, NaHCO3 0.1M pH9.6에 1㎍/ml로 용해 희석한 50ml의 재조합 인간 HSP60 단백질(Stresgen)로 피복된 EIA/RIA 웰 스트립을 이용하여 준비하고 이를 실온에서 하룻밤 유지했다. 스트립을 0.05%의 Tween 20(pH 7.4)를 함유한 PBS로 3회 세척하고 비특이적 결합 부위는 1% BSA 및 5% 수크로스를 함유한 PBS로 실온에서 30분간 차단시켰다. 4회 세척후, 스트립을 실온에서 3시간 1차 항체의 패널로 배양했다; 항인간 HSP60(1% BSA를 5 또는 10㎍/ml으로 PBS에 첨가 희석한 용액; Santa Cruz Biologicals), 마우스 IgG 아이소타입 음성 대조군(1% BSA를 첨가한 5㎍/ml의 PBS), 무관련의 인간 재조합 IgG 항체(헤르셉틴, 5㎍/ml), 세포배양 배지 단독, 및 EBV 불멸화된 인간 IgG 분비 B 세포로부터 얻은 상층액 등을 사용했다. 4회 세척후, 1% BSA를 가한 PBS에 희석된 홍당무 과산화수소 효소 공역결합된 항마우스 IgG 또는 항인간 IgG(Dako)를 이용하여 상기 스트립을 실온에서 1시간 동안 배양했다. 4회 세척 후, 기질-TMB 용액을 스트립에 첨가하고 실온에서 발색 반응시켰다. 플레이트를 450nm에서 판독했다.
결과
본 발명의 방법은, 인간 바이러스, 특히 인간 사이토메칼로바이러스(CMV), 선천적 결함 및 비면역타협 환자의 고병원성을 야기하는 베타헤르페스바이러스(Landolfo S et al., 2003) 등과 결합 및/또는 중화하는 항체를 혈액내 함유하는 것으로 입증된 공여체로부터 수득한 인간 B 세포에 대해 실험하였다.
CMV는 도 11에서 간략히 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 선택, 자극 및 불멸화된 인간 B 세포가 자연 분비하는 항체에 의해 중화될 수 있는 임상적 관심의 대상인 바이러스성 타겟의 좋은 예이다. 또한, 각종 CMV 치료 기술 중에서도 정맥내 CMV 면역 글로불린(Cytotect 또는 CytoGam의 상품명으로 시판되는)을 투 여할 경우, 특히 강력한 항바이러스제를 함께 투여하는 일이 종종 있는 비면역타협 환자에 있어서 CMV 감염을 일부만 차단할 수 있다(Bonaros NE et al., 2004; Kocher AA et al., 2003; Kruger RM et al., 2003). 이러한 조제물은 임상적 용도 뿐만 아니라 고역가 항 CMV 항체를 함유한 인간 혈장 풀로부터 간단히 유도할 수 있는 특징이 있다. CMV 감염 처리는 면역조절을 목적으로 사용이 허가된 포유류의 세포에서 발현함으로써 얻어진 정제된 인간 단클론 항체를 포함하는 보다 강력한 조제물로부터 유리한 효과를 얻을 수 있다.
CMV 중화 항체를 발현하는 인간 B 세포는 하나 이상의 면역학적 스크리닝 분석(면역블롯, ELISA 또는 ELISPOT 등)을 근거로 또는 항원 마이크로분석을 기초로 하여 선택된 공여체로부터 수득할 수 있으며, 이들은 상용의 공급원으로부터 구할 수 있다(Sorin Biomedica, Italy; BioMerieux, France).
인간 B 세포는 ELISA, ELISPOT 또는 중화 분석으로 측정한 바와 같이, 혈액 내 항-CMV 항체의 역가가 높은 선별된 공여체의 임상 시료로부터 분리하였다. 세포를 본 발명의 방법에 따라 처리하였다(도 11). 결과로 얻은 CD22 양성, IgM 음성 EBV 불멸화된 인간 B 세포 집단은, 직접 또는 간접으로, CMV 중화 및/또는 CMV 결합 IgG 항체를 함유하는 세포를 검출하기 위한 초기 세포 집단을 서브클로닝함으로써 유래된 세포 배양물 상층액을 이용하여 스크리닝했다. 상기 항체를 생성하는 초기 B 세포는 항체 코드화 DNA를 클로닝 및 서열화하는 범위에서, 후속의 서브클로닝 단계에서 분리할 수 있다.
첫번째 1차 스크리닝 분석은 각 웰에 약 100개의 B 세포가 함유된 96-웰 플 레이트에서 400개의 서브 배양물에 대해 실시했다. 이들 웰에서 얻은 상층액은, 인간 CMV의 실험실 균주(AD169) 또는 임상 균주(VR1814)를 이용하여 인간 세포 감염을 차단하는 능력에 대해 CMV 미세중화 분석법으로 스크리닝했다. 스크린된 453 B 세포 배양물 중 4개가 실험실 CMV 분리물을 이용한 반복실험에서 중요한 중화 활성을 나타냈으며 특히 하나는 반복 분석에서 임상 CMV 분리물의 중화 반응을 나타냈다(도 12A).
두번째 1차 스크리닝 분석은 또다른 CMV-혈청양성 공여체로부터 수득되고 본 발명의 방법에 따라 처리한 B 세포 집단에 적용되었다. 이 경우에는, 더 감도가 높은 상업적으로 이용가능한 ELISA을 이용하여 CMV 특이 활성을 검출했다. CMV 양성 서브 배양물은 상술한 특징과 같이, 세포 배양물 및 1차 스크리닝 분석에서 검출된 CMV 중화 또는 결합 활성에 관여할 수 있는 항체에 상응하는 서열을 동정하는 범위에서, 서브클로닝 공정을 개시하는데 이용할 수 있다.
이들 항체는 인간 B 세포 상층액에서 얻은 정제된 조제물이거나 재조합 단백질로 발현된 항체로서 문헌에 공지된 기관 또는 세포 시험관내 분석을 통해 확인할 수 있다(Reinhardt B et al., 2003; Forthal DN et al., 2001; Goodrum FD et al., 2002). 더욱이, 관련된 사전임상 테스트를 CMV 감염 동물 특히, 인간 숙주세포가 비면역타협성 설치류에게 이식할 수 있는 모델에 대해 실시할 수 있다(Gosselin J et al., 2005; Thomsen M et al., 2005). 상기 항원에 의해 인식된 CMV 항원/에피토프는 예를 들어, ELISA 또는 기타의 CMV 특이 절단 단백질이나 합성 펩티드를 이용하는 웨스턴 블롯에 근거하거나, 또는 항원/에피토프가 공지되어 있는 다른 CMV 특이 항체와의 경쟁에 근거한 다양한 시험관내 분석법을 통해 동정할 수 있다(Greijer A et al., 1999; Schoppel K et al., 1996; Ohlin M et al.,1993).
또다른 스크리닝 분석은 인간 사이토메갈로바이러스의 결합 또는 중화에 대해 시험하는 세포 배양물 상층액을 이용하여 실시할 수 있다. 실제로, 대형 레퍼터리의 IgG 분비 세포는 CMV 감염에 연루 가능성이 있는 개별 CMV 에피토프 또는 항원에 대한 결합 특이성을 가진 다수의 인간 IgG을 동정하는데 유용하다. 예를 들어, 아테롬성 동맥경화증 환자의 혈액에는 CMV 단백질과 유사한 인간 열충격 단백질 60(HSP60)의 단편을 인식하는 항체가 고레벨로 함유되어 있다. 특히, 이들 단백질 중 US28은 상피세포의 표면에 발현하며 이 단백질과 결합하는 항체는 상피세포의 자살을 유발할 수 있다. 따라서, CMV 감염은 아테롬성 동맥경화증 병리 소견에서 일어나는 자가면역 반응을 촉발하는 것으로 예측할 수 있다(Bason C et al., 2003).
그러므로, 65개의 세포 배양물 상층액 풀(각각, CMV 혈청양성 개체로부터 얻은 1차 B 세포에서 출발하여 생성한 EBV 불멸화된 세포로 구성된 5개의 웰로부터 얻은 상층액을 함유함)은, 재조합 인간 HSP60을 이용하는 ELISA에 따라 HSP60 면역활성에 대해 스크리닝 처리했다. 6개의 풀이 반복 실험시 ELISA의 3배에 달하는 통계적 측면에서 현저한 반응활성도를 나타냈다(도 12B). 불멸화된 항체분비 세포의 배양물을 세포 풀에 서브클로닝할 수 있으며, 인간 HSP60에 결합하는 인간 단클론 IgG 항체를 분비하는 세포 배양물이 분리될 때까지 배양물 스크리닝 및 서브클로닝을 반복한다.
두번째 1차 스크리닝 분석은 특이적 CMV 혈청양성 공여체로부터 수득되고 또다시 본 발명의 방법에 따라 처리한 B 세포 집단에 대해 적용하였다. 이 경우, CMV 특이 반응활성은 1차 B 세포 단일 집단 또는, 각각 개별 CMV 특이적 에피토프에 대한 항체를 발현하는 것으로서, 불멸화된 세포의 올리고머클론 또는 단클론 집단으로부터 선택하고, 또한 개체의 CMV 감염에 대하여 면역 반응을 전반적으로 표현하는 범위 내에서 다양한 시험을 통해 검출되었다(도 13).
EBV 불멸화된 세포의 다클론 집단은 세포 배양물을 구성할 약 4000개의 풀로 분할되었고 이들은 96-웰 플레이트 내에서 각각 20개의 세포를 함유한다. 각 웰은 올리고클론 세포 집단을 함유한다. 그러나, 한정된 항체에 대한 특이성을 가진 항체를 생성할 세포의 빈도가 낮으므로, CMV 특이적 IgG가 상층액에서 검출되는 이들 세포 배양물은 인간 단클론 항체를 발현하는 단클론 세포 배양물로 되기 쉽다.
초기 테스트에서는, CMV 중화 항체에 의해 인식되는 것으로 알려진 특이 항원 또는, CMV 단백질의 혼합물 중 어느 하나에 대하여 특이적인 올리고클론/단클론 세포 배양물에 의하여 생성된 항체의 CMV 결합 특성을 평가했다. 이어서, 적어도 상기 분석 중 하나에서 양성으로 나타나는 대상을 CMV 미세중화 분석법으로 평가했다.
2개의 특이적 CMV 항체를 올리고클론/단클론 세포 집단의 초기 스크리닝 용도로 선택했다: 즉 엔벌로프 당단백질 gB 및 gH 이다. 이들 단백질은 바이러스성 접착 및 융해에 중대한 역할을 하며 보다 상세한 정보을 활용할 수 있는 인간 CMV 중화 항체의 타겟이 된다. 혈청양성 개체에서 취한 혈청 및 상기 당단백질에 대항 하는 단클론 항체는 시험관내 세포 배양물의 HCMV 감염을 억제한다. 인간 혈청의 바이러스 중화 능력에 기여함에 있어서 gB 및 gH에 대항하는 항체의 효과적인 역할은, 항-gB 및 항-gH 역가 간의 상호관계성 및 회복기의 인간 혈청이 나타내는 전체적 중화 활성 이외에도, gB 및 gH 특이적 항체의 흡착후 혈청 중화 능력의 현저한 감소에 의해 입증되었다(Cytomegaloviruses 참조. Molecular Biology and Immunology. Reddehase, M.(ed.) Norfolk; Caister Academic Press(2006); 특히, Boehme K and Compton T p. 111-130, Mach M pp. 265-283 참조).
도 13에 요약한 바와 같이, 세포의 증식이 활발한 올리고클론 세포 배양물을 이용할 경우(세포가 시드된 총 웰의 약 35%), 한정된 CMV 단백질에 대하여 특징적인 분석법 중 하나에서 CMV 단백질과 반응하는 IgG 를 함유한 웰을 확인하거나(gB 또는 gH-ELISA), 또는 총 CMV 단백질 추출물을 확인할 수 있었다(BEIA CMV ELISA). 특히 일부의 웰에는 시험관내 CMV 감염을 중화시키는 인간 IgG이 함유되었다.
BEIA CMV ELISA 에서만 양성이었던 8개의 올리고클론 세포 배양물 중에서, 9G8 이라고 표시한 웰은 CMV 반응활성에 대해 높은 양성도를 나타낸 인간 IgG를 함유한다(도 14). 9G8 웰로부터 취한 1만개의 세포를 함유하는 시료는 cDNA 및, PCR에 의해 특별히 증폭된 인간 IgG의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역에 있어서의 서열을 형성하는데 이용되었다. 증폭 반응의 산물은 클론 및 서열화되었고, 9G8이 특이적 가변 영역을 가진 CMV에 결합되는 새로운 인간 IgG를 분비하는 단클론 세포 배양물인 것으로 확인되었다(도 15). 상기 항체의 가변 영역에 대해 코드화하는 DNA 역시 특이적 CDR 서열을 결정하는데 이용되었으며, 이 서열은 단독 또는 9G8과 조 합시켜 CMV에 대한 결합 항체를 생성하는데 이용할 수 있다.
따라서, 항체분비 세포를 불멸화하는 본 발명의 방법을 포함하는 공정에 따라, 불멸화된 다클론 세포 집단으로부터 직접 생성된 올리고클론 세포 배양물로부터 새로운 VH 및 VL 서열을 동정할 수 있다. 9G8과 같은 항체 또는 상기 항체의 하나 이상의 CDR(예, HCDR3 단독; HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 함유하는 단백질을 CMV 관련 임상 분야 및 실험 분야 특히, 생물 시료내에서 CMV를 검출하는데에 효과적으로 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 HIV-1, HSV-1 및/또는 HSV-2 혈청양성 개체로부터 얻은 1차 B 세포를 불멸화하는데 사용할 수 있었다.
예를 들어, HSV-1/HIV-1 혈청양성의 여섯 개체를 선택하여 이들의 혈장을 상용 ELISA 키트로 관측한 결과, 고역가의 IgG 항체 결합 HSV-1 단백질을 확인할 수 있었다(Bouty BEIA HSV-1; cat no. 20921). 이들 개체에서 취한 PBMC는, 공여체 CMV5에서 얻은 PBMC에 대해 상술한 바와 동일한 방법을 이용하여 풀을 형성하고 불멸화 처리했다.
초기의 7000만 PBMC는 ELISA 키트는 물론, gC 코드화 서열이 lacZ 유전자로 치환된 무영향의 돌연변이 바이러스에 의한 HSV-1 감염을 중화시키는 항체를 검출하는 시험관내 분석법을 이용하여, 세포 배양물의 상층액에서 검출하기에 충분한 양의 HSV-1 특이 IgG 항체를 분비하는 190만 CD22 양성, IgM 음성 세포 집단을 유도한다(Laquerre S et al., 1998).
상기 다클론 세포 집단은 부분적으로, 수백개의 올리고클론 세포 배양물을 시드화함으로써 HSV-1 중화 활성이 있는 항체를 스크리닝하는 세포를 동정하는 스크리닝 분석법에 이용되었으며 상기의 배양물은 각각, 세포 배양물 조제 직후 통계상 약 50 내지 100개의 세포를 함유한다. 또한, 불멸화 처리후 수득된 세포 배양물의 분취물은 포유류 세포주를 취급하는 종래의 방식대로 바이알에 동결 보관하였다. 이들 바이알 중 일부는 수개월 후 해동하고, 여기서 나온 세포를 초기의 다클론 세포 배양뒤 수일간 배양했으며, 다음에 각각 통계상으로 5개의 세포를 함유하는 수천개의 올리고클론 세포 배양물을 조제하는데 이용했다.
HSV-1 중화 분석은 두가지 종류의 올리고클론 세포 배양물(예, 웰당 50 내지 100개의 세포를 즉시 시드하거나 또는, 초기의 다클론 세포 집단의 분취물을 함유하는 바이알을 해동시킨 후 각 웰당 5개의 세포를 시드하여 수득한 것)에서 실시했으며 상기의 두가지 방법은 시험관내 HSV-1를 중화시키는 인간 IgG 항체를 발현하는 올리고클론 세포 배양물의 동정을 유도한다.
특히, 후자의 공정에서 취득한 HSV-1 중화 항체를 분비하는 세포의 경우, 20개 이상의 올리고클론 세포 배양물에서 확인되었다. 항체가 상기 다수의 세포 배양물에서 확인된다고 해도, 다수의 양성 웰 및 RT-PCR 기술에 의해 상기 항체의 서열을 직접 확인할 수 있는 가능 및 다수의 양성 웰은 추후 선택을 위해 다수의 또다른 올리고클론 세포 배양물(상이한 속도로 성장할 수 있는)을 테스트하는 방법을 제공한다. 실제로, 항체 서열을 확인 및 특징화할 뿐만 아니라, 관심 대상인 단클론 항체를, 클론화 및 재조합 단백질 형태로 발현할 필요없이 활성 검사를 위해 직접 정제할 수도 있으며, 따라서 최고의 관심사인 인간 단클론 항체의 동정을 촉진 할 수 있다.
결론
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 방법이 가진 다양한 장점 및 종래 기술을 능가하는 현저한 개선점을 확인할 수 있다.
선택, 자극 및 불멸화 단계의 연속 과정에 따라 효과적으로 이용할 수 있는 다클론 세포 집단을 제공하며, 이들은 세포로부터 분비되는 항체의 특이적 항원 결합성과 무관하게 동 항체의 아이소타입에 근거하여 분리되는 것으로서, 단일 공여체, 또는 공여체 풀로부터 얻은 세포에서 다양한 특성을 가진 항체를 검출하는데 유용하게 이용할 수 있다.
실제로, 본 발명의 방법은 동시 또는 순서대로 적용되는 다양한 기준을 이용하여 스크린 및 선택할 수 있는 다클론, 올리고클론 또는 단클론 세포 집단을 제공한다. 실시예 2에서 보는 바와 같이, 광범위한 항체 레퍼터리를 하나의 대상체로부터, 항체를 스크리닝 분석에 적합한 수준으로 분비하는 다수의 생존성 및 증식성 세포를 제공하는 방식에 따라 본 발명의 방법에 의해 캡처할 수 있다. 또한 결과로 나온 세포 집단의 조성이 균질하여, 세포를 별도로 선택 또는 분류할 필요없이, 선입견 없이 선택한 공여체가 제공하는 극대의 항체 확산 (완성되지 않은 경우) 패널에 접근할 수 있다. 항-CMV 및 항-HSP60에 대한 연속 스크리닝에서 보는 바와 같이, 혈청을 분석하여 불멸화될 세포에 관한 공여체를 선택할 수 있게 되면, 결과로 나온 세포 집단은 추후에 더 큰 특성 스펙트럼을 갖는 항체를 찾을 때 면역 반응을 분석 조사하는데 이용할 수 있다.
또한, 단클론 항체의 동정을 위해 세포 배양물을 직접 조제하거나 극저의 세포 밀도에서 시드 처리되는 세포 배양물을 사용할 수 있다. 결과로 얻어진 세포 배양물은 또한 여러가지 세포배양 조건(예, 공급층 세포, 배지, 성장 인자 등)을 적용하거나 또는 항원 패널 및 생물 활성(공여체 CMV5로부터 수득한 세포에서 보는 바와 같은)을 테스트하기 위하여 유지 및 스크리닝이 동시에 이루어질 수도 있다. 단 반드시 단일 세포 집단으로부터 출발한다.
마지막으로, 이러한 접근은 자동 방식으로 수만의 올리고클론 세포 배양물 중에서 선택하고 또한, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 세포 집단의 분취물을 각각 함유하는 일련의 동결 바이알군을 형성하는데 이용할 불멸화된 항체분비 세포의 다클론 집단을 생성하기에 적합하다.
특히 이들 세포는, HSV-1 혈청양성 공여체로부터 얻은 세포를 이용하는 실시예에서 보는 바와 같이, 바람직한 항체 특이성의 불멸화된 세포 집단을 더 광범위하게 분석하거나 또는 재분석하는 범주에서 필요시에 해동 및 테스트할 수 있는 항체분비 세포의 라이브러리로 간주할 수도 있다. 따라서, 공여체를 선택했거나 또는 세포 집단을 불멸화 및 동결 분취물 형태로 보관했을 때 고려하지 않았던(또는 공지되지 않은) 타겟에 대해서까지도, 원하는 특성의 단클론 항체를 성공적으로 동정 및 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 다클론, 올리고클론 및 단클론 세포 집단을 수득할 수 있다. 또한 이 방법을 이용하여 인간 거대세포 바이러스, 헤르페스 심플릭 스 바이러스 또는 HSP60 단백질과 결합하는 항체를 분비하는 인산 B 세포를 엡스타인 바르 바이러스를 이용하여 효율적으로 불멸화 처리할 수 있다.
(참고문헌)
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<400> 1
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 2
<211> 528
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120
tgtaagggtt ctggatacac ctttgacagc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180
gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac cagatacagc 240
ccatccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctctttg 300
cagtggagca gcctgagggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag acatacatac 360
cccggaccga atagtggcta cgactacttt gagtactggg gccagggaac cctggtcacc 420
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttc 528
<210> 3
<211> 176
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Asp Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Ser Leu Gln Trp Ser Ser Leu Arg Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Thr Tyr Pro Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asp
115 120 125
Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
His Thr Tyr Pro Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asp Tyr Phe Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 423
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ttcctcctgc tactctggct cccagatacc accggagaaa ttgtgttgac acagtctcca 60
gccaccctgt ctttgtctcc aggagaaaga gtcaccctct cctgcagggc cagtcagagt 120
gtttacaact acttagcctg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc 180
tatgatgcat ccaacagggc cactggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg 240
acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt 300
cagctgcgtc gagggacgtt cggccaaggg accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct 360
gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 420
gtt 423
<210> 8
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr
20 25 30
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
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Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Arg Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105 110
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gln Leu Arg Arg Gly Thr
1 5
Claims (19)
- 하나 이상의 특이적 아이소타입의 항체를 분비하는 세포 집단을 불멸화하는 방법으로서,a) 적어도 하나의 세포 표면 마커에 대하여 양성인 세포를 분리함으로써, 하나 또는 그 이상의 생물 시료로부터 항체를 발현하는 세포 집단을 선택하는 단계;b) 세포배양 조건하에 적어도 하나의 자극제로 상기 선택된 세포 집단을 자극하는 단계;c) 세포 배양물에서 상기 자극제를 제거하는 단계;d) 상기 세포 배양물로부터 하나 이상의 아이소타입의 항체를 발현하는 자극된 세포 집단을 선택하는 단계;e) 세포배양 조건하에 상기 선택 및 자극된 세포 집단을 불멸화제에 노출시키는 단계; 및f) 상기 세포 배양물로부터 불멸화제를 제거하는 단계를 순서대로 포함하되, 상기 불멸화제는 바이러스성 불멸화제인 것을 특징으로 하는 불멸화 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 a) 단계에서의 세포 집단은 인간 B 세포이며, 세포 표면 마커는 CD22, CD19 또는 CD27인 불멸화 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 자극제는:a) CpG계 올리고누클레오티드 및 사이토킨의 조합물; 또는b) TNF 수용체종에 속하는 세포막 수용체의 길항체 및 사이토킨의 조합물 중에서 선택되며, 바이러스성 불멸화제는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스인 불멸화 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 d) 단계의 세포 집단은 IgG 항체를 발현하는 불멸화 방법.
- 제 1항에 따른 방법으로 얻은 세포 집단.
- 제 5항에 따른 세포 집단을 포함하는 세포 배양물.
- 삭제
- 삭제
- 제 5항에 따른 세포 집단 또는 제 6항에 따른 세포 배양물을, 원하는 항체결합 특이성 및 생물 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종을 갖는 단클론 항체의 동정 및 제조에 사용하는 방법.
- 제 5항에 따른 세포 집단 또는 제 6항에 따른 세포 배양물을, 개체의 자가 항원 또는 이종 항원, 바이러스, 박테리아 세포, 독소, 기생충 세포, 또는 백신에 대한 아이소타입 특이적 면역반응 특성의 결정에 사용하는 방법.
- 제 5항에 따른 세포 집단 또는 제 6항에 따른 세포 배양물을 포함하는 것으로서, 원하는 항원결합 특이성 및 생물 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종을 갖는 단클론 항체를 동정 및 제조하는 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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- 삭제
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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