CN103627673A

CN103627673A - 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

Info

Publication number: CN103627673A
Application number: CN201210299549.6A
Authority: CN
Inventors: 秦宵然; 王科; 张一心; 谢付波; 王建红; 闻丹忆; 季从飞; 赵奇红
Original assignee: SHANGHAI RUIZHI CHEMICAL STUDY CO Ltd; Nantong Tumor Hospital
Current assignee: SHANGHAI RUIZHI CHEMICAL STUDY CO Ltd; Shanghai Chempartner Co Ltd; Nantong Tumor Hospital
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: CN103627673B

Abstract

本发明提供了一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用。该人脑胶质瘤细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201115。该人脑胶质瘤细胞系通过来自临床标本中的脑胶质瘤细胞经原代培养和传代培养建立，可直接用于体外药物筛选，或在哺乳动物中产生人脑胶质瘤，建立人脑胶质瘤动物模型，用于筛选治疗人脑胶质瘤的候选药物。该人脑胶质瘤细胞系性状稳定，可稳定多次传代，体外传代至第50代性状保持稳定；可在体外、体内分析人脑胶质细胞瘤的发病机制，药物敏感性及转移性等相关特性，进而建立体外、体内两个相互关联的抗脑胶质瘤药物筛选平台，为人脑胶质瘤研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。

Description

一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于细胞系领域，特别涉及一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

生长于颅内的肿瘤通称为脑瘤，包括由脑实质发生的原发性脑瘤和由身体其他部位转移至颅内的继发性脑瘤。原发性脑瘤依其生物特性又分良性和恶性。良性脑瘤生长缓慢，包膜较完整，不浸润周围组织及分化良好；恶性脑瘤生长较快，无包膜，界限不明显，呈浸润性生长，分化不良。

脑肿瘤中胶质细胞瘤发病率最高，约占40.49%，综合发病年龄高峰在30～40岁，或10～20岁。大脑半球发生的胶质瘤约占全部胶质瘤的51.4%，以星形细胞瘤为最多，其次是胶质细胞瘤和少枝胶质细胞瘤，脑室系统也是胶质瘤较多的发生部位，占胶质瘤总数的23.9%，主要为管膜瘤，髓母细胞瘤，星形细胞瘤，小脑胶质瘤占胶质瘤总数的13%，主要为星形细胞瘤。脑胶质瘤具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点。近几十年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，中老年人群尤为明显。据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3～6人/10万人。在目前的技术条件下,胶质瘤特别是恶性度高的胶质瘤预后还很不乐观。美国最新资料显示,在所有胶质细胞瘤中占半数的胶质母细胞瘤患者1年生存率约为30%,5年生存率不足5%。

目前，在脑肿瘤临床治疗常用手段主要有手术治疗、放射治疗和化疗，另外还有一些比较新的治疗方法，如免疫治疗、以EGFR、IGFR、PDGFR等为靶点的靶向治疗和抗血管生成的治疗方法。这些方法通常根据病人的实际情况进行联合应用，但对于脑肿瘤的治疗效果却不尽人意。因此临床上不仅需要新型的治疗方法，同时也需要开发有效的治疗药物。

然而目前在全世界范围，用于药物开发和基础研究的脑瘤细胞系屈指可数，具有亚洲人种遗传背景的脑瘤细胞系更是凤毛麟角。同临床上种类繁多的脑瘤病人相比，脑瘤细胞系稀少的问题严重地制约了相关的临床前研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现今尚不存在建立好或可直接购买的人脑胶质瘤细胞系这一难题，提供一种人脑胶质瘤细胞系及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种人脑胶质瘤细胞，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201115。

本发明还提供如上所述的人脑胶质瘤细胞的子代细胞。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种本发明所述的人脑胶质瘤细胞及其子代细胞的用途，即用于在哺乳动物中产生脑胶质瘤。

其中所述用途较佳地包括制备脑胶质瘤动物模型。其中所述制备动物模型的方法为本领域常规使用的制备方法。所述动物模型的制备方法较佳地包括以下步骤：体外大量培养和收集本发明所述的人脑胶质瘤细胞，将一定量的细胞悬液皮下接种哺乳动物，接种一段时间后，肿瘤开始形成并生长，并能够在小鼠皮下进行传代。其中所述的哺乳动物较佳地包括各种哺乳动物，更佳地是免疫缺陷小鼠，本发明所述哺乳动物优选地为严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）。所述的接种的方式为本领域常规使用的接种方式。所述接种方式较佳地包括皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。本发明所述脑胶质瘤细胞接种方式优选地为皮下穿刺接种。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种筛选治疗脑胶质瘤的候选药物的方法，其中较佳地包括以下步骤：将测试化合物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的测试化合物为治疗人脑胶质瘤的候选化合物，其中所述的细胞模型是本发明所述的人脑胶质瘤细胞系。

其中所述筛选方法为本领域常规使用的筛选方法，所述筛选方法较佳地包括以下步骤：

（1）将一定数量的人脑胶质瘤细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；

（2）将测试化合物稀释成不同浓度施用于细胞，化合物作用72小时后通过测定细胞的活力，计算不同浓度的化合物对细胞的增殖抑制能力，计算化合物半数抑制浓度，用以判断测试化合物的抗肿瘤能力。

其中步骤（1）所述人脑胶质细胞瘤或其子代细胞的接种量较佳地为：5000/孔。步骤（2）所述检测不同化合物半数抑制浓度，用以判断测试化合物的抗肿瘤能力的方法为本领域常规检测和计算方法。其中所述半数抑制浓度检测方法较佳地包括ATP生物发光法或MTT法，本发明所述检测方法优选地为ATP生物发光法。所述的ATP生物发光法是通过对细胞中的ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法，其中所述的ATP是活细胞新陈代谢的一个重要指标。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：一种筛选治疗脑胶质瘤的候选药物的方法，其中较佳地包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致脑胶质瘤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗人脑胶质瘤的候选化合物，其中所述的动物模型具有本发明所述的人脑胶质瘤细胞所导致的脑胶质瘤。

其中所述药物筛选方法为本领域常规的药物筛选方法。所述药物筛选方法较佳地包括以下步骤：

（1）将所述的人脑胶质瘤细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下进行饲养，获得人脑胶质瘤动物模型；

（2）将测试化合物施用于动物模型，施用后导致脑胶质瘤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗人脑胶质瘤的候选化合物。

其中步骤（1）所述的哺乳动物较佳地包括免疫缺陷小鼠，本发明所述的哺乳动物优选地是严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）。所述的接种方式为本领域常规的接种方式。所述接种方式较佳地包括皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。本发明所述人脑胶质瘤细胞接种方式优选地为皮下穿刺接种，所述接种的细胞量较佳地为1.0～2×10⁷个细胞，细胞接种量优选地为1.0×10⁷个细胞。

其中步骤（2）所述的施用方式为本领域常规的施用方式，其中所述施用方式较佳地包括：将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射和肿瘤局部用药中的一种或几种方式施用于人脑胶质瘤荷瘤动物。所述实验中的对照例较佳地为：同时使用不含测试化合物的溶剂施用于人脑胶质瘤荷瘤动物作为对照。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是：一种本发明所述人脑胶质瘤细胞系的建立方法，其中包括以下步骤，

（1）获得新鲜的临床人脑胶质瘤手术切除标本，剪切成小块，使用胶原酶消化肿瘤块；

（2）将步骤（1）所得的分离细胞进行癌细胞的原代培养和传代培养。

其中步骤（2）所述的原代培养为本领域常规的原代培养技术。本发明所述原代培养方法较佳地包括以下步骤：将步骤（1）所得的人脑胶质瘤细胞重悬于DMEM/F12培养液，所述DMEM/F12培养液较佳地包括：1×B27、20ng/ml人表皮生长因子、20ng/ml人成纤维细胞生长因子、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素，置入细胞培养瓶中培养，培养温度较佳地为37℃，培养时间较佳地为4～5天，培养时间优选地为4天，CO₂含量较佳地为5%（V/V）进行培养。

其中步骤（2）所述的传代培养方法为本领域常规的细胞传代培养方法。其中所述传代方法较佳地包括以下步骤：收集旧培养基，离心去上清，所述离心条件优选地为：300g离心3分钟，细胞沉淀使用Accutase重悬消化，所述Accutase购自sigma货号为A6964，待细胞分散后加入HBSS终止消化；离心收集的细胞重悬于DMEM/F12培养液中，于新的细胞培养瓶中继续培养。

细胞培养四代后，更换为新鲜RPMI 1640培养液，所述RPMI 1640培养液成分优选地包括：10％胎牛血清、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素培养。细胞由悬浮生长转变成贴壁生长，进行传代培养。其中所述传代培养方法为本领域常规使用的细胞传代培养方法。本发明所述传代培养方法较佳地包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的RPMI 1640培养液，仔细吹打分散细胞，少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻刮擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，接种于新的培养瓶继续培养。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供的人脑胶质瘤细胞性状稳定，可稳定多次传代，为脑癌研究提供了新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。本发明所得的细胞系既可以直接作为体外抗脑胶质瘤药物筛选模型，也可以通过在哺乳动物如免疫缺陷小鼠体内多次传代，获得高成瘤性人脑胶质瘤动物模型，进而建立体外、体内两个相关联的抗脑胶质瘤药物筛选平台。可利用所得的平台进行脑胶质瘤的发病机理、耐药性以及转移机理的研究，进而寻找脑胶质瘤发病机制、耐药性和转移的特征生物标志物，是人脑癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。本发明建立的脑胶质瘤细胞系不仅丰富了世界脑瘤细胞库，也为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料。

生物材料的保藏

本发明的人脑胶质瘤细胞，于2011年4月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（地址：中国.武汉.武汉大学），培养物名称为人源脑胶质瘤细胞GLC-001，保藏编号为CCTCC NO：C201115。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是GLC-001细胞的形态学观察图（100×）。

图2是GLC-001细胞的染色体分析图。A.GLC-001细胞；B.小鼠细胞染色体（对照）。

图3是GLC-001细胞的短片段重复序列（STR）分析结果图。A～D是GLC-001细胞不同短片段的STR分析结果图。

图4是GLC-001细胞免疫组化染色（DAB法）图谱。A：阴性对照（100×），B：胶质瘤细胞生物标志物神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP 100×）

图5是GLC-001细胞倍增时间曲线图。

图6是GLC-001细胞周期分析图。

图7是体外测试多个抗癌药物对GLC-001细胞增殖的抑制作用示意图。A盐酸伊立替康对GLC-001细胞增殖的抑制作用，B盐酸伊立替康对U-87MG细胞增殖的抑制作用，C洛莫司汀对GLC-001细胞增殖的抑制作用，D洛莫司汀对U-87MG细胞增殖的抑制作用，E尼莫司汀对GLC-001细胞增殖的抑制作用，F尼莫司汀对U-87MG细胞增殖的抑制作用。

图8是GLC-001细胞的成瘤性示意图。

图9是GLC-001细胞在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片（100×）图谱。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，室温为25℃。

实施例1GLC-001细胞的制备

从南通市肿瘤医院获得新鲜的临床脑胶质瘤切除标本（男，52岁，多形性胶母细胞瘤），立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中（含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B）。原代培养：在生物安全柜中，用新鲜的无菌HBSS缓冲液冲洗标本，剪切成20～30立方毫米小块，使用20ml含0.2%II型胶原酶的磷酸缓冲液消化肿瘤块，将分散的细胞重悬于5ml DMEM/F12完全培养液，所述DMEM/F12完全培养液的成分包括：1×B27营养因子（StemCell Technology，07153）、20ng/ml人表皮生长因子、20ng/ml人成纤维细胞生长因子、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素，置入细胞培养瓶中，于37℃温箱5%CO₂条件下培养4天。

传代培养方法：收集旧培养基，300g离心3分钟去上清，细胞沉淀使用1ml 1×Accutase重悬消化，待细胞分散后加入HBSS终止消化；离心收集的细胞重悬于5ml DMEM/F12完全培养液中，于新的细胞培养瓶中继续培养。

细胞培养四代后，更换为RPMI 1640培养液（含10％胎牛血清、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素）进行培养，细胞将由悬浮生长转变成贴壁生长，传代培养方法如下：吸弃旧培养液，向瓶中加入2ml新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入15ml新鲜的RPMI 1640培养液，仔细吹打分散细胞，少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻刮擦培养瓶表面，收集全部细胞按1：3比例（细胞数量比）接种于新的培养瓶继续培养，培养基总体积为15ml。该细胞生长良好，形态较为均一，传代至50代以上。

本发明的人脑胶质瘤细胞系，于2011年4月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（地址：中国.武汉.武汉大学），培养物名称为人源脑胶质瘤细胞GLC-001，保藏编号为CCTCC NO:C201115。

实施例2GLC-001细胞的生物学特性及应用

本发明采用DMEM/F12完全培养液培养纯化GLC-001细胞，然后使用含有胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的GLC-001主体呈梭型，存在不规则分支或分叉，细胞密度较大时失去接触生长抑制，呈交叉堆积生长状态，且由聚集处向外辐射生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞能在裸小鼠体内可形成肿瘤，具有致瘤性。

a.形态学观察

将培养GLC-001细胞的培养瓶置于倒置显微镜下（Olympus），在明视野下进行观察，结果见图1(100×)，可见GLC-001细胞主体呈梭型，存在不规则分支或分叉，细胞密度较大时失去接触生长抑制，呈交叉堆积生长状态，且由聚集处向外辐射生长。

b.染色体的鉴定

将培养的GLC-001细胞置于4℃孵育12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2，可见GLC-001细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，染色体众数(M)集中在35~37之间，占70%，比正常人染色体数少，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体（图2A，1000×）；而小鼠正常体细胞的染色体数2n=40，且均为顶端着丝粒（图2B，1000×），据此可与人类染色体相区别。可见该GLC-001细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。

c.短片段重复序列（STR）鉴定

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位（2～6个碱基对），串联重复形成的一类DNA序列（重复次数为10~60多次，基因片段在400碱基对以下）；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的GLC-001细胞，用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒（购自Axygen公司的AxyPrep^TM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，货号为AP-MN-MS-GDNA）提取细胞基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短片段重复序列的重复数（表1）。在美国典型培养物保藏中心（ATCC）数据库中，进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果，结果见图3A～D。

表1.GLC-001细胞STR检测结果

d.组织来源鉴定

将GLC-001细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫组化染色（DAB显色法）。结果显示，同阴性对照样品（图4A，100×）相比，胶质瘤细胞生物标志物神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP，图4B，100×）呈较强阳性表达，结合病理诊断，该细胞为脑胶质瘤细胞。

e.细胞动力学

将GLC-001细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中，进行培养，分别在12小时、36小时、72小时和96小时使用试剂盒（Promega,G7573）测定每孔细胞中的ATP含量，作图并使用公式“倍增时间=log2/斜率”计算倍增时间。细胞动力学研究结果显示，GLC-001细胞的群体倍增时间为51.2小时（图5）。

f.细胞周期分布

收集约10⁶GLC-001细胞于1.5ml离心管内，300g离心3分钟弃上清。细胞沉淀用1毫升-20℃75%乙醇重悬，室温固定1个小时。300g离心3分钟弃上清，加入500微升PI（碘化丙啶）染色液。混匀，室温孵育30分钟。用流式细胞仪（BD FACS CELIBUR）检测。由于PI按比例结合细胞中的染色质，经536nm波激发后可发射617nm光谱，通过流式细胞仪检测单个细胞发射的617nm左右的光谱信号，即可判断染色质的含量变化。实验中检测得到周期分布图（图6）和各周期分布比例（表2），细胞处于S期的比例为7.85%，G2/M期的比例为14.11%，因此细胞二倍体比例为21.96%。该细胞增殖指数为21.96%，说明有较大比例的细胞处于增殖状态。

表2.GLC-001细胞周期统计表

标记	周期	比例（%）
			M1	G0/G1	77.48
M2	S	7.85
			M3	G2/M	14.11

g.体外细胞毒实验

体外测定脑胶质瘤临床常用治疗药物：盐酸伊立替康，洛莫司汀和尼莫司汀，对GLC-001和脑瘤细胞系U-87MG（ATCC，HTB-14）的抗增殖作用。将GLC-001和U-87MG细胞分别以5000/孔和3000/孔的密度（接种密度根据生长曲线确定）接种在96孔板中，加入不同浓度的药物三天后，用Promega公司的CellTiter Glo试剂盒测定各药物浓度下的细胞活力，经XLFit软件计算IC₅₀（半数抑制浓度）和Index指数（各药物浓度对细胞抑制率总和），实验结果见图7和表3。其中图7A：盐酸伊立替康对GLC-001细胞增殖的抑制作用，B：盐酸伊立替康对U-87MG细胞增殖的抑制作用，C：洛莫司汀对GLC-001细胞增殖的抑制作用，D：洛莫司汀对U-87MG细胞增殖的抑制作用，E：尼莫司汀对GLC-001细胞增殖的抑制作用，F：尼莫司汀对U-87MG细胞增殖的抑制作用。结合图7以及表3的结果，我们发现各治疗药物对GLC001细胞的生长抑制作用比对U-87MG细胞的作用弱，说明GLC001细胞较U-87MG细胞更为耐药。

表3阳性药物对细胞增殖抑制作用

h.细胞的成瘤性

体外培养和收集GLC001细胞，皮下接种SCID免疫缺陷小鼠（北京维通利华），细胞悬液和Matrigel（BD Biosciences,356235）以1︰1体积混合，每只动物接种0.2ml，含1.0×10⁷个细胞，每周调查动物体重和肿瘤大小。接种约80天后，肿瘤开始形成并生长，成瘤率仅25%。瘤块在动物皮下传代3次后，潜伏期缩短，生长速度加快，成瘤率提高至100%。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝（长×宽×宽）÷2（见图8）。由图可见该GLC001细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

i.肿瘤的病理学鉴定

GLC001细胞小鼠皮下成瘤后，于体内传代两次，在第三代生长35天后，取出肿瘤固定后石蜡包埋，制备切片并进行HE染色。病理诊断结果为脑胶质瘤，WHO分级为Ⅳ级（图9）

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种人脑胶质瘤细胞系，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201115。

2.如权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系。

3.如权利要求1或2任一项所述的人脑胶质瘤细胞系的用途，其特征在于，用于在哺乳动物中产生脑瘤。

4.如权利要求3所述的人脑胶质瘤细胞系的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是免疫缺陷小鼠。

5.一种筛选治疗脑胶质瘤的候选药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将测试化合物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的测试化合物为治疗脑胶质瘤的候选化合物，其中所述的细胞模型是权利要求1~2任一项所述的人脑胶质瘤细胞系。

6.一种筛选治疗脑胶质瘤的候选药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致脑胶质瘤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗人脑胶质瘤的候选化合物，其中所述的动物模型具有权利要求1~2任一项所述的人脑胶质瘤细胞系所导致的脑胶质瘤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的动物模型是免疫缺陷小鼠。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，测试化合物的施用方式选自：局部施用于脑胶质瘤病灶处、口服给药和注射给药中的一种或几种。

9.一种如权利要求1或2任一项所述人脑胶质瘤细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤，

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的原代培养方法包括以下步骤：将分散的人脑胶质瘤细胞重悬于含有1×B27、20ng/ml人表皮生长因子、20ng/ml人成纤维细胞生长因子、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素的DMEM/F12培养液中，置入细胞培养瓶中，于37℃温箱，5%（V/V）CO₂条件下培养3～5天；

步骤（2）所述的传代培养方法包括以下步骤：收集旧培养基，离心去上清，细胞沉淀后使用Accutase重悬消化，待细胞分散后加入含有500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素的BHBSS培养液中，终止消化；离心收集的细胞重悬于DMEM/F12培养液中，于新的细胞培养瓶中继续培养；当细胞传代培养四代后，细胞由悬浮生长转变为贴壁生长，吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素的新鲜RPMI 1640培养液，仔细吹打分散细胞使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻刮擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，取适量细胞悬液接种于新的培养瓶继续培养。