CN109536444B - 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 - Google Patents

一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109536444B
CN109536444B CN201811508916.2A CN201811508916A CN109536444B CN 109536444 B CN109536444 B CN 109536444B CN 201811508916 A CN201811508916 A CN 201811508916A CN 109536444 B CN109536444 B CN 109536444B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
amplification
culture
medium
tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811508916.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109536444A (zh
Inventor
姜丽君
李超
张强
毕薇薇
张立娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd filed Critical Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd
Priority to CN201811508916.2A priority Critical patent/CN109536444B/zh
Publication of CN109536444A publication Critical patent/CN109536444A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109536444B publication Critical patent/CN109536444B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Abstract

本发明提供了一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，具体地，包括1)将肿瘤组织加工成体积为0.5‑3mm3的组织块；2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，孵育10‑60分钟；4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10‑30天，每2‑3天采用预扩增培养基半量换液。本发明为恶性实体瘤的特异性生物治疗提供了一种有效的肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法。采用本发明方法分离得到的肿瘤浸润T淋巴细胞纯度高且具有更强的肿瘤细胞杀伤活性。

Description

一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法。
背景技术
目前对于肿瘤的治疗主要的治疗手段包括传统的放射治疗、手术切除肿瘤、药物治疗以及新兴的肿瘤生物治疗。由于手术、放化疗在治疗中会给患者带来巨大的毒副作用，因此生物治疗凭借其显著疗效的优势成为第四种重要的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗主要包括：过继细胞治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗、靶向分子治疗等。目前关于过继细胞治疗的研究比较多，其中包括了肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)，其主要为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞，在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿。
目前本领域体外分离恶性实体瘤TIL方法主要有采用机械解聚、酶消化和非连续密度梯度离心的方法进行分离。这些经典的分离TIL细胞肿瘤杀伤活性的方法需要从患者肿瘤组织分离并诱导培养出原代肿瘤细胞作为靶细胞，并经过体外TIL细胞与靶细胞的共培养(例如24小时)，耗时较长；且从肿瘤组织分离培养原代肿瘤细胞以及肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞也颇具难度，所以，迫切需要建立高效、易行的方法分离、鉴定患者肿瘤浸润T淋巴细胞，以便应用于肿瘤的免疫治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种从恶性实体瘤中分离、诱导、培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法。此法操作简单、方便、适合所有恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离。
在一个实施方案中，本发明提供一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其包括：
1)将肿瘤组织加工成体积为0.5-3mm3的组织块；
2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；
3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，并孵育10-60分钟；
4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液。
在一个具体的实施方案中，所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法还包括步骤5)：替换步骤4)中的预扩增培养基为快速扩增培养基进一步培养7-14天，每2-3天采用快速扩增培养基半量换液。
在一个可选的实施方案中，所述预扩增培养基为补充有50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、10-30ng/ml IL-7、10-30ng/ml IL-15、10-30ng/ml IL-21和1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。
在一个可选的实施方案中，所述预扩增培养基中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白的浓度为100-400ng/ml，优选150-350ng/ml，更优选200-300ng/ml；IL-7的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；IL-15的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；IL-21的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；SUPERGROW细胞培养添加物在预扩增培养基中的体积比为1.5-4.5％(v/v)，优选2-4％(v/v)，更优选2.5-3.5％(v/v)。
在一个优选的实施方案中，所述预扩增培养基为补充有100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、20ng/ml IL-7、20ng/ml IL-15、20ng/ml IL-21和2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。
在一个可选的实施方案中，所述快速扩增培养基为补充有1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、5000-8000IU/ml IL-2的基础培养基。
在一个优选的实施方案中，IL-2为注射用重组人IL-2。
在一个可选的实施方案中，SUPERGROW细胞培养添加物在所述快速扩增培养基中的体积比为1.5-4.5％(v/v)，优选2-4％(v/v)，更优选2.5-3.5％(v/v)；所述快速扩增培养基中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白的浓度为100-400ng/ml，优选150-350ng/ml，更优选200-300ng/ml；IL-2的含量为5500-7500IU/ml，优选6000-7000IU/ml，更优选6000-6500IU/ml。
在一个优选的实施方案中，所述快速扩增培养基为补充有2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、6000IU/ml IL-2的基础培养基。
在上述实施方案中，基础培养基是指未添加血清和其他添加剂的任何商业可获得的细胞培养基，例如但不限于Lonza销售的货号为：04-418Q的X-VIVO15培养基。
在一个具体的实施方案中，所述基质胶为：BD MatrigelTM基底膜基质。在其他实施方案中，也可选择其他基质胶或其等同物，例如纤连蛋白、多聚赖氨酸。
在一个具体的实施方案中，BD MatrigelTM基底膜基质采用基础培养基5-15倍稀释。如前所述，基础培养基是指未添加血清和其他添加剂的任何商业可获得的细胞培养基，例如Lonza销售的货号为：04-418Q的X-VIVO15培养基。
优选地，采用冷的(4℃)基础培养基(Lonza)将BD MatrigelTM基底膜基质进行10倍稀释。
在一个具体的实施方案中，在步骤1)中，将肿瘤组织加工成体积为1-2mm3的组织块。
在一个具体的实施方案中，在步骤2)中，在4℃条件下将经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被2-8分钟，优选3-7分钟，更优选4-6分钟，最优选5分钟。
在一个具体的实施方案中，在步骤3)中，将经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，并在37℃，5％CO2下孵育10-60分钟；优选孵育20-50分钟，更优选20-40分钟，最优选30分钟。
在一个具体的实施方案中，在步骤4)中，向细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液，其中，当培养到5-15天时，镜下可看到肿瘤浸润T淋巴细胞或成纤维细胞生长，去除组织块，继续培养5-15天。
在一个具体的实施方案中，所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法包括：
1)肿瘤组织的处理
取出肿瘤组织，用含有抗生素的PBS冲洗液冲洗和浸泡，去除脂肪、血管和坏死组织。剩余肿瘤组织用手术剪子剪成组织块后，改用眼科剪子进一步加工成体积较小(约1-2mm3)组织块。较小组织块用离心法或换液法冲洗一次待用。
2)小组织块的包被处理
取1管(-20℃)冻存的基质胶储存液(经分装，1ml/2ml EP管)，置4℃冰箱过夜融化，用冷的(4℃)基础培养基进行10倍稀释，在4℃条件下加入一次性塑料平皿内，将上述制备好的小组织块转移到胶液中，使组织块充分浸入胶液中，让胶液包被组织。
3)组织块接种
用眼科镊子夹取胶液包被的组织块，均匀摆放在6孔培养板底部(接种)，相邻组织间隔一定距离。接种组织块的培养板放置在培养箱内(37℃，5％CO2)孵育30分钟。
4)组织块(原代肿瘤浸润T淋巴细胞)预扩增培养
30分钟后，取出培养板，肉眼观察基质胶已凝固，组织块不再移动。在各孔内小心加入5ml预扩增培养基，将培养板放置在培养箱内连续培养，直到淋巴细胞移出和增殖，每2-3天半换液。当培养到7-14天时，镜下可看到肿瘤浸润T淋巴细胞或成纤维细胞生长，去除组织块，培养板继续培养7-14天。如肿瘤浸润T淋巴细胞与成纤维细胞共生长时，将TIL转移到新培养板内继续培养，当细胞培养到一定数量时可进行回输治疗、冻存待用、活性检测或进入快速扩增阶段。
5)肿瘤浸润T淋巴细胞快速扩增培养
当肿瘤浸润T淋巴细胞用预扩增培养基培养到一定时间后，其生长速度会逐渐降低。采用快速扩增培养基重新刺激肿瘤浸润T淋巴细胞的增殖潜能，快速扩增培养时间依据起始细胞数量、临床回输细胞剂量和细胞增殖潜能确定。
在另一方面，本发明提供了通过上述方法获得的肿瘤浸润T淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供了上述的肿瘤浸润T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在上述方面中，所述实体瘤包括但不限于：黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、直肠癌等实体瘤组织。
本发明主要采用基质胶制备肿瘤浸润T淋巴细胞。基质胶主要由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
本发明的方法与传统的机械解聚法、酶消化法和非连续密度梯度离心法相比具有明显的优势，其能够在最短时间内、最大限度的保留目的细胞，且不影响细胞的生物活性。此法操作简单、方便、适合所有恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离，在肿瘤浸润T淋巴细胞制备领域可以得到广泛应用。
本发明的肿瘤浸润T淋巴细胞体外扩增体系采用SUPERGROW细胞培养添加物、兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的x-vivo15无血清培养基联合培养，经测定其培养的细胞纯度高达90％以上，杀瘤性高达90％以上，增殖率达到1000倍。细胞在纯度、杀瘤性、增殖率指标上比较稳定，所以此发明方法培养的肿瘤浸润T淋巴细胞能够满足临床需求，是目前为止肿瘤浸润T淋巴细胞体外培养最优方法。
附图说明
图1A至图1B是采用本发明的方法培养的细胞的镜检图，图1A为长时间动态活细胞成像及数据分析系统IncuCyte采集的局部细胞图片；图1B为显微镜下数码相机采集的细胞图片(100倍)，图片显示孔内有小群TIL生长。
图2A至图2B是采用本发明的方法培养第14天细胞在40倍(图2A)和200倍(图2B)镜下图片。图中显示：细胞团数量较多，体积较大，底部分布较均匀，游离细胞数量较少，细胞处于快速增长期。
图3A至图3G：流式细胞仪检测TIL快速扩增后表型分析。
图4：TIL对人乳腺癌MCF-7细胞的杀伤活性。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：用基质胶分离肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)以及诱导方法
1、肿瘤组织的处理
在GMP实验间内，实验人员用镊子取出肿瘤组织(来自四平市中心人民医院乳腺癌患者术后的癌组织)，用含有抗生素(青霉素、链霉素各100u/ml)的PBS(PH 7.4,Gibco)缓冲液冲洗，并浸泡10分钟，用手术剪子和镊子等工具去除脂肪、血管和坏死组织。剩余肿瘤组织用锋利的手术剪子剪成组织块后，改用锋利的眼科剪子进一步加工成体积较小(约1-2mm3)组织块，加工过程中尽量避免挤压组织，小组织块用离心法分离，采用300g离心5min，去上清液后待用。
2、小组织块的包被处理
取1管(-20℃)冻存基质胶储存液(BD MatrigelTM基底膜基质，货号356237，亦可用其他基质胶或等同物，例如纤连蛋白/多聚赖氨酸，但分离效果不如基质胶)(经分装，1ml/2ml EP管)，置4℃冰箱过夜融化，用冷的(4℃)基础培养基(美国Lonza，货号为：04-418Q，X-VIVO15培养基)进行10倍稀释，获得胶液，在4℃条件下加入一次性塑料平皿内，将上述制备好的小组织块转移到胶液中，使组织块充分浸入胶液中，让胶液包被组织5min。
3、组织块接种
用眼科镊子小心夹取胶液包被的组织块，均匀摆放在6孔培养板底部(接种)，相邻组织间隔一定距离，平均6块/孔。接种组织块的培养板放置在培养箱内(37℃，5％CO2)孵育30分钟。
4、组织块(原代TIL)预扩增培养
1)TIL用预扩增培养基、快速扩增培养基组成
1.1TIL用预扩增培养基：
在X-VIVO15培养基(美国Lonza，货号为：04-418Q)中添加50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(法国赛达公司，货号：S20090067)、10-30ng/ml IL-7(北京同立海源，货号为TL506)、10-30ng/ml IL-15(北京同立海源，货号为TL202)、10-30ng/ml IL-21(北京同立海源，货号为TL509)、1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物(SGR-SM，达科为，DKW34-SM20025)。
在本实施例中，SUPERGROW细胞培养添加物在预扩增培养基中体积分数为2.5％(v/v)。兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白在预扩增培养基终浓度为100ng/ml。IL-7因子在预扩增培养基终浓度为20ng/ml。IL-15因子在预扩增培养基终浓度为20ng/ml。IL-21因子在预扩增培养基终浓度为20ng/ml。
1.2TIL用快速扩增培养基：
在X-VIVO15培养基(美国Lonza，货号为：04-418Q)中添加1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物(达科为，DKW34-SM20025)、50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(法国赛达公司，货号：S20090067)、5000-8000IU/ml注射用重组人IL-2(沈阳三生制药有限公司，100万国际单位/瓶)。
在本实施例中，兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白在快速扩增培养基终浓度为100ng/ml；SUPERGROW细胞培养添加物在快速扩增培养基中体积分数为2.5％(v/v)；IL-2在快速扩增培养基终浓度为6000IU/ml。
2)在上述步骤3的组织块接种30分钟后，取出培养板，肉眼观察基质胶已凝固，组织块不再移动。在各孔内小心加入5ml上述配置的TIL预扩增培养基，将培养板放置在培养箱内连续培养，直到淋巴细胞移出和增殖，每2-3天半换液。当培养到7-14天时，镜下可看到TIL或成纤维细胞生长，去除组织块，培养板继续培养7-14天(本实施例培养7天除去组织块，继续培养7天，共培养14天)。如TIL与成纤维细胞共生长时，需剔除成纤维细胞，此时应将TIL转移到新培养板内继续培养，当细胞培养到一定数量时可进行回输治疗、冻存待用，计数、表型、活性检测或进入以下的快速扩增阶段。
5、TIL快速扩增培养
当TIL用预扩增培养基培养到一定时间后，其生长速度会逐渐降低。采用快速扩增培养基重新刺激TIL的增殖潜能。细胞经2000rpm离心5min后，去除上清，用扩增培养基按照1.5×106/ml密度重悬并重新接种，每2-3天半量换液，培养7-14天即可进行回输治疗或用于活性检测(在本实施例中为继续培养7天，即，总共培养21天)。
测试例1：流式细胞仪检测TIL快速扩增后表型分析
TIL是继LAK细胞后发现的有一类具有抗癌活性的免疫效应细胞，其细胞来源是肿瘤组织及癌旁组织中的分离的浸润淋巴细胞。TIL主要是淋巴细胞，表型以CD3+CD4+和CD3+CD8+为主，但细胞表型具有异质性，不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异，大多数情况下以CD8+T细胞为主。具有高比率的记忆性免疫细胞,高表达相关记忆性标志物CD27、CD45RO、CCR7。
本发明实施例1中快速培养扩增后(第21天)的TIL中，以CD8+亚群淋巴细胞为主，CD8亚群淋巴细胞(CD3+/CD8+)占全体细胞的百分率为77.16％(参见图3A)，而CD4亚群淋巴细胞(CD3+/CD4+)的百分率为9.20％(参见图3B)，CIK(CD3+/CD56+，多种细胞因子诱导的杀伤细胞，其是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞)亚群细胞的百分率为53.60％(参见图3C)。在CD8亚群中含有具有记忆性T淋巴细胞，这些细胞表面高表达CD27(CD8+/CD27+细胞，百分率为17.85％，参见图3D)、CD45RO(CD8+/CD45RO+细胞，其百分率为70.97％，参见图3E)和CCR7(CD8+/CCR7+细胞的百分率为10.06％，参见图3F)，也高表达效应T细胞表面标记CD45RA(CD8+/CD45RA+细胞，其百分率为44.64％，参见图3G)。
测试例2：细胞杀伤活性检测
取对数生长期的人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株(购于上海艾研生物科技有限公司)作为靶细胞，并调整细胞密度为8×105个/ml，每孔取50μl铺于96孔培养板中。取本发明实施例1中获得的第14天(预扩增后，快速扩增前)和第21天(快速扩增后)的TIL细胞，调整密度为8×105个/ml、4×106个/ml、8×106个/ml、1.6×107个/ml，分别加入96孔培养板中，每孔50μl，使效靶比分别为1:1、5:1、10:1、20:1，每组设三个复孔。接种方式如下：
空白组(a值)：X-VIVO-15(100μl)
TIL细胞(b值)：TIL(50μl)+X-VIVO-15(50μl)
对照组(c值)：MCF-7(50μl)+X-VIVO-15(50μl)
实验组(d值)：MCF-7(50μl)+TIL细胞(50μl)
将接种好的细胞，置于37℃，5％CO2条件下共培养24小时后，每孔加10μl的CCK-8试剂(Sigma，96992-100TESTS-F)，摇匀，37℃，5％CO2条件下继续培养3小时，酶标仪波长492nm测定吸光度。按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1-(d值-b值-a值)/(c值-a值)]×100％。结果显示本发明制备的TIL细胞对人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞具有较高的杀伤活性，在10:1、20:1的效靶比下第14天杀伤率即可达到100％；在5:1的效靶比下第14天杀伤率可达到85％以上，第21天杀伤率可达到95％；在1:1的效靶比下第14天和21天的杀伤率均低于40％，但第21天的杀伤率显著高于第14天(参见图4)。
测试例3：TIL体外扩增数量及活性检测
从5例乳腺癌患者的乳腺癌组织(来自四平市中心人民医院)中分离的TIL均在体外适度增殖(按实施例1中的方法)，在预扩增培养阶段，应用预扩增培养基培养后，细胞数量3×106～6×106数量级，在快速扩增阶段，采用快速扩增培养基培养7-10天后，经过21天的培养，5例乳腺癌患者的TIL能扩增到3×109～5×109。表型分析发现细胞以CD3+为主，纯度90％以上，其中CD3+CD8+表达75％以上，表明此方法获得了更多抗原特异性的效应T细胞，因癌症组织内浸润的CD8+细胞的数量与患者的预后成正相关，其数量越多，预后越好。这些结果均显示此法培养的TIL具有很好的抗肿瘤活性。5例患者的TIL扩增数量、活率、表型参见下表1。
表1：5例患者的TIL扩增数量、活率、表型
Figure BDA0001900194870000101

Claims (3)

1.一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其包括：
1)将肿瘤组织加工成体积为0.5-3mm3的组织块；
2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；
3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，孵育10-60分钟；
4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液；其中，所述预扩增培养基为补充有50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、10-30ng/ml IL-7、10-30ng/ml IL-15、10-30ng/ml IL-21和1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基；和
5)替换步骤4)中的预扩增培养基为快速扩增培养基进一步培养7-14天，每2-3天采用快速扩增培养基半量换液；其中，所述快速扩增培养基为补充有1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、5000-8000IU/ml IL-2的基础培养基。
2.根据权利要求1所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其中，所述预扩增培养基为补充有100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、20ng/ml IL-7、20ng/ml IL-15、20ng/ml IL-21和2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。
3.根据权利要求1所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其中，所述快速扩增培养基为补充有2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、6000IU/ml IL-2的基础培养基。
CN201811508916.2A 2018-12-11 2018-12-11 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 Active CN109536444B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508916.2A CN109536444B (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508916.2A CN109536444B (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109536444A CN109536444A (zh) 2019-03-29
CN109536444B true CN109536444B (zh) 2022-06-28

Family

ID=65853433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811508916.2A Active CN109536444B (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109536444B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849892B (zh) * 2020-07-07 2023-02-03 南方医科大学深圳医院 一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(til)的体外扩增方法及用途
CN114763530A (zh) * 2021-01-15 2022-07-19 上海细胞治疗集团有限公司 一种诱导和制备til细胞的方法
CN114410689B (zh) * 2022-03-29 2022-06-17 北京循生生物医学研究有限公司 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991004317A1 (en) * 1989-09-14 1991-04-04 Cellco, Inc. Method for the production of in vitro expanded lymphoid cells for use in adoptive immunotherapy
CN103013914A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 吉林省拓华生物科技有限公司 体外培养杀伤性t细胞的方法
CN107043749A (zh) * 2017-04-21 2017-08-15 北京奥康华医学检验所有限公司 一种肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法
CN108192865A (zh) * 2017-12-29 2018-06-22 吉林省拓华生物科技有限公司 Nk细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒
CN108219004A (zh) * 2018-02-08 2018-06-29 吉林省拓华生物科技有限公司 双特异嵌合抗原受体修饰的t细胞、其制备方法及用途
WO2018209115A1 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2019136459A1 (en) * 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
EP3565586A1 (en) * 2017-01-06 2019-11-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
CN110938594A (zh) * 2019-09-12 2020-03-31 夏建川 一种功能增强型til细胞的培养方法
CN111849892A (zh) * 2020-07-07 2020-10-30 南方医科大学深圳医院 一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞（til）的体外扩增方法及用途
CN112779217A (zh) * 2021-03-29 2021-05-11 复旦大学附属中山医院 一种高记忆表型肿瘤浸润t淋巴细胞的培养方法
WO2021173964A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of tumor infiltrating lymphocytes

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618498B (zh) * 2012-03-26 2014-04-09 时宏珍 Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法
CN102719401B (zh) * 2012-07-05 2014-04-23 时宏珍 Hla-a0201限制性抗mage抗原特异性ctl的制备方法
CA3176706A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 Imstem Biotechnology, Inc. Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
CN104120104B (zh) * 2013-07-17 2016-12-28 吉林省拓华生物科技有限公司 一种cd34+细胞的生产方法
CN104818249B (zh) * 2015-03-27 2017-11-10 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 一种增强型cik细胞制剂及其制备方法
US11179448B2 (en) * 2015-07-16 2021-11-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory T cells and use of same in immunotherapy
CA3002674A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
WO2017147894A1 (zh) * 2016-03-04 2017-09-08 张明杰 增强对异常细胞杀伤力的组合物及其应用
TW202342540A (zh) * 2016-03-14 2023-11-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
CN106085956A (zh) * 2016-06-12 2016-11-09 杨世成 一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用
CN106636206A (zh) * 2016-10-28 2017-05-10 南京市妇幼保健院 一种merrf患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法
CN106554942A (zh) * 2016-11-18 2017-04-05 吉林省拓华生物科技有限公司 一种高效的临床级cd56+群免疫细胞的制备方法
CN108617638B (zh) * 2017-03-22 2020-01-24 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用
JP2020527025A (ja) * 2017-07-12 2020-09-03 シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド 腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物
CN107557332B (zh) * 2017-09-28 2021-02-26 吉林省拓华生物科技有限公司 Cd29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途
CN108070558B (zh) * 2017-11-24 2022-01-28 吉林省拓华生物科技有限公司 一种临床级神经干细胞的制备方法
GB201721615D0 (en) * 2017-12-21 2018-02-07 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Immune cell organoid co-cultures
US20190204299A1 (en) * 2018-01-04 2019-07-04 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
CN108300692B (zh) * 2018-01-17 2022-02-15 吉林省拓华生物科技有限公司 一种制备hpv抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法
CA3090795A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
BR112020018573A2 (pt) * 2018-03-15 2020-12-29 KSQ Therapeutics, Inc. Composições e métodos de regulação gênica para imunoterapia aprimorada
EP3941511A2 (en) * 2019-03-20 2022-01-26 Massachusetts Institute of Technology Uses of amphiphiles in immune cell therapy and compositions therefor
CN110452870A (zh) * 2019-05-20 2019-11-15 河南省肿瘤医院 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品
WO2020257423A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 North Carolina State University In situ recruitment, reprogramming, and release of car-t cells
GB201910605D0 (en) * 2019-07-24 2019-09-04 Immetacyte Ltd Tumour infltracting lymphocyte therapy amd uses thereo
CN112522183B (zh) * 2019-09-17 2023-03-31 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 干细胞体外扩增方法
WO2021061832A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-01 Regents Of The University Of Minnesota Genetically-edited immune cells and methods of therapy
EP4077641A1 (en) * 2019-12-20 2022-10-26 Instil Bio (Uk) Limited Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof
CN113528444B (zh) * 2020-04-15 2023-05-23 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991004317A1 (en) * 1989-09-14 1991-04-04 Cellco, Inc. Method for the production of in vitro expanded lymphoid cells for use in adoptive immunotherapy
CN103013914A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 吉林省拓华生物科技有限公司 体外培养杀伤性t细胞的方法
EP3565586A1 (en) * 2017-01-06 2019-11-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
CN107043749A (zh) * 2017-04-21 2017-08-15 北京奥康华医学检验所有限公司 一种肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法
WO2018209115A1 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
CN108192865A (zh) * 2017-12-29 2018-06-22 吉林省拓华生物科技有限公司 Nk细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒
WO2019136459A1 (en) * 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
CN108219004A (zh) * 2018-02-08 2018-06-29 吉林省拓华生物科技有限公司 双特异嵌合抗原受体修饰的t细胞、其制备方法及用途
CN110938594A (zh) * 2019-09-12 2020-03-31 夏建川 一种功能增强型til细胞的培养方法
WO2021173964A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of tumor infiltrating lymphocytes
CN111849892A (zh) * 2020-07-07 2020-10-30 南方医科大学深圳医院 一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞（til）的体外扩增方法及用途
CN112779217A (zh) * 2021-03-29 2021-05-11 复旦大学附属中山医院 一种高记忆表型肿瘤浸润t淋巴细胞的培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CD25+ Regulatory T Cell Depletion Augments Immunotherapy of Micrometastases by an IL-21-Secreting Cellular Vaccine;Alberto Comes等;《The Journal of Immunology》;20060201;第1750-1758页 *
人实体瘤肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增及功能评价;强新等;《青岛大学医学院学报》;19980930(第03期);第13-15页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109536444A (zh) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7451468B2 (ja) 非造血組織常在性γδ Ｔ細胞の増幅および該細胞の使用
US8278101B2 (en) Stem cell bioprocessing and cell expansion
CN109536444B (zh) 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法
US20050014255A1 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
US20220010276A1 (en) Methods for isolating and expanding cells
JP2002529073A (ja) 三次元装置における造血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞の生成
CN109536446A (zh) 单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、及单核细胞的制造方法
US20220010277A1 (en) Methods for isolating and expanding cells
CA3048831C (en) Method for obtaining monocytes or nk cells
EP1666589B1 (en) Process for producing cytotoxic lymphocytes
WO2020044538A1 (ja) ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地
CN115558641A (zh) 高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用
CN111172110B (zh) 一种脐带血cik细胞的培养方法
JPH089967A (ja) 癌細胞障害性ｔリンパ球の誘導培養方法
US20220249567A1 (en) Low density cell culture
CN107864627A (zh) 包含粘附基质细胞的方法和组合物
CN116179486B (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法
RU2784566C2 (ru) РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ Т-КЛЕТОК
JP2023525345A (ja) ガンマデルタｔ細胞を単離する方法
CN115232854A (zh) 一种源细胞的筛选方法、源细胞、细胞库及产品
WO2005033268A2 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
CN116948962A (zh) 一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异t细胞，及其分离扩增和应用
CN117716023A (zh) 产生骨髓重建物的培养基和方法
CN117844748A (zh) 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法
TW202000900A (zh) 體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之方法及其醫藥組成物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant