CN101374944B - 用于获得永生化抗体分泌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于永生化可分泌一种或多种特定同种型抗体的细胞的新型方法。利用本发明方法获得的多克隆、寡克隆和单克隆细胞种群可在细胞培养条件下，基于它们分泌的抗体的功能和/或结合活性(如针对医学感兴趣的人类或病毒起源的抗原)进行筛选。利用这些方法，已通过EB病毒将可分泌结合人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或HSP60蛋白的抗体的人类B细胞有效地永生化。

Description

用于获得永生化抗体分泌细胞的方法

技术领域

本发明涉及用于获得分泌抗体的永生化(无限增殖化，immortalized)细胞的方法，尤其是那些人类起源且分泌对医学感兴趣抗原具有高度特异性的抗体。

背景技术

抗体是由免疫系统产生以抵抗感染并消除致病因子的天然蛋白。抗体通过结合蛋白抗原或非蛋白抗原并触发用于消除抗原的防御反应而发挥它们的作用。

近年来，已经根据针对人类和非人类分子的抗体的抗原结合特征建立了一种整体治疗方法(即，被动免疫疗法或被动血清疗法)。被动免疫疗法包括给予患者包含对致病分子(例如，毒素、蛋白、病毒、寄生虫或细胞)具有明确抗原特异性的治疗性抗体的药物组合物，其中患者的免疫系统不能产生所述抗体，所给予量和/或特异性可阻断和/或消除该病原体(Dunman PM and Nesin M，2003；KellerMA and Stiehm ER，2000)。

该方法在20世纪80年代早期已被成功引入临床实践中，而且从那时起，治疗性抗体的应用已迅速扩展了用于治疗多种疾病的机会，包括感染性疾病、免疫介导的疾病和癌症，促成了治疗性单克隆抗体领域持续增长(Chatenoud L，2005；Pavlou A and Belsey M，2005；Laffy E and Sodoyer R，2005)。

适合用于被动免疫疗法的治疗性抗体是那些特异性和活性明确的同源性抗体。对单克隆抗体(即，由单克隆抗体分泌细胞分泌的抗体)，可非常准确可靠地确定这些特性，而对于多克隆抗体(即，由抗体分泌细胞的不同克隆体分泌的抗体复合物)则不然。

20世纪70年代以来，已经开发了不同的技术用以分离、繁殖和保持大批细胞系，每一种细胞系均来源于分泌单克隆抗体(mAb)的单一单克隆细胞培养物，可利用恰当的分析检测所述抗体，以鉴定那些具有期望性能的细胞培养物。

所有这些方法均共有的两个重要技术问题是：

a)如何在进行任何体内实验之前提供用于鉴定和表征该抗体所需功能测定的足量抗体；

b)如何保证该治疗性抗体本身不被患者免疫系统识别为抗原，从而触发该治疗性抗体的消除和/或可能对患者有危险的免疫炎性反应。

第一个问题在于，将天然抗体分泌细胞在培养基中繁殖和保持足够的时间以获得该生物物质进行检测比较困难。这种不便已经通过在培养基中永生化并保持原代抗体分泌细胞(其中编码该抗体的核酸最初已被生产和表达)或者通过采用重组DNA技术从这些细胞中分离编码抗体的核酸并将其转移入永生化细胞(在该细胞中，该抗体可表达并保持)中而得以解决。

过去，已经通过将其与已永生化的细胞融合(形成更易于保持的杂种细胞或杂交瘤)或者通过利用以使细胞几乎无限繁殖的方式而改变原代抗体分泌细胞的细胞机制的试剂(如病毒)，在细胞培养条件下使原代抗体分泌细胞永生化。

过去已经通过利用用于产生抗体的人类起源的细胞和核酸或者通过利用人类起源的序列修饰编码具有免疫原潜能的非人类抗体的基因(利用重组DNA技术进行的“人源化”过程)而解决了保证患者安全的问题。

总之，被动免疫疗法可对感染和其他病理提供有效而快速的保护。然而，每一种用来分离、筛选和生产与人类治疗完全相容的单克隆抗体的方法均具有不同类型的缺陷，如下文简要综述的。

杂交瘤技术，由Kohler和Milstein(Kohler G and Milstein C，1975)首次描述，允许在融合于恰当的永生化细胞类型之后分离持续生长的抗体分泌细胞克隆。杂交瘤来源于人类抗体分泌细胞(Olsson L and Kaplan H，1980)，但由于缺乏恰当的人类骨髓瘤或类淋巴母细胞融合伴侣(配体)以及人类/人类同源杂交瘤和人类/鼠类异源杂交瘤不稳定性，因此尚未证实产生人类杂交瘤的工艺是灵活有效的。

通过将鼠类单克隆抗体的抗原结合区移植到人类抗体分子的骨架上产生嵌合分子并通过用其他人类氨基酸取代特定鼠类残基以通过分子学方法降低抗原性，可实现鼠类抗体的人源化(HwangW and Foote J，2005；Carter P，2006)。

目前已存在多种可应用或供临床试验使用的“人源化”抗体。然而，这些抗体仍然包含5-10％鼠类(或非完全人类)蛋白序列并且可能引发限制这些药物治疗效果的免疫反应。另外，人源化过程比较费力且有时会引起抗体结合的改变。

因此，该方法大多数与起源于用相关抗原免疫接种的啮齿类动物的抗体分泌细胞一起使用。考虑到鼠类起源的序列可在人类体内具有免疫原性，因此所得mAb可引发有毒的人抗鼠反应而使抗体依赖性细胞毒性受损和/或快速从身体清除。此外，即使可变区相同的抗体也可以呈现不同的功能和免疫原性能(Torres M et al.，2005)。

用于生产完全人源化单克隆抗体的主要方法基于利用重组DNA技术而克隆和表达人类免疫球蛋白基因。

在第一种情况中，编码抗体片段(包含抗原结合区)的DNA序列文库可从人类组织扩增并插入噬菌体中，从而实现在该噬菌体表面上“显示”抗原结合片段及随后的筛选。从来源于患者、利用噬菌体显示技术克隆和筛选的大型抗体库开始，已经生产了针对人类病原体的单克隆抗体(Mancini N et al.，2004)。

然而，如在大多数情形下采用的，这些文库对于鉴定治疗性抗体可能不是有效的，因为抗体基因不是如同免疫系统在体内那样进行选择的，一方面，用于去除人类抗体库中可能引发免疫反应的序列，而另一方面，用于选择由于亲和力成熟而得到的抗体序列。因此，有时需要复杂的体外亲和力成熟和允许直接序列改变的其他技术以改进来自这些文库的抗体(Hoet R et al.，2005)。

在第二种情况下，表达人类抗体基因的转基因小鼠可用感兴趣抗原免疫接种以产生表达完全人源性抗体的鼠类细胞(KellermannS and Green L，2002)。这种方法比传统的噬菌体显示法具有优势，因为抗体在体内进行选择并且可能包含频率增高的高亲和力抗体。然而，在小鼠体内环境中起作用的小鼠免疫系统可能不会生产具有恰当特异性的人类抗体而用于有效的治疗用途。

因此，用于被动免疫疗法的理想治疗性抗体是来源于人类免疫细胞(其在人体内成熟)的人类单克隆抗体。然而，这种抗体的选择和生产是一个复杂而耗时的过程，这是由于用于生产和分离在细胞培养条件下分泌抗体的存活永生化人类细胞的传统方法是无效的。

人们已经深入综述了人类B细胞的发育和增殖过程(形成其抗原特异性和长期体内反应)以及利用从免疫系统获得的细胞来研究体外过程的措施(Banchereau J and Rousset，F，1992；Crotty S andAhmed R，2004；Carsetti R，2004；McHeyzer-Williams L andMcHeyzer-Williams M，2005)。然而，甚至当可检测到相关结合或中和活性时，现有技术仍不能生产稳定的人类抗体分泌细胞系，因此表达感兴趣mAb的人类B细胞的分离受到抗体分泌阻碍。

多种不同的抗体分泌细胞种群可从具有特定分布的人类供体(例如，幼稚、已接种的、或多或少新近感染的和血清阳性的个体)并从B细胞存在其中且发挥其活性的不同组织(例如，血液、扁桃体、脾、淋巴结)中分离(Viau M and Zouali M，2005)。

人类单克隆抗体的鉴定需要广泛筛选永生化B细胞种群，其中在细胞培养条件下每一个细胞均分泌足够量的特异性单克隆抗体用于其表征(Cole S et al.，1984；James K and Bell G，1987；Borrebaeck C，1989)。然而，用于抗体分泌细胞选择、活化和永生化的技术仍然存在技术问题(抗体产率、永生化效率、某些同种型的过度提呈、细胞稳定性和生长)，导致用于筛选分析的细胞和所分泌抗体的数量不足。

考虑到从人类抗体分泌细胞获得稳定杂交瘤的困难，一种已经广泛用来生产和分离人类抗体分泌细胞的方法是用EB病毒(EBV)永生化人类B细胞，已知EB病毒可用来诱导多克隆B细胞活化和增殖(Sugimoto M et al.，2004；Bishop G and Busch LK，2002)。

抗体分泌细胞已经通过利用不同来源的人类B细胞通过EBV永生化而生成，这些来源例如利用标记抗原预选的健康对象外周血(Casali P et al.1986)、淋巴结、脾或来自患者的外周血(YamaguchiH et al.，1987；Posner M et al.，1991；Raff H et al.，1988；SteenbakkersP et al.，1993；Steenbakkers P et al.，1994)、扁桃体(Evans L et al.，1988)或胸膜液(Wallis R et al.，1989)。

然而，由于EBV感染的人类B细胞的较低可转化性、较低可克隆性以及固有的不稳定性和异质性，所以有用的抗体分泌型B细胞经常在该过程中丢失(Chan M et al.，1986；James K and Bell G，1987)，使得在EBV感染后必须采用进一步的细胞融合步骤(BronD et al.，1984；Yamaguchi H et al.，1987；Posner M et al.，1991)。实际上，一些作者总结到，用于生产稳定的人类IgG抗体分泌型人类单克隆细胞培养物的最佳方法基于人类淋巴细胞与骨髓瘤细胞系的融合(Niedbala W and Stott D，1998；Li J et al.，2006)，尽管存在上文论及的利用人类杂交瘤的技术困难。

针对改进永生化过程，已经进行了各种尝试，例如，通过在单一过程中联用不同的方法(用致癌病毒永生化，用癌基因进行转化，微电融合，小鼠-人类异源融合)(US4997764；Steenbakkers P et al.，1993；Dessain SK et al.，2004)。已通过在细胞培养中联用各种处理而将人类单克隆抗体从已活化且永生化的B细胞中分离(在抗原存在或不存在的情况下)(Borrebaeck C et al.，1988；Davenport C et al.，1992；Laroche-Traineau J et al.，1994；Morgenthaler N et al.，1996；Niedbala W and Kurpisz M，1993；Mulder A et al.，1993；WO 91/09115；Hur D et al.，2005；Traggiai E et al.，2004；Tsuchiyama L et al.，1997；WO 04/076677；WO 88/01642；WO 90/02795；WO 96/40252；WO02/46233)。

通常，关于分离并永生化抗体分泌细胞(尤其是人类起源的)的方法，文献未提供对如何设计获得最大的永生化抗体分泌细胞库的整个过程(即从生物样品中纯化表达抗体的细胞直至筛选在细胞培养条件下分泌的抗体)的清晰理解。

很明显，提供用于建立较优化过程的方法将是有好处的，其中，通过在细胞培养中采用特定手段和条件而以抗原依赖性方式改进抗体分泌细胞的选择和存活(但具有感兴趣的特定同种型)，所分泌抗体的高通量分析可在保存于细胞培养条件下的最大可能的永生化抗体分泌细胞种群上进行。这个过程还将加速利用分子学途径来克隆抗体基因的方法的进程，因为具有感兴趣同种型的抗体从其克隆的B细胞种群可以对检测分泌具有期望活性的抗体的细胞进行重复分析并以存活状态保存用于将来的分析。

发明内容

本发明基于以下观察结果，即文献中尚未以有效方式选择和组合用于选择、刺激和永生化抗体分泌细胞的条件和方法(手段，means)，以改进培养条件下的细胞存活性及其对永生化试剂的敏感性。

事实上，人们惊奇地发现，这些条件和方法的特定组合不仅改善了细胞永生化而且显著增强了整个过程的通量和再现性，该整个过程用来以不依赖抗原的方式生产大量分泌特定同种型抗体并且可以存活状态保存的永生化细胞种群。

实际上，本发明的方法提供了可作为抗体分泌型、同种型特异性细胞文库使用和保持的多克隆细胞种群。利用该方法，在细胞培养条件下分泌具有不同功能和/或结合活性的抗体的特定寡克隆或单克隆细胞种群可在任何希望的时刻检测和分离(图1)。

本发明提供了一种用于永生化可分泌一种或多种特定同种型抗体的细胞种群的方法，包括以下步骤：

a)以不依赖抗原的方式且基于至少一种细胞表面标记物的表达而从一种或多种生物样品中选择分泌抗体的细胞种群；

b)在细胞培养条件下用至少一种刺激剂刺激所选定的细胞种群；

c)从细胞培养物中去除刺激剂；

d)从细胞培养物中选择表达该特定同种型抗体的受刺激细胞种群；

e)使所选定且已刺激的细胞种群在细胞培养条件下暴露于永生化试剂；

f)从细胞培养物中去除永生化试剂；其中永生化试剂是病毒永生化试剂。

另外，在步骤f)之后可以进行以下步骤：

g)在细胞培养条件下保持从细胞培养物获得的细胞种群；

h)确定细胞培养物中分泌特定同种型抗体的细胞种群的数量、存活性和/或增殖活性。

该示意过程可通过采用额外的条件和手段进行整合和修改，涉及到：

-可从其分离细胞的供体或生物样品的鉴定；

-用于选择、刺激和/或永生化抗体分泌细胞的特定手段；

-在细胞培养条件下允许永生化抗体分泌细胞种群保持、生长和增殖的细胞培养条件；

-用于确定细胞培养物中分泌特定同种型抗体的细胞种群的数量、存活和/或增殖活性的方法；

-抗体的期望性能以及经选择用于筛选永生化抗体分泌细胞的相关测定。

在获得可在细胞培养条件下作为永生化细胞种群保持的细胞的最大多样性和数量的范围内，本发明的方法提供了用于优化抗体分泌细胞的选择、刺激、永生化和克隆的手段与条件。事实上，所得细胞种群可看作是分泌抗体并且可在其根据本发明方法生产后立即接受期望的筛选分析或者部分或全部被冷冻并在以后的一种或多种筛选分析中使用的永生化细胞文库。

通过本发明方法获得的细胞种群可分成多个在细胞培养条件下分泌抗体，尤其是分泌具有期望抗原特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的寡克隆或单克隆细胞种群。事实上，这些细胞培养物的上清液用于检测包含具有这种抗原特异性和/或生物学活性的抗体的培养物。该抗原结合特异性和/或生物学活性可针对任何感兴趣的人类、哺乳动物、病毒、细菌、植物、寄生虫、有机或无机抗原。

这些细胞种群的成功分离取决于这些细胞的生长、用来筛选细胞种群的分析方法以及起始材料(通常为来自一个供体或一组供体的外周血)中抗原特异性B细胞的频度。事实上，永生化抗体分泌细胞应当在允许最大细胞增殖和免疫球蛋白分泌以及直接使用细胞培养物上清液来检测期望活性的条件下进行培养。如果需要，细胞种群可以进一步细分用于筛选表现出期望抗原特异性和/或生物学活性的细胞池，直至分离出一种或多种细胞培养物，其中每一种均在该细胞上清液中分泌具有期望抗原特异性和/或生物学活性的单克隆抗体。

因此，通过扩增细胞培养物以及从该细胞培养物的上清液中纯化单克隆抗体可生产具有期望抗原特异性和/或生物学活性的单克隆抗体。另外，随后可分离编码单克隆抗体的DNA并用于该抗体在宿主细胞中的重组表达。

本发明进一步的目的是通过本发明方法获得且在细胞培养条件下保持的永生化抗体分泌细胞种群(尤其是抗体分泌细胞的多克隆、寡克隆和单克隆细胞培养物)，其中本发明方法可用于鉴定和生产具有期望抗原特异性和/或生物学活性的单克隆抗体抗体分泌抗体分泌。这些抗体可直接从细胞培养物纯化或者利用编码抗体的DNA序列作为重组蛋白生产并从特定细胞培养物分离。另外，包含编码一种或多种特定同种型抗体序列的DNA序列的DNA文库可利用从本发明的细胞种群尤其是从已证实分泌具有感兴趣的结合和/或生物学活性中任一种的抗体的细胞种群分离的核酸进行制备。

本发明的其他目的涉及通过本发明方法从抗体分泌细胞获得的细胞种群、细胞培养物、细胞培养物上清液以及DNA文库用于鉴定和生产单克隆抗体。这些通过本发明的方法获得的产品也可包括在用于鉴定和生产具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的试剂盒中，或者用于确定个体(或个体种群)对(自体)同源或异源抗原、病毒、细菌细胞、毒素、寄生虫细胞或疫苗的同种型特异性免疫反应的特征。

通过本发明方法获得细胞种群和细胞培养物可包括在用于生产在细胞培养物上清液中分泌单克隆抗体且可在纯化单克隆抗体的范围内扩增的细胞培养物的方法中。

实施例提供的手段与条件可用于在生产EBV永生化的人类B细胞种群的范围内使用本发明的方法而从相同生物样品获得表达抗原特异或病毒特异的人类IgG抗体的单克隆或寡克隆细胞种群。

附图说明

图1：一个包括用于获得永生化抗体分泌细胞的本发明方法的用于分离和表达单克隆抗体的过程的示意图。

图2：对IL-2(1000U/ml)单独存在或与CpG2006、LPS、SAC或CD40L共同(组合)存在的情况下培养的原代B细胞增殖的影响。通过磁性分离将人类CD22阳性B细胞从5个供体合并(pool)的PBMC中纯化。B细胞在指定浓度化合物存在的情况下培养4天。仅在最后一天将³H-胸苷加入培养基中，将该细胞与标记的核苷酸一起孵育8-12小时。在所有实验中提供用仅培养基、含IL-2的培养基或含CpG2006的培养基培养的样品。如所指出的，检测IL-2与刺激剂LPS(A)/SAC(B)和CD40L(C)组合物的效应。以三个重复孔的平均值报告每分钟计数的值(cpm)。(A)、(B)和(C)之间绝对cpm值的差异是由于每一个实验使用的³H-胸苷批次的特定活性差异。

图3：CpG2006对人类CD22阳性B细胞增殖的剂量依赖性效应。人类CD22阳性B细胞通过磁性分离从合并自5个供体的PBMC中纯化获得。B细胞用指定浓度的CpG2006和IL-2(1000U/ml)培养2天。存活细胞的数量通过台盼蓝染料排除法在显微镜下确定。平行地，将来自每一种指定培养条件的一万个情形(细胞)通过流式细胞仪(B)进行分析，检测存活细胞(黑色条)和母细胞(即具有较高前向和正交散射的细胞，白色条)的百分数。

图4：对通过磁性分离从5个供体合并的PBMC中纯化的CD22或CD19阳性B细胞的存活性和母细胞形成进行基于FACS的分析。培养4天之前(A)或之后(B)联用CpG2006(1μg/ml)和IL-2(100U/ml)(B)进行该分析。在每个图中，通过正向散射(水平轴)和正交散射(垂直轴)分析10,000个细胞，分别作为大小和粒度的测量值。在R1区对存活B细胞设定门控。在R1外部，具有较低正向散射的死细胞沿垂直轴排列。存在母细胞分化的细胞具有较高的正向和正交散射。

图5：用刺激剂(CpG2006与IL-2组合物)刺激的B细胞中细胞增殖和细胞存活的动力学。人类CD22阳性B细胞通过磁性分离从5个供体合并的PBMC中选择。在CpG2006(1μg/ml)和IL-2(1000/1)存在的情况下，培养细胞达到指定时间点。增殖通过³H-胸苷掺入(incorporation)来评估。

图6：CpG2006与IL-2组合物对EBV-介导的人类B细胞永生化的影响。(A)CD22阳性B细胞通过磁珠选择从5个供体池中纯化并在仅培养基(黑色条)或含CpG2006(1μg/ml)和IL-2(1000/1)的培养基(白色条)中培养2天。然后清洗细胞并通过细胞分选排除IgM阳性细胞。CD22阳性、IgM阴性细胞通过在含EBV的上清液/细胞培养基(50％V/V)中过夜培养而永生化。移去含EBV的细胞培养基并将细胞在含IL-2(1000U/ml)的培养基中培养，以受辐照同种PBMC作为饲养层，培养达到指定的天数。(B)CD22阳性、IgM阴性B细胞通过磁珠选择从5个供体的混合物中纯化并通过用含EBV的培养基(30％V/V)培养而永生化，其中在CpG2006(1μg/ml)和IL-2(1000/1)存在(白色条)或不存在(黑色条)的情况下，利用受辐照同种PBMC作为饲养层。在(A)和(B)中，存活淋巴母细胞(大细胞)的数量通过台盼蓝染料排除法在显微镜下进行评价。

图7：用CpG2006和IL-2预刺激2天后、永生化后和培养10天后，CD22阳性、IgM阴性B细胞的表型、EBV(在不存在EBV和CpG2006的情况下，含IL-2和受辐照同种PBMC饲养层)。(A)通过FACS点-线分析对一万个细胞进行分析，其中垂直轴表示IgM荧光水平而水平轴表示正向散射(作为细胞大小的测量值)。存活母细胞(具有高水平的正向散射)都包含在右侧象限内。IgM阴性细胞在下边两个象限中表示，其中不表达IgM抗体的存活母细胞(且大多数表达IgG抗体)在右下象限中示出。(B)利用EBV永生化、CD22阳性、IgM阴性B细胞(如根据(A)刺激和选择的)上清液进行的免疫扩散分析。测定前将用过的培养基浓缩5倍。该测定利用同种型特异抗体来评价细胞培养物上清液中所分泌的总人类免疫球蛋白(αhlg)、人类IgM(cchlgM)和人类IgG(cchlgG)。

图8：按照BASIC(基础)、COMBINED(组合)和SEQUENTIAL(依次)方法所获得多克隆的细胞种群的比较。(A)按照BASIC、COMBINED和SEQUENTIAL方法用于制备多克隆细胞种群的步骤概述。(B)根据细胞总数(通过流式细胞仪测定)和存活细胞的比例(通过碘化丙锭排除法和流式细胞仪测定，如在材料和方法中描述的)比较这些种群。

图9：CD22阳性、IgG阳性B细胞利用BASIC、COMBINED和SEQUENTIAL方案(如在图8和实施例2中描述的)进行制备。10天培养结束时，通过流式细胞仪(利用碘化丙锭排除法；左图)分析所得细胞种群的CD23表达，尤其是那些在R2下形成门控的细胞(利用直接免疫荧光；右图)。在这些细胞(基本上是存活淋巴母细胞)中CD23的表达水平在水平轴上以荧光的log值表示(高，中)，表达特定量CD23的细胞相对数量则在垂直轴上示出。利用标记的、同种型匹配的阴性对照抗体，可确定作为阴性(neg)考虑的荧光水平。

图10：利用BASIC、COMBINED和SEQUENTIAL方法制备的细胞培养物中IgG分泌的分析。培养10天后收集无细胞上清液(参见图8A)，并利用总人类IgG ELISA商品化试剂盒在系列稀释的上清液中测量IgG浓度。每个上清液中的IgG绝对量通过与ELISA试剂盒制造商提供的纯化人类IgG标准曲线进行比较而测得，其中线性范围在～150μg/ml达到平台。来自连续过程上清液的所有稀释液均得到超出标准曲线线性范围的测量结果，并且可仅从这些测量结果外推，总IgG的浓度超过200μg/ml。因此，将结果用混乱的线绘出。

图11：用于鉴定可分泌结合和/或中和人类巨细胞病毒的IgG抗体的人类B细胞的通用过程示意图，包括本发明的方法，用于永生化抗体分泌细胞如人类B细胞。

图12：利用图11中改进的过程获得的EBV永生化的、IgG分泌型人类B细胞培养物的鉴定，用于分离具有不同活性的IgG抗体。(A)来自CMV血清阳性供体的EBV永生化B细胞培养物的上清液与指定的人类巨细胞病毒(CMV)的分离株一起孵育，然后加入指定的人类细胞中。AD169是人类CMV的实验用菌株。VR1814是人类CMV的临床分离株。HELF是人胚肺成纤维细胞，而HUVEC是人类脐静脉内皮细胞。所选的包含细胞培养物上清液的人类IgG抗体的中和活性以CMV感染活性的降低表示(代表至少两种测定)。通过检测CMV早期速发抗原(IEA)的免疫组织学染色而获得数据。阴性对照仅含细胞培养基。(B)合并来自EBV永生化人类B细胞培养物的上清液(5个上清液/池)，并在ELISA中检测结合人类HSP60蛋白的人类IgG抗体。数据表示平行孔的平均值。线表示参照值(是仅利用细胞培养基(RPMI-1640和10％FCS)所观察到水平的3倍)。阳性对照样品(针对HSP60的商品化小鼠抗人类抗体，在指定浓度下)和阴性对照样品(mIgG，非特异性小鼠IgG)用抗小鼠IgG显色。所有其他对照样品(两个仅含培养基的阴性对照或不相关的人类IgG、hIgG)以及含细胞培养物上清液的样品用商品化抗人类IgG抗体显色。

图13：按照本发明的方法制备永生化抗体分泌细胞种群的步骤概述，从表现出CMV中和活性的人类供体的血液开始。永生化的寡克隆和单克隆细胞种群已经根据在细胞培养物上清液中鉴定的抗体性能加以鉴定：分泌结合总CMV蛋白提取物的抗体(如利用试剂盒，BEIA-CMV ELISA测定的)、结合特定抗原的抗体(利用CMV蛋白gB和gH的片段测定的)和/或在体外分析中中和CMV感染的抗体。

图14：已经利用图13中改进的过程获得的EBV永生化、IgG分泌型人类B细胞培养物的鉴定，用于分离结合CMV蛋白的IgG抗体。来自血清中具有中和活性的CMV供体的CD22阳性、IgG阳性B细胞利用如在实施例2中描述的SEQUENTIAL方案制备。收集利用所得种群生成的细胞培养物培养10天(CMV5批量培养)的上清液并保存于4℃，并用在材料和方法中描述的BEIA-CMVELISA试剂盒进行检测。然后，将该细胞培养物以20个细胞/孔分到96孔板中并在受辐照同种PBMC饲养层、CpG2006和IL-2存在的情况下培养4周。从含活跃增殖的细胞种群的孔制备的无细胞上清液利用BEIA-CMV ELISA试剂盒进行筛选。阳性对照(校准物2，10AU/ml)包含于ELISA试剂盒中并按照制造商说明书使用。阴性对照为仅含培养基(含L-谷酰胺、NEAE、10％FCS、CpG2006和IL-2的IMDM)。图中示出了20个代表性细胞培养物的结果。水平线示出了用于该测定的2倍截断值。

图15：孔9G8中细胞所分泌抗体的重链(A；VH；SEQ ID NO：3)和轻链(B；VL；SEQ ID NO：8)中可变区的蛋白序列(参见图14)。重链的CDR序列(HCDR1，SEQ ID NO：4；HDCR2，SEQ ID NO：5；HCDR3，SEQ ID NO：6)和轻链的CDR序列(LCDR1，SEQ ID NO：9；LDCR2，SEQ ID NO：10；LCDR3，SEQ ID NO：11)基于由IMGT(Giudicelli V.et al.，2004；available athttp://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/index.html)提供的比较已知抗体序列的不同方法如V-Quest加以预测并强调。来自该细胞培养物的一万个细胞用于利用标准方案确定两个序列。沉淀细胞并提取mRNA以便利用简并VH和VL引物通过5’RACE扩增生成cDNA，然后将该序列克隆入用于转化细菌细胞的质粒中。编码重链(SEQ ID NO：2)和轻链(SEQ ID NO：7)中可变区的共有DNA序列利用至少4个独立细菌细胞克隆体的序列而确定。

具体实施方式

本发明提供用于改善效力的方法，通过该方法可生产永生化抗体分泌细胞并根据所分泌抗体的抗原特异性和/或生物学活性而加以筛选。

特别地，实施例示出了在细胞培养条件下如何通过对从供体分离的原代细胞恰当联用手段与条件而改善人类B细胞(其利用EB病毒而永生化)的增殖活性、存活和抗体分泌。

已发现，选择与细胞选择和刺激相关的特定手段与条件对于获得存活的增殖性抗体分泌细胞具有意外而重要的增强作用，有助于得到密度和数量较大的永生化抗体分泌细胞，其随后可直接利用细胞培养上清液进行筛选。

实施例还示出了可根据一个或多个细胞表面标记物对来自生物样品的细胞进行初步选择，随后是刺激阶段，其中细胞暴露于一种或多种刺激剂。然而，在确定的浓度比下，刺激剂只有施予特别选择的细胞种群达恰当的时期，才能发挥其最大活性，而不影响细胞的存活和增殖。此外，在刺激步和永生化步之间应形成明显的时间和物理区别，如果将细胞同时暴露于刺激剂和永生化试剂则负向作用明显。

特别地，实施例示出了如何将这些因素结合起来以构建对人IgM阴性(或IgG阳性)B细胞的EBV永生化有效且可重复的方法，随后B细胞可根据其所生产抗体的结合和/或功能特性(例如中和人类细胞的巨细胞病毒感染)利用其细胞培养物上清液而克隆和筛选，最后，该人类B细胞可被分离并克隆用于进一步的表征和抗体(以重组蛋白形式)生成。

在仅涉及抗原特异性细胞种群(其已提前在体外免疫接种)的文献中，已经披露了关于细胞选择和活化的独立步骤的连续方法，除了(或代替)病毒永生化试剂外常常利用与骨髓瘤细胞的融合。

因此，初始B细胞种群可利用细胞毒性试剂排除特定细胞型然后暴露于结合有细胞因子和生长因子的抗原(Borrebaeck C et al.，1988；Davenport C et al.，1992；Laroche-Traineau J et al.，1994)或者暴露于抗原特异性淘选程序，然后于饲养细胞层上进行扩增后加以筛选(Steenbakkers P et al.，1993；Steenbakkers P et al.，1994)。

现在抗体分泌已可利用标准EBV永生化或者联用EBV和癌基因介导的转化(US4997764)、EBV永生化或非特异性细胞活化后与骨髓瘤细胞系融合(Niedbala W and Stott D，1998；WO 02/46233)、EBV永生化后选择表达具有特定同种型的抗体的细胞(Morgenthaler N et al.，1996)或者细胞选择后在B细胞活化剂存在的情况下采用EBV永生化(WO 91/09115；Hur D et al.，2005；Traggiai E et al.，2004；Tsuchiyama L et al.，1997；WO 04/076677)来永生化抗体分泌细胞种群。

然而，这些文献中没有一个提供了连结永生化之前获得细胞选择和活化的手段和条件与提供(尤其是)多克隆细胞种群的病毒永生化过程效力的有效过程，该多克隆细胞种群可广泛且直接用于鉴定表达具有期望同种型和生物学活性的抗体的寡克隆或单克隆细胞种群。

本发明的主要目的在于一种用于永生化分泌一种或多种特定同种型抗体的细胞种群的方法，包括以下步骤：

a)以不依赖抗原的方式且基于至少一种细胞表面标记物的表达而从一种或多种生物样品选择分泌抗体的细胞种群；

b)在细胞培养条件下用至少一种刺激剂刺激所选定的细胞种群；

c)从细胞培养物中去除刺激剂；

d)从细胞培养物选择表达特定同种型抗体的受刺激细胞种群；

e)使所选定且已刺激的细胞种群在细胞培养条件下暴露于永生化试剂；

f)从细胞培养物中去除永生化试剂；

其中该永生化试剂是病毒永生化试剂。

该方法可与一系列通过采用该方法获得的细胞种群分析及应用相关的其他步骤加以整合(图1)。特别地，以下两个步骤应在步骤f)之后进行，因为它们对于建立包含该细胞种群的细胞培养物非常重要：

g)在细胞培养条件下保持从细胞培养物获得的细胞种群；

h)确定细胞培养物中分泌特定同种型抗体的细胞种群的数量、存活和/或增殖活性。

正文和附图提供了关于如何应用本发明的方法的进一步细节，尤其是应用于从外周血样品分离的人类B细胞，从而提供分泌感兴趣抗体的单克隆细胞培养物。

事实上，一方面，本发明方法允许获得以不依赖抗原的方式有效表现出从个体取出并通过病毒永生化捕获的原代细胞中所表达的期望同种型抗体库异质性的细胞种群。

另一方面，通过本发明方法获得的存活更加均一且高度增殖的永生化抗体分泌细胞种群允许借助于可在细胞培养条件下(例如细胞种群、抗体含量高的细胞培养物上清液)或作为其他分子实体(例如，利用从寡克隆细胞种群提取的核酸制备的DNA文库)获得的不同生物学产物对这种抗体库进行更加深入的分析。

此外，本发明方法提供可以获得足够抗体以及可分泌在细胞培养物中直接表征的抗体的永生化细胞的可能性，其中该细胞培养物通过划分经统计包含20个或更少细胞的池中的多克隆永生化抗体分泌细胞(新鲜制备的或提前制备的、冷冻的以及解冻的)种群而生成，并在标准条件下培养。克隆步骤较少(理论上仅一个，而非常规的两个或多个步骤)缩短了用于鉴定分泌感兴趣抗体的永生化细胞的时间，减少了其在亚克隆步骤中丢失的风险并加速了在不同体内或体外分析中抗体的表征过程。这对于可较快速和成功实现特异于治疗靶标的稀少抗体的分离尤其重要。

因此，本发明方法可加以修改并整合于较复杂方法中，用于鉴定和生成正文(特别参见实施例3)和附图(特别参见图1、11和13)中总结的特定同种型单克隆抗体。

接下来的段落中提供适用于本发明方法的手段与条件的定义和进一步的细节并描述该方法和可利用该方法获得的产品(细胞种群、细胞培养物、细胞培养物上清液和抗体，特别是人类单克隆抗体)的可能用途。

术语细胞“种群”通常是指利用相同标准分离或利用相同方法生产的任何细胞群(本发明中为抗体分泌细胞)。例如，细胞种群是那些从选择步骤(例如细胞分选)、处理(例如利用刺激剂或病毒永生化试剂)或者将细胞培养物或细胞种群划分为经统计含相同细胞量的较小细胞池(例如，亚克隆细胞培养物时或制备小瓶永生化细胞以长期冷冻保存时)而得到的种群。细胞种群应当是存活的但并非必需发挥特定的生物学活性(例如，生长、增殖或分泌抗体)，如在细胞培养条件下所表现的情形。

术语细胞“培养物”是指在使细胞表现出生物学活性(例如，生长、增殖或分泌抗体)和/或用特定化合物(例如，刺激剂或病毒永生化试剂)处理所述细胞的范围内，保存于容器(例如培养板的孔、皮氏培养皿、烧瓶、玻璃瓶)中的细胞种群。这些实验条件(即，细胞培养条件)包括采用培养箱，其保持在经恰当选择而适于细胞生长和增殖的温度和大气(与细胞培养基联合运用)中。

因此，细胞培养物由细胞种群以及细胞培养基(含血清、生长因子、细胞因子、营养素等)构成，如果是抗体分泌细胞，则还包括培养用于支持所述细胞种群生长和增殖的其他细胞(所谓的“饲养细胞”)。几天或几周之后，细胞培养基的组成发生了改变，不仅由于细胞消耗还由于细胞分泌或当其进入凋亡或死亡时简单释放的各种分子。因此，定期用新培养基替换细胞培养基，或者可取出部分以分析该细胞培养基的含量。用过的培养基(文献中定义为细胞培养物的“上清液”，以及“废(spent)”或“旧(conditioned)”细胞培养基)可在固定时间点收集，以确定例如细胞培养条件下细胞种群所分泌抗体的含量和活性。应该采用该信息以及关于这些细胞存活和增殖的数据来确定细胞培养物的状态和可能用途(例如，在筛选分析中用于分离mRNA，用于纯化单克隆抗体，用于收集待冷冻的细胞等)。

术语“多克隆”是指表达大量不同抗体(例如，10³、10⁴、10⁵或更多)的细胞培养物或细胞种群，它们中的每一种均由该培养物或种群内的单个细胞或一群细胞表达。特别地，它适用于通过本发明方法获得的细胞培养物或细胞种群(由于其从生物样品中存在的细胞以不依赖抗原的方式而生成)，其在培养物或种群中未加以划分，或者至多在最初含50个或更多个细胞(例如200、500、1000或更多细胞)的培养物或种群中加以划分，如可经统计根据原始多克隆培养物或种群的稀释度而确定的。

术语“寡克隆”是指由细胞培养物或种群分成最初包含少于50个细胞(40、20、10、5、1或少于1个细胞)的培养物或种群而获得的细胞培养物或种群，如经统计根据原始培养物或种群的稀释度而确定的。

由细胞培养物或种群分成最初包含20个或更少细胞的培养物或种群而得到的寡克隆细胞培养物或种群非常重要。事实上，如果在所得细胞培养物中检测到单一或很大程度上显著的生物学特征(例如抗体，其可利用生物学分析鉴定为细胞培养物上清液中分泌的蛋白或利用RT-PCR鉴定为从该培养物分离的mRNA中的转录基因)，则可认为这种细胞培养物是单克隆细胞培养物。

“单克隆细胞培养物”是仅(绝大多数)包括彼此相同的细胞的细胞培养物，通过单个细胞(克隆体)增殖(以及，可选地，分化)起源的，至少由于它可基于用来选择细胞培养物的特定生物学特征(例如分泌特异性抗体)进行评价。因此，来源于这种培养物的抗体、细胞种群或细胞培养物可表示为“单克隆”的，即使可能需要进一步的实验活动，从而以较精确的方式证实克隆形成能力。

术语“永生化的”通常指在所选定且已刺激的细胞种群暴露于病毒永生化试剂之后，根据本发明方法获得的细胞培养物和种群。即使病毒永生化可能与特定病毒产物(例如，蛋白，转录本)的存在相关，但是当细胞在细胞培养条件下表现为连续生长和增殖时也将其定义为永生化。如在实施例中示出的，从生物样品获得且表达抗体的原代人类B细胞已成功用来获得多克隆细胞种群，其随后用来生产包含至少10⁴个细胞的寡克隆细胞培养物。当培养物从100、50、20或甚至5个细胞开始时，该细胞总数仅与细胞分裂次数(10次或更多次细胞分裂)相容，通常仅永生化细胞可在细胞培养条件下发生分裂。

术语“抗体分泌细胞”指包含用于表达抗体的基因且能够向胞外空间(例如，体内血液中或体外细胞培养物上清液中)分泌抗体的原代细胞。

术语“永生化抗体分泌细胞”指暴露于病毒永生化试剂之后，在细胞培养条件下无限或至少一段时期生长、增殖和分泌抗体的抗体分泌细胞和/或多种细胞的分裂次数在很大程度上优于如果该原代细胞未暴露于病毒永生化试剂所观察到的情形抗体分泌。特别地，通过本发明方法得到的的多克隆细胞种群富含存活的生长性淋巴母细胞(其是永生化抗体分泌细胞)，其随后在细胞培养条件下形成寡克隆和单克隆细胞种群。

术语“刺激剂”指化合物或化合物特定组合，其能够在细胞培养条件下产生由抗体分泌细胞介导的刺激反应、抗体分泌诱导这些细胞的增殖和芽殖状态以及形成淋巴母细胞(较大的存活细胞，如通过显微镜和通过在FACS上的前向/正交散射所检测到的)。

术语“刺激阶段”是指一个时期，在该时期内所选定的抗体分泌细胞暴露于刺激剂。

术语“病毒永生化试剂”是指病毒粒子、DNA或蛋白中的任一种，其允许从分离自生物样品的原代细胞生产永生化细胞。在本发明中，该原代细胞是抗体分泌细胞，尤其是人类B细胞，现在已经鉴定了用于人类B细胞的不同的病毒永生化试剂。

术语“永生化阶段”指一个时期，在该时期内所选定且已刺激的抗体分泌细胞暴露于病毒永生化试剂。

实施本发明方法前的预备步骤是鉴定应从其分离包含抗体分泌细胞的生物样品的个体或组织。

如在本发明背景技术中指出的，表达和分泌抗体的细胞已经从不同组织和器官包括血液、扁桃体、脾、生物体液(如脑脊髓或胸膜液)、淋巴结以及其他淋巴器官分离并永生化。

可利用本发明方法永生化的细胞应从这些哺乳动物组织和器官提取。很明显，优选人类起源的细胞用于生产分泌具有治疗或诊断用途的人类单克隆抗体的细胞培养物。然而，这些方法还可应用于非人类抗体分泌细胞(例如，啮齿类或猿猴起源的细胞)。

可从人类供体分离到多种不同类型的原代抗体分泌细胞种群，根据免疫细胞供体的状态以及所寻求抗体的同种型和活性，供体具有的抗体谱是较合适的。。

本发明方法可应用于鉴定通过选自供体的人类B细胞所表达的单克隆抗体，供体例如暴露于感染试剂或患特定形式癌症或自身免疫疾病的患者。因此，该供体可以是天然的、接种的、受一种或多种疾病或感染累及的、已经暴露和/或耐受特定治疗性处理的、呈现特定临床指数或状态的、非有意暴露于病原体等的。

供体的血清本身可初步确定其对抗原的血清阳性，这是由于适应性免疫反应的特异性和长期保持(甚至在末次暴露于该抗原之后几年)可以允许进行定性检测，这足够用于筛选供体。所采用筛选分析的性质和灵敏度在鉴定最适供体时非常关键，并且优选地，用来筛选供体血清的分析应与用来从永生化抗体分泌型B细胞筛选上清液且设计用来检测具有期望功能活性(即，防止病毒进入细胞，或结合肿瘤相关抗原)的抗体的分析相同。

在临床上，细胞从其纯化的组织或器官的选择可以足量从细胞可利用度来指示，用于实施整个过程。考虑到细胞可以较小量从人类临床样品获得和/或在不同于可实施永生化方法的位置制备，则这些细胞可从冷冻样品和/或从来自多个个体的样品而获得，其中该多个样品已混合以提供足够起始材料。

因此，可利用包含抗体分泌细胞的样品(如总外周血或血清)抗体分泌对一组候选供体进行初步筛选。特别地，可利用用于分离外周血单核细胞(PBMC)的标准分离技术如梯度离心，从血液或淋巴组织分离单核细胞。在该分离步骤之后和/或之前，血清(或血浆)、细胞培养物上清液或细胞的样品(获自不同患者、不同组织、和/或不同时间点)可利用用于检测抗体和抗体分泌细胞存在的标准方法(例如，ELISA、BIACORE、蛋白质印迹、FACS、SERPA、抗原阵列、在细胞培养系统中中和病毒感染或ELISPOT分析)进行初步筛选。

文献提供了这些技术的若干实例，其示出了例如ELISPOT用于表征接种供体中免疫反应的用途(Crotty S et al.，2004)、抗原微阵列作为用于新近感染患者的诊断工具的用途(Mezzasoma L et al.，2002)，以及用于检测抗原特异性免疫反应的其他技术(Kern F et al.，2005)。还可根据特定病毒的血清阳性与肿瘤形成相关改变之间的关联性而选择供体(Butel J，2000)。

这种对治疗靶标的抗体反应的初步定性分析(在总体水平或同种型特异活性水平进行评价)应允许鉴定具有表达较高抗体效价的B细胞的供体，该抗体针对期望纯化抗原(例如，涉及癌症的特定人类重组蛋白或特定病毒蛋白)、相关抗原的混合物(例如，获自部分纯化的病毒制品)或生物测定(例如病毒感染的中和)。

一旦选择了一个或多个供体，则B细胞来源可以是脾、血液、淋巴结、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、来自慢性感染/炎症部位的淋巴细胞。然而，外周血通常更易于从供体得到、保存以及在指定时期内监控针对抗原的血清学反应。

例如，从5-50ml的外周血可纯化出大于1千万-1亿个PBMC(外周血单核细胞)，利用本发明方法永生化后，该细胞数量应当能够获得待筛选的足够大的抗体分泌细胞种群。

在从生物样品分离PBMC之后，可利用文献中描述的多种方法之一抗体分泌，根据其表面的细胞表面标记物的表达(如果恰当，其他蛋白的表达)以及该细胞的增殖活性、代谢状态和/或形态学状态而特异性选择抗体分泌细胞。

特别地，用于从人类样品纯化抗体分泌细胞的各种技术利用用于阳性或阴性选择的不同手段与条件。通过物理分离那些可表达细胞表面标记物(其特异于表达并分泌抗体的细胞，如人类B细胞)的细胞，这些细胞可以较容易且有效地进行选择。特定方案可在文献中查到(参见Callard R and Kotowicz K″Human B-cell responses tocytokines″in Cytokine Cell Biology：A practical Approach.Balkwill F.(ed.)Oxford University Press，2000，pg.17-31)。

所述选择通常利用特异性结合这些细胞表面蛋白之一且可连接于固态支持物(例如微珠或塑料板)或标记有荧光染料的抗体来实施，该荧光染料可利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行检测。例如，人类B细胞已经基于EBV永生化前其对结合CD19、CD27和/或CD22微珠的支持物(如微珠)的亲和力或者缺乏对特异于某同种型的抗体的结合亲和力而加以选择(Li H et al.，1995，Bernasconi N et al.，2003；Traggiai E et al.，2004)。

然而，细胞标记物的选择可能与永生化过程的效力有关，可能由于通过选择过程触发且可改变细胞生长和存活的胞内信号。事实上，本专利申请的实施例证实了，CD22(其是控制抗原识别和B细胞活化相关信号转导通路的B细胞限制性跨膜蛋白(Nitschke L，2005)似乎是用于初始B细胞选择的优选分子。由于CD22阳性种群包含的细胞表达具有不同同种型和特异性的抗体，所以可采用其他细胞表面标记物在刺激阶段之前或之后选择细胞。

可替换地或另外地，抗体分泌除基于CD22的选择之外可通过采用基于CD27的选择而实现抗体分泌细胞的特定富集。已知CD27是用于具有体细胞突变性可变区基因的人类B细胞的标记物(BorstJ et al.，2005)。其他标记物如CD5、CD24、CD25、CD86、CD38、CD45、CD70或CD69可用来排除或富集期望的细胞种群。因此，根据供体暴露于抗原(例如，病毒、细菌、寄生虫)的历史、抗体效价，可决定采用总B细胞、CD22富集的B细胞还是进一步富集的B细胞亚群如CD27阳性B细胞。

细胞选择之后，但在永生化阶段之前，细胞种群应暴露于恰当的刺激剂。在本发明中，认为三种主要的化合物为可采用(尤其是以组合方式)的适用性刺激剂。

第一组刺激剂由固有免疫反应的活化剂如B细胞上表达的Toll样受体的激动剂代表。已知Toll样受体(TLR)在细菌寡核苷酸以及其他可引发固有免疫和获得性免疫中涉及的各种各样细胞多克隆活化的化合物的识别中发挥重要作用(Akira S and Takeda K，2004；Peng S，2005)。这个部分由Toll受体介导的固有免疫反应通路是身体对侵入性有机物的最早反应之一，并且在形成引发由适应性免疫反应的B和T细胞介导的有效且特异反应所需的恰当环境和细胞因子微环境中发挥重要作用(Gay et al.，2006)。人类细胞系和原代细胞的这种反应性来源于一些Toll样受体(TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10)，其中每一种受体均具有特异表达谱、首选配体和识别条件。

特别地，人类TLR9识别寡核苷酸，较具体地，基于CpG的寡核苷酸(Hemmi H et al.，2000)。通过CpG基化合物如其中一种称为CpG2006的化合物，TLR9介导的活化触发细胞氧化还原平衡的改变，并诱导包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NKκB的细胞信号转导通路，随后生产促炎细胞因子、干扰素和趋化因子(Takeshita F et al.，2001；Hartmann G et al.，2000；Hartmann G andKrieg A，2000；Ulevitch R，2004)。由于TLR表达的严密调节，人类初始和记忆B细胞亚型可适应多克隆刺激物如CpG寡核苷酸而具有特异的增殖和分化性能。(Bernasconi N et al.，2003，Bernasconi Net al.，2002；Bourke E et al.，2003)。CpG寡核苷酸诱导固有免疫的激活并且可保护免受多种病原体的致死性攻击(Krieg A，2002)。例如，那些包含称为CpG-B基序的寡核苷酸是特别有效的原代B细胞Primary B cell活化剂(Krieg A et al.，1995；Gursel M et al.，2002；Klinman D，2004；Eaton-Bassiri A et al.，2004)。

现在已经鉴定了几种作为一种Toll样受体激动剂而活化的化合物(Coban C et al.，2005；Kandimalla ER et al.，2005；Hayashi E et al.，2005；Bourke E et al.，2003；Ambach A et al.，2004；Sen G et al.，2004)并且已经存在特异筛选技术，同样用于确定免疫球蛋白类和亚类的产量差异(Henault M et al.，2005；Cognasse F.et al.，2005)。

第二组刺激剂由细胞因子代表，特别是已知具有这种免疫刺激活性(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-13)且已在文献中做过比较的白介素(参见Callard R and Kotowicz K″Human B-cell responses tocytokines″in Cytokine Cell Biology：A practical Approach.Balkwill F(ed.)Oxford University Press，2000，pg.17-31)。

第三组刺激剂由TNF受体家族的细胞膜受体激动剂代表，尤其那些激活B细胞中NK-kB通路和的增殖的激动剂，如APRIL、BAFF或CD40L(Schneider P，2005；He B et al.，2004；Craxton A et al.，2003；Tangye S et al.，2003)。

应该指出，刺激剂的选择和浓度、其组合以及刺激阶段的时间长短必须加以选择，这对于获得细胞刺激和蛋白表达的最佳效应从而实现或促进抗体分泌细胞的永生化非常重要抗体分泌。

实施例表明有用的刺激剂，特别是当病毒永生化试剂是EB病毒时，可在以下化合物组合中进行选择：

a)基于CpG的寡核苷酸与细胞因子的组合；

b)TNF受体家族的细胞膜受体激动剂与细胞因子的组合。

根据其刺激性能，已将CpG2006与EBV同时使用以生产永生化人类B细胞(Traggiai et al.，2004；WO 04/76677)，如已经与可溶性CD40配体或针对CD40的激动性抗体一起使用的(WO 91/09115；WO 94/24164；Tsuchiyama L et al.，1997；Imadome K et al.，2003)。

然而，类似的方法对永生化B细胞的保存和筛选有负向影响，因为已知多克隆活化剂如CpG2006对克隆和/或随后筛选过程期间细胞培养物中可能存在的多种细胞类型均具有强有效的作用(Hartmann G and Krieg A，2000；Hartmann G et al.，2000)。特别地，CpG是细胞因子如单核细胞所分泌IL-12和IFN-γ的有效诱导剂，在后续生物测定中尤其是筛选抗病毒抗体时应当避免这些细胞因子的存在(Klinman D et al.，1996，Fearon K et al.，2003；Abel K et al.，2005)。

实施例示出了了人类CD22阳性B细胞是如何通过利用特定浓度的化合物而获得对CpG2006和IL-2组合物的最适反应的，且表明大量其他已知的刺激剂(例如LPS或SAC)并不提供这种反应。

所选定的抗体分泌细胞暴露于刺激剂的时间长短对于构建永生化这种细胞的有效方法特别重要。事实上，实施例表明刺激剂(CpG2006和IL-2)的组合对细胞存活和增殖尤其是在特定时间范围(例如约2至约4天的刺激)内发挥了了最大作用。然而，刺激剂和时间范围的可替换组合对EBV永生化或对其他病毒永生化试剂可以是同等有效的。

如果已证明对获得抗体分泌细胞的较好反应是有用的，则在永生化阶段之前可将刺激剂的组合物同时或依次(例如，在初始细胞选择之后立即加入第一种刺激剂而在几小时或几天之后加入第二种刺激剂)加入细胞培养基中。

刺激剂可直接从稀释的原溶液加入细胞培养基中，或者在利用例如脂质体或其他可改善其吸收和免疫刺激活性的化合物恰当配制之后加入(Gursel I et al.，2001)。还可将刺激剂连接于固体基质(微珠或直接连接于细胞培养板上)，且能允许较有效去除该刺激剂。

考虑到上文对在本发明方法的特定步骤应用刺激剂达特定时期的重要性所做的观察，抗体分泌随后应以可有效去除刺激剂的方式操作抗体分泌细胞，以避免对细胞培养条件下后续永生化和保存的任何负向影响。

因此，细胞可用新鲜培养基清洗一次或多次，并且可选地，保存于正常细胞培养基中(例如，达1天至6天)，以便进一步降低并去除刺激剂的任何残留效应，该残留效应甚至可通过将特定化合物加入细胞培养物中而抑制。

本发明方法适用于在刺激该细胞之后且在将所选定且已刺激的细胞暴露于永生化试剂之前(即，刺激阶段和永生化阶段之间)可根据所表达抗体的同种型而进一步选择的细胞。

应通过采用阳性选择(实现特定细胞的分离)或阴性选择(实现对不需要的细胞的去除)的手段来开展基于同种型的细胞选择。例如，考虑到批准用于医药用途的大多数治疗性抗体都是IgG(LaffyE and Sodoyer R，2005)，则仅受刺激的IgG阳性细胞种群可被阳性(通过FACS或磁性细胞分离器)选择，或通过耗尽细胞种群中表达IgM的细胞，由此富集表达IgG的细胞。利用荧光活化或磁性细胞分离器的抗体分泌细胞分离技术在文献中已经为人所知(Li H etal.，1995；Traggiai E et al.，2004)。根据抗体分泌细胞的来源及其最终用途，可能需要排除(或富集)表达IgD或IgA的细胞。

如果需要这种精确选择，则可采用类似方法根据特定亚类而分离细胞(例如，区别表达IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的人类B细胞)。

所选定且已刺激而表达具有特定同种型抗体的细胞种群现在即可利用病毒永生化试剂进行永生化。文献表明，对抗体分泌细胞可采用不同的永生化试剂抗体分泌，有时甚至在单个过程中进行组合以便获得永生化抗体分泌细胞。

在病毒永生化试剂中，优选将感染并永生化抗体分泌细胞的病毒应用于本发明方法中。具有这种优先性的病毒通常称为亲淋巴病毒并且归组到疱疹病毒属的γ类。该病毒家族的成员以物种特异性方式感染淋巴细胞，且与淋巴组织增殖失调和若干种恶性肿瘤的形成有关(Nicholas J，2000；Rickinson A，2001)。

EBV(EB病毒，也称为疱疹病毒4)和HHV-8(人类疱疹病毒8，也称为KSHV，卡波西式肉瘤相关疱疹病毒)感染并永生化人类淋巴细胞。MHV-68(鼠类疱疹病毒68)、HVS(松鼠猴疱疹病毒)、RRV(罗斯河病毒)、LCV(灵长类淋巴隐病毒)、EHV-2(马疱疹病毒2)、HVA(蛛猴疱疹病毒)以及AHV-1(狷羚疱疹病毒1)是其他致癌性亲淋巴疱疹病毒，它们之间具有一些保守的共同遗传特征，且在不同哺乳动物宿主细胞中具有类似致病作用。无论何时将本发明方法应用于从这些哺乳动物获得的抗体分泌细胞，均可采用这些病毒。

然而，不仅完全病毒可永生化B细胞，且包含由这些特定病毒和其他病毒所获得的特殊病毒蛋白的重组DNA构建体也已成功用来永生化B细胞(Damania B 2004；Kilger E et al.，1998)。包含病毒基因的类似载体可转导入细胞中，有时利用反转录系统或病毒样粒子转导入包装细胞系(反过来，其提供用于这些粒子形成的所有必要因子)中，也可用于本发明的方法中。

永生化阶段可持续1至几小时，达2-4天，即使实施例表明较长永生化阶段对于细胞存活可能是有害的，并且至少在EBV永生化中，4小时已足以构建淋巴母细胞的多克隆种群(较大的存活细胞，如通过显微镜和/或FACS检测的；参见图9)，其提供永生化抗体分泌细胞。

实施例表明，如果首先对CD22表达进行选择，然后利用刺激剂的恰当组合(CpG2006和IL-2)刺激达恰当时间(约2天至约4天)，最后根据优选的同种型(IgG阳性或富集的；IgM阴性或排除的)进行选择，则可利用EBV上清液有效地永生化人类B细胞。

EBV介导的B细胞永生化需要细胞表面受体CD21的表达，其中CD21被认为是主要EBV受体。CD21存在于大多数B细胞亚群上，并通过与CD19及B细胞抗原受体形成复合物而调节B细胞反应(Fearon D and Carroll M，2000)。然而，细胞广泛活化之后及当B细胞转化为浆细胞时，CD21从细胞表面丢失。因此，用EBV转化细胞的能力可以通过加入B细胞刺激剂而得以增强，但是所述条件必须确保CD21保持于细胞表面上，从而实现高效EBV永生化。

本发明示出了如何有效获得永生化抗体分泌细胞种群。事实上，富集了被选择且已永生化的B细胞的细胞培养物种群具有较强的生产有用治疗性抗体的可能性，同时在用EBV病毒永生化时将其生长能力保持为潜伏而非细胞溶解的状态。不同于其中B细胞可以被刺激以分泌IgG的其他方法，永生化过程允许该种群以高度增殖且能够分泌IgG的状态被“捕获”。来自永生化B细胞种群的上清液可用于分析具有期望活性的抗体的存在情况。随后永生化B细胞种群可经克隆以分离抗体分泌细胞的克隆体，通过分子学方法分离抗体基因或者以冷冻状态保存而用于将来的分析。

EBV介导的永生化是一个复杂过程，涉及由于EBV所表达蛋白的B细胞永生化，随后是受EBV与宿主细胞蛋白之间相互作用调节的永生化(Sugimoto M et al.，2004；Bishop G e and Busch LK，2002)。事实上，该永生化过程之后可检测特定EBV蛋白和转录本如EBNA2、EBNA1、LMP2、LMP1或EBER的表达(Thorley-LawsonDA，2001)。这些蛋白可通过PCR、免疫荧光、蛋白质印迹或其他允许检测感染细胞中EBV DNA和蛋白的方法进行检测(Schlee Met al.，2004；Park CH et al.，2004；Humme S et al.，2003；Konishi K etal.，2001；Haan K et al.，2001)。

加入细胞培养物中的EBV上清液的量可以是文献中通常指定的量(10％、20％、30％或更大)，但似乎方法可在EBV上清液的量相对较高(50％V/V)但暴露相对较短(约4至约24小时)的条件下恰当运行。

然而，重要的是，通过例如在新鲜细胞培养基中清洗和培养细胞种群而去除病毒永生化试剂(类似于对刺激剂所指出的)。

可利用以EBV实验、部分缺失或重组菌株中任一种(以及微EBV和其他EBV基载体)感染人类或啮齿动物细胞培养物的通用技术并从富含EBV的上清液中分离感染的细胞而生成用于本发明方法的EBV上清液(Speck P et al.，1999；Oh HM et al.，2003；Bass Hand Darke C，2004；Radons J et al.，2005；US5798230)。

实施例中提供的实验证据表明，通过其他永生化试剂可采用类似的方法。对用于从生物样品纯化抗体分泌细胞的选择手段的恰当组合、在细胞培养条件下刺激剂的恰当组合(如上文所述)以及保持于几小时或几天范围内的刺激阶段的恰当组合(但始终与永生化阶段分开)不仅可改善由EBV介导的永生化而且可改善由其他病毒永生化试剂介导的永生化，如通过其他致癌病毒的感染和/或由癌基因介导的转化。

在从细胞培养物中去除病毒永生化试剂之后，所得到的细胞种群特别富含(相比于其他方法)存活的增殖性淋巴母细胞(参见图9)，而无濒死或者分化的细胞，后者对于构建寡克隆和单克隆细胞培养物是不可用的，且会在细胞培养基中释放可负向影响所选定且已刺激细胞生长、增殖和/或抗体分泌的物质(如细胞因子、反应性氧中间体)。

在该意义上，根据本发明方法获得的多克隆细胞种群特别有用，通过划分这种多克隆种群获得的寡克隆或单克隆细胞种群(包含永生化抗体分泌细胞)也特别有用。

这些细胞种群可用于一系列应用中，尤其是与抗体分离、表征和生成有关的应用。

例如，包含编码一种或多种特定同种型抗体的DNA序列的DNA文库，其中该DNA文库利用从这些细胞种群分离的核酸而制备。利用常用分子生物学技术，mRNA或基因组DNA可从细胞样品提取，并在作为待筛选重组蛋白而表达这些序列的范围内特定地反转录(如有必要)并扩增样品中存在的编码抗体的所有序列的整体或部分(例如，仅结合抗原的可变区)，如文献中所述用于免疫接种的动物或杂交瘤的抗体(Gilliland LK et al.，1996；Lightwood Det al.，2006)。

因此，本发明方法提供可用于鉴定和生产具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的细胞种群、细胞培养物、细胞培养物的上清液以及DNA文库。

可替换地，如果获自由个体提供的抗体分泌细胞，则这种生物学产品可用于确定对特定个体中对自体同源或异源性抗原、病毒、细菌细胞、毒素、寄生虫或疫苗的同种型特异性免疫反应的特征(例如，鉴定由该个体的免疫系统普遍生成的抗体和/或普遍识别的抗原)。

考虑到这些生物学产品(即，本发明的细胞种群、细胞培养物、细胞培养物的上清液以及DNA文库)的广泛应用和稳定性(作为冷冻样品)，可将其包括在用于鉴定和生产具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的试剂盒中。例如，试剂盒的使用者可在实验室内筛选一组细胞培养物上清液或一组DNA文库中具有期望性能的单克隆抗体。

本发明提供了利用上述方法获得的永生化抗体分泌细胞的多克隆种群。这些细胞种群可在用于生产分泌单克隆抗体(其具有期望抗原特异性和/或生物学活性)的细胞培养物的方法中使用，该方法包括以下步骤：

a)在细胞培养物中划分权利要求5的细胞种群或权利要求6的细胞培养物，每一个均包含50个或更多个细胞；

b)筛选细胞培养物的上清液，用于检测那些表现出期望抗原结合特异性和/或生物学活性的细胞培养物；

c)在细胞培养物或种群中划分表现出期望抗原特异性和/或生物学活性的细胞培养物；

d)对所述细胞培养物重复步骤(b)和(c)直至一个或多个细胞培养物，每一个均在细胞培养物的上清液中分泌具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体。

可替换地，这些细胞种群可在用于生产分泌单克隆抗体(其具有期望抗原特异性和/或生物学活性)的细胞培养物的方法中使用，该方法包括以下步骤：

a)筛选通过权利要求6的多个种群获得的细胞培养物的上清液，用于检测分泌具有期望抗原特异性和/或生物学活性的抗体的一个或多个种群；

b)确定由该细胞培养物中每一个分泌且在上清液中表现出所述活性的抗体的序列；

c)分离在细胞培养物上清液中分泌具有这些活性的单克隆抗体的细胞培养物。

为了恰当实施这些方法，多克隆、寡克隆和单克隆细胞种群必须保持在恰当的细胞培养条件下，以检测其性能，尤其是与其在细胞培养物上清液中所分泌抗体的抗原结合和/或功能活性有关的性能。

在该意义上，永生化阶段后细胞培养条件的选择非常重要，以便支持永生化抗体分泌细胞的存活、增殖和抗体分泌。

在本发明中，细胞培养条件的选择对于构建、选择以及培养寡克隆和单克隆细胞培养物是决定性的。在该范围内，抗体分泌细胞混合物可保持在含有一种或多种刺激B细胞生长的试剂的细胞培养基中。

在EBV介导的永生化中，EBV感染应保持在潜伏期，以增强细胞的存活、增殖和IgG产量。然而，特定细胞培养条件的选择可以增强克隆效力和感兴趣单克隆细胞培养物的选择，如过去已综述过的(James K and Bell G，1987)。

第一个重要的方面是用于在永生化阶段之后培养抗体分泌细胞的饲养层(当细胞以低密度培养时)。饲养层可通过受照射的非同种/同种外周血细胞制剂、类淋巴母细胞或成纤维细胞系、脐带血淋巴细胞或不同类型的胚胎细胞构成。具有这些性质的细胞系的一个实例是EL4-B5，为可有效支持B细胞生长和增殖的突变EL4胸腺瘤细胞系(Ifversen P et al.，1993；Wen et al.，1987)。

第二个重要的方面是如何利用容器将这些细胞保存于培养基中。可采用不同的程序和材料，包括静止培养(在孔或烧瓶中)、均质悬浮培养(在连续搅拌反应器或滚筒瓶中)、或者固定培养(在中空纤维或其他支持物上)。

第三个重要的方面是细胞培养基的选择，以在实施本发明方法和永生化阶段之后培养细胞时保持细胞的存活和生长。特别是在该后一个时期内，细胞培养基(如IMDM或RPMI-1640)的选择和细胞营养素(例如氨基酸，血清)的选择对于增强细胞种群的生长和复制非常重要，甚至当以低细胞密度接种时，如在寡克隆细胞培养物中。

最后，第四个重要的方面是在细胞培养基中添加特殊B细胞促生长剂，如那些在刺激阶段中所采用试剂中任一种，如上文概述的(例如CpG-基寡核苷酸、白介素)，或者已知对永生化抗体分泌细胞特别是在EBV永生化之后具有类似促生长作用的任何其他化合物，如4-羟基壬烯醛(Ranian D et al.，2005)、硫氧还蛋白的形式(Wendel-Hansen V et al.，1994)、可溶性CD40配体或针对CD40的对抗性抗体(WO 91/09115；WO 94/24164；Tsuchiyama L et al.，1997；Imadome K et al.，2003)或环孢菌素(Tanner JE and Menezes J，1994；Chen C et al.，2001)。

B细胞促生长剂的选择以及施加该试剂的时期的选择(例如，仅在细胞永生化后紧接着的几天中)还取决于之后采用的筛选分析的类型。在细胞水平的分析中，如果这种试剂可通过改变靶细胞的反应而干扰，则细胞培养物上清液在该分析中不能直接使用，除非该特定试剂已从细胞培养基中去除或替代。可替换地，抗体可以至少部分从细胞培养物上清液中纯化(例如，通过蛋白沉淀、透析和/或亲和力纯化)。然而，优选在接种细胞混合物之后尽快地利继续进行筛选，同时通过构建不会在筛选分析中引发问题的恰当条件、通过清洗细胞或通过改变细胞培养基而无需去除B细胞促生长剂(或细胞培养物上清液中存在的任何其他成分)。

抗体生产细胞根据本发明方法进行分离、刺激和永生化，随后可在细分为独立培养的(例如在6、12、24、32或96孔板中)若干池(每一个代表一个细胞种群，)之前在原始培养基中保存不同的天数(例如，1天直至10天，或者更长的时期如2-4周)。

在细胞培养条件下保持的该原始多克隆细胞种群可以利用已在血清上实施的分析进行检测，以选择供体，或者利用与细胞以后应用相关的任何其他测定，以便确认细胞的存在。此外，可将多克隆细胞种群的一些等分试样置于小瓶中并作为冷冻细胞保存(如通常对于构建的哺乳动物细胞系实施的)，以备以后再次解冻和培养。

细胞池有多个，可达10个至几百个(或者甚至几千个，如实施例3中所示)，经统计每一个均包含10、10²、10³、10⁴、10⁵或更多细胞。实施例示出了分泌抗体的细胞培养物可如何从经统计包含5、20、50和100个细胞的种群开始而构建。在不同的天数(例如，1天直至10天，或者更长时期如2-4周)之后，这些细胞池所分泌抗体的量应足够用于其表征，例如通过在细胞水平或任何其他结合测定中利用细胞培养物上清液(直接地或其中所包含的抗体部分纯化之后)。

包含至少10³、10⁴或10⁵个细胞的细胞培养物可分泌一定量的抗体，在细胞培养物上清液中累积(例如共1至300μg/ml或更大)，该量易于利用商品化ELISA试剂盒检测且通常足够用于实施类似的体外分析。此外，10⁵、10⁴、10³个或甚至更少的细胞足以通过提取、扩增、克隆和测序来自这些细胞的相关mRNA而获得所分泌抗体的序列(如实施例3中所示)。

因此，随后可能在平行实验中通过系列稀释的培养物上清液或部分纯化的抗体制剂(例如，通过蛋白A柱上的亲和层析所获得)利用用剂量反应分析，以高通量方式筛选细胞培养物上清液等分试样的结合和/或功能活性，以便鉴定呈现期望活性的阳性孔。

阳性细胞池(即，那些表现出期望抗原特异性和/或生物学活性的)随后可用来生产一系列新的细胞池以进一步将筛选限制在细胞培养物水平，并由此分离出分泌具有期望特异性和活性的单克隆抗体的细胞培养物，至少在初始筛选分析的水平。然后所选单克隆抗体应利用其他更严格的功能分析进行再评价，并在利用可应用于B细胞的重组DNA技术将其从稳定EBV永生化克隆体分离之后，在同种型水平和VH/VL序列水平进行表征。

如果由利用相关模式和临床实验所获得的进一步数据加以证实，则这种初始表征可从而鉴定从上清液纯化的单克隆抗体(或之后作为重组蛋白而表达)具有诊断和/或治疗用途。特别地，如果已经根据本发明的方法永生化的原始细胞种群是人类B细胞的IgG阳性种群，则该单克隆抗体即可直接用于治疗人类感染和疾病的人类单克隆IgG抗体。

规模化抗体生产可利用哺乳动物、细菌或植物细胞系统来实施，其中，编码所选抗体的重链和轻链全长(或仅其抗原结合区)的克隆序列利用载体进行克隆并作为重组蛋白表达。

本发明方法提供可根据期望抗原特异性和/或生物学活性进行分离的抗体分泌细胞的永生化寡克隆和单克隆细胞培养物，因为其可例如通过筛选从抗体分泌细胞的原始多克隆种群和抗体分泌细胞的寡克隆或单克隆细胞培养物获得的细胞培养物上清液而加以确定。然后这些细胞可用于鉴定和生产具有期望抗原特异性和/或生物学活性的单克隆抗体。在该范围内，特定技术应进行自动化，允许抗体生成通量从若干单克隆细胞培养物可以显著增加(ChambersR，2005)。

应对与细胞培养物上清液和纯化制品一起使用的筛选分析加以选择和构建，以便以最高可能的精确性检测感兴趣抗体。筛选分析应包含有恰当的阳性和阴性对照(例如，来源于其他筛选或商业来源的其他抗体)并且也应足够灵敏，以在适用于抗体期望应用(例如，用于诊断、治疗或预防用途)的浓度范围内检测结合和/或功能活性。

例如，如果预期抗体可用作治疗性化合物，则所述分析应表明，在100、10或1μg/ml(或更低)的抗体浓度下可检测到显著活性。然而，在所述抗体表征的早期阶段，通过该分析所测定活性的敏感性通常仅足以在某些方面对治疗有用的活性进行预测。关于治疗效果以及可能给药的联合剂量，对纯化或重组IgG所做的其他分析是更加严格的。

筛选分析应加以构建以确定抗体涉及的抗原结合特异性和/或生物学活性，并且可利用自身抗原/异型抗原(人类、哺乳动物、细菌、病毒、寄生虫、有机物、化学品或任何其他抗原/变应原化合物)，抗原已纯化并包括在细胞水平的分析或生化分析中，提供对与抗原相互作用特异性或对细胞、组织、病毒或动物模型作用的论证。

可替换地，还可构建所述分析用于确定针对复杂的生物学、非纯化靶标如细胞或组织的抗原结合特异性和/或生物学活性(例如，在内皮细胞中的迁移，致癌性细胞生长等)。

在细胞培养条件下，对细胞的多克隆、或者较好的，寡克隆种群上实施的这些测定的结果可用于选择种群，其应保存在冷冻小瓶中或者用于构建包括编码一种或多种特定同种型抗体的DNA序列的DNA文库。

文献中已经描述若干技术用于在体外筛选抗体，该技术可能与单克隆抗体的特定用途相关且还允许精确且高通量表征抗体。与更经典的技术如免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA和免疫荧光一起，较精细的方法则可利用小器官细胞/器官培养物、芯片或多色纳米颗粒，用于有效的筛选分析(Bradbury A et al.，2003；Haab BB，2005；LaI SP et al.，2002；Olivo P，1996；Potera C，2005；WO 05/82926；WO05/003379；WO 05/83064；WO 05/76013)。

根据抗体分泌细胞的来源和用于选择特定单克隆细胞培养物和表征单克隆抗体的筛选分析的来源，可想象这些抗体的多种不同用途，如作为诊断工具(用于病毒、细菌或寄生虫感染、肿瘤或细胞分型)、作为预防或治疗工具(尤其是用于治疗恶性肿瘤、感染、免疫介导的疾病或炎性失调，或者用在移植患者的治疗中)、用于考察免疫系统(通常是临床相关的抗原)。因此，这些抗体，尤其是人类单克隆抗体可用于制备包括单克隆抗体或抗体片段以及药用载体的药物组合物，用于制备治疗患者的药剂以及用于诊断人类的感染、致癌性、自身免疫或过敏性疾病。

本发明还提供了一种用于生产单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

a)扩增通过上述方法生产的细胞培养物；以及

b)从细胞培养物的上清液纯化单克隆抗体。

特别地，EBV永生化的独特优点在于，在已经对所分泌抗体进行了初始表征和验证之后，细胞培养物可直接用来纯化足够量的抗体(从微克至毫克范围)，以利用体外或体内分析(进一步的生化、组织水平或细胞水平的分析，在啮齿动物中建立的疾病模型，用于亲和力检测的生物物理方法、表位定位等)实施更深入的抗体表征和验证。

在该范围内，控制培养物的克隆形成能力之后，原始细胞培养物可通过改变用于维持细胞生长和改进抗体表达及分泌的培养基和条件而进一步优化(Ling N，2000)。随后通过采用从文献得知的用于利用亲和层析从复杂蛋白混合物分离抗体的技术而从细胞培养物上清液纯化抗体(Nisnevitch M and Firer MA，2001；Huse K etal.，2002)。这些用于抗体纯化的方法可以基于抗体对底物如蛋白A、蛋白G或合成底物的总亲和力(Verdoliva A et al.，2002；Roque AC etal.，2004；Danczyk R et al.，2003)以及通过基于抗原或表位的亲和层析(Murray A et al.，2002；Sun L et al.，2003；Jensen LB et al.，2004)。已经精心设计了其他用于抗体的制备性分离装置，例如基于电泳的装置(Thomas TM et al.，2003)。

明显地，单克隆细胞培养物还可用来鉴定编码单克隆抗体的DNA序列，通过扩增并将其克隆入载体中，然后继续在恰当宿主细胞中表达重组抗体。所选定克隆细胞培养物分泌抗体的蛋白序列易于利用文献中已知的重组DNA技术来分离编码这些抗体的核酸而加以确定(Poul MA et al.，1995；Jovelin F et al.，1995；Heinrichs Aet al.，1995；Dattamajumdar AK et al.，1996；Norderhaug L et al.，1997；Chardes T et al.，1999；Jarrin A and Andrieux A，1999；Essono S et al.，2003)。

这些技术还可用于治疗性抗体进一步的结构和功能表征及优化(Kim SJ et al.，2005)或者用于生产允许单克隆抗体稳定体内递送的载体(Fang J et al.，2005)。

简而言之，mRNA可从细胞培养物制备并且逆转录到cDNA文库中，其可用作用于聚合酶链反应(PCR)的模板，包括用于特异性扩增重链和轻链全长或者仅扩增这些链部分(如可变区)的简并引物。在其中仅分离可变区(负责抗原结合)的情况下，可将这些序列克隆入载体中，从而允许该序列融合至期望同种型(例如人类IgGγ1)的恒定(Fc)区。PCR扩增的DNA片段可利用连接子或限制性位点直接测序或克隆入载体中，用于编码序列的测序，其可改变并再克隆入其他载体中用于将抗体表达为重组蛋白的编码序列。

多克隆或寡克隆细胞种群的mRNA还可用于构建特异于特定同种型抗体分泌细胞的cDNA文库，其可例如作为噬菌体显示文库、细菌文库、酵母菌文库或者可用于复制和保持DNA，尤其是编码蛋白的DNA的任何其他形式的生物学文库。例如，重组抗体序列的文库可以利用从一种或多种寡克隆细胞种群提取的mRNA生产，用于在细菌或真核宿主细胞中生产抗体，然后用于在鉴定一种或多种具有期望抗原特异性和/或生物学活性的抗体范围内筛选这种抗体。

一旦被克隆和表征，抗体可在原核生物(例如大肠杆菌；Sorensen H and Mortensen K，2005；Venturi et al.，2002)、植物(Ma JKet al.，2005)或真核细胞，尤其是人类、啮齿动物或其他作为瞬时或稳定转化细胞而允许高水平表达的真核细胞系(例如CHO、COS、HEK293)(Schmidt F，2004)中表达为重组蛋白，这一点尤其当抗体的表征必须利用更复杂分析(包括体内分析)时是必需的。宿主细胞可根据所克隆的单克隆抗体的重组表达水平进一步筛选。

在这个范围内，克隆的抗体序列可仅在DNA水平(例如，消除或插入限制性位点，优化密码子选择，适配转录和/或翻译调节序列)或在DNA和蛋白水平(例如，添加其他蛋白序列或修饰内部氨基酸)，利用PCR或其他重组DNA技术进行修饰。此外，可利用重组DNA技术而生成基于这些抗体的片段(Fv，Fab，F(ab)’或F(ab)”)或融合蛋白。

例如，还可通过选择将融合于可变区的特异Fc区(Furebring Cet al.，2002)、通过添加稳定化肽序列(WO 01/49713)、通过生成重组单链抗体片段(Gilliland LK et al.，1996)或通过将放射化学物质或聚合物添加到化学修饰的残基(Chapman A et al.，1999)而在结构和/或活性水平修饰重组抗体。

已将不同载体系统用于生产稳定的转染细胞系池(Aldrich TLet al.，2003；Bianchi A and McGrew J T，2003)，且已经实现了重组抗体的高水平、优化、稳定的表达(Schlatter S et al.，2005；Dinnis D andJames D，2005；Kretzmer G，2002)，这是由于细胞培养条件的优化(Grunberg J et al.，2003；Yoon SK et al.，2004)以及通过选择或设计改造具有较高抗体生产水平的克隆体(Bohm E et al.，2004；Borth N，2002；Chen K et al.，2001；Butler M，2005)。

来自细胞培养物的非重组/重组抗体的纯化可利用文献中描述的技术以及其他改进的技术来实施(Hale G et al.，2004；HorensteinAL et al.，2003)。然而，临床开发和应用应基于抗体药动学和药效学的表征(Lobo E et al.，2004)并符合用于人类治疗和体内诊断用途的鼠类、人类和遗传改造的单克隆抗体生成和质量控制的国际要求(EUDRA document 3AB4a)。

现在本发明将借助于以下实施例进行描述，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明。

实施例

实施例1：用于细胞纯化和刺激的方法对细胞培养条件下B细 胞存活和增殖的影响

材料和方法

人类B细胞的分离和保存

通过在Ficoll/Hypaque上的常规密度梯度离心从外周血纯化新鲜的外周血单核细胞(PBMC)。根据实验的不同，随后将细胞利用来自单一供体的PBMC或来自5个不同供体的混合PBMC进行处理，以便评估对不同实验条件的平均反应并减少由于供体变异而导致的差别。

利用如由生产商所描述的VarioMACS技术(Miltenyi BiotecInc.)，通过免疫磁性细胞分选从PBMC中分离人类B细胞。简而言之，将PBMC悬浮于补充了0.5％BSA(牛血清白蛋白)和2mMEDTA(乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸酯)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中并与不同的微珠结合抗体(针对CD19、CD22或CD27)一起孵育。随后洗涤微珠结合细胞并使其在磁场中通过用于其阳性选择的柱子(LS柱；Miltenyi cod.30-042-401)。然后依照生产商的说明书(Miltenyi Biotec Inc.)，利用MACS MultiSort释放剂(20μl/ml)于4℃使细胞从微珠释放达10分钟。

依照生产商的说明书，通过细胞分选对IgM阳性细胞进行阴性选择或者通过利用VarioMACS技术(Miltenyi Biotec Inc.)对IgG阳性细胞进行磁选而获得IgG阳性B细胞。为了进行细胞分选，将CD22阳性B细胞(在有或没有提前刺激的情况下)与最适浓度的抗人类IgM-FITC(Becton Dickinson n.555782)一起冰上孵育1小时。细胞用PBS彻底清洗，然后利用高速分选仪(高效细胞分选仪)在无菌条件下分为IgM阳性和IgM阴性细胞。

将所选细胞悬浮并保存在补充了10％(v/v)热灭活FCS(胎牛血清)、1mM丙酮酸钠、100ug/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI-1640细胞培养基中，并于37℃和5％CO₂下在24孔板中进行培养。

刺激细胞培养物中的B细胞

CpG2006(5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-S′；SEQ IDNO：1)购自Coley制药集团(Coley Pharmaceutical Group)。重组人类白介素2(IL-2)通过Roche获得。重组人白介素4(IL-4)获自Peprotech。重组人CD40配体(包含氨基酸108-261的可溶性片段)获自R&D Systems。金黄色酿脓葡萄球菌柯万菌株(Staphylococcus aureus Cowan strain)(SAC)和脂多糖类(LPS)购自Sigma。

通过³H-胸苷摄取测定B细胞增殖

将细胞(2×10⁶/ml)在指定的培养条件下以一式三份的样品接种到96孔板(50μl/孔)中并通过实验结束前8-16小时添加³H-胸苷(NET-027X胸苷，甲基-³H；特异活性20Ci/mmol；PerkinElmer)(0.5μCi/孔)加以标记。通过将细胞收集到利用β-计数器(WallachInstrument)计数的玻璃纤维过滤器中来测定³H-胸苷的摄取。

利用FACS分析表面标记物的表达

将细胞(3×10⁵/样品)悬浮于含0.5％牛血清白蛋白的PBS中，并与所选的针对CD22(用FITC标记)的单克隆抗体一起于4℃孵育30分钟。洗涤之后，利用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析荧光。单克隆抗体的背景结合活性借助于同种型匹配的阴性对照单克隆抗体进行评估。所分析细胞的数量为10000。

基于FACS的细胞分选

利用

高效细胞分选仪(Dako)来进行细胞分选。IgG表达细胞的阴性选择从细胞(10⁷/ml)与抗人类单克隆IgM-FITC(10μl/10⁶个细胞；Becton Dickinson Cat.No.555782)或抗人类多克隆IgM-FITC(2μl/10⁶个细胞；Jackson，Cat.No.309-096-043)一起在4℃孵育1小时开始，然后清洗细胞并悬浮于分选缓冲液(含5mMEDTA、25mM Hepes(羟乙基哌嗪乙磺酸)和1％FCS的PBS)中(10-20×10⁶/ml)。根据形态学参数(R1)对细胞设立门控。CD22阳性、IgM阴性B细胞在R1区域内选择。

结果

文献提供的关于细胞培养条件下纯化和刺激B细胞的不同方法对细胞存活和增殖的影响的对比信息较少。

白介素2(IL-2)用作参照化合物，是因为考虑到该细胞因子对细胞培养物中原代人类B细胞已确定的促生长作用(Banchereau Jand Rousset F，1992)。利用原代B细胞进行首次比较，该原代B细胞根据其表面上CD22的表面表达从人类PBMC纯化然后用熟知的多克隆B细胞刺激剂：CpG2006、脂多糖类(LPS)、可溶性CD40配体(CD40L)和金黄色葡萄球菌柯万菌株(SAC)协同刺激。

在4天的³H胸苷摄取测定中，当LPS、SAC和CD40L与IL-2一起加入细胞培养基中时，可测得对细胞增殖的正向剂量反应。然而，以文献(Bernasconi N et al.，2003；Traggiai E et al.，2004)中通常描述的浓度而加入的CpG2006组合表明，当与IL-2组合时，该化合物具有显著较高的诱导细胞培养物中B细胞增殖的能力(图2)。类似于用CpG2006与IL-2的组合获得的那些结果，在该分析中通过联合可溶性CD40L(以至少0.5μg/ml的浓度)与另一种细胞因子IL-4(至少20ng/ml)可获得诱增殖效应的结果，表明一旦已确定对IgG分泌的最佳动力学和作用，则该化合物组合可用作本发明方法中的刺激剂。

考虑到联用IL-2与CpG2006鉴定的效应程度，则利用浓度范围为0直至2.5μg/ml的CpG2006而进行CpG2006对最佳B细胞增殖和母细胞形成的滴定，同时保持IL-2浓度的恒定。

在浓度低至0.15μg/ml处检测到CpG2006所诱导的CD22阳性人类B细胞的显著增殖，在0.3μg/ml处达到平台(图3A)。当通过FACS分析相同细胞种群中存活细胞和母细胞(具有高度前向散射的大细胞)的百分比时，最佳CpG2006浓度似乎稍微较高(在0.6和1.25μg/ml之间)，这是由于在这些浓度下可产生较高百分数的母细胞(图3B)。

这个关于CpG2006/IL-2组合的证据，尽管确认之前表明CpG2006的B细胞刺激作用的结果可在低于1μg/ml的浓度下获得，表明受刺激CD22阳性B细胞的增殖和母细胞形成可在一个CpG2006浓度范围(0.3-1μg/ml)内获得。

在这些实验中，以恒定浓度(1000U/ml)加入IL-2，但是在IL-2浓度不同而CpG2006浓度恒定时可进行类似的剂量反应，以进一步确定能够在CpG2006存在时诱导人类B细胞增殖和母细胞形成的最佳IL-2浓度。后续实验还表明，IL-2可在100U/ml和1000U/ml之间的浓度范围内使用。

因此，除了选择多克隆B细胞刺激剂之外，确定特定化合物应当采用(单独或组合)的浓度对于获得对细胞增殖的期望作用非常重要。以CD 19/CD27阳性细胞为例，示出了B细胞对基于CpG2006的活化剂和细胞因子的反应性和增殖(Bernasconi et al.，2002；Jung Jet al.，2002)。然而，似乎文献(Hartmann et al.，2000；Klinmann D etal.，1996；Fearon K et al.，2003)中已知CpG2006对B细胞存活的负向作用中至少一部分通过采用特定条件、浓度及化合物的组合可被降低。

从生物样品中纯化原代B细胞的方法可以成为构建一个过程要考虑的另一要素，其中该过程中，这些原代B细胞的存活和增殖能力在刺激剂存在时不会受到细胞培养条件和体外操作的危害。

文献中主要描述了两种细胞表面标记物对于利用例如固体支持物：CD19和CD2而阳性地选择人类B细胞非常有用，可将联用IL-2和CpG2006的刺激方案应用到利用CD19或CD22特异性微珠纯化的人类B细胞上。

在刺激之前和之后对细胞存活和母细胞形成进行基于FACS的分析。这两种用于细胞纯化的方法之间的比较清楚地表明，纯化之后不久，CD22阳性细胞种群比CD19阳性种群更均质(图4A)。当CD22阳性种群比CD19阳性种群具有较高频率的存活细胞和显著较大比例的活化大细胞时，这种对纯化方法的细胞反应在刺激4天后甚至更明显(图4B)。利用加载有CD22特异性抗体(而非CD19特异性抗体)的微珠纯化的B细胞存活性增加，可能是由于由两种不同选择手段对这些细胞生长潜力所发挥的下游效应不同。

此外，CD22阳性B细胞可通过应用其他选择手段如用于阳性选择IgG表达细胞、或任何其他相关B细胞亚群如CD27阳性记忆B细胞的微珠进行选择和刺激。

一旦表明用于细胞刺激和选择的手段的选择影响细胞存活和增殖，则可能涉及的另一个要素即CD22阳性人类B细胞对用IL-2和CpG2006单独或联合刺激的细胞存活动力学和的增殖反应动力学。

细胞存活和增殖在开始刺激后2、4、6天进行检测，表明CpG2006(1μg/ml)和IL-2(1000U/ml)的联合效应提供了独特的动力学。单独由CpG2006诱导的最大³H-胸苷掺入早至培养2天即可观察到，其后快速下降。对单独IL-2的细胞增殖反应动力学是较为渐进性的，其中直至培养的第6天³H-胸苷掺入还在不断增加。然而，利用CpG2006和IL-2的联合刺激提供了类似于CpG2006的³H-胸苷掺入动力学，但第2天出现显著增强的效应，持续至第4天并在培养的第6天下降(图5)。平行地，检测通过CpG2006和IL02刺激的培养物中存活细胞总数，再次表明在第2天和第4天出现较高的存活细胞数。

因此，联用两种刺激剂的优势显然较为重要，尤其是在培养的第4天，此时分别由IL-2和CpG2006触发的效应(具有相反方向的动力学)之间达到平衡。这些数据还表明，通过同时以及依次加入刺激剂(即，刺激阶段开始时加入一种，几小时或几天之后加入另一种)均可能对抗体分泌细胞的细胞增殖和存活发挥类似或甚至更好的作用抗体分泌。

实施例2：用于细胞纯化和刺激的方法对利用EBV永生化的B 细胞存活、增殖和抗体分泌的影响

材料和方法

B细胞增殖和存活的选择和分析

除非另有指明，人类B细胞的选择、其刺激及分析如实施例1中所指出的那样而实施。

通过FACS对表面标记物表达进行分析

如上文对CD22所指出的，利用抗-CD21-PE结合物(CaltagLaboratories，Cat.No.MHCD2104，batch 04061206)，通过免疫荧光和流式细胞仪可检测CD21阳性细胞。

EB病毒(EBV)上清液的制备

将产生EBV的B95-8狨猴淋巴瘤细胞(ATCC No.CRL-1612；5×10⁵/ml)在补充了10％FCS(完全培养基)的RPMI-1640细胞培养基中培养4天。

将指数生长的B95-8细胞用100nM佛波酯(phorbol ester)(例如PMA；Sigma)刺激2小时(Oh HM et al.，2003)，然后用HBSS(Hank’s平衡盐溶液；Sigma)彻底清洗以除去溶液中的PMA。将PMA刺激的B95-8细胞在添加了10％FCS的完全RPMI-1640细胞培养基中培养48小时，并收集上清液、离心并通过0.22μm膜过滤。

永生化效力在来自不同血液供体的3种不同的CD22阳性B细胞制品上加以评估。在所有情形下，均观察到快速永生化并且获得表现出快速复制的多克隆类淋巴母细胞系。在缺少PMA刺激时，利用在常规条件下制备的一批病毒平行实施永生化，表现为复制较慢。

已刺激的人类CD22阳性、IgM阴性B细胞的EBV永生化

在用IL-2(1000U/ml)和CpG2006(1μg/ml)刺激4天后，用新鲜培养基彻底清洗CD22阳性、IgM阴性细胞，以在暴露于EBV上清液之前去除刺激剂。

细胞的批量永生化如下实施：通过将其(10⁶/ml)与EBV上清液(在添加了10％FCS的RPMI-1640中，50％V/V)一起孵育至少4小时直至18小时，然后用新鲜培养基清洗。用50％EBV上清液处理4-18小时的细胞增殖和存活与用30％EBV上清液处理7天相当。

随后浓缩细胞(在添加了10％FCS和1000U/ml IL-2的RPMI-1640中，10⁶/ml)并以0.5×10⁵受辐照的(3000rad)同种PBMC/孔在24孔板上接种，达8-16天。

利用EBV永生化人类B细胞的不同方法结果的定性和定量比较

人类B细胞已经作为从5个正常供体混合的CD22阳性外周血单核细胞(PBMC)通过磁选而分离，如实施例1所述，然后分到三个细胞池中，每一个均暴露于基于EBV的不同方法，用于B细胞永生化。

在BASIC方法中，这些细胞中的IgG阳性部分利用MoFIo高速细胞分选仪(MoFIo Cytomation)和抗人类IgG FITC(BectonDickinson)通过细胞分选而选择。随后，将8×10⁵个CD22阳性、IgG阳性细胞利用EBV上清液(如上所述制备的)培养12小时、清洗并在受辐照同种PBMC饲养层存在下，以1.5×10⁶个细胞/ml的密度在补充了L-谷酰胺、非必需氨基酸(NEAE)和10％FCS的IMDM培养基(Gibco-BRL)中37℃培养10天。

在COMBINED方法中，已经如同BASIC方法中所述分离了8×10⁵个CD22阳性、IgG阳性细胞离，然后在受辐照同种PBMC饲养层存在下，以1.5×10⁶个细胞/ml的密度利用CpG2006(1μg/ml)和IL-2(200U/ml)以及EBV上清液(如上文所述制备)在补充了L-谷酰胺、NEAE和10％FCS的IMDM培养基(Gibco-BRL)中，37℃培养10天。

在SEQUENTIAL方法中，在补充了L-谷酰胺、NEAE和10％FCS的IMDM培养基(Gibco-BRL)中，首先用CpG2006(1μg/ml)和IL-2(200U/ml)的组合物于37℃预刺激CD22阳性PBMC，然后用PBS清洗细胞并如上所述通过磁选富集IgG阳性细胞。然后将预刺激的细胞(8×10⁵个CD22阳性IgG阳性PBMC)利用EBV上清液(如在BASIC方法中)37℃感染12小时、清洗并在受辐照同种PBMC饲养层存在下，以1.5×10⁶个细胞/ml的密度在IMDM培养基(含L-谷酰胺、NEAE和10％FCS)中37℃培养10天。

通过碘化丙锭和流式细胞仪检测细胞数量和存活性

B细胞总数通过显微镜计数而检测，其存活性则通过利用FACSCalibur台式流式细胞仪和CellQuest软件(Becton DickinsonBiosciences)检测DNA嵌入的荧光染料碘化丙锭排除而检测。简而言之，将细胞在室温下暴露于碘化丙锭(PI，Sigma；在PBS中的终浓度为2.5μg/ml)，并在30分钟内通过流式细胞仪进行分析。存活的细胞定义为那些具有较高前向和正交散射(淋巴细胞和淋巴母细胞的特性)且排除PI的细胞。用PI染色且具有较低前向散射的细胞代表死亡细胞和碎片。

CD23表面表达的分析

如实施例1所述，利用抗人类CD23-PE结合物(BectonDickinson，catalog no.555711)的直接免疫荧光(R2区域)和流式细胞仪通过FACS设置电子门控，在存活淋巴母细胞中检测CD23的表达。

所分泌IgG的检测

培养物上清液中总人类IgG的分泌按照生产商的说明书利用ELISA(Immuno-Tek/Zeptometrics，cat.no.ZMC 0801182)进行检测。简而言之，培养物上清液从培养物收集并在4℃保存。将上清液样品系列稀释并与ELISA试剂盒中包含的纯化人类IgG标准曲线进行比较。测量结果反映10天培养期内培养物中累积的IgG总量。

结果

由于整个工艺(方法)的范围是以最直接的方式生产永生化的人类抗体分泌型细胞，所以选择EBV作为永生化试剂，对于构建和应用利用来自受该病毒感染细胞的上清液是十分直接的。然而，为人熟知的是，实际上仅一部分暴露于EBV的细胞被感染，可能由于CD21(一种存在于细胞表面上为病毒利用进入细胞的受体)的表达有限(Jondal and Klein，1973；Nemerow et al.，1985；Boyd andFecondo，1988)。因此，判断CD21表达受上述所选用于细胞刺激和纯化的手段与条件正向还是负向影响，非常重要。

在该范围内，用IL-2(1000U/ml)和CpG2006(1μg/ml)刺激4天之后，根据不同细胞标记物(仅CD22阳性，CD22阳性和CD27阳性，CD22和IgG阳性，CD22阳性和IgM阴性)所选B细胞种群的增殖动力学，并在不同时间点检测CD21阳性细胞的比例。在所有实验中，CD21在＞90％的存活和增殖细胞中表达，也证实了在本发明方法中采用双重选择途径的可能性。

因此，在证实由所选用于细胞刺激和纯化的手段与条件对细胞增殖活性发挥的强大正向作用之后，检测该途径还可如何改善B细胞对永生化试剂的反应。事实上，已知在B细胞暴露于EBV之后，大部分的细胞停止生长并在培养的第一周内死亡，随后通过EBV永生化细胞重新恢复增殖(James K and Bell G，1987)。因此，理解适当比例经恰当刺激和选择的人类B细胞是否可利用EBV永生化，并理解这些永生化B细胞能否较好地克服EBV永生化后的关键时期，将非常重要。

在用或不用CpG2006和IL-2提前刺激时，将人类CD22阳性、IgM阴性B细胞过夜暴露于EBV上清液、清洗并用包含IL-2(100U/ml)的培养基在受辐照同种PBMC的饲养层上接种。接下来的几天内检测这些细胞的增殖。以这种方式，可证实用CpG2006和IL-2对B细胞的预处理引起在EBV永生化后B细胞恢复增殖的速度和程度增强。这一点可在暴露于EBV上清液之后第7天最清楚地证实，其中相比于未经预刺激的细胞，几乎50％以上的细胞存在于经过预刺激的培养物中(图6A)。当经过预刺激的CD22阳性B细胞未额外排除IgM阳性细胞时，也可证实该观察结果。

之前的方法描述了在其利用EBV上清液永生化的过程中(而不仅之前)应用多克隆B细胞活化剂的益处，其中并没有从细胞培养物中去除活化剂的步骤(WO 91/09115；Hur D et al.，2005；TraggiaiE et al.，2004；Tsuchiyama L et al.，1997；WO 04/076677)。因此，在CpG2006(1μg/ml)和IL-2(1000u/ml)存在与否的情况下，检测暴露于EBV上清液7天的CD22阳性、IgM阴性B细胞培养物中的细胞数量。然而，在EBV永生化过程中CpG2006和IL-2的存在导致存活B细胞数量减少，如可通过显微镜计数细胞所证实的(图6B)。相比于仅暴露于EBV上清液的细胞这种减少已经很显著，但在考虑通过独立预刺激阶段获得的数据时这一点甚至更加重要(图6A)。

这些数据表明，其中人类B细胞培养物用刺激剂(单独或组合使用，如CpG2006和IL-2)处理的独特刺激阶段对利用EBV的B细胞选择和永生化的整个过程均发挥有益作用。这种正向作用可通过利用刺激剂的其他特定组合(例如，浓度降低的CpG2006和/或IL-2)和/或通过将刺激阶段局限于其中B细胞表现出最佳增殖活性和相关标记物(如CD21)表达的时期(例如，2到4天之间)而进一步增强。如果CD22阳性B细胞的生长和存活受到刺激剂与EBV上清液连续而广泛存在的负向影响，则永生化阶段之前刺激剂的去除对于从该方法获得最好结果非常关键。

上文提供的数据不仅证实将该方法应用于根据细胞表面标记物(例如，CD21、CD23、CD24、CD27和/或CD22)表达而确定的人类B细胞特定亚群的可能性，而且证实了进一步应用与B细胞分泌抗体相关的筛选标准的可行性。在本发明中，在继续永生化前采用去除表达特定同种型(IgM)抗体的细胞的技术。

事实上，EBV感染后10天对CD22阳性、经CpG2006/IL-2刺激、排除IgM的、EBV永生化的B细胞进行的基于FACS的分析证实几乎全部存活细胞(由两个右侧象限中较高的前向散射表示的)持续保持IgM阴性(右下象限)，是一种用于治疗性抗体生成更理想的表型(图7A)。人类永生化同种型特异性B细胞培养物可利用本发明方法生成和保持的进一步证据，通过在免疫扩散测定中检测上述B细胞的上清液而获得，如文献中通过免疫扩散而实施的(Mancini G et al.，1965)，确认了这种B细胞基本上是IgG分泌型细胞(图7B)。

这种在EBV永生化之前耦接B细胞特异性刺激和基于同种型的B细胞选择的意外阳性效应可通过包括其他B细胞选择手段而得到进一步改善。

这种方法的效力可根据CD22阳性、用CpG2006/IL-2刺激的IgM阴性B细胞的克隆效率而检测。所得到的细胞在CpG2006和IL-2存在时体外扩增2-4天，然后通过阳性或基于IgM的阴性选择而富集IgG阳性亚群。将CD22阳性、IgM阴性B细胞用EBV感染并通过感染后1-4周在96孔板中有限稀释而进行克隆。批量培养物的克隆效率可通过在该批量培养物的每一个检测稀释度(例如，1∶5，1∶10，1∶25，1∶50，1∶100，1∶200)或在每孔的各个细胞浓度下(例如每孔为1，5，10，20，25，50，100，200或更多个细胞)下对包含生长细胞的孔数计分而进行评价。

当实施EBV永生化时最重要的考虑之一是保持细胞的存活性而用于随后的克隆。在试图鉴定可能在外周血中以极低频率(＜1∶1000)存在的抗原特异性B细胞时尤其如此。现在已经公认，EBV是一种多克隆B细胞刺激剂，但是B细胞暴露于EBV导致培养物中细胞死亡的初始期(Sugimoto M et al.，2004)。

支持本发明的进一步数据已经通过比较在从5个正常供体集中的CD22阳性外周血单克隆细胞(PBMC)的相同起始种群上实施EBV介导的三种细胞永生化方法的结果而得到(图8A)。

在BASIC方法中，采用了一种非常简单的方法，其中CD22阳性、IgG阳性细胞仅暴露于包含EBV的上清液达12小时、清洗并在恰当细胞培养基和饲养细胞上培养10天。在COMBINED方法中，CD22阳性、IgG阳性细胞同时暴露于细胞培养基中的EBV和多克隆活化试剂(CpG2006和IL-2)达10天，类似于文献中关于同时使用这些化合物的描述(Traggiai E et al.，2004；Tsuchiyama L etal.，1997)。SEQENTIAL方法是应用本发明方法的一种可能方式，CD22阳性细胞首先暴露于CpG2006和IL-2的组合物并清洗，然后纯化IgG阳性细胞并将CD22阳性、IgG阳性细胞暴露于含EBV的上清液中达12小时，清洗并再次在恰当细胞培养基中和饲养细胞上培养10天。

由于CD22阳性、IgG阳性细胞的绝对数量对在初始暴露于EBV时的所有条件均进行了标准化，所以由10天培养结束时细胞培养物和上清液分析测得的数据应提供这三种方法的精确比较结果。事实上，BASIC和SEQENTIAL方法使细胞总数增加，得到初始细胞数的几乎2倍(200％)，比COMBINED方法所获得的增加(1.5倍(150％))更显著。更重要的，当确定了存活细胞的数量时，利用SEQENTIAL方法获得的细胞种群表明相比于BASIC方法，并且甚至更显著地，相比于COMBINED方法，存活细胞的数量增加(图8B)。

随后，利用不同的标准对利用所述三种方法获得的细胞种群进行更加定性的分析。

FACS分析表明，除了所有细胞均表达IgG的细胞种群之外，其组成是不同的，作为一个整体，特别是在对应于正在生长和分裂的存活淋巴母细胞的区域(碘化丙锭染色阴性且具有较高正向散射；图9中的R2区域)。相比于利用BASIC方法获得的细胞种群并且甚至更显著地，相比于利用COMBINED方法获得的，利用SEQUENTIAL方法获得细胞种群似乎在该区域中显著较浓缩。由于碘化丙锭累积而具有较高水平荧光的细胞是死亡的或者濒死细胞，利用BASIC和COMBINED方法获得的种群都积累了较多这种细胞，其将不能用于任何进一步的亚克隆或筛选分析(图9，左图)。

还分析了存在于样品中的存活淋巴母细胞种群的CD23表达，CD23是一种细胞表面标记物，在大多数外周血B细胞以低水平存在但其表达通常通过活化得以增强(Azim T and Crawford D，1988)。因为CD23表达与IgG分泌之间的直接关联已经在EBV永生化的人类B细胞种群中得到证实(Wroblewski J et al.，2002)，因此提出该指数作为证据非常重要。CD23的表达水平在水平轴上以对数值示出并且表达给定的CD23量的相对细胞数在垂直轴上示出(图9，右图)。很明显，与利用COMBINED方法获得细胞种群中所观察的相比，BASIC和SEQUENTIAL方法在比例显著较大的细胞中诱导高水平的CD23表达，在COMBINED方法中很明显仅极少数细胞表达高水平的CD23，而出现CD23表达阴性或较低的细胞的积累。

对按照上述三种方法从相同原代B细胞池生产的细胞种群做定性分析，提供了关于本发明方法的特定正向特性的重要信息。事实上，已经证实了将EBV永生化与多克隆刺激分开，而不是使细胞同时暴露于两种类型的试剂，提供的细胞种群存活性、CD23表达和增殖潜力有所改善。此外，FACS分析表明，本发明方法提供的细胞种群在某些方面类似于通过BASIC方法获得细胞种群，但具有较高频率的存活、母细胞样细胞(参见图9，左图)。

该方面似乎对用于比较不同方法的主要因素具有格外重要和惊人的影响：细胞种群在相对较短细胞培养期(8-10天)内在细胞培养物上清液中所积累IgG的量。很明显，这些培养物上清液中IgG分泌水平的任何改进均正向影响其对抗体的筛选，因为其可以缩短用于分离表达这种抗体的寡克隆或单克隆细胞培养物的时间周期。

对在相同的初始细胞种群上利用这三种方法获得细胞培养物中累积的总IgG进行比较(其也已在暴露于EBV之前定量地标准化)进一步确认了基于本发明方法的SEQUENTIAL方法的优点。事实上，如果BASIC和COMBINED方法提供相似浓度的总IgG(80-100μg/ml)，则从SEQUENTIA方法获得的细胞上清液提供的细胞，其表达的总IgG远远超出用于所有检测的稀释因子的ELISA试剂盒(～150μg/ml)线性范围的水平(图10A)。

因此，不仅根据本发明方法获得的多克隆细胞种群由活跃增殖且存活的细胞构成，而且表达的总IgG水平足以进行多种不同的筛选分析，而对化合物诸如多克隆刺激剂无任何可能的干扰，最后加速确定表达感兴趣IgG抗体的细胞存在的过程。

实施例3：表达可结合或中和治疗靶标的IgG抗体的人类B细 胞的选择、刺激、永生化和筛选

材料和方法

表达IgG抗体的人类永生化B细胞的生成

图11中提供了该程序的概述。所述条件和手段是实施例1和2中确定的那些条件和手段。

CMV微中和测定

将人胚肺成纤维细胞(HELF)铺到(2.0-2.5×10⁴/孔)96孔板的平底孔上并在37℃下培养24小时，每个孔中含100μl补充了10％胎牛血清(FCS)、1mM丙酮酸钠(NaP)、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GPS)的伊格尔最低必需培养基(MEM)。

将来自每一个B细胞培养物/克隆体的50μl上清液与实验用菌株CMV一起在96孔板的圆底孔中(AD 169；在50μl补充了5％FCS的MEM中为500pfu；混合物总体积为100μl)37℃孵育1小时。弃去来自HELF培养物的培养基并用病毒混合物取代，随后将该板以2000g离心30分钟并在CO₂中37℃孵育90分钟。然后弃去培养基，添加100μl生长培养基并将该培养物在培养箱中再保持72小时。

B细胞上清液对CMV感染活性的影响通过HELF细胞的间接免疫过氧化酶染色对人类CMV早期速发抗原(IEA)进行染色而检测。将细胞单层用50％丙酮和50％甲醇(保存在-20℃)溶液室温(RT)固定1分钟，然后用PBS清洗。将所述细胞在含1％H₂O₂0.1％Triton X-100/PBS中渗透5分钟，然后用PBS清洗。内源性过氧化酶用含50％甲醇和0.6％H₂O₂的PBS在暗处室温封闭30分钟，然后用PBS清洗。加入50μl蛋白封闭剂(Ultra Tech HRP 500-600Test；Streptavidin-Biotin Universal Detection System；PN IM2391)，RT放置10分钟，然后用PBS清洗。将最佳浓度的一抗(抗人类CMVIEA；Argene Biosoft；RefNo.11-003)加入孔中，RT放置60分钟。清洗孔，然后将50μl生物素化二抗(Ultra Tech HRP 500-600Test；Streptavidin-Biotin Universal Detection System；Ref.No.PN IM2391)加入孔中，RT放置10分钟。用PBS彻底清洗孔，并加入DAB底物(MERCK；ref.no.1.02924.0001)/0.1％H₂O₂，于暗处RT放置30-45分钟。通过用PBS稀释而终止反应并在显微镜下计数IEA阳性核。

B细胞上清液也利用人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和临床CMV菌株VR1814进行检测。

作为阴性对照，采用包含不相关IgG抗体的B细胞上清液。作为阳性对照，采用来源于患者血清且特异于CMV的商品化人类IgG抗体制品(Cytotect；Biotest)(利用渐进性稀释，从125μg/ml开始)。

用于检测CMV结合蛋白的基于ELISA的分析

第一次分析利用用于检测结合人类血清或血浆中CMV蛋白提取物的特异性IgG抗体的商品化定量酶联免疫吸附测定(ELISA)而实施。该商品化ELISA试剂盒(BEIA CMV IgG Quant Kit；Bouty)按照制造商说明书使用并通过特异于CMV且以50U/ml使用的商品化IgG抗体混合物(Cytotect；Biotest)进行验证。

简而言之，将用灭活的CMV蛋白混合物(来源于实验用菌株AD 169)覆盖的可断裂条置于微板中并与1∶81稀释(将10μl上清液加入800μl的BEIA系统的样品稀释液中)的B细胞上清液一起孵育，并将该板室温下孵育30分钟。清洗周期之后，加入提前稀释、与辣根过氧化酶(100μl)结合的单克隆抗人类IgG抗体并将板在室温下再孵育30分钟。在第二个清洗周期之后，加入提前稀释的底物-TMB溶液(100μl)并将该板再在室温下孵育15分钟。利用终止溶液(100μl/孔)终止反应并在450/620纳米处以二色性测定光学密度。

其他测定利用实验室中建立的ELISA而实施，其中ELISA采用固定在固态表面上的特异性肽或重组CMV蛋白。

重组CMV抗原gB免疫显性区与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)一起作为重组融合蛋白而生成，并通过亲和力纯化(GST亲和性纯化；Biodesign Int，cat.No.R18102)，或者作为一种肽而生成。重组CMV抗原gH免疫显性区(VR1814菌株)也在大肠杆菌中生成并根据GST亲和力从细菌细胞裂解物中纯化。这些ELISA通过应用常规ELISA步骤以做了较小改变的96孔模式实施。简而言之，将抗原以2μg/ml PBS稀释在PBS中，并将50μl该蛋白溶液通过4℃过夜孵育用于包被EIA聚苯乙烯板的每一个孔(Nunc，cat.No.469949)。去除蛋白溶液并将孔用100μl清洗缓冲液(包含0.05％吐温20的PBS)清洗四次。随后通过在每一个孔中分配100μl含1％奶的PBS并于37℃孵育该板1小时而进行封闭非特异性结合的处理。在用150μl清洗缓冲液实施4个清洗循环之后，将50μl来自细胞培养物的等分细胞培养物上清液分配到每一个孔中，以50μl细胞培养基/孔用作阴性对照。37℃孵育2小时之后，在将50μl辣根过氧化酶标记的抗人类IgG抗体(Fc特异性羊抗人IgG抗体；Sigma，cat.No.A0170)(已在清洗缓冲液中1∶30000稀释)分配到每一个孔中之前，将板用150μl清洗缓冲液清洗4次。室温孵育1小时之后，在分配50μl/孔的底物-TMB溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺；Sigma，cat no.T0440)之前，将板用150μl清洗缓冲液清洗4次。室温孵育30分钟之后，用100μl/孔的终止溶液(1N硫酸)终止显色反应并在450nm处测定光学密度。

基于ELISA的HSP60结合分析

用于检测结合HSP-60的抗体的ELISA利用50ml以1μg/ml稀释于NaHCO₃0.1M pH 9.6中的重组人类HSP60蛋白(Stressgen)包被的EIA/RIA孔条进行构建，并于室温保存过夜。用含0.05％吐温-20pH 7.4的PBS清洗这些条3次，并且用含1％BSA和5％蔗糖的PBS在室温下封闭非特异性结合部位达30分钟。清洗4次之后，将这些条用一组一抗：抗人类HSP60(以5或10g/ml稀释于含1％BSA的PBS中；Santa Cruz Biologicals)、小鼠IgG同种型阴性对照(以5g/ml溶于含1％BSA的PBS中)、不相关人类重组IgG抗体(Herceptin，5μg/ml)、仅细胞培养基以及来自EBV永生化人类IgG分泌型B细胞的上清液，在室温下孵育3小时。清洗4次之后，将条与辣根过氧化酶结合的抗-小鼠IgG或抗-人类IgG(Dako)(其在具有1％BSA的PBS中稀释)一起室温孵育1小时。清洗4次之后，将底物-TMB溶液加至条上并允许在室温下形成颜色反应。板在450nm处读数。

结果

本发明方法已在从供体获得的人类B细胞上测试过，其中已证实所述供体的血液包含结合和/或中和人类病毒尤其是人类巨细胞病毒(CMV)(一种引起出生缺陷并对免疫缺陷患者高度致病的β疱疹病毒)的抗体(Landolfo S et al.，2003)。

CMV是可由按照本发明方法选择、刺激并永生化的人类B细胞自然分泌的抗体所中和的临床感兴趣病毒靶标的良好实例，如在图11中粗略概括的。此外，在用于CMV的不同治疗策略中，静脉内给予CMV免疫球蛋白(以Cytotect或CytoGam的名称销售)代表一种用于阻断CMV感染仅部分满意的溶液，尤其是在免疫缺陷患者中，经常同时给予强有效的抗病毒剂(Bonaros NE et al.，2004；Kocher AA et al.，2003；Kruger RM et al.，2003)。这些制品已被表征可用于临床应用，但仅来源于具有高效价抗CMV抗体的人类混合血浆中。CMV感染的治疗将得益于具有更强有效的制品(包括通过批准用于调节目的而在哺乳动物细胞中表达而获得的纯化人类单克隆抗体)。

表达中和CMV的抗体的人类B细胞可从基于一种或多种免疫学筛选分析(如免疫印迹、ELISA或ELISPOT)或基于抗原微阵列选择的供体获得，其可从商业来源获得(Sorin Biomedica，Italy；BioMerieux，France)。

人类B细胞分离自所选供体的临床样品，该供体血液中提供较高效价抗CMV抗体，如通过ELISA、ELISPOT或中和测定所测得的)。然后将这些细胞应用于本发明方法(图11)。所得到的CD22阳性、IgM阴性、EBV永生化的人类B细胞种群直接或间接利用细胞培养物上清液进行筛选，细胞培养物通过亚克隆用于检测那些包含中和CMV和/或结合CMV的IgG抗体的种群的原始种群而得到。在克隆编码这些抗体的DNA并测序的范围内，生成这些抗体的原始B细胞随后可在其后的亚克隆步骤中分离。

第一种类型的初始筛选分析应用于96孔板上超过400个亚培养物，每一个孔包含大约100个B细胞。在CMV微中和测定中，筛选来自这些孔的上清液阻断人类CMV的实验用菌株(AD169)或临床菌株(VR1814)感染人类细胞的能力。在所筛选的453个B细胞培养物中有4个在利用实验用CMV分离株的重复实验中表现出显著的中和活性，特别是有1个在重复测定中表现为可中和临床CMV分离株(图12A)。

第二种类型的初始筛选分析应用于从不同CMV血清阳性供体获得的B细胞种群并再次应用于本发明方法。在该情况下，利用更灵敏的商用ELISA可检测到CMV特异的反应性。CMV阳性亚培养物，如上文表征的那些，可用来在鉴定所述细胞培养物和对应于与中和或结合CMV的活性(利用初始筛选分析可检测到)有关的抗体序列的范围内开始亚克隆过程。

这些抗体，如来自人类B细胞上清液的纯化制品或作为重组蛋白表达的，可利用文献中已知的器官水平或细胞水平的体外分析而进一步验证(Reinhardt B et al.，2003；Forthal DN et al.，2001；Goodrum FD et al.，2002)。此外，相关的临床前试验可在CMV感染的动物中进行，尤其是在其中人类宿主细胞可移植入免疫缺陷啮齿动物体内的模型中(Gosselin J et al.，2005；Thomsen M et al.，2005)。由这些抗体识别的CMV抗原/表位可通过利用CMV特异性截短蛋白或合成肽例如基于ELISA或蛋白质印迹或者基于与该抗原/表位已知的其他CMV特异性抗体竞争的不同体外测定加以鉴定(Greijer A et al.，1999；Schoppel K et al.，1996；Ohlin M et al.，1993)。

进一步的筛选分析可利用检测细胞培养物上清液对人类巨细胞病毒的中和或结合情况而实施。事实上，大量IgG分泌型细胞的可利用性允许鉴定大量对不同CMV表位或抗原(可能与CMV感染有关)具有结合特异性的人类IgG。例如，已知动脉粥样硬化患者的血液包含高水平识别人类热休克蛋白60(HSP60)片段(其于CMV蛋白)的抗体。特别地，其中一种称为US28的蛋白在内皮细胞表面上表达，结合该蛋白的抗体可诱导内皮细胞凋亡，提示CMV感染可触发牵涉于动脉粥样硬化致病机理中的自身免疫反应(Bason C et al.，2003)。

因此，65个细胞培养物上清液池(每一个均包含从CMV血清阳性个体获得的原代B细胞生成的EBV永生化细胞的5个孔的上清液)通过采用重组人类HSP60的ELISA对HSP60免疫反应性进行筛选。6个池在重复实验中表现出高于ELISA上背景3倍的统计学显著的反应活性(图12B)。这些永生化抗体分泌细胞的培养物可在细胞池中进行亚克隆、重复筛选和亚克隆过程直至分离出可分泌结合人类HSP60的人类单克隆IgG抗体的细胞培养物。

第二种类型的初始筛选分析应用于从特异性CMV血清阳性供体获得的B细胞种群并再次应用于本发明方法。在该情况下，CMV特异反应活性在从单个原代B细胞种群选择永生化细胞的寡克隆或单克隆种群(每一个表达针对不同CMV特异性表位的抗体)的范围内，利用一组不同试验平行进行检测，由此提供对个体中CMV感染的免疫反应的总体图示(图13)。

EBV永生化细胞的多克隆种群划分为大约4000个用于在96孔板中构建细胞培养物(经统计每一个均包含20个细胞)的池中，其中每一个孔包含一个寡克隆细胞种群。然而，考虑到产生特异于指定抗原的抗体的细胞频率较低，则这些细胞培养物(其上清液中可检测到CMV特异性IgG)的任一个均可能是表达人类单克隆抗体的单克隆细胞培养物。

初始试验评价由寡克隆/单克隆细胞培养物(特异于CMV蛋白混合物或已知可由CMV中和抗体识别的特异性抗原)所生成抗体的CMV结合性能。然后，那些对这些测定中至少一种为阳性的细胞培养物则进一步在CMV微中和测定中进行评价。

选择两种特异性CMV抗原用于寡克隆/单克隆细胞种群的初始筛选：包膜糖蛋白gB和gH。这些蛋白在病毒附着和融合中发挥关键作用，是用于人类CMV中和抗体(已存在关于该抗体较详细的资料)的靶标。来自血清阳性个体的血清以及针对这些糖蛋白的单克隆抗体抑制体外细胞培养物的HCMV感染。针对gB和gH的抗体在促进人类血清病毒中和能力方面的有效作用已经通过抗-gB和抗-gH效价与恢复期人类血清的总体中和活性之间的关联以及通过在gB-和gH-特异性抗体吸附之后血清中和能力的显著下降而清楚地证实(reviewed In CytomegaloViruses.Molecular Biologyand Immunology.Reddehase，M.(ed.)Norfolk：Caister AcademicPress(2006)，and in particular Boehme K and Compton T p.111-130，Mach M pp.265-283)。

如图13中总结的，利用其中细胞活跃增殖的寡克隆细胞培养物(占全部接种细胞孔的大约35％)，可以在特异于指定CMV蛋白(gB-或gH-ELISA)或总CMV蛋白提取物(BEIA CMV ELISA)的测定的至少一种中鉴定包含与CMV蛋白反应的IgG的孔。特别地，一些孔包含可中和体外CMV感染的人类IgG。

在仅BEIA CMV ELISA中为阳性的8个寡克隆细胞培养物中，命名为9G8的孔包含CMV反应活性为高度阳性的人类IgG(图14)。包含来自孔9G8的10000个细胞的样品用来生成cDNA，并且用于通过PCR特别扩增人类IgG重链和轻链可变区的序列。将扩增反应的产物进行克隆并测序，确认了9G8是分泌具有特定可变区且结合CMV的一种新型人类IgG的单克隆细胞培养物(图15)。编码该抗体可变区的DNA也用来确定特定CDR序列，其由9G8单独或组合提供，可用来生成结合CMV的抗体。

因此，包括本发明用于永生化抗体分泌细胞的方法的过程(工艺)可允许鉴定来自直接从已永生化的多克隆细胞种群生成的寡克隆细胞培养物的新型VH和VL序列。抗体如9G8或包含该抗体一个或多个CDR的任何蛋白(例如仅HCDR3；HCDR1、HCDR2和HCDR3；LCDR1、LCDR2和LCDR3)在CMV相关的临床和实验应用中非常有用，特别是用于生物样品中的CMV检测。

本发明方法还用来永生化从HIV-1、HSV-1和/或HSV-2血清阳性个体获得的原代B细胞。

例如，选择6个HSV-1/HIV-1血清阳性个体，因为利用商品化ELISA试剂盒(Bouty BEIA HSV-I；cat no.20921)，其血浆可表现出高效价结合HSV-1蛋白的IgG抗体。混合来自这些个体的PBMC并利用上述用于从供体CMV5所获得PBMC的相同方法进行永生化。

最初的7千万个PBMC形成含190万个CD22阳性、IgM阴性细胞的种群，其所分泌HSV-1特异性IgG抗体的量足以在细胞培养物上清液中利用ELISA试剂盒及利用检测中和HSV-1感染的抗体的体外测定进行检测，所述体外测定基于其中gC编码序列由lacZ基因代替的无效突变病毒(Laquerre S et al.，1998)。

该多克隆细胞种群部分在用于鉴定分泌具有HSV-1中和活性的抗体的细胞的筛选分析中使用，通过在细胞培养物制备后立即接种数百个寡克隆细胞培养物，经统计每一个均包含50-100个细胞。另外，永生化后所获得细胞培养物的等分试样在小瓶中冷冻，如通常冷冻已建立的哺乳动物细胞系一样。几个月后解冻这些小瓶中的一部分，将细胞作为初始多克隆细胞培养物培养数天，然后用于制备数千个寡克隆细胞培养物，经统计每一个均包含5个细胞。

HSV-1中和测定在两种类型的寡克隆细胞培养物(即通过每个孔立即接种50-100个细胞而获得或者通过在解冻包含原始多克隆细胞种群等分试样的小瓶之后每孔接种5个细胞而获得)中实施，两种过程均可对表达中和体外HSV-1的人类IgG抗体的寡克隆细胞培养物进行鉴定。

特别地，从后一个过程获得的分泌HSV-1中和抗体的细胞在20个以上这种寡克隆细胞培养物中进行鉴定。即使可以证明在这些细胞培养物的若干个，所述抗体是相同的，但是大量阳性孔和通过RT-PCR技术直接鉴定这种抗体序列的可能性可提供用以检测多种用于后期选择的可替换性寡克隆细胞培养物(可能以不同速度生长)的手段。事实上，不仅抗体的序列可鉴定和表征，而且感兴趣的单克隆抗体可直接纯化用于检测活性而无需将其作为重组蛋白克隆和表达，加快了最感兴趣的人类单克隆抗体的鉴定。

结论

实施例中示出的结果证明了本发明方法的多个优点和相对于现有技术的显著改进。

选择、刺激和永生化步骤的恰当顺序提供了特别有用的多克隆细胞种群，其根据同种型但独立于其所分泌抗体的特异抗原结合性质而分离，可用于检测与从单个供体或供体池获得的细胞性质不同的抗体。

事实上，本发明方法提供了可通过平行或依次采用的不同标准进行筛选和选择的多克隆、寡克隆或单克隆细胞种群。如实施例2中所示，个体体内抗体库的多样性通过本发明方法以提供大量存活且增殖的细胞(其以高水平分泌抗体，适于广泛的筛选分析)的方式而捕获。此外，所得细胞种群较均匀的组成允许(无需额外的细胞选择或分选)接近极广泛(若非全部)的抗体多样性，其由供体以无偏差的方式提供。如在用于抗-CMV和抗-HSP60的连续筛选中表明的，如果对血清进行特定分析，以选择用于待永生化细胞的供体，则所得细胞种群以后可以用来在用于具有广谱性能的抗体研究中剖析dissect免疫反应。

此外，可能直接生成并利用以极低细胞密度接种的细胞培养物，用于鉴定单克隆抗体。所得细胞培养物也可平行保持和筛选，用于应用不同的细胞培养条件(例如饲养细胞、培养基、生长因子)或者用于检测一组抗原和生物学活性(如从供体CMV5获得的细胞所表明的)，但总是从单个细胞种群开始的。

最后，该方法适合用于生产多克隆的永生化抗体分泌细胞种群，其可用来以自动化方式在数百或数千寡克隆细胞培养物中进行选择抗体分泌及用于得到一系列待冷冻的小瓶，每一个均包含通过本发明的方法获得的细胞种群的等分试样。

特别地，在较深入分析或再次分析永生化细胞种群的期望抗体特异性的范围内，可认为这些细胞是可根据需要解冻和检测的抗体分泌细胞文库，如在利用从HSV-1血清阳性供体所获得细胞的实施例中表明的。因此，具有期望性能的单克隆抗体的鉴定和生产，甚至可针对选择供体时或将细胞种群永生化并以冷冻等分试样储存时未考虑的靶标而实现。

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P20940STA序列表

序列表

<110>里博瓦克斯生物工艺有限公司(Ribovax Bioteehnologies S.A.)

<120>用于获得永生化抗体分泌细胞的方法

<130>P20940STA

<150>PCT /EP2005/056871

<151>2005-12-16

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>CpG寡核苷酸

<400>1

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt    24

<210>2

<211>528

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag   60

gtgcagctgg tgcagtctgg ggcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctce  120

tgtaagggtt ctggatacac ctttgacagc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc  180

gggaaaggcc tggagtggat ggggatcate tatcctggtg actctgatac cagatacagc  240

ccatccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctctttg  300

cagtggagca gcctgagggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag acatacatac  360

cccggaccga atagtggcta cgactacttt gagtactggg gccagggaac cctggtcacc  420

gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc  480

acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actact tc              528

<210>3

<211>176

<212>PRT

<213>Homo sapiers

<400>3

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly

1               5                   10                  15

Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

            20                  25                  30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45

Asp Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

                85                  90                  95

Thr Ala Ser Leu Gln Trp Ser Ser Leu Arg Ala Ser Asp Thr Ala Met

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg His Thr Tyr Pro Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asp

        115                 120                 125

Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

    130                 135                 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145                 150                 155                 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

                165                 170                 175

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Ser Tyr Trp Ile Gly

1               5

<210>5

<211>17

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1               5                   10                  15

Gly

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

His Thr Tyr Pro Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Asp Tyr Phe Glu Tyr

1               5                   10                  15

<210>7

<211>423

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

ttcctcctgc tactctggct cccagatacc accggagaaa ttgtgttgac acagtctcca     60

gccaccctgt ctttgtctcc aggagaaaga gtcaccctct cctgcagggc cagtcagagt    120

gtttacaact acttagcctg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc    180

tatgatgcat ccaacagggc cactggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg    240

acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt    300

cagctgcgtc gagggacgtt cggccaaggg accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct    360

gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct    420

gtt                                                                  423

<210>8

<211>141

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu

1               5                   10                  15

Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr

            20                  25                  30

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr

        35                  40                  45

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser

    50                  55                  60

Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65                  70                  75                  80

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

                85                  90                  95

Val Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Arg Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

            100                 105                 110

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

        115                 120                 125

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

    130                 135                 140

<210>9

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Leu Ala

1               5                   10

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1               5

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

G1n Leu Arg Arg Gly Thr

1               5

Claims (15)

1.一种用于永生化分泌一种或多种特定同种型的抗体的B细胞种群的方法，包括以下次序的步骤：

a)以不依赖抗原的方式且基于至少一种细胞表面标记物的表达而从一种或多种生物样品选择表达抗体的细胞种群；

b)在细胞培养条件下用至少一种刺激剂刺激所选定的细胞种群；

c)从所述细胞培养物中去除所述刺激剂；

d)从所述细胞培养物选择表达所述一种或多种同种型抗体的受刺激细胞种群；

e)使所选定且受刺激的细胞种群在细胞培养条件下暴露于永生化试剂；

f)从所述细胞培养物中去除所述永生化试剂；

其中所述永生化试剂是病毒永生化试剂EB病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的所述细胞种群是人类B细胞，所述细胞表面标记物是CD22、CD19或CD27。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述刺激剂选自：

a)基于CpG的寡核苷酸和细胞因子的组合；和

b)TNF受体家族的细胞膜受体的激动剂与细胞因子的组合。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，步骤d)中的所述细胞种群表达IgG抗体。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤d)中的所述细胞种群表达IgG抗体。

6.利用权利要求1-5中任一项所述的方法获得的细胞种群。

7.一种包含权利要求6的细胞种群的细胞培养物。

8.包括编码一种或多种特定同种型抗体的DNA序列的DNA文库，其中，所述DNA文库利用从权利要求6的细胞种群分离的核酸而制备。

9.权利要求6的细胞种群、权利要求7的细胞培养物、或权利要求8的DNA文库在鉴定和生产具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体中的应用。

10.权利要求6的细胞种群的细胞培养物、权利要求7的细胞培养物、或从由个体提供的抗体分泌细胞获得的权利要求8的DNA文库在确定所述个体对自体同源或异源抗原、病毒、细菌细胞、毒素、寄生虫细胞或疫苗的同种型特异性免疫反应特性中的应用。

11.一种用于鉴定和生产具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求6的细胞种群、权利要求7的细胞培养物、或权利要求8的DNA文库。

12.一种用于生产分泌具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的细胞培养物的方法，包括以下步骤：

a)将通过权利要求1-5中任一项的方法获得的细胞种群划分成每一个含有20个或更多个细胞的细胞培养物；

b)筛选所述细胞培养物的上清液，用于检测那些表现出所述期望抗原结合特异性和/或生物学活性的细胞培养物；

c)划分表现出所述期望抗原特异性和/或生物学活性的细胞培养物；

d)重复步骤(b)和(c)直到分离出一个或多个单克隆细胞培养物，其中每一个均在细胞上清液中分泌具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体。

13.一种用于生产可分泌具有期望抗原结合特异性和/或生物学活性的单克隆抗体的细胞培养物的方法，包括以下步骤：

a)筛选细胞培养物的上清液，所述细胞培养物的上清液是通过将由权利要求1-5中任一项的方法获得的细胞种群划分成含有20个或更少的细胞的多个细胞种群获得的，用于检测可分泌具有所述期望抗原特异性和/或生物学活性的抗体的一个或多个所述细胞种群；

b)确定由在所述上清液中表现出所述活性的细胞培养物中的每一个分泌的抗体的序列；

c)分离可分泌具有这种活性的单克隆抗体的单克隆细胞培养物。

14.一种用于生产单克隆抗体的方法，包括：

a)扩增通过根据权利要求12或13的方法生产的单克隆细胞培养物；以及

b)从所述单克隆细胞培养物的上清液中纯化所述单克隆抗体。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中，所述期望抗原结合特异性和/或生物学活性针对人类、哺乳动物、病毒、细菌、植物、寄生虫、有机或无机抗原。

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