TWI816729B - 抗tigit抗體及其作為治療和診斷的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及抗體,該抗體與TIGIT(具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體,WUCAM或Vstm3)特異性地結合並抑制免疫細胞中的Tigit介導的細胞信號傳導和活性。本發明還包括這些抗體用於治療或診斷可以被Tigit介導的功能調節的癌症、感染性疾病或其他病理性失調的用途。
Description
本申請涉及特異性地結合TIGIT(具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體)的抗體以及該抗體的用途。
[相關申請的交叉引用]
本申請要求於2017年12月30日提交的專利申請號PCT/CN 2017/120392的優先權。出於所有目的,將上述申請的全部內容通過引用併入本文。
Tigit(T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域)是I型跨膜蛋白,是CD28蛋白質家族的成員,在抑制T細胞和NK細胞介導的抗腫瘤免疫功能活性方面起著重要作用 [Boles KS等人, 2009 Eur J Immunol, 39:695-703;Stanietsky N等人, 2009 PNAS 106:17858-63;Yu X等人 2009 Nat. Immunol, 10:48-57]。
將編碼TIGIT的基因和cDNA克隆並將其在小鼠和人中進行表徵。全長人TIGIT具有長度為244個胺基酸(SEQ ID NO: 1)的序列,其中前21個胺基酸由信號肽組成。成熟人TIGIT的胺基酸序列含有223個胺基酸(aa)殘基(NCBI登錄號:NM_173799)。成熟人TIGIT的細胞外結構域(ECD)由以下組成:120個胺基酸殘基(SEQ ID NO: 2,對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸22-141)(其具有V型Ig樣結構域(對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸39-127))、隨後是21個aa跨膜序列、和具有基於免疫受體酪胺酸的抑制性基序(ITIM)的82個aa細胞質結構域 [Yu X等人 2009 Nat. Immunol, 10:48-57;Stengel KF等人 2012 PNAS 109:5399-04]。在ECD內,人TIGIT分別與小鼠和食蟹猴具有有59%和87%的aa序列同一性。
TIGIT在T細胞(包括活化的T細胞、記憶T細胞、調節性T(Treg)細胞和濾泡性T輔助(Tfh)細胞)和NK細胞上表現 [Boles KS等人, 2009 Eur J Immunol, 39:695-703;Joller N等人, 2014 Immunity 40:569-81;Levin SD等人, 2011 Eur J Immunol, 41:902-15;Stanietsky N等人, 2009 PNAS 106:17858-63;Yu X等人 2009 Nat. Immunol, 10:48-57]。
目前為止,已經鑒定了兩種Tigit配位體,CD155(也稱為脊髓灰質炎病毒受體或PVR)和CD112(也稱為脊髓灰質炎病毒受體相關配位體2、PVRL2、粘連蛋白-2)。這些配位體主要在APC(如樹突細胞和巨噬細胞)和腫瘤細胞上表現 [Casado JG等人,2009 Cancer Immunol Immunother 58:1517-26;Levin SD等人, 2011 Eur J Immunol, 41:902-15;Mendelsohn CL等人, 1989 56:855-65;Stanietsky N等人, 2009 PNAS 106:17858-63;Yu X等人 2009 Nat. Immunol, 10:48-57]。作為免疫「檢查點」分子,Tigit在被其配位體CD155和CD112接合時啟動免疫細胞中的抑制性信號傳導。Tigit與CD155的結合親和力(Kd:約1 nM)遠遠高於CD112,並且TIGIT:CD112相互作用在介導抑制性信號時是否在功能上相關仍有待確定。共刺激受體CD226(DNAM-1)以較低的親和力(Kd:約100 nM)與相同的配位體結合,但傳遞陽性信號 [Bottino C等人, 2003 J Exp Med 198:557-67]。此外,CD96(觸覺的)(「Tigit樣」受體)在相同途徑中也起著類似的抑制作用 [Chan CJ等人, 2014 Nat. Immunol 15:431-8]。
Tigit可以通過不同的機制抑制免疫應答。第一,在樹突細胞(DC)上TIGIT與PVR之間的相互作用可以在DC中傳遞「反向信號傳導」,導致IL-10的上調和IL-12分泌的減少,從而抑制T細胞激活 [Yu X等人 Nat Immunol. 2009 10:48–57]。第二,TIGIT以更高的親和力與CD155結合,從而競爭超過DNAM-1-CD155相互作用。第三,TIGIT在T細胞上的直接連接可以下調TCR介導的激活和隨後TIGIT在NK細胞上的增殖和接合,阻斷了NK細胞的細胞毒性 [Joller N等人 2011 186: 1338-42;Stanietsky N等人, 2009 PNAS 106:17858-63]。第四,Tigit在Treg上的表現與腫瘤組織中的高度活化和抑制表型相關,Treg中的TIGIT信號傳導可能有利於Treg穩定性 [Joller N等人 Immunity 2014 40:569-81;Kurtulus S等人 J Clin Invest. 2015 125: 4053–4062]。
TIGIT具有免疫球蛋白尾酪胺酸(ITT)樣基序,隨後是在其細胞質尾中的基於免疫受體酪胺酸的抑制基序(ITIM)[Yu X等人 Nat Immunol. 2009 10:48–57;Engels N等人 Curr Opin Immunol 2011 23: 324–329]。這些基序可以介導磷酸酶SHIP-1和β-抑制蛋白2的募集[Li M等人 J Biol Chem. 2014 289:17647–17657;Liu S等人 Cell death and differentiation 2013 20: 456-464],從而提供了一種機制,通過該機制TIGIT可以固有地傳遞抑制性信號以抑制活化的信號。
在許多類型的癌症如肺癌 [Tassi等人, Cancer Res. 2017 77: 851-861], 食管癌 [Xie J等人, Oncotarget 2016 7:63669-63678]、乳腺癌 [Gil Del Alcazar CR等人 2017 Cancer Discov.]、急性髓性白血病(AML)[Kong Y等人, Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66] 和黑色素瘤 [Chauvin JM等人, J Clin Invest. 2015 125:2046-2058]中已經報道了Tigit表現在腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)和外周血單核細胞(PBMC)中的上調。Tigit在AML中的表現增加與患者存活結果的不良預後相關 [Kong Y等人, Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66]。Tigit信號傳導的上調不僅在對癌症的免疫耐受性方面起著重要作用,而且在對慢性病毒感染的免疫耐受性方面起著重要作用。在HIV感染期間,Tigit在T細胞上的表現顯著更高並且與病毒載量和疾病進展呈正相關 [Chew GM等人, 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349]。此外,單獨阻斷Tigit受體或與其他阻斷組合可以在體外和在體內拯救功能「耗盡」的T細胞 [Chauvin JM等人, J Clin Invest. 2015 125:2046-2058;Chew GM等人, 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349;Johnston RJ等人 Cancer Cell 2014 26:923-937]。在癌症和病毒感染的情況下,Tigit信號傳導的激活促進免疫細胞功能失調,導致癌症向外生長或擴散病毒感染。治療劑對Tigit介導的抑制性信號傳導的抑制可以恢復免疫細胞(包括T細胞、NK細胞和樹突細胞(DC))的功能活性,因此增強對癌症或慢性病毒感染的免疫力。
因此,拮抗分子對Tigit信號傳導的調節可以拯救免疫細胞免於耐受性,從而誘導有效的免疫應答以根除腫瘤或慢性病毒感染。
本發明至少部分是基於對一組單克隆抗體(mAb)的發現,該單克隆抗體在免疫細胞中抑制Tigit介導的細胞信號傳導,通過與Tigit特異性地結合來重新激活免疫細胞並增強免疫力。因此,在第一方面,本申請涉及能夠與人Tigit(SEQ ID NO: 1)結合的抗Tigit抗體及其抗原結合片段。本發明還涉及第一方面的人源化形式的抗Tigit mAb。
在特定的實施例中,本申請的抗體包含重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含一個、兩個或三個CDR,該CDR具有選自SEQ ID NO: 3、4、5或13的胺基酸序列、或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如在SEQ ID NO 3、4、5或13的胺基酸序列中的一個或兩個保守取代;和/或輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含一個、兩個或三個CDR,該CDR具有選自SEQ ID NO: 6、7或8的胺基酸序列、或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如在SEQ ID NO: 6、7或8的胺基酸序列中的一個或兩個保守取代。
在更具體的實施例中,本申請的抗體包含重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含VH-CDR1,其具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代,VH-CDR2,其具有SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代,和VH-CDR3,其具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代;和/或輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含VL-CDR1,其具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代,VL-CDR2,其具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代,和VL-CDR3,其具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代,例如一個或兩個保守取代。
本申請的抗體或其抗原結合片段能夠與人Tigit結合並且包含重鏈可變區,該重鏈可變區具有選自SEQ ID NO: 9、14、19的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9、14、19具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中,序列的差異在於架構區。在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區,該重鏈可變區由選自SEQ ID NO: 10、15或20的核苷酸序列或其變異體編碼。
本申請的抗體或其抗原結合片段能夠與人Tigit結合並且包含重鏈可變區,該重鏈可變區具有選自SEQ ID NO: 11、16、21或24的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11、16、21或24具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中,序列的差異在於架構區。在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區,該重鏈可變區由選自SEQ ID NO: 12、17或22的核苷酸序列或其變異體編碼。
在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段能夠以約1 x 10-9
M至約1 x 10-12
M的Kd值與人Tigit結合。例如,抗體或其抗原結合片段能夠以小於約1 x 10-9
M、小於約1 x 10-10
M、小於約1 x 10-11
M、或小於約1 x 10-12
M的Kd值與人Tigit結合。
在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亞類的重鏈恒定區或其變異體、以及κ或λ類型的輕鏈恒定區或其變異體。在更具體的實施例中,抗體的Fc區是人IgG1 Fc或其變異體,例如SEQ ID NO: 18的Fc區。
在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段通過抗原特異性T細胞促進IFN-γ的產生。在更具體的實施例中,抗體或其抗原結合片段以劑量依賴性方式促進抗原特異性T細胞產生IFN-γ。
在更具體的實施例中,本申請的抗體經由FcγR介導的胞啃作用(Trogocytosis)(特別是FcγRIIB介導的胞啃作用)降低Tigit受體的表面表現。
在一個實施例中,本申請的抗體顯示pH依賴性抗原結合,這樣使得與在生理pH(例如pH 7.4)下與人TIGIT的結合相比,抗體在腫瘤微環境中的微酸性pH(例如pH 6.0)下表現出與人TIGIT更強的結合。在更具體的實施例中,本申請的抗體具有 (1) 大於2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多的在pH 7.4/pH 6.0下的KD比,和/或 (2) 比在pH 7.4下的Rmax高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍的在pH 6.0下的Rmax(RU)值,如通過表面等離子體共振(Biacore)或類似技術測量的。
本文公開的抗Tigit mAb在治療癌症、控制病毒感染和機制上涉及免疫耐受性或「耗盡」的其他人類疾病中具有潛在的治療用途。因此,在另外的實施例中,將本申請的抗Tigit抗體用於在治療癌症中使用。在另一個具體的實施例中,將本申請的抗Tigit抗體用於在治療感染、治療感染性疾病和/或控制病毒感染中使用。在另一個具體的實施例中,將本申請的抗Tigit抗體用於在治療與免疫耐受性相關或由其引起的其他人類疾病的、或治療可以通過增加免疫細胞激活改善的疾病中使用。
在另外的方面,本申請涉及一種組合物,該組合物包含抗Tigit抗體或其抗原結合片段和治療上可接受的賦形劑。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂,下文特舉實施例,並配合所附圖式作詳細說明如下。
定義
胺基酸的保守胺基酸取代在本領域中通常是已知的,並且示例性地示於下表中。通常,保守胺基酸取代意指胺基酸殘基被具有類似側鏈的另一個胺基酸殘基替代。
除非在本文件的其他地方明確定義,否則本文使用的所有其他技術和科學術語具有熟習此項技術者通常理解的含義。
如本文(包括所附申請專利範圍)所使用的,除非上下文另外清楚地指示,否則單數形式的詞語例如「一個」、「一種」和「該」包括它們對應的複數指示物。
除非上下文另外清楚地指示,否則術語「或」用於意指術語「和/或」,並且可與術語「和/或」互換使用。
在整個說明書和隨後的申請專利範圍中,除非上下文另有要求,否則詞語「包含」(comprise)以及變體如「包含」(comprises和comprising)將被理解為暗示包括所述胺基酸序列、DNA序列、步驟或其組,但不排除任何其他胺基酸序列、DNA序列、步驟。當在本文中使用時,術語「包括」可以用術語「含有」、「包含」代替或有時用「具有」代替。
術語「Tigit」包括各種哺乳動物同種型,例如人Tigit、人Tigit的直系同源物、和包含Tigit內的至少一個表位的類似物。Tigit(例如人Tigit)的胺基酸序列、以及編碼其的核苷酸序列是本領域已知的。
當應用於動物、人、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時,如本文所用的術語「給予」(administration、administering)、和「治療」(treating、treatment)意指外源性藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與該動物、人、個體、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。對細胞的處理涵蓋試劑與細胞的接觸、以及試劑與流體的接觸,其中該流體與該細胞接觸。術語「給予」或「治療」還包括指通過試劑、診斷劑、結合化合物或者通過另一種細胞對例如細胞的體外和離體治療。本文的術語「個體」是指任何生物體,優選地動物、更優選地哺乳動物(例如大鼠、小鼠、狗、貓、兔)和最優選地人。
抗體或抗體分子
本文公開了以高親和力和特異性與Tigit結合的抗體分子。
在一些實施例中,抗Tigit抗體與人Tigit結合並且包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區(CDR),該互補決定區包含胺基酸序列SEQ ID NO 3、4、5、13或SEQ ID NO: 6、7、8。在特定的實施例中,本申請的抗體包含重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含一個、兩個或三個CDR,該CDR具有選自SEQ ID NO: 3、4、5或13的胺基酸序列、或其變異體,該變異體包含一個或多個保守的取代;和/或輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含一個、兩個或三個CDR,該CDR具有選自SEQ ID NO: 6、7或8的胺基酸序列、或其變異體,該變異體包含一個或多個保守取代。
在一些實施例中,抗Tigit抗體是分離的抗體、人源化抗體、嵌合抗體或重組抗體。
在一些實施例中,抗Tigit抗體包含至少一個抗原結合位點、或至少一個可變區。在一些實施例中,抗Tigit抗體包含從本文所述抗體衍生的抗原結合片段。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用,並且特別涵蓋抗體(包括全長單克隆抗體)和抗體片段,只要它們識別抗原,例如Tigit。抗體通常是單特異性的,但也可以被描述為專有特異性的、異種特異性的或多特異性的。抗體分子通過特異性結合位點與抗原上的特異性抗原決定簇或表位結合。
本文中的術語「單克隆抗體」或「mAb」或「Mab」意指基本上同質的抗體的群體,即,除了可以以少量存在的可能天然發生的突變,群體中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的。相反,常規(多克隆)抗體製劑典型地包括在其可變結構域(特別是其互補決定區(CDR),其通常對不同表位具有特異性)中具有不同胺基酸序列的多種不同抗體。修飾語「單克隆」表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵,並且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。單克隆抗體(mAb)可以通過熟習此項技術者已知的方法獲得。參見例如,Kohler G等人, Nature 1975 256:495-497;美國專利號 4,376,110;Ausubel Fm等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992;Harlow E等人, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988;以及Colligan JE等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993。本文公開的mAb可以是任何免疫球蛋白類別,包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA、及其任何亞類。產生mAb的雜交瘤可以在體外或在體內進行培養。通過體內生產可以獲得高滴度的mAb,其中將來自單個雜交瘤的細胞腹膜內地注射到小鼠(如原始引發的Balb/c小鼠)中,以產生含有高濃度所需mAb的腹水。可以使用熟習此項技術者熟知的柱色譜法從此類腹水中或從培養上清液中純化同種型IgM或IgG的mAb。
通常,基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包括兩對相同的多肽鏈,每對具有一條「輕鏈」(約25 kDa)和一條「重鏈」(約50-70 kDa)。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100個至110個或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以限定主要負責效應子功能的恒定區。典型地,將人輕鏈分類為κ和λ輕鏈。此外,將人重鏈典型地分類為α、δ、ε、γ或μ,並且將抗體的同種型分別定義為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈內,可變區和恒定區通過約12個或更多個胺基酸的「J」區連接,其中重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。
每條輕鏈/重鏈(VL/VH)對的可變區形成抗體結合位點。因此,通常,完整抗體具有兩個結合位點。除了雙功能或雙特異性抗體之外,兩個結合位點通常是相同的。
典型地,重鏈和輕鏈兩者的可變結構域包含三個高變區,也稱為「互補決定區(CDR)」,其位於相對保守的架構區(FR)之間。CDR通常由架構區對齊,使得能夠與特異性表位結合。通常,從N末端至C末端,輕鏈和重鏈可變結構域依次包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。通常,每個結構域的胺基酸的分配是根據免疫學目的蛋白質的序列的定義,Kabat等人, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ;第5版;NIH Publ. No. 91-3242 (1991);Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75;Kabat等人, (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616;Chothia等人, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917或者Chothia等人, (1989) Nature 342:878-883。
術語「高變區」意指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「CDR」(即,輕鏈可變結構域中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3以及重鏈可變結構域中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3)的胺基酸殘基。參見,Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(按照序列定義抗體的CDR區);還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917(按照結構定義抗體的CDR區)。術語「架構」或「FR」殘基意指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另有說明,「抗體片段」或「抗原結合片段」意指抗體的抗原結合片段,即保留與被全長抗體結合的抗原特異性地結合的能力的抗體片段,例如保留一個或多個CDR區的片段。抗原結合片段的例子包括但不限於,由抗體片段形成的Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;雙鏈抗體(diabodies);線性抗體;單鏈抗體分子,例如單鏈Fv(ScFv);納米抗體以及多特異性抗體。
以特異性與特定靶蛋白結合的抗體也被描述為與特定靶蛋白特異性地結合。這意味著與其他蛋白質相比,抗體表現出優先與該標靶結合,但這種特異性不需要絕對結合特異性。如果抗體的結合決定了樣品中靶蛋白的存在,例如,沒有產生不希望的結果,如假陽性,則抗體被認為對其預期標靶是「特異性的」。可用於本發明的抗體或其結合片段將以比與非靶蛋白的親和力大至少2倍、優選地大至少10倍、更優選地大至少20倍、以及最優選地大至少100倍的親和力與靶蛋白結合。本文中的抗體被稱為與包含給定胺基酸序列(例如成熟人Tigit分子的胺基酸序列)的多肽特異性地結合,條件是其與包含該序列的多肽結合但不與缺乏該序列的蛋白結合。
表現「pH依賴性結合」、「pH依賴性標靶結合」和「pH依賴性抗原結合」在本公開文本中是可互換的,表明本申請的抗體以pH依賴的方式與其標靶/抗原(即人TIGIT)結合。具體地,與在生理pH(例如pH 7.4)下的結合親和力和/或結合信號相比,本申請的抗體在微酸性pH(例如pH 6.0,其通常在腫瘤微環境中發現)下顯示出更高的對其抗原的結合親和力和/或結合信號。用於確定本申請的抗體的結合親和力和/或結合信號強度的方法是本領域熟知的,並且包括但不限於表面等離子體共振(Biacore)或類似技術。更具體地,本申請的抗體在pH 7.4/pH 6.0下的KD比大於2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多,如通過表面等離子體共振(Biacore)或類似技術測量的。可替代地或另外地,本申請的抗體在pH 6.0下的Rmax(RU)值比在pH 7.4下的Rmax高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍,如通過表面等離子體共振(Biacore)或類似技術測量的。可以在25ºC或37ºC下測量抗體的結合親和力。已經發現腫瘤微環境顯示出比生理條件或正常組織相對更加酸性的pH(Zhang等人 Focus on molecular Imaging 2010;Tannock和Rotin等人 Cancer Res 1989)。因此,具有上述pH依賴性結合的本申請的抗體作為用於靶向腫瘤微環境中的TIGIT陽性淋巴細胞的抗TIGIT治療劑是有利的,該抗TIGIT治療劑具有選擇性並且具有與淋巴細胞的外周激活相關的較低毒性。
本文中的術語「人抗體」意指僅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗體。如果在小鼠、在小鼠細胞或在從小鼠細胞衍生的雜交瘤中產生,人抗體可能含有鼠碳水化合物鏈。類似地,「小鼠抗體」或「大鼠抗體」意指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。
術語「人源化抗體」意指含有來自非人(例如,鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此類抗體含有從非人免疫球蛋白衍生的最小序列。通常,人源化抗體將包含至少一個、並且典型地兩個可變結構域的基本上全部,其中全部或基本上全部的高變環與非人免疫球蛋白的高變環對應並且全部或基本上全部的FR區是人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體還任選地包括免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分,典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。當有必要區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體時,將前綴「hum」、「hu」、「Hu」或「h」添加到抗體克隆名稱中。齧齒動物抗體的人源化形式通常包含親本齧齒動物抗體的相同CDR序列,儘管可以包括某些胺基酸取代以增加親和力,增加人源化抗體的穩定性,或者出於其他原因。
本申請的抗體在治療癌症方面具有潛在的治療用途。本文中的術語「癌症」或「腫瘤」意指或描述在哺乳動物中典型地以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。癌症的例子包括但不限於肺癌(包括小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、腎上腺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、白血病、膀胱癌、骨癌、腦癌、子宮內膜癌、頭頸癌、淋巴瘤、卵巢癌、皮膚癌、甲狀腺腫瘤或癌症的轉移性病灶。
此外,本申請的抗體在控制病毒感染和在機制上涉及免疫耐受性或「耗盡」的其他人類疾病方面具有潛在的治療用途。在本申請的上下文中,術語「耗盡」是指在長期慢性病毒感染期間導致免疫細胞對感染病毒作出響應的能力被耗損的過程。
醫藥組合物和套組
在一些方面,本公開文本提供了組合物,例如醫藥上可接受的組合物,其包括與至少一種醫藥上可接受的賦形劑一起配製的本文所述的抗Tigit-3抗體。如本文所用,術語「醫藥上可接受的賦形劑」包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介體、等滲和吸收延遲劑等。賦形劑可能適合用於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮給予(例如通過注射或輸注)。
本文中的組合物可以是各種形式。這些包括例如液體、半固體和固體劑型,如液體溶液(例如,可注射和輸注溶液)、分散體或懸浮液、脂質體和栓劑。合適的形式取決於給予和治療應用的預期模式。典型的合適組合物是處於可注射或輸注溶液的形式。一種合適的給予模式是腸胃外(例如,靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在一些實施例中,抗體通過靜脈內輸注或注射給予。在某些實施例中,抗體通過肌內或皮下注射給予。
如本文所用,術語「治療有效量」是指當給予至個體用於治療疾病或失調、或疾病或失調的至少一種臨床症狀時,足以對疾病、失調或症狀的這種治療產生效果的抗體的量。「治療有效量」可隨以下各項變化:抗體;疾病、病症和/或疾病或病症的症狀;疾病、病症和/或疾病或病症的症狀的嚴重程度;待治療的個體的年齡和/或待治療的個體的體重。在任何給定的例子中,適當的量對於熟習此項技術者來說是清楚的,或者可以通過常規實驗來確定。在組合療法的情況下,「治療有效量」是指用於對疾病、失調或病症有效治療的在組合中包含的活性劑的總量。
如本文所用,「個體」是哺乳動物,例如齧齒動物或靈長類動物,優選地高等靈長類動物,例如人(例如患有本文所述失調或處於患有本文所述失調的風險的患者)。
實例1:抗Tigit單克隆抗體的產生
基於常規雜交瘤融合技術[de StGroth和Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1;Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1]稍作修改而產生抗Tigit單克隆抗體(mAb)。選擇在酶聯免疫吸附測定(ELISA)和熒光激活細胞分選(FACS)測定中具有高結合活性的mAb用於進一步表徵。
用於免疫和結合測定的Tigit重組蛋白
編碼全長人Tigit(SEQ ID NO: 1)的cDNA基於其GenBank序列(登錄號:NM_173799)由Sinino Biological(中國北京(Beijing, China))合成並從其購買。將與SEQ ID NO: 1的胺基酸(AA)1-141對應的全長人Tigit的細胞外結構域(ECD)的編碼區進行PCR擴增,並克隆到基於pcDNA3.1的表現載體(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)(其中C末端與小鼠IgG2a的Fc結構域或與人IgG1重鏈的Fc結構域融合)中,其分別產生兩種重組融合蛋白表現質粒Tigit-mIgG2a和Tigit-huIgG1。Tigit融合蛋白的示意圖顯示於圖1中。對於重組融合蛋白的產生,將Tigit-mIgG2a和Tigit-huIgG1質粒瞬時轉染到293G細胞(內部開發)中,並在配備有旋轉振搖器的CO2培養箱中培養7天。收集含有重組蛋白的上清液並通過離心澄清。使用蛋白A柱(目錄號:17127901,GE Life Sciences)純化Tigit-mIgG2a和Tigit-huIgG1。將Tigit-mIgG2a和Tigit-huIgG1兩種蛋白質用磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)透析,並以小等分試樣存儲在-80ºC冰箱中。
穩定的表現細胞株
為了建立表現全長人Tigit(huTigit)或猴Tigit(mkTigit,登錄號:XM_005548101.2)的穩定細胞株,將Tigit基因(由Genescript(中國南京(Nanjing, China))合成)克隆到逆轉錄病毒載體pFB-Neo(目錄號:217561,Agilent, USA)中。根據先前的方案產生雙向性逆轉錄病毒載體(Dual-tropic retroviral vector)[Zhang T等人 2005, Blood]。將含有huTigit和mkTigit的載體分別轉導到Jurkat和NK92MI細胞(ATCC,Manassas, VA, USA)中以產生細胞株,Jurkat/huTigit and NK92MI/mkTigit。通過在具有G418的培養基中培養和FACS結合測定來選擇高表現細胞株。
免疫、雜交瘤融合和克隆
用含有10 μg Tigit-mIgG2a和水溶性佐劑(目錄號:KX0210041,KangBiQuan(中國北京))的100 μL抗原混合物對八至十二周齡的Balb/c小鼠(來自HFK BIOSCIENCE CO.,LTD(中國北京))腹膜內地(i.p.)進行免疫。三周後重複該程序。在第2次免疫後兩周,通過ELISA和FACS評價小鼠血清的Tigit結合。在血清篩選後10天,用50 μg Tigit-mIgG2a通過經由i.p.注射加強免疫具有最高抗Tigit抗體血清滴度的小鼠。在加強免疫後3天,使用標準技術 [1977 Somat Cell Genet, 3:231] 將脾細胞分離並與鼠骨髓瘤細胞株SP2/0細胞(ATCC)融合。
通過ELISA和FACS評估抗體的Tigit結合活性
如在「Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52」(進行一些修改)中通過ELISA對雜交瘤克隆的上清液進行初始篩選。簡言之,在96孔板中塗覆Tigit-huIgG1蛋白。使用HRP連接的抗小鼠IgG抗體(目錄號:7076S,Cell Signaling Technology, USA)和底物(目錄號:00-4201-56,eBioscience, USA)來開發在450 nm波長處的彩色吸光度信號,其通過使用讀板器(SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, USA)進行測量。使用上述NK92MI/huTigit或NK92mi/mkTigit細胞通過FACS進一步驗證ELISA陽性克隆。將表現Tigit的細胞(105個細胞/孔)與ELISA陽性雜交瘤上清液一起孵育,隨後與Alexa Fluro-647標記的山羊抗小鼠抗體(目錄號:A0473,Beyotime Biotechnology, China)結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte 8HT,Merck-Millipore, USA)對細胞熒光定量。
將來自在ELISA和FACS兩種篩選中都顯示陽性信號的雜交瘤的條件培養基進行功能測定,以鑒定在基於人免疫細胞的測定中具有良好功能活性的抗體(參見以下章節)。進一步亞克隆並表徵具有所希望的功能活性的抗體。
雜交瘤的亞克隆和對無血清或低血清培養基的適應
在通過ELISA、FACS和如上所述的功能測定進行初步篩選之後,通過有限稀釋將陽性雜交瘤克隆進行亞克隆。將來自每個板的基於ELISA和FACS篩選的三個陽性亞克隆進行選擇並通過功能測定進行表徵。將通過功能測定驗證最佳抗體亞克隆適於在具有3% FBS的CDM4MAb培養基(目錄號:SH30801.02,Hyclone, USA)中生長。
單克隆抗體的表現和純化
用抗體表現質粒(目錄號R79007,Invitrogen)瞬時轉染的雜交瘤細胞或293G細胞在CDM4MAb培養基(目錄號:SH30801.02,Hyclone)或在FreestyleTM
293表現培養基(目錄號:12338018,Invitrogen)中培養,並在CO2培養箱中於37ºC下孵育5至7天。通過離心收集條件培養基,並在純化之前通過0.22 μm膜進行過濾。按照製造商的指南,應用含有上清液的鼠或重組抗體並與蛋白A柱(目錄號:17127901,GE Life Sciences)結合。該程序通常產生純度高於90%的抗體。將蛋白A親和純化的抗體對PBS進行透析或使用HiLoad 16/60 Superdex200柱(目錄號:17531801,GE Life Sciences)進一步純化以除去聚集物。通過測量在280 nm處的吸光度來確定蛋白質濃度。將最終的抗體製劑以等分試樣存儲在-80ºC冰箱中。
實例2:對Tigit抗體的克隆和序列分析
基於製造商的方案,收穫鼠雜交瘤克隆,以使用Ultrapure RNA套組(目錄號:74104,QIAGEN, Germany)製備總細胞RNA。使用來自Invitrogen的cDNA合成套組(目錄號:18080-051)合成第1鏈cDNA,並且使用PCR套組(目錄號:CW0686, CWBio(中國北京))進行對編碼鼠mAb的重鏈可變區(Vh)和κ鏈可變區(Vk)的核苷酸序列的PCR擴增。用於Vh和Vk的抗體cDNA克隆的寡聚物由Invitrogen(中國北京)基於先前報道的序列合成(Brocks等人 2001 Mol Med 7:461)。然後將PCR產物亞克隆到pEASY-Blunt克隆載體(目錄號:CB101-02,TransGen, China)中,並由Genewiz(中國北京)測序。從DNA測序結果推導出Vh和Vk區的胺基酸序列。
將鼠mAb通過比較序列同源性進行分析並基於序列相似度進行分組(圖2A及圖2B)。通過序列注釋並通過基於互聯網的序列分析(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html)基於Kabat [Wu和Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250] 和IMGT [Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212] 系統來定義互補決定區(CDR)。將代表性最佳克隆mu1217(Vh和Vk)的胺基酸序列列於表1中(SEQ ID NO: 9和11)。將mu1217的CDR序列列於表2中(SEQ ID NO: 3-8)。
表1. Mu1217 Vh和Vk區的胺基酸序列
表2. mu1217 Vh和Vk區的CDR序列(胺基酸)
實例3:通過SPR對純化的鼠抗Tigit抗體進行親和確定
在ELISA和FACS中具有高結合活性、以及在基於細胞的測定中具有強有力的功能活性的Tigit抗體(在實例1和2中描述)使用BIAcoreTM
T-200(GE Life Sciences)通過SPR測定來表徵它們的結合動力學。簡言之,將抗人IgG抗體固定在活化的CM5生物傳感器芯片(目錄號:BR100530,GE Life Sciences)上。使人Fc標記的Tigit在芯片表面上流過並由抗人IgG抗體捕獲。然後使純化的鼠抗體的連續稀釋(0.12 nM至10 nM)在芯片表面上流過,並且分析表面等離子體共振信號的變化,以通過使用一對一Langmuir結合模型(BIA Evaluation Software,GE Life Sciences)計算結合率(kon
)和解離率(koff
)。將平衡解離常數(KD)計算為比率koff
/kon
。包括mu1217、mu1257、mu1226和mu242的最佳mAb的結合親和力特徵顯示在圖3和表3中。
表3. 雜交瘤抗體通過SPR的結合親和力
實例4:對鼠抗人Tigit mAb mu1217的人源化
mAb人源化和工程改造
對於mu1217的人源化,通過在IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/ index.html)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)網站中比對人免疫球蛋白基因數據庫,搜索人種系基因中與mu1217可變區的cDNA序列享有高度同源性的序列。將以高頻率存在於人抗體庫中(Glanville 2009 PNAS 106:20216-20221)並與mu1217高度同源的人IGVH和IGVK基因選擇作為人源化的模板。
通過CDR-移植進行人源化(Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press),並且使用內部開發的表現載體將人源化抗體(hu1217)工程改造為人IgG1mf形式。在人源化的初始過程中,架構區中鼠到人類胺基酸殘基的突變由模擬的3D結構引導,並且用於維持CDR的典範結構的結構重要性鼠架構殘基被保留在第1版人源化抗體1217(hu1217-1-1,其中6個CDR具有SEQ ID NO: 3、13、5(重鏈 CDR)和SEQ ID NO: 6、7、8(輕鏈CDR)的胺基酸序列,重鏈可變區具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列並由SEQ ID NO: 15的核苷酸序列編碼,並且輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列並由SEQ ID NO: 17的核苷酸序列編碼)中。具體地,將mu1217 Vκ的CDR(SEQ ID NO: 6-8)移植到人種系可變基因IGVκ3-15的架構中,其中保留了1個鼠架構殘基(V58
),從而產生Hu1217-1-1的人源化Vκ序列(SEQ ID NO: 16為胺基酸序列,以及SEQ ID NO: 17為核苷酸序列)。將mu1217 Vh的H-CDR2(SEQ ID NO: 4)、H-CDR1和H-CDR3(SEQ ID NO: 3和5)的N末端移植到人種系可變基因IGVH3-7的架構中,其中保留了兩個鼠架構(SEQ ID NO: 10的T24
和I37
)殘基。在hu1217人源化變異體中,僅移植了Kabat H-CDR2的N末端一半,因為根據模擬的3D結構,預測僅N末端一半對抗原結合是重要的。將所得的Hu1217-1-1人源化Vh序列的胺基酸序列和核苷酸序列分別顯示於SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15中。
使用易於適配的亞克隆位點,使用內部開發的表現載體將Hu1217-1-1構建為人全長抗體形式,該表現載體分別含有人IgG1變異體(被稱為IgG1mf)的恒定區(SEQ ID NO: 18)和κ鏈。對hu1217-1-1抗體的表現和製備通過將上述兩種構建體共轉染到293G細胞中和通過使用蛋白A柱(目錄號:17543802,GE Life Sciences)純化來實現。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL,並以等分試樣存儲在-80ºC冰箱中。
基於hu1217-1-1模板,我們進行了將Vκ架構區中保留的鼠殘基轉化為對應的人種系殘基的幾個單一突變,其包括在Vκ中的V58I和在Vh中的T24A和I37V。所得的hu1217-2A-1(T24A)、hu1217-2B-1(I37V)、和hu1217-1-2a(V58I)全部都具有與hu1217-1-1類似的結合和功能活性。所有人源化突變均使用在特定位置含有突變的引子和定點誘變套組(目錄號FM111-02,TransGen(中國北京))進行。通過測序分析驗證所希望的突變。如先前所述,在結合和功能測定中測試這些hu1217衍生的變異體抗體。
Hu1217抗體通過在CDR和架構區中引入突變來進一步工程改造,以改善用於人類治療用途的分子和生物物理特性。考慮因素包括胺基酸組成、熱穩定性(Tm
)、表面疏水性和等電子點(pI),同時保持功能活性。
總之,人源化單克隆抗體hu1217-2-2(SEQ ID NO: 3、5-8、13和19-21)的完整工程改造的版本衍生自如上所述的突變過程,並且詳細地進行了表徵。結果顯示hu1217-2-2和hu1217-1-1兩者在結合親和力和功能活性(如抑制Tigit介導的下游信號傳導)方面非常相似。
對於親和力確定,抗體由抗人Fc表面捕獲,並且基於表面等離子體共振(SPR)技術用於親和力測定中。抗Tigit抗體的SPR確定的結合特徵的結果匯總在表4中。Hu1217-2-2和hu1217-1-1顯示出非常相似的結合特徵,平均解離常數分別為0.415 nM和0.266 nM,與ch1217的平均解離常數接近。
表4. hu1217抗體通過SPR的結合親和力
* ch1217由與人IgG1mf/κ恒定區融合的mu1217可變結構域構成。
** NA:不可用。
表5. hu1217抗體的CDR
還確認了上面顯示的所有人源化抗體對從健康供體分離的初級人免疫細胞的功能活性(描述於實例7中)。
實例5:不同版本的1217與天然Tigit的結合活性
為了評價抗Tigit抗體與活細胞上的天然Tigit的結合活性,將NK92mi細胞工程改造以過表現人Tigit。將活的NK92mi/Tigit細胞接種在96孔板中,並與抗Tigit抗體的一系列稀釋液一起孵育。將山羊抗人IgG用作第二抗體,以檢測與細胞表面結合的抗體。通過使用GraphPad Prism將劑量-反應數據擬合到四參數邏輯模型來確定與人天然Tigit的劑量依賴性結合的EC50值。如在圖4A、4B和表6中所示,人源化1217抗體hu1217-1-1和hu1217-2-2兩者都顯示出與活細胞上的天然Tigit的良好結合親和力。
表6. 人源化1217變異體與天然Tigit的劑量依賴性結合的EC50
實例6:抗Tigit抗體阻斷Tigit與其配位體PVR和PVR-L2的相互作用
Tigit以高親和力(Kd:約1 nM)與PVR結合,這可以與CD266-PVR相互作用競爭 [Yu等人, 2009]。
為了確定抗Tigit抗體是否可以阻斷Tigit-PVR和Tigit-PVR-L2相互作用,將HEK293細胞工程改造以表現高水平的PVR或PVR-L2。將所得的細胞株分別命名為HEK293/PVR和HEK293/PVR-L2。通過流式細胞術確定可溶性Tigit(Tigit-mIgG2a融合蛋白)與PVR或PVR-L2的結合(圖5A)。通過添加連續稀釋的抗Tigit抗體定量地測量對Tigit-配位體相互作用的阻斷。如在圖5B中所示,hu1217-2-2/IgG1(包含野生型IgG1 Fc區且與hu1217-2-2/IgG1mf具有相同的VH和VL序列的人源化版本)和hu1217-2-2/IgG1mf可以以劑量依賴性方式阻斷與PVR的Tigit結合,其中IC50分別為0.64 μg/mL和0.55 μg/mL。類似地, hu1217-2-2/IgG1和hu1217-2-2/IgG1mf在阻斷Tigit-PVR-L2相互作用方面的IC50分別是0.25 μg/mL和0.18 μg/mL。
實例7:通過抗Tigit抗體激活CMV特異性人T細胞
使用識別人CMV PP65肽(NLVPMVATV,495-503, HLA-A2.1限制性)的天然衍生的T細胞,進一步評估Tigit抗體的功能活性 [Boeckh M, Boeckh M and Geballe AP,2011J Clin Invest. 121:1673-80]。簡言之,在含有10% FBS的完全RPMI中,將來自HLA-A2.1+
健康供體的PBMC用PP65肽(> 98%純度,由GL Biochem(上海(Shanghai))合成)模擬一周。將pp65引發的PBMC用作效應細胞。在測定之前,將靶細胞HCT116細胞(HLA-A2.1+
,104
個)用pp65肽(5 μg/mL)脈衝30 min,並且在96孔板中在抗Tigit抗體或空白對照(僅培養基)存在或不存在的情況下與相同數量的pp65敏化的PBMC共培養過夜。如在圖6中所示,對於兩種供體,hu1217-2-2/IgG1以劑量依賴性方式促進pp65特異性T細胞在細胞培養上清液中分泌IFN-γ。
實例8:抗Tigit抗體增強NK細胞介導的細胞毒性
已知Tigit以相對較高的水平在天然殺傷(NK)細胞上組成型表現,並且在Tigit與其配位體之間的相互作用抑制NK細胞介導的細胞毒性 [Wang F等人 2015Eur. J. Immunology 45:2886-97;Stanietsky N等人, 2009Proc Natl Acad Sci USA 106:17858-63]。
為了確認人源化抗Tigit抗體是否可以促進NK介導的細胞毒性,根據先前所述的方案,將NK細胞株NK92MI作為效應細胞通過逆轉錄病毒轉導工程改造以共表現Tigit和DNAM-1受體兩者(NK92MI/Tigit-DNAM-1)[Zhang等人, 2006 Cancer Res. 66: 5927-5933]。與標靶類似地建立表現PVR的肺癌細胞株SK-MES-1/PVR。
使用CytoTox 96非放射性細胞毒性測定套組(Promega, Madison, WI)通過LDH釋放測定來確定NK92MI/Tigit-DNAM-1細胞對SK-MES-1/PVR細胞的細胞毒性。簡言之,在96孔V形底板中,在抗Tigit Ab(0.007-30 μg/mL)的存在下,將NK92MI/Tigit-DNAM-1細胞(8x105
個)與SK-MES-1/PVR細胞(2 x 104
個)共培養5小時。LDH釋放測定 使用以下方程式確定特異性裂解:特異性裂解的百分比 = [(實驗裂解 - 效應子自發裂解 - 標靶自發裂解)/(標靶最大裂解 - 標靶自發裂解)] x 100。結果顯示抗Tigit抗體hu1217-2-2/IgG1mf以劑量依賴性方式(EC50:0.185 μg/mL)增強NK細胞殺傷(圖7A及圖7B)。
實例9:抗Tigit抗體可以經由FcγR介導的胞啃作用降低Tigit受體的表面表現。
胞啃作用是其中細胞表面分子從供體細胞轉移到受體細胞的一種現象 [Joly E等人 2003 Nat. Immunol;Machlenkin A等人 2008 Cancer Res.;Beum PV等人 2008 J. Immunol;Rossi EA等人 2013 Blood]。經由Fcγ受體(FcγR)的抗體誘導的胞啃作用導致細胞表面上受體的下調 [Carlsten M等人 2016 Clin Cancer Res;Beum PV等人 2011 J. Immunology]。因此,通過胞啃作用對標靶受體的下調可能導致抑制信號傳導。鑒於這些觀察結果,將有可能的是,hu1217-2-2/IgG1可能在FcγR+
細胞的存在下誘導Tigit受體的胞啃作用,從而導致較低的表面表現。為瞭解決這一可能性,將Jurkat/Tigit細胞與表現各種FcγR(包括FcγRIIAH131、FcγRIIB、FcγRIIIAV158
)的HEK細胞與生物素標記的hu1217-2-2/IgG1wt(包含與hu1217-2-2/IgG1mf和野生型IgG1 Fc區相同的VL和VH序列的人源化抗體)或hu1217-2-2/IgG1mf一起孵育過夜。通過用SA-APC(Biolegend)染色來確定Tigit受體的表面表現。如在圖8中所示,與陰性對照人IgG處理的細胞相比,hu1217-2-2/IgG1而非hu1217-2-2/IgG1mf導致Tigit表面表現的顯著降低,表明Jurkat/Tigit細胞上的表面Tigit的減少是FcγR結合依賴性的。此外,10%人血清(含有高水平的內源性IgG)的存在可以部分地降低FcγRIIAH131
介導的或FcγRIIIAV158
介導的、而非FcγRIIB介導的Tigit受體的胞啃作用,表明FcγRIIB可以在體內通過抗Tigit mAb(例如,hu1217-2-2/IgG1wt)在降低Tigit表面表現方面起著關鍵作用。這些觀察結果也與先前的發現 [Ganesan LP等人 2012 J Immunol 189:4981-8;Taylor RP等人 2015 Blood 125:762-6] 一致。
實例10:抗Tigit抗體的ADCC和CDC效應子功能
如下所述使用體外測定來確定抗Tigit抗體在人初級PBMC中誘導ADCC和CDC的能力。
使用人PBMC作為靶細胞的ADCC
建立基於流式細胞術的ADCC測定以確定Tigit抗體是否可以在Tigit+ T細胞中誘導ADCC。通過共轉導含有CD16 V158
(V158等位基因)和FcRγ cDNA的表現質粒,從NK92MI細胞(ATCC)中產生測定效應細胞株NK92MI/CD16V細胞。用PHA(1 μg/ml)刺激來自健康供體的人PBMC,以上調Tigit表現。如在圖99A及圖9B中所示,T細胞(包括CD4+
效應子(CD3+
CD4+
Foxp3-
)、CD8+
和調節性T細胞(CD4+
Foxp3+
))全部都表現顯著量的Tigit。將這些活化的PBMC(來自3個健康供體)用作靶細胞。在Tigit抗體(hu1217-2-2/IgG1mf或hu1217-2-2/IgG1wt,30 μg/mL)或對照抗體(陽性對照抗CD3抗體OKT3(5 μg/ml,Biolegend)或陰性對照人IgG,30 μg/mL)的存在下,將熒光染料CFSE標記的NK92MI/CD16V細胞(5x104
個)與相同數量的靶細胞共培養40小時。與人IgG和hu1217-2-2/IgG1mf相比,hu1217-2-2/IgG1wt可以經由ADCC導致Treg的中度減少。然而,在總T細胞和CD8+
T細胞中未觀察到顯著的ADCC作用(圖9A及圖9B)。
使用人PBMC作為靶細胞的CDC
通過使用預活化的人PBMC和來自健康供體的新鮮自體血清確定hu1217-2-2/IgG1mf和hu1217-2-2/IgG1wt是否會引發CDC。通過Celltiter glo測定套組(Promega(中國北京))來確定通過CDC的細胞裂解。簡言之,將PBMC用PHA(10 μg/mL)預活化3天,並且然後在RPMI1640加自體血清(15%)和抗Tigit或對照抗體(0.01-100 μg/mL)中於37ºC下孵育過夜。通過在反應結束時細胞裂解之後從活細胞釋放的ATP的減少來測定由於CDC引起的細胞死亡。將抗MHC-I A、B、C用作陽性對照。使用96孔熒光計(PHERA Star FS, BMG LABTECH)進行熒光讀數,並且從相對熒光單元(RFU)讀數計算CDC活性如下:%CDC活性 = [(RFU測試 - RFU背景) / (在總細胞裂解下的RFU - RFU背景)] x 100。實驗結果表明,使用從兩個不同供體分離的PBMC,hu1217-2-2/IgG1mf和hu1217-2-2/IgG1wt兩者都沒有可檢測的CDC。相反,陽性對照抗體抗MHC-I誘導顯著的CDC活性(圖10)。
實例11:Hu1217-2-2/IgG1的pH依賴性結合親和力
為了研究pH是否會影響Hu1217-2-2/IgG1的結合特性,在pH 7.4和pH 6.0的運行緩衝液中進行標靶結合SPR測試以進行比較。抗體hu1217-2-2/IgG1被固定到CM5芯片(GE)上。使TIGIT-his的系列稀釋液在pH 7.4或pH 6.0的運行緩衝液HBS中的固定的hu1217-2-2/IgG1上流過。
如下表7中列出的結果所示,與在pH 7.4(生理pH)下獲得的數據相比,hu1217-2-2/IgG1在pH 6.0(與腫瘤微環境的pH類似的酸性pH)下顯示出針對人TIGIT的更高的結合親和力(KD)和更強的結合信號(Rmax)。這些結果表明抗體作為靶向腫瘤環境中的TIGIT陽性淋巴細胞的治療劑的潛在優勢,因為hu1217-2-2/IgG1可能更具選擇性地靶向腫瘤微環境中的TIGIT陽性淋巴細胞,同時具有較低的與外周淋巴細胞的激活相關的潛在毒性。
表7. 通過SPR在pH 7.4和pH 6.0下的hu1217-2-2/IgG1的結合親和力
無
圖1是Tigit-mIgG2a(上圖)和Tigit-huIgG1(下圖)的示意圖。其中,Tigit ECD:Tigit細胞外結構域。N:N末端。C:C末端。
圖2A是抗Tigit抗體Vh(A)區的系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign軟件,對候選抗Tigit抗體的Vh和Vk序列進行比對。序列同源性顯示在系統發生樹中。
圖2B是抗Tigit抗體Vk(B)區的系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign軟件,對候選抗Tigit抗體的Vh和Vk序列進行比對。序列同源性顯示在系統發生樹中。
圖3是通過表面等離子體共振(SPR)確定純化的鼠抗Tigit抗體的親和力。
圖4A及圖4B是通過流式細胞術確定Tigit結合。
圖5A是顯示抗Tigit mAb對Tigit-配位體相互作用的抑制的示意圖。
圖5B是通過流式細胞術確定可溶性Tigit(Tigit-huIgG1融合蛋白)與表現Tigit配位體的HEK293細胞(HEK293/PVR或HEK293/PVR-L2)的結合。通過添加連續稀釋的抗Tigit抗體定量地測量對Tigit-配位體相互作用的阻斷。以兩次重複的平均值 ± SD顯示結果。
圖6是通過抗Tigit mAb激活CMV特異性人T細胞。在抗Tigit抗體的存在下,用CMV肽脈衝的靶細胞HCT116細胞(104
)刺激人CMV肽(NLVPMVATV,495-503)-敏化的HLA-A2.1+
PBMC(4 x 104
)過夜。通過ELISA確定培養上清液中的IFN-γ。所有條件都進行三次重複。結果顯示為平均值 ± SD。
圖7A是抗Tigit mAb促進NK細胞介導的細胞毒性。在工程改造的NK92MI/Tigit-DNAM-1穩定細胞株上的Tigit和DNAM-1表現。
圖7B是抗Tigit mAb促進NK細胞介導的細胞毒性。通過如實例8中所述的LDH(乳酸脫氫酶)釋放測定來確定hu1217-2-2/IgG1mf(0.007-30 μg/ml)的存在下NK92MI/Tigit-DNAM-1細胞對SK-MES-1/PVR細胞的殺死。以三次重複的平均值 ± SD顯示結果。
圖8是抗Tigit mAb hu1217-2-2/IgG1wt經由FcγR介導的胞啃作用降低Tigit受體的表面表現。在生物素標記的抗Tigit mAb的存在下,將Jurkat/Tigit細胞與表現FcγR的HEK293細胞在完全培養基中孵育過夜。在一些情況下,添加10%人AB血清以確定大量人IgG對胞啃作用的影響。通過用SA-APC(Biolegend)染色來確定Tigit受體的表面表現。通過流式細胞術確定MFI。所有數據點都是兩次重複。以平均值 ± SD顯示結果。
圖9A是抗Tigit mAb對人外周血單核細胞(PBMC)的ADCC作用。通過流式細胞術確定在來自健康供體的PHA刺激的PBMC上的Tigit表現。CD4+
(CD4+
Foxp3-
)、CD8+
T效應子和調節性T細胞(Treg、CD4+
Foxp3+
)均表現顯著水平的Tigit(18%-41%)。所顯示的數據是來自3個健康供體的代表性結果。
圖9B是抗Tigit mAb對人外周血單核細胞(PBMC)的ADCC作用。在Tigit mAb(30 μg/mL)或對照抗體(5μg/ml的OKT3作為陽性對照,並且30μg/ml的huIgG作為陰性對照)的存在下,使用CD16+
人NK細胞株NK92MI/CD16V作為效應細胞並使用PHA刺激的PBMC作為靶細胞進行ADCC測定,持續42小時。通過流式細胞術確定CD3+
、CD8+
T細胞和Treg的百分比。
圖10是抗Tigit mAb對人PBMC的CDC作用。使用PHA刺激的PBMC作為靶細胞並使用自體血清作為補體來源進行CDC測定。在預活化的PBMC與在終濃度為15%自體血清中的抗Tigit mAb(0.01-100 µg/ml)共培養3天之後,通過細胞滴度發光測定來測量CDC的百分比(y軸),並如實例11中所述進行計算。顯示了來自供體A和B的數據。將HuIgG用作陰性對照,然而將抗MHC-A、B、C用作陽性對照。
Claims (14)
- 一種抗體或其抗原結合片段,該抗體或其抗原結合片段能夠與人Tigit結合,該抗體或其抗原結合片段包含:(a)重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO 13的VH-CDR2胺基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3胺基酸序列;以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO 7的VL-CDR2胺基酸序列和SEQ ID NO 8的VL-CDR3胺基酸序列;或(b)重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO 4的VH-CDR2胺基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3胺基酸序列;以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO 7的VL-CDR2胺基酸序列和SEQ ID NO 8的VL-CDR3胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其中該抗體是人源化抗體分子。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其包含重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 19、14或9的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其包含輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 21、16或11的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其包含:(a)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 19的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 21的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(b)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 19的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 16的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(c)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 19的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 11的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(d)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 9的 胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 11的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(e)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 9的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 16的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(f)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 9的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 21的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(g)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 14的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 11的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;(h)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 14的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 16 的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;或(i)重鏈可變結構域,該重鏈可變結構域與SEQ ID NO 14的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,以及輕鏈可變結構域,該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO 21的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其包含:(a)重鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 19的胺基酸序列,以及輕鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 21的胺基酸序列;(b)重鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 9的胺基酸序列,以及輕鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 11的胺基酸序列;或(c)重鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 14的胺基酸序列,以及輕鏈可變結構域,其包含SEQ ID NO 16的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其中該抗體包含以下中的一種或多種:(a)在SEQ ID NO 14的位置24處具有T至A突變的重鏈;(b)在SEQ ID NO 14的位置37處具有I至V突變的重鏈;(c)在SEQ ID NO 16的位置58處具有V至I突變的輕鏈。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,其中該抗原結合片段是Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv(ScFv)。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段,該抗體或該抗原結合片段包含IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的亞類的重鏈恒定區或其變異體,以及κ或λ類型的輕鏈恒定區或其變異體。
- 一種醫藥組合物,該醫藥組合物包含如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的抗體或抗原結合片段、以及醫藥上可接受的賦形劑。
- 如申請專利範圍第10項所述的組合物,其進一步包含第二治療劑。
- 一種如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的抗體或抗原結合片段在製備用於治療癌症或腫瘤或感染性疾病的藥物的用途。
- 如申請專利範圍第12項所述的用途,其中該抗體或該抗原結合片段與第二治療劑或手術組合給予,其中該第二治療劑或該手術選自化學療法、靶向療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫的療法、細胞因子、外科手術、輻射手術、共刺激分子的激活劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗或細胞免疫療法。
- 如申請專利範圍第12項所述的用途,其中該感染性疾病是病毒感染。
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