CN105018423A - Cik细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CIK细胞培养方法。本发明采用新因子体系进行CIK细胞培养，细胞扩增比例超过使用传统扩增方法所获得的比例，且因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了培养效果的稳定性。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
Description
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种CIK细胞培养方法。
背景技术
随着肿瘤免疫学的发展，越来越多的研究表明，杀伤细胞过继免疫治疗对于消除残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的重建具有良好的效果，并逐步成为化学治疗和造血干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。CIK 细胞是 1991 年 schmidt wolf 等报道的一类由多种细胞因子诱导的杀伤免疫活性细胞CIK 细胞表面同时表达有 CD3+分子和 CD56+分子，所以兼有T 淋巴细胞较强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物限制性（MHC）杀瘤优点，其效应细胞为 CD3+CD56+细胞，是具有不同特异性的T 细胞受体的异质群体，具有非 MHC 限制的溶细胞活性对肿瘤细胞。
CIK细胞是一群来源于血液T细胞的异质性细胞群体，通过穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒作用和增强IL-12、IFN-γ等细胞因子的作用来杀伤肿瘤细胞。
于1991年建立的由IL-1、IL-2、IFN-γ、Anti-CD3Ab等细胞因子组成的“经典”的CIK扩增方案目前已被全球众多的研究者所采纳。近年以此为基础，一些其他的细胞因子也开始被尝试用于扩增CIK细胞，如Anti-CD28、IL-15、IL-24、SCF、FLT3L等。
白细胞介素 15（IL-15）的生物学作用与 IL-2 相似，是维持和促进效应 T 淋巴细胞的增殖的细胞因子，研究总结了 IL-15 生物学特性：诱导 T、B 和自然杀伤（NK）细胞的分化和增殖；增强 CD8+T 细胞的细胞溶解活性；诱导产生持久的抗原刺激 CD8+ CD44hi 记忆性 T 细胞；刺激 B 细胞的分化和免疫球蛋白的合成；诱导树突状细胞的成熟，但无刺激免疫调节性 T 细胞（Treg 细胞）活性。另有研究表明，IL-15 在机体内自身也具有强大的抗肿瘤作用，而不需要通过 NK 细胞和 CD8+细胞介导。
IL-21 是 IL-2 细胞因子家族最新发现的成员，分子结构与 IL-15 相似，参与调节 B 细胞增殖，协同 IL-15 促进骨髓前体细胞增殖和 NK 细胞增殖、分化和细胞毒活性，由活化的 CD4+T 细胞分泌，利用携带 IL-21 基因的慢病毒转染至 CIKs 细胞内，可以增加 CIK 细胞 IL-21R、穿孔素、颗粒酶 B、FasL、IFN-γ及 TNF-α 的分泌及表达，主要是激活 JAK-STAT 信号转导途径来提高 CIK 细胞的抗白血病活性。
发明内容
本发明的目的是：提供一种CIK细胞培养方法，它的细胞扩增比例高，成本低廉，稳定性好。
本发明是这样实现的：CIK细胞培养方法，从已经取得的外周血100ml中，用生理盐水悬浮的方式分离出单个核细胞，并种植于T75培养瓶中，加入20mlAIM-V培养基，再加1000u/ml IFN-γ，在体积浓度为5%的CO2，37℃下的恒温培养箱培养24小时；再加 100ng/ml 单克隆抗体 CD3及500u/ml IL-2 ，继续培养3-5天；每隔 2 天补加 500u/ml IL-2，同时加50ng/ml 的 IL-15，或加 100ng/ml 的 IL-21，或加25ng/ml 的IL-15 及50ng/ml 的 IL-21；扩增至第 10 天收获 CIK 细胞。
所述的培养过程中，每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细胞因子。
由于采用了以上技术方案，本发明采用新因子体系进行CIK细胞培养，细胞扩增比例超过使用传统扩增方法所获得的比例，且因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了培养效果的稳定性。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
附图说明，
图 1不同细胞因子对外周血 T 淋巴细胞增殖作用，
具体实施方式，
本发明的实施例1：CIK细胞培养方法，
1、分离外周血单个核细胞（PBMC），
用 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法从已获取的外周血中分离出 PBMC，加同外周血同体积生理盐水 1:1混合，取出稀释血缓慢加入含有 15ml Ficoll-Hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）的 50ml 离心管中（将离心管倾斜 45°，在Ficoll-Hypaque 液面以上 1cm 处缓慢加入，注意不要打乱液面界面，两者比例为1:1，将离心机温度设为室温，加速度为最低，2000rpm 离心 18min），用枪头轻轻插入到单个核细胞层（一薄层白膜），沿着管壁小心地准确吸取该层细胞转移到另一支 50ml 离心管中；加入生理盐水 定容至45ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤 2 次，除去血小板和分离介质。
2、CIK 细胞的体外诱导和扩增，
第 0 天，生理盐水悬浮的分离出 PBMC，再用 CIK 初始培养液调整细胞浓度为 5×105 cell /ml，种植于 24 孔板中，每孔 200ul，加 RPMI1640 培养液，加 1000u/ml IFN-γ，5%CO2、37℃恒温培养箱中培养；24 小时后加 100ng/ml 多克隆抗体 CD3及500u/ml IL-2 ；培养 4 天后调整细胞浓度为 1×106cell/ml, 每隔 2 天补加 500u/ml IL-2（对照组），同时 IL-15 组加50ng/ml 的 IL-15，IL-21 组加 100ng/ml 的 IL-21，IL-15+IL-21 组加入 25ng/ml 的IL-15 和 50ng/ml 的 IL-21；每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细胞因子；每次补液前细胞计数板计数，照此法扩增至第 10 天收获 CIK 细胞。
苔盼蓝血球计数板细胞计数法，
用生理盐水吹打均匀的CIK细胞，吸出少量细胞悬液加入1.5mlEP管中，用移液枪吸出20ul加入新EP管中，再取20ul0.2%苔盼蓝混合吹打3次。再用移液枪吸取20ul混合液注入细胞计数板，将细胞计数板插入细胞计数仪中，记录细胞总数、活细胞数及细胞活率。
3、流式细胞仪检测细胞表型，
1）CIK 细胞培养第 10 天时，24 孔板每孔细胞用枪头吹打均匀后，分别收集至 15ml 离心管中混匀，编号对照组、IL-15 组、IL-21 及联合组；
2）分别取 50ul 至 1.5ml EP 管中，在管底部分别加入 10ul PerCP-CD3/ FITC-CD4/PE-CD8 三色直标荧光抗体、2.5ul APC-CD56 直标荧光抗体及 PBS 缓冲液使反应体系为 100ul；
3）常温避光孵育 20min；
4）1ml 过滤后的 PBS 缓冲液或鞘液洗 2 次，以去除未结合的抗体，1500g离心 5min，每次离心后小心吸取上清。上机进行细胞表型检测。
4、CIK 细胞的增殖，
在 CIK 细胞培养的第 1-2 天，细胞增殖活化尚不明显，且细胞浓度有所下降。
在加入 IL-2（对照组）及 IL-15、IL-21（实验组）后细胞开始明显活化增殖，光镜下可见细胞悬浮成簇、成团增长，细胞培养的第 10 天时，
CIK 细胞活力达 90%以上；CIK 细胞数量的对照组（7.83±1.18）×105，IL-15 组（26.0±9.86）×105/ml，IL-21 组（14.58±1.81）×105/ml，联合组（11.53±1.70）×105/ml，CIK 细胞培养 10 天计数实验组细胞数均高于对照组细胞数，差异有统计学意义（P<0.05），且 IL-15 组高于 IL-21 组及联合组（P<0.05），IL-21 组高于联合组
表 1 不同细胞因子对外周血 T 淋巴细胞增殖作用（105/mlx ±s）
图1中，*与对照组相比，P<0.05，
单纯 IL-15、IL-21 及两者联合体外培养诱导 CIK 细胞时，均能提高细胞数量，同时在单纯 IL-15 较 IL-21 及联合对 CIK 细胞增殖作用有更大的优势（P<0.05），单纯IL-21 扩增 CIK 细胞作用优于两者联合（P<0.05）。
结论，
（1）IL-15、IL-21 单独及联合应用均能促进 CIK 细胞的增殖，且 IL-15 对CIK 细胞体外培养的增殖作用优于 IL-21 和两者联合。
本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (2)
1.一种CIK细胞培养方法，其特征在于：从已经取得的外周血100ml中，用生理盐水悬浮的方式分离出单个核细胞，并种植于T75培养瓶中，加入20mlAIM-V培养基，再加1000u/ml IFN-γ，在体积浓度为5%的CO2，37℃下的恒温培养箱培养24小时；再加 100ng/ml 单克隆抗体 CD3及500u/ml IL-2 ，继续培养3-5天；每隔 2 天补加 500u/ml IL-2，同时加50ng/ml 的 IL-15，或加 100ng/ml 的 IL-21，或加25ng/ml 的IL-15 及50ng/ml 的 IL-21；扩增至第 10 天收获 CIK 细胞。
2.根据权利要求1所述的CIK细胞培养方法，其特征在于：所述的培养过程中，每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细胞因子。
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