CN102067828A

CN102067828A - 人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测

Info

Publication number: CN102067828A
Application number: CN2009102238456A
Authority: CN
Inventors: 姚明; 王晓敏; 闫明霞; 孔韩卫; 刘蕾; 萨冰清; 李静
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-11-24
Also published as: CN102067828B

Abstract

本发明公开一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测，用肺转移灶，即人恶性黑色素瘤细胞株A375小鼠肺转移，在SCID小鼠用体内筛选的方法建立了皮下移植小鼠高转移模型及相应的细胞亚系，人黑色素瘤高转移细胞亚系为A375sci，是人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主，染色体范围为60-75条。该细胞亚系存在血路和淋巴两个转移途径；提出用深度免疫缺陷动物进行高转移模型的体内筛选，而在裸小鼠体内表达和应用。应用PCR方法检测Alu基因方法简单、灵敏度高、特异性强，可用于人体肿瘤动物异种移植模型中检测脏器转移特别是微转移。

Description

人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测

技术领域

本发明涉及一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测，属于动物模型和动物细胞系的技术领域。

背景技术

肿瘤的侵袭与转移时恶性肿瘤最基本的生物学特性之一，原发性肿瘤致死是较为罕见的，90％以上肿瘤患者的死于肿瘤细胞在人体内的转移时。

人黑色素瘤是危害头颈部的主要疾病之一，成为最常见的恶性肿瘤。然而目前肿瘤转移的确切机制尚不十分清楚，关于肿瘤转移一直是肿瘤学研究的热点。所以在本领域的研究中较大的局限性，制约了对人黑色素瘤转移机制的研究的进展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测，以解决现有技术所存在的诸多不足之处。

用肺转移灶(人恶性黑色素瘤细胞株A375小鼠肺转移)在SCID小鼠用体内筛选的方法建立了皮下移植小鼠高转移模型及相应的细胞株，而且存在血路和淋巴两个转移途径；提出用深度免疫缺陷动物进行高转移模型的体内筛选，而在裸小鼠体内表达和应用的实验思路，并获得证实。

Alu顺序具有种属特异性，是人类基因组共有的序列且只为灵长类所特有。人Alu顺序探针只能用于检测人基因组中的Alu序列。利用PCR方法可以在脏器中检测常规病理学检查无法发现的微转移的肿瘤细胞。我们用BNX小鼠进行人黑色素瘤皮下移植，并检测了相关脏器的Alu基因表达，由于移植的瘤组织块完全来源于人黑色素瘤所以保证了实验的可靠性、特异性和灵敏性。

应用PCR方法检测Alu基因方法简单、灵敏度高、特异性强，可用于人体肿瘤动物异种移植模型中检测脏器转移特别是微转移，是一种值得推广的方法，有必要深入探讨。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种人黑色素瘤高转移模型，其特征在于，用人恶性黑色素瘤细胞株A375(2000年9月从中国科学院上海生命科学院细胞库获取，细胞编号TCHu 4，由上海市肿瘤研究所按常规方法长期保存和传代)进行SCID小鼠皮下移植，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。

一种人黑色素瘤高转移模型的建立方法，包括以下步骤。

(1)利用人恶性黑色素瘤细胞株A375进行SCID小鼠皮下移植，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增；

(2)SCID小鼠体内综合筛选；选取深度免疫缺陷的SCID小鼠进行肿瘤高转移的体内筛选，等肿瘤长至直径1-2cm大小时，进行皮下移植传代，待动物出现明显恶性病质时，取肺可疑灶重复上述过程；第四代起按转移肿瘤组织→皮下移植→肺转移的体内筛选方式直接传代。

(3)进行试验检测，验证细胞特征。

其中步骤(2)所述皮下转移方法是将肿瘤组织切成2mm³大小，用穿刺针移植至SCID小鼠右侧腋窝皮下，每次筛选传代5-20只SCID小鼠不等，雌雄兼用，5-8周龄，饲养和实验严格按照SPF要求。

其中步骤(2)潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右，荷瘤寿命从60-75天下降并稳定在45天左右。

其中步骤(2)皮下100％成瘤；肺转移率1至5代分别16.7％(1/6)、60％(3/5)、50％(4/8)、70％(14/20)和88.9％(16/18)，从第6代起肺转移率保持在100％；体表淋巴结转移第5代观察SCID小鼠皮下移植的同测腋窝淋巴结转移，用该动物的肺转移灶继续体内筛选，第6代至20代的186只动物中的147只发生淋巴结转移(转移率79.0％)，筛选第18代Scid小鼠，腋窝淋巴结肿大，直径约1.2×1.2cm。

其中步骤(3)中所述试验包括：病理组织学检查、免疫组织化观察、流式细胞分析。

所述病理组织学检查，光镜下筛选的皮下移植瘤巢团状弥散分布。肺脏的肿瘤细胞弥散状及腺样排列，充斥在肺脏边缘，肺泡间隔及支气管周围，细胞排列的形态、大小及分布各不相同，细胞分化差、核大、分裂相多见。每代均能见到肺血管内有散在或成团的肿瘤细胞。

所述免疫组织化观察：筛选的肿瘤组织免疫组化结果TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性，Intergrin beta5阴性，CD31阳性，nm23(nm蛋白)阴性。

所述流式细胞分析：G2-M+S期(增殖期)细胞分别为39.38％±3.27和53.17％±16.1，细胞自然调亡为20.70％±11.51和11.90％±6.93，体内筛选后的人黑色素瘤模型和非转移模型相比，肿瘤细胞生长旺盛，调亡减少。

一种人黑色素瘤高转移细胞亚系，其特征在于，所述人黑色素瘤高转移细胞亚系为A375sci，是人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主，染色体范围为60-75条。

人黑色素瘤高转移细胞亚系A375sci，包藏于中国典型培养物保藏中心。保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山，邮编430072。保藏日期2009年7月29日，保藏编号CCTCC NO：C200954。

所述源细胞是人恶性黑色素瘤细胞株A375(简称为人黑色素瘤细胞A375，或A375)。

所述裸小鼠肺转移率是90％以上、BNX小鼠肺转移率是100％并伴有转移率80％以上的淋巴结转移。

一种人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人黑色素瘤高转移细胞系的建立与传代：

将荷瘤小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出皮下移植瘤A375，剔除坏死组织、纤维包膜及血管，用含双抗的PBS洗2次，向组织滴1-2滴含10％胎牛血清的DMEM培养液，用显微剪刀和显微镊将其尽量剪成小块，用显微镊将剪切好的组织块放在6cm培养皿并在皿底均匀放置，每一小块间距0.5cm左右。沿皿壁缓缓加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，然后盖好皿盖，将培养皿放置在37℃、含5％CO₂的培养箱内静置培养，以后所建立的原代细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养和传代，命名为A375sci。

(2)细胞形态学观察和生长曲线测定：

单细胞悬液加入24孔板培养，每孔含4×10⁴个细胞。次日消化计数3孔细胞，连续计数7天，绘制生长曲线，按下列公式计算细胞倍增时间：TD＝Tlg2/lg(N/N₀)(TD：倍增时间，T：时间间隔；N₀：起点细胞数，N：终点细胞数)。未经筛选的A375以同样方法进行测定作为对照；

(3)进行试验检测，验证细胞特征。进行统计。

所述试验包括：流式细胞术分析、细胞侵袭基底膜实验、细胞染色体分析、体内致瘤实验和PCR检测。

所述流式细胞术分析：体内筛选后的瘤组织取出后，加含10％胎牛血清的DMEM培养液常规培养。第5天部分细胞开始贴壁，小组织块周围有少许细胞向外游出，第10天细胞已经牢固贴壁，更换培养液。此后，根据细胞生长情况传代，随着传代次数的增加成纤维细胞可完全去除；此后每3至4天传代一次，中间更换培养液一次，细胞生长良好；目前已传至10代以上。

所述A375sci与A375一样，半贴壁生长，贴壁程度低于后者；形态以圆形或梭形为主，大小较一致，略小于A375细胞；喜好聚集生长，尤其是上层培液中的悬浮生长的细胞，常常成簇或成团。

所述细胞染色体分析：A375sci为人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主。染色体范围为60-75条。

体内致瘤实验：将A375sci细胞浓度调整为1.5×10⁷，以0.2ml/只分别接种到13只BNX小鼠体侧近腋部皮下，濒死前处死小鼠，观察各脏器转移情况；将皮下肿瘤接种到11只裸小鼠体侧近腋部皮下，平行向下传代，观察转移情况；BNX小鼠和裸小鼠均表现出很好的转移；将肺转移灶移植到裸小鼠腋侧皮下，看到淋巴结广泛转移；肺脏表面粗糙充血，见灰血色小结节成片或弥散分布。

PCR检测：通过Alu-PCR检测，被检测小鼠肺部转移灶及淋巴结均呈阳性，BNX小鼠皮下接种A375sci后形成的肺转移灶，裸小鼠淋巴结转移及肺转移。

一种人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A375sci黑色素瘤BNX皮下移植模型的建立：待肿瘤长到合适大小，颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，75％酒精消毒皮肤，剥取出移植瘤，置于加抗生理盐水中漂洗，剔除纤维包膜及出血坏死部分，切取生长良好的瘤组织，将其剪切成若干个约1.5mm×1.5mm×1.5mm的瘤组织小块备用；抓取动物，固定，消毒皮肤，用20号套管针将剪切好的瘤组织块移植小鼠右侧背部近腋部皮下。按此法皮下移植BNX小鼠34只；

(2)肺组织取材：

从移植的第二天起算，在2W、3W、4W、5W，批量处死8只动物，第五周为10只动物。脱颈椎处死小鼠，编号，称重量取廇径；消毒水洗净，剖检；观察肿瘤转移情况，肉眼及压片对肺的转移情况进行判定与记录；取转移灶或疑似转移灶用于Alu-PCR，以及中性甲醛固定，留作病理；多余肺组织锡纸包好，保存于超低温冰箱；

(3)Alu-PCR；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

取5μlPCR反应液与1μl 6×Loading Buffer混合，在1.7％琼脂糖凝胶电泳，所述琼脂糖凝胶含终浓度为1μg/mlEtBr，在点样孔内点样，110V，30min；

(5)凝胶成像显影

在凝胶图像处理系统中观察结果。

其中步骤(3)所述Alu-PCR包括：

1)DNA的提取；

2)DNA浓度的测定；

3)Alu-PCR，扩增条件95℃，5min；95℃，30s；60℃，20s；72℃，20s；72℃，7min.30cycles.。

所述Alu-PCR的引物序列：

Alu-w1 Sequence(5’to 3’)Gcc TgT AAT CCC AgC ACT TTg；

Alu-w2 Sequence(5’to 3’)ACg CCA TTC TCC TgC CTC A。

所述Alu-PCR的基本反应体系：

Component Volum(20ul) Concentration

H₂O nuclease free 14.9

10*Buffer 2.0 1×

Mgcl₂ 1.2 25mM

dNTP_S 0.4 0.2mM

Alu引物-w1 0.2 100uM

Alu引物-w2 0.2 100uM

TaqDNA聚合酶 0.1 5u/μl

模板DNA 0.1 0.1μg/μl

所述Alu-PCR的结果：第五周，A375sci移植到BNX皮下，4W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移阳性率为100％。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1A为SCID小鼠淋巴结转移。

图1B为SCID小鼠肺转移。

图1C为裸小鼠肺转移。

图2A裸小鼠淋巴结转移。

图2B裸小鼠淋巴结转移。

图3皮下瘤(HE×100)。

图4肺转移(HE×100)。

图5肺小血管内有大量肿瘤细胞(HE×1000)。

图6淋巴结转移(HE×100)。

图7筛选的皮下移植瘤电镜观察。

图8A为筛选的皮下移植瘤IHC结果，TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性。

图8B为筛选的皮下移植瘤IHC结果，Intergrin beta5阴性。

图8C为筛选的皮下移植瘤IHC结果，CD31阳性。

图8D为筛选的皮下移植瘤IHC结果，nm23(nm蛋白)阴性。

图9A为人黑色素瘤A375细胞形态学观察(光镜×200)。

图9B为人黑色素瘤A375sci细胞形态学观察(光镜×200)。

图10A375细胞与A375sci细胞生长曲线。

图11A为A375细胞侵袭基底膜实验。

图11B为A375sci细胞侵袭基底膜实验。

图12A375sci皮下移植105d肺转移的PCR检测。

图13BNX小鼠皮下接种A375sci后形成的肺转移灶。

图14A为A375sci裸小鼠淋巴结转移。

图14B为A375sci裸小鼠肺转移。

图15PCR检测BNX小鼠肺微转移(2w)结果。

图16A为PCR检测BNX小鼠肺微转移(3w)结果。

图16B为PCR检测BNX小鼠肺微转移(3w)结果。

图17为PCR检测BNX小鼠肺微转移(4w)结果。

图18为PCR检测BNX小鼠肺微转移(5w)结果。

人黑色素瘤高转移细胞亚系A375sci。

保藏日期2009年7月29日。

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC。

保藏编号CCTCC NO：C200954。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

一、人黑色素瘤SCID小鼠皮下移植高转移模型的体内筛选

1.1材料

1.1.1动物SCID小鼠(T、B细胞功能缺陷)，由上海市肿瘤研究所提供[生产许可证号为SCXK(沪)2007-0001]。鼠龄6～8周，体重18～22g，雌雄兼用，试验及饲养严格遵守SPF级标准要求[使用许可证号为SYXK(沪)2007-0001]。

1.1.2细胞A375黑色素瘤细胞，由上海市肿瘤研究所按常规方法长期保存和传代(2000年9月从中国科学院上海生命科学院细胞库获取，细胞编号TCHu 4。

1.1.3试剂生理盐水，庆大霉素，1％戊巴比妥钠，10％中性甲醛溶液，2.5％戊二醛，内源性过氧化物酶，1％锇酸固定液，3％醋酸铀-枸橼酸铅，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，DAB，苏木素，胎牛血清，DMEM，胰蛋白酶，PBS等均为进口分装或国产分析纯试剂。

2.1.4器械YZ20T4手术显微镜由苏州六六视觉科技股份有限公司生产；CJ-2F型医用净化工作台由苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产；双人超净工作台由苏州净化设备有限公司生产，型号为SW-CJ-2FD；恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司产品，型号为DK-S22；数码相机为NI KON产品；超低温冰箱(Jouan，France)；液氮生物容器(MVE CRYOSYTEM 4000)；眼科剪；眼科镊；培养皿；20号套管针；电热真空灭菌器等为国产。

1.2方法

1.2.1A375黑色素瘤皮下移植模型的建立

利用人黑色素瘤A357细胞株进行SCID小鼠皮下移植实验时，发现其中一批动物中(共6只)有一只明显肺转移，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。

1.2.2SCID小鼠体内综合筛选

选取深度免疫缺陷的SCID小鼠进行肿瘤高转移的体内筛选。等肿瘤长至直径1-2cm大小时，进行皮下移植传代，待动物出现明显恶性病质时，取肺可疑灶重复上述过程。第四代起按转移肿瘤组织→皮下移植→肺转移的体内筛选方式直接传代。皮下转移方法是将肿瘤组织切成2mm³大小，用穿刺针移植至SCID小鼠右侧腋窝皮下，每次筛选传代5-20只SCID小鼠不等，雌雄兼用，5-8周龄，饲养和实验严格按照SPF要求。

1.2.3病理组织学检查

将出现恶病质的动物解剖，取肺脏，转移淋巴结和可疑脏器，10％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色。皮下移植瘤以2.5％戊二醛和1％锇酸固定液双固定，树脂包埋，超薄切片，3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察、拍片。

1.2.4免疫组织化观察

取筛选的肿瘤组织、常规固定、包埋和切片，选用nm23(nm蛋白)、Intergrin beta5、CD31、TGF-betal(转换生长因子-betal)4个抗体做免疫组化染色。方法如下：取筛选的肿瘤组织以10％中性甲醛溶液固定，石蜡切片常规脱蜡水化，内源性过氧化物酶阻断10min，一抗孵育过夜(4℃)，二抗孵育20min(室温)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育20min(室温)，DAB显色，苏木素衬染后常规脱水，透明，封片。检测四个抗体的表达情况。判断标准：阳性为棕黄色或棕褐色着色。

1.2.5流式细胞分析

取皮下移植4周的人黑色素瘤A375和筛选第21代高转移A375sci模型SCID小鼠各3例，进行肿瘤流式细胞分析。方法如下：用机械法将新鲜的实体瘤组织剪碎，用200目尼龙网过滤成单细胞悬液，置于柠檬酸缓冲液(Citratebuffer)1小时以上。调整细胞浓度到1×10⁶个/ml左右，离心后弃去上清液，加入1800μl A溶液(胰酶消化液)充分作用。加入1500μl B溶液(胰酶抑制酶液)数分钟。加入1500μl C溶液(PI-碘化丙锭)作用15分钟以上。用200目尼龙网再次过滤。上机(FCM)作细胞DNA含量采样及细胞周期分析。

1.3结果

1.3.1体内筛选结果

经体内反复筛选，成功建立了高肺转移合并淋巴结转移模型，至今已传至21代以上。潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右，荷瘤寿命从60-75天下降并稳定在45天左右。筛选传代的243只SCID小鼠，皮下100％成瘤，肺转移率1至5代分别16.7％(1/6)、60％(3/5)、50％(4/8)、70％(14/20)和88.9％(16/18)，从第6代起肺转移率保持在100％(图1B)。体表淋巴结转移1至4代未发现，第5代观察一只SCID小鼠皮下移植的同测腋窝淋巴结转移，用该动物的肺转移灶继续体内筛选，第6代至20代的186只动物中的147只发生淋巴结转移(转移率79.0％)。筛选第18代Scid小鼠，腋窝淋巴结肿大，直径约1.2×1.2cm。(图1A)。

皮下移植生长前期较快，瘤体表面有完整包膜，3-4周出现坏死，与周围均有不同程度的粘连和浸润，肺转移出现在3周以后，晚期肺脏表面粗糙充血，可见灰白色散在或成片的转移结节。淋巴结转移比肺转移稍晚，首先出现在皮下移植部位的同侧腋窝，部分动物可继而出现在对侧腋窝和腹股沟淋巴结转移，转移的淋巴结明显增大，最大直径可超过1cm。动态观察和解剖第18代荷瘤小鼠，肺转移率1至6w分别0％(0/5)、0％(0/5)、20％(1/5)、80％(4/5)、100％(5/5)和100％(5/5)，淋巴结转移率1至6w分别0％(0/5)、0％(0/5)、0％(0/5)、40％(2/5)、60％(3/5)和80％(4/5)。

将肺转移灶移植到裸小鼠腋侧皮下，可以看到淋巴结广泛转移(图2A、B)。肺脏表面粗糙充血，可见灰血色小结节成片或弥散分布(图1C)。

1.3.2生物学特性观察

1.组织病理学检测

光镜下筛选的皮下移植瘤巢团状弥散分布(图3)。肺脏的肿瘤细胞弥散状(图4)及腺样排列，充斥在肺脏边缘，肺泡间隔及支气管周围，细胞排列的形态、大小及分布各不相同，细胞分化差、核大、分裂相多见。每代均能见到肺血管内有散在或成团的肿瘤细胞(图5)，前10代尤为明显，这可能提示筛选初期以血路转移为主，筛选后期血路转移与淋巴转移并存的转移特点。肿大的淋巴结内可见大量肿瘤细胞，弥散分布，几乎破坏全部淋巴结结构(图6)。电镜下瘤细胞形态不规则，核大而异形，多个核仁，核分裂像多见，胞质内线粒体、内质网等增多。(图2-7)。

3.免疫组织化观察

筛选的肿瘤组织免疫组化结果显示(表1)，TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性(图8A)，CD31阳性(图8C)，Intergrin beta5阴性(图8B)，nm23(nm蛋白)阴性(图8D)

表1A375sci肿瘤免疫组化结果

抗体名称	结果	分析
			nm23(nm蛋白)	-	Nm为转移抑制基因，其蛋白几乎在所有正常细胞中均表达。表达越高，转移倾向越低，反之亦然。该蛋白表达阴性，说明这些细胞具有较高的转移倾向。
Intergrin beta5	-	该蛋白属于整合素异源二聚体(alpha和beta)的bate亚单位
					之一，整合素在很多生物学过程中发挥着重要功能，如细胞的生长，分化和调亡。该蛋白表达下调是肿瘤细胞黏附能力减弱，迁移能力增进而导致肿瘤转移的因素之一。

CD31	+	CD31是血管内皮细胞的特异标志，用于显示肿瘤组织中血管密度，一般来说，血管密度越高，肿瘤生长越快，肿瘤转移的机会越多。
			TGF-betal(转换生长因子-betal)	+	TGF-betal是一种在肿瘤转移过程中的一个重要环节“血管新生”过程中发挥着重要作用的蛋白。其作用具有剂量依赖性，低浓度时具有促进作用，高浓度时具有抑制作用。

2.流式细胞分析

其中G2-M+S期(增殖期)细胞分别为39.38％±3.27和53.17％±16.1，细胞自然调亡为20.70％±11.51和11.90％±6.93。结果显示体内筛选后的人黑色素瘤模型和非转移模型相比，肿瘤细胞生长旺盛，调亡减少。

二、A375sci高转移细胞系的生物学特性的研究

2.1材料

2.1.1瘤源

经体内反复筛选，成功建立的高肺转移合并淋巴结模型，取其皮下移植瘤。

2.1.2细胞培养试剂

DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自GIBCO BRL公司；培养皿及培养瓶购自Grener公司；Transwell购自Corning公司；Matrigel为BectonDickinson公司产品；其他化学试剂，如Giemsa染色液、结晶紫等均为进口分装或国产分析纯试剂。

2.1.3仪器

CO₂培养箱为Heraeus产品；倒置显微镜为重庆光电仪器有限公司产品，仪器型号为XDS-1B；正置显微镜为OLYMPUSG公司产品，型号为CKX41及CX41；超净工作台由苏州净化设备有限公司生产。型号为SW-CJ-2FD；CO₂培养箱为Heraeus产品，型号为BB 16UV，以及Thermon公司产品，型号为cell150；恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司产品，型号为DK-S22；倒置显微镜为重庆光电仪器有限公司产品，仪器型号为XDS-1B；数码相机为NIKON产品；超低温冰箱型号为Jouan，法国生产；液氮罐型号为，MVECRYSTEM 4000；；培养皿及培养瓶购自Grener公司；电热真空灭菌器；1000ml、200μl及50μl移液枪为GILSON公司产品，其他一些常规细胞培养耗材为国产。

2.1.4实验动物

BALB/c-nu/nu裸小鼠、BNX小鼠(T、B、NK细胞功能缺陷)，由上海市肿瘤研究所提供[生产许可证号为SCXK(沪)2007-0001]。鼠龄6～8周，体重18～22g，雌雄兼用，试验及饲养严格遵守SPF级标准要求[使用许可证号为SYXK(沪)2007-0001]。

2.方法

2.2.1人黑色素瘤高转移细胞系的建立与传代

将荷瘤小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出皮下移植瘤，剔除坏死组织、纤维包膜及血管。用含双抗的PBS洗2次，向组织滴1-2滴含10％胎牛血清的DMEM培养液，用显微剪刀和显微镊将其尽量剪成小块。用显微镊将剪切好的组织块放在6cm培养皿并在皿底均匀放置，每一小块间距0.5cm左右。沿皿壁缓缓加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，然后盖好皿盖，将培养皿放置在37℃、含5％CO₂的培养箱内静置培养。以后所建立的原代细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养和传代。

2.2.2细胞形态学观察和生长曲线测定

单细胞悬液加入24孔板培养，每孔含4×10⁴个细胞。次日消化计数3孔细胞，连续计数7天，绘制生长曲线，按下列公式计算细胞倍增时间：TD＝Tlg2/lg(N/N₀)(TD：倍增时间，T：时间间隔；N₀：起点细胞数，N：终点细胞数)。未经筛选的A375以同样方法进行测定作为对照。

2.2.3流式细胞术分析

A375及A375sci细胞各取两个样本，用PBS洗一遍，调整浓度到1×10⁶/ml左右；离心去掉上清液，加入1800μl A溶液(胰酶消化液)充分作用；加入1500μl B溶液(胰酶抑制酶液，RNase)数分钟；加入1500μl C溶液(PI-碘化丙锭)作用15min以上；用200目尼龙网再次过滤；上机(FCM)，做DNA细胞周期采样分析。重复一次。

2.2.4细胞侵袭基底膜实验

将metrigel与DMEM以1∶3混合，取30μL铺于Transwell小室中，CO₂培养箱中放置30min，形成一个基质屏障层。用0.25％胰蛋白酶消化A375及A375sci细胞，以5×10⁵/mL密度重新悬浮于无血清DMEM培养基中，取200μl上述细胞悬液加入Transwell小室中。将小室置于24孔板中，下室加入800μL含100ng/mlIGF的正常DMEM培养基，37℃孵育。48h后，擦去上室metrigel和未穿过膜的细胞，滤膜在甲醇中固定，HE染色，400倍光学显微镜下选择滤膜上下左右中5个不同视野，计数每个视野侵袭细胞数，计算平均值，实验重复3次。

2.2.5细胞染色体分析

细胞用胰蛋白酶消化，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液。逐滴加入4ml预温37℃的0.4％的KCl、4ml的0.4％柠檬酸钠和40μl秋水仙素(终浓度0.1μg/ml)，低渗处理120min，其间每隔20min吹打一次，加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)混匀预固定，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液。加入8ml固定液固定30min，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液，再重复固定1次，最后用适量固定液制成细胞悬液，制片，Giemsa染色，封片，拍照。随机挑选分散良好的30个分裂中期细胞进行染色体分析。

2.2.6体内致瘤实验

收集体外培养生长旺盛的连续传代细胞A375sci，调整细胞浓度为7.5×10⁶个/ml，取免疫缺陷BNX小鼠、裸小鼠，每只接种0.2ml于背右侧近腋部皮下，观察成瘤及器官转移情况。

2.2.7PCR检测A375sci在BNX小鼠体内的转移情况

体内致瘤实验的小鼠，在第十二周时，随机选取3只，检测其肺转移情况。

2.2.8统计学方法

实验结果中数据用SPSS统计软件进行t检验及方差分析。

3.3结果

3.3.1A375、A375sci细胞的复苏与传代

体内筛选后的瘤组织取出后，加含10％胎牛血清的DMEM培养液常规培养。第5天部分细胞开始贴壁，小组织块周围有少许细胞向外游出，第10天细胞已经牢固贴壁，更换培养液。此后，根据细胞生长情况传代，随着传代次数的增加成纤维细胞可完全去除。此后每3至4天传代一次，中间更换培养液一次，细胞生长良好。目前已传至10代以上，命名为A375sci。

3.3.2细胞形态学观察

A375sci(图9B)与A375(9A)一样，半贴壁生长，贴壁程度低于后者。形态以圆形或梭形为主，大小较一致，略小于A375细胞。喜好聚集生长，尤其是上层培液中的悬浮生长的细胞，常常成簇或成团。在细胞过于稀疏或过于紧密时，其生长通常会受到抑制。故平时传代时，要注意将细胞吹打分散均匀。

3.3.3生长曲线

A375sci与A375细胞倍增时间分别为21.6h和21.45h。前者的生长速度略慢于后者，无统计学差异。(图10)

3.3.4流式细胞术分析

把人黑色素瘤高转移细胞系A375sci和筛选前的A375细胞株应用流式细胞技术进行细胞周期比较，发现两者在代表细胞分裂增殖G2-M和S期存在明显差异，表明A375sci细胞较A375细胞分裂生长更为旺盛，结果见表2。

表2A375sci和A375细胞周期比较(％)

3.3.5细胞侵袭基底膜实验

通过三次过膜实验的数据可以看出，A375-sci细胞过膜能力显著强于A375细胞(P＜0.01)(表3，图11)。

表3A375sci细胞与a375细胞的侵袭能力的比较(x±s)

^**P＜0.01

3.3.6细胞染色体分析

结果显示为人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主。染色体范围为60-75条。显示该细胞具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。

3.3.7筛选细胞A375sci在不同小鼠体内的致瘤实验

将A375sci细胞浓度调整为1.5×10⁷，以0.2ml/只分别接种到13只BNX小鼠体侧近腋部皮下，濒死前处死小鼠，观察各脏器转移情况。另外将皮下肿瘤接种到11只裸小鼠体侧近腋部皮下，平行向下传代，观察转移情况。BNX小鼠和裸小鼠均表现出很好的转移(表4)

将肺转移灶移植到裸小鼠腋侧皮下，可以看到淋巴结广泛转移(14A)。肺脏表面粗糙充血，可见灰血色小结节成片或弥散分布(14B)。

表4A375sci黑色素瘤细胞体内致瘤各代转移情况(BNX、BALB/c-nu/nu)

3.3.8分子水平检测筛选细胞A375sci在动物体内的转移情况

通过Alu-PCR检测，可以看到被检测小鼠肺部转移灶及淋巴结均呈阳性。见图12。图13BNX小鼠皮下接种A375sci后形成的肺转移灶，图14A375sci裸小鼠淋巴结转移(A)及肺转移(B)。

三、A375sci在BNX小鼠体内微转移的动态检测

3.1材料

3.1.1瘤源

A375sci皮下瘤。(上海市肿瘤研究做长期保存和传代)

3.1.2实验动物

6～8周BNX小鼠，由上海市肿瘤研究所提供[生产许可证号为SCXK(沪)2007-0001]；体重18-22g，雌、雄兼用，实验及饲养严格遵守SPF级标准要求[使用许可证号为SYXK(沪)2007-0001]。

3.1.3仪器

微型高速台式离心机LEGEND MICRO 17R(Thermo公司)；自动PCR扩增仪：PCR System 9700；Tanon-3500全自动数码凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司)；Tanon-EPS100电泳仪(上海天能科技有限公司)。超净工作台；眼科剪；眼科镊；培养皿；20号套管针；电热真空灭菌器等同前。

3.1.4试剂

蛋白酶K(博大泰克)；SDS；引物Alu-w1、Alu-w1(上海生工生物工程技术服务有限公司)；dNTP；耐热DNA多聚酶；琼脂糖；Maker：GeneRuler DNALadder；EtBr；其余试剂均为国产分析纯。

3.2方法

3.2.1A375sci黑色素瘤BNX皮下移植模型的建立

待肿瘤长到合适大小，颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，75％酒精消毒皮肤，剥取出移植瘤，置于加抗生理盐水中漂洗，剔除纤维包膜及出血坏死部分，切取生长良好的瘤组织，将其剪切成若干个约1.5mm×1.5mm×1.5mm的瘤组织小块备用。抓取动物，固定，消毒皮肤，用20号套管针将剪切好的瘤组织块移植小鼠右侧背部近腋部皮下。按此法皮下移植BNX小鼠34只。

3.2.2肺组织取材

从移植的第二天起算，在2W、3W、4W、5W，批量处死8只动物，第五周为10只动物。脱颈椎处死小鼠，编号，称重量取廇径。消毒水洗净，剖检。观察肿瘤转移情况，肉眼及压片对肺的转移情况进行判定与记录。取转移灶或疑似转移灶用于Alu-PCR，以及中性甲醛固定，留作病理。多余肺组织锡纸包好，保存于超低温冰箱。

3.2.3Alu-PCR

1.DNA的提取

将BNX小鼠黑色素瘤肺组织剪碎，正常小鼠肺组织也于剪碎作为阴性对照。取1.5ml离心管加入500μlDNA抽提液，每管加20mg/ml蛋白酶K5μl，55℃过夜(＜16h)。次日，每管加500μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡5min，4℃8000rpm，15min；上清移至新管，重复该步骤两次。移上清至新管，加1ml无水乙醇，以及40μl醋酸铵，DNA棉絮状沉淀出现，12000rpm离心10min。弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml，12000rpm离心10min。弃上清，吸干乙醇，烘箱中烘干(30min/37℃)，勿太干燥。加入40μl H₂O溶解，同时加入20mg/mlRNA酶A 0.5μl/管，4℃过夜溶解。若需急用，可60℃溶解。

2.DNA浓度的测定

取2.6μl用水50倍稀释。分光光度仪A260/280测定浓度。

3.Alu-PCR

(1)引物序列

Alu-w1 Sequence(5’to 3’)Gcc TgT AAT CCC AgC ACT TTg

Alu-w2 Sequence(5’to 3’)ACg CCA TTC TCC TgC CTC A

(2)Alu-PCR的基本反应体系，见表5。

表5Alu-PCR的基本反应体系

Component	Volum(20ul)	Concentration
			H₂O nucleasefree	14.9
10*Buffer	2.0	1×
			Mgcl₂	1.2	25mM
dNTP_S	0.4	0.2mM
			Alu引物-w1	0.2	100uM
Alu引物-w2	0.2	100uM
			TaqDNA聚合酶	0.1	5u/μl
模板DNA	0.1	0.1μg/μl

(3)扩增条件

95℃，5min；95℃，30s；60℃，20s；72℃，20s；72℃，7min.30cycles.

4.琼脂糖凝胶电泳

取5μlPCR反应液与1μl 6×Loading Buffer混合，点样在1.7％琼脂糖凝胶(含EtBr，终浓度为1μg/ml)的点样孔内，110V，30min。

5.凝胶成像显影

在凝胶图像处理系统中观察结果。

3.3结果

3.3.1A375sci黑色素瘤BNX皮下移植模型的建立

A375sci皮下接种的34只BNX小鼠，100％成瘤，见表6。

表6

周数(W)	动物数(只)	体重(g)	瘤体积(mm³)
				2	8	24.84±1.48	179.39±201.53
3	8	25.07±1.32	1549.97±392.58
				4	8	25.33±1.14	2806.62±1058.11
5	10	29.37±2.56	6082.98±1737.76

3.3.2病理解剖学检查与PCR检测转移的结果比较

结果见表7。

表7

周数(W)/转移率(％)	病理剖检	PCR检测
			2	0％(0/8)	0％(0/8)
3	0％(0/8)	37.5％(3/8)
			4	37.5％(3/8)	75.5(6/8)
5	50％(5/10)	100％(10/10)

3.3.3PCR动态检测结果

1.第二周(2W)

A375sci移植到BNX皮下，2W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移率为0％(0/8)。

2.第三周(3W)

A375sci移植到BNX皮下，3W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移阳性率为37.5(3/8)。(图16A)

(备注：加样顺序：1孔.Maker 2孔.+3孔.-4.皮下瘤5、6、7、8孔.肺9孔.水)

(备注：加样顺序：1.Maker 2.+spc(已有)3.+spc(现提)4.-鼠尾(正常小鼠)

5、鼠尾(现提)6、A375sci皮下瘤7、8、9、10肺11.水)(图16B)

3.第四周(4W，)

A375sci移植到BNX皮下，4W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移阳性率为75.5(6/8)。(图17)(备注：加样顺序：1maker 2阳性3阴性4-11为肺组织1～8号)

4.第五周(5W)

A375sci移植到BNX皮下，4W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移阳性率为100％(10/10)。见图18。

(备注：加样顺序：1maker 2阳性3阴性4-13为肺组织1～10号)

四、讨论

肿瘤的转移经历了局部生长、游走、隔离器官内再生等过程，包括了局部浸润，进入血管。淋巴管，粘附和增殖等系列步骤。肿瘤细胞中只有很少细胞具有突破上述系列屏障的潜能而发生转移，体内筛选高转移动物模型，就是利用转移灶之间体内接种并反复传代的方法，把具有转移潜能的肿瘤细胞扩增、分离、纯化。采用上述思路和方法，我们成功地建立了一株黑色素瘤SCID小鼠皮下移植高转移模型A375sci至今传代至21代以上，不仅保持了原肿瘤地组织血和生物学特征，而且其高转移特性也稳定表达。

至今为止，理想地人体肿瘤高转移动物模型并不多，已建立地模型大多是原位移植模型，优点模拟了人体肿瘤的转移过程。我们建立的人黑色素瘤皮下模型，其转移过程重现了人体肿瘤转移的系列步骤和原位移植相比具有实验操作和观察方便，个体差异小和重复性好等优点。同时存在淋巴道和血道两个转移途径，体外建立的相应细胞系A375sci保持了高转移特性也是本模型的重要特点。通过体内验证实验证实，A375sci在不同免疫缺陷动物体内均能表达较高的转移率，BNX小鼠肺转移率为100％(13/13)，裸小鼠肺转移率为90.91％(10/11)。

重度免疫缺陷SCID小鼠，T、B淋巴细胞缺陷，更适合人体肿瘤移植，我们利用SCID小鼠将转移的肿瘤直接皮下移植，体内反复筛选，成功建立了高转移肿瘤模型，国内尚未见类似报道。筛选初期，我们度图在裸小鼠内做相同的高转移表达，结果未获成功。而用建立的高转移细胞系，不仅SCID小鼠体内重现了高转移特性，而且在裸小鼠体内也呈现了相似的转移现象，淋巴结转移率则较高。由此我们提出一个新的实验思路，即利用更深度免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，T、B、NK细胞联合免疫缺陷小鼠等)，进行高转移瘤株的筛选，然后使其在裸小鼠体内表达并用于抗肿瘤转移的研究。

肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的过程。以往对肿瘤淋巴结转移的判断多通过肉眼及常规HE病理检查。上世纪六十年代，Huvos AC第一次使用“微转移(micrometastasisi)”这一概念描述乳腺癌病患者淋巴结中直径小于2mm的转移灶，目前微转移一般指常规检测手段(临床体检、影像学、病理常规检查)不能发现的肿瘤转移灶^[49]。对于结直肠癌，常规病理检查无淋巴结转移癌的病例并非不存在微转移，这在一定程度上影响对患者的诊治及预后的评估^[50]。临床研究表明，肿瘤微转移是影响肿瘤预后的主要因素^[51]。肿瘤微转移是一个独立的预后指标，大量临床研究已经证实：存在微转移的肿瘤患者术后复发转移的风险明显增加，预后不良，而在形成明确转移灶之前作出微转移的诊断有助于确定更加的治疗方案。在人癌转移动物模型研究中，碰到的另一个困难就是：宿主体内微小转移瘤的辨别。以往主要的检验手段是通过采用广泛地组织学检查，费时费力，对于无任何临床表现、常规检查方法很难发现的微小转移则无法判别。因此，获得一种敏感、精确的探测组织中微转移灶的方法，将能允许对单一肿瘤组织细胞的转移潜能直接评价。此外，还可以详细研究转移过程的时期特征和转移细胞的组织分布情况。随着研究的不断深入，发展了一种利用人类DNA重复序列分子探针探测微小转移灶的方法。其原理是裸小鼠组织中不存在人类DNA，而当有人类肿瘤细胞所形成的转移瘤存在时，则可用此DNA分子探针，采用斑点分析和原位杂交技术探测出来，是一种敏感可靠的分析方法，并能进行定量研究，在人癌接种到裸鼠体内后早期就能检测出来。

PCR技术作为分子生物学的一种主要手段，具有快速、灵敏、准确等特性。Alu重复序列在人类基因组中的拷贝数很高(平均3～5kb有1份拷贝)，以此为PCR引物，发展了Alu-PCR方法，建立了从杂种细胞株等复合基因组源中特异扩增人类基因组DNA的方法。在此基础上发展了一系列Alu-PCR的应用技术，包括从特定杂种细胞株分离染色体区域特异的单拷贝探针群，用Alu-PCR或Alu-载体PCR分离YAC末端探针进行走步分析等。如Cole等用Alu-PCR方法获得STS(sequence tagge sites)后筛选并构建了2.5Mb的YAC重叠群并进一步发展了用Alu-PCR直接标记杂种细胞株中的人类基因组DNA，以此为复合探针从列阵的YAC库中筛选区域特异的YAC克隆。

Alu家族是一种仅存在于灵长类基因组中的散布重复序列，虽然各Alu重复顺序拷贝之间存在着差异，但现已确定其有一些相对保守的重复区域^[52]。从大量不同实验得知Alu序列长约300bp，在距一端约170bp有Alu I酶切位点，故而得名，两个Alu片段的间隔区平均为3kb，且Alu家族的标准序列已得知，使得以Alu保守区为引物结合部位进行PCR扩增的Alu-PCR新技术逐步发展起来。Alu-PCR技术利用人类DNA中普遍在的Alu重复序列作为引物，此技术较一般PCR反应的区别就在于它引物设计利用了人类的Alu家族。根据Alu家族的标准序列，设计合适的识别其保守区的PCR双引物，即可经PCR反应扩增Alu片段间隔区域，从而可获得足够量的两个Alu之间的DNA序列。

申请人通过文献的查阅^[54-60]，利用软件设计了Alu引物，通过前期实验的摸索，掌握反应最佳条件。然后用BNX小鼠进行人黑色素瘤皮下移植，并检测了相关脏器的Alu基因表达，由于移植的瘤组织块完全来源于人黑色素瘤所以保证了实验的可靠性、特异性和灵敏性。在2W时，常规病理检测无法看到肺转移，PCR检测也是阴性；在3W、4W、5W时，常规病理检测肺转移率分别为0/8、3/8、5/10，PCR检测肺转移率分别为3/8、6/8、10/10。可见，分子生物学的方法可以早期检测肿瘤微转移情况的发生，其灵敏度和高效性要优于常规病理检测。因此，可以利用Alu基因探测存在于其他动物体内(如小鼠)的人类细胞。通过PCR技术扩增特异的基因片段来鉴别肿瘤的微转移，这为这为人癌标本异种于免疫缺陷小鼠体内后微转移的检测提供了一个很好的手段。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种人黑色素瘤高转移模型，其特征在于，用人恶性黑色素瘤细胞株A375进行SCID小鼠皮下移植，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。

2.一种如权利要求1所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，包括以下步骤：

(2)SCID小鼠体内综合筛选；选取深度免疫缺陷的SCID小鼠进行肿瘤高转移的体内筛选，等肿瘤长至直径1-2cm大小时，进行皮下移植传代，待动物出现明显恶性病质时，取肺可疑灶重复上述过程；第四代起按转移肿瘤组织→皮下移植→肺转移的体内筛选方式直接传代；

(3)进行试验检测，验证细胞特征。

3.根据权利要求2所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，其中步骤(2)所述皮下转移方法是将肿瘤组织切成2mm³大小，用穿刺针移植至SCID小鼠右侧腋窝皮下，每次筛选传代5-20只SCID小鼠不等，雌雄兼用，5-8周龄，饲养和实验严格按照SPF要求。

4.根据权利要求2所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，其中步骤(2)潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右，荷瘤寿命从60-75天下降并稳定在45天左右。

5.根据权利要求2所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，其中步骤(2)皮下100％成瘤；肺转移率1至5代分别16.7％(1/6)、60％(3/5)、50％(4/8)、70％(14/20)和88.9％(16/18)，从第6代起肺转移率保持在100％；体表淋巴结转移第5代观察SCID小鼠皮下移植的同测腋窝淋巴结转移，用该动物的肺转移灶继续体内筛选，第6代至20代的186只动物中的147只发生淋巴结转移(转移率79.0％)，筛选第18代Scid小鼠，腋窝淋巴结肿大，直径约1.2×1.2cm。

6.根据权利要求2所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，其中步骤(3)中所述试验包括：病理组织学检查、免疫组织化观察、流式细胞分析。

7.根据权利要求6所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，所述病理组织学检查，光镜下筛选的皮下移植瘤巢团状弥散分布；肺脏的肿瘤细胞弥散状及腺样排列，充斥在肺脏边缘，肺泡间隔及支气管周围，细胞排列的形态、大小及分布各不相同，细胞分化差、核大、分裂相多见；每代均能见到肺血管内有散在或成团的肿瘤细胞。

8.根据权利要求6所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，所述免疫组织化观察：筛选的肿瘤组织免疫组化结果TGF-betal阳性，Intergrin beta5阴性，CD31阳性，nm23阴性。

9.根据权利要求6所述的人黑色素瘤高转移模型的建立方法，其特征在于，所述流式细胞分析：G2-M+S期细胞分别为39.38％±3.27和53.17％±16.1，细胞自然调亡为20.70％±11.51和11.90％±6.93，体内筛选后的人黑色素瘤模型和非转移模型相比，肿瘤细胞生长旺盛，调亡减少。

10.一种人黑色素瘤高转移细胞亚系，其特征在于，所述人黑色素瘤高转移细胞亚系为A375sci，是人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主，染色体范围为60-75条。

11.根据权利要求10所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系，其特征在于，所述源细胞是人恶性黑色素瘤细胞株A375。

12.根据权利要求10所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系，其特征在于，所述裸小鼠肺转移率是90％以上、BNX小鼠肺转移率是100％并伴有转移率80％以上的淋巴结转移。

13.一种根据权利要求10所述人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人黑色素瘤高转移细胞系的建立与传代：

将荷瘤小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出皮下移植瘤，剔除坏死组织、纤维包膜及血管，用含双抗的PBS洗2次，向组织滴1-2滴含10％胎牛血清的DMEM培养液，用显微剪刀和显微镊将其尽量剪成小块，用显微镊将剪切好的组织块放在6cm培养皿并在皿底均匀放置，每一小块间距0.5cm左右；沿皿壁缓缓加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，然后盖好皿盖，将培养皿放置在37℃、含5％CO₂的培养箱内静置培养，以后所建立的原代细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养和传代，命名为A375sci；

(2)细胞形态学观察和生长曲线测定：

单细胞悬液加入24孔板培养，每孔含4×10⁴个细胞；次日消化计数3孔细胞，连续计数7天，绘制生长曲线，按下列公式计算细胞倍增时间：TD＝Tlg2/lg(N/N₀)，其中TD：倍增时间，T：时间间隔；N₀：起点细胞数，N：终点细胞数；未经筛选的A375以同样方法进行测定作为对照；

(3)进行试验检测，验证细胞特征，进行统计。

14.根据权利要求13所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，所述试验包括：流式细胞术分析、细胞侵袭基底膜实验、细胞染色体分析、体内致瘤实验和PCR检测。

15.根据权利要求14所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，所述流式细胞术分析：体内筛选后的瘤组织取出后，加含10％胎牛血清的DMEM培养液常规培养；第5天部分细胞开始贴壁，小组织块周围有少许细胞向外游出，第10天细胞已经牢固贴壁，更换培养液；根据细胞生长情况传代，随着传代次数的增加成纤维细胞可完全去除；此后每3至4天传代一次，中间更换培养液一次，细胞生长良好；目前已传至10代以上。

16.根据权利要求13所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，所述A375sci与A375一样，半贴壁生长，贴壁程度低于后者；形态以圆形或梭形为主，大小较一致，略小于A375细胞；喜好聚集生长，尤其是上层培液中的悬浮生长的细胞，常常成簇或成团。

17.根据权利要求14所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，所述细胞染色体分析：A375sci为人类肿瘤细胞核型，染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主；染色体范围为60-75条。

18.根据权利要求14所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，体内致瘤实验：将A375sci细胞浓度调整为1.5×10⁷，以0.2ml/只分别接种到13只BNX小鼠体侧近腋部皮下，濒死前处死小鼠，观察各脏器转移情况；将皮下肿瘤接种到11只裸小鼠体侧近腋部皮下，平行向下传代，观察转移情况；BNX小鼠和裸小鼠均表现出很好的转移；将肺转移灶移植到裸小鼠腋侧皮下，看到淋巴结广泛转移；肺脏表面粗糙充血，见灰血色小结节成片或弥散分布。

19.根据权利要求14所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法，其特征在于，PCR检测：通过Alu-PCR检测，被检测小鼠肺部转移灶及淋巴结均呈阳性，BNX小鼠皮下接种A375sci后形成的肺转移灶，裸小鼠淋巴结转移及肺转移。

20.一种人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A375sci黑色素瘤BNX皮下移植模型的建立：待肿瘤长到合适大小，颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，75％酒精消毒皮肤，剥取出移植瘤，置于加抗生理盐水中漂洗，剔除纤维包膜及出血坏死部分，切取生长良好的瘤组织，将其剪切成若干个约1.5mm×1.5mm×1.5mm的瘤组织小块备用；抓取动物，固定，消毒皮肤，用20号套管针将剪切好的瘤组织块移植小鼠右侧背部近腋部皮下；按此法皮下移植BNX小鼠34只；

(2)肺组织取材：

(3)Alu-PCR；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

(5)凝胶成像显影：

在凝胶图像处理系统中观察结果。

21.根据权利要求20所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，步骤(3)所述Alu-PCR包括：

1)DNA的提取；

2)DNA浓度的测定；

22.根据权利要求21所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，所述Alu-PCR的引物序列：

Alu-w1Sequence(5’to 3’)Gcc TgT AAT CCC AgC ACT TTg；

Alu-w2Sequence(5’to 3’)ACg CCA TTC TCC TgC CTC A。

23.根据权利要求21所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，所述Alu-PCR的基本反应体系：

Component Volum(20ul) Concentration

H₂O nuclease free 14.9 ；

10*Buffer 2.0 1×；

Mgcl₂ 1.2 25mM；

dNTPS 0.4 0.2mM；

Alu引物-w1 0.2 100uM；

Alu引物-w2 0.2 100uM；

TaqDNA聚合酶 0.1 5u/μl；

模板DNA 0.1 0.1μg/μl。

24.根据权利要求21所述的人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测，其特征在于，所述Alu-PCR的结果：第五周，A375sci移植到BNX皮下，4W后剖检8只小鼠，PCR检测肺转移阳性率为100％。