CN102465113B

CN102465113B - 一种人肝癌细胞系及其应用

Info

Publication number: CN102465113B
Application number: CN201010540639.0A
Authority: CN
Inventors: 樊嘉; 秦宵然; 周俭; 胡刚; 代智; 闻丹忆; 张亚华
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University; Shanghai Chempartner Co Ltd
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University; Shanghai Chempartner Co Ltd
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: CN102465113A

Abstract

本发明提供了一种人肝癌细胞及其制备方法和应用。该人肝癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201072。该人肝癌细胞可用于在哺乳动物中产生人肝癌，制备人肝癌模型，可进一步用于筛选治疗人肝癌的候选药物。本发明的人肝癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代。体外传代自第20代至第50代性状保持稳定。本发明的人肝癌细胞系具有临床上人肝癌的生物学性状，并且癌细胞基因组中有乙肝病毒DNA整合，为肝癌研究提供新的更接近于临床肝癌生物学特性的实验材料。

Description

一种人肝癌细胞系及其应用

技术领域

本发明属于细胞系领域，特别涉及一种人肝癌细胞系及其应用。

背景技术

原发性肝癌是消化道常见恶性肿瘤之一，全世界每年新发肝癌大约100万人，是全球第六位最常见癌症，全球第3位癌症致死原因。原发性肝癌的发病有明显的区域性，我国是该疾病的高发国家，其发病率占全球55％，死亡率占全球45％，目前每年约有32万例肝癌患者死亡。在我国，原发性肝癌在恶性肿瘤发病中居第二位，近年来并有逐渐上升趋势，具有发病率高、死亡率高及治愈率低等特点，多数患者就诊时已是晚期，进展迅速，缺少有效治疗方案，总体预后不佳。

在我国，引起原发性肝癌的原因主要是以下四个因素：1、病毒性肝炎：主要为乙型肝炎病毒(HBV)与丙型肝炎病毒(HCV)引起。我国肝癌病人HBV标记阳性的病人达到85％～90％。2、黄曲霉毒素。3、饮水污染。4、饮酒与吸烟。其中病毒性肝炎是最主要的原因。

原发性肝癌起病多较隐匿，早期一般多无临床症状，或仅有肝病的症状与体征，很难早期发现。一旦出现典型的临床表现，如肝区疼痛，消瘦，黄疸或腹水等，通常已属于中晚期。因此，在初诊的肝癌病人中仅有10％-15％的病人有进行根治性切除手术的机会，而其他绝大部分病人由于肿瘤的大小，部位，数目以及肝脏储备功能的影响，不能耐受手术切除，只能进行介入，射频，放疗和中医等姑息性治疗。

而且肝癌容易发生转移和复发，如大肝癌切除术后5年复发、转移率为60％～80％，小肝癌也有40％～50％。肝癌最早在肝内转移，很容易侵犯门静脉及分支并形成瘤栓，脱落后在肝内引起多发性转移灶；或者通过血行转移，形成肺转移和淋巴转移。因此，原发性肝癌病人总的预后不佳，迫切需要寻求更加有效的治疗方法。

目前缺少用于肝癌发生机理及抗肝癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料。而运用临床肿瘤组织直接建立细胞系的成功率较低，因此，通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型，进而通过原代培养建立的人源肿瘤细胞具有更接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性将具有更好的预测性，是研究肝癌发生分子机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的人肝癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上肝癌的生物学性状相差较大的不足，而提供一种新的人肝癌细胞系及其制备方法和用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人肝癌细胞，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201072。

本发明还提供如上所述的人肝癌细胞的子代细胞。

本发明还提供如上所述的人肝癌细胞的用途，用于在哺乳动物中产生肝癌。所述的哺乳动物可以是各种哺乳动物，优选裸小鼠。所述的裸小鼠优选BALB/c裸小鼠。所述的肝癌优选低分化或中分化肝细胞癌。所述的肝癌是癌细胞基因组中有乙肝病毒DNA整合的肝癌。

本发明还提供一种上述人肝癌细胞系的建立方法，包括以下步骤，

1)获得新鲜的临床肝癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；

2)穿刺接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。

其中，所述的哺乳动物、所述的肝癌都如上所述。

所述的新鲜的临床肝癌手术切除标本较佳的用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种。较佳的用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)漂洗。

所述的接种的方式可以是皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。对于肝癌较佳的是进行皮下穿刺接种。

所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳的包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱5％CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液(含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，2μg/ml乙醇胺，0.1％牛血清白蛋白，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，静置培养；

所述的传代培养方法可以是常规哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳的包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)。

本发明还提供一种筛选治疗肝癌的候选药物的方法，包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人肝癌细胞所导致的肝癌肿瘤。

具体的，本发明的筛选治疗肝癌的候选药物的方法包括以下步骤：

(1)将所述的肝癌细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人肝癌动物模型；

(2)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物。

其中，所述的动物模型优选裸小鼠。所述的裸小鼠优选BALB/C裸小鼠。较佳的可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于肝癌荷瘤动物。较佳的使用对照实验，一种优选的方式是：同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于肝癌荷瘤动物作为对照。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明的人肝癌细胞性状稳定，可稳定多次传代，并且乙肝病毒标记阳性，为肝癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有成瘤性，可以成功制备肝癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的抗肝癌药物筛选平台。也可用于研究肝癌转移的发病机理、肝癌的耐药机理，进而可以寻找肝癌转移和耐药的特征生物标志物。是人肝癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。

生物材料的保藏

本发明的人肝癌细胞，于2010年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，培养物名称为人源肝癌细胞LIXC-002，保藏编号为CCTCC NO：C201072。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1.LIXC-002细胞的形态学观察(100×)。

图2.LIXC-002细胞的染色体分析。A.LIXC-002细胞；B.裸小鼠细胞染色体(参照)。

图3.LIXC-002细胞的短片段重复序列(STR)分析结果。

图4.LIXC-002细胞的甲胎蛋白(AFP)表达，用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和凝胶电泳检测。

图5.LIXC-002细胞的乙肝病毒(HBV)DNA整合检测。

图6.LIXC-002细胞倍增时间曲线。

图7.Acumen高内涵细胞筛选仪分析LIXC-002细胞周期。

图8.LIXC-002细胞的成瘤性。A.LIXC-002细胞在裸小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；B.终点时肿瘤重量。

图9.肿瘤的病理组织切片。A.临床上取得的肿瘤标本(100×)；B.裸小鼠体内亲本肿瘤(100×)；C.LIXC-002细胞在裸小鼠体内成瘤(100×)。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 LIXC-002细胞的制备

裸小鼠：5只裸小鼠，雄性，体重16.0±1.0g，鼠龄5周，饲养于SPF环境。裸小鼠由上海斯莱克实验动物技术有限公司提供。

从上海中山医院获得新鲜的临床肝癌切除标本(男，71岁，原发性肝癌，病理诊断结果为：(肝右叶)肝细胞肝癌，分化II级，周围肝组织结节性肝硬化，脉管内见癌栓；乙肝两对半检查为：HBs抗原阳性，HBe抗体阳性，HBc抗体阳性)，立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，穿刺接种裸小鼠腋背部皮下。动物接种后，健康状态良好，行为正常。接种30天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种40天后开始生长明显，至接种后60天时，肿瘤体积超过300mm³。

原代培养：皮下穿刺接种人肝癌70～90天后，将荷瘤裸小鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)漂洗肿瘤组织块3次，去除结缔组织和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5％CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入10ml DMEM/F12培养液(含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，2μg/ml乙醇胺，0.1％牛血清白蛋白，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

传代培养：当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，向瓶中加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到第5代以后，将培养液逐步更换为RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素)，细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。

在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样，细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将该细胞系命名为LIXC-002，提交保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201072。

实施例2 LIXC-002细胞的生物学特性及应用

本发明采用含有胎牛血清和胰岛素的RPMI 1640培养液培养LIXC-002细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的LIXC-002细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。细胞基因组有乙肝病毒DNA整合。该LIXC-002细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。该LIXC-002细胞和其来源的临床肝癌肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及肝癌的发生、发展、转移和生物标志物提供新的试验材料。具体如下：

a.形态学观察

将培养LIXC-002细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。结果见图1，可见LIXC-002细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以不规则铺路石样为主，符合上皮样细胞的特点。

b.染色体的鉴定

将培养的LIXC-002细胞置于4℃12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2，可见，LIXC-002细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为多倍体，染色体众数(M)集中在100～120之间，占46.7％，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体(图2A)；而小鼠细胞的染色体数2n＝40，且均为顶端着丝粒(图2B)，据此可与人类染色体相区别。可见该LIXC-002细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。

c.短片段重复序列(STR)鉴定

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的LIXC-002细胞，用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(购自Axygen公司的AxyPrep^TM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，货号为AP-MN-MS-GDNA)提取细胞基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短片段重复序列的重复数。结果见图3，其中，Amelogenin为性染色体特异性位点。在美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库中，进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。

d.甲胎蛋白(AFP)表达鉴定

收集新鲜培养的LIXC-002细胞，用Trizol裂解细胞，氯仿和异丙醇提取总RNA。用随机引物逆转录获得cDNA。设计人AFP的RT-PCR引物(正义链：5’-TGCCAACTCAGTGAGGACAA-3’，反义链：5’-TCCAACAGGCCTGAGAAATC-3’)，退火温度为60℃，30s，产物长度为356碱基对(bp)。琼脂糖凝胶电泳结果显示(图4)，表明LIXC-002细胞的AFP表达为阳性。

e.乙肝病毒DNA拷贝检测

使用市售商品化乙肝病毒(HBV)PCR荧光定量诊断试剂盒(购于杭州博日科技有限公司)，参照使用说明进行。收集新鲜培养的LIXC-002细胞，并提取基因组DNA，用荧光探针定量检测基因组DNA中乙肝病毒拷贝数。见图5，图5A，LIXC-002和标准品的荧光PCR检测结果；图5B，不同浓度的标准品拟合所得标准曲线。结果显示，LIXC-002细胞中，乙肝病毒DNA为阳性。

f.细胞动力学

将LIXC-002细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中，进行培养，分别在12小时，24小时，36小时，48小时，72小时和96小时固定细胞，并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪Acumen测量每孔细胞数。细胞动力学研究结果显示，LIXC-002细胞的群体倍增时间为46.84小时(图6)。

g.细胞周期检测

将LIXC-002细胞以1000/孔的密度接种在96孔板中，培养24小时后，固定细胞，并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪Acumen测量每孔细胞数和每个细胞的总DNA含量(每个细胞的总DNA含量和该细胞的总PI荧光强度呈正比)；并根据不同细胞周期时，细胞总DNA含量的变化，计算各个细胞周期的细胞总数。结果显示，LIXC-002细胞G₁期为28.70％，S期为22.67％，G₂/M期为32.66％，8N期为7.24％。根据细胞增殖指数公式PI＝(G₂/M+S)÷(G₀/G₁+S+G₂/M+8N)×100％，计算结果：LIXC-002细胞PI＝60.62％(图7)。

h.细胞的成瘤性

体外大规模培养和收集LIXC-002细胞，皮下接种BALB/C裸小鼠(每只动物接种5.0×10⁶个细胞，共接种6只动物)，每周三次调查动物体重和肿瘤大小。接种约10天后，肿瘤开始形成并生长。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2(见图8A)。在约30天后肿瘤开始快速生长，第90天结束实验处死动物，肿瘤重量为1.22g±0.37g(见图8B)。可见该LIXC-002细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

i.肿瘤的病理学鉴定

将实施例1的临床肝癌手术标本、穿刺接种于裸小鼠背部皮下90天后皮下长出的肿瘤、和上述h步骤中LIXC-002细胞在裸小鼠皮下接种90天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和H&E染色，结果见图9。它们的病理诊断结果见下表1。可见临床标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤和LIXC-002细胞在裸小鼠体内所成肿瘤的结构类似，形成对应关系。

表1.各肿瘤标本的病理诊断结果

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种人肝癌细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201072。

2.如权利要求1所述的人肝癌细胞的子代细胞。