CN109090039B - 经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 - Google Patents
经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109090039B CN109090039B CN201811040186.8A CN201811040186A CN109090039B CN 109090039 B CN109090039 B CN 109090039B CN 201811040186 A CN201811040186 A CN 201811040186A CN 109090039 B CN109090039 B CN 109090039B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- cultured
- tumor tissue
- vitro
- xenograft model
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000013415 human tumor xenograft model Methods 0.000 title claims description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 67
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 8
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 5
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 20
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 10
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人源性异种移植模型研究领域,尤指经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,建立方法包括以下步骤:1)收集肿瘤组织标本;2)将肿瘤组织置于培养液中;3)完成低温运输及处理准备;4)在无菌操作台内将肿瘤组织切成米粒大小;5)肿瘤组织清洗,然后置于48孔板中培养;6)通过原位末端标记法检测组织凋亡情况;7)选取免疫缺陷型NCG小鼠经麻醉与皮肤处理;8)将培养的肿瘤组织植入小鼠肾包膜内;9)经过3个月后完成建模;本发明为异种移植模型选择肿瘤组织块进行建模,有利于保留原发肿瘤的组织病理及遗传学特性;且获取的肿瘤组织先进行体外培养,有利于肿瘤分型和临床实践;添加PD98059和人工基质胶可以大幅度减少组织凋亡,有利于提高移植成功率。
Description
技术领域
本发明涉及一种人源性异种移植模型研究领域,尤指经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法。
背景技术
癌症属于世界范围内的重大公共卫生问题,其发病率和死亡率逐年增加,同时癌症病发是现今导致死亡的主要原因 (Siegel R L et al., 2017);因此在目前状况基础上,建立能够高度模拟人体内肿瘤发生发展的模型是肿瘤研究的关键一步;当前通过小鼠体内模型研究以模拟人体内肿瘤发生发展模型,而目前应用较多的小鼠体内模型包括基因工程小鼠、化学诱导模型及人源性异种移植模型,其中人源性异种移植模型(英文:patient-derived xenografts, 缩写PDX)是基于将患者的新鲜肿瘤细胞或组织通过注射、外科操作等接种到免疫缺陷小鼠体内,更能保留原发肿瘤的组织病理及遗传学特性,也从而成为肿瘤病理研究和药物筛选的重要工具(Sausville EA et al., 2006)。
根据移植部位的不同,PDX模型主要分为皮下移植、原位移植、肾包膜下移植,皮下移植一般位于小鼠双侧腹股沟或腋窝处,容易观察和定期测量肿瘤大小,但该部位缺乏血供及肿瘤-宿主间的相互作用,并且极少出现扩散和转移瘤;原位移植是最符合肿瘤微环境的移植方式,但该模型操作较难,成瘤率较低,仅限于乳腺脂肪垫、胰腺、大脑等部位,不具有普适性(Hidalgo M et al., 2014);肾包膜处血供丰富,成瘤率较高,因此肾包膜处成为移植的理想部位(Cunha G R et al., 2016)。
人源性异种移植模型根据接种材料的不同可分为单细胞悬液移植和组织块移植,细胞块移植模型易操作,成瘤率高;但是由于细胞块移植模型经过体外筛选,基因谱的表达已发生改变,丧失肿瘤内的异质性,同时缺乏肿瘤微环境的相互作用,不能客观的反映原发肿瘤发生、增殖、转移等的特性(Daniel VC et al., 2009; Siolas, D et al., 2013);组织块移植模型基因组突变减少 ,更加真实地反应了原发肿瘤的生物学特性(Bendavid Uet al., 2017; Loukopoulos P, 2004),但由于肿瘤类型不同及操作较复杂,该模型移植成功率在23%-75%不等,同时对临床手术和动物实验操作的时限和肿瘤部位定位要求比较高,需要在手术后极短时间内移植动物,同时需要选取活性高的肿瘤癌巢部位移植才能获得较高的移植成功率,需要临床医生的密切配合才能实现,这些成为目前本技术推广应用的严重障碍(Siolas D et al., 2013)。
目前PDX技术应用面临的最大问题是,人源性异种移植模型以细胞移植为主,丧失肿瘤内的异质性,同时缺乏肿瘤微环境的相互作用,不能客观的反映原发肿瘤发生、增殖、转移等的特性;而组织块移植,由于肿瘤类型不同及操作较复杂,移植成功率及建模时间差异较大,均有待进一步优化改进。
参考文献:
Siegel R L, Miller K D, Jemal A, et al. Cancer Statistics, 2017. CA:A Cancer Journal for Clinicians, 2017, 67(1): 7-30.
Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015.CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(2): 115-132.
Sausville EA, Burger AM. Contributions of human tumor xenografts toanticancer drug development. Cancer Res 2006;66:3351–4.
Daniel VC, Marchionni L, Hierman JS, Rhodes JT, Devereux WL, RudinCM, et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer revealsirreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. CancerRes 2009;69:3364–73.
Siolas, D. & Hannon, G.J. Patient-derived tumor xenografts:transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73, 5315–5319(2013).
Loukopoulos P, Kanetaka K, Takamura M, Shibata T, Sakamoto M,Hirohashi S. Orthotopic transplantation models of pancreatic adenocarcinomaderived from cell lines and primary tumors and displaying varying metastaticactivity. Pancreas 2004;29:193–203.
Bendavid U, Ha G, Tseng Y, et al. Patient-derived xenografts undergomouse-specific tumor evolution. Nature Genetics, 2017, 49(11): 1567-1575.
Hidalgo M, Amant F, Biankin A V, et al. Patient-Derived XenograftModels: An Emerging Platform for Translational Cancer Research. CancerDiscovery, 2014, 4(9): 998-1013.
Cunha G R, Baskin L S. Use of sub-renal capsule transplantation indevelopmental biology. Differentiation, 2016: 4-9.。
发明内容
为解决上述问题,本发明旨在公开一种人源性异种移植模型研究领域,尤指经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,通过对组织块的体外培养后再进行异种移植,建立能高度模拟人体内肿瘤发生发展的小鼠模型,为肿瘤病理研究和药物筛选获得新工具与方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,其特征在于,所述的建立方法包括以下步骤:
1)收集经手术切除的肿瘤组织标本;
2)将所述肿瘤组织暂时置于预冷的含抗生素的培养液中储存;
3)然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理;
4)在无菌操作台内,将从步骤2)的培养液中取得的肿瘤组织切成米粒大小;
5)所述肿瘤组织经含抗生素的PBS清洗,然后置于48孔板中培养;随后在48孔板中加入培养基,再添加调节激酶抑制剂PD98059;
6)所述肿瘤组织通过原位末端标记法,检测组织凋亡情况;
7)选取免疫缺陷型NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠经腹腔麻醉、消毒背部皮肤处理,然后自肋脊角逐层切开暴露肾脏,揭开肾包膜;
8)将培养的肿瘤组织用毛细玻璃管轻轻植入小鼠肾包膜内,缝合肌肉及皮肤;
9)经过3个月后完成建模,得到所述人源性肿瘤异种移植模型。
优选地,所述用于步骤1)的肿瘤组织标本大小为1-3cm3。
优选地,所述步骤2)的培养液为无血清RPMI-1640培养液。
优选地,所述步骤5)的每个孔板加入400ul培养基,每三天换一次液,并置于5%CO2、37℃的恒温箱中培养2个月。
优选地,步骤7)的免疫缺陷型NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠基于SPF环境饲养。
优选地,所述步骤5)的培养基中,还添加有人工基质胶。
本发明的有益效果体现在:本发明在PDX模型利用人体新鲜细胞或组织进行接种移植的基础上,通过对肿瘤组织块进行体外培养,结合肾包膜下移植,优化PDX模型的接种条件,提高成瘤率;并通过结果验证,体外培养中添加PD98059及人工基质胶能减少组织凋亡;培养后的组织能成功建模,并保持原发肿瘤的远处转移及形成腹水的特性;该体系可应用于大部分恶性肿瘤的PDX建模,尤其是肝癌及卵巢癌中可广泛实施。
本发明为异种移植模型选择肿瘤组织块进行建模,有利于保留原发肿瘤的组织病理及遗传学特性;且获取的肿瘤组织先进行体外培养,有利于肿瘤分型和临床实践;添加PD98059和人工基质胶可以大幅度减少组织凋亡,有利于提高移植成功率;同时本发明中异种移植部位选择在肾包膜下,血供丰富,有利于缩短建模时间,提高成瘤率,重现肿瘤在体内的发生发展过程。
附图说明
图1是本发明具体实施例一的体外组织培养的培养基组分及相应浓度对照表。
图2是本发明具体实施例一的光密度半定量统计图。
图3是本发明具体实施例一的肾包膜下异种移植模型(PDX)图。
图4是本发明具体实施例一的免疫组化法检测肝细胞癌移植瘤块的标记物显示图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式:
经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,所述的建立方法包括以下步骤:
1)收集经手术切除的肿瘤组织标本;患者在术前均经病理学检查确诊为恶性肿瘤;
2)取大小为1-3cm3的肿瘤组织标本,将所述肿瘤组织暂时置于预冷的含抗生素的培养液中储存;培养液为无血清RPMI-1640培养液;
3)然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理;
4)在无菌操作台内,将从步骤2)的培养液中取得的肿瘤组织切成米粒大小;
5)所述肿瘤组织经含抗生素的PBS清洗,然后置于48孔板中培养;随后在48孔板中加入培养基,再添加调节激酶抑制剂PD98059;
所述步骤5)的培养基中,还添加有人工基质胶;
所述步骤5)的每个孔板加入400ul培养基,每三天换一次液,并置于5%CO2、37℃的恒温箱中培养2个月;
6)所述肿瘤组织通过原位末端标记法,检测组织凋亡情况;
7)选取基于SPF环境饲养的免疫缺陷型NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠经腹腔麻醉、消毒背部皮肤处理,然后自肋脊角逐层切开暴露肾脏,揭开肾包膜;
8)将培养的肿瘤组织用毛细玻璃管轻轻植入小鼠肾包膜内,缝合肌肉及皮肤;
9)经过3个月后完成建模,得到所述人源性肿瘤异种移植模型。
进一步具体应用:
步骤5)中的培养基的主要成分如图一所示,其必要成分为:RPMI1640 + PS+丙酮酸钠+non-AA +谷氨酰胺、4 mg/mL BSA、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、5 ug/mL insulin,另外可以选择性仅添加调节激酶抑制剂PD98059,或仅添加蛋白激酶A激动剂霍乱毒素,或者同时添加调节激酶抑制剂PD98059与蛋白激酶A激动剂霍乱毒素,从而比较模型建立效果;
2D/3D培养液成分 | Control | PD | 霍乱毒素 | PD+霍乱毒素 |
RPMI1640 + PS+丙酮酸钠+non-AA +谷氨酰胺 | √ | √ | √ | √ |
4 mg/mL BSA | √ | √ | √ | √ |
10 ng/ml bFGF | √ | √ | √ | √ |
20 ng/ml EGF | √ | √ | √ | √ |
5 ug/mL insulin | √ | √ | √ | √ |
0.1nM霍乱毒素 | √ | √ | ||
25nM PD98059 | √ | √ |
如图1,为体外组织培养的培养基组分及相应浓度的对照表,“√”代表各组添加的成分;每组5份中分化肝癌样本;对照组分别对照添加调节激酶抑制剂PD98059、霍乱毒素或者调节激酶抑制剂PD98059+霍乱毒素的效果;
在相同培养基的2D培养方法与3D培养方法中,3D培养方法效果更好:
2D培养方法为:在48孔板中放入2-3块肝癌组织,然后每孔加400ul培养基;
3D培养方法为:在48孔板的每孔内平铺60ul人工基质胶,待凝固后放入2-3块肝癌组织,再加入100-120ul人工基质胶覆盖肝癌组织,继而添加400ul培养基。
如图2,采用免疫荧光的原位末端标记(Tunel)法检测肝癌组织各组凋亡情况;Image J 软件进行光密度半定量统计,GraphPad Prism软件进行统计分析,*:P<0.05;添加调节激酶抑制剂PD98059或霍乱毒素的结果对照:
1)3D培养相对2D培养可减少组织凋亡;
2)在培养基添加PD98059相比添加霍乱毒素能减少组织凋亡;
3)在培养基添加PD98059相比添加PD98059与霍乱毒素能减少组织凋亡;
4)在培养基添加PD98059和人工基质胶后,减少组织凋亡的效果最佳。
如图3a,SPF环境饲养的免疫缺陷型NCG小鼠经腹腔麻醉,消毒背部皮肤,自肋脊角逐层切开暴露肾脏,揭开肾包膜,将培养的肿瘤块用毛细玻璃管轻轻植入小鼠肾包膜内,缝合肌肉及皮肤;如图3b,小鼠在3个月内成功建模,其中卵巢癌模型出现颈部转移;如图3c,肝细胞癌模型出现腹水。
如图4,建模成功的肝癌小鼠经颈椎脱臼处死后,获得移植瘤块,经免疫组化染色后,仍能检测到原发肿瘤AFP、GPC-3、Heppar-1的表达,由此证实其能保留原发肿瘤的组织病理及遗传学特性,该体系适用于大部分恶性肿瘤的人源性异种移植模型(patient-derived xenografts, PDX)的建立。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明的技术范围作任何限制,本行业的技术人员,在本技术方案的启迪下,可以做出一些变形与修改,凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,其特征在于,所述的建立方法包括以下步骤:
1)收集经手术切除的肿瘤组织标本;
2)将所述肿瘤组织标本暂时置于预冷的含抗生素的培养液中储存;
3)然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理;
4)在无菌操作台内,将从步骤2)的培养液中取得的肿瘤组织标本切成米粒大小;
5)所述肿瘤组织标本经含抗生素的PBS清洗,然后置于48孔板中培养;随后在48孔板中加入培养基,再添加调节激酶抑制剂PD98059;培养基中还添加有人工基质胶;
6)所述肿瘤组织标本通过原位末端标记法,检测组织凋亡情况;
7)选取免疫缺陷型NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠经腹腔麻醉、消毒背部皮肤处理,然后自肋脊角逐层切开暴露肾脏,揭开肾包膜;免疫缺陷型NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠基于SPF环境饲养;
8)将培养的肿瘤组织标本用毛细玻璃管轻轻植入小鼠肾包膜内,缝合肌肉及皮肤;
9)经过3个月后完成建模,得到所述人源性肿瘤异种移植模型。
2.根据权利要求1所述的经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,其特征在于,用于所述步骤1)的肿瘤组织标本大小为3cm3。
3.根据权利要求1所述的经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,其特征在于,所述步骤2)的培养液为无血清RPMI-1640培养液。
4.根据权利要求1所述的经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法,其特征在于,所述步骤5)的每个孔板加入400ul培养基,每三天换一次液,并置于5%CO2、37℃的恒温箱中培养2个月。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811040186.8A CN109090039B (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811040186.8A CN109090039B (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109090039A CN109090039A (zh) | 2018-12-28 |
CN109090039B true CN109090039B (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=64865469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811040186.8A Active CN109090039B (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109090039B (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109517793B (zh) * | 2018-11-30 | 2022-05-10 | 广州长峰生物技术有限公司 | 一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法 |
CN110476892A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-11-22 | 中南大学湘雅二医院 | 一种骨肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法及应用 |
CN110547250B (zh) * | 2019-09-23 | 2021-12-28 | 中南大学湘雅二医院 | 免疫健全的滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法及应用 |
CN110663648A (zh) * | 2019-09-26 | 2020-01-10 | 上海联鑫生物科技有限公司 | 一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法 |
CN111110385A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-08 | 南京普恩瑞生物科技有限公司 | 人源性肿瘤异种移植模型的构建方法 |
CN111088230A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 南京普恩瑞生物科技有限公司 | 促进离体肿瘤组织微血管生长的孵育液及其制备方法 |
CN110999865B (zh) * | 2020-01-07 | 2022-06-17 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种继发性甲旁亢引发的骨质疏松小鼠模型的构建方法及其应用 |
CN111500541A (zh) * | 2020-04-12 | 2020-08-07 | 江苏安泰康健康科技有限公司 | 一种缩短人源肿瘤异种移植pdx模型周期的方法 |
CN113528445B (zh) * | 2021-06-21 | 2023-06-02 | 创模生物科技(北京)有限公司 | Pdx建模佐剂及其应用 |
CN113892457B (zh) * | 2021-09-16 | 2023-03-31 | 中南大学湘雅医院 | 一种原位脑胶质瘤的pdxc模型构建方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103627673A (zh) * | 2012-08-21 | 2014-03-12 | 上海睿智化学研究有限公司 | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1688190A (zh) * | 2002-08-01 | 2005-10-26 | Gtc生物治疗学公司 | 用于由体细胞核转移生产转基因动物的纯合原代细胞系的快速筛选方法 |
US9388382B2 (en) * | 2005-10-05 | 2016-07-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells |
KR101491108B1 (ko) * | 2012-04-13 | 2015-02-10 | 주식회사 강스템바이오텍 | 피부세포로부터 기능성 인슐린 생산 세포의 직접 제조방법 |
CN102978160A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-20 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外诱导扩增nkt细胞的方法 |
CN103828763B (zh) * | 2014-03-18 | 2015-10-28 | 复旦大学附属中山医院 | 一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型及其构建方法 |
CN104546868A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-04-29 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法及模型 |
CN108148811B (zh) * | 2018-01-16 | 2022-03-01 | 复旦大学附属中山医院 | 一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法 |
-
2018
- 2018-09-07 CN CN201811040186.8A patent/CN109090039B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103627673A (zh) * | 2012-08-21 | 2014-03-12 | 上海睿智化学研究有限公司 | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109090039A (zh) | 2018-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109090039B (zh) | 经体外培养的人源性肿瘤异种移植模型的建立方法 | |
CN102821600B (zh) | 使用移植了nog确立癌细胞株的非人动物模型进行的抗癌药靶探索以及筛选方法 | |
JP2023521878A (ja) | 食道扁平上皮癌の上皮細胞用の培養培地、培養方法、及びその用途 | |
Ciucci et al. | Preclinical models of epithelial ovarian cancer: practical considerations and challenges for a meaningful application | |
WO2019182326A1 (en) | Method and system for 3d cell culture and use thereof | |
CN102051344B (zh) | 一组人成骨肉瘤细胞系及小鼠体内移植模型 | |
Chen et al. | Human liver cancer organoids: Biological applications, current challenges, and prospects in hepatoma therapy | |
CN101982178A (zh) | 人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法 | |
Yang et al. | Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: key challenges and current opportunities | |
CN110066767A (zh) | 一种鼻咽癌组织类器官培养基及培养方法 | |
CN114075539B (zh) | 构建原位原发膀胱癌动物模型的方法 | |
Naito et al. | In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice | |
CN109112106A (zh) | 人原代肝癌组织的体外模型的建立方法 | |
Rutzky et al. | Human colon adenocarcinoma cells. III. In vitro organoid expression and carcinoembryonic antigen kinetics in hollow fiber culture | |
CN108396007B (zh) | 体外构建奶牛血乳屏障三维模型的方法 | |
CN110904026B (zh) | 一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用 | |
CN109182271A (zh) | 基于类器官方法构建正常免疫小鼠人胃癌移植瘤模型的方法和应用 | |
CN109182272A (zh) | 基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用 | |
CN105861441A (zh) | 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法 | |
Dodson et al. | Distinction of the phenotypes of in vitro anchorage-independent soft-agar growth and in vivo tumorigenicity in the nude mouse | |
Mishra et al. | Human lung fibroblasts inhibit non-small cell lung cancer metastasis in ex vivo 4D model | |
CN107177551B (zh) | 一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用 | |
Lee et al. | Establishment and characterization of a diethylnitrosamine-initiated woodchuck hepatocyte cell line | |
CN114027256B (zh) | 高肝硬度背景sd大鼠原位肝癌模型的构建方法及其应用 | |
CN114369573B (zh) | 构建原位原发鼻咽癌动物模型的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |