CN113201494A - 一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞工程领域，特别是涉及一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途，所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H‑1保藏编号为CCTCC NO:C 202174。所述黏膜黑色素瘤细胞可以用于构建黑色素瘤动物模型。所述黏膜黑色素瘤细胞以及黑色素瘤动物模型可以用于制备诊断或治疗黑色素瘤产品、黑色素瘤生物标志物筛选或黑色素瘤发生发展机制研究。本发明的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H‑1具有永生性，连续传代一百代不发生老化，能够表达HMB45、Melan‑A和S100A6标志物，且具有三倍体核型。

Description

一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，特别是涉及一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途。
背景技术
黏膜恶性黑色素瘤
恶性黑色素瘤是一类源于基底层黑色素细胞的高度恶性肿瘤。黑色素瘤可以发生于皮肤或黏膜，多由黏膜黑斑或皮肤黑色素痣发展而来。黑色素瘤的发病具有一定的种族特异性：白种人较易发生皮肤恶性黑色素瘤，黏膜黑色素瘤则比较少见；而黄色人种的黏膜和肢端黑色素瘤则更为常见。黏膜黑色素瘤(mucosal melanoma，MM)包括口腔、口咽、鼻腔/鼻窦、食管、直肠肛管、生殖道、泌尿道等部位来源的黑色素瘤，为亚洲人群黑色素瘤第二大亚型(占22.6％)，特别是中国地区黏膜恶性黑色素瘤占全身恶性黑色素瘤发病比例达到22.6％-25％，远高于欧美人群，是一类极具中国人种特异性的恶性肿瘤。在亚洲人群中，头颈部黏膜恶性黑色素瘤(Head andneckmucosal melanoma，HNMM)占全身黏膜恶性黑色素瘤55％以上，解剖部位多集中于口腔、口咽、鼻腔鼻窦等部位。HNMM约占黑色素瘤总体的0.7％-3.8％，是一类病因及发病机制不明且预后极差的恶性黑色素瘤亚型，与皮肤黑色素瘤相比，发生于头颈部黏膜的黑色素瘤恶性程度更高，复发率和远处转移率高，预后差、死亡率高，5年存活率约0～20％。
MM早期临床表现为棕红色或黑色凸起，临床上无色素性HNMM较为少见，随着病变进展，局部出现溃疡并伴随出血，并发生局部淋巴结转移和远处肺、肝和骨转移。前期研究报道已经证实皮肤恶性黑色素瘤与患者长期的紫外线暴露有关，而HNMM因其解剖部位特殊，发病因素与紫外线无关，目前其致病因素仍然不明。近年来，虽然常规治疗方式(如手术治疗、放射治疗、干扰素、免疫治疗等)和综合治疗策略在MM临床治疗中取得了一定的发展，但仍未形成规范化、标准化的临床诊疗方案或指南，严重影响MM患者的治疗和预后，其主要原因之一是缺乏有效的临床试验及临床前模型用于开MM的研究的有效临床前模型，特别是人源的MM细胞系及相关疾病模型。
1.2黏膜黑色素瘤细胞系研究现状
永生化的癌细胞系是基础科研和临床前研究的有力工具，在阐明癌症发生的分子机制和检测有效治疗试剂方面发挥着重要作用。然而，由于MM发病较少，原发组织获取也相对困难，构建成成系难度极为复杂。有关黏膜黑色素瘤细胞系的报道也很少，目前仅有少量文献报道成功建立黏膜黑色素瘤细胞系，如Tagawa等学者1980年报道一例从胸水提取的口腔黏膜黑色素瘤转移灶细胞系，chang等学者2000年报道了一例口腔黏膜黑色素瘤细胞系，然而这些报道对建成的细胞系的生物学特点阐述的相对的不深入，并缺乏后续研究报告。在ATCC官方网站检索“melanoma”相关的细胞系及相关细胞产品约有280余种，人源的黑色素瘤细胞系有18种，均来源于皮肤或转移灶，目前未见有黏膜来源的公认的黑色素瘤细胞系。此外，这些公认的黑色素瘤细胞系的人种主要来自欧美国家，也不能代表包括中国人群在内的东亚人种。黏膜黑色素瘤同期其他黑色素瘤在生物信息学上明显不同，其他来源的黑色素瘤细胞系不能代替MM进行科学研究。从原发肿瘤灶中分离黏膜黑色素瘤细胞构建稳定细胞系的常见到问题是由于样本较难获得，且样本相对较小，有一半数量的样本无法分离出肿瘤细胞，即使分离出肿瘤细胞，但多数传代至P5～P10代左右就出现细胞老化、生长停滞现象。这一定程度上反映黏膜黑色素瘤细胞系构建体外培养条件复杂，技术要求高。同时如果想要得到某一部位的黑色素瘤细胞系，比如口腔黏膜的黑色素瘤细胞系，如果取口腔组织作为分离细胞的样本，由于口腔解剖包括唇、颊、舌、口咽等多个解剖学部位，涉及皮肤、黏膜等组织结构，因此不能明确获得的口腔组织样本是否来源于口腔黏膜。因此需要建立黏膜黑色素瘤细胞系，尤其是具备永生性的具有中国人遗传背景的并进行遗传信息学注解的黏膜黑色素瘤细胞系，以推进对该疾病的研究。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，保藏编号为CCTCC NO:C 202174。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1连续传代一百代不发生老化。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1表达HMB45、Melan-A和S100A6标志物。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有三倍体核型。
本发明还提供一种黑色素瘤动物模型，所述黑色素瘤动物模型体内移植有人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，所述黑色素瘤动物模型为小鼠模型。
本发明还提供所述黑色素瘤动物模型的构建方法，所述构建方法包括将体外培养的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1接种至小鼠体内。
优选的，将体外培养的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1用无血清培养基和Metrigel的混合液悬液后再接种。
本发明还提供所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1或所述黑色素瘤动物模型在制备治疗黑色素瘤产品、黑色素瘤生物标志物筛选或黑色素瘤发生发展机制研究中的用途。
如上所述，本发明的一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途，具有以下有益效果：确定是从口腔黏膜组织中分离得到的黏膜黑色素瘤细胞，具有中国人口腔黑色素瘤的特性，具有中国人遗传背景并进行遗传信息学注解，具备永生性，解决了现有技术中用于分离黏膜黑色素瘤细胞的样本较难获得且样本相对较小的问题，或者有一半数量的样本根本无法分离出肿瘤细胞的问题，以及即使分离出肿瘤细胞，但多数传代至P5～P10代左右就出现细胞老化、生长停滞现象，不能永生的问题。
附图说明
图1显示为人黏膜黑色素细胞瘤细胞株MM9H-1镜下细胞形态图。A:MM9H-1P4代，B:MM9H-1P30代；C:MM9H-1P50代；D:人皮肤黑色素瘤经典细胞系A375细胞形态。E:MM9H-1(P14代)离心后，离心管底部黑色细胞团块。F:左侧黑色团块为MM9H-1(P50代)，右侧为人皮肤黑色素瘤经典细胞系A375离心后白色团块。
图2显示为MM9H-1细胞的生长曲线。
图3显示为与A375细胞相比，MM9H-1细胞迁移能力较强。
图4显示为免疫荧光显示MM9H-1细胞(P10代)表达黑色素瘤相关标志物染色，显示细胞表达黑色素瘤标志物S100A6、Melan-A、HMB45。
图5显示为MM9H-1细胞(P50代)表达黑色素瘤相关标志物Melan-A、HMB45。
图6显示为MM9H-1成球实验。MM9H-1接种一周后成球后，收集球体转移到12孔板中，肉眼可见黑色细胞球体,进行冰冻切片、HE染色，可观察到细胞紧密聚集并含有黑色素。A、B、C(P10代),D、E、F(P50代)。
图7显示为MM9H-1细胞染色体核型鉴定图。
图8显示为MM9H-1细胞裸鼠皮下成瘤。A：皮下成瘤大体观；B：肿瘤剖面，黑色实体肿瘤；C：肿瘤生长曲线。
图9显示为MM9H-1-PDX和对应病人HE组织学染色图。A：患者原发灶；B：MM9H-1-PDX。
图10显示为MM9H-1-PDX和对应病人免疫组化染色(红染)对比，相关指标表达与病人组织表达一致。
图11显示为MM9H-1对多种化疗药物不敏感。
具体实施方式
本发明提供一种黏膜黑色素瘤细胞，所述黏膜黑色素瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，细胞名称为人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，保藏日期为2021-03-09，保藏编号为CCTCC NO:C 202174，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1来源于人口腔黏膜。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1呈细长梭形，含有少量不规则多角形细胞，大小比皮肤黑色素瘤细胞系A375较大。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有中国人遗传背景。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有永生性。所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1连续传代一百代不发生老化。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1表达HMB45、Melan-A和S100A6标志物。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有三倍体核型。
所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1细胞对以下中的一种或多种抗肿瘤药物原发耐药：
CDK4/6抑制剂：Palbociclib、Ribociclib、Abemaciclib；
常规化疗药物：Dacarbazine Carboplatin；
EGFR靶向药物：Erlotinib厄洛替尼；
BRAF抑制剂：Vemurafenib、Dabrafenib；
MEK抑制剂：Cobimetinib、Trametinib；
多靶点抑制剂：Lenvatinib；
mTOR抑制剂：Everolimus。
本发明的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1用于非治疗目的。
本发明还提供人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
1)将从黏膜黑色素瘤患者口腔牙龈黏膜的肿瘤原发灶获得的样本去除黏膜及结缔组织后处理成组织碎片；
2)培养步骤1)获得的组织碎片；
3)筛选得到人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1。
在一种实施方式中，步骤1)中将获得的黏膜样本用含抗生素的缓冲液浸泡后再去除黏膜组织。
在一种实施方式中，步骤1)中在组织保存液中去除黏膜组织。
在一种实施方式中，步骤1)中将组织处理成1mm大小的组织碎片。
在一种实施方式中，步骤2)中培养组织碎片前先将其处理为适于贴壁的状态。
在一种实施方式中，培养时所用的黏膜黑色素瘤培养基的成分包括DMEM和血清。
培养期间镜下观察细胞融合度，需要传代时采用胰酶消化法传代培养。
在一种实施方式中，在P2代时筛选黑色素瘤细胞。
在一种实施方式中，采用标签抗体进行筛选。
本发明还提供一种黑色素瘤动物模型，所述黑色素瘤动物模型体内移植有人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，所述黑色素瘤动物模型为小鼠模型。
本发明还提供所述黑色素瘤动物模型的构建方法，所述构建方法包括将体外培养的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1接种至小鼠皮下。
在一种实施方式中，将体外培养的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1用无血清培养基和Metrigel的混合液悬液后再接种。
在一种实施方式中，所述小鼠为裸小鼠。
所述黑色素瘤动物模型为BALB/c Nude小鼠模型。
本发明还提供所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1或所述黑色素瘤动物模型在制备治疗黑色素瘤产品中的用途。
所述用途为在制备治疗人黑色素瘤药物中的用途。
所述用途为在制备治疗人黏膜黑色素瘤药物中的用途。
所述用途为在制备治疗人口腔黏膜黑色素瘤药物中的用途。
所述产品选自药物。所述用途例如为利用人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1细胞或动物模型研究治疗黑色素瘤药物的药物代谢、药效或安全性。再例如利用人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1细胞或动物模型筛选治疗黑色素瘤的药物。
本发明还提供所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1或所述黑色素瘤动物模型在黑色素瘤生物标志物筛选或黑色素瘤发生发展机制研究中的用途。所述机制研究为体外进行的研究。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1细胞系的建立
标本来源为上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科，一例67岁的女性黏膜黑色素瘤患者，原发灶位于下牙龈黏膜。冷冻活检术前，征得患者本人及监护人同意，签署知情同意书，术后病理诊断为：黏膜黑色素瘤。组织学染色见图(9A)。
具体培养方法：
活检样本迅速装入含有商用组织保存液(MACS,Germany)的离心管中。离心管装入冰盒中运输至实验室。
在生物安全柜内操作，将组织转移至培养皿中，用含有两性霉素B(500ng/ml)和5％青链霉素双抗的PBS浸泡组织约10分钟。转移至放有新配制的无血清培养基的(主要成分为DMEM+两性霉素B(500ng/ml)+5％青链霉素双抗)培养皿中，去除黏膜组织。将组织剪成约1mm大小的组织碎片。将组织碎片转移到新的含有黏膜黑色素瘤培养基的培养皿中。培养基的主要成为DMEM+20％胎牛血清。
用1毫升的移液枪头，将蘸有培养基的组织转移至T25的培养瓶底部，均匀分布组织。加入2毫升黏膜黑色素瘤培养基，旋紧瓶口，倒置放入细胞培养箱。
6～8小时后，将培养瓶正置。4天后，轻轻取出，添加4毫升黏膜黑色素瘤培养基，继续培养。期间根据需求镜下观察细胞融合度，在细胞迁出面积约10倍镜下视野范围时，胰酶消化法传代培养。P2代生长至汇聚80％后，用标签抗体黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，MCSP；BectonDickinson,San Jose,CA)进行流式细胞筛选，然后传代，细胞生长稳定后，按照1:3比例传代。
细胞系形态观察
传代培养细胞系在不同生长密度时显微镜观察细胞形态并拍照。细胞形态如图1A(P4代)、B(P30代)、C(P50代)所示，肿瘤细长梭形，含有少量不规则多角形细胞，细胞大小与人皮肤黑色素瘤细胞系A375相比(图1D)，相对较大。细胞经连续传代后仍保持稳定细胞形态，如P50代与P4代形态相同。细胞增殖速度稳定，同A375相似(图2)。细胞系连续传代一百余代后未出现老化现象。
细胞离心后，离心管底部可见明显黑色细胞团块，图1E为P14代，图1F(左侧)为P50代离心后细胞团块。
实施例2细胞划痕实验
细胞划痕实验显示，与经典人皮肤黑色素瘤细胞A375相比，MM9H-1迁移能力更强(图3)。
细胞划痕实验使用伤口愈合插件(Ibidi，德国，#81176)开展实验，该插件可以产生边缘整齐的划痕区域。具体步骤如下：将插件置于12孔板中，将MM9H-1细胞消化制备成悬液约5x106/毫升的细胞悬液，接种于插件的方孔中，每孔80微升细胞悬液；24小时后，镜下观察孔内细胞，约90～100％汇聚，取下插件，加入500微升无血清培养基于12孔板中；镜下拍照，作为0基线；每24小时观察一次并拍照，测定划痕两侧细胞迁移距离。
实施例3细胞系黑色素瘤相关标志物染色
用免疫荧光技术对人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1进行黑色素瘤的标志物HMB45、Melan-A、S100A6、S100B进行鉴定。结果如图4所示，人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1表达标志物HMB45、Melan-A、S100A6。在P50代时用黑色素瘤混合标签抗体对MM9H-1进行检测，HMB45、Melan-A等标志物均稳定表达(图5)。
将MM9H-1细胞接种到直径12mm的共聚焦小皿中，培养24h后，吸出培养液，PBS洗2次，预冷的4％多聚甲醛，4℃固定30min，室温PBS洗5min×3次，0.1％Triton X-100处理10min，室温PBS洗5min×3次，5％的山羊血清封闭30min，加入稀释一抗(HMB45、Melan-A、S100A6)置于湿盒，4℃过夜，室温PBS洗去一抗，10min×3次，加入荧光二抗室温反应60min，室温PBS洗去二抗，10min×3次，加入DAPI，室温染色10min，PBS洗10min×3次。荧光显微镜下拍照。
实施例4细胞成球实验
细胞成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法，其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力。人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1生长至80％汇聚，进行消化传代，用黏膜黑色素瘤培养基制备成500个/ml的细胞悬液，接种于低吸附6孔板中，每孔两毫升。3天后开始镜下观察，第4天起可观察到明显的细胞球体，第7天球体增大，形成肉眼可见黑色球体。结果如图6所示，在正常培养基培养下，人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有成球能力，且在连续传代后依然具备很强的成球能力。收集球体进行冰冻切片，结果如图6所示，细胞紧密聚集并含有黑色素。详见图6A、B、C(P10代),D、E、F(P50代)。
实施例5染色体分析
采用染色体显带技术(G显带/400带)对人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1进行染色体分析。细胞培养生长到70％，更换新的培养基，加入终浓度为0.2μg/ml的秋水酰胺，继续培养2-4小时；细胞使用0.075mol/L的氯化钾溶液进行低渗处理，37℃孵育20分钟，将细胞固定在新制备的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)中，然后放到-20℃的冰箱中冷冻1小时，然后把细胞均匀的铺在37℃预热的玻片上。然后使用胰蛋白酶进行消化，Giemsa染色，使用自动扫片仪进行扫片，在软件中进行分析(Applied Imaging Software CytoVision)。结果如图7所示，人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1核型分析检出三倍体核型以及复杂的染色体结构和数量异常。具体如下：68～72<3n>；+add(1)(p13),增加1条短臂重排的1号染色体；inv(2)(q13q31),der(2)del(2)(p13)inv(2)del(2)(q32)×2,1条2号长臂臂内倒位，2条2号长臂臂内倒位同时短臂和长臂都有缺失的衍生染色体；+3,3号增加；-4,4号丢失；+5,der(5)add(5)(p15)add(5)(q31)×2,增加1条5号，2条5号长臂和短臂重排形成的衍生染色体；-6,6号染色体丢失；+7,+7,add(7)(q21),del(7)(q21),add(7)(p13),7号增加2条，1条长臂重排，1条长臂缺失，1条短臂重排；+8,add(8)(q21)×2,8号增加，2条8号长臂重排染色体；+9,add(9)(p13)×2,9号增加，2条9号短臂重排染色体；+10,add(10)(p13)×2,10号增加，2条10号短臂重排染色体；-12,add(12)(q24)×2,12号丢失1条，2条12号长臂重排；-15,-15,-15,15号丢失；add(16)(q22),16号长臂重排；-17,-17,17号丢失；+19,+19,add(19)(q13)×1～2,19号增加，长臂重排；-20,20号丢失；add(21)(p11.2),21号短臂重排；-22,add(22)(q12)×2,22号丢失，2条长臂重排；+3～5mar 3～5条标记染色体；[cp20]20个细胞组合核型。这些异常不同于任何肿瘤，但符合高级别恶性肿瘤的特征。
实施例6裸鼠皮下移植瘤模型的建立及组织形态学鉴定
BALB/c Nude小鼠皮下移植瘤模型的建立，实验步骤如下：
体外培养人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，待细胞长至对数生长期，消化细胞成单细胞悬液，PBS洗涤3次，计数后用无血清培养基和Metrigel按照1:1配制成溶液，制备成1×107cells/ml细胞悬液；
用1ml注射器接种100μl于6周龄裸鼠皮下，约4天后注射部分黑色肿瘤包块长大，定期用游标卡尺测量肿瘤长短径，每周两次，计算肿瘤体积，计算公式如下：V＝a*b*b/2,其中V为肿瘤体积(mm3)；a为肿瘤长径，b为肿瘤短径(mm)；
约25天左右，终止实验，安乐死实验小鼠，取出皮下肿瘤后福尔马林固定，并进行组织学染色。
根据计算肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。结果如图8C所示。
裸鼠成瘤图片参阅图8，图8A为成瘤的裸鼠的照片，图8B为自成瘤的裸鼠取下的瘤体照片。结果说明人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1在免疫缺陷小鼠体内有很好的成瘤能力，且其生长较为稳定，可应用于体内试验研究。
实施例7细胞系与原发灶一致性鉴定
将MM9H-1裸鼠皮下移植后获得的肿瘤组织切片进行HE染色，与临床患者肿瘤组织HE染色进行组织形态学对比。组织形态学结果如图9所示，细胞形态与临床样本相似。同时，MM9H-1-PDX和对应病人原发灶黏膜黑色素瘤相关标志物进行免疫组化染色(红染)对比，相关指标表达与病人组织表达一致(如图10)。
免疫组化染色步骤如下：将蜡块切成4μm厚的切片进行免疫组织化学染色，柠檬酸钠修复液水浴加热进行抗原修复，3％过氧化氢脱色素处理60min，PBS洗涤后加入一抗，4℃过夜，室温PBS洗去一抗，10min×3次，加入二抗室温反应30min，室温PBS洗去二抗，10min×3次，AEC红显9min，苏木素复染9min，水溶性封片剂封片。
实施例8药物敏感测试
采用CCK8试剂盒(日本同仁化学研究所，日本)检测MM9H-1细胞药物敏感性。
具体实验步骤如下：
1.细胞悬液制备：对细胞进行消化、计数。用含有10％胎小牛血清得培养液配成制成20000个/ml的单细胞悬液。
2.细胞接种：接种前在96孔板的周围一圈36个孔每孔滴加200微升PBS，每孔体积200μl的细胞悬液接种到96孔板。摇匀，放于培养箱内。设置9个浓度梯度，每个浓度梯度设置5个复孔。
3.药物配制：根据selleck提供的药品说明书，用细胞培养基将实验药物配制成不同浓度梯度：20μM，10μM，1μM，500nM，100nM，50nM，10nM，1nM，0nM。
4.药物处理细胞：吸除培养基，每孔滴加200微升的含有不同浓度梯度的培养基。
5.CCK8处理细胞：72小时后，检测细细胞活力。将CCK8试剂与培养基按照1:10配制成够实验用的量。吸去96孔板内原培养基，加入100微升的CCK8稀释液，操作室尽量避免气泡的产生。没有细胞的空白孔中加100微升CCK8稀释液作为空白对照。放入培养箱中孵育1到2个小时。
6.用酶标仪测OD值，根据说明说，设定在450nm波长检测的吸光度。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，保藏编号为CCTCC NO:C 202174。
2.根据权利要求1所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，其特征在于，所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有永生性。
3.根据权利要求1所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，其特征在于，所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1表达HMB45、Melan-A和S100A6标志物。
4.根据权利要求1所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，其特征在于，所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1具有三倍体核型。
5.根据权利要求1所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，其特征在于，所述人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1为人口腔黏膜黑色素瘤细胞。
6.一种黑色素瘤动物模型，其特征在于，所述黑色素瘤动物模型体内移植有权利要求1-5任一所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1，所述黑色素瘤动物模型为小鼠模型。
7.根据权利要求6所述的黑色素瘤动物模型，其特征在于，所述黑色素瘤动物模型为BALB/c Nude小鼠模型。
8.权利要求7所述的黑色素瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将权利要求1-5任一所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1接种至小鼠皮下。
9.权利要求1-5任一所述的人黏膜黑色素瘤细胞MM9H-1或权利要求7所述的黑色素瘤动物模型在制备诊断或治疗黑色素瘤产品、黑色素瘤生物标志物筛选或黑色素瘤发生发展机制研究中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，所述诊断或治疗黑色素瘤产品为药物。
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