CN110106150A - 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用 - Google Patents
一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种滑膜肉瘤细胞系hSS‑005R的制备方法，所述滑膜肉瘤细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201911；所述制备方法包括原代培养和传代培养。本发明建立了一种新的人滑膜肉瘤细胞系，其性状稳定，可稳定多次传代。本发明建立的人滑膜肉瘤细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了滑膜肉瘤细胞库，可以成功制备滑膜肉瘤动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞研究领域，具体涉及一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用。
背景技术
滑膜肉瘤(synovial sarcoma)是一种侵袭性强，恶性程度高的肿瘤，滑膜肉瘤占所有软组织肉瘤的5-10％，在青少年及年轻人的软组织肿瘤中占到10-20％。1983年至2012年间，滑膜肉瘤的发病率从0.906％持续增加到1.548％。滑膜肉瘤好发于四肢，约占到所有滑膜肉瘤病例的70％。滑膜肉瘤常见的转移部位是肺部，其次是淋巴结和骨髓。滑膜肉瘤最初命名是因其被发现于关节附近的组织中，其与周围的滑膜组织在微观组织结构上具有相似性。然而，近年来一些研究表明：滑膜肉瘤可出现在食管，肺部，心脏等缺乏滑膜的组织，与此种名称相左。滑膜肉瘤确切细胞起源仍然是一个未解之谜，部分的学者认为其可能来自于间充质干细胞。此外，滑膜肉瘤可表现为上皮组织来源肿瘤和间质细胞来源的肿瘤分化的标记物，尽管滑膜肉瘤与上述两种来源肿瘤的组织类型相似性较低。目前部分学者倾向于将滑膜肉瘤定义为“不确定分化”的肿瘤。世界卫生组织将滑膜肉瘤定义如下：伴有一定程度分化(包括腺体成分)的间叶组织来源的梭形细胞肿瘤。滑膜肉瘤在病理组织学上可以将其分为：双相型，具有不同程度的上皮细胞和梭形细胞成分；(2)单相纤维型，仅由梭形细胞组成；(3)单相上皮型，主要由上皮细胞组成，仅存在少量梭形细胞群；(4)低分化型，其可以类似于具有高级细胞核特点，高度有丝分裂活性和含有坏死区域的小圆细胞肿瘤，大细胞/上皮样肿瘤或梭形细胞肿瘤。其中在多组研究数据中，最常见诸于报道的是单相纤维型滑膜肉瘤，恶性程度非常高，生长极其迅速。而双相型滑膜肉瘤是滑膜肉瘤组织中最具特征性的一种，含有梭形细胞及纤维细胞，梭形细胞和上皮样细胞结合而成的肿瘤细胞相互移行。有研究认为，滑膜肉瘤由单相型向双相型滑膜肉瘤转变时不是跳跃性的，而是呈现一个渐变转化的形式。
大多数的研究认为：新辅助化疗或者伴放射治疗的广泛肿瘤切除术依然是滑膜肉瘤治疗的首选方法。即使接受了规范的临床治疗，10年内有效生存率依然不到10％，仅为8.9％。所以，改进滑膜肉瘤的治疗方案以改善患者预后成为一个棘手的难题。
目前，在众多限制滑膜肉瘤治疗的研究进展的主要问题是如何建构一个合理且有效的肿瘤模型。
细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。尤其是经过40-50次分裂的渡过第二次死亡危机的细胞，称之为细胞系。因原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易再传下去，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40--50代，这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变。当细胞传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
能无限增殖和稳定传代的细胞系能为滑膜肉瘤的研究提供稳定的性状和充足的原材料，但目前在国内外能购买到的滑膜肉瘤细胞系十分有限，其中在国内细胞库能直接购买的滑膜肉瘤细胞系只有一种，SW-982。且现有滑膜肉瘤细胞系与临床滑膜肉瘤的生物学性状相差较大。因此，为了滑膜肉瘤细胞相关的研究，本领域需要提供更多种新的滑膜肉瘤细胞系以及其制备方法和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的人滑膜肉瘤细胞系生物多样性低，尤其是细胞系建立成功率低，同时现有细胞系与临床滑膜肉瘤的生物学性状相差较大等不足，提供一种新的人滑膜肉瘤细胞系及其建立方法和应用。
本发明提供一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201911。
本发明还提供一种如上所述滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的子代细胞系。
在一种具体的实施方式中，所述细胞系c-myc癌基因高表达。
在一种具体的实施方式中，所述细胞系中不存在SS18-SSX融合基因。
本发明还提供一种如上所述细胞系的小鼠体内模型的构建方法，包括取hSS-005R细胞皮下单侧接种小鼠，接种1～3周后，肿瘤开始形成并生长，接种后30～50天的小鼠为医药研究用小鼠模型。
在一种具体的实施方式中，所述小鼠为免疫缺陷小鼠，优选所述免疫缺陷小鼠为裸鼠或SCID鼠。
本发明还提供一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法，所述滑膜肉瘤细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201911；所述制备方法包括原代培养和传代培养。
本领域技术人员可知的，原代培养是通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。而传代培养的定义为：原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。可以理解，在任何时候，细胞从一个瓶子接种到另一个瓶子时总会丢失一部分，因此，在客观上细胞必定有所稀释。
在一种具体的实施方式中，所述原代培养为贴壁培养或酶消化法培养。本发明中，酶消化法包括加入消化酶使得组织溶解而释放细胞。所述酶消化法培养均为本领域技术人员可知的常规操作。
在一种具体的实施方式中，所述原代培养为贴壁培养，所述方法包括将获得新鲜的临床人滑膜肉瘤患者手术切除肿瘤标本切成3-5mm3的薄块，将薄块贴壁在细胞培养瓶底贴壁培养，贴壁培养1-2周后，肿瘤组织块中陆续爬出肿瘤细胞，随后对原代培养的肿瘤细胞进行传代培养。
在一种具体的实施方式中，所述传代培养包括弃去进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入新鲜的胰蛋白酶细胞消化液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的完全培养基震荡或拍打使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心重悬接种于新的培养瓶继续培养；每次待细胞长满整个培养瓶或长至80％以上时则分瓶进行传代培养，每瓶细胞在进行传代培养时将该代肿瘤细胞分成2～5瓶，在这些新的培养瓶中继续培养其子代肿瘤细胞。
本发明还提供一种如上所述滑膜肉瘤细胞系hSS-005R在筛选或制备抗滑膜肉瘤细胞药物中的应用。
本发明还提供一种筛选治疗滑膜肉瘤候选药物的体内实验方法，所述体内实验方法包括以下步骤：将测试化合物施用于hSS-005R细胞成瘤的哺乳动物肿瘤模型，施用后导致滑膜肉瘤的肿瘤体积减少或者消失的测试化合物就是治疗滑膜肉瘤候选化合物。
本发明中，所述hSS-005R细胞均是指来自于滑膜肉瘤细胞系hSS-005R中的细胞。
本发明还提供一种筛选治疗滑膜肉瘤候选药物的体外实验方法，所述体外实验方法包括以下步骤：将测试化合物或不同测试化合物的组合以不同浓度直接施用于hSS-005R细胞，根据不同浓度的测试化合物或其组合对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断测试化合物对滑膜肉瘤的抗肿瘤能力。
在一种具体的实施方式中，所述的外实验方法包括以下步骤：1)将所述hSS-005R细胞以3000/孔的密度接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；2)将测试化合物稀释成不同浓度，施用于hSS-005R细胞，药物作用24小时后通过测定细胞的活力，计算不同浓度的化合物对细胞的增殖抑制能力，用以判断测试化合物的抗肿瘤能力。
在一种具体的实施方式中，所述测试化合物包括顺铂、多柔比星以及c-myc抑制剂Kj-pyr-9和10058-F4中的一种或多种。
本发明还提供一种如上所述滑膜肉瘤细胞系hSS-005R在制备滑膜肉瘤细胞模型或动物模型中的应用，优选所述动物模型中的动物为免疫缺陷小鼠。
本发明建立的人滑膜肉瘤细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了滑膜肉瘤细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验针对临床抗瘤药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料；并且该人滑膜肉瘤细胞系对滑膜肉瘤临床一线药物—顺铂耐药，是研究滑膜肉瘤耐药机制的良好试验材料；也是一组绝佳地对顺铂耐药新机制的探索研究材料，具有很高的科研价值和开发意义。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的有益效果至少在于：
1.本发明建立了一种新的人滑膜肉瘤细胞系，其性状稳定，可稳定多次传代，为滑膜肉瘤研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。
2.本发明建立的人滑膜肉瘤细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了滑膜肉瘤细胞库，可以成功制备滑膜肉瘤动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。
3.本发明建立的人滑膜肉瘤细胞系对滑膜肉瘤临床一线化疗药物—顺铂获得性耐药，其在体内和体外实验中表现稳定的顺铂耐药特性，这对于顺铂耐药新机制的探索，是一组绝佳的研究材料，具有很高的科研价值和开发意义，是研究滑膜肉瘤耐药机制的良好试验材料。
4.本发明建立的人滑膜肉瘤细胞系通过与裸鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台，是人滑膜肉瘤基础研究和临床前期应用的理想细胞系。
生物材料的保藏
本发明的人滑膜肉瘤细胞系于2019年1月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCCTCC)(地址：中国武汉武汉大学邮编430072)，培养物名称为：人滑膜肉瘤细胞hSS-005R，保藏编号为：CCTCC NO：C201911。
附图说明
图1为hSS-005R细胞在光学显微镜下的形态学观察。A.(100倍)B.(200倍)。
图2为hSS-005R细胞的短片段重复序列(CSTR)鉴定结果。
图3为流式细胞仪分析hSS-005R细胞周期。
图4为体外测试多个抗癌药物对hSS-005R细胞增殖的抑制作用。
图5为hSS-005R细胞的成瘤性，动物肿瘤体内生长曲线。其中A为肿瘤在裸鼠体内的生长曲线，B为肿瘤在裸鼠体内的生长情况照片拍摄。
图6为原发肿瘤组织和hSS-005R细胞在裸鼠体内成瘤的病理组织。其中，A：原发肿瘤组织；B：hSS-005R细胞。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中，所述hSS-005R细胞均是指保藏在中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为CCTCC NO：C201911，来自于滑膜肉瘤细胞系hSS-005R中的细胞。
实施例1
实施例1为本发明所述细胞系hSS-005R细胞的制备。
原代培养方法：将术中切除的新鲜滑膜肉瘤标本在无菌状态下置于DMEM高糖+10％FBS完全培养基中，冰上保存。用新鲜的PBS缓冲液(含1％的双抗-青霉素，链霉素)漂洗后，切成薄片，将剪碎的组织片贴壁于细胞培养瓶瓶底，加入适量的DMEM高糖+10％FBS完全培养基于37℃细胞培养箱5％二氧化碳条件直立放置1小时，使组织块在瓶底贴牢。随后将直立的培养瓶轻柔缓慢放倒使完全培养基浸没过贴壁组织块。无需换液，一般4-5天后能观察到细胞从组织块中爬出。当培养基变黄时更换新的培养基，等细胞基本长满时，按正常传代方式进行传代培养。
传代培养：弃去进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入新鲜的胰蛋白酶细胞消化液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的完全培养基震荡或拍打使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心接种于新的培养瓶继续培养；每更换一次培养瓶则相当于传代培养一次；每次待细胞长满整个培养瓶或长至80％以上时则分瓶进行传代培养，每瓶细胞在进行传代培养时将该代肿瘤细胞分成2～5瓶，在这些新的培养瓶中继续培养其子代肿瘤细胞。
在本发明中，将来源于肿瘤组织的原代细胞传代培养50代后，得细胞系，命名为hSS-005R，提交保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201911。
实施例2
实施例2为hSS-005R细胞的生物学特性及应用。
本发明采用DMEM高糖培养液培养纯化hSS-005R细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至30代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。该hSS-005R细胞能在裸鼠体内可形成肿瘤，具有致瘤性。该hSS-005R细胞和其来源的临床滑膜肉瘤肿瘤标本，裸鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性提供新的试验材料。具体如下：
a.形态学观察
将培养hSS-005R细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，可见hSS-005R细胞主体呈铺路石样，存在少量不规则细胞，呈克隆性生长，密度较大时可表现粘附性聚集，结果见图1(A100倍，B200倍)。
b.短片段重复序列CSTR)鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10-60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
收集新鲜培养的hSS-005R细胞，使用Tsingke的动物基因组抽提试剂盒(货号TSP201-200)提取细胞的基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括Amelogenin，THO1，TPOX，D13S317，vWA，D16S539，D5S818，CSF1PO以及D7S820等各个STR位点的序列重复数，其中STR位点的引物序列如表1所示。上述序列和ATCC，DSM2Z等细胞保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的遗传图谱，在美国典型培养物保藏中心(CATCC)数据库中进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。由此可以证明其独一无二性，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染(检测结果见图2)。
从图2可知，本发明提供的滑膜肉瘤细胞系hSS-005R属于全新的人滑膜肉瘤细胞系。
表1：STR位点的引物序列
c.细胞周期分布
收集约106个hSS-005R细胞于1.5ml离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用1毫升-20℃75％乙醇重悬，室温固定1个小时。离心弃上清，加入500微升PI染色液。混匀，室温孵育30分钟。用流式细胞仪检测每孔细胞数和每个细胞的总DNA含量(每个细胞的总DNA含量和该细胞的总PI荧光强度呈正比)；并根据不同细胞周期时，细胞总DNA含量的变化，计算各个细胞周期的细胞总数。检测得到周期分布及各周期分布比例如图3所示。
本领域技术人员可知的，细胞周期的间期分为三期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。1.G1期(first gap)是从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。2.S期(synthesis)即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。3.G2期(second gap)为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。而细胞增殖指数是指S期和G2期细胞之和占总细胞数的比例，反映该群细胞的增殖速度。S期增多，表示细胞分裂活跃。
从图3可知，本发明中滑膜肉瘤细胞系hSS-005R细胞的增殖能力活跃。该细胞符合肿瘤细胞的增殖特点。
d.体外细胞毒实验
体外测定滑膜肉瘤临床常用化疗药物—顺铂(Cislatin)、多柔比星(doxorubicin即阿霉素)以及Kj-pyr-9(c-myc抑制剂)，10058-F4(c-myc抑制剂)对hSS-005R细胞系的抗增殖作用。将受试细胞以3000/孔的密度接种在96孔板中，给不同浓度的药物和联合用药24小时后，用CCK8检测各药物浓度下的细胞活力。其中，联合用药的两种药物的药物浓度各占一半，其总用量与同浓度相比的其他药物的用量相同。其中，多柔比星联合Kj-pyr-9(c-myc抑制剂)用药效果最佳，结果见图4。
e.细胞的成瘤性
体外培养和收集hSS-005R细胞，皮下接种裸鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，每只动物接种0.2ml，含1.0×107个细胞，接种6只小鼠，单侧接种，N＝6，每周监测动物体重和肿瘤大小。接种约2周后，肿瘤开始形成并生长，成瘤率基本为100％。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2；其结果如图5所示。从图5可见，hSS-005R细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤并生长均一快速。
f.hSS-005R细胞小鼠皮下成瘤后，取出肿瘤固定后石蜡包埋，制备切片并进行HE染色。图6A为原组织瘤块，图6B为hSS-005R细胞小鼠瘤块，其病理诊断结果为滑膜肉瘤，组织形态高度接近于原组织瘤块。结果见图6。这说明本发明所述细胞系hSS-005R细胞能很好地反映原肿瘤组织的情况。
g.全外显子基因融合分析
从基因融合的结果来看，hSS-005R细胞都不含有SSX基因融合的现象，且支持基因融合的可读(read)数目都很少，基本都可以判定为背景噪音。所以本例滑膜肉瘤肿瘤模型为临床上罕见的SS18-SSX表达阴性的滑膜肉瘤。结果见表2。
表2：融合基因结果
本领域技术人员知晓：大多数的滑膜肉瘤存在着t(X,18；P11p,q11)的易位，由此产生滑膜肉瘤一个最为重要的特异性融合基因SS18-SSX，该融合基因翻译而成融合蛋白SS18-SSX。而且这种染色体易位突变一直存在于滑膜肉瘤细胞发生发展的整个过程中。因而有部分学者认为，滑膜肉瘤染色体易位所产生的融合基因，SS18-SSX，可能作为滑膜肉瘤的原癌基因，驱动肿瘤的发生发展。鉴于SS18-SSX融合基因存在于绝大多数的滑膜肉瘤中，具有高度的特异性，这为滑膜肉瘤的特异性诊断提供了一个重要的确诊思路：通过分子检测手段检测融合基因SS18-SSX的存在，诊断滑膜肉瘤，具有较高的特异性。尽管对于滑膜肉瘤而言，超过95％的滑膜肉瘤的患者出现SS18-SSX的融合基因，出现不含有SS18-SSX融合基因的滑膜肉瘤概率低于5％。
也就是说，本发明提供的滑膜肉瘤细胞系hSS-005R中是一种少见的分型，可能其恶性程度相对更高，也许能够治疗该分型的药物种类更少，相关研究也相应会更少。
h.MYC拷贝数变化
hSS-005R细胞8号染色体中有大量的拷贝数扩增和少量拷贝数缺失的现象。表3中带下划线标记的区间覆盖MYC基因，其CNV拷贝数变化达到7，ProbCall为0.999999998，准确度高。结果见表3。
表3：MYC拷贝数变化
本领域技术人员知晓：c-myc癌基因与多种肿瘤发生发展有关。本发明所述细胞系经过基因外显子测序表达可知其c-myc癌基因高表达。该测序表明了该滑膜肉瘤细胞系的细胞无限增殖特性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法，所述滑膜肉瘤细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201911；所述制备方法包括原代培养和传代培养。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原代培养为贴壁培养或酶消化法培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述原代培养为贴壁培养，所述方法包括将获得新鲜的临床人滑膜肉瘤患者手术切除肿瘤标本切成3～5mm3的薄块，将薄块贴壁在细胞培养瓶底贴壁培养，贴壁培养1-2周后，肿瘤组织块中陆续爬出肿瘤细胞，随后对原代培养的肿瘤细胞进行传代培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述传代培养包括弃去进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入新鲜的胰蛋白酶细胞消化液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的完全培养基震荡或拍打使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心重悬接种于新的培养瓶继续培养；每次待细胞长满整个培养瓶或长至80％以上时则分瓶进行传代培养，每瓶细胞在进行传代培养时将该代肿瘤细胞分成2～5瓶，在这些新的培养瓶中继续培养其子代肿瘤细胞。
5.一种如权利要求1所述滑膜肉瘤细胞系hSS-005R在筛选或制备抗滑膜肉瘤细胞药物中的应用。
6.一种筛选治疗滑膜肉瘤候选药物的体内实验方法，所述体内实验方法包括以下步骤：将测试化合物施用于hSS-005R细胞成瘤的哺乳动物肿瘤模型，施用后导致滑膜肉瘤肿瘤体积减少或消失的测试化合物就是治疗滑膜肉瘤候选化合物。
7.一种筛选治疗滑膜肉瘤候选药物的体外实验方法，所述体外实验方法包括以下步骤：将测试化合物或不同测试化合物的组合以不同浓度直接施用于hSS-005R细胞，根据不同浓度的测试化合物或其组合对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断测试化合物对滑膜肉瘤的抗肿瘤能力。
8.根据权利要求7所述的体外实验方法，其特征在于，所述的外实验方法包括以下步骤：1)将所述hSS-005R细胞以3000/孔的密度接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；2)将测试化合物稀释成不同浓度，施用于hSS-005R细胞，药物作用24小时后通过测定细胞的活力，计算不同浓度的化合物对细胞的增殖抑制能力，用以判断测试化合物的抗肿瘤能力。
9.根据权利要求8所述的体外实验方法，其特征在于，所述测试化合物包括顺铂、多柔比星以及c-myc抑制剂Kj-pyr-9和10058-F4中的一种或多种。
10.一种如权利要求1所述滑膜肉瘤细胞系hSS-005R在制备滑膜肉瘤细胞模型或动物模型中的应用，优选所述动物模型中的动物为免疫缺陷小鼠。
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