CN110564683A - 一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，通过采集外周血分离筛选单个核细胞并刺激诱导单个核细胞诱导出γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，复合形成一种共培养细胞组合物，其具有非常好的临床应用价值。且该共培养诱导扩增方法提高细胞培养效率，大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度，简化了在临床中治疗过程，也降低了治疗成本，简化了治疗手段。

Description

一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞诱导扩增方法，具体涉及γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，及使用该方法获得的γδT-NK细胞复合细胞在癌细胞SK-BR-3上的应用。
背景技术：
γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞。
γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的0.5％-1％。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。γδT细胞所识别的抗原种类有限:①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。
γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。
γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(common lymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。
γδT细胞作用还体现在：
①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。
②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。
③γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。
④γδT能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。
⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。
⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。
由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。
细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的 CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。
在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗或者在临床治疗中采用联合治疗的方式，在现有技术中，采用联合治疗需要花费更高的费用，为病患带来更多经济压力。
因此，发明一种实用高效、成本低、技术简单、可大量扩增高数量、高细胞毒活性的细胞组合物成为目前病患治疗的一种希望。
发明内容
针对上述所述问题，本发明提出了一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，通过采集外周血分离筛选单个核细胞并刺激诱导单个核细胞诱导出γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，复合形成一种共培养细胞组合物，其具有非常好的临床应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
所述γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法包括以下步骤：
(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；
(2)γδT-NK细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mL IL-2 的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mLanti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；
(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mL EX培养基进行扩增培养，依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21；
(5)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、1-100μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；
(6)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。
优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-human CD3Ab浓度为50ng/mL、anti-humanCD28Ab 浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。
在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。
优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。
上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过 Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和 iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。
所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-380ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1800U/ml。
一种细胞组合物，由上述γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法获得的γδT-NK 细胞组合物。
上述γδT-NK细胞组合物在癌细胞及抗肿瘤治疗上的应用。
本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种γδT细胞和 NK细胞共培养诱导扩增的方法，制备方法操作简单，诱导扩增后可获得大量扩增的γδT细胞和NK细胞，共培养诱导扩增两种具有类似性质的抗肿瘤免疫细胞，提高细胞培养效率，相较于独立培养各种免疫细胞而言大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度，简化了在临床中治疗过程，也降低了治疗成本；(2)共同诱导培养条件下细胞可相互促进刺激生长和扩增，且共培养出的γδT-NK细胞毒性/活性强；(3)共培养γδT-NK细胞组合物对癌细胞的杀伤性能比使用单一的免疫细胞杀伤性效果好。
附图说明：
图1为扩增培养γδT-NK细胞总生长曲线、γδT细胞生长曲线、NK细胞生长曲线。
图2为扩增培养γδT-NK细胞、γδT细胞、NK细胞在第6天、第12天和第18天的扩增倍数。
图3为扩增培养γδT-NK细胞总生长曲线、γδT细胞生长曲线、NK细胞生长曲线
图4为扩增培养γδT-NK细胞、γδT细胞、NK细胞在第6天、第12天和第18天的扩增倍数。
图5为γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞对SK-BR-3细胞的杀伤活性检测。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1γδT-NK细胞的获得
γδT-NK细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT-NK细胞：
(1)使用前30分钟开启生物安全柜；
(2)使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；
(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；
(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；
(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；
(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；
(7)向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；
(8)弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；
(9)20℃，400×g，离心10分钟；
(10)加入5ml 50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；
(11)由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有50μM的唑来膦酸和1000U/mL IL-2的混合培养基调整细胞浓度至1×106cells/ml，使用T-175培养瓶培养细胞；
(12)混合培养基体外刺激4天后加入含有200ng/mL anti-human CD3Ab、150ng/mLanti-human CD28Ab、100ng/mL IL-15、100ng/mL IL-21、500U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(13)培养2天，在培养瓶中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；
(14)培养3-4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mLEX培养基进行扩增培养，依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21，使得IL2细胞因子、IL-15、IL-21 最终浓度与原始浓度相同；
(15)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、50μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；
(16)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞生长及细胞总数。
在培养第0、4、6、9、12、16、18天统计细胞数细胞数，制作细胞生长曲线，如图1 所示，接种3000万细胞，扩增18天，细胞总数可达约420亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第6天、第12天和第18天，计算γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞扩增倍数，如图2所示。
实施例2γδT-NK细胞的获得
γδT-NK细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT-NK细胞：
(1)使用前30分钟开启生物安全柜；
(2)使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；
(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；
(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；
(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；
(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；
(7)向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；
(8)弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；
(9)20℃，400×g，离心10分钟；
(10)加入10ml 50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；
(11)由步骤10中取外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有50μM的唑来膦酸和1000U/mL IL-2的混合培养基调整细胞浓度至1×106cells/ml，使用T-175培养瓶培养细胞；
(12)混合培养基体外刺激4天后加入含有150ng/mL anti-human CD3Ab、300ng/mLanti-human CD28Ab、150ng/mL IL-15、120ng/mL IL-21、800U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(13)培养2天，在培养瓶中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；
(14)培养3-4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mLEX培养基进行扩增培养，依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21，使得IL2细胞因子、IL-15、IL-21 最终浓度与原始浓度相同；
(15)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、50μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；
(16)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。
在培养第0、4、6、9、12、16、18天统计细胞数细胞数，制作细胞生长曲线，如图3 所示，接种3500万细胞，扩增18天，细胞总数可达约510亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第6天、第12天和第18天，计算γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞扩增倍数，如图4所示。
实施例3γδT-NK细胞混合细胞物对SK-BR-3细胞的作用
使用5μM的CFSE对SK-BR-3细胞染色，将NK细胞或γδT细胞或γδT-NK细胞混合细胞物或PBS与SK-BR-3细胞按照20:1的比例，37℃孵育4h后，加入1μg/ml的PI染料， CFSE+PI双阳性的细胞为死亡细胞，如图5所示，γδT细胞和NK细胞混合细胞物能显著地增强癌细胞的杀伤活性，几乎100％的杀伤SK-BR-3细胞。
由上述实施例可以得出，通过上述共培养模式，可以共同诱导扩增出γδT细胞和NK 细胞，且两种细胞可以相互促进生长扩增，扩增量完全满足临床需求，简化了单一细胞诱导扩增培养模式，共同诱导扩增培养细胞，节省大量经济和时间成本，同时共同培养的细胞对SK-BR-3细胞杀伤性比单一细胞左右效果好，可以很好的杀伤癌细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，其特征在于：
(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；
(2)γδT-NK细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mLanti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；
(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mL EX培养基进行扩增培养，依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21；
(5)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、1-100μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；
(6)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。
2.根据权利要求1所述γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，其特征在于：也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。
3.根据权利要求1所述γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，其特征在于：
所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml；
所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-380ng/ml；
所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1800U/ml。
4.根据权利要求1所述γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法，其特征在于：
唑来膦酸浓度为5μM、anti-human CD3Ab浓度为50ng/mL、anti-human CD28Ab 浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。
5.一种细胞组合物，其特征在于：由权利要求1-4任一项所述的γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法获得的γδT-NK细胞组合物。
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