CN108059680A - 一种针对cd20和cd3的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体公开了一种针对CD20和CD3的双特异性抗体。本发明包括：单价单元，为轻链—重链对，该轻链—重链对针对肿瘤细胞表面的抗原CD20具有特异性结合能力；单链单元和连接子linker，该单链单元能够特异性结合免疫细胞表面的CD3抗原；该linker连接该单链单元的重链N端和轻链C端，形成Fab‑Fc形式；单价单元与单链单元之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接。本发明的双特异性抗体能够特异性结合CD20和CD3，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果；可用于CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤的治疗，包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等，在肿瘤的免疫治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种针对CD20和CD3的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种针对CD20和CD3的双特异性抗体，及其在肿瘤等免疫疾病中的应用。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)，又称为双功能抗体，可以同时特异性结合两个不同的抗原或两个不同的抗原表位。由于其特异性和双功能性，在肿瘤的免疫治疗及自身免疫病等领域具有良好的应用效果和前景。本发明是针对CD20和CD3抗原的双特异性抗体，能够同时结合恶性B细胞上的CD20抗原和免疫细胞上的CD3抗原，其中抗肿瘤的特异性抗原部分可以结合肿瘤细胞，而抗免疫活性细胞CD3部分，具有激活NK细胞或T细胞作用，将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，提高局部NK细胞或T细胞浓度，从而提高免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。双特异抗体有多种形式，而且对于不同的肿瘤相关抗原，不同的双特异抗体的形式效果是不一样的。因此对于某一个特定的肿瘤相关抗原，需要一系列的试验来选择合适的双特异抗体形式。以下将对上述双特异性抗体相关的现有技术进行概述：
1.CD20
CD20是B淋巴细胞表面特异性的标志性分子，在成熟B细胞及大多数恶性B淋巴细胞表达，但不在早期B细胞祖细胞或晚期成熟浆细胞表达。该分子由297个氨基酸残基组成，穿透细胞膜四次，其抗原表位为第三、第四跨膜区间无糖链的43个氨基酸残基组成的唯一暴露于细胞外的环。CD20的确切功能尚不明确，CD20可能参与B细胞的激活和分化及起到钙通道的功能。由于CD20与抗体结合后不被吸纳进入细胞，也不发生明显的细胞表面脱落现象，所以其是治疗B淋巴细胞相关疾病的理想抗原，比如利妥昔单克隆抗体和奥滨尤妥珠单克隆抗体都是针对CD20的抗体药物，且药效良好。鉴于现有针对CD20的抗体介导免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用仍有上升空间和双特异抗体的优势，良好的抗CD20/CD3双特异抗体可以很好的介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，极具临床应用前景。
2.CD3
CD3分子是广泛分布于T淋巴细胞表面的膜抗原，由6条多肽链组成,每条多肽链胞浆区均有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif,简称ITAM)。CD3与T细胞表面膜受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。CD3分子的主要功能为稳定TCR结构；当TCR特异性识别并结合抗原后,作为诱导T细胞活化的第一信号，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，从而通过调控引起T细胞的增殖与活化，其是调节T细胞状态的理想分子。
3.双特异性抗体
虽然单克隆抗体在临床上广泛用于肿瘤治疗、抗感染治疗和其它疾病的治疗，但由于这些抗体所针对的都是单一的靶点，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁靶细胞，为了增强抗体的效应功能，双特异性抗体在人们多次尝试中经改造而产生。双特异性抗体能够同时识别两个不同的抗原或抗原表位，能在靶细胞和功能细胞之间架起桥梁，加强对肿瘤细胞的杀伤功能。双特异性抗体主要通过：杂交—杂交瘤法、化学偶联法和基因工程方法获得。杂交—杂交瘤法是将两株各自分泌不同单抗的杂交瘤细胞再融合得到的四源杂交瘤或将一株杂交瘤细胞与免疫脾细胞融合得到的三元杂交瘤，目前人源杂交瘤尚未取得突破性进展，只能生产出鼠源双特异性抗体，应用受到极大限制；化学偶联法是将两个不同的全抗分子或功能性片段用化学偶联的方法连接在一起生成双特异性抗体，该方法在操作中难免由于改变抗体的抗原结合部位的结构而破坏其活性；基因工程方法是随着分子生物学的发展而产生的，目前已有数种由该方法产生的双特异性抗体进入临床阶段，并显示出较好的前景。
4.杵臼结构(Knob into Hole)
杵臼结构是将抗体Fc的CH3的疏水氨基酸进行突变。将一条链CH3的侧链氨基酸突变形成分子比较大的疏水氨基酸(杵，knob)，以加强疏水作用力；另一个CH3侧链氨基酸突变形成小的氨基酸(臼，hole),用于减少空间位阻；突变后带有Knob的和带有Hole的CH3以疏水作用形式形成杵臼结构(Knob into Hole，KiH),有利于重链异源二聚体的形成；杵的CH3由于突变后氨基酸的空间位阻大，而臼突变后由于疏水作用力变弱，这两者都不利于同源二聚体的形成；KiH突变主要是发生在CH3结构域的空间结构的内部疏水氨基酸，突变后暴露在外面的氨基酸几乎没有变化，所以不影响Fc的效应功能和引起的免疫原性。因此，KiH常被用于双特异抗体。
现有技术中，针对CD20和CD3抗原的双特异抗体仍存在不足，例如BiTE形式的双特异抗体，BiTE是将抗CD3单链抗体(ScFv)与不同抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体通过肽段进行连接而获得，可同时结合CD3阳性T细胞及肿瘤细胞。BiTE通过结合T细胞表面CD3，将T细胞募集至肿瘤细胞表面，从而激活T细胞进行肿瘤杀伤。BiTE技术克服了ScFv稳定性差、表达量低、溶解性低等问题，但该技术使其恒定区与抗原结合的亲和力下降，同时在体内的半衰期很短；采用Knob-in-Hole技术的双特异抗体由于保留了Fc区域，从而拥有较长的半衰期，但Fc区的修饰使得该抗体在体内没有天然的单克隆抗体稳定。
发明内容
本发明提供了一种新型靶向CD20/CD3的双特异性抗体，本发明的双特异抗体在保持原有CD20抗体体内生物学活性的同时通过特异性识别CD3抗原，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本发明抗CD20/CD3的双特异抗体克服了现有技术中双特异抗体存在的稳定性差、亲和力低、半衰期短、表达量低等缺陷，既保留了对抗原的高亲和力和较长的半衰期，同时对Fc区进行了特定的改造，使其比采用KiH技术的双特异抗体在体内更加稳定，该抗体表达量高，可用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明提供了一种针对CD20/CD3的双特异性抗体，包括：(1)单价单元，为轻链—重链对，该轻链—重链对针对肿瘤细胞表面的抗原CD20具有特异性结合能力，所述单价单元的序列包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；(2)单链单元和连接子linker，所述单链单元能够特异性结合免疫细胞表面的CD3抗原；所述linker连接该单链单元的重链N端和轻链C端，形成Fab-Fc形式，所述单链单元和连接子linker的序列为SEQ IDNO.1。
其中，所述(1)单价单元是由轻链和重链组成，所述重链和轻链之间通过二硫键连接。
其中，所述(1)单价单元与所述(2)单链单元和连接子linker之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接。
其中，本发明双特异性抗体的Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型，优选为IgG4类型。
一种编码所述双特异性抗体的多苷酸或组合。
一种编码所述多核苷酸或组合的表达载体。
一种转染所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
一种针对所述CD20和CD3的双特异性抗体在非正常表达的B淋巴细胞相关治疗疾病中的药物用途。
一种针对上述CD20和CD3的双特异性抗体在肿瘤疾病治疗中的药物用途；所述肿瘤疾病为CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤，所述CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。(摘自1.Smith EJ,Olson K,Haber LJ et al.,Sci Rep,2015Dec中的第一段Abstract；2.Sun LL,Ellerman D,Mathieu M et al.,Sci TranslMed,2015May的第4页；以及3.临床试验NCT02290951)。
本发明相对于现有技术而言，具备的有益效果是：
本发明提供了一种针对CD20和CD3的双特异性抗体，本发明的双特异性抗体在保持原有CD20抗体体内生物学活性的同时通过特异性识别CD3抗原，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的双特异性抗体为Fab-Fc形式，相较于ScFv，CH1和CL能够帮助VH和VL形成稳定的结构，因此,Fab比ScFv形式在结构上更加稳定。本发明的单价单元与单链单元之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接，该结构相对与常用的KiH结构不同，形成的异源二聚体更加稳定，并且更难形成同源二聚体。
本发明的双特异性抗体可用于非正常表达的B淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗，所述肿瘤相关疾病为CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
说明书附图
图1、本发明双特异抗体的分子示意图；
图2、本发明双特异抗体分子中抗CD20轻链的表达载体；
图3、本发明双特异抗体分子中抗CD20重链的表达载体；
图4、本发明双特异抗体分子中抗CD3抗体的表达载体；
图5、纯化后的本发明双特异抗体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图6、本发明双特异抗体与Raji细胞(过表达CD20细胞系)结合情况；
图7、本发明双特异抗体与Jurkat细胞(过表达CD3细胞系)结合情况；
图8、本发明双特异抗体介导的PBMC(外周血单核细胞)对Raji细胞的杀伤效果。
具体实施方式
本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。
一种针对CD20/CD3的双特异性抗体，包括：(1)单价单元，为轻链—重链对，该轻链—重链对针对肿瘤细胞表面的抗原CD20具有特异性结合能力，所述单价单元的序列包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；
SEQ ID NO.2(CD20L)：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
SEQ ID NO.3(CD20H)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSQEEMTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG；
(2)单链单元和连接子linker，所述单链单元能够特异性结合免疫细胞表面的CD3抗原；所述linker连接该单链单元的重链N端和轻链C端，形成Fab-Fc形式，单链单元和连接子linker的序列为SEQ ID NO.1；
SEQ ID NO.1[CD3的轻链(GGGGS)6GG重链V区]：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
其中，所述(1)单价单元是由一条轻链和一条重链组成，所述重链和轻链之间通过二硫键连接。
其中，所述(1)单价单元与所述(2)单链单元和连接子linker之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接。
其中，本发明双特异性抗体的Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型，优选为IgG4类型。
一种编码所述双特异性抗体的多苷酸或组合。
一种编码所述多核苷酸或组合的表达载体。
一种转染所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
一种针对所述CD20和CD3的双特异性抗体在非正常表达的B淋巴细胞相关治疗疾病中的药物用途。
一种针对上述CD20和CD3的双特异性抗体在肿瘤疾病治疗中的药物用途；所述肿瘤疾病为CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤，所述CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。(摘自1.Smith EJ,Olson K,Haber LJ et al.,Sci Rep,2015Dec中的第一段Abstract；2.Sun LL,Ellerman D,Mathieu M et al.,Sci TranslMed,2015May的第4页；以及3.临床试验NCT02290951)。
具体实施例
以下结合附图和实施例详述本发明。
实施例1、双特异抗体分子表达载体的构建
构建的双特异抗体分子(抗体命名为JY052),包含抗CD20抗体的单价单元和抗CD3抗体的单链单元，其中单价单元包含抗CD20抗体的轻链和重链，单链单元中抗CD3抗体的轻链和重链通过linker连接起来，构型示意图如图1。选择PTSE作为表达载体去克隆和表达抗CD20的轻链、重链基因和抗CD3单链基因。轻、重链基因和单链基因分别在编码区序列两侧加入Sall、BamHl酶切位点，合成三条基因并分别克隆到PUC19载体中。将三个质粒分别转化到TOP感受态中，用小提试剂盒进行小提后与载体分别用限制性内切酶Sall-HF和BamHI-HF酶切，进行同源重组，分别得到含有轻链、重链及单链基因的表达载体(如图2、图3、图4)，质粒分别命名为：PTSE-antiCD20L、PTSE-antiCD20H、PTSE-antiCD3。
实施例2、双特异抗体分子的表达与纯化
1).双特异抗体的表达
利用无内毒素大提试剂盒进行质粒大提，具体操作步骤如下：
(1)取200ul活化的菌液置于500ml摇瓶(含200ml amp+的LB培养基)中，37℃，220rpm摇床过夜培养；
(2)取200ml过夜培养的菌液，加入离心管中，7000rpm离心5分钟收集细菌，尽量除尽全部上清；
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入12.5ml Buffer P1(已加入RNase A)，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；
(4)向离心管中加入12.5ml Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟，待溶液应变得清亮粘稠；
(5)向离心管中加入12.5ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟；7000rpm离心15分钟，将上清全部倒入除内毒素过滤器(Endo-Remover FQ)中，慢慢推动推柄(Plungers)过滤，滤液收集在干净的50ml离心管(自备)中；
(6)向滤液中加入(10ml)0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀；
(7)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱(Spin Columns DQ)中加入2ml BufferPS，7000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(8)将步骤6中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中；
(9)7000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(10)向吸附柱中加入10ml Buffer PW(已加入无水乙醇)，7000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液；
(11)重复步骤(10)一次；
(12)将吸附柱重新放回收集管中，7000rpm离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；
(13)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1ml无内毒素用水，室温放置2-5分钟，7000rpm离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中；测定浓度后，于-20℃保存质粒。
人胚肾细胞(HEK293ES悬浮细胞)在FreeStyle 293Expression Medium(Gibco)中培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2-0.6×106/ml，细胞培养体积为摇瓶容积的15-35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，CO2:5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的HEK293ES细胞，传代到细胞密度为0.5×106/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％CO2)培养过夜，待第二天进行转染。
转染前将准备好的1×106/ml细胞悬液在摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养2h，转染时，依次加入PTSE-JY052-antiCD20L(终浓度0.3ug/ml)、PTSE-JY052-antiCD20H(终浓度0.3ug/ml)、PTSE-JY052-antiCD3(终浓度0.3ug/ml)、聚乙烯亚胺PEI(终浓度2ug/ml)，混匀，一起共转染到HEK293ES悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃，5％CO2摇床中培养，表达抗CD20×CD3的双特异抗体。转染96小时后离心收获上清液体。
2).双特异抗体的纯化
上清液体用0.22uM滤膜过滤，利用亲和层析柱从表达上清中获得带有Fc结构域的抗体。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mM Tris-Hcl 0.15M Nacl PH7.0和0.1M柠檬酸-柠檬酸钠PH3.0。通过阳离子交换柱HiTrap-SPFF获得目标双特异抗体，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩。纯化后的双特异分子还原SDS-PAGE图如图5所示，左边为双特异抗体，从上至下依次为抗CD3的Fab-Fc,抗CD20抗体的重链、抗CD20的轻链，右侧是蛋白质分子量Marker；结果显示所纯化的双特异抗体含有CD3的Fab-Fc、抗CD20抗体的重链和抗CD20的亲链，且每条带的分子量大小与理论一致。
实施例3、双特异抗体分子与过表达CD20或CD3细胞结合情况
采用过表达CD20的淋巴瘤细胞系(Raji)来检测双特异抗体与细胞表面CD20的结合情况，将专利CN 104640881A的和专利CN1331888C中的CD20/CD3双特异抗体与JY052进行比较，采用步骤如下：离心收集Raji细胞，同时稀释各种抗体，最高浓度为1uM，3倍梯度稀释；将收集的细胞用PBS+1％BSA洗三遍，再加PBS+1％BSA重悬细胞,然后铺细胞于96孔板中，每孔1×105个细胞，加入100ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞三遍，再用稀释好的Alexa488标记的抗人IgG-Fc抗体重悬细胞，室温避光孵育1小时，PBS洗三遍，再用100ul PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。试验结果如图6所示,以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，JY052与Raji细胞有着良好的结合能力，均优于专利CN104640881A(BS3/20-001)和专利CN1331888C抗体(CD20/CD3-CL)，而同型对照(hIgG)则没有结合。
采用过表达CD3的T细胞系(Jurkat)来检测双特异抗体与细胞表面CD3的结合情况，采用专利CN 104640881A的CD20/CD3双特异抗体BS3/20-001和专利CN1331888C中的anti-CD20/CD3BiTE做对照，实验步骤如前所述，试验结果如图7所示,以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，JY052与Jurkat的细胞表面CD3分子结合良好，均优于专利CN104640881A(BS3/20-001)和专利CN1331888C抗体(anti-CD20/CD3-BITE)，而同型对照(hIgG)则没有结合。
实施例4、双特异抗体分子介导的PBMC对效应细胞的杀伤作用
a).Raji靶细胞PKH26标记
取2×106个于1.5ml离心管中1500rpm离心5min，弃完全培养基，用无血清的培养基分别清洗细胞两次；用PKH26试剂盒中的Diluent C溶液重悬细胞，然后加入等体积的2×P KH26染料液(配制比例：0.4μl染料原液溶于100μl Diluent C)，混匀后室温放置1min。反应结束后，立即加入与管中溶液等体积的0.5％BSA-PBS溶液终止反应，再加入1ml相应的完全培养基稀释重悬细胞，1500rpm离心5min收集细胞沉淀。用完全培养基重悬后与细胞培养瓶中培养待用。
b).PBMC分离
在50ml管中加入20ml单个核细胞分离液；用全血稀释液将采集到的血液按1:1比例进行稀释处理，混匀后沿康宁管内壁匀速缓慢的铺至分离液上层，每管内加入稀释后全血体积为20ml；待各管加液完毕后放入提前预冷至22℃的离心机内，600g水平离心15min(加减速设置为1)；离心完成后取出离心管，用移液器小心吸取置于分离液和血清间呈圆弧状分布的细胞层—单个核细胞(PBMC)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在细胞液中加入细胞洗涤液，充分混匀后离心，弃上清，再重复洗涤一次，收集细胞沉淀，用RPMI-1640培养基重悬，培养于细胞瓶中待用。
c).CD3+T细胞磁珠分选
PBS(Ph7.2,含0.5％BSA，2mM EDTA),过滤除菌，同时避免产生气泡。
离心去血小板(20度，200g，10-15min)，然后0μm滤膜去除细胞团块。收集PBMC细胞：200g离心10min，弃上清。2x107细胞重悬于60μl buffer+20μl FcR Blocking Reagent中。加入20μl磁珠，混匀，2-8℃孵育15min；加入1-2ml buffer，300g，离心10min，弃尽上清；500μl重悬。将分选柱置于分选架上，500μl润洗；加入细胞悬液，收集未结合细胞；柱体顶端液体流尽后，500μl洗三次；将分选柱从分选架上取下，置于收集管中，1ml快速冲洗，收集细胞，计数并观察活细胞比例。
d).效应功能检测
按终浓度1uM起，将不同的双特异抗体按1:3倍比稀释，11梯度，2复孔；同时设立2个无药物对照孔，用培养基补足体积,将标记后Raji细胞(2×104个/孔/50μl)与CD3+T细胞(2×105个/孔/50μl)，按照所需用量混匀后分至V-bottom 96孔板各孔，同时设立以下三个流式对照孔：①无标记的Raji细胞(2×104个/孔)②PKH26标记后的细胞(2×104个/孔)；③CD3+T细胞(2×105个/孔)。培养18小时，孵育结束后按照1:50000的比例加入TO-PRO3染料，37℃避光孵育10min；同时设立一个流式对照④TO-PRO3标记后的细胞。3000rpm离心5min后弃部分培养基上清，用0.5％BSA-PBS溶液重悬，流式检测。
【计算公式】
细胞死亡率％＝(1-PKH26+TOPRO3-细胞数目(药物作用组)/PKH26+TOPRO3-细胞数目(无药物作用组))×100％
结果如图8所示，JY052对靶细胞的杀伤能力优于奥滨尤妥珠单克隆抗体(GA101)，同时也优于专利CN 104640881A的BS3/20-001和专利CN1331888C中的CD20/CD3双特异抗体anti-CD20/CD3BiTE(CD20/CD3-CL)。
经上述实施例证明，本发明的双特异性抗体在保持原有CD20抗体体内生物学活性的同时通过特异性识别CD3抗原，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的双特异性抗体为Fab-Fc形式，相较于ScFv，CH1和CL能够帮助VH和VL形成稳定的结构，因此，Fab比ScFv形式在结构上更加稳定。本发明的单价单元与单链单元之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接，该结构相对与常用的KiH结构不同，形成的异源二聚体更加稳定，并且更难形成同源二聚体。本发明的双特异性抗体可用于非正常表达的B淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗，所述肿瘤相关疾病为CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种针对CD20和CD3的双特异性抗体
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
245 250 255
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
260 265 270
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
275 280 285
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
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Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
305 310 315 320
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
340 345 350
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
355 360 365
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
370 375 380
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
385 390 395 400
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
405 410 415
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
420 425 430
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
435 440 445
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
450 455 460
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
465 470 475 480
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
485 490 495
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
500 505 510
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
515 520 525
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
530 535 540
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
545 550 555 560
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
565 570 575
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
580 585 590
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
595 600 605
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
610 615 620
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
625 630 635 640
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Arg Leu Thr Val
645 650 655
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Leu Gly
690
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 2
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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180 185 190
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<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
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275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445

Claims (11)

1.一种针对CD20和CD3的双特异性抗体，其特征在于，包括：(1)单价单元，为轻链—重链对，该轻链—重链对针对肿瘤细胞表面的抗原CD20具有特异性结合能力，所述单价单元的序列包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；(2)单链单元和连接子linker，所述单链单元能够特异性结合免疫细胞表面的CD3抗原；所述linker连接该单链单元的重链N端和轻链C端，形成Fab-Fc形式，单链单元和连接子linker的序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述(1)单价单元是由轻链和重链组成，所述重链和轻链之间通过二硫键连接。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述(1)单价单元与所述(2)单链单元和连接子linker之间通过铰链区的二硫键和CH3结构域的杵臼结构连接。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的Fc区为IgG4类型。
6.一种编码如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体的多苷酸或组合。
7.一种编码如权利要求6所述的多核苷酸或组合的表达载体。
8.一种转染如权利要求7所述的表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
9.一种如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体在非正常表达的B淋巴细胞相关治疗疾病中的药物用途。
10.一种如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体在肿瘤疾病治疗中的药物用途；所述肿瘤疾病为CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤。
11.一种如权利要求10所述的双特异性抗体的药物用途，所述CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
CN109836502A (zh) * 2018-11-12 2019-06-04 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
CN110551221A (zh) * 2019-07-02 2019-12-10 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
CN110623921A (zh) * 2019-08-15 2019-12-31 北京东方百泰生物科技有限公司 一种抗cd3和抗cd19的双特异性抗体注射制剂
CN111394387A (zh) * 2020-03-13 2020-07-10 苏州智享众创孵化管理有限公司 一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法
CN111484555A (zh) * 2019-01-28 2020-08-04 正大天晴药业集团股份有限公司 新型双特异性cd3/cd20多肽复合物
CN112062855A (zh) * 2020-08-26 2020-12-11 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种含有衔接器的药物治疗剂的开发和应用
WO2021031784A1 (zh) * 2019-08-19 2021-02-25 杨洋 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用
CN114685664A (zh) * 2022-04-12 2022-07-01 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
CN114716559A (zh) * 2022-04-12 2022-07-08 广州明征生物科技有限公司 双特异性抗体及其治疗癌症的应用
WO2023138551A1 (zh) * 2022-01-20 2023-07-27 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cd20双特异性抗体及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104558191A (zh) * 2015-01-21 2015-04-29 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd20×cd3的构建及应用
CN104936985A (zh) * 2013-02-26 2015-09-23 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104936985A (zh) * 2013-02-26 2015-09-23 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
CN104558191A (zh) * 2015-01-21 2015-04-29 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd20×cd3的构建及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIEDERFELLNER G: "3PP3", 《RSCB PDB数据库》 *
ULRICH BRINKMANN: "The making of bispecific antibodies", 《MABS》 *
VON KREUDENSTEIN TS: "Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design", 《MABS》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
CN109836502B (zh) * 2018-11-12 2021-09-07 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
CN109836502A (zh) * 2018-11-12 2019-06-04 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
CN111484555A (zh) * 2019-01-28 2020-08-04 正大天晴药业集团股份有限公司 新型双特异性cd3/cd20多肽复合物
CN110551221A (zh) * 2019-07-02 2019-12-10 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
CN110623921A (zh) * 2019-08-15 2019-12-31 北京东方百泰生物科技有限公司 一种抗cd3和抗cd19的双特异性抗体注射制剂
WO2021031784A1 (zh) * 2019-08-19 2021-02-25 杨洋 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用
CN111394387A (zh) * 2020-03-13 2020-07-10 苏州智享众创孵化管理有限公司 一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法
CN112062855A (zh) * 2020-08-26 2020-12-11 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种含有衔接器的药物治疗剂的开发和应用
WO2023138551A1 (zh) * 2022-01-20 2023-07-27 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cd20双特异性抗体及其用途
CN114685664A (zh) * 2022-04-12 2022-07-01 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
CN114716559A (zh) * 2022-04-12 2022-07-08 广州明征生物科技有限公司 双特异性抗体及其治疗癌症的应用
CN114685664B (zh) * 2022-04-12 2023-10-20 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用

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