CN108124445A - Ctla4抗体、其药物组合物及其用途 - Google Patents

Ctla4抗体、其药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了分离的CTLA4的单克隆抗体，所述抗体能够高特异性与CTLA4结合，并且有效地阻断CLTA4与B7的结合，降低CTLA4活性或表达水平，解除CTLA4对机体免疫功能的抑制，激活T淋巴细胞，有效的治疗肿瘤和免疫系统疾病。还提供了一种单克隆抗体偶联物，包括所述抗体的药物组合物和诊断组合物，及其在制备预防和/治疗和/或联合治疗肿瘤和免疫系统疾病的药物中的应用。

Description

CTLA4抗体、其药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗和分子免疫学领域，涉及CTLA4抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及多种CTLA4的单克隆抗体。
背景技术
脊椎动物免疫系统需要多层次的分子和细胞相互作用以实现最佳的免疫应答。具体地，T淋巴细胞(T细胞)的激活是机体免疫应答系统的重要组成部分。抗原呈递细胞(APC)可以通过将抗原经由主要组织相容性复合物(MHC)分子携带的肽呈递至T细胞受体(TCR)来激活T细胞。这种激活还需要APC的共刺激，将非特异性的共刺激信号递送至T细胞需要至少两个在APC上发现的同源B7家族成员B7-1(也称为B7、B7.1或CD80)和B7-2(也称为B7.2或CD86)，两者都可在与T细胞上CD28受体结合时递送共刺激信号，导致T细胞激活。CD28是免疫球蛋白(Ig)超家族的同源二聚体糖蛋白成员，其具有单个细胞外可变区，并且表达于大多数成熟的人T细胞上。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen-4，亦简称为CTLA4)与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞表面。然而，作为淋巴细胞激活的共刺激信号，CTLA4与CD28分子的功能是相反的，CTLA4的作用主要是抑制T细胞激活，表现为在CTLA4缺陷小鼠中有大规模淋巴组织增生。
研究表明，CTLA4中和抗体或外源性CTLA4蛋白可以阻断CTLA4与其天然配体结合，从而封闭CTLA4对T细胞的负性调节信号并且增强T细胞对各种抗原的反应性，因此，阻断CTLA4可以提供需要增强免疫刺激的相关人类疾病的新治疗方法，例如癌症和传染性疾病，目前CTLA4抗体已经被批准用于恶性黑色素瘤治疗，同时在临床试验阶段用于前列腺癌，膀胱癌，结肠直肠癌，胃肠道癌，肝癌等。
白细胞介素2(IL-2)由T细胞产生调节T细胞亚群的生长因子，也是调控免疫应答的重要因子，并可促进B细胞增殖分化，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。体外实验中，CTLA4抗体可特异地解除CTLA4对机体的免疫抑制，激活T细胞，诱导IL-2产生，在抗肿瘤及感染性疾病的治疗中有广泛应用前景。
目前，尚需要研发新的阻断CTLA4与B7的结合的抗体及其人源化抗体。
发明内容
本专利发明人利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的CTLA4作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了数个杂交瘤细胞株，能够分泌产生与CTLA4特异性结合的特异性单克隆抗体，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断CTLA4与B7-1或B7-2之间的结合(图3、表II)。通过分子克隆等手段进一步得到了嵌合抗体，并进行了一系列表征和功能实验研究。制备得到的嵌合抗体能够结合人T细胞表面的CTLA4(图4)，具有高亲和力(表V)，并且与参照抗体之间具有相同或不同的表位(图5)。体外功能试验结果显示，这些嵌合抗体能够促进T细胞系或原代T细胞的免疫功能(图7、8)；动物实验结果表明，这些嵌合抗体能够有效抑制肿瘤在人源化CTLA4敲入小鼠体内的生长(图9)。最后，对这些抗体进行了人源化以降低免疫原性和获得治疗性抗体。由此提供了下述发明：
本专利提供了特异性结合人CTLA4的抗体，还提供了其中结合人CTLA4可抑制人CTLA4结合人B7的嵌合抗体和人源化抗体。本发明还提供了特异性结合人CTLA4的嵌合抗体，其可阻断人CTLA4结合人B7至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
本发明提供了特异性结合人CTLA4的抗体，该抗体生产自杂交瘤细胞系。本发明提供的杂交瘤细胞系来源于小鼠免疫，细胞融合，通过筛选等一系列操作，可以生产特异性阻断CTLA4和CD80的结合的单克隆抗体。(参见实施例1)
本发明一方面提供了鼠源单克隆抗体，与重组CTLA4抗原结合，EC50在(0.02nM)和(0.06nM)范围内；所提供鼠源单克隆抗体，与细胞表面天然CTLA4抗原结合，EC50在(1nM)和(4nM)范围内。其中，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％of maximaleffect)。(参见实施例2)
本发明另一方面提供了鼠源单克隆抗体，阻断CTLA4与B7-1(CD80)或B7-2(CD86)的结合，IC50分别在(2ng/mL)和(70ng/mL)范围内以及(200ng/mL)和(11000ng/mL)范围内。其中，IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。(参见实施例3)
本发明中，如果没有特别说明，所述B7为B7-1和/或B7-2；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者GenBank中公开的序列。例如，B7-1(CD80,NCBIGene ID:941)；B7-2(CD86,NCBI Gene ID:942)。
本发明一方面提供的鼠源单克隆抗体，与小鼠的物种交叉反应较弱，与食蟹猴有物种交叉反应。(参见实施例4)
本发明还提供了特异性结合人CTLA4的嵌合抗体，其中通过将鼠源CTLA4抗体的可变区连接至人的IgG1和κ恒定区，构建了嵌合抗体的重链和轻链。本发明提供的嵌合抗体与鼠源抗体相比，具有相似的亲和力。(参见实施例5)
本发明一方面提供了分离的抑制CTLA4结合人B7的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区包含如SEQ ID NO：13所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：14所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：15所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：16所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：17所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：18所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：19所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：20所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：21所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：22所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：23所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：24所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：25所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：26所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：27所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：28所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：29所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：30所示的轻链CDR3。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗原结合片段是Fab或F(ab)'2或scFv。
本发明的一些具体实施方案中，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
本发明的一些具体实施方案中，重链可变区包含与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示序列具有至少75％相同性的氨基酸序列。
本发明的一些具体实施方案中，轻链可变区包含与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列具有至少75％相同性的氨基酸序列。
本发明的一些具体实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：7所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示序列。
本发明的一些具体实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：9所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示序列。
本发明的一些具体实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：11所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：12所示序列。
本发明的一些具体实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38所示氨基酸序列。
本发明的一些具体实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40所示氨基酸序列。
本发明的一些具体实施方案中，抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和/或轻链恒定区；其中抗体重链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区，和/或抗体轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区。
本发明的一些具体实施方案中，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，抑制CTLA4结合人B7-1和/或人B7-2。
本发明的再一方面涉及分离的抑制CTLA4结合人B7的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段与上述任一种抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段结合相同的表位，或者与上述任一种抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段竞争性结合人B7。
本发明的再一方面涉及分离的核酸，其编码上述任一种抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；包含该核酸的载体；以及包含该核酸或该载体的宿主细胞。
本发明提供的嵌合抗体能与活化的T细胞结合。(参见实施例6)
本发明提供的嵌合抗体在动力学检测中具有高亲和力，其中平衡结合常数KD为(<1x10-12)和(8.68x10-11)，本发明一方面提供的动力学参数使用生物分子相互作用系统Octet-96(Pall Life Sciences,S-000959)测定。(参见实施例7)
本发明提供的嵌合抗体与已知的阳性对照抗体相比，与抗原CTLA4-hFc的结合表位不完全相同(参见实施例8)。
本发明提供的嵌合抗体具有较强的体外生物学活性。一方面，在细胞活性实验中，使用Jurkat细胞检测，本发明的抗体可以增强细胞因子IL-2的分泌(参见实施例9)；另一方面，在异体混和淋巴细胞反应中，本发明抗体可以增强IFN-γ的分泌(参见实施例10)。
本发明提供的嵌合抗体具有较强的体内药理学活性。在肿瘤动物模型中，本发明的抗体可以有效抑制肿瘤生长并减小肿瘤体积。(参见实施例11)
本发明涉及的抗体在体内和体外具有以下用途：阻断CTLA4与B7的结合、调节(例如下调)CTLA4的活性或CTLA4的水平、解除CTLA4对机体的免疫抑制、激活T淋巴细胞或者提高T淋巴细胞中IL-2的表达。
本发明的再一方面涉及免疫偶联物，包含抗体部分和偶联部分，所述抗体部分是上述任一种抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分是治疗试剂或诊断试剂。优选地，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
本发明提供了药学上的有效抗体，该抗体可以特异性结合人CTLA4。具体的，该药学上有效的人抗体与T细胞和其他免疫细胞表面的CTLA4结合。
在另一方面，本发明提供药物组合物，包含如上所述的任一种抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段、如上所述的核酸、或如上所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。本发明的组合物还可包含抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段与作为单独分子的一种或多种其他生物活性分子的结合物，例如至少一种本发明的嵌合抗体与另一生物活性分子的结合物，或者可在同一分子内结合与一个或多个其他生物活性分子的多个结合物，例如作为双特异性或多特异性分子，为两个或多个本发明的嵌合抗体的结合物或为与一个或多个其他生物活性分子的结合物。
本发明的再一方面涉及本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段、核酸、或免疫偶联物在制备用于特异性结合CTLA4的药物中的应用。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合CTLA的药物用于阻断CTLA4与B7的结合、下调CTLA4的活性或CTLA4的水平、解除CTLA4对机体的免疫抑制、激活T淋巴细胞或者提高T淋巴细胞中IL-2的表达。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合CTLA的药物用于预防和/治疗和/或辅助治疗癌症和传染性疾病。
在一些具体实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤或黑色素瘤。
本发明的再一方面涉及预防和/治疗和/或辅助治疗癌症和免疫系统疾病的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
在一些具体实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤或黑色素瘤。
本文所使用的术语“相同性”是指利用本领域熟知的算法，例如BLAST，使用默认参数计算获得的两条或更多条序列之间相同氨基酸残基的百分比。
本文所使用的术语“药学可接收的载体”是指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。
本文所使用的术语“有效量”指的是足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分。
本发明所提供的药物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径给受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
本文所使用的用词“包含”通常表示包括但不限于，当提及“包含”某一序列时，也应当认为其包括由该序列组成的情形。
本领域的技术人员会理解，除了本文描述的那些之外，本发明的抗体会具有另外的用途或组合物，在其中所述抗体结合人CTLA4抗原的所有情况中，这种用途和组合物被认为在本发明的范围之内。本领域的技术人员会理解，可对本发明的抗体的可变区序列(SEQID NO:7至SEQ ID NO:12)或本发明抗体的CDR(SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:30)或人源化抗体序列(SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:45)作出改变，所述改变不会显著改变本发明抗体的特性，因此应认为这种变体在本发明的范围之内。此外，在所述抗体的可变区或CDR序列内的这种改变应被认为是在本发明的范围之内，只要这种变体的可变区序列与本发明的序列具有显著同源性。
附图说明
图1：ELISA检测鼠源抗CTLA4抗体与hCTLA4-Fc蛋白的结合
图2：FACS检测鼠源抗CTLA4抗体与293T-hCTLA4细胞的结合
图3：ELISA检测鼠源抗CTLA4抗体阻断CD80或CD86与CTLA4的结合
图4：FACS检测CTLA4嵌合抗体与活化T细胞的结合
图5：ELISA检测CTLA4嵌合抗体与其他抗体的表位竞争
图6：ELISA检测CTLA4嵌合抗体剂量依赖性增强Jurkat细胞IL-2的分泌
图7：ELISA检测CTLA4嵌合抗体剂量依赖性增强Jurkat-hCTLA4细胞IL-2的分泌
图8：ELISA检测MLR实验中CTLA4嵌合抗体增强IFN-γ的分泌
图9：CTLA4嵌合抗体抑制肿瘤在人CTLA4敲入小鼠体内的生长
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：动物免疫和抗CTLA4鼠抗体的筛选
选用适宜年龄的Balb/c小鼠，进行免疫注射。用hCTLA4-mFc融合蛋白作为抗原与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合后，通过皮下注射入免疫小鼠体内，刺激相应B淋巴细胞克隆。随后，大约每两至三周腹腔内注射100μg的1:1乳化于不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)中的CTLA4-mFc，从而对已免疫的小鼠进行加强免疫。通过无菌操作取出小鼠脾淋巴细胞，与准备好的SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例(脾细胞1x108，骨髓瘤细胞2x107)混合，并加入聚乙二醇(Sigma，P7181)进行细胞融合。
融合后，将融合细胞加入96孔板中，每孔加入0.1mL HAT培养基，放入二氧化碳培养箱中，37℃培养；第4天，每孔中加入0.1mL HT培养基；第7天时，将培养基完全换成HT培养基。第8-12天时进行筛选，阳性细胞通过有限稀释法进行亚克隆，扩大培养，并通过ELISA和FACS进行测试，具体方法如下:
将2μg/mL的hCTLA4-hFc包被在96孔板上(Corning,catalog#9018)，4℃过夜孵育。用PBST(PBS含0.05％的Tween-20)洗板三次，使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)封闭。用PBST洗板三次后，加入杂交瘤上清，37℃孵育2小时。洗板后，加入1/5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(BioLegend,catalog#405306)，37℃孵育1小时。洗板后，加入TMB(Tiangen catalog#PA107-02)显色。
抗体与293T-hCTLA4细胞的结合采用FACS进行检测。在96孔板(Corning,catalog#3799)中每孔加入1x105 293T-hCTLA4细胞，与杂交瘤上清在4℃孵育30分钟。用缓冲液(PBS含有1％BSA和5mM EDTA)洗涤细胞两次后，加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗，4℃孵育30分钟。细胞经缓冲液洗涤后，在Attune Nxt流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析。
CTLA4抗体能够阻断CTLA4与CD80的结合，因此采用配体阻断实验进一步筛选杂交瘤上清。将2μg/mL羊抗鼠IgG抗体(Sigma,catalog#M4280)包被96孔板(Corning,catalog#9018)，4℃过夜。洗板3次后，使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)在37℃封闭2小时。洗板三次后，加入预先混合的20μg/mL hCD80-Fc和20ng/mL生物素化的hCTLA4-His，室温下孵育1小时。洗板后，加入HRP标记的链霉亲和素(BD,catalog#554066)，室温孵育1小时。洗板后，加入TMB显色。
实施例2：纯化杂交瘤上清抗CTLA4抗体的理化和结合特性
通过三轮以上的有限稀释法得到杂交瘤单克隆细胞。将稳定的杂交瘤单克隆细胞进行8-9天的无血清驯化(Gibco,catalog#12045-076)，并扩大到T-175培养瓶(NUNC,catalog#159910)中。在第8-9天时，收集上清并用0.22μm滤膜过滤。上清通过Protein A柱(GE Healthcare,catalog#17549112)以分离纯化抗体，抗体吸附于柱上。Protein A柱用1mM PBS洗涤，然后用50mM的PBS(pH3.0)将抗体从柱上洗脱。洗脱液用0.5M的氢氧化钠溶液调节pH至中性，并使用0.22μm滤膜过滤。抗体溶液经Ultra-15centrifugal concentrators(Millipore,catalog#ACS500024)浓缩后，用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific，NanoDrop 2000)检测定量抗体浓度。纯化抗体溶液中的内毒素含量使用Gel Clot TAL kit(Xiamen Bioendo Technology,catalog#010250)检测，标准为含量低于1EU/mL。
纯化后的抗体采用ELISA方法检测与CTLA4-hFc的结合。将hCTLA4-hFc包被在96孔板上(Corning,catalog#9018)，4℃过夜孵育。用PBST(PBS含0.05％的Tween-20)洗板三次，使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)在37℃封闭2小时。PBST洗板三次后，加入待测抗体，并在室温孵育1小时。洗板三次后，加入1/5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Invitrogen,catalog#31432)，室温孵育1小时。用PBST洗板后，加入TMB显色。结果如图1所示，结合半数有效浓度见表I。
纯化后抗体进一步采用FACS方法检测其与293T-hCTLA4细胞的结合。293T-hCTLA4细胞用FACS缓冲液(PBS含1％BSA)重悬至4x106细胞/mL，50μL/孔加入96孔圆底板(Corning,catalog#3795)。将待测的纯化抗体按照一定浓度加入孔中(50μL/孔)，4℃孵育1小时。细胞经缓冲液洗涤三次后，加入PE标记的荧光二抗，4℃孵育0.5小时。细胞用FACS缓冲液洗三次，重悬到200μL/孔，使用Attune Nxt流式细胞仪(Thermo Fisher)检测荧光信号。结果如图2所示，结合半数有效浓度见表I。
表I
实施例3：鼠源CTLA4抗体阻断CD80或CD86与CTLA4之间的相互作用
采用ELISA方法检测抗体能否阻断CD80或CD86与CTLA4之间的结合。使用BiotinLabeling Kit-NH2(Dojindo,catalog#LK03)试剂盒对hCTLA4-hFc蛋白进行生物素标记。将纯化抗体包被到96孔板(Corning,catalog#9018)上，4℃过夜。使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)在37℃封闭2小时。洗板三次后，加入预先混合的生物素化的hCTLA4-hFc和hCD80-Fc或hCD86-Fc，室温孵育1小时。用PBST洗板，加入HRP标记的链霉亲和素(BD,catalog#554066)，室温孵育1小时。洗板后，加入TMB显色。结果如图3，结果总结见表II。
表II
实施例4：鼠源CTLA4抗体的物种交叉反应
使用ELISA方法检测纯化抗体的物种交叉反应。将定量纯化抗体包被到96孔板(Corning,catalog#9018)上，4℃过夜。使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)在37℃封闭2小时。将生物素标记的鼠CTLA4-His(SinoBiological,catalog#50503-M08H)或猴CTLA4-Fc(SinoBiological,catalog#90213-C02H)加入板中，室温孵育1小时。用PBST洗板三次，加入1/1000稀释的HRP标记的链霉亲和素(BD,catalog#554066)，室温孵育1小时。洗板后，加入TMB显色。结果如表III中所示。
表III
实施例5：鼠源抗体cDNA的克隆以及嵌合抗体的构建
用简并引物PCR方法，获得杂交瘤抗体重链和轻链的可变区基因序列。杂交瘤单克隆细胞使用Trizol(Invitrogen,catalog#15596-018)裂解后分离得到总RNA，并使用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen,catalog#18080-051)，以RNA作为模板进行反转录，得到cDNA库。以得到的cDNA库作为模板，使用简并引物进行PCR(Zhou H,et al.,Nucleic Acids Research 22:888-889(1994),Chardes T et al.,FEBSLetters452:386-394(1999))。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，重链和轻链可变区的PCR扩增产物预计大小为400碱基对。PCR产物克隆到pClone007载体(Tsingke,catalog#TSV-007BS)，并且转化至大肠杆菌感受态Trans 5α(Transgen,catalog#CD201-02)，并在琼脂板上挑选3-6个大肠杆菌单克隆进行基因测序。在某些情况下，PCR产物也可直接用于基因测序。通过以上方法，最终得到抗体4H9-G5-D5-B1,9B8-H2-B6-G5,19C5-G11-A7-G5的重链和轻链的可变区全长基因序列。经NCBI Ig-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)进一步分析后得到抗体重链和轻链的互补决定区(ComplementarityDetermining Region)和骨架区(Framework)的基因和氨基酸序列(Kabat E.A.,et al.,1991,Sequences of proteins of immunological interest,in:NIH PublicationNo.91-3242,US Department of Health and Human Services,Bethesda,MD)。具体信息见抗体序列表和表IV。
通过将鼠源CTLA4抗体的可变区连接至人的IgG1和κ恒定区，构建了嵌合抗体的重链和轻链。通过PCR方法，在重链和轻链可变区引入合适的酶切位点，分别克隆到相应的嵌合抗体表达载体中。通过脂质体转染法，将嵌合抗体重链和轻链的质粒导入293F细胞，并继续培养6天。细胞培养上清中的抗体用Protein A柱(GE Healthcare,catalog#17549112)进行纯化。Protein A柱用1mM PBS洗涤，然后用50mM的PBS(pH3.0)将抗体从柱上洗脱。洗脱液用0.5M的氢氧化钠溶液调节pH至中性，并使用0.22μm滤膜过滤。抗体溶液经Ultra-15centrifugal concentrators(Millipore,catalog#ACS500024)浓缩后，用Nanodrop分光光度计检测定量抗体浓度。纯化抗体溶液中的内毒素含量使用Gel Clot TAL kit(XiamenBioendo Technology,catalog#010250)检测，标准为含量低于1EU/mL。转染的293F细胞生产的嵌合抗体的结合活性用ELISA和FACS检测(具体步骤见实施例2)，结果表明了嵌合抗体与鼠源抗体相比，保持了原有的CTLA4亲和力。
表IV
实施例6：人鼠CTLA4嵌合抗体与活化的人T细胞的结合
使用FACS检测CTLA4嵌合抗体与活化的人T细胞的结合。人外周血单核细胞(PBMC)使用密度梯度离心法(Ficoll-Paque Premium,GE Healthcare,catalog#17-5442-02)从人外周血中分离。T细胞使用Pan T Isolation Kit(Miltenyi,catalog#130-096-535)进一步从PBMC中分离纯化得到。T细胞重悬至培养基(RPMI-1640培养基(Gibco,catalog#C22400500BT)，10％灭活的FBS(Gibco,catalog#10099-141)，青霉素/链霉素双抗(Gibco,catalog#15140-122))，并根据说明书使用Human T-Activator CD3/CD28(Gibco,catalog#11132D)进行活化。3天后，被活化的T细胞和10μg/mL的嵌合抗体在缓冲液(含1％BSA的PBS)中4℃孵育1小时。将T细胞洗涤三次后，加入PE标记的鼠抗人IgG Fc(BioLegend,catalog#409304)二抗4℃孵育1小时。用缓冲液洗涤三次后，每孔加入200μL缓冲液重悬T细胞，并使用Attune Nxt流式细胞仪(Thermo Fisher)检测荧光信号。结果如图4所示。
实施例7：人鼠CTLA4嵌合抗体动力学检测
使用生物分子相互作用系统Octet-96(Pall Life Sciences,S-000959)，测量抗体与抗原之间结合的动力学常数(kassoc和kdissoc)，并进一步计算平衡结合常数KD。将CTLA4-mFc抗原蛋白偶联至AMC传感器(Pall Life Sciences,PN18-5099)表面，并加入不同浓度抗体，测量CTLA4嵌合抗体与传感器表面CTLA4-mFc蛋白之间的结合和解离。具体来说，AMC传感器在缓冲液(含有0.02％Tween-20和0.1％BSA的PBS)中预湿润10分钟，然后在CTLA4-mFc的样品缓冲液中平衡5分钟，使得CTLA4-mFc蛋白耦合至传感器表面。CTLA4-mFc偶联的AMC传感器首先在缓冲液中平衡2分钟，然后置于含有不同浓度抗体(3-200nM)的缓冲液中共孵育5分钟，以测量抗体与CTLA4-mFc蛋白的结合；最后，将结合了抗原和抗体的传感器重新置于样品缓冲液，并等待10分钟，以测量抗体与CTLA4-mFc蛋白的解离。测量得到的数据采用1：1模型进行整体拟合，以获得结合与解离动力学常数，并在此基础上进一步得到平衡结合常数KD。实验结果见表V。
表V
实施例8：人鼠CTLA4嵌合抗体的表位分析
使用ELISA方法检测CTLA4嵌合抗体与参照抗体之间的抗原表位竞争。2μg/mL的Ipilimumab包被到96孔板(Corning,catalog#9018)上，4℃过夜。使用5％脱脂奶粉(Oxoid,catalog#LP0031B)在37℃封闭2小时，用PBST洗涤3次。生物素标记的CTLA4-hFc与梯度稀释的嵌合抗体在室温预先孵育30分钟后，加入96孔板中，室温孵育1小时。用PBST洗板三次，加入1/1000稀释的HRP标记的链霉亲和素(BD,catalog#554066)，室温孵育1小时。洗板后，加入TMB显色。结果见图5。嵌合抗体4H9-G5-D5-B1能够完全阻断Ipilimumab与CTLA4-hFc的结合。相反，嵌合抗体9B8-H2-B6-G5不能完全阻断Ipilimumab与CTLA4-hFc的结合，表明这两个抗体与抗原CTLA4-hFc具有不同的结合表位。
实施例9：人鼠CTLA4嵌合抗体增强Jurkat细胞的免疫功能
使用Jurkat细胞来检测人鼠CTLA4嵌合抗体的细胞生物活性。在第一个实验中，Raji细胞作为抗原递呈细胞能够激活Jurkat细胞，而加入外源性CTLA4-hFc蛋白能够阻断这一过程。在以上体系中加入CTLA4抗体，能够中和外源性CTLA4-hFc蛋白而恢复Raji细胞活化Jurkat细胞的功能。具体来说，Raji细胞用25μg/mL丝裂霉素C(MedChem Express,catalog#HY-13316)在37℃处理1小时，然后用PBS洗涤细胞4次。Jurkat细胞和处理过的Raji细胞使用培养基(RPMI-1640含10％灭活FBS)重悬后，加入96孔圆底板中(Corning,catalog#3799)，并同时加入等量的抗CD3抗体(BioLengend,catalog#317326)和CTLA4-hFc融合蛋白，以及不同浓度的测试抗体。细胞培养2天后收集上清，并用ELISA方法(抗体购自BD)定量检测上清中IL-2的含量。结果显示，CTLA4抗体能够增强IL-2的分泌，并呈现剂量依赖效应，结果见图6。
在另一个实验中，使用Jurkat-hCTLA4细胞系来评估抗CTLA4抗体的体外生物学活性。使用电穿孔法(Lonza)，将hCTLA4质粒导入Jurkat细胞，然后用潮霉素进行克隆筛选，最终获得Jurkat-hCTLA4稳定细胞株。在96孔圆底板中，加入Jurkat-hCTLA4细胞和丝裂霉素C处理过的Raji细胞，并同时加入不同浓度的CTLA4抗体。细胞培养2天后收集上清，用如上所述的ELISA方法定量检测IL-2。结果显示，CTLA4抗体能够增强IL-2的分泌，并呈现剂量依赖效应，结果见图7。
实施例10：人鼠CTLA4嵌合抗体的异体混合淋巴细胞实验(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)
使用混合淋巴细胞反应检测CTLA4抗体的体外生物学活性。使用密度梯度离心法(Ficoll-Paque Premium,GE Healthcare,catalog#17-5442-02)，从人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用CD14Cell Isolation Kit(Miltenyi,catalog#130-050-201)从PBMC中进一步分离纯化得到单核细胞(monocyte)。通过在培养基中加入细胞因子1000U/mLGM-CSF(Prospec,catalog#CYT-221)和1000U/mL IL-4(Prospec,catalog#CYT211)，以诱导单核细胞分化成树突细胞(Dendritic cells)。细胞因子每2-3天补充一次，经过5-6天后收获未成熟的树突细胞供后继实验使用。
人CD3+T细胞使用Pan T Cell Isolation Kit(Miltenyi,catalog#130-096-535)从PBMC中分离得到。在96孔圆底板(Corning,catalog#3799)中加入CD3+T细胞和未成熟的树突细胞，以及不同浓度的CTLA4抗体。细胞培养5-6天后，收获上清并用ELISA方法定量检测细胞因子含量。结果如图8显示，人鼠CTLA4嵌合抗体能够增强MLR中IFN-γ的分泌。
实施例11：人鼠CTLA4嵌合抗体抑制肿瘤生长
本发明中所述的肿瘤动物模型，是通过在CTLA4人源化转基因小鼠(南京银河生物医药有限公司开发)中接种鼠结肠癌细胞系MC38(NCI)，而构建的用以在小鼠体内测试成药性CTLA4抗体体内药效的特殊肿瘤动物模型。
对CTLA4人源化转基因小鼠(7-11周龄)侧面皮下注射0.1mL体积的3×105个MC38肿瘤细胞。接种肿瘤细胞6天之后，待肿瘤体积达到约70mm3，以10mg/kg剂量(剂量体积10mL/kg)每周两次注射所述CTLA4抗体、参考抗体以及对照PBS，共进行6次给药。在实验过程中，每周两次使用游标卡尺测量皮下肿瘤体积，跟踪动物直至注射肿瘤细胞后的第34天。如图9所示，经过6次给药后，待测抗体9B8-H2-B6-G5明显抑制肿瘤生长，部分肿瘤在药物处理后几乎消失。
实施例12：人鼠嵌合CTLA4抗体的人源化
使用CDR移植技术，对鼠源9B8-H2-B6-G5抗体进行人源化改造。根据文献报道，人源抗体重链亚型III的框架区和轻链κ亚型I的框架区被广泛应用于抗体的人源化改造(Carter P et al.,PNAS 89:4285-4289(1992)；Presta LG et al.,Cancer Research 57:4593-4599(1997))。将鼠源9B8-H2-B6-G5抗体的CDR区移植到上述人源抗体的框架区上，并对框架区氨基酸残基进行点突变，以增强抗体亲和力。所得到的人源化抗体使用Octet系统和AMC传感器，检测抗体与CTLA4-mFc的亲和力，以筛选出最佳人源化抗体。人源化抗体重链和轻链9B8-VH4、9B8-VH5、9B8-VH6、9B8-VL4、9B8-VL5的DNA和氨基酸序列见表IV。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 苏州银河生物医药有限公司
<120> CTLA4抗体、其药物组合物及其用途
<160> 45
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(366)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 1
caggtccaac tgcagcaacc tgggtctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc aactactggg tccattgggt gaaacagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttttcctg gtagtgatac ttctaactac 180
gatgagaagt tcatcagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag tgcagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagactcgcc 300
tactttacta actacggggg tgctatggac tactggggtc gaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 2
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(333)
<223> 轻链可变区DNA序列
<400> 2
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagttgtatc tctggggcag agggccacc 60
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctgcgt ataattatat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacgtccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc tcagtaggga gcttccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(345)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 3
gaggtgaagc tggatgagac tggaggaggc ttggtgcaac ctgggaggtc catgaaactc 60
tcctgtgttg tctctggatt cacttttagt gacaactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaaag gactggagtg ggtagcacaa attagaaaca aaccttataa ttttgaaaca 180
tattattcag attctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagtact 240
gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacatgg gtgtctatta ctgtacgggg 300
gggtttactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(321)
<223> 轻链可变区DNA序列
<400> 4
gacatccaga tgactcagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtg gagcaagtga gaatatttac ggtggtttaa attggtatca gcggaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct gatctatggt gcaaccaact tggcagaagg catgtcatcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tattctctca agatcagtag cctgcatcct 240
gacgatgttg caacgtatta ctgtcaaaat gtgttaagta gtccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(357)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 5
gaggttcagct gcagcagtct gggactgtgc tggcaaggcc tggggcttcc gtgaagatgt 60
cctgcaaggc ttctggttac agctttacca gctactggat acactgggta aaacagaggc 120
ctggacaggg tctagaatgg attggtgctt tttatcctgg aaatagtgat actaactaca 180
accagaactt caagggcaag gccaaattga ctgcagtcac atccgccagc actgcctaca 240
tggagctcag cagcctgaca aatgaggact ctgcggtcta ttactgtaca tattactacc 300
gtagtagcta tgctatggac aactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 357
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(321)
<223> 轻链可变区DNA序列
<400> 6
gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gactggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(122)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
　　 115 120
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(111)
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Val His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(115)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 9
Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(107)
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(119)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 11
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(107)
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asp Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(10)
<223> 重链CDR1氨基酸序列
<400> 13
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(17)
<223> 重链CDR2氨基酸序列
<400> 14
Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Ile
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Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(15)
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<400> 15
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(15)
<223> 轻链CDR1氨基酸序列
<400> 16
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Asn Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(7)
<223> 轻链CDR2氨基酸序列
<400> 17
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(9)
<223> 轻链CDR3氨基酸序列
<400> 18
Gln Leu Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(10)
<223> 重链CDR1氨基酸序列
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn Trp Met Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 重链CDR2氨基酸序列
<400> 20
Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
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Val Lys Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(6)
<223> 重链CDR3氨基酸序列
<400> 21
Thr Gly Gly Phe Thr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(11)
<223> 轻链CDR1氨基酸序列
<400> 22
Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(7)
<223> 轻链CDR2氨基酸序列
<400> 23
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Glu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(9)
<223> 轻链CDR3氨基酸序列
<400> 24
Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(10)
<223> 重链CDR1氨基酸序列
<400> 25
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(17)
<223> 重链CDR2氨基酸序列
<400> 26
Ala Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(12)
<223> 重链CDR3氨基酸序列
<400> 27
Thr Tyr Tyr Tyr Arg Ser Ser Tyr Ala Met Asp Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(11)
<223> 轻链CDR1氨基酸序列
<400> 28
His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asp Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(7)
<223> 轻链CDR2氨基酸序列
<400> 29
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(9)
<223> 轻链CDR3氨基酸序列
<400> 30
Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(366)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 31
gaggttcaac ttgttgaatc tgggggcgga ctggtccagc caggaggaag cctcaggctc 60
tcatgcgccg ccagtggtta cacctttacc aactactggg tacactgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gattggaatg gattggcaac atatttcctg ggtcagacac aagcaactat 180
gatgaaaaat ttatcagtaa agctacactt tccgtggaca ccagtaaaaa tactgcttat 240
cttcagatga actccttgcg tgcagaggac accgctgtct attattgtgc tcgcctggca 300
tactttacaa attacggcgg agccatggac tactggggtc aaggtacact ggtcactgtc 360
tcgagc 366
<210> 32
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(366)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 32
gaggttcaac ttgttgaatc tgggggcgga ctggtccagc caggaggaag cctcaggctc 60
Tcatgcgccg ccagtggtta cacctttacc aactactggg tacactgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gattggaatg ggtgggcaac atatttcctg ggtcagacac aagcaactat 180
gatgaaaaat ttatcagtcg atttacaata tccgtggaca ccagtaaaaa tactttgtat 240
cttcagatga actccttgcg tgcagaggac accgctgtct attattgtgc tcgcctggca 300
tactttacaa attacggcgg agccatggac tactggggtc aaggtacact ggtcactgtc 360
tcgagc 366
<210> 33
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(366)
<223> 重链可变区DNA序列
<400> 33
gaggttcaac ttgttgaatc tgggggcgga ctggtccagc caggaggaag cctcaggctc 60
tcatgcgccg ccagtggtta cacctttacc aactactggg tacactgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gattggaatg ggtgggcaac atatttcctg ggtcagacac aagcaactat 180
gatgaaaaat ttatcagtcg gttcacactt tccgtggaca ccagtaaaaa tactgcttat 240
cttcagatga actccttgcg tgcagaggac accgctgtct attattgtgc tcgcctggca 300
tactttacaa attacggcgg agccatggac tactggggtc aaggtacact ggtcactgtc 360
tcgagc 366
<210> 34
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(333)
<223> 轻链可变区DNA序列
<400> 34
Gacattgttc tcacacagag cccttctagc cttgtagcct ccgtagggga cagggtaaca 60
ataagttgtc gagctagtaa gtcagtttca acctctgcct acaattacat gcactggtat 120
cagcaaaaac ccggaaaggc tcctaagctc ttgatatatc tggcctcaaa tctggagtca 180
ggagttccat ccagatttag cggcagcggg tctggaaccg acttcaccct cacaatctcc 240
ccttgcaac ccgaggactt cgccacctat tactgccaac tctcccgaga attgccatat 300
acattcggtc aaggaaccaa agttgaaata aag 333
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(333)
<223> 轻链可变区DNA序列
<400> 35
gacattcaac tgacacagag cccttctagc ctttcagcct ccgtagggga cagggtaaca 60
ataacatgtc gagctagtaa gtcagtttca acctctgcct acaattacat gcactggtat 120
cagcaaaaac ccggaaaggc tcctaagctc ttgatatatc tggcctcaaa tctggagtca 180
ggagttccat ccagatttag cggcagcggg tctggaaccg acttcaccct cacaatctcc 240
tccttgcaac ccgaggactt cgccacctat tactgccaac tctcccgaga attgccatat 300
acattcggtc aaggaaccaa agttgaaata aag 333
<210> 36
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(122)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(122)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(122)
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(111)
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 39
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<222> (1)...(111)
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(452)
<223> 重链全长氨基酸序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 42
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(452)
<223> 重链全长氨基酸序列
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 43
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(452)
<223> 重链全长氨基酸序列
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Asp Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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340 345 350
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
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405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 44
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(218)
<223> 轻链全长氨基酸序列
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
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Ala Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 45
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(218)
<223> 轻链全长氨基酸序列
<400> 45
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
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Ala Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (26)

1.分离的抑制CTLA4结合人B7的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区包含如SEQ ID NO：13所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：14所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：15所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：16所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：17所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：18所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：19所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：20所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：21所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：22所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：23所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：24所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：25所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：26所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO：27所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：28所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：29所示的轻链CDR2、以及如SEQ ID NO：30所示的轻链CDR3。
2.如权利要求1的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗体是全长抗体。
3.如权利要求1的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段是Fab或F(ab)'2或scFv。
4.如权利要求1-3任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
5.如权利要求1-4任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示序列具有至少75％相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列具有至少75％相同性的氨基酸序列。
7.如权利要求6的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含SEQ ID NO：7所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示序列。
8.如权利要求6的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含SEQ ID NO：9所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示序列。
9.如权利要求6的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含SEQ ID NO：11所示序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：12所示序列。
10.如权利要求1-6任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38所示氨基酸序列。
11.如权利要求1-6或10任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40所示氨基酸序列。
12.如权利要求1-11任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和/或轻链恒定区；其中抗体重链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区，和/或抗体轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区。
13.如权利要求1-12任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，抑制CTLA4结合人B7-1和/或人B7-2。
14.分离的抑制CTLA4结合人B7的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段与权利要求1-13任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段结合相同的表位，或者与权利要求1-13任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段竞争性结合人B7。
15.分离的核酸，其编码权利要求1-14任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段。
16.载体，其包含权利要求15的核酸。
17.宿主细胞，其包含权利要求15的核酸或权利要求16的载体。
18.免疫偶联物，包含抗体部分和偶联部分，所述抗体部分是权利要求1-14任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分是治疗试剂或诊断试剂。
19.如权利要求18的免疫偶联物，其中所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
20.药物组合物，包含权利要求1-14任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段、权利要求15的核酸、或权利要求18或19的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
21.权利要求1-14任一项的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段、权利要求15的核酸、或权利要求18或19的免疫偶联物在制备用于特异性结合CTLA4的药物中的应用。
22.权利要求21的应用，其中特异性结合CTLA的药物用于阻断CTLA4与B7的结合、下调CTLA4的活性或CTLA4的水平、解除CTLA4对机体的免疫抑制、激活T淋巴细胞或者提高T淋巴细胞中IL-2的表达。
23.权利要求21的应用，其中特异性结合CTLA的药物用于预防和/治疗和/或辅助治疗癌症和免疫系统疾病。
24.权利要求23的应用，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤或黑色素瘤。
25.预防和/治疗和/或辅助治疗癌症和免疫系统疾病的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的权利要求20的药物组合物。
26.权利要求25的应用，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤或黑色素瘤。
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