CN105567634A - 一种用于nk细胞体外扩增的培养基及nk细胞体外扩增的方法 - Google Patents

一种用于nk细胞体外扩增的培养基及nk细胞体外扩增的方法 Download PDF

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CN105567634A CN201610056712.4A CN201610056712A CN105567634A CN 105567634 A CN105567634 A CN 105567634A CN 201610056712 A CN201610056712 A CN 201610056712A CN 105567634 A CN105567634 A CN 105567634A
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Abstract

本发明涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法，所述培养基按体积百分含量包括淋巴细胞无血清培养基100％或RPMI1640培养基1～90％和淋巴细胞无血清培养基10～99％的混合物，以及血清替代物和白介素2；其中，所述血清替代物的浓度为0.5～4g/L，所述白介素2的浓度为50～500μg/mL。本发明的培养基及制备方法能实现NK细胞在短时间内的爆发性增殖，成本低廉且扩增的细胞杀伤性极高，满足三类医疗技术应用的要求和体细胞治疗药物质量控制的要求。

Description

一种用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，在抗肿瘤和抗病毒感染免疫中起着重要作用。由于NK细胞杀伤活性无MHC限值，因此称为自然杀伤细胞。NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)及寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治疗制剂。人体体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性：利用肿瘤细胞系的方法，确认其对血液系统肿瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿瘤和皮肤癌等均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了其临床及非临床的治疗效果。2009年，NK细胞治疗技术就已列入国家三类医疗技术目录。
充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。由于人外周血中NK细胞含量很少(约占淋巴细胞的5～10％)，从外周血中分离NK细胞成本昂贵，而且分离的NK细胞一般都处于非活化状态，在很大程度上限制了其在临床上应用。要达到治疗效果，所需的有效NK细胞数量单一批次应用至少要5×109个(且纯度达到80％以上)，目前有报道的采用无血清培养体系，通过IL-2、IL-21及相关组合因子刺激培养均不能实现NK细胞的高活性、高纯度和高扩增倍数，其扩增能力最多达到300倍，临床应用存在安全风险。通过自体血清培养体系实现规模扩增，且获得单一培养体系、单批次扩增的细胞数量大于1×1010个NK细胞，且纯度大于90％的未见报道。
CN102586185A公开了一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，具体为使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞的方法，该发明是以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；然后培养K562细胞一段时间，最后经物理、化学方式得到纯化的K562细胞，再对NK细胞进行培养。CN102268405B公开了一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。该方法是利用如下成套培养基并同时添加饲养细胞体外活化扩增自体NK细胞：由培养基1、培养基2和培养基3组成的成套培养基；所述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素15、人白细胞介素18、植物血凝素、抗人T细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培养基；所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述抗人T细胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；所述培养基3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2的相同。CN103849599A公开了一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。所述培养基内含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和抗CD3抗体，可以高效扩增和活化NK细胞，从而获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节相关疾病的治疗中具有显著疗效。根据本发明的高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法，其由细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子构成，用于大量培养扩增自体活化的NK细胞，其特征在于，所述添加因子包含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和抗CD3抗体。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种杀伤能力大于90％的新型的用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；
本发明的目的之二在于提供一种培养规模达到20L且可平行放大用于规模化生产的用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；
本发明的目的之三在于提供一种能实现NK细胞短时间内爆发性增殖的用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法。
第一方面，本发明提供一种用于NK细胞体外扩增的培养基，按体积百分含量包括如下组分：淋巴细胞无血清培养基100％或RPMI1640培养基1～90％和淋巴细胞无血清培养基10～99％的混合物，以及血清替代物和白介素2；其中，所述血清替代物的浓度为0.5～4g/L，例如可以是0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、3.9g/L或4g/L，所述白介素2的浓度为50～500μg/mL，例如可以是50μg/mL、51μg/mL、52μg/mL、53μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、58μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、180μg/mL、200μg/mL、220μg/mL、240μg/mL、250μg/mL、280μg/mL、300μg/mL、320μg/mL、350μg/mL、380μg/mL、400μg/mL、420μg/mL、450μg/mL、480μg/mL或500μg/mL。
本发明中，白介素2的作用是刺激淋巴细胞的生长，血清替代物、淋巴细胞无血清培养基以及RPMI1640培养基的作用均为供给和补充细胞营养物质。
优选地，所述培养基按体积百分含量包括如下组分：淋巴细胞无血清培养基：40～50％和RPMI1640培养基：50～60％，以及血清替代物和白介素2。
优选地，所述血清替代物的浓度为1～3g/L。
优选地，所述白介素2的浓度为200～300μg/mL。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的培养基进行NK细胞体外扩增的方法，包括制备跨膜结合蛋白为白介素15或白介素21的K562细胞的步骤，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联。
本发明K562细胞的跨膜结合蛋白与膜蛋白的序列连接方式采用2A方式串联，而现有技术均采用病毒相连，使得本发明在临床细胞制备和应用上更安全。其中，CD137L能与T细胞的CD137特异性结合，刺激分泌IFN-，从而刺激淋巴细胞的增殖；CD19能提升NK细胞活性，激活NK细胞靶向功能；CD64和CD86起到诱导NK细胞增殖的作用。
在本发明中，制备所述K562细胞的具体步骤如下：
(1)人工合成GM-CSF序列、IL-21/15序列、CD4序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列，并将IL-21/15序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列通过2A序列串联，插入到带有抗生素标记的真核表达载体中；
(2)将步骤(1)得到的真核表达载体测序，正确后进行纯化，再与带有转座酶的质粒共转染到K562细胞中，加入抗生素进行加药处理，获得阳性转染细胞；
(3)将步骤(2)得到的阳性转染细胞再加入抗生素进行加药处理，流式细胞仪分选，获得高纯度转染K562细胞；
(4)再经过加药处理和5～20次的流式细胞仪分选，获得100％阳性转染的K562细胞，阳性细胞经稳定传代20代以上，获得基因组整合外源基因的稳定转染细胞系；
(5)将步骤(4)获得的稳定转染细胞系再进行流式细胞仪分选，获得基因组整合外源基因高表达的稳定转染细胞系。
作为优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(2)将所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体与外周血单个核细胞共培养；
任选地，步骤(2’)：将所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体、步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中，添加所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞。
优选地，所述CD16单克隆抗体的浓度为20～40ng/mL，例如可以是20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL、27ng/mL、28ng/mL、29ng/mL、30ng/mL、31ng/mL、32ng/mL、33ng/mL、34ng/mL、35ng/mL、36ng/mL、37ng/mL、38ng/mL、39ng/mL或40ng/mL。若浓度小于20ng/mL，会导致NK细胞的纯度下降；若浓度大于40ng/mL，一方面会增加成本，另一方面也会导致获得的NK细胞数量下降。
优选地，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个，例如可以是1.5×107个、2.0×107个、2.5×107个、3.0×107个、3.5×107个、4.0×107个、4.5×107个或5.0×107个。若外周血单个核细胞的个数小于1.5×107个，会导致同等条件下扩增规模和扩增量无法实现；若大于5.0×107个，会增加试剂的消耗，而对最终产量和质量无明显的影响，因此本发明实现了以更少的外周血单个核细胞获取相同数量和质量NK细胞，而目前其他方法的外周血单个核细胞初始量必须大于5.0×107个。
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。若外周血单个核细胞的密度小于1.0×106个/mL，会导致所述方法的效果不稳定；若大于3.0×106个/mL，虽然细胞个数增加，试剂消耗也相应增加，但NK细胞最终的产量和质量无变化，造成药品和资源的浪费。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。密度过小会造成所述方法的工艺不稳定，密度过大会造成成本过高，浪费药品和试剂。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，例如可以是1:2、1.1:2、1.2:2、1.3:2、1.4:2、1.5:2、1.6:2、1.7:2、1.8:2、1.9:2、2:2、2.1:2、2.2:2、2.3:2、2.4:2、2.5:2、2.6:2、3:2、3.5:2、4:2或5:2，更优选为2:1。若该数量比小于1:2，无法刺激诱导NK细胞的增殖；若数量比大于5:2，则增加成本，浪费资源。
优选地，所述共培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃，更优选为39℃。若培养温度低于35℃，导致细胞生长缓慢，不利于其增殖；若大于40℃，会造成细胞死亡。
优选地，所述共培养时二氧化碳的水平为5～10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％，更优选为5％。若二氧化碳的水平超过此范围，会对细胞生长造成不利影响，导致细胞增殖缓慢甚至死亡。
优选地，所述共培养的仪器为二氧化碳培养箱。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2)将NK细胞培养基、鼠抗人CD16单克隆抗体与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的第3和第6天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(4)在培养的第7天添加步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(5)在培养的第8、第10和第12天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(6)从培养的第13天开始，每天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(7)在第15或16天离心收集NK细胞。
任选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)制备跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2’)将NK细胞培养基、鼠抗人CD16单克隆抗体、步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3’)在培养的第3和第6天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(4’)在培养的第7天添加步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(5’)在培养的第8、第10和第12天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(6’)从培养的第13天开始，每天添加NK细胞培养基和鼠抗人CD16单克隆抗体；
(7’)在第15或16天离心收集NK细胞。
作为优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将所述NK细胞培养基与外周血单个核细胞共培养；任选地，
步骤(2’)：将所述NK细胞培养基、步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中，添加所述NK细胞培养基和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞。
优选地，步骤(2)、步骤(2’)和步骤(3)同时另外加入CD16单克隆抗体。
优选地，所述CD16单克隆抗体的浓度为20～40ng/mL，例如可以是20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL、27ng/mL、28ng/mL、29ng/mL、30ng/mL、31ng/mL、32ng/mL、33ng/mL、34ng/mL、35ng/mL、36ng/mL、37ng/mL、38ng/mL、39ng/mL或40ng/mL。
优选地，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个，例如可以是1.5×107个、2.0×107个、2.5×107个、3.0×107个、3.5×107个、4.0×107个、4.5×107个或5.0×107个。
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，例如可以是1:2、1.1:2、1.2:2、1.3:2、1.4:2、1.5:2、1.6:2、1.7:2、1.8:2、1.9:2、2:2、2.1:2、2.2:2、2.3:2、2.4:2、2.5:2、2.6:2、3:2、3.5:2、4:2或5:2，更优选为2:1。
优选地，所述共培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃，更优选为39℃。
优选地，所述共培养时二氧化碳的水平为5～10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％，更优选为5％。
优选地，所述共培养的仪器为二氧化碳培养箱。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2)将NK细胞培养基与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的第3和第6天添加NK细胞培养基；
(4)在培养的第7天添加步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(5)在培养的第8、第10和第12天添加NK细胞培养基；
(6)从培养的第13天开始，每天添加NK细胞培养基；
(7)在第15或16天离心收集NK细胞；
任选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2’)将NK细胞培养基、步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3’)在培养的第3和第6天添加NK细胞培养基；
(4’)在培养的第7天添加步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(5’)在培养的第8、第10和第12天添加NK细胞培养基；
(6’)从培养的第13天开始，每天添加NK细胞培养基；
(7’)在第15或16天离心收集NK细胞。
作为优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将人血浆、淋巴细胞无血清培养基与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中添加淋巴细胞无血清培养基和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞；
任选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2’)将人血浆、淋巴细胞无血清培养基、外周血单个核细胞和步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞共培养；
(3’)在培养的后续过程中添加淋巴细胞无血清培养基和与步骤(2’)中所加入的相同的K562细胞；
(4’)离心，收集NK细胞。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21或白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，例如可以是1:2、1.1:2、1.2:2、1.3:2、1.4:2、1.5:2、1.6:2、1.7:2、1.8:2、1.9:2、2:2、2.1:2、2.2:2、2.3:2、2.4:2、2.5:2、2.6:2、3:2、3.5:2、4:2或5:2，更优选为2:1。
优选地，所述人血浆的体积百分含量为1～15％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。
优选地，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个，例如可以是1.5×107个、2.0×107个、2.5×107个、3.0×107个、3.5×107个、4.0×107个、4.5×107个或5.0×107个。
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL，例如可以是1.0×106个/mL、1.2×106个/mL、1.4×106个/mL、1.6×106个/mL、1.8×106个/mL、2.0×106个/mL、2.2×106个/mL、2.4×106个/mL、2.6×106个/mL、2.8×106个/mL或3.0×106个/mL。
优选地，所述细胞培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃，更优选为39℃。
优选地，所述细胞培养时二氧化碳的水平为5～10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％，更优选为5％。
优选地，所述细胞培养的仪器为二氧化碳培养箱。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2)将无血清培养基与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的第3和第6天添加无血清培养基；
(4)在培养的第7天添加步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(5)在培养的第8、第10和第12天添加无血清培养基；
(6)从培养的第13天开始，每天添加无血清培养基至所述培养基体积为4L；
(7)在第15或16天离心收集NK细胞。
任选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联；
(2’)将无血清培养基、步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3’)在培养的第3和第6天添加无血清培养基；
(4’)在培养的第7天添加与步骤(2’)所加入的相同的K562细胞；
(5’)在培养的第8、第10和第12天添加无血清培养基；
(6’)从培养的第13天开始，每天添加无血清培养基至所述培养基体积为4L；
(7’)在第15或16天离心收集NK细胞。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明公开了采用体外刺激培养和规模化扩增NK细胞的方法，通过对培养技术和培养体系的改良，以哺乳动物外周血/脐带血单个核细胞为原始材料，采用自制的带有刺激因子白介素15/白介素21的K562细胞、白介素2、CD16单克隆抗体及无血清培养体系下进行体外刺激培养及大规模扩增培养。
(2)本发明的K562细胞的跨膜结合蛋白与膜蛋白的序列连接方式采用的是2A串联，不同于现有技术的病毒相连，因此在临床诊断上更加安全。本发明的培养规模可达20L，在短时间内实现NK细胞的爆发性增殖：经21天体外扩增培养后的NK细胞扩增倍数大于1.0×104，具有高活性的NK细胞的数量高于1.0×1012个，纯度大于90％，对于肿瘤细胞的杀伤能力大于90％，且并未由于传代次数的增加而降低其细胞毒性作用的发挥。
(3)本发明的方法制备的NK细胞可进一步平行放大用于规模生产，用于恶性肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病和移植后排斥反应及移植物抗宿主病等各类疾病的治疗，同时可以增加移植物抗白血病的作用，全面解决高纯度NK细胞标准化和规模扩增等问题；还解决了由于供体或自体血浆不稳定导致的NK细胞制备工艺的难题，制备出的NK细胞适合长期冻存，即时复苏即可使用；还可结合患者实际需要，实现一次采集，并在不同地点和不同时间多疗程使用。
(4)在降低患者采集对身体的影响和患者应用便利程度、安全性、单疗程回输总量和质量控制方面，本发明的方法培养的NK细胞均优于现有技术制备的免疫细胞；不仅达到了三类医疗技术应用的要求，还达到了体细胞治疗药物质量控制的要求，降低了培养过程中材料的成本和临床应用上的成本。
附图说明
图1(A)为实施例4扩增的细胞形态图(10×显微镜)，图1(B)为普通的T淋巴细胞形态图(10×显微镜)；
图2为实施例4扩增的NK细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明的实施例采用如下试剂和耗材进行试验：
淋巴细胞无血清培养基NOBIMPEX05(N105-1000)(德国NOB公司)、淋巴细胞无血清培养基NOBIMPEX06(N106-60)(德国NOB公司)、血清替代物(Pall15950-017Ultroser)、白介素2(北京双鹭药业，100万IU/瓶)、HycloneRPMI-1640培养基(Thermofisher)、淋巴细胞无血清培养基X-VIVO15(Lonza)和CD16单克隆抗体(美国BD公司)；T75细胞培养瓶(NUCK)、T175细胞培养瓶(NUCK)、低吸附细胞培养板(CORNING)、细胞培养袋GT-T610A(Takara)和移液管(NUCK)。
本发明的实施例采用如下设备进行试验：
生物安全柜(Thermo)、ThermoScientificSorvallST16/16R台式高性能离心机、二氧化碳培养箱(Thermo，3111)、倒置生物显微镜(Motic，AE-31)、自动细胞计数仪(Invitrogen，Countess)、移液器(Thermo)和GEWAVE波浪生物反应器。
实施例1K562细胞的制备
本实施例采用以下方法制备K562细胞：
(1)人工合成GM-CSF序列、IL-21/15序列、CD4序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列，并将IL-21/15序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列通过2A序列串联，插入到带有抗生素标记的真核表达载体中；
(2)将步骤(1)得到的真核表达载体测序，正确后进行纯化，再与带有转座酶的质粒共转染到K562细胞中，加入抗生素进行加药处理，获得阳性转染细胞；
(3)将步骤(2)得到的阳性转染细胞再加入抗生素进行加药处理，流式细胞仪分选，获得高纯度转染K562细胞；
(4)再经过加药处理和5～20次的流式细胞仪分选，获得100％阳性转染的K562细胞，阳性细胞经稳定传代20代以上，获得基因组整合外源基因的稳定转染细胞系；
(5)将步骤(4)获得的稳定转染细胞系再进行流式细胞仪分选，获得基因组整合外源基因高表达的稳定转染细胞系。
将制备的K562细胞进行质量标准测试，结果符合标准(如表1所示)，可以进行后续使用。
表1跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞质量标准
实施例2培养基的制备
将166.7μg白介素2用1mL淋巴细胞无血清培养基充分混合溶解得混合溶液，然后取所述混合溶液300μL加入到900mL淋巴细胞无血清培养基中，得到混合液A；
将0.4g血清替代物加入100mL淋巴细胞无血清培养基中，经漩涡混合器重悬溶解后，加入混合液A，即获得用于NK细胞体外扩增的培养基，密封后在2～8℃保存备用。
实施例3培养基的制备
将1.67mg白介素2用1mL淋巴细胞无血清培养基充分混合溶解得混合溶液，然后取所述混合溶液300μL加入到900mL淋巴细胞无血清培养基中，得到混合液B；
将5g血清替代物加入100mL的RPMI1640培养基中，经漩涡混合器重悬溶解后，加入混合液B，即获得用于NK细胞体外扩增的培养基，密封后在2～8℃保存备用。
实施例4NK细胞的扩增
本实施例采用如下步骤进行NK细胞的培养：
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将无病毒污染的新鲜血液(志愿提供)50mL进行离心，收集血清储存，加入淋巴细胞分离液，将人外周血单个核细胞(PBMC)分离出来，共收集PBMC4.0×107个(其中NK细胞2.0～4.0×106个)；
(3)将PBMC稀释为浓度1.0×106个/mL与跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞和本发明的培养基混合加入T75方瓶中培养；
(4)在培养的第3和第6天添加本发明的培养基，加入的总体积为步骤(3)中总体系体积的50％；
(5)在培养的第7天进行计数，结果为1.0×108个NK细胞；随后加入本发明的培养基，以及6×107个跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞，重悬后以NK细胞浓度为1.0×106个/mL的条件下将所有培养体系加入细胞培养袋中；
(6)第8天补加1/2体积的本发明的培养基，第10天补加2/3体积本发明的培养基，第11天补加2/3体积本发明的培养基，第12天补加3/4体积本发明的培养基，第12天补加3/4体积本发明的培养基，第13天补加3/4体积本发明的培养基，第14天将培养液分至2倍体积的细胞培养袋培养中(其中包括1倍体积本发明的培养基)，第15天补加2/3体积本发明的培养基，第16天补加2/3体积本发明的培养基并离心收获细胞。
实施例5NK细胞的扩增
本实施例采用如下步骤进行NK细胞的培养：
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将无病毒污染的新鲜血液(志愿提供)30mL进行离心，收集血清储存，加入淋巴细胞分离液，将人外周血单个核细胞(PBMC)分离出来，共收集PBMC3.0×107个(其中NK细胞1.5～3.0×106个)；
(3)将PBMC稀释为浓度1.0×106个/mL与本发明的培养基混合加入T75方瓶中培养；
(4)在培养的第3和第6天添加本发明的培养基，加入的总体积为步骤(3)中总体系体积的50％；
(5)在培养的第7天进行计数，结果为0.6×108个NK细胞；随后加入本发明的培养基，以及8×107个跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞，重悬后以NK细胞浓度为1.0×106个/mL的条件下将所有培养体系加入细胞培养袋中；
(6)第8天补加1/2体积的本发明的培养基，第10天补加2/3体积本发明的培养基，第11天补加2/3体积本发明的培养基，第12天补加3/4体积本发明的培养基，第12天补加3/4体积本发明的培养基，第13天补加3/4体积本发明的培养基，第14天将培养液分至2倍体积的细胞培养袋培养中(其中包括1倍体积本发明的培养基)，第15天补加2/3体积本发明的培养基并离心收获细胞。
实施例6NK细胞的扩增
(1)制备跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将无病毒污染的新鲜血液(志愿提供)30mL进行离心，收集血清储存，加入淋巴细胞分离液，将人外周血单个核细胞(PBMC)分离出来，共收集PBMC2.1×107个(其中NK细胞0.3～0.4×106个)；
(3)将PBMC稀释为浓度1.0×106个/mL与本发明的培养基混合加入T75方瓶中培养；其他步骤与实施例2相同，仅把本发明的培养基替换为本发明的培养基(加入CD16单克隆抗体，使其终浓度为30ng/mL)。
实施例7NK细胞的扩增
与实施例3相同，仅把跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞替换为跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞。
实施例8NK细胞的扩增
与实施例4相同，仅在步骤(3)中的培养体系中添加跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞。
实施例9NK细胞的扩增
与实施例5相同，仅把扩增培养体系更换为NOBIMPEX06完全培养基。
对实施例4～9扩增的NK细胞进行检测，结果如表1所示。
表1
图1(A)-(B)为实施例4扩增的细胞形态图和普通T淋巴细胞形态图，可以看出，在相同放大倍数下，实施例4扩增出的细胞比T淋巴细胞小，而且呈分散式悬浮生长；说明其扩增出的细胞是NK细胞而不是T淋巴细胞，说明本发明的培养基和培养方法可以进行NK细胞的扩增。
图2为实施例4扩增的NK细胞生长曲线，可以看出NK细胞数量随培养时间延长而增多，其中，培养0～10h时细胞数量基本无变化，10～20h时细胞数量呈爆发式增长，说明本发明的培养基及培养方法确实能提供NK细胞良好的扩增环境，实现短时间内的快速增殖。
NK细胞对肝脏肿瘤细胞株SMMC-7721的杀伤性测试：将实施例4制备的NK细胞(即效应细胞)与肝脏肿瘤细胞株SMMC-7721(即靶细胞)按照5:2的数量比混合，在37℃条件下放入二氧化碳培养箱孵育4h，加入甲基偶氮唑盐(MTT)再孵育4小时，在570nm波长下测OD值并计算杀伤率，公式为：
杀伤率(％)＝[1-(效应细胞OD+靶细胞孔OD-效应细胞孔OD)/靶细胞孔OD]×100％
测试结果显示，NK细胞对肝脏肿瘤细胞株SMMC-7721的杀伤率为85％。
从以上各项结果可以看出，利用本发明的培养基及方法能够在短时间内实现NK细胞的爆发性增殖，经21天体外扩增培养后的NK细胞扩增倍数大于1.0×104，具有高活性的NK细胞的数量高于1.0×1012个，纯度大于90％，对于肿瘤细胞的杀伤能力大于90％；制备的NK细胞复苏性良好，可以长期保存。本发明制备的NK细胞可用于恶性肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病和移植后排斥反应及移植物抗宿主病等各类疾病的治疗，同时可以增加移植物抗白血病的作用，全面解决高纯度NK细胞标准化、规模扩增问题和成品NK细胞不能长期储存等问题；在临床方面，不仅达到了三类医疗技术应用的要求，还达到了体细胞治疗药物质量控制的要求，降低了培养过程中材料的成本和临床应用上的成本。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于NK细胞体外扩增的培养基，其特征在于，按体积百分含量包括如下组分：淋巴细胞无血清培养基100％或RPMI1640培养基1～90％和淋巴细胞无血清培养基10～99％的混合物，以及血清替代物和白介素2；
其中，所述血清替代物的浓度为0.5～4g/L，所述白介素2的浓度为50～500μg/mL。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，按体积百分含量包括如下组分：淋巴细胞无血清培养基：40～50％和RPMI1640培养基：50～60％，以及血清替代物和白介素2；
优选地，所述血清替代物的浓度为1～3g/L；
优选地，所述白介素2的浓度为200～300μg/mL。
3.一种利用权利要求1或2所述的培养基进行NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，包括制备跨膜结合蛋白为白介素15或白介素21的K562细胞的步骤，所述K562细胞包括引导肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽；所述分子膜定位蛋白为CD4；所述膜蛋白为CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜结合蛋白与膜蛋白的相应序列通过2A序列串联。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(2)将所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体与外周血单个核细胞共培养；任选地，
步骤(2’)：将所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体、步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中，添加所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CD16单克隆抗体的浓度为20～40ng/mL；
优选地，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个；
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，更优选为2:1；
优选地，所述共培养的温度为35～40℃，更优选为39℃；
优选地，所述共培养时二氧化碳的水平为5～10％，更优选为5％；
优选地，所述共培养的仪器为二氧化碳培养箱。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将所述NK细胞培养基与外周血单个核细胞共培养；任选地，
步骤(2’)：将所述NK细胞培养基、步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中，添加所述NK细胞培养基和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(2’)和步骤(3)同时另外加入CD16单克隆抗体；
优选地，所述CD16单克隆抗体的浓度为20～40ng/mL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个；
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，更优选为2:1；
优选地，所述共培养的温度为35～40℃，更优选为39℃；
优选地，所述共培养时二氧化碳的水平为5～10％，更优选为5％；
优选地，所述共培养的仪器为二氧化碳培养箱。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2)将人血浆、淋巴细胞无血清培养基与外周血单个核细胞共培养；
(3)在培养的后续过程中添加淋巴细胞无血清培养基和步骤(1)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(4)离心，收集NK细胞；
任选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)制备所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞；
(2’)将人血浆、淋巴细胞无血清培养基、外周血单个核细胞和步骤(1’)所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞共培养；
(3’)在培养的后续过程中添加淋巴细胞无血清培养基和与步骤(2’)中所加入的相同的K562细胞；
(4’)离心，收集NK细胞。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述跨膜结合蛋白为白介素21的K562细胞密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述跨膜结合蛋白为白介素21或白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞的数量比为(1～5)：2，更优选为2:1；
优选地，所述人血浆的体积百分含量为1～15％；
优选地，所述外周血单个核细胞的个数为1.5～5.0×107个；
优选地，所述外周血单个核细胞的密度为1.0～3.0×106个/mL；
优选地，所述细胞培养的温度为35～40℃，更优选为39℃；
优选地，所述细胞培养时二氧化碳的水平为5～10％，更优选为5％；
优选地，所述细胞培养的仪器为二氧化碳培养箱。
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