CN116096863A - 免疫疗法组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的特别用于过继性免疫疗法的组合物。本发明还提供了用于制备此类组合物的方法，其包括使样品与抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体接触。

Description

免疫疗法组合物
技术领域
本发明涉及包含自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的特别用于过继性免疫疗法的组合物。本发明还提供了用于制备此类组合物的方法，其包括使样品与抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体接触。
背景技术
非细胞免疫疗法(如，免疫检查点抑制剂)和细胞免疫疗法(如，靶向αβCAR-T细胞的CD19)的近期成功促进了利用未修饰的和基因工程化的Treg、iNK-T、γδT细胞、NK细胞和巨噬细胞来开发新型免疫治疗方法。制造此类先进的治疗药物产品(ATMP)需要复杂的过程，所述过程利用各种细胞因子、培养基、刺激珠和饲养细胞的组合。由于复杂的制造过程和潜在的后勤挑战，目前这些疗法的广泛应用既麻烦又昂贵。
例如，绝大多数CAR修饰的αβT细胞疗法仅限于自体环境，并且制造运行的成功很大程度上预先取决于供体材料的质量。存在与这些疗法相关的若干个缺点。第一，αβT细胞受MHC限制，从而导致在同种异体环境中发生致命的移植物抗宿主病。第二，大多数CAR-T疗法都与不需要的副作用有关，诸如细胞因子释放综合征、神经毒性、中靶脱瘤毒性。第三，αβT细胞向实体瘤部位的迁移不良阻碍了实体瘤靶向方法的治疗效果。
为了帮助在同种异体环境中使用这种突破性技术，科学领域正在寻求两种主要策略：(1)通过使用复杂的基因编辑方法(如通过敲除天然αβTCR)使T细胞不受MHC限制或(2)利用固有的不受MHC限制的细胞类型(即NK细胞和γδT细胞)作为递送媒介物来产生真正的同种异体细胞产品。这两种方法都有其自身的挑战：基因编辑使制造过程和质量控制步骤具有挑战性，而不受限制的细胞类型的培养则需要明确定义的细胞因子环境和/或饲养细胞系统。虽然存在从血源或细胞系中培养NK细胞的确立方法，但这些方法中的大多数都包括使用同种异体饲养细胞，所述饲养细胞需要被辐照并且在之后去除。大多数方法甚至使用辐照的肿瘤细胞系(K562)，这些细胞系在制造期间使用遗传引入的膜结合细胞因子和共刺激分子作为饲养层。在一些情况下(即，NK细胞疗法)，所述疗法的广泛、现成的应用受到细胞产品的较差的低温保存和随后降低的细胞毒性潜能的阻碍。
先前已使用添加外源细胞因子描述了γδT细胞的扩增方法，例如参见WO2017/072367和WO2018/212808。还描述了使用药理学修饰形式的羟甲基丁-2-烯基焦磷酸酯(HMBPP)或临床批准的氨基双膦酸酯来扩增患者自身γδT细胞的方法。通过这些方法，超过250名癌症患者得到了治疗，看似安全，但只有罕见发生完全缓解。仍然需要能够扩增大量γδT细胞的方法。
NK细胞和γδT细胞是特别有吸引力的免疫治疗剂，因为它们不受MHC限制，并且它们的激活不依赖于MHC结合抗原的识别。尽管它们共享一些特定特征(例如，区分健康细胞和恶性细胞的能力、天然细胞毒性受体的存在等)，但它们在进化上也是保守的，并且每种细胞类型都具有独特的免疫学性质。这包括但不限于每种细胞类型的独特作用机制，诸如缺失通过NK细胞的自身和NCR配体识别的概念，以及它们与抗体合作执行抗体介导的细胞细胞毒性(ADCC)的潜力。除了NCR，Vδ1细胞还使用不受MHC限制的TCR来识别肿瘤相关抗原并迁移到特定组织部位。Vδ2 T细胞具有独特的不变TCR，使它们能够通过感知甲羟戊酸途径代谢活性的增加来识别恶性细胞，这一特征与具有突变的p53癌基因的恶性细胞有关。除了广谱的靶标识别和细胞毒性模式之外，先天性淋巴细胞还将炎症与持续的适应性响应联系起来。例如，γδT细胞可以与B细胞相互作用并且促进免疫球蛋白(IG)类别转换，从而导致对肿瘤抗原的抗体响应改善。NK和γδT细胞两者都吸引抗原呈递细胞并且使抗原呈递细胞成熟，从而正式将供体细胞与患者自身的免疫系统联系起来，并有可能启动持久的免疫响应。NK细胞和γδT细胞产生的炎性环境进一步吸引并且激活了常规的αβT细胞。
虽然NK细胞非常有效地对抗感染性疾病(例如，由病毒、细菌或真菌引起)，但Vδ1γδT细胞是用于识别和防止CMV再激活的基础(免疫受损患者，例如移植受者和接受过重度治疗的癌症患者的重要问题)。此外，CMV激活的Vδ1γδT细胞显著降低了移植后接受免疫抑制剂治疗的患者中继发性恶性肿瘤的风险。
Vδ2γδT细胞通过识别HMBPP(非甲羟戊酸途径的一种非常高亲和力的中间体，主要由原核生物和一些真核细胞类型使用)，在识别和消除分枝杆菌感染(mycobacterialinfection)方面是至关重要的。Vδ2细胞也识别原生动物，并极大地促进针对疟疾感染的免疫响应。
理想情况下，现成的同种异体细胞疗法产品将组合上述每种细胞类型所独有的所有有点：增强对恶性细胞的细胞毒性、对病毒和细菌感染的广泛保护等；并且同时减轻每种单一细胞产品的限制，从而降低抗原漂移、肿瘤逃逸或免疫抑制的风险。目前这种组合疗法是不可用的，并且将需要对每种细胞类型进行单独的制造运行，然后以预定比例混合细胞。本发明旨在克服这个主要的制造挑战。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了包含自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的经经分离的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少40％是CD56亮。
根据本发明的另一方面，提供了包含NK细胞和γδT细胞的经经分离的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少50％表达CD56。
根据本发明的另一方面，提供了包含细胞的经经分离的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
根据本发明的另一方面，提供了扩增不受MHC限制的非γδ+淋巴细胞的方法，其包括在存在白介素-15(IL-15)和不存在白介素-4(IL-4)的情况下，使用抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体或其片段来刺激包含γδT细胞和NK细胞的混合细胞群，并且培养混合细胞群。
根据本发明的另一方面，提供了制备包含细胞群的组合物的方法，所述细胞群富集不受MHC限制的淋巴细胞，其中所述方法包括：
(1)在不存在IL-4的情况下，在所述培养的第一天，在以下物质的存在下，培养从受试者获得的样品：
(i)抗Vδ1抗体或其片段；和
(ii)IL-15；以及
(2)分离从样品中培养的细胞群。
根据本发明的另一方面，提供了可通过如本文所定义的方法获得的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的用于疗法的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的γδT的至少40％表达CD56。
根据本发明的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含细胞的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
附图说明
图1：条件1、2和3细胞培养方案的示意图。在条件1中，用抗Vδ1抗体、IL-4、IL-1β、IL-21和IFNγ接种并培养细胞。条件1培养物进一步定期补充抗Vδ1抗体、IL-21和IL-15，直至收获。在条件2中，用抗Vδ1抗体和IL-15接种并培养细胞。条件2培养物进一步定期补充抗Vδ1抗体和IL-15，直至收获。在条件3中，用抗Vδ1抗体、IL-15、IL-4、IL-1β、IL-21和IFNγ接种并培养细胞。条件3培养物进一步定期补充α-Vδ1抗体、IL-21和IL-15，直至收获。终止条件1、2和3培养，并在第11-14天之间收获细胞。
图2：图表，其示出了用条件1、2或3培养时，收获的细胞的总产量。将细胞在24孔GREX板中接种并培养。收获后，浓缩细胞并使用NucleoCounter NC250计数。条件1和2生成相等的细胞产量，而条件3相对于条件1增加了细胞产量。
图3：图表，其示出了在不同培养方案(条件1、2或3)下培养时，经收获的细胞的免疫细胞组成。具体地说，此图表示出了总CD45+淋巴细胞的Vδ1+γδT细胞、Vδ2+γδT细胞和NK(CD3-CD56+)细胞的百分比。通过流式细胞术评估不同细胞群的百分比。条件1和3生成了高度富集Vδ1+T细胞的细胞产物，而条件2生成了包含Vδ1+T、Vδ2+T和NK细胞的混合群的细胞产物。
图4：图表，其示出了在不同培养方案(条件1、2或3)下培养的Vδ1+γδT细胞中的关键表型标记的细胞表面标记表达。更具体地说，研究了Vδ1+γδT细胞内的NKp30、CD27和NKG2D细胞表面表达。通过流式细胞术评估表型表面表征。从条件1和3生成的Vδ1+T细胞对CD27和NKG2D高度阳性，并且对NKp30呈低阳性。从条件2生成的Vδ1+T细胞表达较少的CD27，但NKp30和NKG2D的表达增强。
图5：用不同的抗Vδ1抗体或抗CD3抗体和IL-15接种并培养时，收获的细胞的免疫细胞组成。具体地说，此图表示出了总CD45+淋巴细胞的Vδ1+γδT细胞、Vδ2+γδT细胞和NK(CD3-CD56+)细胞的百分比。通过流式细胞术评估不同细胞群的百分比。使用两种单独的抗Vδ1抗体克隆富集NK细胞以及γδT细胞。使用抗CD3抗体仅富集γδT细胞。
图6：细胞的细胞毒性。(A)示出了与在不同培养方案(条件1、2或3)下培养的收获细胞共培养后，NALM-6ALL肿瘤细胞系的杀伤百分比。共培养20-22小时后，通过流式细胞术评估杀伤百分比。(B)示出了总CD45+淋巴细胞的CD56阳性淋巴细胞和CD56阳性γδT细胞的百分比。通过流式细胞术评估不同细胞群的百分比。条件2和3都显著增强了对NALM-6肿瘤细胞的细胞毒性活性。增强的杀伤与各条件之间的CD56表达相关。
图7：培养前和从条件1和条件2收获后，PBMC中的Vδ1和Vδ2细胞的CD56表达谱。CD56表面表达通过经由流式细胞术分析染色强度来确定。相对于Vδ1和Vδ2细胞的固有PBMC水平，条件2强烈富集Vδ1和Vδ2细胞上的CD56表达的强度。
图8：培养前和从条件2收获后，PBMC中的γδT细胞和NK细胞的CD56表达。CD56表面表达通过流式细胞术确定。条件2强烈富集γδT细胞和NK细胞上的CD56-亮细胞的百分比。
图9：在不同培养方案(条件1或2)下生成的细胞冷冻保存后的存活力和总细胞恢复。使用NucleoCounter NC250并且通过流式细胞术评估总细胞存活力。总细胞恢复的百分比是根据解冻和洗涤冷冻保存的细胞后计数的总细胞相对于培养终止和收获后冷冻的细胞量来推断的。在冷冻保存后，在条件1和条件2之间观察到等效的存活力和细胞恢复。
图10：冷冻保存后的细胞表型。(A)示出了在条件2培养方案冷冻保存前后生成的细胞产物的免疫细胞组成的代表性流程图。(B)示出了在条件2培养方案冷冻保存前后生成的细胞产物上存在的主要三个群(Vδ1+γδT细胞、Vδ2+γδT细胞和NK(CD3-CD56+)细胞)的表型细胞表面标记特征。更具体地说，分析了所有存在的免疫细胞群中的NKp30、CD27、NKG2D和CD56细胞表面表达，并且将所述表达与其冷冻保存前后的表达进行了比较。条件2示出了冷冻保存前后的等效的免疫细胞组成和细胞表面标记表型。
图11：冷冻保存后的细胞毒性。图表示出了在冷冻保存后，以广泛的效靶比与由条件1和2培养方案生成的细胞产物共培养后，NALM-6ALL肿瘤细胞系裂解物的百分比。共培养20-22小时后，通过流式细胞术评估杀伤百分比。相对于条件1，条件2显示出在冷冻保存后在一定范围的效靶比中对NALM-6细胞的细胞毒性增强。
图12：增加的转导许可。(A)示出了图表，并且(B)是使用所有免疫细胞的慢病毒载体的转导的代表性流程图，所述免疫细胞构成由条件1和2生成的产物。转导是在Retronectin的存在下执行的。使用粗冷冻保存材料生成转导的细胞产物。在转导后96小时，通过流式细胞术确定CAR19阳性细胞的百分比。流程图示出了表达CAR的Vδ1+γδT细胞的代表性图。条件2显示出相对于条件1的转导许可增强。
图13：从条件2培养方案生成的细胞的增强的CAR介导的细胞毒性的图表和代表性流程图。更具体地说，(A)示出了与以广泛的效靶比从条件2培养方案生成的CAR19转导和未转导细胞共培养后，死NALM-6细胞(CTV+ve的Sytox+ve)的百分比。(B)示出了与NALM-6共培养后从条件2生成的转导细胞的1：50效靶比(右上)和凋亡靶细胞辨别(右下)的代表性流程图。从条件2生成的CAR19转导细胞对NALM-6细胞表现出增强的细胞毒性。在低至1：100的效靶比处观察到细胞毒性靶向。
图14：细胞比例和产量。(A)培养方案的示意图。用抗Vδ1抗体(克隆C08)和IL-15接种并培养细胞。在这个实验装置中，细胞在第6天和第9天补充IL-15，直到第12天收获。(B)图表，其示出了使用(A)中描述的过程培养时的收获细胞的免疫细胞组成(顶部)，以及从5名供体收获的细胞(底部)的总产量和存活力。
图15：来自多名供体的细胞比例。(A)图表，其示出了如图14A所述使用15名随机选择的健康供体进行扩增时，收获的细胞的免疫细胞组成。具体地说，此图表示出了总CD45+淋巴细胞的Vδ1+γδT细胞、Vδ2+γδT细胞和NK(CD3-CD56+)细胞的百分比。(B)示出了原始值的表。
图16：CD56表达与细胞毒性的相关性。当如图14A所述培养细胞时，在由γδT细胞和NK细胞组成的先天免疫细胞组合(combo)上诱导CD56表达，表示为(A)中值荧光强度，和(B)表示为第0天和第12天之间组合内的不同免疫细胞亚群上的CD56+的百分比。(C)来自8名供体的CD3+细胞(γδT细胞)上的CD56表达与细胞毒性之间的相关性。图表展示了sytox+靶细胞百分比与CD56+T细胞百分比之间的线性回归(R2＝0.93，p＝0.0001)。
图17：免疫细胞组合的归巢/趋化因子受体谱。如图14A中所述培养细胞，然后冷冻保存。解冻后，将细胞用显示标记的抗体染色，并且通过流式细胞术采集。图表示出了来自3名供体的表达感兴趣的标记的每个免疫亚群的百分比。
图18：免疫细胞组合上的CD56表达与转导能力之间的相关性。(A)如图14A所示培养细胞并且如实施例8所述转导细胞。示出了收获时的转导效率。图表示出了总转导效率以及免疫细胞组合的每个显示成员内的转导效率。(B)按CD56表达分层的Vδ1+亚群中的转导效率。(C)流式细胞术数据(上图)，其示出了使用如图14A所示的C08和IL-15或使用OKT3+IL-4+IL-21+IFNγ+IL-1β培养的Vδ1+细胞上的CD56表达(实施例1的修改条件1)。图表(下图)示出了使用OKT3+IL-4+IL-21+IFNγ+IL-1β培养的细胞的Vδ1+亚群内的按CD56表达分层的转导效率。观察到较低的CD56表达，并且与使用图14A中所述的过程培养的细胞相比，在此条件下CD56表达对转导效率的影响要低得多。
图19：免疫细胞组合(“组合”)对实体瘤靶标的细胞毒性靶向。使用如图14A所述生成的效应细胞，指定效靶比下的(A)OVCAR细胞(卵巢癌起源)和(B)HeLa(宫颈癌起源)的靶细胞裂解物的百分比。未转导的免疫细胞组合和用包括4-1BB和CD3ζ细胞内信号传导结构域的间皮素靶向嵌合抗原受体转导的基因工程化组合细胞的比较。作为对照，使用了使用相同结合剂和信号传导结构域的最先进的αβCAR-T细胞。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中技术人员通常所理解的含义。如本文中所用，以下术语具有下面归于它们的含义。
伽马德尔塔(γδ)T细胞代表在其表面表达独特的、定义的T细胞受体(TCR)的T细胞的小亚群。该TCR由一条伽马(γ)链和一条德尔塔(δ)链组成。每条链含有可变(V)区、恒定(C)区、跨膜区和胞质尾。V区含有抗原结合位点。人γδT细胞有两种主要亚型：一种在外周血中占优势的亚型和一种在非造血组织中占优势的亚型。这两个亚型可以由细胞上存在的δ和/或γ的类型来定义。例如，在外周血中占主导地位的γδT细胞主要表达δ可变2链(Vδ2)。在非造血组织中占主导地位(即，组织驻留的)的γδT细胞主要表达δ可变1(Vδ1)链。编码Vγ的主要TGRV基因区段是TRGV2、TRGV3、TRGV4、TRGV5、TRGV8、TRGV9和TRGV11以及非功能基因TRGV10、TRGV11、TRGVA和TRGVB。最常见的TRDV基因区段编码Vδ1、Vδ2和Vδ3，外加若干个同时具有Vδ和Vα名称的V区段(Adams等人，296：30-40(2015)Cell Immunol.)。
对“Vδ1 T细胞”的提及是指具有Vδ1链的γδT细胞，即Vδ1+T细胞。
对“δ可变1”的提及也可以称为Vδ1或Vd1，而编码含有此区域的TCR链的核苷酸可以称为“TRDV1”。与γδTCR的Vδ1链相互作用的抗体或其片段实际上全部是与Vδ1结合的抗体或其片段并且可以称为“抗TCRδ可变1抗体或其片段”或“抗Vδ1抗体或其片段”。
本文额外提及了其他δ链，诸如“δ可变2”链。这些可以以类似的方式指代。例如，δ可变2链可以称为Vδ2，而编码含有此区域的TCR链的核苷酸可以称为“TRDV2”。在优选的实施方案中，与γδTCR的Vδ1链相互作用的抗体或其片段不与其他δ链(诸如Vδ2)相互作用。
本文还提及了“γ可变链”。这些也可以称为γ链或Vγ，而编码含有此区域的TCR链的核苷酸可以称为TRGV。例如，TRGV4是指是Vγ4链。在优选的实施方案中，与γδTCR的Vδ1链相互作用的抗体或其片段不与γ链(诸如Vγ4)相互作用。
对“自然杀伤细胞”或“NK细胞”的提及是指自然杀伤细胞，这是一种不表达TCR或CD3并且CD56表达大多呈阳性的先天样淋巴细胞。NK细胞还可以表达FC受体CD16和天然细胞毒性受体，诸如NKp44和NKp46以及NKG2D。根据细胞表面的CD56密度，人类NK细胞可以分为两个亚群-CD56亮和CD56暗细胞——每种细胞具有不同的表型性质。虽然外周血中的大多数NK细胞是CD56暗，但CD56亮NK细胞在组织中更为丰富。CD56表达被认为是激活的标志，CD56暗NK细胞上调其CD56表达以采用CD56亮免疫表型(Van Acker等人(2017)Front.Immunol.8：892)。
对“不受MHC限制的淋巴细胞”或“非MHC限制性淋巴细胞”的提及是指不需要效应细胞和靶细胞之间的主要组织相容性复合物(MHC)相容性来识别或启动免疫响应的淋巴细胞。因此，此术语是指NK细胞和γδT细胞，因为这些淋巴细胞不需要MHC识别。
对“不受MHC限制的非γδ+淋巴细胞”的提及是指不表达γδTCR(即，γδ-)的不受MHC限制的淋巴细胞。因此，此术语是指NK细胞。
术语“抗体”包括任何包含至少一个抗体可变结构域的抗体蛋白质构建体，所述抗体可变结构域包含至少一个抗原结合位点(ABS)。抗体包括但不限于IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(及其亚型)的免疫球蛋白。由两条同一的重(H)链和两条相同的轻(L)链多肽组装而成的免疫球蛋白G(IgG)抗体的整体结构在哺乳动物中已得到充分确立并且高度保守(Padlan(1994)Mol.Immunol.31：169-217)。
常规抗体或免疫球蛋白(Ig)是包含以下四条多肽链的蛋白质：两条重(H)链和两条轻(L)链。每条链分为恒定区和可变结构域。重(H)链可变结构域在本文中缩写为VH，轻(L)链可变结构域在本文中缩写为VL。这些结构域、与这些结构域相关的结构域和源自这些结构域的结构域在本文中可称为免疫球蛋白链可变结构域。VH和VL结构域(也称为VH和VL区)可以进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)的区域，其中散布着更保守的区域(称为“框架区”(“FR”))。框架区和互补决定区已经被精确定义(Kabat等人Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版U.S.Department of Health and HumanServices，(1991)NIH公开号91-3242)。还存在CDR序列的替代编号惯例，例如Chothia等人(1989)Nature 342：877-883中列出的那些。在常规抗体中，每个VH和VL均由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的常规抗体四聚体是由通过例如二硫键相互连接的重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链形成，并且重链被类似地连接。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域即CL构成。重链的可变结构域和轻链的可变结构域是与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用的抗体片段(其也可称为“抗体片段”、“免疫球蛋白片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合多肽”)是指抗体的这样的部分(或含有该部分的构建体)，该部分与靶标，即γδT细胞受体的δ可变1(Vδ1)链(例如，其中一条或多条免疫球蛋白链不是全长的但与靶标特异性地结合的分子)特异性地结合。涵盖在术语抗体片段内的结合片段的实例包括：
(i)Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)；
(ii)F(ab′)2片段(由在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段组成的二价片段)；
(iii)Fd片段(由VH和CH1结构域组成)；
(iv)Fv片段(由抗体单臂的VL和VH结构域组成)；
(v)单链可变片段scFv(由使用重组方法通过合成接头来联接的VL结构域和VH结构域组成，该合成接头使该VL结构域和VH结构域能够被制成单个蛋白链，在该单个蛋白链中，VL区和VH区配对从而形成单价分子)；
(vi)VH(由VH结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
(vii)VL(由VL结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
(viii)结构域抗体(dAb，由VH或VL结构域组成)；
(ix)微型抗体(由一对经由CH3结构域连接的scFv片段组成)；和
(x)双抗体(由scFv片段的非共价二聚体组成，该scFv片段由来自一种抗体的VH结构域组成，该VH结构域由小肽接头连接到来自另一种抗体的VL结构域)。
“人抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。施用了所述人抗体的人受试者不会对所述抗体内所含主要氨基酸产生跨物种抗体响应(例如，称为HAMA响应-人抗小鼠抗体)。所述人抗体可以例如在CDR中且尤其是在CDR3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变或通过体细胞突变引入的突变)。然而，所述术语并非旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体，或通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体也可以称为“重组人抗体”。
用来自人可变结构域的相应残基取代非人免疫球蛋白可变结构域的框架区中的至少一个氨基酸残基称为“人源化”。可变结构域的人源化可以降低在人类中的免疫原性。
“特异性”是指特定抗体或其片段可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数量。抗体的特异性是抗体将特定抗原识别为独特分子实体并将它与其他抗原区分开来的能力。与抗原或表位“特异性地结合”的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与特定靶抗原或表位的反应比它与替代靶标的反应更频繁、更迅速、时间更长持续和/或亲和力更高，则称该分子表现出“特异性结合”。如果抗体以比其与其他物质的结合亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合靶抗原或表位，则所述抗体与靶抗原或表位“特异性地结合”。
由抗原与抗原结合多肽解离的平衡常数(KD)表示的“亲合力”，是抗原决定簇与抗体(或其片段)上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇与抗原结合多肽之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和常数(KA)，即1/KD。亲和力可以通过已知方法根据目标特定抗原确定。
任何小于10-6的KD值都被认为指示结合。抗体或其片段与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以任何合适的已知方式确定，该方式包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定、平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱法(例如使用荧光测定)以及它们的本领域已知的不同变型。
“亲合力”是抗体或其片段与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇和抗体上的其抗原结合位点之间的亲和力及抗体上存在的相关结合位点的数量有关。
“人组织Vδ1+细胞”和“造血和血液Vδ1+细胞”和“肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)Vδ1+细胞”分别被定义为人组织或造血血液系统或人肿瘤中所含的或源自其中的表达Vδ1(Vδ1+)的细胞。所有所述细胞类型都可以通过(i)它们的位置或它们所源自的位置和(ii)它们的Vδ1+TCR表达来鉴定。
“调节抗体”是指一种抗体，其在与表达所述抗体结合的靶标的细胞接触或结合后，赋予可测量变化和/或功能(诸如对靶细胞或疾病细胞的细胞毒性)，所述可测量变化包括但不限于细胞周期和/或细胞数量和/或细胞存活力和/或一种或多种细胞表面标记和/或一种或多种分泌分子(例如，细胞因子、趋化因子、白细胞三烯等)的分泌的可测量变化。
“调节”细胞或其群的方法是指这样一种方法，其中触发所述一个或多个细胞或其分泌物的至少一个可测量变化以生成一个或多个“调节的细胞”。
“免疫响应”是诸如在添加调节抗体后，免疫系统的至少一种细胞、或一种细胞类型、或一种内分泌途径、或一种外分泌途径的可测量变化(包括但不限于细胞介导的响应、体液响应、细胞因子响应、趋化因子响应)。
“免疫细胞”被定义为免疫系统的细胞，包括但不限于CD34+细胞、B细胞、CD45+(淋巴细胞共同抗原)细胞、α-βT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞-细胞、浆细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板、树突状细胞、吞噬细胞、粒细胞、先天性淋巴样细胞、自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞。通常，借助组合细胞表面分子分析(例如，经由流式细胞术)对免疫细胞进行分类，以鉴定或分组或聚类以将免疫细胞分化成亚群。这些可以使用额外的分析进一步细分。例如，CD45+淋巴细胞可以进一步细分为vδ阳性细胞群和vδ阴性细胞群。
“疾病细胞”表现出与疾病(诸如癌症)、感染(诸如病毒感染)、或炎性病状或炎性疾病的进展相关的表型。例如，疾病细胞可以是肿瘤细胞、自身免疫组织细胞或病毒感染细胞。因此，所述疾病细胞可以被定义为肿瘤细胞、或病毒感染细胞或炎性细胞。
“健康细胞”是指不患病的正常细胞。它们也可以称为“正常”或“非疾病”细胞。非疾病细胞包括非癌性、或未感染、或非炎性细胞。所述细胞通常与相关疾病细胞一起使用以确定药物赋予的疾病细胞特异性和/或更好地了解药物的治疗指数。
“疾病细胞特异性”是测量效应细胞或其群体(诸如例如Vδ1+细胞群)在区分和杀死疾病细胞(诸如癌细胞)同时保留非疾病或健康细胞方面有多有效的量度。这种潜力可以在模型系统中测量，并且可能涉及比较效应细胞或效应细胞群选择性杀死或裂解疾病细胞的倾向与所述效应细胞杀死或裂解非疾病或健康细胞的潜力。所述疾病细胞特异性可以告知药物的潜在治疗指数。
“增强的疾病细胞特异性”描述了效应细胞(诸如例如Vδ1+细胞)或其群的表型，所述效应细胞已经被调节以进一步增加其特异性杀死疾病细胞的能力。这种增强可以多种方式测量，包括疾病细胞杀伤特异性或选择性的倍数变化或百分比增加。
合适地，本发明的抗体或其片段(即，多肽)是分离的。“分离的”多肽或组合物是从其原始环境中取出的多肽或组合物。术语“分离的”可以用于指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合Vδ1或其片段的分离抗体基本上不含特异性结合除Vδ1之外的抗原的抗体)。
合适地，用于本发明的组合物是分离的。“分离的”组合物是从其原始环境中取出的组合物。例如，如果天然存在的组合物从自然系统中的一些或所有共存物质中分离，则它是分离的。例如，如果组合物是体外或离体制备的，则认为它是分离的。
抗体或其片段可以是“功能活性变体”，所述功能活性变体还包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其他非天然存在的变体。如本领域已知的，等位基因变体是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改变多肽的生物学功能的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。作为非限制性实例，当含有CDR的框架被修饰时，当CDR本身被修饰时，当所述CDR被移植到替代框架上时，或者当掺入N末端或C末端延伸时，所述功能活性变体仍然可以发挥功能。进一步地，含有CDR的结合结构域可以与不同的伴侣链(诸如与另一种抗体共享的伴侣链)配对。在与所谓的“普通”轻链或“普通”重链共享后，所述结合结构域仍然可以发挥功能。进一步地，所述结合结构域可以在多聚化时发挥功能。进一步地，“抗体或其片段”还可以包含功能变体，其中VH或VL或恒定结构域已远离或朝向不同的规范序列(例如，如IMGT.org中所列的)进行修饰并且仍然发挥功能。
为了比较两个密切相关的多肽序列，可以使用NCBI BLAST v2.0，使用多肽序列的标准设置(BLASTP)计算第一多肽序列与第二多肽序列之间的“序列同一性％”。为了比较两个密切相关的多核苷酸序列，可以使用NCBI BLAST v2.0，使用核苷酸序列的标准设置(BLASTN)计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性％”。
如果多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列在它们的整个长度上共享100％的序列同一性，则称该多肽或多核苷酸序列与该其他多肽或多核苷酸序列相同或“同一”。序列中的残基从左到右进行编号，即对于多肽而言从N端到C端进行编号；对于多核苷酸而言从5′到3′端进行编号。
序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的某个位置中的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有一个、两个或更多个此类氨基酸差异。在其他方面与第一序列同一(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致％序列同一性降低。例如，如果同一序列为9个氨基酸残基长，则第二序列中的一个取代导致序列同一性为88.9％。如果第一多肽序列和第二多肽序列为9个氨基酸残基长并且共享6个同一残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于66％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享66.7％的同一性)。
或者，为了比较第一参考多肽序列与第二比较多肽序列的目的，可以确定为产生第二序列而对第一序列制作的添加、取代和/或缺失的数目。“添加”是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括第一多肽的任一末端的添加)。“取代”是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。所述取代可以是保守性的或非保守性的。“缺失”是从第一多肽的序列中缺失一个氨基酸残基(包括在第一多肽的任一末端的缺失)。
“保守性”氨基酸取代是这样一种氨基酸取代，其中一个氨基酸残基被另一个具有相似化学结构的氨基酸残基替换，并且预期对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响。此类保守性取代适当地是以下组中的一个氨基酸被同一组中的另一个氨基酸残基取代的取代：
Figure BDA0004105319660000181
Figure BDA0004105319660000191
合适地，疏水性氨基酸残基是非极性氨基酸。更合适地，疏水性氨基酸残基选自V、I、L、M、F、W或C。
如本文所用，多肽序列的编号以及CDR和FR的定义如根据Kabat系统所定义(Kabat等人，1991，以引用方式整体并入本文)。第一多肽序列与第二多肽序列之间的“对应”氨基酸残基是第一序列中与第二序列中的氨基酸残基共享根据Kabat系统的相同位置的氨基酸残基，同时第二序列中的氨基酸残基的身份可能与第一序列中的氨基酸残基的身份不同。适当地，如果根据Kabat定义，框架和CDR的长度相同，则对应残基将共享相同的数字(和字母)。可以手动或通过使用例如用于序列比对的已知计算机算法，诸如NCBI BLAST v2.0(BLASTP或BLASTN)，使用标准设置来实现比对。
本文对“表位”的提及是指靶标的被抗体或其片段特异性结合的部分。表位也可称为“抗原决定簇”。当两种抗体都识别相同或空间重叠的表位时，抗体与另一种抗体结合“基本上相同的表位”。确定两种抗体是否与同一或重叠表位结合的常用方法是竞争测定法，该竞争测定法可以使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同的格式进行配置(例如，使用放射性或酶标记的孔板，或对抗原表达细胞进行流式细胞术)。
在蛋白质靶标上发现的表位可以被定义为“线性表位”或“构象表位”。线性表位由蛋白质抗原中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的，但在蛋白质被折叠成其三维结构后聚集在一起的氨基酸形成。
如本文所用的术语“载体”意在指代能够转运已经与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其是指额外的DNA区段可被连结到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中额外的DNA区段可以被连结到病毒基因组中。某些载体能够在将其引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物和酵母载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在被引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而连同宿主基因组一起被复制。而且，某些载体能够指导与之操作性地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有实用性的表达载体常常呈质粒形式。在本专利说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等效功能的此类其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，并且还包括噬菌体和噬菌粒系统。如本文中所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指已引入了重组表达载体的细胞。此类术语旨在不仅指特定的受试者细胞，而且指此类细胞的后代，例如，当采用所述后代制备然后任选地被储存、提供、出售、转移或用于制造如本文所述的抗体或其片段的细胞系或细胞库时。
对“受试者”、“患者”或“个体”的提及是指待治疗的受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、农场动物(诸如奶牛)、运动动物或宠物动物(诸如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠或小鼠)。在一些实施方案中，受试者是人。在替代实施方案中，受试者是非人哺乳动物，诸如小鼠。
术语“足够量”意指足以产生所需效果的量。术语“治疗有效量”是有效改善疾病或病症的症状的量。治疗有效量可以是“防治有效量”，因为防治可以被认为是治疗。
如本文所用，当用于本文中时，术语“约”包括比指定的值高至多10％(并包括10％)和低至多10％(并包括10％)，适当地比指定的值高至多5％(并包括5％)和低至多5％(并包括5％)，特别是指定的值。术语“在......之间”包括指定边界的值。
如果疾病或病症的体征或症状的严重程度、受试者经历此类体征或症状的频率，或两者都降低，则该疾病或病症得到“改善”。
如本文所用，“治疗疾病或病症”意指降低受试者所经历的该疾病或病症的至少一种体征或症状的频率和/或严重程度。
如本文所用，“癌症”是指细胞的异常生长或分裂。一般来说，癌细胞的生长和/或寿命超过正常细胞及其周围的组织的的生长和/或寿命并且与之不协调。癌症可以是良性的、恶化前的或恶性的。癌症发生在多种细胞和组织中，包括口腔(例如口、舌、咽等)、消化系统(例如食道、胃、小肠、结肠、直肠、肝脏、胆管、胆囊、胰腺等)、呼吸系统(例如喉、肺、支气管等)、骨骼、关节、皮肤(例如基底细胞、鳞状细胞、脑膜瘤等)、乳腺、生殖系统(例如子宫、卵巢、前列腺、睾丸等)、泌尿系统(例如膀胱、肾脏、输尿管等)、眼睛、神经系统(例如大脑等)、内分泌系统(例如甲状腺等)和造血系统(例如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病等)。
细合物
本文提供了组合物，其包含特别有利的“三位一体”细胞类型：NK细胞、Vδ1细胞和Vδ2细胞。NK细胞和γδT细胞都缺乏MHC限制，并且不需要MHC来激活。尽管这些细胞共享一些允许它们识别肿瘤细胞同时保留健康细胞的生物学特性，但NK细胞和γδT细胞(包括其亚群)具有仅存在于一种特定的细胞类型中，但并非在所有先天淋巴细胞中都发现的进化保守和独特的性质。因此，一种期望的细胞方法将组合每种细胞类型的优势，从而为患者补充几乎完整且高度启动的先天免疫系统，所述系统可以与患者自身的适应性免疫系统相互作用，并协调更大和持续的免疫响应。
根据本发明的一方面，提供了包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少40％是CD56亮。
根据本发明的另一方面，提供了包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的NK细胞的至少50％是CD56亮。
根据本发明的一方面，提供了包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少50％表达CD56。
CD56也称为神经细胞粘附分子(NCAM)，是免疫球蛋白(Ig)超家族的粘附分子，与NK细胞、αβT细胞和γδT细胞中的高细胞毒性相关。它已被证明参与与自身的顺式和反式结合，所述结合有助于淋巴细胞活化。它还被证明是淋巴细胞之间、淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)之间以及淋巴细胞和靶细胞之间的免疫突触形成的基础(Nussbaumer和Thumher(2020)Cells 9(3)：772)。
细胞表型还可以通过细胞表面的CD56密度来定义。因此，存在CD56亮和CD56暗细胞领域中已知的公认亚型。本发明的组合物中存在的γδT细胞上的CD56的增强的表达和/或强度在本文中显示与增强的杀伤具有相关性，从而表明本文描述的组合物的治疗潜力。
在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约40％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约45％(诸如46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％)是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约50％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约55％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约60％是CD56亮。
在一些实施方案中，组合物中存在的NK细胞的至少约50％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的NK细胞的至少60％(诸如至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％)是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的NK细胞的至少约70％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的NK细胞的至少约75％是CD56亮。在一些实施方案中，组合物中存在的NK细胞的至少约80％是CD56亮。
可以使用本领域已知的方法确定CD56表面表达，诸如通过用流式细胞术分析染色强度。将细胞分为CD56亮和CD56暗是本领域所理解的，例如如Van Acker等人(2017)Front.Immunol.8：892中所述。此类方法将样品群与已知CD56表达水平的参考群(诸如含有 NK细胞的细胞群)进行比较。NK细胞具有可以被鉴定为亮和暗的不同CD56表达水平，因此通 过使用这种参考群建立门控策略，样品群也可以为了本发明的目的而分选为CD56亮和CD56暗 部分。
在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约40％表达CD56。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约45％(诸如46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％)表达CD56。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约50％表达CD56。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约55％表达CD56。在一些实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少约60％表达CD56。在其他实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少70％(诸如至少75％)表达CD56。在一个实施方案中，组合物中存在的γδT细胞的至少80％(诸如至少85％)表达CD56。在另一个实施方案中，在如本文所述的约12天(诸如12天)时间段的培养后，组合物中存在的γδT细胞的至少80％表达CD56。
在一些实施方案中，组合物中存在的细胞的至少80％(诸如85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％)包含NK细胞和γδT细胞。在一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少85％包含NK和γδT细胞。在另一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少90％包含NK和γδT细胞。在又一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少95％包含NK和γδT细胞。
在一些实施方案中，组合物中存在的细胞的至少80％(诸如85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％)由NK细胞和γδT细胞组成。在一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少85％由NK和γδT细胞组成。在另一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少90％由NK和γδT细胞组成。在又一个实施方案中，组合物中存在的细胞的至少95％由NK和γδT细胞组成。
在一些实施方案中，组合物中存在的细胞的至少30％是γδT细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少约30％的γδT细胞，诸如至少约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的γδT细胞。在另一个实施方案中，组合物包含至少约40％的γδT细胞，诸如大于约45％的γδT细胞。在其他实施方案中，组合物中存在的细胞的至少15％(诸如至少20％)是γδT细胞。在一个实施方案中，组合物包含至少约20％的γδT细胞。
在一些实施方案中，组合物中存在的细胞的少于80％是γδT细胞。在一些实施方案中，组合物包含少于约80％的γδT细胞，诸如少于约79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、60％、68％、57％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的γδT细胞。在另一个实施方案中，组合物包含少于约60％的γδT细胞。在一些实施方案中，组合物包含约30％至80％之间的γδT细胞，诸如约30％至60％的γδT细胞。在另一个实施方案中，组合物包含约50％的γδT细胞。
在一些实施方案中，组合物包含至少约10％的Vδ1 T细胞，诸如至少约11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的Vδ1 T细胞。在另一个实施方案中，组合物包含至少约20％的Vδ1 T细胞。在一些实施方案中，组合物包含约10％至55％之间的Vδ1 T细胞，诸如约10％至30％之间的Vδ1 T细胞。在一个实施方案中，该组合物包含约30％的Vδ1 T细胞。
在一些实施方案中，组合物包含至少约5％的Vδ2 T细胞，诸如至少约6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的Vδ2 T细胞。在另一个实施方案中，组合物包含至少约7％的Vδ2 T细胞。在一些实施方案中，组合物包含约7％至30％之间的Vδ2 T细胞。在一个实施方案中，组合物包含约15％至20％之间的Vδ2 T细胞。
在一些实施方案中，γδT细胞包含Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞和Vδ8细胞。在一些实施方案中，γδT细胞包含Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞。在一些实施方案中，至少70％，诸如至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，特别是至少90％的γδT细胞由Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞组成。在一些实施方案中，γδT细胞包含Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞。在一些实施方案中，γδT细胞包含非Vδ1/Vδ2 T细胞。
在一些实施方案中，组合物中存在的细胞的至少30％是NK细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少约30％的NK细胞，诸如至少约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的NK细胞。在另一个实施方案中，组合物包含至少约40％的NK细胞。在一些实施方案中，组合物包含少于约80％的NK细胞，诸如少于约79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、60％、68％、57％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的NK细胞。在另一个实施方案中，组合物包含少于约60％的NK细胞。在一些实施方案中，组合物包含约20％至70％之间的NK细胞，诸如约30％至60％的NK细胞。在其他实施方案中，组合物包含约40％至50％之间的NK细胞。在另一个实施方案中，组合物包含约50％的NK细胞。在其他实施方案中，组合物中存在的细胞的至少约10％是NK细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少约10％的NK细胞，诸如至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的NK细胞。在一个实施方案中，组合物包含约10％至75％之间的NK细胞。在另一个实施方案中，组合物包含至少约20％的NK细胞。
在一些实施方案中，组合物包含少于约10％的αβT细胞，诸如少于约5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％的αβT细胞。在另一个实施方案中，组合物包含少于约1％的αβT细胞。具有αβ受体的T细胞具有高反应性，因此在本发明的上下文中适合向患者施用的细胞群仅可以含有低水平的αβT细胞。
本发明的组合物也可以通过组合物中存在的不受MHC限制的淋巴细胞的比例来定义。因此，根据本发明的另一方面，提供了包含细胞的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。Vδ1、Vδ2和NK细胞的比例可以如先前所述。在一些实施方案中，至少13％的细胞是Vδ1 T细胞，至少7％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少35％的细胞是NK细胞。在一些实施方案中，至少20％的细胞是Vδ1 T细胞，至少10％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少40％的细胞是NK细胞。在其他实施方案中，至少30％的细胞是Vδ1 T细胞，至少20％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少35％的细胞是NK细胞。
如本文所述，γδT细胞可以包含Vδ1T细胞。在一些实施方案中，组合物中存在的Vδ1 T细胞表达高水平的NKp30。例如，超过约10％，诸如超过约15％、20％或25％的Vδ1 T细胞表达NKp30(即，NKp30+)。在一些实施方案中，γδT细胞包含Vδ1 T细胞并且至少15％的所述Vδ1 T细胞表达NKp30。
在一些实施方案中，组合物中存在的Vδ1 T细胞表达低水平的CD27(CD27低)。例如，少于约70％，例如少于约50％、40％或30％的Vδ1 T细胞表达CD27(即，CD27+)。在一些实施方案中，γδT细胞包含Vδ1 T细胞并且少于50％的所述Vδ1 T细胞表达CD27。
包含工程化细胞的组合物
先天性淋巴细胞不通过一种受体控制增殖、激活、细胞因子产生和杀伤。因此，本文所述的组合物将允许基因工程策略，所述策略在αβT细胞中或甚至在一种先天细胞类型中是特别不可能的或不太有利的。例如，可以使用非信号传导CAR，诸如WO2019180279中描述的非信号传导CAR。特定结构域的使用将启动平衡响应，例如DAP10可以触发响应，如NK细胞中的激活和杀伤，以及Vδ1 T细胞中Th1细胞因子的产生。
在一些实施方案中，经分离的组合物包含工程化NK细胞和γδT细胞。如本文提供的实例所示，所要求保护的组合物的细胞已显示具有增加的使它们适用于基因工程方法的转导允许。
组合物的细胞可以被工程化以表达一种或多种转基因，所述转基因可以编码例如膜结合蛋白(例如细胞表面受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)、αβTCR、天然细胞毒性受体(例如NKp30、NKp44或NKp46)、细胞因子、细胞因子受体(例如IL-12受体)、趋化因子受体(例如CCR2受体))、可选择标记(例如报告基因)、或自杀基因。在一些情况下，本发明提供了一种不受MHC限制的淋巴细胞群，所述细胞群被工程化以表达CAR和任选的一种或多种额外的转基因编码蛋白(例如装甲蛋白)。在一些实施方案中，一种或多种转基因是密码子优化的。
在一些实施方案中，工程化NK细胞和γδT细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。术语“嵌合抗原受体”或替代的“CAR”是指重组多肽构建体，其包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和传播激活细胞的激活信号的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR在CAR融合蛋白的N末端包括任选的前导序列。
在一些实施方案中，至少20％(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，至少50％(例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，20％-80％的工程化细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，约20％至60％之间的工程化细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，40％-70％的工程化细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。
在一些实施方案中，至少约20％(例如至少20％、25％、30％、35％或40％)的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，至少40％(例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，至少50％(例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或基本上全部)的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，40％-95％的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，50％-80％的工程化NK细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，约20％至70％之间的工程化细胞NK表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。
在一些实施方案中，至少20％(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，至少30％(例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，至少约50％(例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或基本上全部)的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，20％-60％的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在一些实施方案中，30％-55％的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，约35％至60％之间的工程化γδT细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。
还如本文提供的实例所示，所要求保护的组合物的CD56+细胞已显示仍具有增加的使它们特别适用于基因工程方法的转导允许。
在一些实施方案中，至少20％(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％)的工程化CD56+细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，至少约40％(例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％)的工程化CD56+细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，约20％至80％之间的工程化CD56+细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。在其他实施方案中，约45％至75％之间的工程化CD56+细胞表达转基因，例如CAR或其他膜结合或可溶性蛋白质。
药物组合物
根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的组合物。根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的包含细胞群的药物组合物。在此类实施方案中，该组合物可以包含任选地与其他赋形剂组合的细胞。还包括包含一种或多种额外的活性剂(例如适用于治疗本文提及的疾病的活性剂)的组合物。
药物组合物可以包括不受MHC限制的淋巴细胞，特别是如本文所述的扩增的不受MHC限制的淋巴细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包括缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明的药物组合物的冷冻保存溶液包括例如DMSO。可以配制组合物，例如用于静脉内施用。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如没有可检测水平的污染物，例如内毒素或支原体的污染物。
优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、鞘内)。在一个优选实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选实施方案中，组合物通过肌肉内或皮下注射施用。
将本发明的药物组合物作为通常用于治疗如本文所述的疾病的其它确立的疗法的辅助或者与该其它确立的疗法联合用于治疗此类疾病的治疗方法中是在本发明的范围内。
在本发明的另一方面，细胞群、组合物或药物组合物与至少一种活性剂依序、同时或单独施用。
制备富含不受MHC限制的淋巴细胞的组合物的方法
本发明提供了用于制备富含不受MHC限制的淋巴细胞的组合物的方法。此类方法特别有利于制备适用于同种异体用途的组合物，因为治疗效果将不受到MHC相容性的限制。
根据本发明的一方面，提供了扩增不受MHC限制的非γδ+淋巴细胞的方法，其包括在存在白介素-15(IL-15)和不存在白介素-4(IL-4)的情况下，使用抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体或其片段来刺激包含γδT细胞和NK细胞的混合细胞群，并且培养混合细胞群。应理解，所述混合细胞群可以从如本文更详细描述的样品中获得。
发明人惊讶地发现，抗Vδ1抗体和IL-15的存在刺激了组合物的产生，所述组合物是完全不受MHC限制的CD56+免疫疗法。不受理论的束缚，Vδ1 T细胞似乎受到特异性结合Vδ1 TCR的抗体的存在的刺激，并且出乎意料地支持非Vδ1细胞扩增，例如NK细胞扩增。不受理论的束缚，这种非Vδ1细胞扩增，诸如NK细胞扩增，可以经由在NK细胞表面上表达的抗Vδ1抗体和CD16介导。通过本发明的方法产生的独特细胞组合物提供了具有非常有前途的治疗应用的细胞混合物。
根据本发明的一方面，提供了制备包含细胞群的组合物的方法，所述细胞群富集不受MHC限制的淋巴细胞，其中所述方法包括：
(1)在白介素4(IL-4)不存在的情况下，在所述培养的第一天，在以下物质的存在下，培养从受试者获得的样品：
(i)抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体或其片段；和
(ii)白介素15(IL-15)；以及
(2)分离从样品中培养的细胞群。
应理解，培养步骤可以在体外或离体执行。初始样品可能包含混合细胞群，例如，包含超过一种免疫细胞类型(诸如γδT细胞、NK细胞和任选的αβT细胞，优选仅γδT细胞和NK细胞)的细胞群。因此，在一个实施方案中，样品包含混合细胞群，所述混合细胞群包含γδT细胞和NK细胞。
在另一个实施方案中，样品在培养前(诸如在施用抗Vδ1抗体或其片段之前)富集T细胞。
在一些实施方案中，在施用抗Vδ1抗体或其片段之前，样品中存在的不受MHC限制的淋巴细胞以外的细胞类型被耗竭，诸如NK细胞和γδT细胞以外的细胞类型被耗竭。例如，在培养样品之前，样品可能富集T细胞和/或耗竭αβT细胞。在一个实施方案中，样品首先耗竭αβT细胞。可以使用本领域已知的技术来实现富集或耗竭，诸如使用涂覆有抗体的磁珠，所述抗体与细胞表面上与待要富集/耗竭的表型相关的分子结合。
细胞培养物中存在淋巴细胞以外的细胞类型可能抑制不受MHC限制的淋巴细胞的扩增。此类细胞(例如间质、上皮、肿瘤和/或饲养细胞)可以在培养前去除。因此，在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与基质细胞直接接触。基质细胞的实例包括成纤维细胞、周细胞、间充质细胞、角质形成细胞、内皮细胞和非血液肿瘤细胞。优选地，淋巴细胞在培养期间不与成纤维细胞直接接触。在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与上皮细胞直接接触。在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与肿瘤细胞和/或饲养细胞直接接触。
在一个实施方案中，方法包括在基本上不存在的基质细胞接触的情况下培养不受MHC限制的淋巴细胞。在另一个实施方案中，方法包括在不存在实质上的成纤维细胞细胞接触的情况下培养不受MHC限制的淋巴细胞。
在一个实施方案中，方法包括在含有血浆(例如人血浆)的培养基中培养样品。在另一个实施方案中，在包含2.5％血浆(诸如2.5％人血浆)的培养基中培养样品。
在一个实施方案中，方法包括在基本上不含血清的培养基(例如，无血清培养基或含有血清替代物(SR)的培养基)中培养样品。因此，在一个实施方案中，方法包括在无血清培养基中培养。这种无血清培养基还可以包括血清替代物培养基，其中血清替代物基于化学定义的组分以避免使用人或动物来源的血清。在替代实施方案中，方法包括在含有血清(例如，人AB血清或胎牛血清(FBS))的培养基中培养。在一个实施方案中，培养基含有血清替代物。在一个实施方案中，培养基不含有动物来源的产品。
应理解，在无血清培养基中培养的样品具有避免过滤、沉淀、污染和血清供应问题的优点。此外，动物衍生产品不适合用于人类治疗药物的临床级制造。与使用含有AB血清的培养基相比，对细胞(特别是Vδ1 T细胞)使用无血清培养基可显著增加从样品中获得的细胞数量。
在一个实施方案中，抗Vδ1抗体或其片段呈可溶或固定化形式。例如，可以将抗体或其片段以可溶形式向样品施用。或者，当抗体或其片段结合或共价连接至诸如珠子或板的表面(即，以固定化形式)时，可以将抗体或其片段向样品施用。在一个实施方案中，将抗体固定在表面上，诸如涂有Fc的孔。或者，抗体或其片段与细胞表面结合(例如，固定在抗原呈递细胞(APC)的表面上)。在另一个实施方案中，当细胞群与抗体接触时，抗体未固定在表面上。
与抗Vδ1抗体或其片段接触的细胞群可以从多种样品类型获得。在一个实施方案中，样品是造血样品或其部分(即，细胞群从造血样品或其部分获得)。本文对“造血样品”或“造血组织样品”的体积包括血液(诸如外周血或脐带血)、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织、胸腺组织及其部分或富集部分。样品优选是血液，包括外周血或脐带血或其部分，包括血沉棕黄层细胞、白细胞去除术产品、外周血单核细胞(PBMC)和低密度单核细胞(LDMC)。在一些实施方案中，造血样品由低密度单核细胞(LDMC)或外周血单核细胞(PBMC)组成。在一些实施方案中，样品是人血或其部分。可以使用本领域已知的技术(诸如密度梯度离心)从血液样品中获得细胞。例如，可以将全血分层到等体积的FICOLL-HYPAQUE上，然后在室温下以400xg离心15-30分钟。界面材料将含有低密度单核细胞，可以收集所述低密度单核细胞并在培养基中洗涤，并在室温下以200xg离心10分钟。在一些实施方案中，细胞群不是从特定类型的样品(诸如非造血组织样品，例如皮肤)中获得的。
在替代实施方案中，样品是非造血组织样品。本文对“非造血组织”或“非造血组织样品”的提及包括皮肤(例如，人皮肤)和肠(例如，人肠)。非造血组织是血液、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织或胸腺组织以外的组织。在一个实施方案中，非造血组织样品是皮肤(例如，人皮肤)。在一些实施方案中，细胞群从皮肤(例如，人皮肤)获得，所述细胞群可以通过本领域已知的方法获得。例如，细胞群可以通过在合成支架上培养非造血组织样品从非造血组织样品中获得，所述合成支架被配置成促进细胞从非造血组织样品中流出。或者，方法可以应用于从以下的细胞群(例如，γδT细胞)获得：胃肠道(例如，结肠或肠)、乳腺、肺、前列腺、肝脏、脾脏、胰腺、子宫、阴道和其他皮膜、粘膜或浆膜。
样品可以从癌组织样品(即，γδT和NK细胞也可以驻留在癌组织样品中)获得，例如从乳腺或前列腺肿瘤获得。在一些实施方案中，样品可以来自人癌组织样品(例如，实体瘤组织)。在其他实施方案中，样品可以来自人类癌组织以外的来源(例如，没有大量肿瘤细胞的组织)。例如，样品可以来自与附近或相邻癌组织分开的皮肤区域(例如，健康皮肤)。因此，在一些实施方案中，样品不是从癌组织(例如，人类癌组织)获得的。
样品可以从人类或非人动物组织获得。因此，方法可以额外包括从人类或非人动物组织中获得样品的步骤。在一个实施方案中，样品从人类获得。在替代实施方案中，样品从非人动物受试者获得。
在一些实施方案中，将与抗Vδ1抗体或其片段接触的细胞群在至少约10mL(诸如约15mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL或更大)的体积中培养。在一个实施方案中，将细胞群在约30mL中培养。在另一个实施方案中，将细胞群在约100mL中培养。
在一些实施方案中，与抗Vδ1抗体或其片段接触的细胞群以0.5x106个细胞/cm2(诸如1x106个细胞/cm2、1.5x106个细胞/cm2、2x106个细胞/cm2、2.5x106个细胞/cm2或3x106个细胞/cm2)的细胞密度培养。在一个实施方案中，细胞群以约1x106细胞/cm2的细胞密度培养。在另一个实施方案中，细胞群以约2x106细胞/cm2的细胞密度培养。
因此，本发明提供了用于产生富集的不受MHC限制的淋巴细胞群的离体方法。可以通过包括使混合细胞群或其纯化部分与抗体或其片段接触的方法，从分离的混合细胞群(例如，从取自患者/供体的样品获得)中产生富集的群。
因此，本文提供了可根据如本文所定义的方法获得的富含不受MHC限制的淋巴细胞的细胞群，诸如根据如本文所定义的方法获得的富含不受MHC限制的淋巴细胞的细胞群。根据本发明的这方面，应理解，这种不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群可以在体外或离体获得/扩增。在一方面，提供了可根据如本文所定义的方法获得的不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群，诸如根据如本文所定义的方法获得的不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群，其中所述群在体外或离体分离和扩增。
还提供了可根据如本文所定义的方法获得的扩增的NK细胞群。根据本发明的这方面，应理解，这种扩增的NK细胞群可以在体外或离体获得/扩增。在一方面，提供了根据如本文所定义的方法获得的扩增的NK细胞群，其中所述NK细胞群在体外或离体分离和扩增。
还提供了可根据如本文所定义的方法获得的扩增的γδT细胞群。根据本发明的这方面，应理解，这种扩增的γδT细胞群可以在体外或离体获得/扩增。在一方面，提供了根据如本文所定义的方法获得的扩增的γδT细胞群，其中所述γδT细胞群在体外或离体分离和扩增。
如本文所述的抗体或其片段可用于扩增不受MHC限制的淋巴细胞的方法。这些方法可以在体外或离体进行。如果扩增方法在体外进行，则可以将抗体(或其片段)应用于如上所述获得的分离的细胞群。在一些实施方案中，从已经从造血组织样品(诸如血液样品)中分离的细胞群扩增细胞。
不受MHC限制的淋巴细胞的扩增包括在如本文所述的抗体或其片段和白介素-15(IL-15)的存在下培养样品。这种培养可以在存在或不存在其他细胞因子的情况下发生。细胞因子可以包括白介素、淋巴因子、干扰素、集落刺激因子和趋化因子。本文提供的数据表明，从培养开始，在存在IL—15和不存在白介素4(IL-4)的情况下培养样品优先扩增不受MHC限制的淋巴细胞。因此，本文所述的方法包括从培养开始(即，第一天)，在不存在IL-4的情况下，在存在抗Vδ1抗体(或其片段)和IL-15的情况下培养样品。应理解，对如本文所述的细胞因子的提及可包括任何化合物，所述化合物在促进对培养中的不受MHC限制的淋巴细胞产生类似生理效应的能力方面具有与所述细胞因子相同的活性，并且包括但不限于模拟物或其任何功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括在培养开始时(即，第一天)添加抗Vδ1抗体(或其片段)。在另外的实施方案中，本文所述的方法包括仅在培养开始时(即，仅第一天)添加抗Vδ1抗体(或其片段)。在其他实施方案中，本文所述的方法包括在培养期间的一个或多个额外时间点(例如，在一个或两个额外时间点)添加抗Vδ1抗体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括在培养开始时(即，第一天)添加IL-15。在另外的实施方案中，本文所述的方法包括仅在培养开始时(即，仅第一天)添加IL-15。在其他实施方案中，本文所述的方法包括在培养期间的一个或多个额外时间点(例如，在一个或两个额外时间点)添加IL-15。很容易理解，降低添加抗Vδ1抗体和/或IL-15的频率提供了减少培养物操作(例如减少处理)的优势。这种减少的操作/处理可能导致可制造性提高。
这种培养步骤可以在存在或不存在其他细胞因子的情况下执行。细胞因子的实例包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL—12)、白介素18(IL-18)、白介素21(IL-21)、白介素33(IL-33)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、白介素1β(IL-1β)、干扰素γ(IFN-γ)和基质细胞衍生因子1(SDF-1)。
使用的细胞因子(例如，白介素)可以是人或动物来源的，优选人来源的。它可以是野生型蛋白质或任何生物活性片段或变体，即能够结合其受体。这种结合可以在根据本发明的方法的条件中诱导γδT细胞的激活。更优选地，细胞因子可以是可溶形式，与另一种分子(诸如例如肽、多肽或生物活性蛋白)融合或复合。优选地，使用人重组细胞因子。更优选地，白介素浓度的范围可以在1-10000ng/ml之间变化，甚至更优选在1-1000ng/ml之间，诸如约100ng/ml。在一些实施方案中，IL-15的浓度为100ng/ml。因此，在一个实施方案中，培养步骤在100ng/ml IL-15的存在下执行。
在一个实施方案中，细胞因子是具有白介素-15样活性的生长因子，即在促进对培养中的不受MHC限制的淋巴细胞产生类似生理效应的能力方面具有与IL—15相同的活性的任何化合物，并且包括但不限于IL-15和IL—15模拟物或IL—15的任何功能等同物，包括IL-2和IL-7。
在一个实施方案中，培养基中存在IL-15。在一个实施方案中，培养基中不存在IL-4。
如本文所用，对“扩增的”或“扩增的群”的提及包括比未扩增的群更大或含有更多细胞的细胞群。此类群可以是数量大的、数量少的或混合群，其中一部分或特定细胞类型在群内扩增。应理解，术语“扩增方法”是指导致扩增或扩增群的过程。因此，与没有执行扩增步骤或在任何扩增步骤之前的群相比，扩增或扩增群可能数量更大或含有更多细胞。还应理解，本文指示的用于指示扩增的任何数字(例如，倍数增加或倍数扩增)是说明细胞群的数量或大小或细胞数量的增加并且指示量的扩增。
在一个实施方案中，方法包括培养样品至少5天(例如至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少18天、至少21天、至少28天或更长，例如5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21天)。在另一个实施方式中，方法包括培养样品至少7天，诸如至少11天或至少14天。
在另一个实施方案中，方法包括以有效产生不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群的量培养样品至少5天(例如至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少1_3天、至少14天、至少1_8天、至少21天、至少28天或更长，例如5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21天)。
在一个实施方案中，培养样品5至60天，诸如至少7至45天、7至21天或7至18天的时间段。在一个实施方案中，培养样品11至14天的时间段。在另一个实施方案中，培养样品12天的时间段以产生不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群。在另一个实施方案中，培养样品14天的时间段。在又一个实施方案中，培养样品一段时间，直至活性增殖标记(诸如Ki-67)的表达被下调，即在可以检测到这种下调之前的一段时间。因此，在一个实施方案中，在活性增殖标记(诸如Ki-67)的表达被下调之前培养样品一段时间。在某些实施方案中，直至下调活性增殖标记的表达/下调活性增殖标记的表达之前的培养期是12天。在一个实施方案中，直至下调Ki-67的表达/下调Ki-67的表达之前的培养期是12天。
方法可以包括在培养期间定期添加抗-Vδ1抗体或其片段和/或生长因子。例如，抗Vδ1抗体或其片段和/或生长因子可以每2至7天添加一次，更优选每3至4天添加一次。在一个实施方案中，(在初次施用后)，在培养后7天添加抗Vδ1抗体或其片段和/或生长因子并且其后每3至4天添加一次。
本发明的方法提供了不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群，其数量大于参考群。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群在数量上大于扩增步骤前分离的不受MHC限制的淋巴细胞群(例如，相对于扩增步骤前分离的不受MHC限制的淋巴细胞群的至少2倍数量、至少5倍数量、至少10倍数量、至少25倍数量、至少50倍数量、至少60倍数量、至少70倍数量、至少80倍数量、至少90倍数量、至少100倍数量、至少200倍数量、至少300倍数量、至少400倍数量、至少500倍数量、600倍数量、至少1,000倍数量或更多)。在一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群在数量上是相对于扩增步骤前分离的不受MHC限制的淋巴细胞群的5倍至10倍之间。在另一个实施方案中，在如本文所定义的培养期之后，扩增群的数量是扩增前分离的群的5倍至10倍之间。在又一个实施方案中，在12天的培养期之后，扩增群的数量是扩增前分离的群的5倍至10倍之间。在另一个实施方案中，在14天的培养期之后，扩增群的数量是相对于扩增前分离的群的5倍至10倍之间。在一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群在数量上大于在不存在抗体或其片段的情况下培养相同时间长度的群。在一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞(特别是NK细胞)的扩增群在数量上大于在不存在IL-4的情况下培养相同时间长度的群。
本发明的方法提供了可以如本文所述表征的不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群。例如，在一些实施方案中，存在于使用所述方法分离的细胞群中的至少70％的不受MHC限制的淋巴细胞表达CD56。
在一些实施方案中，使用所述方法分离的细胞群包含γδT细胞并且至少40％的γδT细胞表达CD56。在一些实施方案中，至少约45％的γδT细胞表达CD56。在一些实施方案中，至少约45％(诸如至少46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％)的γδT细胞表达CD56。在一些实施方案中，至少约50％的γδT细胞表达CD56。在一些实施方案中，至少约55％的γδT细胞表达CD56。在一些实施方案中，至少约60％的γδT细胞表达CD56。
本发明的方法可以提供不受MHC限制的淋巴细胞群，其CD56亮细胞的比例比参考群(例如起始材料/样品)高。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮γδT细胞的数量增加至少40％。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮γδT细胞的数量增加至少45％，诸如至少46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％。在一些实施方案中，扩增组合物存在的CD56亮γδT细胞的数量增加至少约50％。在一些实施方案中，存在于扩增组合物中的CD56亮γδT细胞数量增加至少约55％。在一些实施方案中，存在于扩增组合物中的CD56亮γδT细胞数量增加至少约60％。
在一些实施方案中，扩增组合物中存在的γδT细胞的至少约40％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的γδT细胞的至少约45％(诸如至少46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％)是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的γδT细胞的至少约50％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的γδT细胞的至少约55％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的γδT细胞的至少约60％是CD56亮。
在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮NK细胞的数量增加至少50％。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮NK细胞的数量增加至少60％，诸如至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮NK细胞的数量增加至少约70％。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮NK细胞的数量增加至少约75％。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的CD56亮NK细胞的数量增加至少约80％。
在一些实施方案中，扩增组合物中存在的NK细胞的至少约50％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的NK细胞的至少60％(诸如至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％)是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的NK细胞的至少约70％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的NK细胞的至少约75％是CD56亮。在一些实施方案中，扩增组合物中存在的NK细胞的至少约80％是CD56亮。
扩增方法可以提供不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群，其NK细胞比例高于参考群。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约30％的NK细胞，诸如至少约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的NK细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约40％的NK细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约80％的NK细胞，诸如少于约79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、60％、68％、57％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的NK细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约60％的NK细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约20％至70％之间的NK细胞，诸如约30％至60％的NK细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约50％的NK细胞。
扩增方法可以提供不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群，其γδT细胞比例高于参考群。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约30％的γδT细胞，诸如至少约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的γδT细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约40％的γδT细胞，诸如超过约45％的γδT细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约80％的γδT细胞，诸如少于约79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、60％、68％、57％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的γδT细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约60％的γδT细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约30％至60％之间的γδT细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约50％的γδT细胞。
在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约10％的Vδ1 T细胞，诸如至少约11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的Vδ1 T细胞。在另一个实施方案中，Vδ1 T细胞的扩增群含有至少约20％的Vδ1 T细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约10％至55％之间的Vδ1 T细胞，诸如约10％至30％之间的Vδ1 T细胞。
在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有至少约5％的Vδ2 T细胞，诸如至少约6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的Vδ2 T细胞。在另一个实施方案中，Vδ1 T细胞的扩增群含有至少约7％的Vδ2T细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有约7％至30％之间的Vδ2 T细胞。
在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约10％的αβT细胞，诸如少于约5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％的αβT细胞。在另一个实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的扩增群含有少于约1％的αβT细胞。具有αβ受体的T细胞具有高反应性，因此在本发明的上下文中适合向患者施用的细胞群仅可以含有低水平的αβT细胞。本文所述的抗体可用于选择性扩增不受MHC限制的淋巴细胞，这减少了扩增后为去除αβT细胞而对大量纯化方法的需要。
在一些实施方案中，使用所述方法分离的细胞群的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成，并且其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
细胞表面标记表达的增加或减少可以额外地或替代地用于表征一个或多个不受MHC限制的淋巴细胞(包括CD27和/或NKp30)的扩增群。在一些实施方案中，与参考群(诸如未使用本发明的方法扩增的群)相比，不受MHC限制的淋巴细胞群中存在的Vδ1T细胞的扩增群表达较低水平的CD27。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞群中存在的Vδ1T细胞的扩增群表达低水平的CD27(CD27低)。例如，Vδ1 T细胞的扩增群的少于约70％，诸如少于约50％、40％或30％表达CD27(即，CD27+)。在一些实施方案中，与参考群(诸如未使用本发明的方法扩增的群)相比，不受MHC限制的淋巴细胞群中存在的Vδ1T细胞的扩增群表达较高水平的NKp30。例如，Vδ1 T细胞的扩增群的超过约10％，诸如超过约15％、20％或25％表达NKp30(即，NKp30+)。
在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞群中存在的Vδ1T细胞的扩增群表达高水平的NKG2D(NKG2D高)。例如，Vδ1 T细胞的扩增群的超过约80％，诸如超过约85％、90％或95％表达NKG2D(即，NKG2D+).
许多适用于γδT细胞的增殖的基础培养基(basal culture media)是可用的，特别是培养基(medium)，诸如CTS OpTmizer(Thermo Fisher)AIM-V、Iscoves培养基和RPMI-1640(Life Technologies)、EXVIVO-10，EXVIVO-15或EXVIVO-20(Lonza)，任选地存在血清或血浆。培养基可以补充有如本文所定义的其他培养基因子，诸如血清、血清蛋白和选择剂，诸如抗生素。例如，在一些实施方案中，RPMI-1640培养基含有2mM谷氨酰胺、10％FBS、10mM HEPES、pH 7.2、1％青霉素-链霉素、丙酮酸钠(1mM；Life Technologies)、非必需氨基酸(例如。100μM Gly、Ala、Asn、Asp、Glu、Pro和Ser；1X MEM非必需氨基酸(LifeTechnologies))，和10μl/Lβ-巯基乙醇。在替代实施方案中，AIM-V培养基可以补充有CTS免疫血清替代物和两性霉素B。方便地，细胞在培养期间在合适的培养基中在含有5％CO2的潮湿环境中在37℃下培养。培养基还可以补充有特异性支持特定细胞(诸如NK细胞和/或Vδ2T细胞)扩增的因子。因此，在一个实施方案中，培养基包含NK细胞和/或Vδ2 T细胞补充剂。培养基补充剂的实例包括Miltenyi Biotech的NK补充剂。此类补充剂的存在可以增强靶细胞的增殖潜力，从而增加此类细胞在扩增群中的比例。
如本文所述，抗体(或其片段)可以应用于从样品中获得的细胞群。在一个实施方案中，在施用抗Vδ1抗体或其片段之前从样品中分离细胞群。
本文对细胞(特别是γδT细胞)的“分离(isolation)”或“分离(isolating)”的提及，是指这样的方法或过程，其中细胞被去除、分离、纯化、富集或以其他方式从组织或细胞池中取出。应理解，此类提及包括术语“分离的”、“去除的”、“纯化的”、“富集的”等。γδT细胞的分离包括从完整的非造血组织样品或从非造血组织的基质细胞(例如，成纤维细胞或上皮细胞)分离或分开细胞。此类分离可以替代地或额外地包括从其他造血细胞(例如，αβT细胞或其他淋巴细胞)中分离或分开γδT细胞。分离可以持续限定的时间段，例如从组织外植体或活检被放置在分离培养物中开始，到从培养物中收集细胞时结束，诸如通过离心或用于转移分离细胞群的其他方式来扩增培养或用于其他目的，或从培养物中去除原始组织外植体或活检。分离步骤可以持续至少约3天至约45天。在一个实施方式中，分离步骤持续至少约10天至至少28天。在另一个实施方案中，分离步骤持续至少14天至至少21天。因此，分离步骤可以持续至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、约35天、约40天或约45天可以理解，尽管在此分离步骤期间细胞增殖可能不明显，但不一定不存在。事实上，本领域的技术人员认识到分离的细胞也可以开始分裂以在含有样品的分离容器内产生多个此类细胞。
细胞群可以通过允许淋巴细胞(特别是Vδ1 T细胞)分离的合适方法从人或非人动物样品(诸如非造血组织样品)获得。Clark等人(2006)J.Invest.Dermatol.126(5)：1059-70提出了一种这样的方法，所述文献描述了一种用于从人皮肤中分离淋巴细胞的三维皮肤外植体方案。外植体可以粘附到合成支架上以促进淋巴细胞从外植体流出到支架上。合成支架是指适合支持细胞生长的非天然三维结构。合成支架可以由以下材料构成：诸如聚合物(例如，天然或合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯)、陶瓷(例如，磷酸三钙、铝酸钙、羟基磷灰石钙)或金属(钽、钛、铂和与铂、铌、铪、钨同族的金属及其合金组合)。根据本领域已知的方法，生物因子(例如，胶原蛋白(例如，胶原蛋白I或胶原蛋白II)、纤连蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白、血管生成因子、抗炎因子、糖胺聚糖、体外原(vitrogen)、抗体及其片段、细胞因子可以涂覆在支架表面上或封装在支架材料内来增强细胞粘附、迁移、存活或增殖。这种方法和其他方法可以用于从许多其他非造血组织类型(例如，肠、前列腺和乳腺)中分离细胞群。合适的分离方法的其他实例利用“爬出(crawl-out)”方法，所述方法可以包括在足以分离或分开免疫细胞(特别是不受MHC限制的淋巴细胞)的细胞因子和/或趋化因子的存在下培养细胞群。
非造血组织驻留淋巴细胞可以例如通过牢固的移液管从基质细胞(诸如真皮成纤维细胞)中收获并分离。淋巴细胞收获物可以通过40μm尼龙网进一步洗涤，以便保留在所述过程中可能变得松散的成纤维细胞聚集体。也可以使用例如使用CD45抗体的荧光或磁性相关细胞分选来分离淋巴细胞。
本文对“培养”的提及包括将样品(包括从样品中分离、分开、去除、纯化或富集的细胞)添加到包含细胞和/或样品需要和/或优选的生长因子和/或必需营养物质的培养基中。应理解，此类培养条件可以根据待从样品中分离的细胞或细胞群进行调整，或者可以根据要待从样品中分离和扩增的细胞或细胞群进行调整。
培养基可以额外包括有助于γδT细胞生长和扩增的其他成分。可以添加的其他成分的实例包括但不限于血浆或血清、纯化的蛋白质(诸如白蛋白)、脂质来源(诸如低密度脂蛋白(LDL))、维生素、氨基酸、类固醇和支持或促进细胞生长和/或存活的任何其他补充剂。
抗体或其片段
在本文提供的方法中使用的抗体是能够特异性结合γδT细胞受体(TCR)的δ可变1链(Vδ1)的抗体或其片段。在一个实施方案中，抗Vδ1抗体或其片段是激活性抗Vδ1抗体或其片段。令人惊讶地发现，在某些培养条件下，在抗Vδ1抗体存在下培养细胞群能够同时富集所有不受MHC限制的淋巴细胞，而不仅仅是预期的Vδ1 T细胞。在一些实施方案中，抗Vδ1抗体以42ng/ml的浓度使用。因此，在一个实施方案中，本文所述的方法的培养步骤在42ng/ml的抗Vδ1抗体的存在下执行。
在一个实施方案中，抗体或其片段是scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、可变结构域(例如VH或VL)、双抗体、微型抗体或单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体或其片段是scFv。
本文所述的抗体可以是任何类别的，例如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD或其同种型，并且可以包含κ或λ轻链。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体，例如同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一种。在另一个实施方案中，抗体可以是已经被修饰以赋予期望性质(诸如Fc被突变成降低效应子功能、延长半衰期、改变ADCC或提高铰链稳定性)的格式，诸如IgG格式。此类修饰是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，抗体或其片段是人的。因此，抗体或其片段可以源自人免疫球蛋白(Ig)序列。抗体(或其片段)的CDR、框架和/或恒定区可以源自人Ig序列，特别是人IgG序列。CDR、框架和/或恒定区对于人Ig序列，特别是人IgG序列可以是基本相同的。使用人抗体的优点在于它们在人类中具有低免疫原性或没有免疫原性。
抗体或其片段也可以是嵌合的，例如小鼠-人抗体嵌合体。
或者，所述抗体或其片段源自非人物种，诸如小鼠。此类非人抗体可以被修饰以增加它们与在人中天然产生的抗体变体的相似性，因此所述抗体或其片段可以部分或完全人源化。因此，在一个实施方案中，所述抗体或其片段是人源化的。
靶向表位的抗体
本文提供了与γδTCR的Vδ1链的表位结合的抗体(或其片段)。此类结合可以任选地对γδTCR活性产生诸如激活或抑制的影响。
在一个实施方案中，表位可以是γδT细胞的激活性表位。“激活性”表位可以包括，例如，刺激TCR功能，诸如脱粒、TCR下调、细胞毒性、增殖、动员、存活或对衰竭的抵抗力的增加、细胞内信号传导、细胞因子或生长因子分泌、表型变化或基因表达的变化。例如，激活性表位的结合可以刺激γδT细胞群(优选Vδ1 T细胞群)的扩增(即，增殖)。因此，这些抗体可用于调节γδT细胞激活，从而调节免疫响应。因此，在一个实施方案中，激活性表位的结合使γδTCR下调。在额外的或替代的实施方案中，激活性表位的结合激活γδT细胞的脱粒。在另一个额外的或替代的实施方案中，激活性表位的结合激活γδT细胞杀伤。
或者，抗体(或其片段)可通过阻止另一抗体或分子的结合或相互作用而具有阻断作用。在一个实施方案中，本发明提供了阻断Vδ1并阻止TCR结合(例如通过空间位阻)的分离的抗体或其片段。通过阻断Vδ1，所述抗体可以阻止TCR激活和/或信号传导。表位可以是γδT细胞的抑制性表位。“抑制性”表位可以包括例如阻断TCR功能，从而抑制TCR激活。
表位优选包含γδTCR的Vδ1链的至少一个胞外、可溶性、亲水性、外部或胞质部分。
特别地，表位不包含在γδTCR的Vδ1链的高变区，特别是Vδ1链的CDR3中发现的表位。在一个优选实施方案中，表位在γδTCR的Vδ1链的非可变区内。应理解，此类结合允许对Vδ1链进行独特识别，而不受高度可变(特别是CDR3)的TCR序列的限制。识别MHC样肽或抗原的各种γδTCR复合物可以以这种方式识别，仅通过Vδ1链的存在。因此，应理解，任何包含Vδ1链的γδTCR都可以使用如本文所定义的抗体或其片段来识别，而不管γδTCR的特异性如何。在一个实施方案中，表位包含在SEQ ID NO：1的氨基酸区1-24和/或35-90内的一个或多个氨基酸残基，例如不是CDR1和/或CDR3序列的一部分的Vδ1链部分。在一个实施方案中，表位不包含在SEQ ID NO：1的氨基酸区域91-105(CDR3)内的氨基酸残基。
以与充分表征的αβT细胞类似的方式，γδT细胞利用一组不同的体细胞重排变量(V)、多样性(D)、联接(J)和恒定(C)基因，但是γδT细胞含有比αβT细胞更少的V、D和J区段。在一个实施方案中，抗体(或其片段)结合的表位不包含在Vδ1链的J区(例如，在人δ1链种系中编码的四个J区之一：SEQ ID NO：131(J1*0)或132(J2*0)或133(J3*0)或134(J4*0))中发现的表位。在一个实施方案中，抗体(或其片段)结合的表位不包含在Vδ1链的C区(例如，SEQID NO：135(C1*0)，其含有C末端近膜/跨膜区)中发现的表位。在一个实施方案中，抗体(或其片段)结合的表位不包含在Vδ1链的N末端前导序列(例如SEQ ID NO：129)中发现的表位。因此，抗体或片段可以仅结合在Vδ1链的V区(例如SEQ ID NO：130)中。因此，在一个实施方案中，表位由γδTCR的V区中的表位(例如SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-90)组成。
对表位的提及是针对Luoma等人(2013)Immunity 39：1032-1042和RCSB蛋白质数据库条目：4MNH和3OMZ中描述的序列衍生的Vδ1序列作出的，所述Vδ1序列示为SEQ ID NO：1：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGESLTRADKLIFGKGTRVTVEPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS(SEQ ID NO：1)
SEQ ID NO：1表示可溶性TCR，其包含V区(也称为可变结构域)、D区、J区和TCR恒定区。V区包含氨基酸残基1-90，D区包含氨基酸残基91-104，，J区包含氨基酸残基105-115，并且恒定区包含氨基酸残基116—209。在V区内，CDR1定义为SEQ ID NO：1的氨基酸残基25-34，CDR2定义为SEQ ID NO：1的氨基酸残基50-54，并且CDR3定义为SEQ ID NO：1的氨基酸残基93-104(Xu等人，PNAS USA 108(6)：2414-2419(2011))。
因此，在一个实施方案中，分离的抗体或其片段结合γδT细胞受体(TCR)的可变δ1(Vδ1)链的表位，所述表位包含以下氨基酸区域内的一个或多个氨基酸残基：
(i)SEQ ID NO：1的3-20；和/或
(ii)SEQ ID NO：1的37-77。
本文所述的抗体的表位绘制如PCT申请号PCT/GB2020/051956的实施例1和9所述进行，所述申请以引用方式并入本文。
在另一个实施方案中，抗体或其片段另外识别包含SEQ ID NO：128的氨基酸残基1-90表位的多态V区。因此，当定义本文所述的表位时，SEQ ID NO：1的氨基酸1-90和多肽种系变体序列(SEQ ID NO：128的氨基酸1-90)可以被认为是可互换的。本发明的抗体可以识别这种种系序列的两种变体。举例来说，在规定如本文所定义的抗体或其片段识别包含SEQID NO：1的氨基酸区域1-24和/或35-90的一个或多个氨基酸的表位的情况下，这还指代SEQID NO：128的相同区域；特别是SEQ ID NO：128的氨基酸区域1-24和/或35-90。
在一个实施方案中，抗体或其片段识别SEQ ID NO：1的氨基酸区域1-90内的一个或多个氨基酸残基和SEQ ID NO：128的1-90区域的等同位置的氨基酸。更具体地说，在一个实施方案中，如本文定义的抗体或其片段识别人种系表位，其中所述种系编码SEQ ID NO：1的位置71处的丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。
在一个实施方案中，表位包含所述区域内的一个或多个，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域3-20内的一个或多个(诸如5个或更多，诸如10个或更多)氨基酸残基。在替代实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域37-77(诸如氨基酸区域50-54)内的一个或多个(诸如5个或更多个，诸如10个或更多个)氨基酸残基。在又一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域3-20(诸如5-20或3-17)内的一个或多个(诸如5个或更多，诸如10个或更多)氨基酸残基和SEQ IDNO：1的氨基酸区域37-77(诸如62-77或62-69)内的一个或多个(诸如5个或更多，诸如10个或更多)氨基酸残基。
应当进一步理解，所述抗体(或其片段)不需要与限定范围内的所有氨基酸结合。此类表位可以称为线性表位。例如，与包含SEQ ID_NO：1的氨基酸区域5-20内的氨基酸残基的表位结合的抗体可以仅与所述范围内的一个或多个氨基酸残基(例如所述范围的每个末端处的氨基酸残基(即氨基酸5和20)，任选地包括位于该范围内的氨基酸(即氨基酸5、9、16和20))结合。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、20、37、42、50、53、59、62、64、68、69、72或77中的至少一个。在另一个实施方案中，表位包含选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、20、37、42、50、53、59、62、64、68、69、72或77的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个氨基酸。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：128，如下所述)的以下氨基酸区域内的一个或多个氨基酸残基：
(i)3-17；
(ii)5-20；
(iii)37-53；
(iv)50-64；
(v)59-72；
(vi)59-77；
(vii)62-69；和/或
(viii)62-77。
在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20和62-77；50-64；37-53和59-72；59-77；或3-17和62-69内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，表位由SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20和62-77；50-64；37-53和59-72；59-77；或3-17和62-69内的一个或多个氨基酸组成。
在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、62、64、68和69，或合适地由SEQ ID NO：1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、62、64、68和69组成。在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基5、9、16、20、62、64、72和77，或合适地由SEQ ID NO：1的氨基酸残基5、9、16、20、62、64、72和77组成。在又一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基37、42、50、53、59、64、68、69、72、73和77，或合适地由SEQ ID NO：1的氨基酸残基37、42、50、53、59、64、68、69、72、73和77组成。在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基50、53、59、62和64，或合适地由SEQ ID NO：1的氨基酸残基50、53、59、62和64组成。在另一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基59、60、68和72，或合适地由SEQ ID NO：1的氨基酸残基59、60、68和72组成。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20和/或62-77内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20和62-77内的一个或多个氨基酸残基组成。在另一个替代实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20或62-77内的一个或多个氨基酸残基。具有此类表位的抗体或片段可以具有1245_P01_E07的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可以来源于1245_P01_E07。例如，具有1245_P01_E07的一个或多个CDR序列或1245_P01_E07的VH和VL序列中的一者或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域50-64内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由SEQ ID NO：1的氨基酸区域50-64内的一个或多个氨基酸残基组成。具有此类表位的抗体或片段可以具有1252_P01_C08的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可以来源于1252_P01_C08。例如，具有1252_P01_C08的一个或多个CDR序列或1252_P01_C08的VH和VL序列中的一者或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域37-53和/或59-77内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由SEQ ID NO：1的氨基酸区域37-53和59-77内的一个或多个氨基酸残基组成。在另一个替代实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域37-53或59-77内的一个或多个氨基酸残基。具有此类表位的抗体或片段可以具有1245_P02_G04的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可以来源于1245_P02_G04。例如，具有1245_P02_G04的一个或多个CDR序列或1245_P02_G04的VH和VL序列中的一者或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
在一个实施方案中，表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域59-72内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由SEQ ID NO：1的氨基酸区域59-72内的一个或多个氨基酸残基组成。具有此类表位的抗体或片段可以具有1251_P02_C05的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可以来源于1251_P02_C05。例如，具有1251_P02_C05的一个或多个CDR序列或1251_P02_C05的VH和VL序列中的一者或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
在一个实施方案中，表位不包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域11-21内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域21-28内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域59和60内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域67-82内的氨基酸残基。
在一个实施方案中，表位与可商购获得的抗Vδ1抗体(诸如TS-1或TS8.2)结合的表位不同。如WO2017197347中所述，当δ1链包括Vδ1 J1和Vδ1 J2序列但不包括Vδ1 J3链时，检测到TS-1和TS8.2与可溶性TCR的结合，表明TS-1和TS8.2的结合涉及δJ1和δJ2区域中的关键残基。
本文对“在……内”的提及包括限定范围的极端。例如，“在氨基酸区域5-20内”是指所有氨基酸驻留在残基5至残基20(包括残基5和残基20)。
本领域已知用于确定抗体所结合的表位的各种技术。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析、肽切割分析晶体学研究和NMR分析。另外，还可以采用诸如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法。另一种可用于鉴定多肽内与抗体相互作用的氨基酸的方法是通过质谱法检测的氢/氘交换(如实施例9中所述)。一般来讲，氢/氘交换方法涉及对感兴趣的蛋白质进行氘标记，然后将抗体与氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，并且使受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比不属于界面的一部分的氨基酸内的可交换质子更慢的速率经历氘到氢的反向交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，因此与未包括在界面中的氨基酸相比，表现出相对较高的质量。抗体解离后，使靶蛋白经受蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸相对应的氘标记残基。
抗体序列
本发明的经分离的抗Vδ1抗体或其片段可以参考它们的CDR序列进行描述。
在一个实施方案中，抗Vδ1抗体或其片段包含以下中的一种或多种：
CDR3，其包含与SEQ ID NO：2-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
CDR2，其包含与SEQ ID NO：26-37和序列A1-A12中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和/或
CDR1，其包含与SEQ ID NO：38-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，分离的抗Vδ1抗体或其片段包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO：2-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：26-37和序列：A1-A12(表2)中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ IDNO：38-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-25中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：26-37和序列：A1-A12(表2)中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：38-61中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2—25中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR2，所述CDR2由与SEQ ID NO：26-37和序列：A1-A12(表2)中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR1，所述CDR1由与SEQ ID NO：38-61中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3与SEQID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少80％序列同一性。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14—25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-7，特别是2—6，诸如2、3或4中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2—7，特别是2—6，诸如2、3或4中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ IDNO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-7，特别是2-6，诸如2、3或4中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-7，特别是2-6，诸如2、3或4中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-7，特别是2-6，诸如2、3或4中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：2-7，特别是2-6，诸如2、3或4中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成；和/或VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：14-19，特别是14-18，诸如14、15或16中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少80％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少90％序列同一性的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：8-13，特别是8、9、10或11中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成；和VL区，所述VL区包含CDR3，所述CDR3由与SEQ ID NO：20-25，特别是20、21、22或23中的任一个具有至少95％序列同一性的序列组成。
本文提及“至少80％”或“80％或更高”的实施方案将被理解为包括等于或高于80％的所有值，诸如85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，抗体或其片段与指定序列具有至少85％，诸如至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
代替序列同一性百分比，实施方案也可以用一个或多个氨基酸变化，例如一个或多个添加、取代和/或缺失来定义。在一个实施方案中，序列可以包含最多五个氨基酸变化，诸如最多三个氨基酸变化，尤其是最多两个氨基酸变化。在另一个实施方案中，序列可以包含最多五个氨基酸取代，诸如最多三个氨基酸取代，尤其是一个或两个氨基酸取代。例如，抗体或其片段的CDR3包含与SEQ ID NO：2-25中的任一个相比具有不超过2个，更合适地不超过1个取代的序列，或者更合适地由所述序列组成。
合适地，CDR1、CDR2或CDR3中的不同于它们在SEQ ID NO：2-61和序列：A1-A12中的对应残基的任何残基是相对于它们的对应残基的保守性取代。例如，CDR3中的不同于它们在SEQ ID NO：2-25中的对应残基的任何残基是相对于它们的对应残基的保守性取代。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：
(i)VH区，其包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)VH区，其包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：26-37中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(iii)VH区，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：38-49中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(iv)VL区，其包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(v)VL区，其包含CDR2，所述CDR2包含与序列：A1-A12中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和/或
(vi)VL区，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：50-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含重链，所述重链具有：
(i)VH区，其包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2-13中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)VH区，其包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：26-37中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和
(iii)VH区，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：38-49中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含轻链，所述轻链具有：
(i)VL区，其包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)VL区，其包含CDR2，所述CDR2包含与序列：A1-A12中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和
(iii)VL区，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：50-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：2、3、4、5或6，诸如2、3、4或5，特别是2、3或4中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：26、27、28、29或30，诸如26、27、28或29，特别是26、27或28中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：38、39、40、41或42，诸如38、39、40或41，特别是38、39或40中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：8、9、10或11中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO：32、33、34或35中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区(或由其组成)，所述VH区包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：44、45、46或47中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：2的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：26的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：38的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：2的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：26的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：38的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：3的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：27的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：39的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：3的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：27的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：39的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：4的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：28的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：40的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：4的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：28的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：40的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：5的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：29的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：41的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：5的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：29的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：41的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：6的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：30的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：42的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：6的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：30的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：42的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：8的序列的CDR3、包含SEQ ID N0：32的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：44的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：8的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：32的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：44的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：9的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：33的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：45的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ IDNO：9的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：33的序列组成，且CDR1由SEQ ID NO：45的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：10的序列的CDR3、SEQ ID NO：34的CDR2序列和SEQ ID NO：46的CDR1序列。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：10的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：34的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：46的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：11的序列的CDR3、SEQ ID NO：35的CDR2序列和SEQ ID NO：47的CDR1序列。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：11的序列组成，CDR2由SEQ ID NO：35的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：47的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区(或由其组成)，所述VL区包含CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO：14-25，诸如SEQID NO：14、15、16、17或18，诸如14、15、16或17，特别是14、15或16中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区(或由其组成)，所述VL区包含CDR2，所述CDR2包含与序列：A1-A12(表2)，诸如序列：A1、A2、A3、A4或A5，诸如A1、A2、A3或A4，特别是A1、A2或A3中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区(或由其组成)，所述VL区包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO：50-61，诸如SEQ ID NO：50、51、52、53或54，诸如50、51、52或53，特别是50、51或52中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：14的序列的CDR3、包含序列：A1的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：50的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：14的序列组成，CDR2由序列：A1的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：50的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：15的序列的CDR3、包含序列：A2的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：51的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：15的序列组成，CDR2由序列：A2的序列组成，并且CDR1由SEq ID NO：51的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID No：16的序列的CDR3、包含序列：A3的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：52的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：16的序列组成，CDR2由序列：A3的序列组成，并且CDR1由SEQ ID No：52的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID No：17的序列的CDR3、包含序列：A4的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：53的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：17的序列组成，CDR2由序列：A4的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：53的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：18的序列的CDR3、包含序列：A5的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：54的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：18的序列组成，CDR2由序列：A5的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：54的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：20的序列的CDR3、包含序列：A7的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：56的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：20的序列组成，CDR2由序列：A7的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：56的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：21的序列的CDR3、包含序列：A8的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：57的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：21的序列组成，CDR2由序列：A8的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：57的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：22的序列的CDR3、包含序列：A9的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：58的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：22的序列组成，CDR2由序列：A9的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：58的序列组成。
在一个实施方案中，VL区包含：包含SEQ ID NO：23的序列的CDR3、包含序列：A10的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：59的序列的CDR1。在一个实施方案中，CDR3由SEQ ID NO：23的序列组成，CDR2由序列：A10的序列组成，并且CDR1由SEQ ID NO：59的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：2的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：26的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：38的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：14的序列的CDR3、包含序列：A1的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：50的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：2的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：26的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：38的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：14的序列组成，LCDR2由序列：Al的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：50的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：3的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：27的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：39的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：15的序列的CDR3、包含序列：A2的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：51的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：3的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：27的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：39的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：15的序列组成，LCDR2由序列：A2的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：51的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：4的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：28的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：40的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID N0：16的序列的CDR3、包含序列：A3的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：52的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：4的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：28的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：40的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：16的序列组成，LCDR2由序列：A3的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：52的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：5的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：29的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：41的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEq ID N0：17的序列的CDR3、包含序列：A4的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：53的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：5的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：29的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：41的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：17的序列组成，LCDR2由序列：A4的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：53的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：6的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：30的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：42的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：18的序列的CDR3、包含序列：A5的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：54的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：6的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：30的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：42的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：18的序列组成，LCDR2由序列：A5的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：54的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：7的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：31的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：43的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID N0：19的序列的CDR3、包含序列：A6的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：55的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：7的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：31的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：43的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：19的序列组成，LCDR2由序列：A6的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：55的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：8的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：32的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：44的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：20的序列的CDR3、包含序列：A7的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：56的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：8的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：32的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：44的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：20的序列组成，LCDR2由序列：A7的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：56的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：9的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：33的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：45的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：21的序列的CDR3、包含序列：A8的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：57的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：9的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：33的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：45的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：21的序列组成，LCDR2由序列：A8的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：57的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID No：10的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：34的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：46的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：22的序列的CDR3、包含序列：A9的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：58的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID No：10的序列组成，HCDR2由SEQ ID No：34的序列组成，HCDR1由SEQ IDNO：46的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：22的序列组成，LCDR2由序列：A9的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：58的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID No：11的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：35的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：47的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID N0：23的序列的CDR3、包含序列：A10的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：59的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：11的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：35的序列组成，HCDR1由SEQID NO：47的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：23的序列组成，LCDR2由序列：A10的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：59的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID NO：12的序列的CDR3、包含SEQ ID NO：36的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：48的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEq ID N0：24的序列的CDR3、包含序列：A11的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：60的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID No：12的序列组成，HCDR2由SEQ ID No：36的序列组成，HCDR1由SEQID No：48的序列组成，LCDR3由SEQ IDNo：24的序列组成，LCDR2由序列：A11的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID No：60的序列组成。
在一个实施方案中，VH区包含：包含SEQ ID No：1 3的序列的CDR3、包含SEQ IDNO：37的序列的CDR2、包含SEQ ID NO：49的序列的CDR1，并且VL区包含：包含SEQ ID NO：25的序列的CDR3、包含序列：A12的序列的CDR2和包含SEQ ID NO：61的序列的CDR1。在一个实施方案中，HCDR3由SEQ ID NO：13的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO：37的序列组成，HCDR1由SEQ ID NO：49的序列组成，LCDR3由SEQ ID NO：25的序列组成，LCDR2由序列：A12的序列组成，并且LCDR1由SEQ ID NO：61的序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个如表2中所述的CDR序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1252_P01_C08的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P01_E07的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P02_G04的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P02_B07的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1251_P02_C05的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1139_P01_E04的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P02_F07的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P01_G06的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1245_P01_G09的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1138_P01_B09的一个或多个(诸如全部)CDR序列。在替代实施方案中，抗体或其片段包含如表2中所述的克隆1251_P02_G10的一个或多个(诸如全部)CDR序列。
Figure BDA0004105319660000711
合适地，上文列举的VH区和VL区各自包含四个框架区(FR1-FR4)。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)，所述框架区包含与SEQ IDNO：62-85中的任一个中的框架区具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)，所述框架区包含与SEQ ID NO：62-85中的任一个中的框架区具有至少90％，诸如至少95％、97％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)，所述框架区包含SEQ ID NO：62-85中的任一个的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)，所述框架区由SEQ ID NO：62-85中的任一个的序列组成。
本文所述的抗体可以由它们的完整轻链和/或重链可变序列定义。在一个实施方案中，抗体或其片段包含与SEQ ID NO：62-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段由与SEQ ID NO：62-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含与SEQ ID NO：62-73中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由与SEQ ID NO：62-73中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，VH区包含与SEQ ID NO：62、63、64、65或66，诸如62、63、64或65，特别是62、63或64中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VH区由与SEQ ID NO：62、63、64、65或66，诸如62、63、64或65，特别是62、63或64中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，VH区包含与SEQ IDNO：68、69、70、71、72或73，诸如68、69、70或71中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VH区由与SEQ ID NO：68、69、70、71、72或73，诸如68、69、70或71中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含与SEQ ID NO：74-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由与SEQ ID NO：74-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，VL区包含与SEQ ID NO：74、75、76、77或78，诸如74、75、76或77，特别是74、75或76中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VL区由与SEQ ID NO：74、75、76、77或78，诸如74、75、76或77，特别是74、75或76中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，VL区包含与SEQ IDNO：80、81、82、83、84或85，诸如80、81、82或83中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VL区由与SEQ ID NO：80、81、82、83、84或85，诸如80、81、82或83中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，其包含与SEQ ID NO：62-73中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和VL区，其包含与SEQ ID NO：74-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，其由与SEQ ID NO：62-73中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和VL区，其由与SEQ ID NO：74-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列(1252_P01_C08)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ IDNO：62的氨基酸序列(1245_P01_E07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列(1245_P02_G04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列(1139_P01_E04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列(1245_P02_F07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列(1245_P01_G06)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列(1245_P01_G09)。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：63的氨基酸序列(1252_P01_C08)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ IDNO：62的氨基酸序列(1245_P01_E07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：64的氨基酸序列(1245_P02_G04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：68的氨基酸序列(1139P01_E04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：69的氨基酸序列(1245_P02_F07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：70的氨基酸序列(1245_P01_G06)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VH区，所述VH区由SEQ ID NO：71的氨基酸序列(1245_P01_G09)组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列(1252_P01_C08)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ IDNO：74的氨基酸序列(1245_P01_E07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列(1245_P02_G04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列(1139_P01_E04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列(1245_P02F07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列(1245_P01_G06)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列(1245_P01_G09)。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：75的氨基酸序列(1252_P01_C08)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ IDNO：74的氨基酸序列(1245_P01_E07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：76的氨基酸序列(1245_P02_G04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：80的氨基酸序列(1139_P01_E04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：81的氨基酸序列(1245_P02_F07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：82的氨基酸序列(1245_P01_G06)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含VL区，所述VL区由SEQ ID NO：83的氨基酸序列(1245_P01_G09)组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列(1252_P01_C08)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列(1252_P01_C08)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列(1245_P01_E07)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列(1245_P01_E07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列(1245_P02_G04)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列(1245_P02_G04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列(1139_P01_E04)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列(1139_P01_E04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列(1245_P02_F07)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列(1245_P02_F07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列(1245_P01_G06)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列(1245_P01_G06)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列(1245_P01_G06)；和VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列(1245_P01_G09)。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：63的氨基酸序列(1252_P01_C08)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：75的氨基酸序列(1252_P01_C08)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEq ID NO：62的氨基酸序列(1245_P01_E07)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：74的氨基酸序列(1245_P01_E07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：64的氨基酸序列(1245_P02_G04)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：76的氨基酸序列(1245_P02_G04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：68的氨基酸序列(1139_P01_E04)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：80的氨基酸序列(1139_P01_E04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：69的氨基酸序列(1245_P02_F07)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：81的氨基酸序列(1245_P02_F07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：70的氨基酸序列(1245_P01_G06)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID NO：82的氨基酸序列(1245_P01_G06)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段包含：VH区，所述VH区由SEQ ID NO：71的氨基酸序列(1245_P01_G09)组成；和VL区，所述VL区由SEQ ID No：83的氨基酸序列(1245_P01_G09)组成。
对于同时包含VH区和VL区的片段，这些VH区和VL区可以共价缔合(例如经由二硫键或接头)或非共价缔合。本文所述的抗体片段可包含scFv，即包含通过接头联接的VH区和VL区的片段。在一个实施方案中，VH区和VL区通过(例如合成的)多肽接头联接。多肽接头可以包含(Gly4Ser)n接头，其中n＝1至8，例如2、3、4、5或7。多肽接头可以包含[(Gly4Ser)n(Gly3AlaSer)m]p接头，其中n＝1至8，例如2、3、4、5或7，m＝1至8，例如0、1、2或3，以及p＝1至8，例如1、2或3。在另一个实施方案中，接头包含SEQ ID NO：98。在另一个实施方案中，接头由SEQ ID NO：98组成。
在一个实施方案中，抗体或其片段包含与SEQ ID NO：86-97中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：86-97中的任一个的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列(1252_P01_C08)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列(1245_P01_E07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列(1245_P02_G04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列(1139_P01_E04)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列(1245_P02_F07)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列(1245_P01_G06)。在替代实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列(1245_P01_G09)。
在一个实施方案中，抗体或其片段由与SEQ ID NO：86-97中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：86-97中的任一个的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：87的氨基酸序列(1252_P01_C08)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：86的氨基酸序列(1245_P01_E07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：88的氨基酸序列(1245_P02_G04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：92的氨基酸序列(1139_P01_E04)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：93的氨基酸序列(1245_P02_F07)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：94的氨基酸序列(1245_P01_G06)组成。在替代实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：95的氨基酸序列(1245_P01_G09)组成。
本领域技术人员将理解，scFv构建体可以被设计和制成包括N末端和C末端修饰以帮助翻译、纯化和检测。例如，在scFv序列的N末端处，额外的甲硫氨酸和/或丙氨酸氨基酸残基可以包括在规范VH序列(例如，起始QVQ或EVQ)之前。在C末端(即，按照IMGT定义结束的规范VL结构域序列的C末端)，可以包括额外的序列，诸如(i)恒定结构域的一部分序列，和/或(ii)额外的包括标签的合成序列(诸如His标签和Flag标签)，以帮助纯化和检测。在一个实施方案中，将SEQ ID NO：124添加到SEQ ID NO：86、88-90、92-97中的任一个的C末端。在一个实施方案中，将SEQ ID NO：125添加到SEQ ID NO：86、88-90、92-97中的任一个的C末端。在一个实施方案中，将SEQ ID NO：126添加到SEQ ID NO：87或91中的任一个的C末端。在一个实施方案中，将SEQ ID NO：127添加到SEQ ID NO：87或91中的任一个的C末端。很好理解，所述scFv N末端或C末端序列是任选的，并且如果采用替代的scFv设计、翻译、纯化或检测策略，则可以去除、修改或替换。
如本文所述，该抗体可以呈任何格式。在一个优选实施方案中，抗体呈IgG1格式。因此，在一个实施方案中，抗体或其片段包含与SEQ ID NO：111-122中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：111-122中的任一个的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：111-116，诸如SEQ ID NO：111-113和116的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：117-122，诸如SEQ ID NO：117-120的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含SEQ ID NO：111、112、116-120，诸如SEQ ID NO：111、112或116，或SEQ ID NO：117-120的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体或其片段由与SEQ ID NO：111-122中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：111-122中的任一个的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：111-116，诸如SEQ ID NO：111-113和116的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：117-122，诸如SEQ ID NO：117-120的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由SEQ ID NO：111、112、116-120，诸如SEQ ID NO：111、112或116，或SEQ ID NO：117-120的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体与如本文所定义的抗体或片段结合相同或基本上相同的表位，或与如本文所定义的抗体或片段竞争。通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗Vδ1抗体结合相同的表位，或者与参考抗Vδ1抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗Vδ1抗体结合相同的表位，使所述参考抗体在饱和条件下与Vδ1蛋白或肽结合。接下来，评估试验抗体与Vδ1链结合的能力。如果测试抗体在与参考抗Vδ1抗体饱和结合后能够与Vδ1结合，则可以断定测试抗体与参考抗Vδ1抗体结合至不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗Vδ1抗体饱和结合后不能与Vδ1链结合，则测试抗体可以与和参考抗Vδ1抗体所结合的表位相同的表位结合。
本发明还包括与如本文限定的抗体或其片段或具有本文所述的任何示例性抗体的CDR序列的抗体竞争与Vδ1的结合的抗Vδ1抗体。例如，可以用抗体执行竞争性测定以确定哪些蛋白质、抗体和其他拮抗剂与抗体竞争与Vδ1链的结合以及/或者共享表位。这些测定是本领域技术人员容易知道的；它们评价拮抗剂或配体之间对蛋白质上有限数目的结合位点(例如，Vδ1)的竞争。抗体(或其片段)在竞争前或竞争后固化或不溶化，并且结合Vδ1链的样品与未结合的样品分离，例如，通过倾析(其中抗体预不溶化)或通过离心(其中抗体在竞争反应后沉淀)。此外，竞争性结合可以通过功能是否因抗体与蛋白质的结合或不结合而改变，例如，抗体分子是否抑制或加强例如标记的酶活性来确定。如本领域已知和本文所述，可以使用ELISA和其他功能测定。
如果两种抗体中每一种抗体均竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与靶抗原的结合，则这两种抗体与相同或重叠表位结合。也就是说，一种抗体的1、5、10、20或100倍过量将另一种抗体的结合抑制了至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定中测量的。或者，如果靶抗原中减少或消除一种抗体结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。
然后可以进行额外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的试验抗体结合的缺乏事实上是否是由于与参考抗体结合相同的表位，或者空间阻断(或另一种现象)是否是造成缺乏观察到的结合的原因。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其它定量或定性抗体结合测定来执行此类实验。
在一些实施方案中，抗体或其片段通过改变与Asn 297(Kabat编号方案)连接的糖而含有修饰的效应子功能。在另一个所述修饰中，Asn 297未被岩藻糖基化或表现出减少的岩藻糖基化(即，去岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)。岩藻糖基化包括将岩藻糖添加至分子，例如将岩藻糖附接至N-聚糖、O-聚糖和糖脂。因此，在去岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不附接至恒定区的碳水化合物链。可以修饰抗体以防止或抑制抗体的岩藻糖基化。通常，糖基化修饰涉及通过靶向工程或通过靶向或偶然的宿主或克隆选择，在含有替代糖基化加工能力的宿主细胞中表达所述抗体或其片段。这些和其他效应子修饰在最近的综述中进一步讨论，诸如Xinhua Wang等人(2018)Protein&Cell 9：63-73和Pereira等人(2018)mAbs 10(5)：693-711，并且所述文献特此并入。
抗体序列修饰
可以使用已知方法修饰抗体及其片段。本领域技术人员可以容易地掺入对本文所述的抗体分子的序列修饰。以下实例是非限制性的。
在从噬菌体文库中发现抗体和恢复序列期间，可以通过亚克隆将所需的抗体可变结构域重新格式化为全长IgG。为了加速所述过程，常常使用限制性酶转移可变结构域。这些独特的限制位点可以引入额外的/替代性氨基酸且远离规范序列(此类规范序列可以在例如国际免疫遗传学[international ImMunoGeneTics，IMGT]信息系统(参见http://www.imgt.org)中找到)。这些可以作为κ或λ轻链序列修饰引入。
κ轻链修饰
可变κ轻链可变序列可以使用限制位点(例如Nhe1-Not1)在重新格式化为全长IgG期间克隆。更具体地说，在κ轻链N端，引入额外的Ala-Ser序列以支持克隆。优选地，然后在进一步开发期间去除此额外的AS序列以生成规范的N端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述的含κ轻链的抗体在它们的N末端不含有AS序列，即SEQ ID NO：74、76-78和80-85不包含初始AS序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO：74和76-78不包含初始AS序列。应理解，此实施方案也适用于本文中包括的含有这个序列的其它序列(例如SEQ ID NO：86、88-90和92-97)。
可以制作额外的氨基酸变化以支持克隆。例如，对于本文所述的抗体，在κ轻链可变结构域/恒定结构域边界处引入了缬氨酸到丙氨酸的变化以支持克隆。这导致了κ恒定结构域修饰。具体地，这导致以RTAAAPS(从NotI限制位点)开始的恒定结构域。优选地，此序列可以在进一步开发期间进行修饰，以生成以RTVAAPS开始的规范κ轻链恒定区。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有κ轻链的抗体含有以序列RTV开始的恒定结构域。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO：111-114和117－122的序列RTAAAPS被序列RTVAAPS替换。
λ轻链修饰
与上面的κ实例类似，λ轻链可变结构域也可以通过引入限制位点(例如Nhe1-Not1)在重新格式化为全长IgG期间克隆。更具体地说，在λ轻链N端，可以引入额外的Ala-Ser序列以支持克隆。优选地，然后在进一步开发期间去除此额外的AS序列以生成规范的N端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有λ轻链的抗体在它们的N末端不含有AS序列，即SEQ ID NO：75和79不包含初始AS序列。应理解，此实施方案也适用于本文中包括的含有这个序列的其它序列(例如SEQ ID NO：87、91、115和116)。在一个实施方案中，SEQ IDNO：75不含有初始的六个残基，即去除了ASSYEL序列。
作为另一个实例，对于本文所述的抗体，在λ轻链可变结构域/恒定结构域边界处引入了赖氨酸到丙氨酸的变化以支持克隆。这导致了λ恒定结构域修饰。具体地，这导致以GQPAAAPS(从NotI限制位点)开始的恒定结构域。优选地，此序列可以在进一步开发期间进行修饰，以生成以GQPKAAPS开始的规范λ轻链恒定区。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有λ轻链的抗体含有以序列GQPK开始的恒定结构域。因此，在一个实施方案中，SEQ IDNO：115或116的序列GQPAAAPS被序列GQPKAAPS替换。
重链修饰
通常，人可变重链序列以碱性谷氨酰胺(Q)或酸性谷氨酸(E)开始。然而，已知这两种序列都转化为酸性氨基酸残基焦谷氨酸(pE)。Q到pE的转化导致抗体的电荷变化，而E到pE的转化不改变抗体的电荷。因此，为了避免随时间推移的可变电荷变化，一种选择是首先将起始重链序列从Q修饰为E。因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体的重链在N末端含有Q到E的修饰。特别地，SEQ ID NO：62、64和/或67-71的初始残基可以从Q到E修饰。应理解，此实施方案也适用于本文中包括的含有这个序列的其它序列(例如SEQ ID NO：86、88、91-97和111、112、115、117-120)。
此外，IgG1恒定结构域的C末端以PGK结束。然而，末端碱性赖氨酸(K)通常在表达期间被切割(例如在CHO细胞中)。这转而通过C端赖氨酸残基的不同损失导致抗体的电荷变化。因此，一种选择是首先去除赖氨酸，从而产生以PG结束的统一且一致的重链C末端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体的重链的末端K从所述重链的C末端被移除。具体而言，本发明的抗体可以包含SEQ IDNO：111-122中的任一个，其中末端赖氨酸残基已被去除。
任选的/同种异型修饰
在抗体发现期间，可以采用特定的人同种异型。任选地，抗体可以在开发期间转换为不同的人同种异型。作为非限制性实例，对于κ链，存在命名为Km1、Km1，2和Km3的三种人同种异型，它们限定了三个Km等位基因(使用同种异型编号)：Km1与缬氨酸153(IMGTV45.1)和亮氨酸191(IMGT L101)相关；Km1，2与丙氨酸153(IMGT A45.1)和亮氨酸191(IMGTL101)相关；且Km3与丙氨酸153(IMGT A45.1)和缬氨酸191(IMGT V101)相关。任选地，因此可以通过标准克隆方法将序列从一种同种异型修饰为另一种同种异型。例如，L191V(IMGTL101V)变化会将Km1，2同种异型转换为Km3同种异型。对于有关此类同种异型的进一步参考，参见Jefferis和Lefranc(2009)MAbs 1(4)：332-8，其以引用方式并入本文。
因此在一个实施方案中，本文所述的抗体含有源自相同基因的另一种人同种异型的氨基酸取代。在另一个实施方案中，抗体含有对κ链的L191V(IMGT L101V)取代以将c-结构域从km1，2转化为km3同种异型。
抗体结合
抗体或其片段可以以如通过表面等离子体共振测量的小于1.5x10-7M(即，150nM)的结合亲和力(KD)与γδTCR的Vδ1链结合。在一个优选实施方案中，KD小于1.5x10-7M(即，150nM)。在另一个实施方案中，KD为1.3x10-7M(即130nM)或更小，诸如1.0x10-7M(即100nM)或更小。在又一个实施方案中，KD小于5.0x10-8M(即，50nM)，诸如小于4.0x10-8M(即，40nM)、小于3.0x10-8M(即，30nM)或小于2.0x10-8M(即，20nM)。例如，根据一方面，提供了一种人抗Vδ1抗体，其以如通过表面等离子体共振测量的小于1.5x10-7M(即150nM)的结合亲和力(KD)与γδTCR的Vδ1链结合。
在一个实施方案中，抗体或其片段以如通过表面等离子体共振测量的小于4.0x10-8M(即40nM)、小于3.0x10-8M(即30nM)或小于2.0x10-8M(即20nM)的结合亲和力(KD)与γδTCR的Vδ1链结合。
本文所述的抗体的结合亲和力分析如PCT申请号PCT/GB2020/051956的实施例1和5所述进行，所述申请以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，抗体或其片段的结合亲和力是通过将所述抗体或其片段直接或间接(例如通过用抗人IgG Fc捕获)涂覆到传感器(例如胺高容量芯片或等效物)的表面上来确定的，其中被所述抗体或其片段结合的靶标(即，γδTCR的Vδ1链)流过芯片以检测结合。合适地，在25℃下在PBS+0.02％Tween 20运行缓冲液中以30微升/分钟使用MASS-2仪器(其也可以称为Sierra SPR-32)。
本文描述了可用于限定抗体功能的其他测定。例如，本文所述的抗体或其片段可以通过例如测量抗体结合后的γδTCR的下调的γδTCR接合(engagement)来评估。可以例如通过流式细胞术测量在施加抗体或其片段(任选地被呈递在细胞表面上)后的γδTCR的表面表达。本文所述的抗体或其片段也可以通过测量γδT细胞脱粒来评估。例如，可以在将抗体或其片段(任选地被呈递在细胞表面上)施加于γδT细胞后例如通过流式细胞术来测量CD107a(细胞脱粒的标记)的表达。本文所述的抗体或其片段也可以通过测量γδT细胞杀伤活性(以测试抗体是否对γδT细胞的杀伤活性有影响)来评估。例如，可以在抗体或其片段(任选地被呈递在细胞表面上)的存在下将靶细胞与γδT细胞一起孵育。孵育后，可以用细胞存活力染料对培养物进行染色，以区分活靶细胞和死靶细胞。然后可以例如通过流式细胞术测量死细胞的比例。
如本文所述，测定中使用的抗体或其片段可以被呈递在表面，例如细胞(诸如包含Fc受体的细胞)的表面上。例如，该抗体或其片段可以被呈递在THP-1细胞，诸如TIB-202TM细胞(可从美国模式培养物保藏中心(ATCC)获得)的表面上。或者，该抗体或其片段可以在测定中直接使用。
在此类功能测定中，可以通过计算半数最大浓度(也称为“EC50”或“50％时的有效浓度”)来测量输出。术语“IC50”是指抑制浓度。EC50和IC50都可以使用本领域已知的方法，诸如流式细胞术方法测量。为免生疑问，本申请中的EC50值是使用呈IgG1格式的抗体提供的。此类值可以很容易地如下基于该抗体格式的分子量转换为等效值：
(μg/m1)/(以kDa计的MW)＝μM
抗体(或片段)结合后γδTCR下调的EC50可以小于0.50μg/ml，诸如小于0.40μg/ml、0.30μg/ml、0.20μg/ml、0.15μg/ml、0.10μg/ml或0.05μg/ml。在一个优选实施方案中，抗体(或片段)结合后γδTCR下调的EC50小于0.10μg/ml。具体而言，抗体(或片段)结合后γδTCR下调的EC50可以小于0.06μg/ml，诸如小于0.05μg/ml、0.04μg/ml或0.03μg/ml。具体而言，所述EC50值是当抗体以IgG1格式测量时的值。例如，可以使用流式细胞术测量EC50γδTCR下调值(例如，如实施例6的测定所述)。
抗体(或片段)结合后γδT细胞脱粒的EC50可以小于0.050μg/ml，诸如小于0.040μg/ml、0.030μg/ml、0.020μg/ml、0.015μg/ml、0.010μg/ml或0.008μg/ml。具体而言，抗体(或片段)结合后γδT细胞脱粒的EC50可以小于0.005μg/ml，诸如小于0.002μg/ml。在一个优选实施方案中，抗体(或片段)结合后γδT细胞脱粒的EC50小于0.007μg/ml。具体而言，所述EC50值是当抗体以IgG1格式被测量时的值。例如，γδT细胞脱粒EC50值可以通过使用流式细胞术检测CD107a表达(即细胞脱粒的标记)来测量(例如，如实施例7的测定所述)。在一个实施方案中，CD107a表达是使用抗CD107a抗体，诸如抗人CD107a BV421(克隆H4A3)(BDBiosciences)测量的。
抗体(或片段)结合后γδT细胞杀伤的EC50可以小于0.50μg/ml，诸如小于0.40μg/ml、0.30μg/ml、0.20μg/ml、0.15μg/ml、0.10μg/ml或0.07μg/ml。在一个优选实施方案中，抗体(或片段)结合后γδT细胞杀伤的EC50小于0.10μg/ml。具体而言，抗体(或片段)结合后γδT细胞杀伤的EC50可以小于0.060μg/ml，诸如小于0.055μg/ml，特别小于0.020μg/ml或0.010μg/ml。具体而言，所述EC50值是当抗体以IgG1格式被测量时的值。例如，EC50γδT细胞杀伤值可以通过在抗体、γδ_T细胞和靶细胞孵育后使用流式细胞术检测死细胞的比例(即使用细胞存活力染料)来测量(例如，如实施例8的测定所述)。在一个实施方案中，使用细胞存活力染料，即存活力染料eFluorTM 520(ThermoFisher)测量靶细胞的死亡。
在这些方面中描述的测定中，该抗体或其片段可以被呈递在细胞，诸如THP-1细胞(例如TIB-202TM(ATCC))的表面上。THP-1细胞任选地用染料，诸如CellTrackerTM OrangeCMTMR(ThermoFisher)标记。
本文所述的抗体的功能分析如WO2021032961(PCT申请号PCT/GB2020/051956)的实施例1、6、7和8所述进行，所述申请以引用方式并入本文。表3中提供了本文所述抗体的结合和功能性质的总结。
表3.抗Vδ1抗体的结合和功能性质的总结
Figure BDA0004105319660000861
Figure BDA0004105319660000871
*1252_P02_C05的结合未达到饱和，因此数据是外推的；N/D：无法确定；N/D*：无法确定，滴定曲线未达到平台；N/D**：杀伤曲线降低，EC50未确定。
抗体(或片段)可以使用例如Green和Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2012)第4版Cold Spring Harbour Laboratory Press中公开的技术获得和操纵。
可以使用杂交瘤技术通过将产生抗体的特定B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合来产生单克隆抗体，所述骨髓瘤细胞是因其在组织培养中生长的能力和不存在抗体链合成而被选择。
针对确定的抗原的单克隆抗体可以例如通过如下方式获得：
a)用永生细胞且优选用骨髓瘤细胞使从先前用确定的抗原免疫的动物的外周血中获得的淋巴细胞永生化，以便形成杂交瘤，
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)并回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。
或者，不需要使用杂交瘤细胞。可以经由常规实践，例如使用本领域已知的噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术，从合适的抗体文库中分离出能够与如本文所述的靶抗原结合的抗体。因此，单克隆抗体可以例如通过包括以下步骤的工艺获得：
a)将从淋巴细胞，尤其是动物(适当地先前用确定的抗原免疫)的外周血淋巴细胞获得的DNA或cDNA序列克隆到载体，尤其是噬菌体且更特别是丝状噬菌体中，
b)在允许抗体产生的条件下用上述载体转化原核细胞，
c)通过使抗体经受抗原亲和力选择来对抗体进行选择，
d)回收具有期望特异性的抗体。
多核苷酸和表达载体
还提供了编码用于本发明的方法的抗Vδ1抗体或片段的多核苷酸。在一个实施方案中，抗Vδ1抗体或片段由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：99-110具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，抗Vδ1抗体或片段由包含SEQ ID NO：99-110的VH区的表达载体编码。在另一个实施方案中，抗Vδ1抗体或片段由包含SEQ ID NO：99-110的VL区的表达载体编码。在另一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：99-110或由SEQ ID NO：99-110组成。在另一个实施方案中，提供了包含所述多核苷酸的eDNA。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：99-110具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-110的VH区。在另一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99—110的VL区。在另一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：99—110或由SEQ ID NO：99-110组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cDNA。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：99-101或105-108具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-101或105-108的VH区。在另一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-101或105-108的VL区。在另一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：99-101或105-108或由SEQ ID NO：99-101或105-108组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cDNA。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：99-101具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-101的VH区。在另一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-101的VL区。在另一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：99-101或由SEQ ID NO：99-101组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cDNA。
在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的SEQ ID NO：99-110的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的SEQ ID NO：99-101或105-108的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的SEQ ID NO：99-101的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。
在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4的SEQ ID NO：99-110的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4的SEQ ID NO：99-101或105-108的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含以下或由以下组成：与编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4的SEQ ID NO：99-101的任一部分具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性的序列。
本发明的多核苷酸和表达载体也可以参考所编码的氨基酸序列进行描述。因此，在一个实施方案中，多核苷酸包含编码SEQ ID NO：62至85中任一个的氨基酸序列的序列或者由编码SEQ ID NO：62至85中任一个的氨基酸序列的序列组成。在一个实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID NO：62至73中任一个的氨基酸序列的序列。在另一个实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID NO：74至85中任一个的氨基酸序列的序列。
为了表达抗体或其片段，将如本文所述的编码部分或全长轻链和重链的多核苷酸插入到表达载体中，以使得基因操作性地连接至转录和翻译控制序列。因此，在一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-110的VH区，诸如SEQ ID NO：99、100、101、105、106、107或108的VH区。在另一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO：99-110的VL区，诸如SEQ IDNO：99、100、101、105、106、107或108的VL区。
应理解，本文所述的核苷酸序列包含额外的序列，所述序列编码氨基酸残基以帮助翻译、纯化和检测，但是可以根据所使用的表达系统来使用替代序列。例如，SEQ ID NO：99-110的初始(5’端)九个核苷酸和SEQ ID NO：99-100、102-103、105-110的最后(3’端)36个核苷酸、或SEQ ID NO：101和104的最后(3’端)39个核苷酸是任选的序列。如果采用替代设计、翻译、纯化或检测策略，则可以去除、修饰或取代这些任选的序列。
可以给编码多肽的DNA或cDNA制作这样的突变，所述突变对于所述多肽的氨基酸序列沉默的，但是为在特定宿主中的翻译提供了优选密码子。用于在例如大肠埃希氏菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)，以及哺乳动物，特别是人中翻译核酸的优选密码子是已知的。
多肽的突变可以例如通过对编码该多肽的核酸的取代、添加或缺失来实现。对编码该多肽的核酸的取代、添加或缺失可以通过许多方法引入，该方法包括例如易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因重组装、人工基因合成、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连结重组装(SLR)或这些方法的组合。对核酸的修饰、添加或缺失也可以通过包括以下的方法来引入：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射引起的诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、整体诱变、嵌合核酸多聚体创建和/或它们的组合。
具体而言，可以使用人工基因合成。编码本文所述的多肽的基因可以通过例如固相DNA合成法合成产生。整个基因可以从头合成，不需要前体模板DNA。为了获得所需的寡核苷酸，将构建块(building block)按产物序列所需的顺序依序偶联到不断增长的寡核苷酸链上。在链组装完成后，将产物从固相释放到溶液中，进行脱保护并进行收集。产物可以通过高效液相色谱法(HPLC)分离，以获得高纯度的所需寡核苷酸。
表达载体包括例如质粒、逆转录病毒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)来源的附加体。将多核苷酸连结到载体中，以使得该载体中的转录和翻译控制序列发挥它们的调控多核苷酸的转录和翻译的预期功能。表达和/或控制序列可以包括启动子、增强子、转录终止子、编码序列5′的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号和终止密码子。表达载体和表达控制序列被选择为与所用表达宿主细胞相容。SEQ ID NO：99-110包含编码本发明的单链可变片段的多核苷酸，其包含通过合成接头(例如编码SEQ ID NO：98)联接的VH区和VL区。应理解，本发明的多核苷酸或表达载体可以包含VH区、VL区或两者(任选地包括接头)。因此，可以将编码VH区和VL区的多核苷酸插入到单独的载体中，或者将编码这两个区的序列插入到相同的表达载体中。通过标准方法将一种或多种多核苷酸插入到表达载体中(例如，连结多核苷酸和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则进行平端连接)。
如本文所述，方便的载体是这样一种载体，其编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，具有工程化的适当限制性位点，以便可以轻松插入和表达任何VH或VL序列。表达载体还可以编码促进抗体(或其片段)从宿主细胞分泌的信号肽。可以将多核苷酸克隆到载体中，使得信号肽框内连接至抗体的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
宿主细胞可以包含编码抗体或其片段的轻链的第一载体，和编码抗体或其片段的重链的第二载体。或者，重链和轻链都在被引入到细胞中的同一表达载体上编码。在一个实施方案中，多核苷酸或表达载体编码与抗体或其片段融合的膜锚或跨膜结构域，其中抗体或其片段被呈递在宿主细胞的细胞外表面上。
可以通过任何已知的用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法进行转化。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域众所周知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封、基因枪注射和DNA直接显微注射到细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体引入到哺乳动物细胞中。
可用作宿主进行表达的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括许多可从美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的永生化细胞系。这些细胞系尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系(诸如Sf9细胞)、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。可以使用本领域已知的方法在大肠埃希氏菌中分离和表达抗体的抗原结合片段，诸如scFv和Fv片段。
通过培养宿主细胞一段足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
本发明的抗体(或片段)可以使用例如Green和Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2012)第4版Cold Spring Harbour Laboratory Press中公开的技术获得和操纵。
可以使用杂交瘤技术通过将产生抗体的特定B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合来产生单克隆抗体，该骨髓瘤细胞是因其在组织培养中生长的能力和不存在抗体链合成而被选择。
针对确定的抗原的单克隆抗体可以例如通过如下方式获得：
a)用永生细胞且优选用骨髓瘤细胞使从先前用确定的抗原免疫的动物的外周血中获得的淋巴细胞永生化，以便形成杂交瘤，
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)并回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。
或者，不需要使用杂交瘤细胞。可以经由常规实践，例如使用本领域已知的噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术，从合适的抗体文库中分离出能够与如本文所述的靶抗原结合的抗体。因此，单克隆抗体可以例如通过包括以下步骤的工艺获得：
a)将从淋巴细胞，尤其是动物(适当地先前用确定的抗原免疫)的外周血淋巴细胞获得的DNA或cDNA序列克隆到载体，尤其是噬菌体且更特别是丝状噬菌体中，
b)在允许抗体产生的条件下用上述载体转化原核细胞，
c)通过使抗体经受抗原亲和力选择来对抗体进行选择，
d)回收具有期望特异性的抗体。
治疗方法
本发明的组合物特别可用于临床应用。除了组合物中存在的三种免疫细胞类型的抗癌和健康细胞保护活性之外，NK细胞还非常有效地对抗由病毒、细菌或真菌引起的感染性疾病。Vδ1 T细胞具有作为识别和保护免受CMV再激活的基础的确定记录，这是免疫受损患者(如移植患者或预先治疗的癌症患者)的一个重要问题。CMV激活的Vδ1实际上显著降低了移植后使用广泛免疫抑制剂的患者的继发性恶性肿瘤的风险。
Vδ2 T细胞的独特之处在于它们以非常高的亲和力识别非甲羟戊酸途径的中间体，即HMBPP，它专供原核生物和一些真核生物使用。这些细胞在识别和对抗分枝杆菌感染方面发挥至关重要的作用，并且可以占活动性感染患者血液中所有T细胞的超过50％。Vδ2也识别原生动物，并极大地促进针对疟疾的免疫响应。
因此，本文所述的组合物将提供针对癌症疗法或移植诱导的并发症的广泛保护，诸如病毒再激活和细菌感染，所述并发症可以导致免疫疗法中的死亡。一种细胞类型一次无法覆盖的保护。
出于同样的原因，该组合物对于治疗感染性疾病也很有吸引力。事实上，NK细胞已被试用于治疗冠状病毒(COVID-19)。因此，组合物可用于治疗COVID、CMV、HIV、疟疾和任何分枝杆菌感染。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的用于疗法的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法的组合物。
通过本发明的方法获得的细胞群和组合物也可用于疗法中。因此，根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的用作药物的细胞群。本文对“用于”作为药物或用于疗法的细胞群的提及仅限于向受试者施用细胞群。
在一个实施方案中，细胞群用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病。在另一个实施方案中，细胞群用于治疗癌症。
根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含如本文所定义的用作药物的细胞群。在一个实施方案中，包含细胞群的药物组合物用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病。在另一个实施方案中，包含细胞群的药物组合物用于治疗癌症。
根据本发明的另一方面，提供了调节有需要的受试者中的免疫响应的方法，其包括施用治疗有效量的如本文所定义的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的γδT的至少40％表达CD56。应理解，上文针对组合物描述的实施方案可同样应用于本发明的该方面。
根据本发明的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含细胞的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的细胞群用于制造药物，例如用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的药物的用途。
过继T细胞疗法
通过本发明的方法获得的组合物可以用作药物，例如用于过继T细胞疗法。这涉及将免疫细胞转移到患者体内。疗法可以是自体的，即免疫细胞可以转移回获得它们的同一患者体内，或者疗法可以是同种异体的，即一个人的免疫细胞可能会转移到不同的病人体内。在涉及同种异体转移的情况下，组合物可以基本上不含αβT细胞。例如，可以使用本领域已知的任何合适的方式(例如，通过例如使用磁珠的负选择)从组合物中耗竭αβT细胞，例如，在扩增之后。治疗方法可以包括：提供从供体个体获得的样品；如本文所述培养从样品获得的免疫细胞，例如以产生扩增的群；以及向受体个体施用培养的免疫细胞。
待治疗的患者或受试者优选是人类癌症患者(例如，正在接受实体瘤治疗的人类癌症患者)或病毒感染患者(例如，CMV感染或HIV感染患者)。在一些情况下，患者患有实体瘤和/或正在接受实体瘤治疗。因为它们通常驻留在非造血组织中，组织驻留的Vδ1 T细胞也比它们的全身血液驻留对应物更有可能归巢并保留在肿瘤块内，并且这些细胞的过继转移可能更有效靶向实体瘤和潜在的其他非造血组织相关免疫病理学。
由于γδT细胞和NK细胞不受MHC限制，因此它们不识别它们作为外来物转移到其中的宿主，这意味着它们不太可能引起移植物抗宿主病。这意味着它们可以“现成”使用并且转移到任何受体中，例如，用于同种异体过继T细胞疗法。
通过本文所述的方法获得的不受MHC限制的淋巴细胞可以表达NKG2D并且对NKG2D配体(例如MICA)作出响应，所述NKG2D配体与恶性肿瘤密切相关。它们还可以在不存在任何激活的情况下表达细胞毒性特征，并且因此可能有效杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，治疗患有肿瘤的个体的方法可以包括；提供从供体个体获得的所述肿瘤的样品，如上所述培养从样品获得的不受MHC限制的淋巴细胞，和；向患有肿瘤的个体施用不受MHC限制的淋巴细胞群。
在一些情况下，治疗有效量的通过上述方法中任一种获得的不受MHC限制的淋巴细胞以治疗有效量向受试者施用(例如，用于治疗癌症，例如用于治疗实体瘤)。在一些情况下，治疗有效量的不受MHC限制的淋巴细胞少于每剂10x1012个细胞(例如，少于每剂9x1012个细胞、少于每剂8x1012个细胞、少于每剂7x1012个细胞、少于每剂6x1012个细胞、少于每剂5x1012个细胞、少于每剂4x1012个细胞、少于每剂3x1012个细胞、少于每剂2x1012个细胞、少于每剂1x1012个细胞、少于每剂9x1011个细胞、少于每剂8x1011个细胞、少于每剂7x1011个细胞、少于每剂6x1011个细胞、少于每剂5x1011个细胞、少于每剂4x1011个细胞、少于每剂3x101个细胞、少于每剂2x1011个细胞、少于每剂1x1011个细胞、少于每剂9x1010个细胞、少于每剂7.5x1010个细胞、少于每剂5x1010个细胞、少于每剂2.5x1010个细胞、少于每剂1x1010个细胞、少于每剂7.5x109个细胞、少于每剂5x109个细胞、少于每剂2.5x109个细胞、少于每剂1x109个细胞、少于每剂7.5x108个细胞、少于每剂5x108个细胞、少于每剂2.5x108个细胞、少于每剂1x108个细胞、少于每剂7.5x107个细胞、少于每剂5x107个细胞、少于每剂2.5x107个细胞、少于每剂1x107个细胞、少于每剂7.5x106个细胞、少于每剂5x106个细胞、少于每剂2.5x106个细胞、少于每剂1x106个细胞、少于每剂7.5x105个细胞、少于每剂5x105个细胞、少于每剂2.5x105个细胞或少于每剂1x105个细胞)。
在一些实施方案下，治疗有效量的不受MHC限制的淋巴细胞在治疗过程期间少于10x1012个细胞(例如，在治疗过程期间少于9x1012个细胞、少于8x1012个细胞、少于7x1012个细胞、少于6x1012个细胞、少于5x1012个细胞、少于4x1012个细胞、少于3x1012个细胞、少于2x1012个细胞、少于1x1012个细胞、少于9x1011个细胞、少于8x1011个细胞、少于7x1011个细胞、少于6x1011个细胞、少于5x1011个细胞、少于4x1011个细胞、少于3x1011个细胞、少于2x1011个细胞、少于1x1011个细胞、少于9x1010个细胞、少于7.5x1010个细胞、少于5x1010个细胞、少于2.5x1010个细胞、少于1x1010个细胞、少于7.5x109个细胞、少于5x109个细胞、少于2.5x109个细胞、少于1x109个细胞、少于7.5x108个细胞、少于5x108个细胞、少于2.5x108个细胞、少于1x108个细胞、少于7.5x107个细胞、少于5x107个细胞、少于2.5x107个细胞、少于1x107个细胞、少于7.5x106个细胞、少于5x106个细胞、少于2.5x106个细胞、少于1x106个细胞、少于7.5x105个细胞、少于5x105个细胞、少于2.5x105个细胞或少于1x105个细胞)。
在一些实施方案中，如本文所述的不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108细胞/千克。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括至多约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108细胞/千克。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括约1.1x106-1.8x107细胞/千克。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括至少约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，不受MHC限制的淋巴细胞的剂量包括至多约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。
在一个实施方案中，向受试者施用104至106个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重。在一个实施方案中，受试者接受不受MHC限制的淋巴细胞群的初始施用(例如，104至106个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重的初始施用，例如，104至105个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重)和不受MHC限制的淋巴细胞群的一次或多次(例如，2、3、4或5次)后续施用(例如，104至106个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重的一次或多次后续施用，例如，104至105个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重)。在一个实施方案中，一次或多次后续施用在前一次施用后少于15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用，例如，在前一次施用后少于4、3或2天。在一个实施方案中，在至少三次施用不受MHC限制的淋巴细胞群的过程中，受试者接受总共约106个不受MHC限制的淋巴细胞/千克受试者体重，例如，受试者接受1x105个不受MHC限制的淋巴细胞的初始剂量、3x105个不受MHC限制的淋巴细胞的第二剂量和6x105个不受MHC限制的淋巴细胞的第三剂量，并且例如每次施用在前一次施用后的少于4、3或2天。
在一些实施方案中，可以向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。额外的治疗剂可以选自由以下组成的组：免疫治疗剂、细胞毒剂、生长抑制剂、放射治疗剂、抗血管生成剂或其两种或更多种剂的组合。额外的治疗剂可以在施用不受MHC限制的淋巴细胞的同时、之前或之后施用。额外的治疗剂可以是免疫治疗剂，其可以作用于受试者体内(例如，受试者自身的免疫系统)的靶标和/或转移的不受MHC限制的淋巴细胞上的靶标。
组合物的施用可以任何方便的方式进行。本文所述的组合物可以经动脉地、皮下地、皮内地、瘤内地、结节内地、髓内地、肌内地、通过静脉注射或腹膜内地(例如通过皮内注射或皮下注射)向患者施用。不受MHC限制的淋巴细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
基因工程化
通过本发明的方法获得的不受MHC限制的淋巴细胞也可以进行基因工程化以增强治疗性质，诸如例如用于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法。这涉及生成工程化受体(如CAR)以重新编程具有新特异性(例如单克隆抗体的特异性)的T细胞。工程化受体可以使淋巴细胞对恶性细胞具有特异性，并因此可用于癌症免疫疗法。例如，淋巴细胞可以识别表达肿瘤抗原(诸如受试者组织的正常体细胞不表达的肿瘤相关抗原)的癌细胞。因此，CAR修饰的淋巴细胞可用于例如癌症患者的过继T细胞疗法。
应理解，本文描述的所有实施方案都可以应用于本发明的所有方面。
条款
定义本发明及其优选方面的一组条款如下：
1.一种包含自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的经分离的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少40％是CD56亮。
2.一种包含NK细胞和γδT细胞的经分离的组合物，其中组合物中存在的NK细胞的至少50％是CD56亮。
3.一种包含NK细胞和γδT细胞的经分离的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少50％表达CD56。
4.如条款1至3中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少80％包含NK细胞和γδT细胞。
5.如条款1至4中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成。
6.如条款1至5中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少20％是γδT细胞。
7.如条款1至6中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少30％是γδT细胞。
8.如条款1至7中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的少于80％是γδT细胞。
9.如条款1至8中任一项所述的经分离的组合物，其中γδT细胞包含Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞。
10.如条款1至9中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少20％是NK细胞。
11.如条款1至10中任一项所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的至少30％是NK细胞。
12.一种包含细胞的经分离的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
13.如条款12所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的γδT细胞的至少40％表达CD56。
14.如条款12或条款13所述的经分离的组合物，其中组合物中存在的细胞的少于80％是γδT细胞。
15.如条款1至14中任一项所述的经分离的组合物，其中γδT细胞包含Vδ1 T细胞，并且至少15％的所述Vδ1 T细胞表达NKp30。
16.如条款1至15中任一项所述的经分离的组合物，其中γδT细胞包含Vδ1 T细胞，并且少于50％的所述Vδ1 T细胞表达CD27。
17.如条款1至16中任一项所述的经分离的组合物，其中经分离的组合物包含工程化NK细胞和γδT细胞。
18.如条款17所述的经分离的组合物，其中工程化NK细胞和γδT细胞表达嵌合抗原受体。
19.如条款1至18中任一项所述的经分离的组合物，其用于治疗。
20.如条款1至18中任一项所述的经分离的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法。
21.一种扩增不受MHC限制的非γδ+淋巴细胞的方法，其包括在存在白介素-15(IL-15)和不存在白介素-4(IL-4)的情况下，使用抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体或其片段来刺激包含γδT细胞和NK细胞的混合细胞群，并且培养所述混合细胞群。
22.如条款21所述的方法，其包括将混合的细胞群培养至少7天，诸如至少14天。
23.如条款21或22中任一项所述的方法，其中至少50％的扩增的非γδ+不受MHC限制的淋巴细胞是CD56亮。
24.一种制备包含细胞群的组合物的方法，所述细胞群富集不受MHC限制的淋巴细胞，其中所述方法包括：
(1)在不存在IL-4的情况下，在所述培养的第一天，在以下物质的存在下，培养从受试者获得的样品：
(i)抗Vδ1抗体或其片段；和
(ii)IL-15；以及
(2)分离从样品中培养的细胞群。
25.如条款24所述的方法，其中方法的步骤(1)包括将样品培养至少7天，诸如至少14天。
26.如条款24或条款25所述的方法，其中不受MHC限制的淋巴细胞包含NK细胞和γδT细胞。
27.如条款24至26中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的细胞群中存在的不受MHC限制的淋巴细胞的至少70％表达CD56。
28.如条款24至27中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的细胞群包含γδT细胞，并且至少40％的γδT细胞表达CD56。
29.如条款24至28中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的细胞群的少于80％是γδT细胞。
30.如条款24至29中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的细胞群的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成，并且其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
31.如条款21至30中任一项所述的方法，其中激活性抗Vδ1抗体或其片段结合γδT细胞受体(TCR)的可变δ1(Vδ1)链的表位，所述表位包含以下氨基酸区域内的一个或多个氨基酸残基：
(i)SEQ ID NO：1的3-20；和/或
(ii)SEQ ID NO：1的37-77。
32.如条款31所述的方法，其中表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸区域5-20和62-77；50-64；37-53和59-72；59-77；或3-17和62-69内的一个或多个氨基酸残基。
33.如条款21至32中任一项所述的方法，其中抗Vδ1抗体或其片段包含以下的一种或多种：
CDR3，其包含与SEQ ID NO：2-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
CDR2，其包含与SEQ ID NO：26-37和序列A1-A12(表2)中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和/或
CDR1，其包含与SEQ ID NO：38-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
34.如条款21至33中任一项所述的方法，其中抗Vδ1抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含与SEQ ID NO：62-73中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
35.如条款21至34中任一项所述的方法，其中抗Vδ1抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含与SEQ ID NO：74-85中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
36.如条款21至35中任一项所述的方法，其中抗Vδ1抗体或其片段包含SEQ ID NO：86-97中任一个的氨基酸序列。
37.如条款24至36中任一项所述的方法，其中样品是造血样品或其部分。
38.如条款37所述的方法，其中造血样品选自外周血、脐带血、淋巴组织、胸腺、骨髓、淋巴结组织或其部分。
39.如条款37或条款38所述的方法，其中造血样品由低密度单核细胞(LDMC)或外周血单核细胞(PBMC)组成。
40.如条款24至39中任一项所述的方法，其中样品从人类或非人动物组织获得。
41.如条款24至40中任一项所述的方法，其中样品在所述培养之前富集T细胞。
42.如条款24至41中任一项所述的方法，其中样品在所述培养之前耗竭αβT细胞。
43.如条款24至42中任一项所述的方法，其中培养在包含2.5％血浆的培养基中执行。
44.一种组合物，其通过如条款21至43中任一项所述的方法获得。
45.如条款44所述的组合物，其用于治疗。
46.如条款44所述的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法。
47.一种治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含NK细胞和γδT细胞的组合物，其中组合物中存在的γδT的至少40％表达CD56。
48.一种治疗有需要的受试者的癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含细胞的组合物，其中至少90％的细胞由NK细胞和γδT细胞组成，其中至少10％的细胞是Vδ1 T细胞，至少5％的细胞是Vδ2 T细胞，并且至少30％的细胞是NK细胞。
49.如条款24至43中任一项所述的方法，其中方法的步骤(1)包括将样品培养至少12天，诸如约12天。
50.一种富集不受MHC限制的淋巴细胞的细胞群，其通过如条款21至43或条款49中任一项所述的方法获得。
51.如条款50所述的细胞群，其用于治疗。
52.如条款50所述的细胞群，其用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法。
53.一种包含细胞群的组合物，其可通过如条款21至43中任一项所述的方法获得。
本发明的其他特征和优点将从本文提供的描述中显而易见。然而应该理解，虽然描述和具体实施例示出本发明的优选实施方案，但它们仅通过举例说明的方式给出，因为各种变化和修改对于本领域的技术人员将变得显而易见。现在将使用以下非限制性实施例来描述本发明：
实施例
实施例1.材料和方法
细胞扩增
将细胞在下文所述并且如图1中所总结的条件下扩增。
条件1：使用补充有2.5％合并同种异体血浆(Octaplas，Octapharma)和Glutamax(ThermoFisher)的无血浆培养基(CTS OpTmizer，Thermo Fisher)，由αβ-TCR+耗竭的外周血单核细胞生成Vδ1+γδT细胞。分离的细胞在重组IL-4、IL-1β、IL-21和IFNγ和可溶性抗Vδ1单克隆抗体(1252_P01_C08-内部抗体克隆)的存在下接种。设置后，将培养物在37℃和5％CO2下在加湿孵育箱中孵育。用新鲜的IL-15、IL-21和抗Vδ1抗体重新补充扩增的细胞。培养11-14天后收获细胞，并且在Cryostor5(STEMCELL Technologies)中作为混合群冷冻保存。
条件2：使用补充有2.5％合并同种异体血浆(Octaplas，Octapharma)和Glutamax(ThermoFisher)的无血浆培养基(CTS OpTmizer，Thermo Fisher)，由αβ-TCR+耗竭的外周血单核细胞生成CD56+淋巴细胞。将经分离的细胞在重组IL-15和可溶性抗Vδ1单克隆抗体(内部抗体克隆)的存在下生长。设置后，将培养物在37℃和5％CO2下在加湿孵育箱中孵育。用新鲜的IL-15和抗Vδ1抗体定期重新补充扩增的细胞。培养11-14天后收获细胞，并且在Cryostor5(STEMCELL Technologies)中作为混合群冷冻保存。
条件3：如条件1所述由αβ-TCR+耗竭的外周血单核细胞生成Vδ1+γδT细胞。然而，除了重组IL-4、IL-1β、IL-21和IFNγ和可溶性抗Vδ1单克隆抗体(内部抗体克隆)之外，还在重组IL-15的存在下接种细胞。设置后，将培养物在37℃和5％CO2下在加湿孵育箱中孵育。用新鲜的IL-15、IL-21和抗Vδ1抗体重新补充扩增的细胞。培养11-14天后收获细胞，并且在Cryostor5(STEMCELL Technologies)中作为混合群冷冻保存。
细胞纯度和表面表型的流式细胞术评估
使用MACSQuant16流式细胞仪执行免疫表型分析。使用eFluor780可固定活性染料排除死细胞。使用可从Miltenyi和BioLegend获得的FITC抗CD45、PE抗TCRα/β、APC抗TCRγ/δ、VioBlue抗TCR Vδ1、FITC抗CD27、PE抗NKp30、PE-Vio770抗NKG2D、PE抗CD19、PerCP-Vio770抗CD14、PE-Vio770抗CD56、APC抗CD3、PE抗TCR Vδ3和PE-Vio770抗TCR Vδ2抗体来分析细胞的表面标记表达。
用编码CD19嵌合抗原受体的慢病毒转导
在涂覆RetroNectin(20μg/mL)的非组织培养处理的24孔板中，用编码CD19靶向嵌合抗原受体的慢病毒载体来转导来自条件1和2的扩增细胞。将病毒载体与在CTS OpTmizer(补充有IL-15和抗Vδ1抗体)中稀释的免疫细胞混合，并且在32℃下以800x g旋转接种45分钟。转导效率在转导后四天通过流式细胞术确定。
解冻冷冻保存的培养物
将冷冻的冷冻小瓶在37℃水浴中解冻，并且添加至预热的OpTmizer+2.5％同种异体血浆。将细胞以300g离心7分钟，计数并评估存活力，然后以2x106细胞/mL重悬用于表型分析和下游测定。
细胞毒性测定
将来自条件1至3的经扩增的细胞与CellTrace Violet标记的NALM-6肿瘤靶细胞在96孔圆底板中以不同的效靶比共培养。对照(Ctrl)仅测试靶细胞，不存在效应细胞。20小时后，将SYTOX AADVANCED死细胞染色剂添加到培养物中，然后在MACSQuant10流式细胞仪上采集。CellTrace Violet(CTV)染色鉴定NALM-6肿瘤细胞，并且用于SYTOX的阳性区分死细胞和活细胞。
实施例2.细胞培养条件的比较
使用实施例1中所述和如图1所总结的条件1-3中的任一个来扩增细胞群。然后分析并比较扩增的细胞群。
收获时的细胞产量在图2中示出。条件2产生与条件1相同的细胞产量。条件3相对于条件1增加了细胞产量。
分析了免疫细胞组成。条件1和3产生了高度富集Vδ1 T细胞的群，但是条件2产生了由Vδ1+、Vδ2+和NK细胞组成的混合群。因此，条件2出乎意料地显示所有不受MHC限制的淋巴细胞的同时富集。结果在图3中示出。表4总结了使用条件2培养的三名供体的单个细胞组成。
表4.在条件2下从3名供体获得的细胞组成
Figure BDA0004105319660001091
分析了Vδ1 T细胞的表面表型。来源于条件1和3的Vδ1 T细胞对CD27和NKG2D呈阳性。来源于条件2的Vδ1 T细胞表达较少的CD27但比条件1和3表达更多的NKp30，这与效应细胞表型一致。结果在图4中示出。
实施例3.抗Vδ1抗体的比较
使用条件2但在不同抗体的存在下扩增细胞群。结果在图5中示出。在条件2中使用两种单独的内部抗Vδ1抗体克隆(1252_P01_C08和1245_P01_B07)富集NK细胞和γδ细胞。这与仅有效富集γδT细胞的抗CD3抗体(OKT-3，BioLegend)进行对比。
实施例4.细胞组成细胞毒性
使用1∶1的低效靶比在如实施例1所述的细胞毒性测定中测试条件1-3产生的细胞组成。条件2显示出最大的细胞毒性活性，尽管条件1和3都显著增强了对NALM-6肿瘤细胞的细胞毒性活性(图6A)。增强的杀伤与条件之间的CD56表达相关(图6B)。
CD56表面表达还通过用流式细胞术分析染色强度来确定。相对于Vδ1和Vδ2细胞的固有PBMC水平，条件2强烈富集Vδ1和Vδ2细胞上的CD56表达的强度(图7)。此外，与初始PMBC起始材料相比，从条件2收获中获得的γδ和NK细胞群两者中显示出CD56-亮细胞的丰度增加(图8)。
实施例5.储存后细胞的功能
还研究了冷冻和然后解冻的储存步骤后细胞的功能。在第11-14天去除使用条件1和2培养的一部分细胞并冷冻。然后如实施例1所述解冻细胞。冷冻保存后，条件1和条件2之间的细胞具有相等的存活力和恢复(图9)。
还分析了使用条件2扩增后冷冻保存的细胞的表型。条件2示出了冷冻保存前后的等效免疫细胞组成和细胞表面表型(图10)。
最后，研究了冷冻保存后细胞的细胞毒性。相对于条件1，条件2显示出在冷冻保存后、在一定范围的效靶比中对NALM-6肿瘤细胞的细胞毒性增强(图11)。
实施例6.细胞组合物转导
使用如实施例1所述的慢病毒载体转导使用条件2获得的细胞组合物。在条件2下产生的细胞相对于条件1显示出增强的转导允许(图12)。此外，CAR转导的条件2进一步增强了对NALM-6细胞的细胞毒性，在低至1∶100的效靶比处观察到杀伤(图13)。
实施例7.优化的方法条件
进一步优化了方法。如实施例1的条件2所述、使用以下变化由αβ-TCR+耗竭的外周血单核细胞生成CD56+淋巴细胞。培养基包括1x NK补充剂(NK 
Figure BDA0004105319660001111
MiltenyiBiotec)。除非另有说明，否则可溶性抗Vδ1单克隆抗体仅在培养开始时提供并且不再添加。对C08和G04内部可溶性抗Vδ1单克隆抗体(WO2021032961中所述)两者进行了测试，结果相似，但除非说明，否则使用C08。除非另有说明，否则根据观察到的表明增殖状态的Ki-67表达下降，在第11天(12天扩增)收获细胞。
发现该方法是稳健的，D11收获时间更短，并且在第0天单次补充可溶性抗Vδ1单克隆抗体提供良好的细胞扩增和正确的细胞类型(图14)。使用额外的供体重复实验进一步证明了所述过程的稳健性(图15)。其他参数，诸如培养体积、起始细胞密度、容器类型和NK补充剂的添加，要么无负面影响，要么有一些积极影响(数据未示出)。
此外，来自每种细胞类型的细胞增加了它们的CD56表达，包括表达水平(如增加的MFI所示，图16A)，以及通常不是CD56高表达者的γδ细胞部分的CD56阳性百分比(图16B)。增加的CD56表达与增加的细胞毒性相关(图16C)。
最后，细胞表面上的趋化因子受体的表达水平在图17中示出。这表明这些细胞可能潜在地靶向广泛的细胞类型。
实施例8.使用γ逆转录病毒载体的转导
如图14A中所述培养细胞。作为比较，如实施例1的条件2中所述接种并培养细胞，不同之处如下：使用可溶性抗CD3单克隆抗体(克隆OKT3)代替可溶性抗Vδ1单克隆抗体。然后使用编码CD19靶向嵌合抗原受体的GALV或RD114假型γ逆转录病毒载体转导细胞。将病毒载体在CTS OpTmizer中稀释，并且通过离心(32℃下，2000x g，2小时)粘附至涂覆RetroNectin(20μg/mL)的非组织培养物涂覆的6孔板。将培养的细胞转移至病毒预装载板。将细胞在32℃下以800x g离心45分钟(“旋转”)或保持静止(“不旋转”)。转导效率在转导后6天通过流式细胞术确定(图18A)。
还显示，本方法的CD56+细胞比CD56-细胞更易转导(图18B)。这与通过WO2021032961的方法生成的细胞不同，通过WO2021032961的方法生成的细胞受CD56状态的影响较小(图18C)。
先前已经显示，当用靶向血红素的CAR(CD19)转导时，细胞组合物能够杀死血液学靶标。图19显示了，当用靶向间皮素的CAR转导时，细胞组合物可以有效地杀死实体瘤靶标。事实上，本发明的未转导的组合细胞群与传统的表达CAR的αβT细胞(最低线)表现一样好或更好，而表达CAR的组合细胞群明显优于两者。
序列表
<110> 伽玛德治疗有限公司
<120> 免疫疗法组合物
<130> GDT-P2862PCT
<160> 135
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg
1               5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu
        35                  40                  45
Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser
    50                  55                  60
Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ser
                85                  90                  95
Leu Thr Arg Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr
            100                 105                 110
Val Glu Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
        115                 120                 125
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
    130                 135                 140
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
                165                 170                 175
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
            180                 185                 190
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
        195                 200                 205
Ser
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Val Asp Tyr Ala Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Pro Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Thr Trp Ser Gly Tyr Val Asp Val
1               5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Glu Asn Tyr Leu Asn Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Asp Ser Gly Val Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
His Gln Val Asp Thr Arg Thr Ala Asp Tyr
1               5                   10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val
1               5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Val
1               5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val
1               5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
His Ser Trp Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu Thr
1               5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1               5                   10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Val Thr
1               5                   10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Gln Phe Lys Arg Tyr Pro Pro Thr
1               5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Ser Thr Leu Val
1               5                   10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Gln Gln Ser His Ser His Pro Pro Thr
1               5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asp Thr
1               5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Val Thr
1               5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu Thr
1               5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1               5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Ser Thr
1               5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1               5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr
1               5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1               5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1               5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1               5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1               5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Thr Tyr Tyr Gly Ser Lys Trp Tyr Asn
1               5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1               5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1               5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Tyr
1               5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys Ser Ala Ala
1               5                   10
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1               5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1               5                   10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1               5                   10
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1               5                   10
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Gln Ser Ile Gly Thr Tyr
1               5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Asn Ile Gly Ser Gln Ser
1               5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Gln Asp Ile Asn Asp Trp
1               5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Gln Ser Leu Ser Asn Tyr
1               5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Gln Asn Ile Arg Thr Trp
1               5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1               5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Gln Ser Ile Ser Thr Trp
1               5
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1               5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Gln Ser Ile Ser Thr Trp
1               5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1               5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Gln Ser Ile Ser Ser His
1               5
<210> 62
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Asp Tyr Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 63
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Pro Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Ser Thr Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Ala Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Leu Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Trp Ser Gly Tyr Val Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Asn Tyr Leu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 66
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Ser Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 67
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Gln Val Asp Thr Arg Thr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 68
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 69
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 70
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
    50                  55                  60
Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 72
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 73
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 75
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
1               5                   10                  15
Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Gln
            20                  25                  30
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val
        35                  40                  45
Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210> 76
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ala Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn
            20                  25                  30
Asp Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Gln Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 77
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 78
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Lys Arg Tyr
                85                  90                  95
Pro Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Ala Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro
1               5                   10                  15
Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Thr Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210> 80
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser His
                85                  90                  95
Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210> 82
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 83
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 84
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 85
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 86
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Asp Tyr Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Gly Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gly Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
                165                 170                 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
Tyr Ser Thr Leu Leu Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235                 240
<210> 87
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Pro Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
    130                 135                 140
Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met
                165                 170                 175
Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
            180                 185                 190
Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg
        195                 200                 205
Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser
    210                 215                 220
Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
<210> 88
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Ser Thr Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Ala Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Leu Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Trp Ser Gly Tyr Val Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro
    130                 135                 140
Ala Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Asp Ile Asn Asp Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys
<210> 89
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Asn Tyr Leu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Leu Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
                165                 170                 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225                 230                 235                 240
<210> 90
<211> 239
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Ser Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn
145                 150                 155                 160
Ile Arg Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro
                165                 170                 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Lys
    210                 215                 220
Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235
<210> 91
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Gln Val Asp Thr Arg Thr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Val Leu
<210> 92
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys
<210> 93
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Ser His Ser His Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp
225                 230                 235                 240
Ile Lys
<210> 94
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
                165                 170                 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
Tyr Ser Thr Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235                 240
<210> 95
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
    50                  55                  60
Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys
<210> 96
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
                165                 170                 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235                 240
<210> 97
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
                165                 170                 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
Tyr Ser Thr Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235                 240
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成接头
<400> 98
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5                   10
<210> 99
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
gccatggccc aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtcaagcc tggagggtcc 60
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg actactacat gagctggatc 120
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtttcataca ttagtagtag tggtagtacc 180
atatactacg cagactctgt gaagggccga ttcaccatct ccagggacaa cgccaagaac 240
tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agggtggact acgctgatgc atttgatatc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360
agtggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcgctagcga catccagatg 420
acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cgcttgccgg 480
gcaggtcaga gcattggcac ctatttaaat tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 540
aaactcctga tctatgttgc atccagtttg caaagtgggg tcccgtcacg gttcagtggc 600
agtggatctg ggacagaatt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 660
acttactact gtcaacagag ttacagtacc ctcctcactt tcggcagagg gaccaaggtg 720
gaaatcaaac gtaccgcggc cgcatccgca catcatcatc accat 765
<210> 100
<211> 768
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggcaggtcc 60
ctgagactct cctgtgcagc ctctgggttc accgtcagta gcaactacat gagctgggtc 120
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagtta tttatagcgg tggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240
ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgagc 300
cccatagagc tgggtgcttt tgatatctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg ctagctccta tgagctgact 420
cagccaccct cagtgtcagt ggccccagga aagacggcca ggattacctg tgggggaaac 480
aacattggaa gtcaaagtgt gcactggtac cagcagaagc caggccaggc ccctatgctg 540
gtcatctatt atgatagcga ccggccctca gggatccctg agcgattctc tggctccaac 600
tctgggaaca cggccaccct gaccatcagc agggtcgaag ccggggatga ggccgactat 660
tactgtcagg tgtgggatag tagtagtgat catgtggtat tcggcggcgg gaccaagctg 720
accgtcctag gtcagcccgc ggccgcatcc gcacatcatc atcaccat 768
<210> 101
<211> 774
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
gccatggccc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc 60
ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcca gcaaaagtgc tgcttggaac 120
tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 180
aagtggtcta ctgattatgc agcatctgtg aaaagtcgaa taaccatcaa cccagacaca 240
tccaagaacc agctctccct gcagttaaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 300
tactgtgcaa gaacgtggag tggttatgtg gacgtctggg gccaaggaac cctggtcacc 360
gtctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgc tagcgacatc 420
cagatgaccc agtcccctcc cgccctgtct gcatctgtgg gagacagagt caccatcact 480
tgccgggcca gtcaagatat taatgactgg ttggcctggt atcagcataa acctgggaaa 540
gcccctaagc tcctgatcta tgatgcctcc agtttggaaa gtggggtccc atcaaggttc 600
agcggcagtg gatctgggac agaattcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgatgat 660
tttgcaactt actactgtca acagagttac agtacccctc aggtcacttt tggccagggg 720
acacgactgg agatcaaacg taccgcggcc gcatccgcac atcatcatca ccat 774
<210> 102
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtcaagcc tggagggtcc 60
ctgagactct cctgtgcggc ctctggattc accttcagtg actactacat gagctggatc 120
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtttcataca ttagtagtag tggtagtacc 180
atatactacg cagactctgt gaagggccga ttcaccatct ccagggacaa cgccaagaac 240
tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 300
agagaaaact atctaaatgc ttttgatatc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcg 360
agtggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcgctagcga catccagatg 420
acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 480
acaagtcaga gccttagtaa ttacttaaat tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 540
aagctcctga tctatgctgc atccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc 600
agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgcg 660
acttactact gtcaacagag ttacagtacc cctctcactt tcggcggagg gaccaagcta 720
gagatcaaac gtaccgcggc cgcatccgca catcatcatc accat 765
<210> 103
<211> 762
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 60
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 120
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtgg tggtggtacc 180
acatactcct cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 240
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 300
agagattcag gggttgcttt tgatatctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg ctagcgacat ccagatgacc 420
cagtctccat ccttcctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggcc 480
agtcagaata tacgtacctg gttggcctgg tatcagcaga aaccagggag agcccctaag 540
ctcctgatct atgatgcctc cagtttggaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt 600
ggatctggga ctgatttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact 660
tattactgtc aacagtttaa acgttaccct ccgacgtttg gcctggggac caaggtggag 720
atcaaacgta ccgcggccgc atccgcacat catcatcacc at 762
<210> 104
<211> 780
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
gccatggccc aggtccagct ggtacagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 60
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttacca gctactggat cggctgggtg 120
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctgg tgactctgat 180
accagataca gcccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagc 240
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttattgtgcg 300
agacatcagg ttgatacacg gacggctgat tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ccagtctgcg 420
ctgactcagc ctgcctccgt gtctgggtct cctggacagt cggtcaccat ctcctgcact 480
ggaaccagga gtgacgttgg tggttataac tatgtctcct ggtaccaaca ccacccaggc 540
aaagccccca aactcatgat ttatgaggtc agtaatcggc cctcaggggt ttctaatcgc 600
ttctctggct ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag 660
gacgaggctg attattactg cagctcatat acaagcacca gcactctggt attcggcgga 720
gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc gcggccgcat ccgcacatca tcatcaccat 780
<210> 105
<211> 771
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
gccatggccc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc 60
ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tgcttggaac 120
tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 180
aagtggtata atgattatgc agtatctgtg agaagtcgaa taaccatcaa cccagacaca 240
tccaagaacc agttctccct gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 300
tactgtgcaa gaagctggaa tgatgctttt gatatctggg ggcaagggac cacggtcacc 360
gtctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgc tagcgatatt 420
gtgatgacac agtctccttc caccctgtct gcatctatag gagacagagt caccatcact 480
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Gly
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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
        275                 280                 285
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
    290                 295                 300
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Leu Asn Ala
305                 310                 315                 320
Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            340                 345                 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    370                 375                 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                405                 410                 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
            420                 425                 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        435                 440                 445
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    450                 455                 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465                 470                 475                 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                485                 490                 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            500                 505                 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        515                 520                 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    530                 535                 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545                 550                 555                 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
                565                 570                 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            580                 585                 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        595                 600                 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    610                 615                 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625                 630                 635                 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                645                 650                 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 114
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Lys Arg Tyr
                85                  90                  95
Pro Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly
            260                 265                 270
Thr Thr Tyr Ser Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
        275                 280                 285
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
    290                 295                 300
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Val Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
            340                 345                 350
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
        355                 360                 365
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
    370                 375                 380
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
385                 390                 395                 400
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
                405                 410                 415
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
            420                 425                 430
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
    450                 455                 460
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
465                 470                 475                 480
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                485                 490                 495
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
            500                 505                 510
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
        515                 520                 525
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
    530                 535                 540
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
545                 550                 555                 560
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
                565                 570                 575
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
            580                 585                 590
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
        595                 600                 605
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
    610                 615                 620
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
625                 630                 635                 640
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
                645                 650                 655
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 115
<211> 667
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Ala Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro
1               5                   10                  15
Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Thr Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
Gly Gln Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
        115                 120                 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145                 150                 155                 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
                165                 170                 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
            180                 185                 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
        195                 200                 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
    210                 215                 220
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys
225                 230                 235                 240
Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg
                245                 250                 255
Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly
            260                 265                 270
Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile
        275                 280                 285
Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu
    290                 295                 300
Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gln Val Asp
305                 310                 315                 320
Thr Arg Thr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
                325                 330                 335
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
            340                 345                 350
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
        355                 360                 365
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
    370                 375                 380
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
                405                 410                 415
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
            420                 425                 430
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
        435                 440                 445
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
    450                 455                 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465                 470                 475                 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
                485                 490                 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
        515                 520                 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
    530                 535                 540
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545                 550                 555                 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
                565                 570                 575
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
            580                 585                 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        595                 600                 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    610                 615                 620
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                645                 650                 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660                 665
<210> 116
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
1               5                   10                  15
Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Gln
            20                  25                  30
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val
        35                  40                  45
Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
        115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
                165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
            180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
        195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser
            260                 265                 270
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
        275                 280                 285
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
    290                 295                 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Pro Ile Glu Leu Gly Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
            340                 345                 350
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
        355                 360                 365
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
    370                 375                 380
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
385                 390                 395                 400
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
                405                 410                 415
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
            420                 425                 430
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
    450                 455                 460
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
465                 470                 475                 480
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                485                 490                 495
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
            500                 505                 510
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
        515                 520                 525
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
    530                 535                 540
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
545                 550                 555                 560
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
                565                 570                 575
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
            580                 585                 590
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
        595                 600                 605
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
    610                 615                 620
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
625                 630                 635                 640
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
                645                 650                 655
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 117
<211> 666
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 117
Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile
225                 230                 235                 240
Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg
                245                 250                 255
Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg
            260                 265                 270
Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr
        275                 280                 285
Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser
    290                 295                 300
Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Asn
305                 310                 315                 320
Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
                325                 330                 335
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
            340                 345                 350
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        355                 360                 365
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    370                 375                 380
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
                405                 410                 415
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            420                 425                 430
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        435                 440                 445
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
    450                 455                 460
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
465                 470                 475                 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
                485                 490                 495
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
            500                 505                 510
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
    530                 535                 540
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
545                 550                 555                 560
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                565                 570                 575
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
            580                 585                 590
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
        595                 600                 605
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
    610                 615                 620
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
625                 630                 635                 640
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
                645                 650                 655
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660                 665
<210> 118
<211> 666
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 118
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser His
                85                  90                  95
Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Ile
225                 230                 235                 240
Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg
                245                 250                 255
Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg
            260                 265                 270
Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr
        275                 280                 285
Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser
    290                 295                 300
Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
                325                 330                 335
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
            340                 345                 350
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        355                 360                 365
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    370                 375                 380
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
                405                 410                 415
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            420                 425                 430
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        435                 440                 445
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
    450                 455                 460
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
465                 470                 475                 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
                485                 490                 495
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
            500                 505                 510
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
    530                 535                 540
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
545                 550                 555                 560
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                565                 570                 575
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
            580                 585                 590
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
        595                 600                 605
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
    610                 615                 620
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
625                 630                 635                 640
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
                645                 650                 655
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660                 665
<210> 119
<211> 664
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
        275                 280                 285
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
    290                 295                 300
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala
305                 310                 315                 320
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            340                 345                 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    370                 375                 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                405                 410                 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
            420                 425                 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        435                 440                 445
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    450                 455                 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465                 470                 475                 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                485                 490                 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            500                 505                 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        515                 520                 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    530                 535                 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545                 550                 555                 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
                565                 570                 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            580                 585                 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        595                 600                 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    610                 615                 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625                 630                 635                 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                645                 650                 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 120
<211> 666
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 120
Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile
225                 230                 235                 240
Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg
                245                 250                 255
Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly
            260                 265                 270
Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser
    290                 295                 300
Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                325                 330                 335
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
            340                 345                 350
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        355                 360                 365
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    370                 375                 380
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
                405                 410                 415
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            420                 425                 430
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        435                 440                 445
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
    450                 455                 460
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
465                 470                 475                 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
                485                 490                 495
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
            500                 505                 510
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
    530                 535                 540
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
545                 550                 555                 560
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                565                 570                 575
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
            580                 585                 590
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
        595                 600                 605
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
    610                 615                 620
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
625                 630                 635                 640
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
                645                 650                 655
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660                 665
<210> 121
<211> 664
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
        275                 280                 285
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
    290                 295                 300
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Trp Ser Asp Ala
305                 310                 315                 320
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            340                 345                 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    370                 375                 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                405                 410                 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
            420                 425                 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        435                 440                 445
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    450                 455                 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465                 470                 475                 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                485                 490                 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            500                 505                 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        515                 520                 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    530                 535                 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545                 550                 555                 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
                565                 570                 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            580                 585                 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        595                 600                 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    610                 615                 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625                 630                 635                 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                645                 650                 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 122
<211> 664
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
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Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
        275                 280                 285
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
    290                 295                 300
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Trp Asn Asp Ala
305                 310                 315                 320
Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
                325                 330                 335
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    370                 375                 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                405                 410                 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
            420                 425                 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        435                 440                 445
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    450                 455                 460
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465                 470                 475                 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                485                 490                 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            500                 505                 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        515                 520                 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    530                 535                 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545                 550                 555                 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
                565                 570                 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            580                 585                 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        595                 600                 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    610                 615                 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625                 630                 635                 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                645                 650                 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            660
<210> 123
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TRDV1(3OMZ) TRAC抗原序列
<400> 123
Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg
1               5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu
        35                  40                  45
Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser
    50                  55                  60
Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ser
                85                  90                  95
Leu Thr Arg Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr
            100                 105                 110
Val Glu Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
        115                 120                 125
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
    130                 135                 140
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
                165                 170                 175
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
            180                 185                 190
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
        195                 200                 205
Ser Cys Thr Thr Ala Pro Ser Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala
    210                 215                 220
Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys
225                 230                 235                 240
Lys Lys Leu Ala Gln Gly Ser Gly His His His His His His
                245                 250
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 任选的scFv标签序列(κ序列 + His标签)
<400> 124
Arg Thr Ala Ala Ala Ser Ala His His His His His
1               5                   10
<210> 125
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 任选的scFv标签序列(κ序列 + His和FLAG标签)
<400> 125
Arg Thr Ala Ala Ala Ser Ala His His His His His His Lys Leu Asp
1               5                   10                  15
Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys
            20                  25                  30
Asp Asp Asp Asp Lys
        35
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 任选的scFv标签序列(λ序列 + His标签)
<400> 126
Gly Gln Pro Ala Ala Ala Ser Ala His His His His His
1               5                   10
<210> 127
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 任选的scFv标签序列(λ序列 + His和FLAG标签)
<400> 127
Gly Gln Pro Ala Ala Ala Ser Ala His His His His His His Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
            20                  25                  30
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
        35
<210> 128
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg
1               5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu
        35                  40                  45
Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser
    50                  55                  60
Val Asn Phe Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ser
                85                  90                  95
Leu Thr Arg Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr
            100                 105                 110
Val Glu Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
        115                 120                 125
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
    130                 135                 140
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
                165                 170                 175
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
            180                 185                 190
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
        195                 200                 205
Ser Cys Thr Thr Ala Pro Ser Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala
    210                 215                 220
Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys
225                 230                 235                 240
Lys Lys Leu Ala Gln Gly Ser Gly His His His His His His
                245                 250
<210> 129
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Met Leu Phe Ser Ser Leu Leu Cys Val Phe Val Ala Phe Ser Tyr Ser
1               5                   10                  15
Gly Ser Ser Val
            20
<210> 130
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg
1               5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu
        35                  40                  45
Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser
    50                  55                  60
Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu
                85                  90                  95
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro
1               5                   10                  15
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Leu Thr Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ile Val Glu
1               5                   10                  15
Pro
<210> 133
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Ser Trp Asp Thr Arg Gln Met Phe Phe Gly Thr Gly Ile Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
Val Glu Pro
<210> 134
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Arg Pro Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Tyr Leu Glu Val Gln Gln
1               5                   10                  15
<210> 135
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 135
Xaa Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg
            20                  25                  30
Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile
        35                  40                  45
Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr
    50                  55                  60
Glu Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val
65                  70                  75                  80
His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys
                85                  90                  95
Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys
            100                 105                 110
Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr
        115                 120                 125
Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
145                 150

Claims (30)

1.一种包含自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述γδT细胞的至少40％是CD56亮。
2.一种包含NK细胞和γδT细胞的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述γδT细胞的至少50％表达CD56。
3.如权利要求1或权利要求2所述的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述细胞的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成。
4.如权利要求1至3中任一项所述的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述细胞的至少30％是γδT细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的经分离的组合物，其中所述γδT细胞包含Vδ1T细胞和Vδ2T细胞。
6.如权利要求1至5中任一项所述的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述细胞的至少30％是NK细胞。
7.一种包含细胞的经分离的组合物，其中所述细胞的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成，其中所述细胞的至少10％是Vδ1T细胞，所述细胞的至少5％是Vδ2T细胞，并且所述细胞的至少30％是NK细胞。
8.如权利要求7所述的经分离的组合物，其中所述组合物中存在的所述γδT细胞的至少40％表达CD56。
9.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的组合物，其中所述γδT细胞包含Vδ1T细胞，并且所述Vδ1T细胞的至少15％表达NKp30。
10.如权利要求1至9中任一项所述的经分离的组合物，其中所述γδT细胞包含Vδ1T细胞，并且所述Vδ1T细胞的少于50％表达CD27。
11.如权利要求1至10中任一项所述的经分离的组合物，其中所述经分离的组合物包含工程化NK细胞和γδT细胞。
12.如权利要求1至11中任一项所述的经分离的组合物，其用于治疗。
13.如权利要求1至12中任一项所述的经分离的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法。
14.一种扩增不受MHC限制的非γδ+淋巴细胞的方法，其包括在存在白介素-15(IL-15)和不存在白介素-4(IL-4)的情况下，使用抗TCRδ可变1(抗Vδ1)抗体或其片段来刺激包含γδT细胞和NK细胞的混合细胞群，并且培养所述混合细胞群。
15.一种制备包含细胞群的组合物的方法，所述细胞群富集不受MHC限制的淋巴细胞，其中所述方法包括：
(1)在不存在IL-4的情况下，在所述培养的第一天，在以下物质的存在下，培养从受试者获得的样品：
(i)抗Vδ1抗体或其片段；和
(ii)IL-15；以及
(2)分离从所述样品中培养的细胞群。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述方法的步骤(1)包括将所述样品培养至少7天，诸如至少14天。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中步骤(2)中分离的所述细胞群中存在的所述不受MHC限制的淋巴细胞的至少70％表达CD56。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的所述细胞群包含γδT细胞，并且所述γδT细胞的至少40％表达CD56。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中步骤(2)中分离的所述细胞群的至少90％由NK细胞和γδT细胞组成，并且其中所述细胞的至少10％是Vδ1T细胞，所述细胞的至少5％是Vδ2T细胞，并且所述细胞的至少30％是NK细胞。
20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述激活性抗Vδ1抗体或其片段结合至γδT细胞受体(TCR)的可变δ1(Vδ1)链的表位，所述表位包含以下氨基酸区域内的一个或多个氨基酸残基：
(i)SEQ ID NO:1的3-20；和/或
(ii)SEQ ID NO:1的37-77。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述表位包含SEQ ID NO:1的氨基酸区域：5-20和62-77；50-64；37-53和59-72；59-77；或3-17和62-69内的一个或多个氨基酸残基。
22.如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中所述抗Vδ1抗体或其片段包含以下中的一种或多种：
CDR3，其包含与SEQ ID NO:2-25中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；
CDR2，其包含与SEQ ID NO:26-37和序列A1-A12(表2)中的任一个具有至少80％序列同一性的序列；和/或
CDR1，其包含与SEQ ID NO:38-61中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述样品是造血样品或其级分。
24.如权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述样品在所述培养之前耗竭αβT细胞。
25.如权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述培养在包含2.5％血浆的培养基中执行。
26.如权利要求15至25中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤(1)包括将所述样品培养约12天，诸如12天。
27.一种富集不受MHC限制的淋巴细胞的细胞群，其可通过如权利要求14至26中任一项所述的方法获得，诸如通过如权利要求14至26中任一项所述的方法获得。
28.一种包含细胞群的组合物，其可通过如权利要求14至26中任一项所述的方法获得，诸如通过如权利要求14至26中任一项所述的方法获得。
29.如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的组合物，其用于疗法中。
30.如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法。
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