CN104829727B - 一种双特异性抗体cd19×cd3的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单价单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单链单元针对肿瘤细胞表面抗原CD19具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途。

Description

一种双特异性抗体CD19×CD3的构建及应用

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。 BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介 导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同 时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞 的特异性杀伤。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发 展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9k Da、23.1k Da、20.5kDa、18.7k Da，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一 起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8 条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导， 稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪 氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结 合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.CD19

CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物。在正常淋巴组织中，CD19表达于生发中心的B细胞 和滤泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞，与CD20和CD22染色 模式基本相同，但同CD20相比，CD19在前B细胞中也表达。此外，通过流式细胞学 检测方法，CD19在人体组织分离得到的浆细胞中可以检测到。通常来说CD19在B淋 巴细胞瘤中表达，其中包括B淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、 滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、边缘区淋巴。

3.双特异性抗体技术发展

双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大 分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体 在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其 中肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗 产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对 病变细胞特异靶点刺激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能， 特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善 抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫 治疗中具有广阔的应用前景。

4.双特异性抗体制备

双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交—杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的 方式连接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体概 念。杂交—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗 体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和 从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受 到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异 性抗体的多种构建模式，并主要分为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多 价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试 验阶段，并显示有较好的应用前景。

5.肿瘤的过继免疫治疗

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体 内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、 激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤 细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放 疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残 存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗 中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛 配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是， 双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内， 而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就 能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进 而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手 术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。

发明内容

术语和缩略语

BiAb:双特异性抗体(bispecific antibody)

TA:肿瘤抗原(tumor antigen)

VH:重链可变区(heavy chain variable region)。

VL:轻链可变区(light chain variable region)。

CL：轻链恒定区(constant region of light chain)。

CDR：是英文Complementarity determining regions(CDRs)的缩写，是指抗体 的抗原互补决定区。

ScFv：单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment)，又称为单链抗体。

CLD:细胞系开发(cell line development)

FACS：荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式细胞分选术。

本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和凋亡能力来杀 伤肿瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤 细胞的功效。

具体地，本发明提供了以下的技术方案：

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK 细胞；优选地，该轻链-重链对对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；和(b) 单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和 CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优 选地该肿瘤细胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和CD133，更优选地该肿瘤细胞表面抗 原是CD19。

在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的CH2结构域位于ScFv片段和CH3结构域之间。

在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD19。

在一种实施方式中，在单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。

在一种实施方式中，单链单元包括针对CD19的抗体抗-CD19，单价单元包括针对CD3的抗体抗-CD3；优选地，所述抗-CD3重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸 序列，抗-CD3的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD19 ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD3重链在222位点上 的半胱氨酸与抗-CD3的轻链213位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3 重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD19 ScFv-Fc的265和268位点上的半胱氨酸分 别以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在394和411位点上与抗--CD19 ScFv-Fc的 438和407位点上形成盐桥连接，所述的抗-CD3重链在368位点上与抗-CD19 ScFv-Fc的 443位点上形成隆突-入-穴连接。

在一种实施方式中，单价单元中的重链包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片 段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。

在一种实施方式中，所述单价单元的人IgG Fc段和所述单链单元的IgG Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构连接。

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二 表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓 缩置换缓冲液PBS。

在一种实施方式中，第一表达载体是pCHO1.0；第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素。

在一种实施方式中，所述单价单元为抗-CD3抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V) F、MK-Leader(EcoRV)F、L2K-VL(MK)F1和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak 序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II) F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak 序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-CD3轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-CD3的pCHO1.0表达载体， 质粒命名为pCHO1.0-抗-CD3-HL-LDY；

所述单链单元为抗-CD19 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-Leader (AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F和h hIgG1(sbfI)R，通过PCR扩增抗CD19 ScFv-Fc结构 域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD19 ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-抗CD19-ScFv-Fc-KKW。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗 体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗CD19特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病， 或者用于杀死表达CD19细胞。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗 体在制备药物中的用途，所述药物用于在人肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达CD19特异抗原 的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达CD19特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药 物的药效。本发明还提供了以下的技术方案：

本发明提供了一种新方法制备双特异性抗体SMBODY(ScFv and monomerbispecific antibody，如图2所示)，该双特异性抗体包括两组重轻链组合，其中一 组特异结合一种抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身 形成二聚体；而另一组特异结合另一种抗原，同样在其重链Fc区进行另外一些改造， 也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。并且其中一组 的抗体结构为单聚体Ab，另一组为ScFv-Fc，这样就避免了各自轻链与对方重链错配 的可能性，从而形成125KD的双特异性抗体蛋白分子。Fc改造后，单聚体Ab的重链 和单链自然异二聚化，同时CL和CH1间自然二聚化，最后形成SMBODY，SMBODY各结 构域排列顺序及结构示意图见图2。

本发明中利用以上制备双特异性抗体的方法，制备双特异性抗体。其中是以CD19和人源CD3为靶点的双特异性抗体，被命名为M902，如图2，抗-CD3这边为IgG形式， 包括抗-CD3重链与轻链，抗-CD19这边为ScFv-Fc形式，包括抗-CD19 VH、VL、Fc 结构域。以上双特异性抗体通过抗体基因工程方法进行构建，双特异性抗体SMBODY 的单聚体Ab重链和单聚体Ab轻链二元表达载体，以及ScFv-Fc表达载体。根据LC， HC，ScFv，Fc基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中LC，HC，ScFv和Fc 分别进行PCR扩增，通过PCR或重叠延伸PCR法获得基因片段，然后通过同源重组法 进行克隆。酶切pCHO1.0或pCHO1.0-潮霉素载体，然后纯化回收PCR产物和酶切后的 载体，分二步分别将LC片段，HC片段同源重组克隆到pCHO1.0载体上，ScFv-Fc片段 同源重组克隆到pCHO1.0-潮霉素载体上，并测序。重组蛋白质SMBODY在哺乳动物细胞 中的表达、检测，使用转染试剂将分别表达单价单元重链、单价单元轻链和单链单元 的质粒共转染至哺乳动物细胞中，再收集上清进行SDS－PAGE和蛋白质印迹检测SMBODY的表达情况。将转染表达后的培养液上清离心，过滤，用结合缓冲液稀释，过 亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS－PAGE检测纯化蛋白质。

本发明的技术方案的有益的技术效果有：

1.本申请提供了一种异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肽单元。该异二聚体与其对应的同二聚体分子量大小不同，可利用分子量的大小来区别异二聚 体和同二聚体，从而较方便的确定双特异性抗体的纯度。这两个抗原结合多肽单元之 一包含类似于野生型抗体的轻链-重链对，在整个本申请中，该单元也称为“单价单 元”。另一抗原结合多肽单元包含单链可变片段(ScFv)。这样的ScFv可融合至抗体的 恒定片段(Fc)。在本申请全文中此融合肽也被称为“单链单元”。

2.本发明公开了一种新型双特异性抗体SMBODY(ScFv and monomer bispecificantibody)介导的免疫细胞杀伤体外药效的建立及其应用。本发明包括双特异性抗体 药物研究过程中所介导的免疫细胞杀伤、双特异性抗体的制备，以及双特异性抗体体 外药效模型的建立和检测。双特异性抗体SMBODY包括一组单价单元(重轻链组合)， 另一组则为单链单元(ScFv连接Fc组合)，其中单链单元特异结合一种人的肿瘤细胞 抗原，包括CD19等一系列肿瘤细胞膜表面抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造， 使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组单价单元特异结合另一种人的T细 胞抗原CD3，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两 组单元之间很容易形成异二聚体。与此同时，双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细 胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用 前景。

令人惊奇的是，本申请证明这种非对称的抗体是稳定的并具有高的抗原结合效率。 这是令人感到意外的，因为已经证实在生理条件下即使是单链抗体的同二聚体都是不稳定的。例如，Ahmad等的ScFv Antibody:Principles and Clinical Application,”Clinical and Developmental Immunology,2012:980250(2012),显示基于ScFv的 IgG类抗体不稳定，并且需要进一步改造以减少聚集并提高稳定性。

另外，因为具有非对称性，异二聚体具有与由其中任一抗原结合多肽单元组成的同二聚体所不同的等电点。基于异二聚体和同二聚体之间的等电点差异，可以容易地 将需要的异二聚体与同二聚体分离，大大减少了双特异性抗体普遍存在的下游工艺开 发存在的困难。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其它的附图，其中：

图1.CD3分子结构示意图。

图2.CD19 X CD3 SMBODY双特异性抗体分子示意图。

图3.电泳检测PCR产物结果图；(A)M：DL1000核酸分子标记；1.抗CD3抗体轻链；(B)M：DL2000核酸分子标记；1.抗CD3抗体重链；2.抗CD19抗体ScFv-Fc。

图4.纯化的双抗体电泳及纯度检测结果图；(A)SDS-PAGE电泳，M：蛋白分子量标记； 1：非还原性CD19×CD3 SMBODY双抗体；2：还原性CD19×CD3 SMBODY双抗体；(B) CD19×CD3的HPLC-SEC纯度峰形图。

图5.基于流式细胞分析方法测定抗体与Raji细胞的亲和力结果图，(■)CD19×CD3 SMBODY(M902)；(●)Anti-CD19单克隆抗体。

图6.基于流式细胞分析方法测定抗体与Jurkat细胞的亲和力结果图，(■)CD19×CD3 SMBODY(M902)；(●)Anti-CD3单克隆抗体L2K。

图7.流式检测CD19×CD3双抗体同时结合Raji和Jurkat细胞情况图；(●)为CD19× CD3 SMBODY(M902)双抗体；(■)对照抗体MT103。

图8.抗体经过热处理后活性检测图，A.与CD19结合活性检测，(●)CD19×CD3(M902) 双抗体；(■)Anti-CD19单克隆抗体；B.与CD3结合活性检测，(●)CD19×CD3(M902)双 抗体；(■)Anti-CD3单克隆抗体L2K。

图9.CIK表型检测图，右上角的CD3，CD56双阳性的NK类细胞。

图10.流式检测不同浓度抗体存在条件下，效应细胞CIK对靶细胞Raji的杀伤作用结果图；■M902：CD19×CD3双抗体，▼AC19：Anti-CD19单抗，▲Mco101：对照4420 ×CD3双抗体，●hIgG：人IgG。

图11.流式检测不同浓度抗体存在条件下，效应细胞PBMC对靶细胞Raji的杀伤作用结果图；■M902：CD19×CD3双抗体，▼Anti-CD19：抗CD19单抗，▲Mco101：对照 4420 XCD3双抗体，●hIgG：人IgG。

具体实施方式

实施例1：双特异性抗体的表达载体构建(CD19×CD3，M902)

1.双特异性抗体序列设计

以CD19和CD3为靶点的双特异性抗体被命名为CD19×CD3，如图2，抗CD19这边为ScFv-Fc形式，包括抗-CD19 VH、VL、Fc结构域；抗CD3这边为IgG形式，包括抗CD3重 链与轻链，含有Fab和Fc结构域。其中ScFv-Fc一边Fc进行KKW改造，IgG形式一边Fc 进行LDY改造，具体Fc改造过程参见PCT/CN2012/084982，使其各自不易形成同源二聚体， 而易于形成杂合二聚体，即CD19×CD3双特异性抗体。同时，为了双抗体能在CHO细胞 中表达，并能分泌到培养基中，选择了鼠kappa链的前导肽序列作为分泌信号肽。各个 结构域及信号肽的氨基酸序列和核酸序列见如下SEQ ID NO:1-8。

抗-CD3重链氨基酸序列(序列号1)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTA YMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗-CD3重链核酸序列(序列号2)

gatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggct acacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcc tagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcc tacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgcc ttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcacc ctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtg tcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctca gcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacac caaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcg tggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctg ccgggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctcgccagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagg ggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

抗-CD3轻链氨基酸序列(序列号3)

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEA EDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗-CD3轻链核酸序列(序列号4)

gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagagccagtt caagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagt ggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagcatggaggct gaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctga aacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgt gtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagact acgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacagggg agagtgttag

抗CD19 ScFv-Fc氨基酸序列(序列号5)

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESS STAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAV SLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAAT YHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CD19 ScFv-Fc核酸序列(序列号6)

caggtgcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggct atgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttggcc tggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtaaagccactctgactgcagacgaatcctccagcacagcc tacatgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggcc gttattactatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctccagcggaggcggcggttcaggcggagg tggaagtggtggaggaggttctgatatccagctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggcc accatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtgatagttatttgaactggtaccaacagattccaggac agccacccaaactcctcatctatgatgcatccaatctagtttctgggatcccacccaggtttagtggcagtgggtctgg gacagact

tcaccctcaacatccatcctgtggagaaggtggatgctgcaacctatcactgtcagcaaagtactgaggatccgtggac

鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列(序列号7)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

鼠kappa链的前导肽序列核酸序列(序列号8)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt

2.双特异性抗体基因克隆

选择pCHO1.0作为表达载体去克隆和表达抗CD3的重链和轻链基因，pCHO1.0-潮霉素表 达载体是通过用潮霉素抗性基因替换pCHO1.0载体中的嘌呤霉素基因改造而来，被选择用来 克隆和表达抗CD19的ScFv-Fc融合基因。表1中的引物根据克隆方案设计好后，发送到苏州金 唯智生物科技有限公司进行合成。以表1中的引物进行PCR扩增，模板为早期实验中基因合成 或亚克隆到pCDNA3.1或pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982专利有详细描述，然后分别 将抗-CD3重、轻链分别构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗CD19ScFv-Fc构建到pCHO1.0- 潮霉素的表达载体上。

表1.双特异性抗体基因克隆中使用的引物

初始PCR扩增模板DNA：35ng的模板DNA，如，目标抗体的轻链和重链；lμl的 10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10x PCR Buffer缓冲液；1μl的10mM dNTP；1μl 的2.5单位/μlPyrobest DNA聚合酶(Takara，R005A)；和蒸馏水到25μl总体积在 microfuge管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用 GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：95℃，5分钟； 以下的25个循环：95℃，每次30秒；56℃，30秒；和72℃，1分钟。

通过几轮重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入 轻链(图3)；以及相应的引物将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZ17I引入 重链(图3)。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCH01.0表达载体 进行同源重组，获得装入抗-CD3轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZ17I酶切后再和HC 进行同源重组，获得抗-CD3的pCH01.0表达载体，质粒命名为pCH01.0-抗-CD3-HL-LDY。

通过重叠PCR扩增抗-CD19ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位 点AvrII与BstZ17I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段(图3)与酶切过的pCHO1.0-潮霉 素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD19ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCH01.0-潮 霉素-抗CD19-ScFv-Fc-KKW。

实施例2：双特异性抗体表达与纯化

1.双特异性抗体的表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的 说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD CHO培养基(Gibco，10743-029) 中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)， 使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-抗-CD3-HL-LDY与pCHO1.0-潮霉素-抗 CD19-ScFv-Fc-KKW一起共转染到CHO-S细胞中，设计共转染这两种质粒以表达对CD19×CD3的双特异性抗体。

分别在转染后第2天，培养温度下调到32℃，并每天补加3.5％FeedA，培养14天后，800*g离心收获表达上清。

2.双特异性抗体的纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，18-1153-45, 17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mMNaH2PO4+ 40.5mM Na2HPO4，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM 精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离， 阳离子交换柱购自GE公司(18-1153-44,17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mMNaH2PO4+ 6.2mM Na2HPO4，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP 柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH2PO4+6.2mM Na2HPO4+1M NaCl，pH 6.0)20 个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换Buffer PBS。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC 检测，纯度在95％以上，见图4。

实施例3：双特异性抗体与细胞的结合活性测定(FACS)

本发明的双特异性抗体与相应细胞上的靶抗原结合。本发明以Raji(购自 ATCC，CCL-86)作为CD19阳性的细胞，Jurkat(Jurkat，TIB-152)作为CD3 阳性的细胞，并以本发明制备的双抗体测定其细胞结合活性。

1.利用流式分析法检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性

培养足够的Raji细胞，离心收集细胞。同时稀释双特异性抗体，浓度从1000nmol开始， 3倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+1％FBS洗两遍，再加 PBS+1％FBS重悬细胞至4×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)， 加入50ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再 用稀释好的PE标记的抗人IgG FC抗体(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30 分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行分析计算双抗体与Raji的结合亲和力KD值。结果显示CD19×CD3SMBODY 双抗体与CD19阳性的Raji细胞具有良好的结合活性，见图5,其KD值为8.857nM。

2.流式分析法检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性

培养足够的Jurkat悬浮细胞，离心收集细胞。接下来的实验过程与上述实施例相同， 将100ul PBS重悬的细胞，上机检测，以平均荧光强度，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计算双抗体与Jurkat细胞的结合亲和力KD值。结果显示CD19×CD3SMBODY双 抗体与CD3阳性的Jurkat细胞具有良好的结合活性，见图6,其KD值为8.3nM。

3.双抗体介导的共结合活性检测

将培养好的Raji和Jurkat细胞，离心收集并用PBS洗2遍，分别用CFSE和PKH-26染色。同 时稀释双特异性抗体，浓度从10ug/ml开始，10倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将 染色好的Raji和Jurkat细胞离心去上清，用PBS+1％FBS洗两遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至 4×10⁶个细胞/ml，按1:1混合均匀，将细胞铺板于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)，加 入50ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，最后用100ul PBS重悬，上机检测，分析双阳性细胞的比率，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计 算。结果显示CD19×CD3 SMBODY双抗体能同时结合CD19阳性的Raji细胞和CD3阳性的Jurkat 细胞，并能促进2种细胞共结合，见图7,结果显示依赖抗体浓度而变化，最高比率达到15％以上。

实施例4：双特异性抗体的热稳定性测定

1.双特异性抗体的热挑战性实验

单链抗体片段(ScFv)通过一个连接肽(Gly4Ser)3把重链可变区和轻链可变区连接 起来而形成的。但是有报道ScFv内在的不稳定性可能会影响抗体药物的质量(Michaelson JS1,etc.,Anti-tumor activity of stability-engineered IgG-likebispecific antibodies targeting TRAIL-R2 and LTbetaR.MAbs.2009 Mar-Apr；1(2):128-41)。 因此，我们将抗体稀释到0.4mg/ml,分别4℃，37℃，42℃，47℃，52℃，57℃，62℃，67℃，72℃，77℃，82℃，PCR仪处理1h，每管15ul。离心取上清，按照以下步骤进行流 式检测，收集单细胞悬液加入96孔板，3×105/孔，加入各种处理抗体，并加入荧光二抗， 流式上机检测，结果见图8，结果显示CD19×CD3 SMBODY双抗体与Raji细胞上CD19结合的 T₅₀值为60.41；与Jurkat细胞上CD3结合的T₅₀值为58.81，都显示了良好的热稳定性。

实施例5：双抗体介导的体外细胞杀伤检测

1.PBMC细胞的分离及CIK细胞培养

取新鲜抗凝血，400g离心5min，弃上清。加入10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻 轻吹打混匀，室温或冰上裂解4-5分钟。在裂解过程中宜适当摇动以促进红细胞裂解。4 ℃400g离心5min，弃红色上清。若红细胞裂解不完全，重复步骤2和3一次。洗涤1-2 次。加入5倍细胞沉淀体积的PBS，重悬沉淀，4℃400g离心2-3分钟，弃上清。可再重 复1次，共洗涤1-2次。根据实验需要用适当4℃PBS重悬细胞沉淀后即可进行计数等后 续实验。

CIK细胞的培养，用CIK细胞启动培养液(无血清X-Vivo细胞培养液+750IU/mlIFN- γ±2％自体血浆)将每份细胞补满30ml，加到75cm2培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱培养。培养24小时后，加入CIK细胞刺激因子混合液1ml(无血清X-Vivo 细胞培养液+75ng/ml抗-人CD3ε、750IU/ml IL-2、0.6ng/ml IL-1α)，继续置于饱 和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱内培养。接下来的步骤根据CIK细胞的生长情况决定补 液(无血清X-Vivo培养液+750IU/ml IL-2±2％自体血浆)、分瓶的事情，基本上要维持 细胞在2*10^6的浓度左右生长。最后用流式细胞仪FC500对收集的CIK细胞进行表型检 测，包括：CD3，CD56，CD4，CD8，检测这些细胞表面抗原在CIK细胞的表达情况。检测 结果见图9，表型结果显示CIK细胞具有15.9％的CD3和CD56双阳性，培养的细胞具有 很好的NK T细胞的比率。。

2.双抗体有效介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞检测

收集Raji单细胞悬液，用终浓度为5uM的CFSE染色(染色步骤见protocol-1 CFSE染色)，染色后用该细胞培养的10％FBS-1640将细胞重悬至2×10^5/ml，按照2×10^4/ 孔，即100ul/孔加入96孔板培养过夜。按实验设计的效靶比加入培养的CIK细胞，50ul/ 孔，设置对照孔，无需加入CIK细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入CIK细胞的 同时按实验设计加入相应抗体，50ul/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。 24h后取出96孔板，各孔于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为1ug/ml)流式上机 检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞Raji的死亡率。检测结果见 图10，细胞杀伤结果显示CD19×CD3 SMBODY双特异性抗体介导CIK细胞杀伤肿瘤细胞显 示良好的杀伤效果，其最大杀伤效率和EC50都明显强于Anti-CD19单抗。

3.双抗体有效介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞检测

制备Raji单细胞悬液。用终浓度为5uM的CFSE染色(染色步骤见protocol-1 CFSE染色)，染色后用该细胞培养的10％FBS-1640将细胞重悬至2×10^5/ml，按照2×10^4/ 孔，即100ul/孔加入96孔板培养过夜。按实验设计效靶比加入PBMC细胞，50ul/孔，设 置对照孔，无需加入PBMC细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入PBMC细胞的同时 按实验设计加入相应抗体，50ul/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。48h 后取出96孔板，各孔于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为1ug/ml)流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞Raji的死亡率。检测结果见图11， 细胞杀伤结果显示CD19×CD3 SMBODY双特异性抗体介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞显示良 好的杀伤效果，其最大杀伤效率和EC50都强于Anti-CD19单抗。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变 化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制 本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述本发 明具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。

Claims (5)

1.双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对肿瘤细胞表面抗原CD19具有特异性结合能力；

其中，单链单元包括针对CD19的抗体抗-CD19，单价单元包括针对CD3的抗体抗-CD3；并且

所述抗-CD3重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-CD3的轻链氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD19ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD3重链在222位点上的半胱氨酸与抗-CD3的轻链213位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD19ScFv-Fc的265和268位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在394和411位点上与抗--CD19ScFv-Fc的438和407位点上形成盐桥连接，所述的抗-CD3重链在368位点上与抗-CD19ScFv-Fc的443位点上形成隆突-入-穴连接。

2.制备权利要求1所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上，所述第一表达载体是pCHO1.0；所述第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；所述细胞是CHO-S细胞；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)中：

所述单价单元为抗-CD3抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoRV)F、MK-Leader(EcoRV)F、L2K-VL(MK)F1和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-CD3轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-CD3的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-CD3-HL-LDY；所述引物Kozak(EcoR V)F、MK-Leader(EcoRV)F、L2K-VL(MK)F1、hIgK(PacI)R、Kozak(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1、hIgG1(sbfI)R核苷酸序列分别为SEQIDNO:9、10、11、12、13、14、15、16；

所述单链单元为抗-CD19ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-Leader(AvrII)F、AC19-VH F1和hIgG1(sbfI)R，通过PCR扩增抗CD19ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD19ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-抗CD19-ScFv-Fc-KKW；所述引物Kozak(Avr II)F、MK-Leader(AvrII)F、AC19-VH F1、hIgG1(sbfI)R核苷酸序列分别为SEQIDNO:17、18、19、20。

4.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗CD19特异抗原表达所引起的肿瘤疾病，或者用于杀死表达CD19细胞。

5.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达CD19特异抗原的肿瘤疾病的药物或者评价用于治疗表达CD19特异抗原的肿瘤疾病的药物的药效。