JP7461674B2 - 食道扁平上皮癌の上皮細胞用の培養培地、培養方法、及びその用途 - Google Patents
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Description
R1は、C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、C4~C8シクロアルキルアルキル、C2~C6スピロシクロアルキル、及び1個~2個のR6で任意に独立して置換されたアリール(例えば、フェニル及びナフチル等)、1個~2個のR6で任意に独立して置換されたアリールC1~C6アルキル(例えば、フェニルメチル等)、及び1個~2個のR6で任意に独立して置換されたヘテロアリール(例えば、チエニル等)から選択され、
R2及びR3は、それぞれ独立して、C1~C6アルキル、好ましくはC1~C3アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
R4及びR5は、それぞれ独立して、水素、C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、C4~C8シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルC1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、C1~C6アルキルアミノC1~C6アルキル、C1~C6アルコキシC1~C6アルキル及びC3~C6ヘテロシクリルC1~C6アルキル(ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される)から選択され、
R6は、ハロゲン(好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ)、C1~C6アルキル(好ましくはメチル)、C1~C6アルコキシ(好ましくはメトキシ)、及びC1~C6ハロアルキル(好ましくはトリフルオロメチル)から選択される)の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、ROCKキナーゼ阻害剤はY27632、ファスジル及びH-1152からなる群から選択される少なくとも1つである。
R1は、C1~C6アルキル、1個~2個のR6で任意に独立して置換されたフェニル、1個~2個のR6で任意に独立して置換されたチエニル、及び1個~2個のR6で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、R1は1個~2個のR6で任意に独立して置換されたフェニルであり、
R5は、水素、C1~C6アルキル、及びC3~C6シクロアルキルから選択され、より好ましくは、R5は、水素であり、
R6は、ハロゲン、C1~C6アルキル、及びC1~C6ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、R6は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである)の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
本明細書では、MST1/2キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にMST1/2シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、MST1/2キナーゼ阻害剤は、例えば、MST1/2キナーゼに結合することにより、MST1/2キナーゼの活性を低下させる。MST1とMST2は構造が似ているため、MST1/2キナーゼ阻害剤は、例えば、MST1又はMST2に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
本発明の他のMST1/2阻害剤化合物を化合物1と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
ヒト初代ESCC上皮細胞の分離
ESCC組織試料、すなわち試料番号0F0060、0F0061及び0F0062は、インフォームドコンセントを得た3人のESCC癌患者の癌組織から外科的切除により得られたものである。以下、試料の1つ(番号0F0060)について説明する。
初代ESCC上皮細胞用培養培地の最適化
(1)異なる因子による影響
細胞外マトリックスゲル(Matrigel(商標))(BD Biosciences製)を無血清DMEM/F12培地中に1:100で希釈して、細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを48ウェル培養プレートに500μl/ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを37℃のインキュベーター内で1時間放置した。1時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Matrigel被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル(Matrigel(商標))(BD Biosciencesから購入)を無血清DMEM/F12培地中に1:100で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを48ウェル培養プレートに500μl/ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを37℃のインキュベーター内で1時間放置した。1時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Matrigel被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル(Matrigel(商標))(BD Biosciencesから購入)を無血清DMEM/F12培地中に1:100で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを48ウェル培養プレートに500μl/ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを37℃のインキュベーター内で1時間放置した。1時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Matrigel被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル(Matrigel(商標))(BD Biosciences製)を無血清DMEM/F12培地中に1:100で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを48ウェル培養プレートに200μl/ウェルで加え、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを37℃のインキュベーター内で1時間放置した。1時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Matrigel被覆プレートを得た。
製剤2:インスリン-トランスフェリン-セレン複合体を含まないFEM培地組成;
製剤3:上皮成長因子を含まないFEM培地組成;
製剤4:肝細胞成長因子を含まないFEM培地組成;
製剤5:Y27632を含まないFEM培地組成;
製剤6:化合物1を含まないFEM培地組成;
製剤7:A83-01を含まないFEM培地組成;
製剤8:SB202190を含まないFEM培地組成。
ヒト初代ESCC上皮細胞の培養
(1)ESCC組織由来の初代ESCC腫瘍細胞の培養
ESCC患者の癌組織(試料番号0F0062)から、実施例1と同様の方法を使用して癌組織に由来するESCC上皮細胞を分離し、取得した。次に、癌組織由来のESCC腫瘍細胞をフローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd)で計数し、総細胞数を求めた。その後、Matrigel(商標)(BD Biosciencesから購入)被覆12ウェルプレートに、4×104細胞/cm2の密度で細胞を接種した。調製した初代ESCC上皮細胞用培養培地FEMを2mL、12ウェルプレートに加え、37℃、5%CO2のインキュベーター(Thermo Fisherから購入)に入れ、培養した。
実施例1と同様の方法を使用して、ESCC患者1名の癌組織から癌組織由来の初代ESCC腫瘍細胞(番号0F0065)を分離した。次に、Matrigel(商標)(BD Biosciencesから購入)被覆12ウェルプレートと、何も処理をしていない12ウェルプレートに、それぞれ同数(4×104細胞/cm2)の初代ESCC腫瘍細胞0F0065を接種した。調製した初代ESCC上皮細胞用培養培地FEMを2mL、12ウェルプレートに加え、消毒後37℃、5%CO2のインキュベーター(Thermo Fisherから購入)に入れ、培養した。図5A及び図5Bは、それぞれ、Matrigelコーティング条件及びMatrigelをコーティングしない条件で11日目まで培養したESCC組織由来の初代ESCC腫瘍細胞0F0065の顕微鏡画像(100倍倒立位相差顕微鏡で撮影)である。図から、図5A(Matrigelコーティングあり)の細胞密度及び細胞数は、図5B(Matrigelコーティングなし)のものよりも高くなっていることがわかる。同時に、図5Aでは細胞の老化が見られないのに、図5Bでは少数の老化した細胞(細胞体が大きくなった細胞)が見られた。したがって、Matrigel被覆培養プレートは、何も処理しない培養プレートに比べて、ESCC腫瘍細胞の増殖に有利であることが確認できる。
ESCC組織由来の初代ESCC腫瘍細胞の増殖促進に対する種々の培養培地の影響
(1)種々の培養培地が初代細胞のクローン形成及び初代細胞の増殖効果に及ぼす影響の比較
実施例2と同様の方法で初代ESCC上皮細胞用培養培地FEMを調製し、コントロールとして基礎培地BMを調製した。また、別のコントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術用培養培地FMを追加で調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい。培養培地の処方を表6に示す。同時に、追加のコントロールとして、初代食道癌細胞用培養培地KMを調製した。調製工程については、Karin J. Purdie et al., Cancer Cell Culture:Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 731, 151-159, 2011を参照されたい。培養培地の処方は表7に示す通りである。さらに、追加のコントロールとして、Stemcellから市販の培地EpiCult(商標)Plus Medium(以下、「EPI培地」ともいう)を購入し、培養培地の処方を表8に示す。
この実施例の(1)と同様の方法を使用して、初代ESCC上皮細胞用培養培地FEMと、コントロールとしての培養培地BM、KM、FM及びEPIを得た。
集団倍加(PD)=3.32×log10(消化された細胞の総数/初回接種時の細胞数)、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
癌組織由来の初代ESCC腫瘍細胞の同定
(1)初代ESCC組織及び継代培養後のESCC細胞の免疫組織化学的同定
ESCC患者の外科的切除試料からほぼ大豆大の癌組織(試料番号0F0053)を採取し、1mLの4%パラホルムアルデヒドに浸漬した。残りの癌組織から、実施例1と同様の方法でESCC上皮細胞(試料番号0F0053)を得た。試料0F0053は、本発明の培養培地FEMを用いて、実施例3の方法に従い、6回目の継代まで連続培養した。
ESCC腫瘍細胞(番号0F0025)を、本発明の培養培地FEMを用いて、実施例3の方法に従って連続培養を行った。in vitroで1回目、2回目、及び3回目と培養及び継代したESCC腫瘍細胞(それぞれP1、P2、P3)及びESCC患者から手術で直接得た癌組織について、DNeasy blood & tissue Kit(QIAGEN製)を用いて細胞のゲノムDNAを抽出した。同じ患者から正常食道組織を収集し、同じ方法でゲノムDNAを抽出し、これをバックグラウンドコントロールとして使用した。次に、細胞試料及び組織試料のゲノムDNAに対して全エクソームシーケンスを行い(詳細な操作手順については、非特許文献2を参照されたい)、シーケンス結果を参照ゲノムと比較した。CNVkitソフトウェアを使用して比較結果を分析した。全ゲノムの遺伝子コピー数解析にはCBSセグメンテーション(サーキュラーバイナリセグメンテーションアルゴリズム(circular binary segmentation algorithm))を用い、ローリングメジアン(rolling median)ソフトウェアにより、位置及びコピー数の変化が類似した領域の特徴を抽出し、結果を染色体順位に従ってプロットした。図11A~図11Dから、本発明の技術によって培養された癌組織由来のESCC腫瘍細胞のコピー数の変動は、患者の元の癌組織におけるコピー数の変動と実質的に一致していたことが確認される。
初代ESCC細胞の連続的な増殖に対する培養培地からの単一因子又は因子の組み合わせの除去の影響
実施例2と同様の方法で、初代ESCC上皮細胞用培養培地FEMを調製した。コントロールとして、実施例2と同様の方法を使用して基礎培地(以下、「BM」とも称する)を調製した。さらに、表9に従ってその他6種類の異なる培養培地を調製した。
集団倍加(PD)=3.32×log10(消化された細胞の総数/初回接種時の細胞数)、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
癌組織由来の初代ESCC腫瘍細胞のマウスでの異種移植による腫瘍形成実験
病理診断されたESCC患者1名の癌組織から、実施例1と同様の方法を使用してESCC腫瘍細胞(番号0F0056)を分離し、取得した。0F0065を実施例3の方法に従って本発明の培養培地FEMを用いて培養し、ESCC腫瘍細胞数が1×107に達した時点で、実施例4と同様の方法を使用してESCC腫瘍細胞を消化し、収集した。本発明のESCC腫瘍細胞用培養培地FEMとMatrigel(商標)(BD Biosciencesから購入)を1:1の割合で混合し、Matrigelと混合した培養培地100μLを用いて5×106個のESCC腫瘍細胞を再懸濁し、得られたものを6週齢の雌性高度免疫不全マウス(NCG)(Nanjing Model Animal Research Centerから購入)のESCC脂肪パッドと右前肢の腋下にそれぞれ注入した。ESCC腫瘍細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を3日ごとに観察して写真撮影した。
癌組織由来のESCC腫瘍細胞の薬物感受性機能的試験
ESCC患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来のESCC腫瘍試料から培養したESCC腫瘍細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
(1)薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した:10μLの試験される薬物ストック溶液(薬物ストック溶液の濃度は、人体における薬物の最大血中濃度Cmaxの2倍に基づいて決定された)をそれぞれ取り、20μLのDMSOを含む0.5mLのEPチューブに加え、上記のEPチューブからの10μLの溶液を、20μLのDMSOを入れた2つ目の0.5mLのEPチューブへとピペットで移した。つまり、薬物を1:3の比率で希釈した。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる7個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を384ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のDMSOを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例では、試験する薬物は、ボルテゾミブ(MCEから購入)、マイトマイシン(MCEから購入)、ヒドロキシカンプトテシン(MCEから購入)、及びエルロチニブ(MCEから購入)であった。
Claims (17)
- 初代食道扁平上皮癌(ESCC)の上皮細胞を培養するための初代細胞培養培地であって、
MST1/2キナーゼ阻害剤とROCKキナーゼ阻害剤とを含むことを特徴とし、前記MST1/2キナーゼ阻害剤は、式(I):
R1は、C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、C2~C6スピロシクロアルキル、並びに1個~2個のR6で任意に独立して置換されたフェニル及び1個~2個のR6で任意に独立して置換されたチエニルから選択され、
R2及びR3は、それぞれ独立して、C1~C3アルキルから選択され、
R4及びR5は、それぞれ独立して、水素、C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、及びC4~C8シクロアルキルアルキルから選択され、
R6は、ハロゲン、C1~C6アルキル、及びC1~C6ハロアルキルから選択される)の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、前記ROCKキナーゼ阻害剤は、Y27632である、初代細胞培養培地。 - R1が1個~2個のR6で任意に独立して置換されたフェニルであり、
R5が水素であり、
R6 がフルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである、請求項2に記載の初代細胞培養培地。 - 前記MST1/2キナーゼ阻害剤の量が、0.3μM~10μMであることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の初代細胞培養培地。
- 前記MST1/2キナーゼ阻害剤の量が、0.75μM~6μMであることを特徴とする、請求項5に記載の初代細胞培養培地。
- 前記MST1/2キナーゼ阻害剤の量が、2μM~6μMであることを特徴とする、請求項5に記載の初代細胞培養培地。
- 前記培養培地中の前記ROCKキナーゼ阻害剤の量が、0.3μM~20μMであることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
- 前記培養培地中の前記ROCKキナーゼ阻害剤の量が、2.5μM~15μMであることを特徴とする、請求項8に記載の初代細胞培養培地。
- 前記培養培地中の前記ROCKキナーゼ阻害剤の量が、7.5μM~12.5μMであることを特徴とする、請求項8に記載の初代細胞培養培地。
- 上皮成長因子;インスリン-トランスフェリン-セレン複合体;B27添加剤又はN2添加剤;肝細胞成長因子;A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、及びSJN2511の少なくとも1つから選択されるTGFβ I型受容体阻害剤;並びにSB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247、及びBIRB796の少なくとも1つから選択されるP38/MAPK阻害剤の1つ以上の因子を更に含有することを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
- 前記上皮成長因子の量が、12.5ng/ml~100ng/mlであり、
前記インスリン-トランスフェリン-セレン複合体中のインスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ2.5μg/ml~20μg/ml、1.25μg/ml~10μg/ml、1.25ng/ml~10ng/mlであり、
前記B27添加剤又はN2添加剤の体積濃度が、1:25~1:200であり、
前記肝細胞成長因子の量が、2.5ng/ml~20ng/mlであり、
前記TGFβ I型受容体阻害剤の量が、125nM~500nMであり、
前記P38/MAPK阻害剤の量が、125nM~500nMであることを特徴とする、請求項11に記載の初代細胞培養培地。 - 前記上皮成長因子の量が、50ng/ml~100ng/mlであり、
前記インスリン-トランスフェリン-セレン複合体中のインスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ5μg/ml~20μg/ml、2.5μg/ml~10μg/ml、2.5ng/ml~10ng/mlであり、
前記B27添加剤又はN2添加剤の体積濃度が、1:25~1:50であり、
前記肝細胞成長因子の量が、10ng/ml~20ng/mlであり、
前記TGFβ I型受容体阻害剤の量が、250nM~500nMであり、
前記P38/MAPK阻害剤の量が、250nM~500nMであることを特徴とする、請求項11に記載の初代細胞培養培地。 - 血清、ウシ下垂体抽出物、Wntアゴニスト、R-スポンジンファミリータンパク質、BMP阻害剤、ニコチンアミド、又はN-アセチルシステインを含まないことを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
- 前記初代ESCC上皮細胞が、ESCC腫瘍細胞、正常ESCC上皮細胞、及びESCC上皮幹細胞から選択されることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
- 初代ESCC上皮細胞を培養する方法であって、
(1)請求項1~15のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地を調製する工程と、
(2)細胞外マトリックスゲル希釈剤で培養容器をコーティングする工程と、
(3)ESCC組織から分離した初代ESCC上皮細胞を前記コーティングされた培養容器に接種し、工程(1)の前記初代細胞培養培地を用いて培養する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。 - ESCC疾患を治療するための薬剤を評価又はスクリーニングする方法であって、
(1)請求項16に記載される前記培養方法により、前記ESCC上皮細胞を培養する工程と、
(2)試験する前記薬剤を選択し、種々の薬剤濃度勾配に希釈する工程と、
(3)工程(1)で得られた前記ESCC上皮細胞に、勾配に希釈した前記薬剤を添加し、細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
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