CN113528444B - 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents

一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于培养原代食管鳞癌上皮细胞的、含有MST1/2激酶抑制剂和ROCK激酶抑制剂组合的原代细胞培养基和使用了该原代细胞培养基的培养方法。所述培养方法中，使用上述原代细胞培养基在包被有细胞外基质胶的培养器皿上培养原代细胞，使得原代细胞快速增殖。由本发明的原代细胞培养基和原代细胞培养方法得到的细胞模型，能够用于药物的疗效评估和筛选。

Description

一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代食管鳞癌上皮细胞的培养基及培养方法，还涉及培养得到的细胞在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。
背景技术
食管癌是目前世界上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。根据国家癌症中心统计最新数据显示，男性发病前十位恶性肿瘤中食管癌占第六位，女性食管癌占第二位。世界上多个地区呈地方性发病率升高，而我国是属于食管癌高发地区，年发病人数是24.6万，年平均死亡人数约15万人，占全国肿瘤死亡率21.8％，在导致死亡最多的癌症中死亡率排名第4位(2019国家癌症中心数据)。近年来，尽管人们对食管癌的分子分型和发病机制的研究取得一些进展，但由于在国内外食管癌分子分型的差异性，导致针对食管鳞癌尤其是中晚期患者的治疗手段仍然有限，缺乏个性化的精准用药指导。因为食管鳞癌不同于腺癌有比较明确的分子靶点，所以仅凭分子或基因诊断很难真正预测临床用药的疗效。
功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表食管鳞癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟，一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am JPathol，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。
然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。在对患者原代细胞进行药物敏感性测试时，这些鼠源性细胞的存在会干扰患者自体原代细胞的药物敏感性检测结果；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6)：1862-1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7)：750，2018)，从而使患者自体原代细胞对药物的响应结果受到较大影响。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题。但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat Cell Biol，18(3)：246-54，2016)。
鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代食管鳞癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。在将该技术应用于构建原代食管鳞癌肿瘤细胞模型时，所培养的食管鳞癌肿瘤细胞能代表食管鳞癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养原代食管鳞癌上皮细胞的培养基以及使用该培养基的原代食管鳞癌上皮细胞的培养方法。采用本发明的原代食管鳞癌上皮细胞培养基和培养方法，能够达到体外培养周期短、成本可控、操作便捷并不受外源性细胞干扰的目的。在该技术应用于构建原代食管鳞癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有食管鳞癌患者自身生物学特性的原代食管鳞癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。
本发明的一个方面在于提供一种用于培养原代食管鳞癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂和ROCK激酶抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，所述ROCK激酶抑制剂选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种。
Figure GDA0002576232250000031
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1-C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基，优选C1-C3烷基，更优选甲基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1-C6烷基(优选甲基)、C1-C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1-C6卤代烷基(优选三氟甲基)。
优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure GDA0002576232250000041
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基，R1更优选为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基，R5更优选为氢；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基，R6更优选为氟、甲基或三氟甲基。
优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。
Figure GDA0002576232250000042
/>
Figure GDA0002576232250000051
/>
Figure GDA0002576232250000061
/>
Figure GDA0002576232250000071
/>
Figure GDA0002576232250000081
最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1，且本发明的ROCK激酶抑制剂优选地为Y27632。
在本发明的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为0.3μM～10μM，优选为0.75μM～6μM，更优选为2μM～6μM。另外，ROCK激酶抑制剂在培养基中的含量通常为0.3μM～20μM，优选为2.5μM～15μM，更优选为7.5μM～12.5μM。
本发明的原代细胞培养基优选还含有以下因子中的一种或多种：表皮生长因子(EGF)；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；B27添加剂或N2添加剂；肝细胞生长因子(HGF)；选自A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂；和选自SB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247、和BIRB796中的至少一种的P38/MAPK抑制剂。
其中，在优选的实施方式中，所述EGF的含量为12.5ng/ml～100ng/ml，更优选为50ng/ml～100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物中胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠各自的含量分别为2.5～20μg/ml-1.25～10μg/ml-1.25～10ng/ml，更优选分别为5～20μg/ml-2.5～10μg/ml-2.5～10ng/ml；所述B27添加剂或N2添加剂在培养基中的体积浓度为1:25～1:200，更优选为1:25～1:50；所述HGF的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，更优选为10ng/ml～20ng/ml；所述TGFβI型受体抑制剂优选A83-01，且TGFβI型受体抑制剂的含量为125nM～500nM，优选为250nM～500nM；所述P38/MAPK抑制剂优选为SB202190，且P38/MAPK抑制剂的含量为125nM～500nM，优选为250nM～500nM。
该培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和食管鳞癌上皮细胞类器官培养基成分相比，添加了MST1/2激酶抑制剂和ROCK激酶抑制剂(特别优选化合物1和Y27632)的组合，且不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺(Nicotinamide)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的原代食管鳞癌上皮细胞的体外培养。
本发明中，原代食管鳞癌上皮细胞可以为食管鳞癌肿瘤细胞、正常食管鳞癌上皮细胞、食管鳞癌上皮干细胞。
本发明的一个方面在于提供一种原代食管鳞癌上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：
(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基。
(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿。
具体地，该细胞外基质胶使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的Matrigel(购自康宁公司)或BME(购自Trevigen公司)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是DMEM/F12(购自康宁公司)。细胞外基质胶的稀释比例为1:50-1:400，优选为1:100-1:200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被时间为30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。
(3)从食管鳞癌组织分离得到原代食管鳞癌上皮细胞。
原代食管鳞癌上皮细胞例如可以来源于食管鳞癌组织样本和癌旁组织样本。食管鳞癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的食管鳞癌肿瘤患者手术切除癌组织样本，癌旁组织样本采集自离食管鳞癌组织距离至少5cm以上的食管组织。在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在5mm3以上，将其置于预冷的10-15mL DMEM/F12培养基中，培养基盛在塑料无菌带盖离心管内，冰上运输至实验室；其中，DMEM/F12培养基中含有1-2体积％青霉素、链霉素和/或0.2-0.4体积％Primocin(以下简称组织运输液)。当使用链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为200μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，优选为50～200U/mL，更优选为200U/mL；当使用Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为100μg/mL。
在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、0.1～0.5mg/mL氯化钙、5～10mg/mL牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS和RPMI-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1500转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1500转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。
(4)在包被好的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代食管鳞癌上皮细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。
更具体而言，在6孔板的一个孔中按2×104～8×104个/cm2(例如4×104个/cm2)的密度接种原代食管鳞癌肿瘤细胞，加入2-3mL原代上皮细胞培养基，在例如37℃、5％CO2的条件下于细胞培养箱中培养8-16天，期间每4天换成新鲜的原代细胞培养基，在原代食管鳞癌上皮细胞长至占6孔板底面积80％～90％左右的细胞密度时进行消化传代。
该接种步骤无需使用饲养细胞，相比细胞条件重编程技术，免去了培养和辐照饲养细胞的操作步骤。该步骤相比类器官技术，也无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基，预先包被好的培养器皿可直接用于原代细胞接种。此外，包被培养器皿仅需少量稀释后的细胞外基质胶，相比类器官技术，节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，也简化了操作步骤。
任选地，接种后的原代食管鳞癌上皮细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入1～2mL 0.05％胰酶(购自Thermo Fisher公司)进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养液2～4mL重悬消化处理后的细胞，以1500转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入包被有细胞外基质胶的T25细胞培养瓶中继续扩大培养。T25细胞培养瓶的包被操作同步骤(2)。
扩增的食管鳞癌上皮细胞呈2D生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。
另一方面，由本发明的原代食管鳞癌上皮细胞的培养方法培养得到的食管鳞癌上皮细胞、特别是食管鳞癌肿瘤细胞，能够用于药物的疗效评估和筛选，所述方法包括以下步骤：
(1)获取原代食管鳞癌上皮细胞，特别优选获取源自食管鳞癌患者的癌组织样本或活检癌组织样本，分离得到原代食管鳞癌上皮细胞，根据如上所述的原代食管鳞癌上皮细胞的培养方法培养并扩增原代食管鳞癌上皮细胞(特别是原代食管鳞癌肿瘤细胞)达至少105数量级、优选至少106数量级的细胞数目。
(2)选定需要检测的药物。
(3)药物以其最大血浆浓度Cmax为参考，以2-5倍Cmax为起始浓度，稀释多个不同的药物浓度梯度，例如5-10个、优选6-8个药物浓度梯度。
(4)将步骤(1)中培养得到的食管鳞癌上皮细胞消化成单细胞悬液，用流式图像计数仪进行计数，用本发明的原代细胞培养基将单细胞悬液稀释，按每孔2000-4000个的密度将稀释后的细胞悬液均匀地加入到多孔板内，例如每孔50μL细胞稀释液，并进行过夜贴壁。
该步骤避免了细胞重编程技术出现的由于饲养细胞的存在而干扰原代细胞计数和后续的原代细胞活力检测的问题，也无需像类器官技术一样，在冰上将细胞悬液与基质胶混合包埋再铺板的繁琐步骤，从而大大简化了操作流程，增强了技术的可操作性和实用性。由于接种的细胞为单细胞悬液而不是像类器官一样的3D结构，所以该技术与类器官技术相比，铺板的细胞数更加均一，铺板产生的孔间细胞数差异小，也更适合进行后续的高通量药物筛选操作。
(5)采用高通量自动化工作站，对步骤(4)中得到的贴壁细胞添加梯度稀释后的所选定的传统化疗药物、靶向药物、抗体药物或几种药物组合等候选药物，进行处理。
(6)加药处理数小时后，例如72小时后，采用Cell-Titer Glo发光法细胞活力检测试剂盒(购自Promega公司)检测食管鳞癌上皮细胞的存活率，进行药物活性筛选。
具体而言，向每孔加入例如10μL Cell Titer-Glo试剂(购自Promega公司)，均匀震荡后，用荧光酶标仪测量各孔的化学发光强度，根据测得的数值，以药物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用GraphPad Prism软件绘制药物量-效曲线，计算各个药物对所测试细胞的增殖的抑制强度。
在本发明的原代食管鳞癌肿瘤细胞在药物筛选和体外药物敏感性检测的应用中，由于不是细胞共培养体系，所以不会出现细胞重编程技术中的饲养细胞干扰检测结果的现象。由于细胞呈2D生长，与药物的作用时间也比类器官技术的药物检测时间短(类器官技术的平均给药时间为6天)。
本发明的有益效果还包括：
(1)提高原代食管鳞癌上皮细胞培养的成功率，成功率达到80％以上；
(2)保证体外原代培养的食管鳞癌上皮细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；
(3)所培养的原代食管鳞癌上皮细胞不受成纤维细胞干扰，能得到纯化的食管鳞癌上皮细胞；
(4)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；
(5)扩增食管鳞癌上皮细胞效率高，只要有104级别的细胞数量就可在两周左右时间内成功扩增出106数量级的食管鳞癌上皮细胞，扩增出的食管鳞癌上皮细胞还可以连续传代；
(6)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；
(7)培养成本可控：原代食管鳞癌癌培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等因子，是对已有原代食管鳞癌上皮细胞类器官培养基的简化和改进，细胞接种也无需使用浓度较高的细胞外基质与原代细胞混合形成胶滴，而只需使用少量细胞外基质胶制备的稀释液，节约了成本较高的细胞外基质的用量；
(8)操作便捷，该技术相比条件重编程技术，无需培养饲养细胞并对饲养细胞进行辐射，避免了不同批次饲养细胞的质量和数量影响原代细胞培养效率的问题，药物筛选的铺板和检测的对象只有原代食管鳞癌上皮细胞，而不受细胞条件重编程技术所需的共培养体系中饲养细胞的干扰；相比类器官技术，本发明采用的细胞外基质胶的包被方法，培养器皿可预先准备，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；
(9)所述技术培养获得的食管鳞癌上皮细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。
采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人的或其他哺乳动物的食管鳞癌上皮细胞，包括食管鳞癌肿瘤细胞、正常食管上皮细胞、食管鳞癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时本发明技术的培养基还可以用于开发体外食管鳞癌原代细胞扩增培养的试剂盒。
另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、食管鳞癌上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于食管鳞癌疾病的新药研发等。
附图说明
图1A-1E为显示培养基中不同因子对食管鳞癌原代细胞增殖的影响的图；图1F为显示含不同浓度的化合物1和Y27632组合的培养基对食管鳞癌原代细胞增殖效果的图。
图2是显示培养基中不同因子递增对食管鳞癌原代细胞增殖的影响的图。
图3A-3H是显示各添加因子的浓度对食管鳞癌原代细胞增殖的影响的图。
图4A和4B是将从1例食管鳞癌临床组织样本(编号0F0062)分离得到的细胞采用本发明的培养基FEM分别培养至第4天和第12天的食管鳞癌肿瘤细胞在倒置显微镜下拍摄的照片。
图5A和5B是1例食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0065)分别在包被细胞外基质胶Matrigel和不包被Matrigel的条件下培养至第11天的细胞的镜下照片。
图6A-6E是从1例食管鳞癌手术切除样本分离得到的细胞(编号0F0060)采用5种不同培养基培养14天后在倒置显微镜下拍摄的照片。
图7是从6例食管鳞癌手术切除样本(编号0F0056、0F0060、0F0061、0F0062、0F0071、0F0075)分离得到的细胞在5种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图。
图8是将从1例食管鳞癌临床组织样本(编号0F0075)分离得到的细胞分别采用5种不同培养基条件下培养所获得的细胞生长曲线对比图。
图9A-9D是将从1例食管鳞癌临床组织样本(编号0F0075)分离得到的细胞分别在FEM和EPI培养条件下培养至第1代和第9代时的镜下照片。
图10A和10B分别是从1例食管鳞癌手术切除样本(编号0F0053)和分离之后得到的细胞采用本发明的培养基FEM培养获得的食管鳞癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。
图11A-11D是从1例食管鳞癌手术切除样本(编号0F0025)和分离得到的细胞采用本发明的培养基FEM培养获得的不同代数的食管鳞癌肿瘤细胞的拷贝数变异分析结果比较图。
图12是将从1例食管鳞癌临床组织样本(编号0F0061)分离得到的细胞分别在本发明的培养基FEM以及删减不同组分后得到的培养基条件下培养的细胞的生长曲线对比图。
图13A-13H是将从1例食管鳞癌临床组织样本(编号0F0061)分离得到的细胞分别在本发明的培养基FEM以及删减不同组分后得到的培养基条件下培养至第3代时的镜下照片。
图14A和14B分别表示从两个不同的食管鳞癌患者的手术切除癌组织样本(编号0F0060和编号0F0062)采用本发明的培养基FEM培养的原代食管鳞癌肿瘤细胞对不同化疗药物和靶向药物的剂量-效应曲线。
具体实施方式
本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向上皮细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于来源于食管上皮细胞的培养基。
此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。
[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]
本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。
1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯 磺酰胺1
Figure GDA0002576232250000161
2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。
2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。
2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备
本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。
Figure GDA0002576232250000181
/>
Figure GDA0002576232250000191
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Figure GDA0002576232250000201
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Figure GDA0002576232250000211
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Figure GDA0002576232250000221
[实施例1]
人原代食管鳞癌上皮细胞的分离
食管鳞癌组织样本来源于三例进行过说明并获得同意的食管鳞癌肿瘤患者手术切除癌组织样本，它们分别是样本编号0F0060、0F0061、0F0062。下面以其中一例样本(编号0F0060)进行说明。
在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的4mL组织运输液(具体配制见表1)中，运输液盛在5mL塑料无菌带盖冻存管(购自广州洁特生物)内，冷链(0-10℃)运输至实验室。
表1组织运输液配方
Figure GDA0002576232250000222
表2组织消化液配方
Figure GDA0002576232250000223
Figure GDA0002576232250000231
在生物安全柜内，将组织样本(编号0F0060)转移至100mm细胞培养皿(购自NEST公司)内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的残留的血液清洗掉，并剔除组织样本表面的脂肪等多余的组织。将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入2mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至15mL离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心4分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，具体配制见表2)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成。
消化完成后，70μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500转/分钟离心4分钟。
弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1500转/分钟离心4分钟。弃上清，得到消化分离后的食管鳞癌原代细胞，加入基础培养基(BM)重悬，其中，基础培养基是由市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度。使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为228万。
另外两例食管鳞癌肿瘤组织样本按照以上同样的方法进行分离，得到的细胞总数分别为147万(0F0061)和268万(0F0062)。
[实施例2]
原代食管鳞癌上皮细胞培养基的优化
(1)不同因子的作用
将细胞外基质胶
Figure GDA0002576232250000241
(BD生物科技公司制)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100稀释比例，配制成细胞外基质稀释液，在48孔培养板内加入500μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
配制基础培养基(缩写为BM)：向市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度，配制得到BM。
接着，在基础培养基(BM)中分别加入不同种类和不同浓度的添加剂因子(表3)，配制成含有不同添加成分的食管鳞癌上皮细胞培养基。
表3不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
Figure GDA0002576232250000242
Figure GDA0002576232250000251
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶(Matrigel)的48孔板内。将按照实施例1相同方法从食管鳞癌组织分离得到的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0064)以2×104个/cm2的细胞密度接种在Matrigel包被过的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0064)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养开始后每4天进行一次培养基的更换。培养12天后，进行细胞计数。其中，作为实验对照，使用未添加任何添加剂的基础培养基(BM)。将结果示于图1A-E。图中纵坐标表示不同培养基培养之后得到的细胞数与基础培养基BM培养之后得到细胞数的比值。如图所示，在BM基础上加入表3中不同浓度不同因子对细胞增殖产生不同的作用，其中，在特定浓度范围下，B27添加剂、N2添加剂、胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、表皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样本生长因子1、化合物1和Y27632对细胞增殖有一定的促进作用。
(2)Y27632与化合物1的组合作用
将细胞外基质胶
Figure GDA0002576232250000252
(购自BD生物科技公司)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100稀释比例，配制成细胞外基质稀释液。在48孔培养板内加入500μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
向基础培养基BM中分别加入不同浓度的Y27632和化合物1(表4)，配置成含有不同添加成分的食管鳞癌上皮细胞培养基。
表4不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
Figure GDA0002576232250000253
Figure GDA0002576232250000261
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶(Matrigel)的48孔板内。将按照实施例1方法从食管鳞癌组织分离得到的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0063)以2×104个/cm2的细胞密度接种在Matrigel包被过的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使等数目的新鲜分离的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0063)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养开始后每4天进行一次培养基的更换。培养12天后，进行细胞计数。使用基础培养基BM作为实验对照。将实验结果示于图1F。如图所示，将不同浓度Y27632和化合物1组合使用对细胞增殖有一定协同促进作用，其中10μMY27632和3μM化合物1浓度组合下效果最佳。
(3)培养基中不同因子递增对本专利方法获得的食管鳞癌原代细胞增殖影响
将细胞外基质胶
Figure GDA0002576232250000262
(购自BD生物科技公司)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100稀释比例，配制成细胞外基质稀释液。在48孔培养板内加入500μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。/>
向基础培养基BM中分别依次递加不同小分子、添加剂以及生长因子(表5)，配制成含有不同添加成分的食管鳞癌上皮细胞培养基。
表5不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
Figure GDA0002576232250000271
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶(Matrigel)的48孔板内，同时将BM培养基作为实验对照。将按照实施例1的方法从食管鳞癌组织分离得到的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0065)以2×104个/cm2的细胞密度接种在Matrigel包被过的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0065)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养10天后，进行细胞计数。将实验结果示于图2。如图所示，确定NO.8为本专利最优选的培养基用于培养扩增食管鳞癌原代细胞(下文缩写为FEM)。在此基础上再加入一些因子或者小分子抑制剂均没有更显著的促进细胞增殖的效果。
(4)所添加因子的不同浓度对本专利获得的食管鳞癌原代细胞的增殖作用
将细胞外基质胶
Figure GDA0002576232250000281
(BD生物科技公司制)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100稀释比例，配制成细胞外基质稀释液，在48孔培养板内加入200μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
配制本专利原代食管鳞癌上皮细胞培养基(缩写为FEM)：向基础培养基(BM)中以最终浓度50ng/ml的条件添加表皮生长因子EGF，以最终浓度10ng/ml的条件添加肝细胞生长因子HGF，以1:50比例稀释条件添加胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)储液(胰岛素10μg/ml，转铁蛋白在FEM培养基的终浓度为5μg/ml转铁蛋白和亚硒酸钠在FEM培养基的终浓度为5ng/ml)，以1:50比例稀释B27添加剂，以最终浓度3μM的条件添加化合物1，以最终浓度10μM的条件添加Y27632，以最终浓度500nM条件添加TGFβ1抑制剂A83-01，以最终浓度500nM条件添加P38/MAPK抑制剂SB202190，制备原代食管鳞癌上皮细胞培养基。
使用与实施例1同样的方法从食管鳞癌患者的癌组织(样本编号0F0065)中分离获得癌组织来源的食管鳞癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的食管鳞癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至
Figure GDA0002576232250000282
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去12孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自Gibco公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用基础培养基BM重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。所得细胞用于以下培养实验。
接着，配制以下8种配方培养基进行实验：
配方1：培养基FEM组分中不含B27添加剂；
配方2：培养基FEM组分中不含胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；
配方3：培养基FEM组分中不含表皮生长因子；
配方4：培养基FEM组分中不含肝细胞生长因子；
配方5：培养基FEM组分中不含Y27632；
配方6：培养基FEM组分中不含化合物1；
配方7：培养基FEM组分中不含A83-01；
配方8：培养基FEM组分中不含SB202190。
分别使用上述配方1～8来稀释上述消化后的细胞悬液，按照每孔1万细胞，250微升体积种入48孔板中。
在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的B27添加剂每孔250微升，B27添加剂的终浓度分别为1:200、1:100、1:50、1:25；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物每孔250微升，胰岛素-转铁蛋白-硒复合物储液的终浓度分别为1:200、1:100、1:50、1:25(对应于胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠的终浓度分别为2.5μg/ml-1.25μg/ml-1.25ng/ml；5μg/ml-2.5μg/ml-2.5ng/ml；10μg/ml-5μg/ml-5ng/ml；20μg/ml-10μg/ml-10ng/ml)；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的表皮生长因子每孔250微升，表皮生长因子的终浓度分别为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的肝细胞生长因子每孔250微升，肝细胞生长因子的终浓度分别为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y27632每孔250微升，Y27632的终浓度分别为20μM、15μM、12.5μM、10μM、7.5μM、5μM、2.5μM；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的终浓度分别为6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1.5μM、0.75μM；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的A83-01每孔250微升，A83-01的终浓度分别为1000nM、500nM、250nM、125nM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的SB202190每孔250微升，SB202190的终浓度分别为1000nM、500nM、250nM、125nM；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。
待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算比值，将结果分别示于图3A～3H。图3A～图3H中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基，比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。
根据图3A～3H的结果，B27添加剂在培养基中的体积浓度优选为1:25～1:200，更优选1:25～1:50；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物的体积浓度优选为1:25～1:200，更优选1:25～1:100(对应于胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠的终浓度分别为2.5～20μg/ml-1.25～10μg/ml-1.25～10ng/ml；优选5～20μg/ml-2.5～10μg/ml-2.5～10ng/ml)；表皮生长因子的含量优选为12.5ng/ml～100ng/ml，更优选为50ng/ml～100ng/ml；肝细胞生长因子的含量优选为2.5ng/ml～20ng/ml，更优选为10ng/ml～20ng/ml；Y27632的含量优选为2.5μM～15μM，更优选为7.5μM～12.5μM；化合物1的含量优选为0.75μM～6μM，更优选为2μM～6μM；A83-01的含量优选为125nM～500nM，更优选为250nM～500nM；SB202190的含量优选为125nM～500nM，更优选为250nM～500nM。
[实施例3]
人原代食管鳞癌上皮细胞的培养
(1)食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞的培养
使用与实施例1同样的方法从食管鳞癌患者的癌组织(样本编号0F0062)中分离获得癌组织来源的食管鳞癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的食管鳞癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至
Figure GDA0002576232250000311
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。
图4A是本实施例按4×104个/cm2密度接种至Matrigel包被处理过的12孔板，自接种开始后培养至第4天的镜下照片(40倍倒置相差显微镜拍照)。镜下观察可见，所培养的癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞纯度较高，不含有成纤维细胞。图4B是本实施例自接种后培养第12天的镜下照片(40倍倒置相差显微镜拍照)。从图4A和4B两张图可以看出，分离后得到食管鳞癌原代细胞在体外培养4天在镜下就可以看到明显的克隆形成，并且经过12天的扩增，细胞数目得到显著的扩增，提示本发明技术是一种高效的体外扩增食管鳞癌上皮细胞的技术。
(2)食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞在包被细胞外基质胶和不包被细胞外基质胶的条件下培养效果的比较
使用与实施例1同样的方法从一例食管鳞癌患者的癌组织中分离获得癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0065)。接着，将相同数量(4×104个/cm2)的原代食管鳞癌肿瘤细胞0F0065分别接种至
Figure GDA0002576232250000312
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板和未经过任何处理的12孔板中。向12孔板中添加2mL制备好的原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)进行培养。图5A和5B为食管鳞癌组织源性原代食管鳞癌肿瘤细胞0F0065分别在包被Matrigel和不包被Matrigel的条件下培养至第11天的细胞的镜下照片(100倍倒置相差显微镜拍照)。根据图中可以看出，图5A(包被Matrigel)中细胞密度较图5B(不包被Matrigel)中细胞密度要大，细胞数量较多，同时5B中细胞中有少量老化细胞(胞体较大的细胞)，而5A则没有细胞老化现象，由此可以确认采用Matrigel包被处理培养板较未经过任何处理的培养板，更有利于食管鳞癌肿瘤细胞的增殖。
[实施例4]
不同培养基对食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞的促增殖效果
(1)不同培养基对初代原代细胞克隆形成的影响和增殖效果的比较
使用与实施例2同样的方法制备原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，和作为对照的基础培养基BM。另外制备细胞条件重编程技术用培养基FM作为另一对照例，配制步骤参见(Liu等，Nat Protoc.，12(2):439-451，2017)，培养基配方见表6。同时，作为另一对照例，制备食管癌原代细胞培养基KM，配制步骤参见(Karin J.Purdie等.Cancer Cell Culture:Methods and Protocols,Second Edition,Methods in Molecular Biology,vol.731,151-159,2011)，培养基配方见表7。此外，作为另一对照例，自stem cell公司购买商品化培养基EpiCultTMPlus Medium，以下也称“EPI培养基”)，培养基配方见表8。
表6细胞条件重编程技术培养基(FM)成分
Figure GDA0002576232250000321
Figure GDA0002576232250000331
表7培养基KM(Keratinocyte medium)成分
培养基成分 供应商 终浓度
表皮生长因子 北京义翘 10ng/ml
碘塞罗宁 MCE 13ng/ml
转铁蛋白 北京义翘 5μg/ml
霍乱毒素 Sigma-Aldrich 8.4ng/ml
氢化可的松 Sigma-Aldrich 0.4μg/ml
胰岛素 Sigma-Aldrich 5μg/ml
胎牛血清 Gibico 10体积％
DMEM培养基 Corning 65体积％
Ham’s F12营养液 Gibico 25体积％
表8商品化培养基EpiCultTMPlus Medium(EPI)成分
培养基成分 供应商 终浓度
EpiCultTMPlus Basal Medium stem cell 98体积％
EpiCultTMPlus Supplement stem cell 2体积％
氢化可的松 stem cell 480ng/ml
使用与实施例1同样的方法获得食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0060)。接着，按照相同的密度(4×104个/cm2)分别在以下五种培养条件下培养：
A.本发明技术：按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至
Figure GDA0002576232250000332
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的本发明的原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM进行培养；
B.细胞条件重编程技术：按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至铺有受γ射线辐照过后的小鼠成纤维细胞系J2细胞(购自Kerafast公司)上，采用细胞条件重编程技术培养基FM在24孔板中进行培养(具体步骤参见Liu等，Am J Pathol，183(6):1862-1870，2013)；
C.按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至
Figure GDA0002576232250000333
((BD生物科技公司制)包被处理过的12孔板内，采用2mL的培养基KM在24孔板中进行培养；/>
D.按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至
Figure GDA0002576232250000341
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的商品化培养基EPI在24孔板中进行培养；
E.按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至
Figure GDA0002576232250000342
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的基础培养基BM在24孔板中进行培养。
上述五种培养中，每4天对五种培养条件下培养的细胞进行换液。同时观察24孔板中各培养基培养下细胞形成克隆和细胞增殖状态，使用显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)进行拍照记录细胞生长状况。
对于采用本发明技术培养的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0060)，分别在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自GIBCO公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为36.4万。另四种培养条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化和计数，使用培养基FM、KM、EPI和BM培养得到的细胞总数分别是31.5万、9.1万、9.8万和8.4万。。
图6A-6E的细胞照片为编号0F0060的样本在五种不同的培养条件下培养至第14天时的镜下照片(40倍倒置相差显微镜下)：其中图6A为0F0060使用基础培养基BM培养至第14天时的镜下照片；图6B为0F0060使用本专利培养基FEM培养至第14天时的镜下照片；图6C为0F0060使用培养基KM培养至第14天时的镜下照片；图6D为0F0060使用商品化培养基EPI培养至第14天时的镜下照片；图6E为0F0060使用条件重编程培养基FM培养至第14天时的镜下照片。从图中可以看出，样本0F0060使用基础培养基BM(6A)培养14天不能形成细胞克隆；使用培养基KM(6C)和EPI(6D)培养14天仅形成少量细胞克隆，且细胞状态不佳；使用条件重编程培养基FM(6E)培养14天细胞有一定扩增，但是细胞密度和细胞数量均不及本专利培养基FEM培养获得的效果明显。
图7是6例食管癌病人样本(编号0F0056、0F0060、0F0061、0F0062、0F0071、0F0075)按照实施例1获得的食管癌原代细胞在以上五种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图，其中√代表有一般的克隆形成能力和促增殖效果，√√代表有较明显的克隆形成能力和促增殖效果，×代表不能形成克隆，NT代表未测试。从图中可以确认本专利技术培养基在对食管鳞癌组织来源获得的原代细胞培养中对克隆形成能力和促细胞增殖效果都较其他四种培养条件有明显优势。
(2)不同培养基对原代食管鳞癌肿瘤细胞的持续培养和生长曲线的绘制
使用与本实施例(1)中同样的方法获得原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，以及作为对照的培养基BM、KM、FM和EPI。
使用与本实施例(1)中同样的方法将食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0075)分别在以下五种培养基培养，并进行消化传代和计数。
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按4×104个/孔密度接种并持续培养。
以下为原代食管鳞癌上皮细胞在不同技术培养条件下细胞的扩增倍数(Population Doubling)的计算公式：
Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等.Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。
如图8所示是采用Graphpad Prism软件绘制的五种不同技术培养条件下的细胞0F0075的生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图中可以确认本发明培养基FEM培养的食管鳞癌上皮细胞的增殖速率优于其他四种培养条件，同时可以确认本发明技术可以对原代食管鳞癌上皮细胞进行持续培养，在扩增至30天时速率仍保持不变。
图9A和9C的细胞照片为0F0075分别在FEM和EPI培养条件下培养至第1代时的镜下照片(40倍倒置相差显微镜下)。图9B和9D的细胞照片为0F0075分别在FEM和EPI培养条件下培养至第9代时的镜下照片(40倍倒置相差显微镜下)。由图中可以确认本发明技术可以对原代食管鳞癌上皮细胞进行持续培养，且多次传代并持续培养的细胞形态和未传代前的细胞形态相比，未发生明显改变。而使用商品化培养基EPI培养至第9代时细胞形态已经发生明显改变，不能维持原代食管鳞癌上皮细胞持续培养。
[实施例5]
癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞的鉴定
(1)原代食管鳞癌组织和传代培养后的食管鳞癌细胞免疫组化鉴定
从一例食管鳞癌患者的临床手术切除样本取出约绿豆粒大小的癌组织(样本编号0F0053)，浸泡在1mL 4％多聚甲醛中固定。剩余癌组织使用与实施例1相同的方法获得食管鳞癌上皮细胞(样本编号0F0053)。使用实施例3的方法采用本发明的培养基FEM将样本0F0053持续培养至第六代。
采用免疫组化法检测样本0F0053原始组织和持续培养至第六代得到的原代细胞中与食管鳞癌相关的重要生物标记物的表达。4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的免疫组织化学检测(具体步骤参见Li等，Nature Conmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗为细胞角蛋白Cytokeratin(CK)(购自CST公司)、p63抗体(购自CST公司)、p53抗体(购自CST公司)、和Ki67抗体(购自R&D公司)。
由图10A和B可以确认，采用本发明技术培养的食管鳞癌肿瘤细胞(样本编号0F0053)培养至第6代时细胞上与食管鳞癌相关的生物标记物的表达情况与细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明技术所培养的细胞保持了食管鳞癌病人癌组织的原始病理特性。
(2)食管鳞癌组织和癌组织消化培养后的食管鳞癌细胞的拷贝数变异分析
采用实施例3的方法采用本发明的培养基FEM将食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0025)进行持续培养，将体外培养传代第1次、第2次和第3次的食管鳞癌肿瘤细胞(P1、P2和P3)和食管鳞癌病人直接手术来源的癌组织，使用DNeasy blood&tissue kit(QIAGEN公司制)提取细胞的基因组DNA。收集同一患者的正常食管组织，采用同样的方法提取基因组DNA作为背景对照。随后，对细胞和组织样本的基因组DNA进行全外显子组测序(具体操作步骤参见Hans Clevers等，Cell，11；172(1-2):373-386，2018)，将测序结果与参考基因组进行比对，使用cnvkit软件对比对结果进行分析，采用CBS segmentation(循环二元分割算法)对整个基因组范围的基因拷贝数进行分析，通过rolling median软件对位置和拷贝数变化相近的区域进行特征提取，按染色体顺序将结果绘制成图。经图11A-D确认，本发明技术所培养的癌组织来源的食管鳞癌肿瘤细胞与病人原始癌组织内拷贝数变异基本保持一致。
[实施例6]
培养基中去除单一因子或者因子组合对原代食管鳞癌细胞持续扩增培养的影响
使用与实施例2同样的方法制备原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM。作为对照，使用与实施例2同样的方法制备基础培养基(以下也称“BM”)。另外按照表9制备其他6种不同培养基。
表9不同培养基成分(浓度为终浓度)
Figure GDA0002576232250000371
Figure GDA0002576232250000381
使用与实施例1同样的方法获得一例食管鳞癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0061)。按4×104个/cm2接种密度将原代食管鳞癌肿瘤细胞接种至
Figure GDA0002576232250000382
(BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用1mL的本发明的原代食管鳞癌上皮细胞培养基(FEM)置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)进行培养。
在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入400μL 0.05％胰酶(购自GIBCO公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液800μL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。按2×104个/cm2密度将细胞接种至另一包被有细胞外基质胶的24孔培养板中继续培养。按照相同密度使用另7种不同培养基将细胞接种至包被有细胞外基质胶的24孔培养板中进行培养。
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按2×104个/cm2密度接种并使用各自不同的培养基进行持续培养。
以下为原代食管鳞癌上皮细胞在不同技术培养条件下细胞的扩增倍数(Population Doubling)的计算公式：
Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等.Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。
如图12所示是采用Graphpad Prism软件绘制的八种不同技术培养条件下的细胞生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。
图13A-13H的细胞照片为0F0061在以上8种不同的培养条件下培养至第3代时的镜下照片(100倍倒置相差显微镜下)：其中图13A为在本专利培养基FEM培养的镜下照片；图13B为在FEM不含化合物1的培养基培养的镜下照片；图13C为在FEM不含A83-01的培养基培养的镜下照片；图13D为在FEM不含Y27632的培养基培养的镜下照片；图13E为在FEM不含SB202190的培养基培养的镜下照片；图13F为在FEM不含A83-01和SB202190的培养基培养的镜下照片；图13G为在FEM不含化合物1和Y27632的培养基培养的镜下照片；图13H为基础培养基BM培养的镜下照片。
由图12和图13的结果可知，在本发明培养基中单独去除化合物1、Y27632、A83-01和SB202190以及去除化合物1与Y27632组合和A83-01与SB202190组合之后，细胞的增殖效果都明显减弱。其中去除化合物1与Y27632的组合成分之后，细胞的增殖速率明显的降低，提示本发明的培养基中化合物1与Y27632的组合成分是细胞增殖和持续培养所必需的。
[实施例7]
癌组织来源的原代食管鳞癌肿瘤细胞在小鼠体内的异种移植成瘤实验
使用与实施例1同样的方法从一例病理诊断为食管鳞癌患者的癌组织中分离获得食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0056)，按照实施例3的方法采用本发明的培养基FEM对0F0056进行培养，待食管鳞癌肿瘤细胞数量达到1×107个时，采用实施例4的方法对食管鳞癌肿瘤细胞进行消化，并收集。采用本发明的食管鳞癌肿瘤细胞培养基FEM和
Figure GDA0002576232250000401
(购自BD生物科技公司)按照1:1混匀，并吸取100μL与Matrigel混匀后的培养基将5×106个食管鳞癌肿瘤细胞重悬，分别注射入6周大的雌性高度免疫缺陷小鼠(NCG)小鼠(购自南京模式动物研究所)的食管鳞癌脂肪垫和右前肢腋下部位，每三天观察一次食管鳞癌肿瘤细胞在小鼠体内形成肿瘤的体积和生长速率。
在肿瘤细胞接种后的第15天即可观察到小鼠的两处肿瘤细胞接种部位均有瘤体形成，自第15天起至第30天，小鼠体内肿瘤增殖明显。说明采用本发明的培养方法所培养的癌组织来源的食管鳞癌肿瘤细胞在小鼠体内具有成瘤性。
[实施例8]
癌组织来源的食管鳞癌肿瘤细胞的药物敏感性功能测试
下面以食管鳞癌患者手术切除样本为例，说明由病人来源的食管鳞癌肿瘤样本培养得到的食管鳞癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。
一、原代食管鳞癌肿瘤细胞的铺板：按照实施例1中方法得到的分离后的食管鳞癌肿瘤细胞(编号0F0060和编号0F0062)细胞悬液，按照4×104个/cm2密度接种至
Figure GDA0002576232250000402
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代食管鳞癌上皮细胞培养基FEM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养，在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去12孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自Gibco公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用FEM培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数分别为83万和76.8万。按2000～4000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。
二、药物梯度实验：
(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取10μL的待测药物母液(药物母液浓度按2倍于该药物在人体中的最大血药浓度Cmax配制)，加入到含20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，再从上述EP管中吸取10μL到第二个已装有20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的7种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO作为对照。本实施例中，待测药物为硼替佐米(购自MCE公司)、丝裂霉素(购自MCE公司)、羟基喜树碱(购自MCE公司)和厄洛替尼(购自MCE公司)。
(2)使用高通量自动化工作站(Perkin Elmer公司JANUS)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有食管鳞癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。
(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(购自Promega公司)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入10μL配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测化学发光数值。
(4)细胞活性检测：按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用Graphpad Prism软件作图并计算半数抑制率IC50。
(5)药物敏感性测试结果如图14所示。
图14A和B分别表示从两个不同的食管鳞癌患者的手术切除癌组织样本(编号0F0060和编号0F0062)所培养获得的食管鳞癌肿瘤细胞，对两个化疗药物丝裂霉素和羟基喜树碱的药物敏感性和对靶向药物硼替佐米和厄洛替尼的敏感性。其中14A为编号0F0060样本培养获得的食管癌细胞对四种药物的敏感性结果；14B为编号0F0062样本培养获得的食管癌细胞对四种药物的敏感性结果。结果显示，同一病人的细胞对不同药物具有不同的敏感性，不同病人的细胞对同一药物的敏感性也不同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (14)

1.一种用于培养原代食管鳞癌上皮细胞的原代细胞培养基，其特征在于：
含有0.75μM～6μM的MST1/2激酶抑制剂和2.5μM～15μM的ROCK激酶抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐或溶剂化物，所述ROCK激酶抑制剂选自Y27632、法舒地尔和H-1152中的至少一种，
Figure FDA0004145738040000011
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基、芳基C1-C6烷基和杂芳基；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基和C3-C6杂环基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C1-C6卤代烷基。
2.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；
R2和R3各自独立地选自C1-C3烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、哌啶基C1-C6烷基和四氢吡喃基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C1-C6卤代烷基。
3.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐或溶剂化物，
Figure FDA0004145738040000021
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基；
R5选自氢、C1-C6烷基和C3-C6环烷基；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。
4.如权利要求3所述的原代细胞培养基，其中
R1为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5为氢；
R6为氟、甲基或三氟甲基。
5.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂选自以下化合物或其药学可接受的盐中的至少一种：
Figure FDA0004145738040000022
/>
Figure FDA0004145738040000031
/>
Figure FDA0004145738040000041
/>
Figure FDA0004145738040000051
/>
Figure FDA0004145738040000061
6.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：所述MST1/2激酶抑制剂的含量为2μM～6μM。
7.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述ROCK激酶抑制剂在培养基中的含量为7.5μM～12.5μM。
8.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
还含有以下因子中的一种或多种：表皮生长因子；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；B27添加剂或N2添加剂；肝细胞生长因子；TGFβI型受体抑制剂；和P38/MAPK抑制剂。
9.如权利要求8所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述TGFβI型受体抑制剂选自A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494和SJN2511中的至少一种；且
所述P38/MAPK抑制剂选自SB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247和BIRB796中的至少一种。
10.如权利要求8所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述表皮生长因子的含量为12.5ng/ml～100ng/ml；
所述胰岛素-转铁蛋白-硒复合物中胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各自的含量分别为2.5～20μg/ml、1.25～10μg/ml、1.25～10ng/ml；
所述B27添加剂或N2添加剂的体积浓度为1:25～1:200；
所述肝细胞生长因子的含量为2.5ng/ml～20ng/ml；
所述TGFβI型受体抑制剂的含量为125nM～500nM；
所述P38/MAPK抑制剂的含量为125nM～500nM。
11.如权利要求8所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述表皮生长因子的含量为50ng/ml～100ng/ml；
所述胰岛素-转铁蛋白-硒复合物中胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各自的含量分别为5～20μg/ml、2.5～10μg/ml、2.5～10ng/ml；
所述B27添加剂或N2添加剂的体积浓度为1:25～1:50；
所述肝细胞生长因子的含量为10ng/ml～20ng/ml；
所述TGFβI型受体抑制剂的含量为250nM～500nM；
所述P38/MAPK抑制剂的含量为250nM～500nM。
12.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
不含血清、牛垂体提取物、Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸。
13.一种原代食管鳞癌上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制如权利要求1～12中任一项所述的原代细胞培养基；
(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿；
(3)在包被好的培养器皿内接种从食管鳞癌组织分离得到原代食管鳞癌上皮细胞，使用步骤(1)中的所述原代细胞培养基进行培养。
14.一种评估或筛选用于治疗食管鳞癌疾病的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求13所述的培养方法培养得到食管鳞癌上皮细胞；
(2)选定需要检测的药物，稀释成不同的药物浓度梯度；
(3)向步骤(1)培养得到的食管鳞癌上皮细胞中添加梯度稀释后的所述药物，并进行细胞活力检测。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536444B (zh) * 2018-12-11 2022-06-28 吉林省拓华生物科技有限公司 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法
CN113717941B (zh) * 2020-05-26 2023-11-14 中科院合肥技术创新工程院 一种用于喉癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
CN115960832A (zh) * 2021-10-11 2023-04-14 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 一种肠癌原代细胞的培养基及体外培养方法和用途
CN115960831A (zh) * 2021-10-11 2023-04-14 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肠癌类器官的培养基及培养方法
WO2023060684A1 (zh) * 2021-10-13 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肺癌类器官的培养基、培养方法及其应用
CN115960815A (zh) * 2021-10-13 2023-04-14 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肺癌胸水来源类器官的培养基、培养方法及其应用
WO2023060676A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 卵巢癌类器官的培养基、培养方法及其应用
CN115975932A (zh) * 2021-10-14 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 卵巢癌原代细胞的培养基、培养方法及其应用
CN115975931A (zh) * 2021-10-14 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 食管癌类器官的培养基、培养方法及其应用
CN115975937A (zh) * 2021-10-14 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肝癌悬浮类器官的培养基和培养方法
WO2023060681A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 一种用于宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法
WO2023060820A1 (zh) * 2021-10-15 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 胃癌原代细胞的培养基和培养方法
CN115975933A (zh) * 2021-10-15 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 卵巢癌原代细胞的培养基、培养方法及其应用
CN115975910A (zh) * 2021-10-15 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 胃癌类器官的培养基及培养方法
WO2023060682A1 (zh) * 2021-10-15 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法
CN115975938A (zh) * 2021-10-15 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 胃癌原代细胞的培养基和培养方法
WO2023060774A1 (zh) * 2021-10-15 2023-04-20 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 宫颈癌类器官的培养基、及其培养方法和应用
CN114196620B (zh) * 2022-02-14 2022-05-20 广东省农业科学院动物科学研究所 一种母猪乳腺组织体外培养方法
CN115104601B (zh) * 2022-08-25 2022-12-13 杭州艾名医学科技有限公司 一种组织保存液及其制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102787094B (zh) * 2011-05-17 2015-09-23 李晖 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
WO2013071217A1 (en) * 2011-11-10 2013-05-16 OSI Pharmaceuticals, LLC Dihydropteridinones
WO2015173425A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved culture method for organoids
CN105801582A (zh) * 2016-04-12 2016-07-27 合肥工业大学 一类新型二氢蝶啶酮类衍生物及其制备方法和在医药上的用途
CN106190980A (zh) * 2016-07-12 2016-12-07 张云霞 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法
EP3541933A4 (en) * 2016-11-21 2020-09-16 Beijing Percans Oncology Co. Ltd. TUMOR EPITHELIAL CELL CULTURES
AU2018392805A1 (en) * 2017-12-22 2020-05-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NEK inhibitors and methods of use
CN108624561B (zh) * 2018-05-26 2021-09-17 复旦大学 原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用
CN111039944B (zh) * 2018-10-12 2021-11-23 中国科学院合肥物质科学研究院 Mst1激酶抑制剂及其用途

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