CN108219004A

CN108219004A - 双特异嵌合抗原受体修饰的t细胞、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN108219004A
Application number: CN201810127130.XA
Authority: CN
Inventors: 王本旭; 徐岩; 毕薇薇
Original assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明涉及双特异嵌合抗原受体修饰的T细胞、其制备方法及用途。具体地，本发明涉及包含特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分和特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的双特异嵌合抗原受体、编码其的cDNA、包含所述cDNA的表达载体、用所述表达载体转染的T淋巴细胞以及所述T淋巴细胞在治疗肿瘤中的用途。

Description

双特异嵌合抗原受体修饰的T细胞、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗的技术领域。具体地，本发明涉及特异性靶向CEA5和MSLN胞外域的表达IL-15的双特异性嵌合抗体受体修饰的T细胞、其制备方法以及在治疗肿瘤中的用途。

背景技术

细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的肿瘤细胞。淋巴细胞免疫技术在国内外已经用于临床治疗肿瘤，并取得些许临床疗效，例如细胞因子诱导杀伤细胞、细胞毒T淋巴细胞以及TIL等，但均为非特异性杀伤作用，其对体内肿瘤细胞的清除作用还十分有限。

嵌合抗原受体CAR由一个scFv单链抗体通过铰链和跨膜结构与胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以来，其已经历了三个不同的发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，增强了T细胞的增殖能力。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。

2017年8月30日美国FDA批准第一个CAR-T细胞(诺华的CD19CART)上市，商品名Kymriah。2017年10月18日，FDA再次批准CAR-T细胞治疗Kite Pharma的Yescarta上市。伴随这两个产品的上市，CAR-T技术治疗肿瘤进入历史性阶段。目前，国内外进入临床试验的CAR-T项目有200余项。

无论是已上市的CAR-T产品，还是正在进行临床试验的项目，均存在CAR-T细胞脱靶效应，在一定程度上导致CAR-T细胞的强烈副作用。因此有必要对CAR的自身应用体系进行改造，提高CAR介导的肿瘤ACT的临床安全性。

发明内容

目前临床应用的T淋巴细胞技术靶向肿瘤细胞的杀伤特异性差、在体内激活患者自身免疫作用的抗肿瘤效果不足，造成大多数T淋巴细胞靶向技术对恶性肿瘤的临床治疗有限。本发明人在前期研究工作中发现，肺鳞癌、结直肠癌和胰腺导管癌组织和细胞均特异性地共高表达癌胚抗原(CEA5)和间皮素(Mesothelin，MSLN)两个肿瘤特异性抗原。

在这一发现的基础上，本发明人通过杂交瘤技术分别获得与肿瘤抗原CEA5和MSLN的胞外区特异性结合的两个单克隆抗体，以及产生该单克隆的细胞株。通过蛋白测序确定单克隆抗体的重链和轻链的可变区，利用基因PCR技术将重链和轻链通过链接子(linker)连接产生单链抗体(scFv)，借助酶联免疫法和流式细胞仪检测分别能特异性结合CEA5和MSLN肿瘤抗原的两个scFv，这两个scFv可以作为结合CEA5和MSLN肿瘤抗原的抗体。

本发明提供了一种表达IL-15的靶向肺癌、结、直肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞的双特异嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备方法。其中癌胚抗原(CEA5)和间皮素(Mesothelin,MSLN)两种靶抗原能够同时在肺鳞癌细胞、结直肠癌细胞以及导管胰腺癌共表达。本发明靶向CEA5和MSLN胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异性结合的单链抗体；同时由于IL-15能够刺激T细胞、NK细胞、NKT细胞等加速成熟，间接破坏肿瘤微环境，因而构建成含抗人CEA5和MSLN以及IL-15的双特异性嵌合抗原受体基因，重组到病毒载体上并转染至人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异性结合人CEA5和MSLN共表达的肺癌结直肠癌胰腺癌等肿瘤细胞，激活第一信号和共刺激信号而引发抗癌细胞活性，细胞水平试验抗肿瘤具有很强杀伤活性。

进一步地，本发明涉及参与不同信号的两个嵌合抗原受体，其各自独立地传递信号，其中一个嵌合抗原受体由特异性结合肿瘤抗原CEA5胞外区的scFV、CD8铰链区、跨膜区和CD3ζ胞内信号传导域组成，另一个嵌合抗原受体由特异性结合肿瘤抗原MSLN胞外区的scFV、CD8铰链区、跨膜区和CD137胞内信号传导域组成。

本发明共表达的细胞因子包括IL-12、IL-15、IFN-γ。在本发明的进一步的方面，通过人工合成MSLN-CAR-T2A-IL-15基因片断，构建慢病毒质粒，包装成慢病毒后，浸染T细胞，借助CAR-T细胞与肿瘤细胞相互作用，内源表达IL-15。

在本发明中的一个实施方案中，所述共表达的细胞因子为IL-15。

本发明涉及一种内源表达IL-15的靶向肺癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞的双特异嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备方法。

本发明的基础在于通过流式细胞分析技术得知，CEA5和MSLN两种靶抗原能够同时在肺鳞癌细胞、结直肠癌细胞以及导管胰腺癌高度共表达。本发明靶向CEA5和MSLN胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异性结合的单链抗体；同时由于IL-15(IL-15)能够刺激T细胞、NK细胞、NKT细胞等加速成熟，间接破坏肿瘤微环境，因而构建成含抗人CEA5和MSLN以及IL-15的双特异性嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染至人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异性结合人CEA5和MSLN共表达的肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞，在体外试验激活免疫信号而引发很强的抗肿瘤细胞活性。

本发明所述双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染T淋巴细胞，再将T淋巴细胞培养至16天，获得双特异性CAR-T细胞；通过流式细胞分析技术，CAR-T细胞阳性率达60％以上。

一方面，本发明一种双特异性嵌合抗原受体，其包含特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分和特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分，其中所述特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分由抗CEA5胞外区的特异性抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ胞内信号传导域组成，所述特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分由抗MSLN胞外区的特异性抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD137胞内信号传导域组成。

优选地，所述抗CEA5胞外区的特异性抗体是scFv抗体；其由通过接头连接的轻链可变区和重链可变区组成。

进一步优选地，所述抗MSLN胞外区的特异性抗体scFv抗体；其由通过接头连接的轻链可变区和重链可变区组成。

优选地，根据本发明所述的双特异性嵌合抗原受体，其中所述抗CEA5胞外区的特异性抗体包含如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：4所示的重链可变区。

优选地，根据本发明所述的双特异性嵌合抗原受体，其中抗MSLN胞外区的特异性抗体包含如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：8所示的重链可变区。

更优选地，根据本发明所述的双特异性嵌合抗原受体，其中所述CD8铰链区和CD8跨膜区如SEQ ID NO：14所示和CD3ζ胞内信号传导域如SEQ ID NO：10所示。

进一步优选地，根据本发明所述的双特异性嵌合抗原受体，其中所述CD137胞内信号传导域如SEQ ID NO：12所示。

另一方面，本发明涉及编码本发明双特异性嵌合抗原受体的cDNA。

另一方面，本发明涉及包含编码本发明双特异性嵌合抗原受体的cDNA的表达载体。

根据本发明的一个实施方案，可以在一个表达载体中包含编码特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA和编码特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA；其中编码两部分的cDNA通过mRNA自剪切位点，如T2A切割位点连接。

根据本发明的另一个实施方案，可以在不同的表达载体中分别包含编码特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA和编码特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA。

在本发明的另一个实施方案中，可以在一个表达载体中包含编码特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA、编码特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA，以及包含IL-15基因。优选地，通过T2A切割位点连接编码特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA、编码特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA和包含编码IL-15的基因。

根据本发明的另一个实施方案，可以在不同的表达载体中分别包含编码特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA、编码特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分的cDNA、以及编码IL-15的基因。

优选地，根据本发明所述的表达载体是慢病毒载体。

另一方面，本发明涉及用根据本发明的表达载体转染的T淋巴细胞，其中所述T淋巴细胞特异性结合人CEA5和MSLN，和/或所述T淋巴细胞表达IL-15。

另一方面，本发明涉及根据本发明所述的T淋巴细胞在制备用于抗肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤的细胞共表达CEA5和MSLN抗原。优选地，所述肿瘤选自肺癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌。

附图说明

图1显示A172模型靶细胞的荧光蛋白表达图；其中A172/CEA模型细胞显示显著的CEA绿色荧光表达；A172/MSLN模型细胞显示显著的MSLN蛋白红色荧光表达；A172/CEA/MSLN模型细胞显示显著的CEA绿色荧光和MSLN蛋白红色荧光表达。

图2通过ELISA检测的双特异CEA-MSLN-CART细胞杀伤A172模型靶细胞的LDH效果；细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)OD值越高，说明效应细胞杀伤该靶细胞效果愈明显，靶细胞凋亡或死亡数量愈多。所以从本结果中可以看出，C-M15-CART细胞(即双特异CEA-MSLN-CART的简写)对A172/CEA/MSLN模型靶细胞的杀伤效果明显优于对其它模型靶细胞的杀伤效果。

图3A1-图3E4是显示人结肠癌细胞系SW620、人胰腺癌细胞系PANC-1、人结肠癌细胞系LoVo、人胰腺癌细胞系BxPC-1和人肺癌细胞系NCI-H226的流式细胞分析图。这些图显示经流式细胞检测，上述五种细胞膜表面均共表达CEA和MSLN两种靶抗原，其中，图3A-1至3A-4表示BxPc-3细胞；图3B-1至3B-4表示LoVo细胞；图3C-1至3C-4表示NCI-H226；图3D-1至3D-4表示PANC-1以及图3E-1至3E-4表示SW620细胞。

图4是双特异CEA-MSLN-CART细胞杀伤肿瘤细胞效果图示。该结果表明，与PMBC相比，本发明的双特异CEA-MSLN-CART细胞杀伤LoVo、NCI-H226、PANC-1和SW620的效果显著。尽管NCI-H226肺癌细胞膜表面亦共表达CEA5和MSLN双靶标，但CEA-MSLN-CART细胞对其杀伤效果微弱。

图5是双特异CEA-MSLN-CART细胞杀伤肿瘤细胞效靶比实验结果。从结果中显示出，随着CART细胞数量增多，其杀伤LoVo、PANC-1和SW620效果增强，当E:T比值达到20时，CART细胞杀伤能力达到最强。

图6是ELISA检测双特异CEA-MSLN-CART细胞杀伤A172/CEA/MSLN靶细胞时IL-15表达结果。结果显示，CART细胞杀伤靶细胞时，其上清中IL-15的OD值与其它两组对照细胞相比，有差异。表明IL-15能够正常表达。

图7A至图7D是CAR慢病毒侵染PBMC后48h荧光检测结果。结果显示，CAR慢病毒侵染率达60％以上。

图8是CEA-MSLN-CAR结构。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的具体实施方案中，本发明人通过人工合成构建两个嵌合抗原受体，其中一个嵌合抗原受体由特异性结合肿瘤抗原CEA5胞外区的scFV、CD8铰链区、跨膜区和CD3ζ胞内信号传导域组成，另一个嵌合抗原受体由特异性结合肿瘤抗原MSLN胞外区的scFV、CD8铰链区、跨膜区和CD137胞内信号传导域组成，其中在MSLN特异性嵌合抗体受体中包含IL-15基因片段，即，人工合成MSLN-CAR-T2A-IL-15基因片断。

使用上述基因片段构建慢病毒质粒，包装成慢病毒后，浸染T细胞，借助CAR-T细胞与肿瘤细胞相互作用，内源表达IL-15。

具体地，本发明的信号肽-scFV(CEA5)-CD8铰链区-CD8跨膜区-CD3ζ胞内区、信号肽-scFV(MSLN)-CD8铰链区-CD8跨膜区-CD137胞内区、以及信号肽-IL15通过T2A切割位点连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因cDNA(参见图8)。

在本发明的实施方案中使用的抗CEA5以及抗MSLN的单克隆抗体的序列以及其它序列如下所示：

CEA5 scFv

编码轻链可变区(VL)的基因序列：

GATATCGTGATGACCCAGTCTCAAAGATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCCCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTACAGTCTGAAGACTTGGCGGAGTATTTCTGTCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATGAAACGT SEQ ID NO：1

轻链可变区(VL)的氨基酸序列：

D I V M T Q S Q R F M S T S V G D R V SV T C K A S Q N V G T N V A WY Q Q K PG Q S P K A L I Y S A S Y R Y S G V P DR F T G S G S G T D F T L T IS N V Q SE D L A E Y F C H Q Y Y T Y P L F T F GS G T K L E M K R SEQ ID NO：2

编码重链可变区(VH)的基因序列：

CAGGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAGTTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATACCTTCACAGAATTCGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCTGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAAGAGTTTAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCACCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTAAATATTTCTGTGCTCGATGGGATTTCTATGACTATGTTGAAGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC SEQ ID NO：3

重链可变区(VH)的氨基酸序列：

Q V K L Q Q S G P E L K K P G E T V K I S C K A S G Y T F T E F G M NW V K Q AP G K G L K W M G W I N T K T G E A T Y V E E F K G R F A F S L E TS A T T A YL Q I N N L K N E D T A K Y F C A R W D F Y D Y V E A M D Y W G QG T T V T V S SEQ ID NO：4

MSLN scFv

编码轻链可变区(VL)的基因序列：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGCGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA SEQ ID NO：5

轻链可变区(VL)的氨基酸序列：

DIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：6

编码重链可变区(VH)的基因序列：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAGACCTGGGGCCTCAGTGCAGGTTTCCTGCAGAGCATCTGGATACTCAATCAACACCTACTATATGCAGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGAGCAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTGATCAACCCTAGTGGTGTGACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCCTGACCAACGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCTCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGCACTGTGGGGGGATTTCGGGATGGACGTGTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO：7

重链可变区(VH)的氨基酸序列：

QVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSS SEQ ID NO：8

CD3δ(CD247,CD3zeta)

基因序列：

ATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGCCATCCTGCAGGCACAGTTGCCGATTACAGAGGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGATCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCTTCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO：9

蛋白序列：

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO：10

CD137

基因序列：

ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQID NO：11

蛋白序列：

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO：12

CD8α序列

基因序列：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGAGCCAGTTCCGGGTGTCGCCGCTGGATCGGACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAGCTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGTCCAACCCGACGTCGGGCTGCTCGTGGCTCTTCCAGCCGCGCGGCGCCGCCGCCAGTCCCACCTTCCTCCTATACCTCTCCCAAAACAAGCCCAAGGCGGCCGAGGGGCTGGACACCCAGCGGTTCTCGGGCAAGAGGTTGGGGGACACCTTCGTCCTCACCCTGAGCGACTTCCGCCGAGAGAACGAGGGCTACTATTTCTGCTCGGCCCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGAAGACGTGTTTGCAAATGTCCCCGGCCTGTGGTCAAATCGGGAGACAAGCCCAGCCTTTCGGCGAGATACGTC SEQ ID NO：13

蛋白序列：

MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV SEQ ID NO：14

接头

基因序列：

GGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCT SEQ ID NO：15

蛋白序列：

GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO：16

信号肽序列

基因序列：

ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCASEQ ID NO：17

蛋白序列：

M L L L V T S L L L C E L P H P AF L L I P SEQ ID NO：18

IL-15

基因序列：

ATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCT SEQ ID NO：19

蛋白序列：

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS SEQ ID NO：20

实施例1：A172模型靶细胞构建

1、胰酶消化A172细胞，将细胞转移至15ml离心管中，1000rpm，离心3min，去上清，用DMEM培养基重悬细胞，制备单细胞悬液，计数。调整细胞浓度为2.5×104/ml。

2、96孔细胞培养板每孔加A172细胞悬液100ul，共8孔。

37℃，5％CO2，培养24h。

3、按MOI值为200稀释病毒液。

pWSLV-02-CEA病毒液(滴度为107)稀释

取2个1.5ml EP管，标记1号和2号，1号EP管加入200ul DMEM完全培养基，2号EP中加入100ul DMEM完全培养基。取50ulpWSLV-02-CEA病毒原液加至1号EP管中，混匀；从1号EP管中取100ul病毒悬液加至2号EP管中，混匀。

pWSLV-05-MSLN病毒液(滴度为108)稀释

取2个1.5ml EP管，标记1号和2号，1号EP管加入490ul DMEM完全培养基，2号EP中加入200ul DMEM完全培养基。取10ulpWSLV-02-CEA病毒原液加至1号EP管中，混匀；从1号EP管中取200ul病毒悬液加至2号EP管中，混匀。

4、A172细胞培养24h后，

吸弃原培养基，后每孔加入100ul含有8ug/ml聚凝胺(polybrene)(原液1:1250倍稀释)的新鲜培养基。

第1和2号孔各加入10ul新鲜培养基，

第3和4号孔各加入10ul pWSLV-02-CEA 2号EP管病毒悬液，

第5和6号孔各加入10ul pWSLV-05-MSLN 2号EP管病毒悬液，

第7和8号孔先各加入10ul pWSLV-02-CEA 2号EP管病毒悬液，后各加入10ulpWSLV-05-MSLN 2号EP管病毒悬液。

混匀。

37℃，5％CO2培养

5、4小时后每孔各加入100ul新鲜培养基(作用：稀释聚凝胺)。37℃，5％CO2继续培养。

6、16小时后，每孔各用200ul新鲜培养基替换含有病毒的培养基。37℃，5％CO2继续培养。

7、48后普通倒置显微镜观察观察绿色荧光。

8、扩大培养双侵染细胞，流式细胞技术检测病毒侵染效率。

实施例2：双特异CAR-T细胞制备

1、第1天，取1块24孔平底细胞培养板，每孔加入200ul包被液，移液枪轻轻吹吸，使包被液覆盖板孔底部。(为了后期流式检测，可以包被5孔)。

培养板放置于密闭塑料袋内，4℃包被过液。

2、第2天，取1支冻存的PBMC，常规方法解冻，离心，用一定量的T细胞完全培养基重悬，制备单细胞悬液。

计数，并调整细胞悬液浓度为1×10⁶/ml。

3、从4℃环境取出包被培养板，每包被孔加入500ul PBS或生理盐水轻轻清洗2次，去清洗液。

4、每包被孔先加入400ul T细胞完全培养基，再加入100ul PBMC悬液(每孔中PBMC为1×105)，37℃，5％CO₂培养过夜(16～18h)。

5、第3天，收集培养孔中的PBMC到15ml离心管，1500rpm，离心8min。去上清，加入1.4ml慢病毒侵染培养基，重悬PBMC，用吸管轻轻吹打细胞到单细胞悬液。

然后将细胞悬液平均分至原包被孔中，每孔280ul。

6、每孔中加入20ul慢病毒液(未用完的病毒液保存于4℃，用于次日使用)，移液枪轻轻吹吸混匀。

室温，200g，离心60min。

37℃，5％CO2培养过夜。

7、第4天，重复步骤(5)、(6)进行第2次慢病毒侵染。

8、第5天，收集PBMC到15ml离心管，1500rpm，离心8min。去上清，加入1ml T细胞完全培养基，重悬PBMC，用吸管轻轻吹打细胞到单细胞悬液。

将细胞悬液移至6孔板的1个孔中，37℃，5％CO2继续培养。

9、每隔2天换1次液。视情况换培养瓶培养。

10、第7天时，用荧光倒置显微镜观察细胞，看到绿色荧光说明CAR-T细胞构建成功。

11、细胞数量足可以进行流式检测时，流式检测CAR-T细胞占比。

实施例3：双特异CAR-T杀伤靶细胞效靶比测定

1、制备CEA-MSLN-CART细胞。

2、复苏CEA/MSLN/A172靶细胞，并扩大培养。

3、待靶细胞铺满瓶底，消化细胞，离心收集细胞，X-VIVO-15培养基重悬细胞，并计数，调整靶细胞浓度为2×10⁵/ml。

4、取一块圆形底96孔细胞培养板，如下设计

A 1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

A11

A12

B1

B2

B3

B4

B5

B6

B7

B8

B9

B10

B11

B12

C1

C2

C3

C4

C5

C6

C7

C8

C9

C10

C11

C12

D1

D2

D3

D4

D5

D6

D7

D8

D9

D10

D11

D12

其中A1、B1孔是靶自发释放(Target Spontaneous Release)孔；

C1、D1孔是靶最大释放(Target Maximum Release)孔；

A2、B2孔是培养基背景(Culture Medium Background)孔；

C2、D2孔是体积校正对照(Volume Correction Control)孔；

A3至A8和B3至B8孔是效应细胞自发释放(Effector Cell Spontaneous Release)孔；以及

C3至C8和D3至D8孔是实验(Experimental)孔。

除A2、B2、C2和D2各孔外，其它每孔中加入50μl靶细胞悬液。A2、B2孔和C2、D2孔分别加入100μl X-VIVO-15完全培养基。

A3至A8和B3至B8的各孔中再加入50μl PBMC细胞悬液(E:T值从3至8依次为40、20、10、5、2.5、1.25)。

C3至C8和D3至D8的各孔中再加入50μl CAR-T细胞悬液(E:T值从3至8依次为40、20、10、5、2.5、1.25)。

A1、B1、C1和D1四孔分别加入50μl X-VIVO-15完全培养基。

250g，离心4min，确保CAR-T细胞与靶细胞充分接触。

将培养板37℃，5％CO₂继续培养4h。

5、培养3小时15分钟后，取出细胞培养板，分别向C1、D1、C2、D2的各孔中加入10μl裂解溶液(Lysis Solution)(10X)，混匀。

37℃，5％CO₂继续培养45min。

6、45min后，取出培养板。250g，离心4min。

7、从培养板每孔中吸取50μl转移至对应的ELISA板孔中，然后向每孔中加入50μl试剂，充分混匀。

避光室温作用30min。

8、每ELISA板孔中加入50μl终止，混匀。

9、490nm检测吸光度。

10、如下计算E:T值：

％细胞毒性＝(实验–效应细胞自发–靶自发)/(靶最大–靶自发)

实验＝实验，20:1细胞比率(平均值)–培养基背景(平均值)

靶自发＝靶自发(平均值)–培养基背景(平均值)

效应细胞自发＝效应细胞自发(平均值)–培养基背景(平均值)

靶最大＝靶最大(平均值)–体积培养物对照(平均值)

同样地研究了本发明的双特异性CAR-T细胞对人结肠癌细胞系SW620、人胰腺癌细胞系PANC-1、人结肠癌细胞系LoVo、人肺癌细胞系NCI-H226的杀伤作用的研究。

实施例4：双特异CAR-T杀伤肿瘤实验

1、制备CEA-MSLN-CART细胞。

2、复苏LoVo、NCI-H226、PANC-1和SW620等肿瘤细胞，并扩大培养。

消化细胞，并计数。

3、取24孔细胞培养板，每种细胞接种3个细胞培养孔，每孔接种1×10⁵细胞。同时做2排平行实验。

37℃，5％CO₂继续培养6h，至细胞贴壁。

4、完全去掉上清培养液，每孔加新鲜T细胞完全培养液300μl。

第1列板孔再加入100μl新鲜T细胞完全培养液；

第2列板孔再加入100μl新鲜T细胞完全培养液(含PBMC 2×10⁶)；

第3列板孔再加入100μl新鲜T细胞完全培养液(含双特异CAR-T 2×10⁶)；

37℃，5％CO₂继续培养。

5、普通生物显微镜下每天观察肿瘤细胞生长状态，并确认CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞效果。

序列表

<110> 吉林省拓华生物科技有限公司

<120> 双特异嵌合抗原受体修饰的T细胞、其制备方法及用途

<130> 380012CG

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(327)

<223> CEA5-VL

<400> 1

gatatcgtga tgacccagtc tcaaagattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgttg cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatccc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtacagtct 240

gaagacttgg cggagtattt ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat gaaacgt 327

<210> 2

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(109)

<223> CEA5-VL

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(360)

<223> CEA5-VH

<400> 3

caggtgaagc tgcagcagtc aggacctgag ttgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggata taccttcaca gaattcggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

cctggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca aaactggaga ggcaacatat 180

gttgaagagt ttaagggacg gtttgccttc tctttggaga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctaaat atttctgtgc tcgatgggat 300

ttctatgact atgttgaagc tatggactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CONFLICT

<222> (1)..(120)

<223> CEA5-VH

<400> 4

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 5

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> MSLN-VL

<400> 5

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctattggaga cagagtcacc 60

atcacctgcc gggccagcga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggccccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(107)

<223> MSLN-VL

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(357)

<223> MSLN-VH

<400> 7

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagagac ctggggcctc agtgcaggtt 60

tcctgcagag catctggata ctcaatcaac acctactata tgcagtgggt gcgacaggcc 120

cctggagcag ggcttgagtg gatgggagtg atcaacccta gtggtgtgac aagctacgca 180

cagaagttcc agggcagagt caccctgacc aacgacacgt ccacgaacac agtctacatg 240

cagctgaaca gcctgacctc tgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag atgggcactg 300

tggggggatt tcgggatgga cgtgtggggc aagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(119)

<223> MSLN-VH

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Leu Thr Asn Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Ala Leu Trp Gly Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Lys Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 489

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60

gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 180

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480

ccccctcgc 489

<210> 10

<211> 163

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

100 105 110

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

115 120 125

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

130 135 140

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

145 150 155 160

Pro Pro Arg

<210> 11

<211> 765

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60

acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg gtacattctg tgataataac 120

aggaatcaga tttgcagtcc ctgtcctcca aatagtttct ccagcgcagg tggacaaagg 180

acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga ccaggaagga gtgttcctcc 240

accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact gcctgggggc aggatgcagc 300

atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa aaaaaggttg taaagactgt 360

tgctttggga catttaacga tcagaaacgt ggcatctgtc gaccctggac aaactgttct 420

ttggatggaa agtctgtgct tgtgaatggg acgaaggaga gggacgtggt ctgtggacca 480

tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc cgcctgcccc tgcgagagag 540

ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc tgacgtcgac tgcgttgctc 600

ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc 660

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactg 765

<210> 12

<211> 255

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 13

<211> 705

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagccagt tccgggtgtc gccgctggat cggacctgga acctgggcga gacagtggag 120

ctgaagtgcc aggtgctgct gtccaacccg acgtcgggct gctcgtggct cttccagccg 180

cgcggcgccg ccgccagtcc caccttcctc ctatacctct cccaaaacaa gcccaaggcg 240

gccgaggggc tggacaccca gcggttctcg ggcaagaggt tgggggacac cttcgtcctc 300

accctgagcg acttccgccg agagaacgag ggctactatt tctgctcggc cctgagcaac 360

tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 420

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 480

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 540

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 600

gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac cgaagacgtg tttgcaaatg tccccggcct 660

gtggtcaaat cgggagacaa gcccagcctt tcggcgagat acgtc 705

<210> 14

<211> 235

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr

20 25 30

Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe

115 120 125

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

195 200 205

Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser

210 215 220

Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

225 230 235

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 接头

<400> 15

ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatct 45

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(15)

<223> 接头

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 17

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(66)

<223> 编码信号肽

<400> 17

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(22)

<223> 信号肽

<400> 18

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 19

<211> 486

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 19

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttct 486

<210> 20

<211> 162

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 20

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

Claims

1.一种双特异性嵌合抗原受体，其包含特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分和特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分，其中所述特异性结合CEA5胞外区的嵌合抗原受体部分由抗CEA5胞外区的特异性抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ胞内信号传导域组成，所述特异性结合MSLN胞外区的嵌合抗原受体部分由抗MSLN胞外区的特异性抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD137胞内信号传导域组成。

2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其中抗CEA5胞外区的特异性抗体包含如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：4所示的重链可变区。

3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其中抗MSLN胞外区的特异性抗体包含如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：8所示的重链可变区。

4.cDNA，其编码如权利要求1-3中任一项所述的双特异性嵌合抗原受体。

5.一种表达载体，其包含权利要求4所述的cDNA。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其进一步包含编码IL-15的基因。

7.根据权利要求5或6所述的表达载体，其中所述的表达载体是慢病毒载体。

8.用权利要求5-7中任一项所述的表达载体转染的T淋巴细胞，其中所述T淋巴细胞特异性结合人CEA5和MSLN，和/或所述T淋巴细胞表达IL-15。

9.根据权利要求8所述的T淋巴细胞在制备用于抗肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤的细胞共表达CEA5和MSLN抗原。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌。