CN103756961A - 一种体外诱导扩增nkt细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，该方法由以下步骤组成：a.改造白血病细胞株K562，使其表达CD1d、anti-CD28MAb，筛选得到表达CD1d、anti-CD28MAb的稳定细胞株；b.用稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞培养NKT细胞。本发明稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株，其表面表达CD1d分子，限制性的递呈α-GalCer给NKT细胞，能够充分刺激NKT细胞增殖，其表面表达的anti-CD28MAb是协同刺激信号CD28的单克隆抗体，提供了NKT细胞增殖的活化信号；能够提供同DC细胞一致的CD1d分子，且能够大量繁殖，从而避免了DC细胞不能增殖的缺陷，大大提高了NKT细胞增殖的高效率；稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞共培养的NKT细胞分泌IFN-γ的能力更强，从而作用于NK细胞、DC细胞和CD8+T细胞。
Description
[技术领域]
本发明涉及一种免疫学领域，具体是指一种体外诱导扩增NKT细胞的方法。
[背景技术]
自然杀伤T细胞（NKT细胞）是继T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）之后又一类新型的T淋巴细胞，属于第4类免疫细胞。作为一种新型的免疫调节细胞，NKT细胞既表达T细胞的表面标志，又表达NK细胞的表面标志，NKT细胞具有细胞毒性和免疫调节作用。近几年在其表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗等方面的研究有了很大进展。
NKT细胞最显著的特征是其表达的TCR和NK细胞的激活受体，NKT细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在外脐血中也有NKT细胞。NKT细胞最佳刺激效应物是α半乳糖神经酰胺（glycolipid α-galactosylceramide，α-GalCer），是一类来源于海绵体或者共生微生物的的提取物。最近，许多内源性的哺乳动物自身的脂质体也是CD1d的配体，能被NKT识别。
在细胞毒方面，NKT细胞在自身配体及合成配体的刺激下，其表面的IL-12受体活化，刺激DC细胞分泌大量的IL-12，并促使未成熟DC细胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌IFN-γ，同时IFN-γ作用于NK细胞促使NK细胞亦分泌大量的穿孔素，DC细胞分泌的IL-12作用于初始CD4T细胞，使其向Thl极化，上述因素共同作用而介导某些病毒感染、胞内寄生菌感染的靶细胞和肿瘤靶细胞发生溶解破坏；也可通过表达FasL,经Fas/FasL途径使上述靶细胞发生凋亡。在免疫调节作用方面：活化NKT细胞可分泌IL-4和IFN-γ等细胞因子。IL-4可诱导CD4+Th0细胞向CD4+Th2细胞分化，参与体液免疫应答或超敏反应；IFN-γ与IL-12协同作用,可使CD4+Th0细胞向CD4+Thl细胞分化，增强细胞免疫应答。此外NKT细胞还可分泌多种趋化性细胞因子等参与炎症反应。
总之，NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞，在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中具有远大的应用前景。
[发明内容]
为了解决现有技术中的不足，本发明提供一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，该方法诱导扩增出的NKT细胞分泌细胞因子水平高，杀瘤活性高。
为实现上述目的，设计一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
a.改造白血病细胞株K562，使其表达CD1d、anti-CD28Mab：用淋巴细胞分离液分离初外周血单个核细胞（PBMC），采用RT-PCR方法分别从人PBMC中扩增CD1d、anti-CD28MAb cDNA,测序正确后，CD1d、anti-CD28MAb基因分别克隆至含有不同筛选标记的2种真核表达载体，先后转染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建K562稳定细胞株。（K562-CD1d-anti-CD28 MAb）；
b.用100Gy γ射线辐照K562稳定细胞株，用含有IL-2、IL-15和α-Galcer的培养基调整人外周血单个核细胞（PBMC）细胞浓度至1×106/ml，两种细胞混匀后置于37℃、5%的CO2培养箱中培养；每3～4天进行补液及传代，第12天收获细胞。
所述的K562稳定细胞株浓度∶外周血单个核细胞=1-4∶1。
步骤（b）中，IL-2的浓度为50U/ml。
步骤（b）中，IL-15的浓度为50ng/ml。
步骤（b）中，α-Galcer的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
与常规方法比较仅使用NKT培养液培养的NKT细胞相比，本发明的方法有以下优点：稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞在α-GalCer存在的情况下可促进NKT细胞大量扩增，其效果明显优于单独用α-GalCer。
与常规仅使用α-GalCer培养NKT细胞的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点：
1.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株，其表面表达CD1d分
子，限制性的递呈α-GalCer给NKT细胞，能够充分刺激NKT细胞增殖；
2.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株，其表面表达的anti-CD28MAb是协同刺激信号CD28的单克隆抗体，提供了NKT细胞增殖的活化信号；
3.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株能够提供同DC细胞一致的CD1d分子，且能够大量繁殖，从而避免了DC细胞不能增殖的缺陷，大大提高了NKT细胞增殖的高效率；
4.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞共培养的NKT细胞分泌IFN-γ的能力更强，从而作用于NK细胞、DC细胞和CD8+T细胞。
[具体实施方式]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
机采PBMC，将采集的血样转至离心管；700g，10min离心，吸取上层血浆培养时备用；血样标本还原至原体积，混匀；稀释血缓慢加在Ficoll上，离心力900g，离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次；用100Gy γ射线辐照K562稳定细胞株，用含有50U/ml IL-2、50ng/ml IL-15和100ng/mlα-Galcer的培养基调整人外周血单个核细胞（PBMC）细胞浓度至1×106/ml，两种细胞混匀后置于37℃、5%的CO2培养箱中培养；
每3～4天进行补液及传代，每天观察细胞的生长和死亡情况，第12天收获细胞；
实施例2
两组培养方法NKT细胞增殖倍数的比较：
分别取α-GalCer单独培养和稳定表达CD1d、anti-CD28 MAb的K562细胞与α-GalCer共培养组的NKT细胞，100ul加入FITC标记的TCRVβ11单克隆抗体，避光孵育20min，加入0.3mlPBS，测定人外周血培养的NKT细胞扩增后效应细胞的比较（如表一所示）。
表一 两种培养方法NKT细胞扩增后效应细胞的扩增比较
实施例3
两组培养方法的NKT细胞体外杀伤活性的比较
取靶细胞K562（肿瘤细胞株没有任何改造）细胞离心，调整靶细胞的密度为1×105个/mL，收集两种方法培养的NKT细胞离心，使效靶比分别为10∶1和20∶1和40∶1，每组设置3个复孔，37℃、5%，CO2培养箱中孵育24h，加入MTT试剂20μl/孔，37℃孵育4h，再加入二甲基亚砜100μl/孔，37℃孵育2h，待充分溶解沉淀后于酶联免疫检测仪(波长570nm)检测吸光度(A)，计算杀伤率。计算公式为：
杀伤率(%)=[1-(A实验孔-A效应孔/A靶细胞孔)]×100%
结果显示，在相同效靶比条件下，实验组的杀伤率明显优于常规组，差异有统计学意义（P<0.01）。如表二所示：
表二 两种培养方法NKT细胞体外杀伤活性对比
实施例4
流式检测两组细胞中细胞因子IFN-γ的表达水平：
α-GalCer和K562稳定细胞株+α-GalCer组培养21天后，用流式细胞仪测定TCRVβ 11－和TCRVβ11+细胞内IFN-γ的阳性比率，结果见表三。
表三 两种培养方法NKT细胞内IFN-γ的阳性比率
Claims (6)
1.一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
a.改造白血病细胞株K562，使其表达CD1d、anti-CD28 MAb，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，采用RT-PCR方法分别从人PBMC中扩增CD1d、anti-CD28MAb cDNA,测序正确后，CD1d、anti-CD28MAb基因分别克隆至含有不同筛选标记的2种真核表达载体，先后转染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建K562稳定细胞株K562-CD1d-anti-CD28MAb；
b.用100Gy γ射线辐照K562稳定细胞株，用含有IL-2、IL-15和α-Galcer的培养基调整人外周血单个核细胞浓度至1×106/ml，两种细胞混匀后置于37℃、5%的CO2培养箱中培养；每3～4天进行补液及传代，第12天收获细胞。
2.如权利要求1或2或3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的培养基的为RPMI 1640加入10%人血清或10%胎牛血清；或AIM-V加入10%人血清或10%胎牛血清。
3.如权利要求3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的K562稳定细胞株浓度∶外周血单个核细胞=1-4∶1。
4.如权利要求3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的IL-2的浓度为50U/ml。
5.如权利要求3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的IL-15的浓度为50ng/ml。
6.如权利要求3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的α-Galcer的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
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