CN112513080A - Vista抗原结合分子 - Google Patents
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Abstract
公开了VISTA抗原结合分子。还公开了编码VISTA抗原结合分子的核酸和表达载体、包含VISTA抗原结合分子的组合物和其使用方法。
Description
本申请要求于2018年3月29日提交的PCT/EP2018/058258、2018年9月7日提交的GB1814562.3和2018年11月5日提交的US 16/180,949的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用合并于此。
发明领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及抗体技术。本发明还涉及医学药物治疗和预防方法。
发明背景
已在多种实体瘤和淋巴瘤中发现了髓源性抑制细胞(MDSC)介导的免疫反应抑制。MDSCs在进展期结直肠癌中升高(Toor等，Front Immunol.2016；7:560)。在乳腺癌中也观察到了MDSCs，并且晚期乳腺癌患者外周血MDSCs的百分比升高(Markowitz等，Breast CancerRes Treat.2013年7月；140(1)：13-21)。MDSC丰度还与实体瘤的不良预后相关(Charoentong等，Cell Rep.2017年1月3；18(1)：248-262)。
MDSC通过多种机制抑制T细胞，包括产生活性氧、一氧化氮和精氨酸酶。这些最终导致DC、NK和T细胞活性受到抑制并增加了肿瘤负担(Umansky等人，Vaccines(Basel)(2016)4(4)：36)。MDSC还通过产生可溶性因子，例如基质金属蛋白酶、VEGF、bFGF、TGF-β和S100A8/A9来促进肿瘤的发展和转移，这些因子促进新血管形成、侵袭、增殖和转移。
靶向含V型免疫球蛋白域的T细胞活化抑制剂(VISTA)一种解除MDSC介导的效应免疫细胞功能抑制的有效治疗策略，VISTA是一种主要在MDSCs上表达的免疫检查点分子。
WO 2017/137830 A1公开了抗VISTA抗体VSTB174，例如在段落[00221]中公开，它包含了抗VISTA抗体VSTB112的可变区域。段落[00362]公开了VSTB123包含VSTB174的可变区。WO 2017/137830 A1的实施例25在段落[0417]和图42A公开了mIgG2a抗体VSTB123能够抑制MB49肿瘤模型中的肿瘤生长。段落[0418]和图42A公开显示，相反地，以IgG2a LALA形式提供的相同抗体VSTB124不抑制肿瘤生长；参见段落[0408]。基于这些结果，实施例25在段落[0419]中得出结论，抗VISTA抗体治疗的功效可能需要活性Fc。因此，提出的抗VISTA抗体的作用机制如图47所示(参见段落[0053]的图47的图例)，涉及NK细胞表达的Fc介导的FcγRIII的结合。
Le Mercier等人，Cancer Res.(2014)74(7)：1933-44中公开了仓鼠单克隆抗VISTA抗体mAb13F3抑制B16OVA和B16-BL6黑色素瘤模型中的肿瘤生长。第1942页的左右两段分别教导VISTA mAb的免疫原性和FcR结合活性可能是实现最佳靶标中和作用和治疗功效的关键限制因素。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种任选分离的抗原结合分子，其能够结合VISTA并抑制VISTA介导的信号转导，而不依赖于Fc介导的功能。
还提供了一种任选分离的抗原结合分子，其能够与VISTA结合并抑制VISTA介导的信号转导，其中所述抗原结合分子不能诱导Fc介导的抗体效应子功能。
在一些实施方式中，抗原结合分子不能诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，和/或不能诱导抗体依赖的细胞介导吞噬(ADCP)，和/或不能诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)。
还提供了一种任选分离的抗原结合分子，其能够与VISTA结合并抑制VISTA介导的信号传导，其中所述抗原结合分子不与Fcγ受体结合和/或所述抗原结合分子不与C1q结合。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够在Ig样V型结构域中结合VISTA。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含或由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子不与IGN175A竞争结合VISTA(例如，通过表位结合分析所确定的，例如如实施例8中所述)。
在一些实施方式中，抗原结合分子不能够结合由SEQ ID NO：275的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
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具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：137的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：138的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：139的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：127的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：144的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：151的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：158的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：165的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：170的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：177的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：179的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：246的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：247的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：195的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：197的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：200的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：203的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：297或SEQ ID NO：299之一的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：297的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：299的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：301的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：302的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：303的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：276的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：282的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：285的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：287的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：62的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：95的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：143的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：150的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：157的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：102的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：119的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：126的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：183的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：188的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：196的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：199的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：202的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：133的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：136的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：168的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：176的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合人VISTA以及小鼠VISTA和食蟹猕猴VISTA中的一种或多种。
还提供了任选分离的抗原结合分子，其包含(i)根据本发明的抗原结合分子，和(ii)能够结合VISTA以外的抗原的抗原结合分子。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合在细胞表面表达VISTA的细胞。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够抑制VISTA和VISTA结合伴侣之间的相互作用。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够抑制VISTA介导的信号转导。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够增加效应免疫细胞的增殖和/或细胞因子产生。
还提供了包含根据本发明的抗原结合分子的嵌合抗原受体(CAR)。
还提供了一种或多种任选分离的编码根据本发明的抗原结合分子或CAR的核酸。
还提供了一种或多种表达载体，其包含根据本发明的一种或多种核酸。
还提供了一种细胞，其包含根据本发明的抗原结合分子，CAR，核酸或多种核酸，表达载体或多种表达载体。
还提供了一种方法，所述方法包括在适合从核酸或表达载体中表达抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含根据本发明的一种或多种核酸，或一种或多种表达载体的细胞。
还提供了包含根据本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体或细胞的组合物。
在一些实施方式中，所述组合物还包含能够抑制由除VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂，其中除VISTA以外的免疫检查点抑制剂任选地选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA。
还提供了根据本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物，用于医学治疗或预防的方法。
还提供了本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物，用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法。
还提供了本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物在制备用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法的药物中的用途。
还提供了一种治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物。
在一些实施方式中，所述癌症选自：含有表达VISTA的细胞的癌症、含有表达VISTA的细胞浸润的癌症、含有表达VISTA的癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢肿瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
还提供了本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物，用于治疗或预防病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSCs)的疾病的方法。
还提供了本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物在制备用于治疗或预防在病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法的药物中的用途。
还提供了一种治疗或预防在病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物。
在一些实施方式中，所述方法还包括给予能够抑制由除VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂，任选地，其中除VISTA以外的免疫检查点分子选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
还提供了一种抑制VISTA介导的信号传导的方法，其包括使表达VISTA的细胞与根据本发明的抗原结合分子接触。
还提供了一种抑制髓源性抑制细胞(MDSC)活性的方法，所述方法包括使MDSC与根据本发明的抗原结合分子接触。
还提供了一种增加效应子免疫细胞的数目或活性的方法，所述方法包括使用根据本发明的抗原结合分子抑制表达VISTA的细胞的活性。
还提供了一种任选分离的体外复合物，其包含与VISTA结合的根据本发明的抗原结合分子。
还提供了一种包括使含有或怀疑含有VISTA的样品与根据本发明的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与VISTA的复合物的形成的方法。
还提供了一种对受试者作选择或分层次以便用于VISTA靶向药物治疗的方法，所述方法包括将来自受试者的样品与根据本发明的抗原结合分子体外接触，并检测抗原结合分子与VISTA的复合物形成。
还提供了根据本发明的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后剂的用途。
还提供了根据本发明的抗原结合分子在用于检测、定位或成像癌症的方法中的用途，任选地其中所述癌症选自：含有表达VISTA的细胞的癌症、含有表达VISTA的细胞浸润的癌症、含有表达VISTA的癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢肿瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
说明
与已知的抗VISTA抗体相比，本发明涉及具有新颖和/或改进性能的新型VISTA结合分子。
本发明人制备了与VISTA的细胞外区域中的特定目标区域结合的抗原结合分子。与现有技术中公开的VISTA结合抗原结合分子相比，本发明的VISTA结合分子具有所需的生物物理和功能性质的组合。
特别地，本文描述的VISTA结合分子被证明能够通过不需要Fc介导的功能的机制拮抗VISTA介导的信号转导。发明人证明，本文所述的包含Fc的VISTA结合分子缺乏与Fcγ受体和/或C1q结合的能力，能够在体内提供治疗性抗癌作用。
发明人首次建立了可以通过不需要Fc介导的效应子功能的机制(例如，针对表达VISTA的细胞的ADCC/ADCP/CDC)直接拮抗VISTA介导的信号传导。
本公开的VISTA结合分子靶向一个VISTA的区域，该区域不同于已知的抗VISTA抗体靶向的区域。靶向VISTA特定区域的抗原结合分子能够拮抗VISTA介导的信号传导，而无需Fc介导的效应子功能。
因此，本文公开的VISTA结合分子可用于抑制VISTA介导的信号转导而不消耗表达VISTA的细胞。这很重要，因为VISTA在不希望被消耗的细胞上表达。因此，本文公开的VISTA结合分子能够抑制VISTA介导的信号传导，同时使不良副作用最小化。
还有利地显示了本文公开的VISTA结合分子能够从VISTA介导的抑制作用中释放T细胞。具体地，本文公开的VISTA结合分子显示出能够增加T细胞增殖和在表达VISTA或VISTA的细胞存在下培养的T细胞产生，例如IFNγ和TNFa。
VISTA，结合伴侣和VISTA介导的信号传导
含V型免疫球蛋白结构域的T细胞活化抑制剂(VISTA；也称为例如B7-H5、SISP1、PD-1H)是由UniProt Q9H7M9鉴定的蛋白，其具有示于SEQ ID NO：1(Q9H7M9-1，v3)的氨基酸序列。VISTA的结构和功能如Lines等人，Cancer Res。(2014)74(7)：1924-1932中所述，其通过引用整体并入本文。VISTA是一个约50kDa的I型单次跨膜分子，可作为免疫检查点，由C10orf54基因编码。VISTA的胞外结构域与PD-L1同源。
SEQ ID NO：1的N-末端32个氨基酸构成信号肽，因此VISTA的成熟形式(即在加工去除信号肽后)具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：1的第33至194位形成胞外结构域(SEQ ID NO：3)，第195至215位形成跨膜结构域(SEQ ID NO：4)，而第216至311位形成细胞质结构域(SEQ ID NO：5)。胞外结构域包含Ig样V型结构域(SEQ ID NO：1的33至168位，如SEQ ID NO：6所示)。
在本说明书中，“VISTA”是指来自任何物种的VISTA，并且包括来自任何物种的VISTA同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
如本文所用，蛋白质的“片段”、“变体”或“同源物”可以任选地表征为与参照蛋白(例如，参照同种型)的氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，参照蛋白的片段、变体、同种型和同源物可以通过执行参照蛋白所执行的功能的能力来表征。
“片段”通常是指参照蛋白的一部分。“变体”通常是指具有包含相对于参照蛋白的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其他修饰，但与参照蛋白的氨基酸序列保留相当程度的序列同一性(例如，至少60％)的氨基酸序列的蛋白质。“同种型”通常是指由与参照蛋白的物种相同的物种表达的参照蛋白的变体。“同源物”通常是指与参照蛋白的物种相比，由不同物种产生的参照蛋白的变体。同源物包括直系同源物。
“片段”可以具有任何长度(以氨基酸数目计)，尽管可以任选地为参照蛋白(即衍生出该片段的蛋白质)长度的至少20％，并且可以具有参照蛋白长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之一的最大长度。VISTA的片段的最小长度可以为10、20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸之一，最大长度可以为20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸之一。
在一些实施方式中，VISTA是来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类或人)的VISTA和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠科动物)的VISTA。VISTA的同种型、片段、变体或同源物可以可选地表征为与来自给定物种(例如人类)的未成熟或成熟VISTA同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如，具有参照VISTA的功能特性/活性，而该功能特性/活性是由合适的分析方法所确定的。例如，VISTA的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与VSIG-3和/或PSGL-1有关联。
在一些实施方式中，VISTA包含或由与SEQ ID NO：1或2具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，VISTA的片段包含或由与SEQ ID NO：2、3或6之一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
VISTA是B7蛋白质家族的成员，主要由白细胞表达，尤其是CD14+单核细胞(包括单核细胞衍生的抑制细胞(MDSC))和CD33+髓样细胞表达。VISTA也由CD56+NK细胞、树突状细胞表达，并在CD4+和CD8+T细胞上表达程度较低。VISTA在MDSC，尤其是浸润肿瘤的MDSC以及浸润肿瘤的髓样DC(Le Mercier等人，Cancer Res.(2014)74(7)：1933-44)，以及与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)和中性粒细胞上高表达。
有证据表明，VISTA可以同时充当T细胞的配体和受体，从而抑制T细胞效应子功能并维持外周耐受性；过度表达VISTA的肿瘤逃避了免疫控制并且比不过度表达VISTA的肿瘤生长更快(Wang等人，Journal of Experimental Medicine.(2011)208(3)：577-92；Lines等人，Cancer Res.(2014)74(7)：1924-1932)。VISTA已被证明是CD4+T细胞上的一种共抑制受体或T细胞的一种共抑制配体。据报道，VISTA-/-CD4+T细胞比野生型CD4+T细胞显示出更强的抗原特异性增殖和细胞因子产生，这表明VISTA在CD4+T细胞上起抑制受体的作用。已显示使用单克隆抗VISTA抗体阻断VISTA功能可增强肿瘤微环境中肿瘤反应性T细胞的浸润、增殖和效应子功能(Le Mercier等人，Cancer Res.(2014)74(7):1933-4)。
已提出VISTA与VSIG-3(IGSF11)相互作用-参见例如Wang等人，J Immunol(2017)，198(1Supplement)154.1，其通过引用整体并入本文。通过VISTA将VSIG-3与活化的T细胞结合可抑制T细胞增殖，并减少细胞因子和趋化因子(例如IFN-γ、IL-2、IL-17、CCL5/RANTES、CCL3/MIP-1a和CXCL11/I-TAC)的产生。
VSIG-3是由UniProt Q5DX21所鉴定的蛋白质。由人IGSF11基因编码的mRNA可变剪接产生三种不同的同种型：同种型1(UniProt：Q5DX21-1，v3；SEQ ID NO：7)；同种型2(UniProt：Q5DX21-2；SEQ ID NO：8)，其在第1至17位包含与SEQ ID NO：7不同的序列；和同种型3(UniProt：Q5DX21-3；SEQ ID NO：9)，其在第1至17位包含与SEQ ID NO：7不同的序列，并且还在第211-235位包含与SEQ ID NO：7不同的序列。
SEQ ID NO：7、8和9的N-末端22个氨基酸构成信号肽，因此VSIG-3同种型1、2和3的成熟形式(即在加工去除信号肽后)分别具有如SEQ ID NO：10、11和12所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：7和8的第23至241位形成VSIG-3同种型1和2(SEQ ID NO：13)的胞外结构域，而SEQ ID NO：9的第23至216位形成VSIG-3同种型3(SEQ ID NO：14)的胞外结构域。VSIG-3的跨膜结构域如SEQ ID NO：15所示，而胞质结构域如SEQ ID NO：16所示。胞外结构域包含Ig样V型结构域(如SEQ ID NO：17所示)，并且VSIG-3同种型1和2的胞外结构域另外包含Ig样C2型结构域(如SEQ ID NO：18所示)。
在本说明书中，“VSIG-3”是指来自任何物种的VSIG-3，并且包括来自任何物种的VSIG-3同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
VSIG-3片段的最小长度可以为10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸之一，最大长度可以为20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸。
在一些实施方式中，VSIG-3是来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类或人)的VSIG-3和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠科动物)的VSIG-3。VSIG-3的同种型、片段、变体或同源物可以可选地表征为与来自给定物种(例如人类)的未成熟或成熟VSIG-3同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如，具有参照VSIG-3的功能特性/活性，而该功能特性/活性是由合适的分析方法所确定的。例如，VSIG-3的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与VISTA有关联。
在一些实施方式中，VSIG-3包含或由与SEQ ID NO：7至12之一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，VSIG-3的片段包含或由与SEQID NO：10至14、17或18之一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
已提出VISTA与VSIG-8相互作用-参见例如WO/2016/090347 A1。VSIG-8是由UniProt P0DPA2(SEQ ID NO：19)所鉴定的蛋白质。SEQ ID NO：19的N-末端21个氨基酸构成信号肽，因此VSIG-8的成熟形式(即在加工去除信号肽后)具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：19的22至263位形成VSIG-8的胞外结构域(SEQ ID NO：21)。VSIG-8的跨膜结构域如SEQ ID NO：22所示，而胞质结构域如SEQ ID NO：23所示。胞外结构域包含Ig样V型结构域1(如SEQ ID NO：24所示)和Ig样V型结构域2(如SEQ ID NO：25所示)。
在本说明书中，“VSIG-8”是指任何物种的VSIG-8，包括来自任何物种的VSIG-8同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
VSIG-8片段的最小长度可以是10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸之一，最大长度可以是20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸之一。
在一些实施方式中，VSIG-8是来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类或人)的VSIG-8和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠科动物)的VSIG-8。VSIG-8的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与来自给定物种(例如人类)的未成熟或成熟VSIG-8同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如，具有参照VSIG-8的功能特性/活性，而该功能特性/活性是由合适的分析方法所确定的。例如，VSIG-8的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与VISTA有关联。
在一些实施方式中，VSIG-8包含或由与SEQ ID NO：19或20具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，VSIG-8的片段包含或由与SEQ IDNOs：20、21、24或25之一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
已提出VISTA与PSGL-1相互作用-参见例如WO 2018/132476 A1。PSGL-1同种型1是由UniProt Q14242-1(SEQ ID NO：323)所鉴定的蛋白质。PSGL-1同种型2是由UniProtQ14242-2(SEQ ID NO：324)所鉴定的蛋白质，与PSGL-1同种型1的不同之处在于，它在SEQID No：323的第1位之后还包含16个氨基酸。
SEQ ID NO：323N-末端的17个氨基酸构成信号肽，因此PSGL-1的成熟形式(即在加工去除信号肽后)具有如SEQ ID NO：325所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：323的18至320位形成PSGL-1的细胞外结构域(SEQ ID NO：326)。PSGL-1的跨膜结构域如SEQ ID NO：327所示，而胞质结构域如SEQ ID NO：328所示。胞外结构域包含12、10个氨基酸串联重复序列；重复区如SEQ ID NO：329所示。
在本说明书中，“PSGL-1”是指来自任何物种的PSGL-1，并且包括来自任何物种的PSGL-1同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
PSGL-1片段的最小长度可以是10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸之一，最大长度可以是20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸之一。
在一些实施方式中，PSGL-1是来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类或人)的PSGL-1和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠科动物)的PSGL-1。PSGL-1的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与来自给定物种(例如人类)的未成熟或成熟PSGL-1同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如，具有参照PSGL-1的功能特性/活性，而该功能特性/活性是由合适的分析方法所确定的。例如，PSGL-1的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与VISTA有关联。
在一些实施方式中，PSGL-1包含或由与SEQ ID NO：323或324具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，PSGL-1的片段包含或由与SEQID NO：325、326或329之一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
靶分子上特别感兴趣的区域
本发明的抗原结合分子被专门设计成靶向特别感兴趣的VISTA区域。采用两步法，通过分析预测的抗原性、功能和安全性来选择要靶向的VISTA区域。然后使用对应于目标区域的肽作为免疫原以产生特异性单克隆抗体，来制备对VISTA目标区域具有特异性的抗体，然后进行筛选以鉴定能够结合天然状态的VISTA的抗体。该方法提供了对抗体表位的精确控制。
本发明的抗原结合分子可以参考它们结合的VISTA区域来定义。本发明的抗原结合分子可以结合感兴趣的VISTA的特定区域。在一些实施方式中，抗原结合分子可以结合VISTA的线性表位，其由一个氨基酸的连续序列(即氨基酸一级序列)组成。在一些实施方式中，抗原结合分子可以结合VISTA的构象表位，其由氨基酸序列的一个氨基酸的不连续序列组成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与VISTA结合。在一些实施方式中，抗原结合分子结合VISTA的细胞外区域(例如SEQ ID NO：3所示的区域)。在一些实施方式中，抗原结合分子结合VISTA的Ig样V型结构域(例如SEQ ID NO：6所示的区域)。在一些实施方式中，抗原结合分子在对应于SEQ ID NO：1的61至162位的区域中(如SEQ ID NO：31所示)结合VISTA。
在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：322所示的VISTA区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：26所示的VISTA区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：27所示的VISTA区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：28所示的VISTA区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：29所示的VISTA区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：30所示的VISTA区域结合。
在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：271所示的VISTA区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：272所示的VISTA区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：273所示的VISTA区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：274所示的VISTA区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ IDNO：275所示的VISTA区域。
抗体结合的肽/多肽的区域可以由技术人员使用本领域所熟知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体分析、肽扫描、诱变作图、氢-氘交换质谱分析、噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这样的方法例如在Gershoni等人，BioDrugs，2007，21(3)：145-156中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合与某一抗体所结合的VISTA区域相同的VISTA区域或重叠的VISTA区域，所述抗体包含如本文所述的抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8，V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12之一的VH和VL序列。
如本文所用，“肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸单体的链。肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是两个或更多个肽的聚合物链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：1、2、3、6或31之一的氨基酸序列或由其组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：271的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：272的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：273的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：274的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：275的氨基酸序列组成的肽。
抗原结合分子结合给定肽/多肽的能力可以通过技术人员众所周知的方法来分析，包括通过ELISA、免疫印迹(例如蛋白质印迹)、免疫沉淀、表面等离振子共振(SPR；参见例如Hearty等人，Methods Mol Biol(2012)907：411-442)或生物膜层反射光干涉(参见例如Lad等人，(2015)J Biomol Screen 20(4)：498-507)进行分析。
在抗原结合分子能够结合包含参考氨基酸序列的肽/多肽的实施方式中，所述肽/多肽可以在参考氨基酸序列的一个或两个末端包含一个或多个附加的氨基酸。在一些实施方式中，所述肽/多肽包含在参考氨基酸序列的一个或两个末端上附加的例如1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、10-20、10-30、10-40、10-50、20-30、20-40或20-50个氨基酸。
在一些实施方式中，在参考序列的一个或两个末端(即，N-末端和C-末端)提供的附加的氨基酸与在VISTA的氨基酸序列的上下文中的参考序列末端的位置相对应。举例来说，如果抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：26的序列和在SEQ ID NO：26的C-末端的附加的两个氨基酸的肽/多肽，则附加的两个氨基酸可以是精氨酸和天冬酰胺，对应于SEQ IDNO：1的90和91位。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合由抗体结合的肽/多肽，所述抗体包含如本文所述的抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8，V4H1，V4H2，V4-C1，V4-C9，V4-C24，V4-C26、V4-C27，V4-C28，V4-C30，V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12之一的VH和VL序列。
髓源性抑制细胞(MDSC)
髓源性抑制细胞(MDSC)是髓系细胞谱系的一组异质性免疫细胞，其特征在于免疫抑制表型。MDSC生物学在Kumar等人，Trends Immunol.(2016)；37(3)：208-220中进行了综述，其通过引用整体并入本文。
MDSC的特点是具有许多生化和基因组特征，这些特征将这些细胞与成熟的髓样细胞(即巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)区分开来，例如：NADPH氧化酶(Nox2)的表达增加，活性氧(ROS)的产生增加(如超氧阴离子(O2-)，过氧化氢(H2O2)和过氧亚硝酸盐(PNT；ONOO-))；精氨酸酶1和一氧化氮合酶2(nos2)的表达增加，一氧化氮(NO)的产生增加；c/EBPβ和STAT3的表达增加；IRF8表达降低；并增加了S100A8/9蛋白的生成。
MDSC有两种不同的类型：在形态和表型上与嗜中性粒细胞相似的多形核MDSC(PMN-MDSC)，以及与单核细胞更相似的单核MDSC(M-MDSC)。MDSC的形态和表型特征如Marvel和Gabrilovich，J Clin Invest.2015年9月1日；125(9)：3356-3364中所述，其通过引用整体并入本文。在小鼠中，MDSC被广泛地识别为CD11b+Gr1+细胞。Gr-1hi细胞主要是PMN-MDSC，而Gr-1lo细胞主要是M-MDSC。基于Ly6C和Ly6G标记，可以更准确地识别这些子集；M-MDSC是CD11b+Ly6ChiLy6G–，而PMN-MDSC是CD11b+Ly6CloLy6G+。在人类中，MDSCs是在单核部分中鉴定的。PMN-MDSC是CD14–CD11b+CD33+CD15+或CD66b+细胞，M-MDSC是CD14+HLA-DR–/lo细胞。Lin–HLA-DR–CD33+MDSC的种群代表富集骨髓祖细胞的混合细胞群。
与MDSC介导的免疫抑制有关的因素包括精氨酸酶(ARG1)、诱导型NOS(iNOS)、TGF-β、IL-10和COX2的表达，半胱氨酸的螯合，T细胞的l-选择素表达降低以及Tregs的诱导。M-MDSC和PMN-MDSC采用不同的免疫抑制机制。M-MDSC通过产生NO和细胞因子抑制抗原特异性和非特异性T细胞应答，并且比PMN-MDSC具有更强的免疫抑制作用。PMN-MDSC通过产生ROS以抗原特异性方式抑制免疫反应。MDSC在病理上牵涉到癌症和感染性疾病的发生和发展。MDSC在人类疾病中的作用在Kumar等人，Trends Immunol.(2016)；37(3)：208-220(通过引用并入本文)和Greten等人，Int Immunopharmacol.(2011)11(7)：802-807中综述，其通过引用整体并入本文。
MDSC在肿瘤组织中含量丰富，并通过多种机制促进癌症的发展和进展，例如在Umansky等人，Vaccines(Basel)(2016)4(4)：36中综述。MDSC通过趋化因子表达被募集到肿瘤部位，并且肿瘤微环境中的促炎因子导致MDSC的免疫抑制功能显著上调。MDSC通过抑制效应免疫细胞的功能(例如效应T细胞和NK细胞的功能)，促进调节性T细胞的产生/活化，生长因子(如VEGF和bFGF)的产生以及ECM-修饰因子(例如基质金属蛋白酶)的产生，促进肿瘤的发展、新血管形成和转移。
可以通过参考VISTA的表达来表征MDSC。在本发明的各个方面的实施方式中，MDSC可以是“表达VISTA的MDSC”或“VISTA+MDSCs”。MDSC可以在细胞表面表达VISTA(即VISTA可以在细胞膜中或细胞膜上表达)。
抗原结合分子
本发明提供了能够结合VISTA的抗原结合分子。
“抗原结合分子”是指能够结合靶抗原的分子，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab')2、Fab2、双抗体、三抗体、scFv-Fc、小抗体、单域抗体(例如VhH)等)，只要它们表现出与相关靶分子的结合即可。
本发明的抗原结合分子包含能够结合靶抗原的部分。在一些实施方式中，所述能够结合靶抗原的部分包含能够特异性结合靶抗原的抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，能够结合靶抗原的部分包含能结合靶抗原的适配体或由适配体组成，所述适配体(例如核酸适体)能够结合靶抗原(如在Zhou和Rossi，Nat RevDrug Discov2017 16(3):181-202中综述)。在一些实施方式中，能够与靶抗原结合的部分包含抗原结合肽/多肽或由其组成，例如肽适配体、硫氧还蛋白、单体，anticalin、Kunitz域、avimer、knottin、fynomer、atrimer、DARPin、亲和体、纳米抗体(即单域抗体(sdAb))、亲和素、犰狳重复蛋白(ArmRP)、OBody或纤连蛋白–如在Reverdatto等人，Curr Top MedChem.2015；15(12)：1082-1101中所综述，其通过引用整体并入本文(也参见例如Boersma等人，J Biol Chem(2011)286：41273-85和Emanuel等人，Mabs(2011)3：38-48)。
本发明的抗原结合分子通常包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含能够特异性结合靶抗原的抗体的VH和VL。由VH和VL形成的抗原结合结构域在本文中也可以称为Fv区。
抗原结合分子可以是或可以包含抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。抗原结合分子可包含多于一个的多肽，它们一起形成抗原结合结构域。所述多肽可以共价或非共价结合。在一些实施方式中，所述多肽形成包含所述多肽的较大多肽的一部分(例如，在包含VH和VL的scFv的情况下，或在包含VH-CH1和VL-CL的scFab的情况下)。
抗原结合分子可以指多于一个的多肽(例如2、3、4、6或8个多肽)的非共价或共价复合物，例如包含两个重链多肽和两个轻链多肽的IgG样抗原结合分子。
可以使用能够结合VISTA的单克隆抗体(mAb)的序列设计和制备本发明的抗原结合分子。也可以使用/提供抗体的抗原结合区，例如单链可变片段(scFv)、Fab和F(ab')2片段。“抗原结合区”是能够与给定抗体特异的靶标结合的抗体的任何片段。
抗体通常包含六个互补决定区CDR；三个在重链变量(VH)区中：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，以及三个在轻链可变(VL)区中：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。六个CDR共同定义了抗体的互补位，它是抗体与靶抗原结合的部分。
VH区和VL区包含每个CDR两侧的框架区(FR)，这些框架区为CDR提供了支架。从N末端到C末端，VH区包含以下结构：N末端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C末端；以及VL区包含以下结构：N末端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C末端。
定义抗体CDR和FR有几种不同的惯例，例如Kabat等人在《具有免疫学意义的蛋白质序列》第5版，美国国立卫生研究院公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达(1991)，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)中描述的惯例，以及VBASE2，如Retter等，Nucl.Natl.Acad.Sci.(2005)33(增刊1)：D671-D674中所述。本文所述抗体克隆的VH区和VL区的CDR和FR是根据国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统定义的(LeFranc等人，NucleicAcids Res.(2015)43(数据库期号)：D413-22)，它使用IMGT V-DOMAIN编号规则，如Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.(2003)27:55-77中所述。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合VISTA的抗原结合分子的CDR。在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合VISTA的抗原结合分子的FR。在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合VISTA的抗原结合分子的CDR和FR。也就是说，在某些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合VISTA的抗原结合分子的VH区和VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含VH区和VL区，其是或是衍生自本文所述的VISTA结合抗体克隆(即抗VISTA抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12)的VH/VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(1)至(18)之一的VH区：
(1)(4M2-C12衍生的共有序列)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：305的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：306的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：307的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(2)(V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(3)(V4-C1)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：277的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(4)(V4-C9)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：286的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(5)(4M2-C12/V4H1/V4H2共有序列)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：244的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(6)(4M2-C12、4M2-B4、V4H2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(7)(V4H1)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(8)(2M1-B12、2M1-D2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(9)(4M2-C9、5M1-A11)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(10)(4M2-D9)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(11)(1M2-D2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(12)(4M2-D5)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：144的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(13)(4M2-A8)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：158的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(14)(9M2-C12)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：170的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(15)(13D5衍生)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：246的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(16)(13D5p)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(17)(13D5-1)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：195的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(18)(13D5-13)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：200的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(19)至(35)之一的VH区：
(19)(V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：292的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：293的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：281的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(20)(V4-C1、V4-C9)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：279的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：280的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：281的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(21)(4M2-C12)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(22)(4M2-B4)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(23)(V4H1)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(24)(V4H2)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(25)(2M1-B12)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(26)(4M2-C9)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(27)(2M1-D2)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(28)(4M2-D9)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：110的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：111的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：112的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(29)(1M2-D2)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：123的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：124的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：125的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(30)(5M1-A11)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：134的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：135的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(31)(4M2-D5)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：147的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：148的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：149的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：135的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(32)(4M2-A8)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：161的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：162的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：163的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：135的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(33)(9M2-C12)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：172的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：173的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：174的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：175氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(34)(13D5p、13D5-1)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：186的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：187的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(35)(13D5-13)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：186的氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：201的氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含VH区，所述VH区包含根据以上(1)至(18)之一的CDR和根据以上(19)至(35)之一的FR。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(36)至(57)之一的VH区：
(36)包含根据(1)的CDR和根据(19)、(20)、(21)、(22)、(23)或(24)的FR的VH区。
(37)包含根据(2)的CDR和根据(19)的FR的VH区。
(38)包含根据(3)的CDR和根据(20)的FR的VH区。
(39)包含根据(4)的CDR和根据(20)的FR的VH区。
(40)包含根据(5)的CDR和根据(21)、(22)、(23)或(24)的FR的VH区。
(41)包含根据(6)的CDR和根据(21)的FR的VH区。
(42)包含根据(6)的CDR和根据(22)的FR的VH区。
(43)包含根据(6)的CDR和根据(24)的FR的VH区。
(44)包含根据(7)的CDR和根据(23)的FR的VH区。
(45)包含根据(8)的CDR和根据(25)的FR的的VH区。
(46)包含根据(8)的CDR和根据(27)的FR的VH区。
(47)包含根据(9)的CDR和根据(26)的FR的VH区。
(48)包含根据(9)的CDR和根据(30)的FR的VH区。
(49)包含根据(10)的CDR和根据(28)的FR的VH区。
(50)包含根据(11)的CDR和根据(29)的FR的VH区。
(51)包含根据(12)的CDR和根据(31)的FR的VH区。
(52)包含根据(13)的CDR和根据(32)的FR的VH区。
(53)包含根据(14)的CDR和根据(33)的FR的VH区。
(54)包含根据(15)的CDR和根据(34)或(35)的FR的VH区。
(55)包含根据(16)的CDR和根据(34)的FR的VH区。
(56)包含根据(17)的CDR和根据(34)的FR的VH区。
(57)包含根据(18)的CDR和根据(35)的FR的VH区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(58)至(76)之一的VH区：
(58)包含与SEQ ID NO：276的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(59)包含与SEQ ID NO：285的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(60)包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(61)包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(62)包含与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(63)包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(64)包含与SEQ ID NO：62的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(65)包含与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(66)包含与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(67)包含与SEQ ID NO：102的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(68)包含与SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(69)包含与SEQ ID NO：119的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(70)包含与SEQ ID NO：133的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(71)包含与SEQ ID NO：143的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(72)包含与SEQ ID NO：157的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(73)包含与SEQ ID NO：168的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(74)包含与SEQ ID NO：183的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(75)包含与SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
(76)包含与SEQ ID NO：199的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VH区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(77)至(96)之一的VL区：
(77)(4M2-C12衍生的共有序列)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：308的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(78)(C24/C26/C27共有序列)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：309的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(79)(V4-C 24、V4-C26)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：295的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(80)(V4-C27、V4-C30、V4-C31)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：300的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(81)(4M2-C12/V4H1/V4H2共有)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：245的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(82)(4M2-C12、4M2-B4，V4-C1，V4-C9，V4-C28)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(83)(V4H1)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(84)(V4H2)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(85)(2M1-B12、2M1-D2)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(86)(4M2-C9)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(87)(4M2-D9)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的LC-CDR3，
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一种氨基酸取代。
(88)(1M2-D2)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：127的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(89)(5M1-A11)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：137的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：138的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：139的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(90)(4M2-D5)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：151的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3；和
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(91)(4M2-A8)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：165的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(92)(9M2-C12)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：177的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：179的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(93)(13D5p衍生)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：247的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(94)(13D5p)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(95)(13D5-1)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：197的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列为的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(96)(13D5-13)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：203的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(97)至(120)之一的VL区：
(97)(V4-C1)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(98)(V4-C9)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(99)(V4-C24)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：296的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(100)(V4-C26)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：298的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(101)(V4-C27)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(102)(V4-C28)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：296的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(103)(V4-C30)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：296的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(104)(V4-C31)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：304的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(105)(4M2-C12)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(106)(4M2-B4)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(107)(V4H1)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(108)(V4H2)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(109)(2M1-B12)一个包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(110)(4M2-C9)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(111)(2M1-D2)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(112)(4M2-D9)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：117的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(113)(1M2-D2)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：130的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：131的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：132的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(114)(5M1-A11)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：140的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：141的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：142的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(115)(4M2-D5)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：154的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：155的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：156的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(116)(4M2-A8)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：166的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：155的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(117)(9M2-C12)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：180的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：181的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：182的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(118)(13D5p)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：191的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：192的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：193的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(119)(13D5-1)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：191的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：198的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：193的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(120)(13D5-13)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：191的氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：192的氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：204的氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中一个或多个的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含VL区，所述VL区包含根据以上(77)至(96)之一的CDR和根据以上(97)至(120)之一的FR。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(121)至(148)之一的VL区：
(121)包含根据(77)的CDR和根据(97)、(98)、(99)、(100)、(101)、(102)、(103)、(104)、(105)、(106)、(107)或(108)的FR的VL区。
(122)包含根据(78)的CDR和根据(99)、(100)或(101)的FR的VL区。
(123)包含根据(79)的CDR和根据(99)的FR的VL区。
(124)包含根据(79)的CDR和根据(100)的FR的VL区。
(125)包含根据(80)的CDR和根据(101)的FR的VL区。
(126)包含根据(82)的CDR和根据(97)的FR的VL区。
(127)包含根据(82)的CDR和根据(98)的FR的VL区。
(128)包含根据(82)的CDR和根据(102)的FR的VL区。
(129)包含根据(80)的CDR和根据(103)的FR的VL区。
(130)包含根据(80)的CDR和根据(104)的FR的VL区。
(131)包含根据(81)的CDR和根据(105)、(106)、(107)或(108)的FR的VL区。
(132)包含根据(82)的CDR和根据(105)的FR的VL区。
(133)包含根据(82)的CDR和根据(106)的FR的VL区。
(134)包含根据(83)的CDR和根据(107)的FR的VL区。
(135)包含根据(84)的CDR和根据(108)的FR的VL区。
(136)包含根据(85)的CDR和根据(109)的FR的VL区。
(137)包含根据(85)的CDR和根据(111)的FR的VL区。
(138)包含根据(86)的CDR和根据(110)的FR的VL区。
(139)包含根据(87)的CDR和根据(112)的FR的VL区。
(140)包含根据(88)的CDR和根据(113)的FR的VL区。
(141)包含根据(89)的CDR和根据(114)的FR的VL区。
(142)包含根据(90)的CDR和根据(115)的FR的VL区。
(143)包含根据(91)的CDR和根据(116)的FR的VL区。
(144)包含根据(92)的CDR和根据(117)的FR的VL区。
(145)包含根据(93)的CDR和根据(118)、(119)或(120)的FR的VL区。
(146)包含根据(94)的CDR和根据(118)的FR的VL区。
(147)包含根据(95)的CDR和根据(119)的FR的VL区。
(148)包含根据(96)的CDR和根据(120)的FR的VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以下(149)至(173)之一的VL区：
(149)包含与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(150)包含与SEQ ID NO：282的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(151)包含与SEQ ID NO：287的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(152)包含与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(153)包含与SEQ ID NO：297的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(154)包含与SEQ ID NO：299的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(155)包含与SEQ ID NO：301的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(156)包含与SEQ ID NO：302的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(157)包含与SEQ ID NO：303的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(158)包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(159)包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(160)包含与SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(161)包含与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(162)包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(163)包含与SEQ ID NO：95的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(164)包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(165)包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(166)包含与SEQ ID NO：126的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(167)包含与SEQ ID NO：136的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(168)包含与SEQ ID NO：150的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(169)包含与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(170)包含与SEQ ID NO：176的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(171)包含与SEQ ID NO：188的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(172)包含与SEQ ID NO：196的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
(173)包含与SEQ ID NO：202的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含根据以上(1)至(76)中任一项的VH区和根据以上(77)至(173)中任一项的VL区。
在根据本发明的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的实施方式中，该取代可以是保守取代，例如根据下表的取代。在一些实施方式中，中间列中的同一区块中的氨基酸被取代。在一些实施方式中，最右边一栏中同一行中的氨基酸被取代：
在一些实施方式中，取代可以是功能上保守的。即，在一些实施方式中，与等效的未取代分子相比，取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含取代的抗原结合分子的一种或多种功能性质(例如靶结合)。
抗体的抗原结合区的VH和VL区共同构成Fv区。在一些实施方式中，根据本发明的抗原结合分子包含与VISTA结合的Fv区或由其组成。在一些实施方式中，Fv的VH和VL区被提供为通过连接区连接的单个多肽，即单链Fv(scFv)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，免疫球蛋白重链恒定序列是或衍生自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM的重链恒定序列。
在一些实施方式中，免疫球蛋白重链恒定序列是人免疫球蛋白G1恒定序列(IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO：205)。SEQ ID NO：205的1至98位形成CH1区(SEQID NO：206)。SEQ ID NO：205的99至110位在CH1和CH2区域之间形成铰链区(SEQ ID NO：207)。SEQ ID NO：205的111至223位形成CH2区(SEQ ID NO：208)。SEQ ID NO：205的224至330位形成CH3区(SEQ ID NO：209)。
可以使用pFUSE-CHIg-hG1制备示例性的抗原结合分子，所述pFUSE-CHIg-hG1在CH3区域中包含D356E、L358M取代突变(根据EU编号编码的位置)。由pFUSE-CHIg-hG1编码的CH3区的氨基酸序列如SEQ ID NO：210所示。应当理解，根据对本文所述的抗原结合分子的Fc区的修饰，可以为CH3区提供进一步的取代。
在一些实施方式中，CH1区包含SEQ ID NO：206的序列或由其组成，或包含与SEQID NO：206的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，CH1-CH2铰链区包含SEQ ID NO：207的序列或由其组成，或包含与SEQ ID NO：207的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，CH2区包含SEQ ID NO：208的序列或由其组成，或包含与SEQ ID NO：208的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，CH3区包含SEQ ID NO：209或210的序列或由其组成，或包含与SEQ ID NO：209或210的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白κ恒定序列(IGKC；Cκ；UniProt：P01834-1，v2；SEQ ID NO：211)。在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白λ恒定序列(IGLC；Cλ)，例如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。在一些实施方式中，CL区包含SEQ ID NO：211的序列或由其组成，或包含与SEQ ID NO：211的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
抗体的抗原结合区的VL和轻链恒定(CL)区，以及VH区和重链恒定1(CH1)区共同构成Fab区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fab区，其包含VH、CH1、VL和CL(例如Cκ或Cλ)。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CH1的多肽(例如VH-CH1融合多肽)，和含有VL和CL的多肽(例如VL-CL融合多肽)。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CL的多肽(例如VH-CL融合多肽)和含有VL和CH的多肽(例如VL-CH1融合多肽)；也就是说，在一些实施方式中，Fab区是CrossFab区。在一些实施方式中，Fab或CrossFab的VH、CH1、VL和CL区被提供为通过连接区连接的单个多肽，即单链Fab(scFab)或单链CrossFab(scCrossFab)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含与VISTA结合的Fab区或由其组成。
在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子包含与VISTA结合的完整抗体或由其组成。如本文所用，“完整抗体”是指具有与免疫球蛋白(Ig)的结构基本相似的结构的抗体。例如，在Schroeder和Cavacini，J Allergy Clin Immunol.(2010)125(202)：S41-S52中描述了不同种类的免疫球蛋白及其结构，其通过引用整体并入本文。
G型免疫球蛋白(即IgG)是约150kDa的糖蛋白，包含两条重链和两条轻链。从N末端到C末端，重链包含VH，其后是包含三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区，类似地，轻链包含VL，其后是CL。根据重链，免疫球蛋白可以分为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，IgA(例如IgA1、IgA2)，IgD，IgE或IgM。轻链可以是κ(κ)或λ(λ)。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子包含与VISTA结合的IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM或由其组成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与VISTA至少是单价结合。结合价是指给定抗原决定簇的抗原结合分子中结合位点的数目。因此，在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含至少一个VISTA结合位点。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含多个VISTA结合位点，例如2、3或4个结合位点。结合位点可以相同或不同。在一些实施方式中，所述抗原结合分子对于VISTA是例如二价、三价或四价。
本发明的方面涉及多特异性抗原结合分子。“多特异性”是指抗原结合分子显示出与一个以上靶标的特异性结合。在一些实施方式中，所述抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含至少两个不同的抗原结合结构域(即至少两个抗原结合结构域，例如包含不同的VH和VL)。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子结合VISTA和另一靶标(例如VISTA以外的抗原)，因此至少是双特异性的。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。
应当理解，根据本发明的抗原结合分子(例如，多特异性抗原结合分子)可以包含能够与该抗原结合分子的特异性靶标结合的抗原结合分子。例如，能够结合VISTA和VISTA以外的抗原的抗原结合分子可以包括：(i)能够与VISTA结合的抗原结合分子，以及(ii)能够与VISTA以外的抗原结合的抗原结合分子。
还应当理解，根据本发明的抗原结合分子(例如，多特异性抗原结合分子)可以包含能够与该抗原结合分子的特异性靶标结合的抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。例如，根据本发明的抗原结合分子可以包括例如(i)能够结合VISTA的抗原结合多肽复合物，其包含轻链多肽(包含VL-CL结构)和重链多肽(包含VH-CH1-CH2-CH3结构)，和ii)能够结合VISTA以外的抗原的抗原结合多肽复合物，其包含轻链多肽(包含VL-CL结构)和重链多肽(包含VH-CH1-CH2-CH3结构)。
在一些实施方式中，较大的抗原结合分子(例如多特异性抗原结合分子)的组分抗原结合分子可以被称为例如作为较大抗原结合分子的“抗原结合结构域”或“抗原结合区”。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够结合VISTA的抗原结合分子和能够结合VISTA以外的抗原的抗原结合分子。在一些实施方式中，所述除VISTA以外的抗原是免疫细胞表面分子。在一些实施方式中，所述除VISTA以外的抗原是癌细胞抗原。在一些实施方式中，所述除VISTA以外的抗原是受体分子，例如细胞表面受体。在一些实施方式中，所述除VISTA以外的抗原是细胞信号传导分子，例如细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素或淋巴因子。在一些实施方式中，所述除VISTA以外的抗原是生长因子或激素。
癌细胞抗原是由癌细胞表达或过表达的抗原。癌细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌细胞抗原的表达可能与癌症有关。癌细胞抗原可以由癌细胞异常表达(例如，癌细胞抗原可以异常定位表达)，或者可以由癌细胞以异常结构表达。癌细胞抗原可能能够引发免疫反应。在一些实施方式中，所述抗原在癌细胞的细胞表面表达(即癌细胞抗原是癌细胞表面抗原)。在一些实施方式中，与本文所述的抗原结合分子结合的抗原的一部分展示在癌细胞的外表面上(即是细胞外的)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方式中，所述癌细胞抗原是其表达与癌症症状的发展、进展或严重性相关的抗原。与癌症相关的抗原可能与癌症的原因或病理有关，或者可能由于癌症而异常表达。在一些实施方式中，所述癌细胞抗原是与相应的非癌细胞(例如，源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比，其表达被癌细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平上)的抗原。在一些实施方式中，所述癌症相关抗原可以优先由癌细胞表达，而不由相应的非癌细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方式中，所述癌症相关抗原可以是突变的癌基因或突变的抑癌基因的产物。在一些实施方式中，与癌症相关的抗原可以是过度表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌症抗原、癌胚抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。
免疫细胞表面分子可以是在免疫细胞的细胞表面上或表面表达的任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。在一些实施方式中，被本发明的抗原结合分子结合的免疫细胞表面分子的一部分在免疫细胞的外表面上(即是细胞外的)。免疫细胞表面分子可以在任何免疫细胞的细胞表面表达。在一些实施方式中，免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞或先天性淋巴样细胞(ILC)或其前体(例如胸腺细胞或B前体细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞表面分子可以是共刺激分子(例如CD28、OX40、4-1BB、ICOS或CD27)或其配体。在一些实施方式中，免疫细胞表面分子可以是检查点分子(例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA)或其配体。
根据本发明的多特异性抗原结合分子可以以任何合适的形式提供，例如在Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2)：182-212中所描述的那些形式，其通过引用整体并入本文。合适的形式包括Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2)：182-212的图2中所示的形式：抗体缀合物，例如IgG2、F(ab’)2或CovX-抗体；IgG或IgG样分子，例如IgG、嵌合IgG、κλ-抗体常见HC；CH1/CL融合蛋白，例如scFv2-CH1/CL、VHH2-CH1/CL；“仅可变域”双特异性抗原结合分子，例如串联scFv(taFV)、三抗体、双抗体(Db)、dsDb、Db(kih)、DART、scDB、dsFv-dsFv、tandAb、三头抗体、串联dAb/VHH、三价dAb.VHH；非Ig融合蛋白，例如scFv2-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-白蛋白、taFv-毒素、微抗体、DNL-Fab2、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2、ImmTAC(TCR-scFv)；修饰的Fc和CH3融合蛋白，例如scFv-Fc(kih)、scFv-Fc(CH3电荷对)、scFv-Fc(EW-RVT)、scFv-fc(HA-TF)、scFv-Fc(SEED抗体)、taFv-Fc(kih)、scFv-Fc(kih)-Fv、Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc(SEED抗体)、DART-Fc、scFv-CH3(kih)、TriFabs；Fc融合体，例如双抗体、scDb-Fc、taFv-Fc、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、Fab-scFv-Fc、scFv4-Ig、scFv2-Fcab；CH3融合体，例如双抗体、scDb-CH3；IgE/IgM CH2融合，例如scFv-EHD2-scFv、scFvMHD2-scFv；Fab融合蛋白，例如Fab-scFv(双抗体)、Fab-scFv2(三抗体)、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-VHH、正交Fab-Fab；非Ig融合蛋白，例如DNL-Fab3、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2；不对称IgG或类IgG分子，例如IgG(kih)、IgG(kih)通用LC、ZW1 IgG通用LC、Biclonics通用LC、CrossMab、CrossMab(kih)、scFab-IgG(kih)、Fab-scFab-IgG(kih)、正交Fab IgG(kih)、DuetMab、CH3电荷对+CH1/CL电荷对、铰链/CH3电荷对、SEED-抗体、双特异性抗体、四合一CrossMab(kih)、LUZ-Y通用LC；LUZ-Y scFab-IgG、FcFc*；附加的和Fc修饰的IgG，例如IgG(kih)-Fv、IgG HA-TF-Fv、IgG(kih)scFab、scFab-Fc(kih)-scFv2、scFab-Fc(kih)-scFv、半DVD-Ig、DVI-Ig(四合一)、CrossMab-Fab；修饰的Fc和CH3融合蛋白，例如Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc-SEED抗体、TriFab；附加的IgG-HC融合蛋白，例如IgG-HC、scFv、IgG-dAb、IgG-taFV、IgG-CrossFab、IgG-正交Fab、IgG-(CαCβ)Fab、scFv-HC-IgG、串联Fab-IgG(正交Fab)Fab-IgG(CαCβFab)、Fab-IgG(CR3)、Fab-铰链-IgG(CR3)；附加的IgG-LC融合体，例如IgG-scFv(LC)、scFv(LC)-IgG、dAb-IgG；附加的IgG-HC和LC融合，例如DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、scFv4-IgG、Zy抗体；Fc融合体，例如Fab-scFv-Fc、scFv4-Ig；F(ab’)2融合体，例如F(ab’)2-scFv2；CH1/CL融合蛋白scFv2-CH1-铰链/CL；修饰的IgG，例如DAF(二合一IgG)、DutaMab、Mab2；和非Ig融合体，例如DNL-Fab4-IgG。
技术人员能够设计和制备双特异性抗原结合分子。产生双特异性抗原结合分子的方法包括对抗原结合分子或抗体片段进行化学交联，例如通过具有可还原的二硫键或不可还原的硫醚键，如Segal和Bast于2001在《双特异性抗原结合分子的产生》，免疫学最新方案14：IV：2.13：2.13.1–2.13.16中所述，其通过引用整体并入本文。例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)可用于化学交联，例如Fab片段经由铰链区SH-基团以产生二硫键连接的双特异性F(ab)2异二聚体。
产生双特异性抗原结合分子的其他方法包括融合产生抗体的杂交瘤，例如，用聚乙二醇产生一个能够分泌双特异性抗体的方形细胞，如D.M.和Bast，B.J.于2001在《双特异性抗原结合分子的产生》，免疫学最新方案14：IV：2.13：2.13.1–2.13.16中所述。
根据本发明的双特异性抗原结合分子也可以通过重组产生，例如通过由编码抗原结合分子的多肽的核酸构建体表达，例如《抗体工程》：方法和方案，第二版(Humana出版社，2012年)，第40章：双特异性抗体的产生：Diabodies and Tandem scFv或法文(Hornig
-Schwarz)，《如何制作双特异性抗原结合分子》，分子医学方法2000，40：333-339中所述，其通过引用整体并入本文。例如，可以通过分子克隆技术制备编码两个抗原结合片段的轻链和重链可变域(即能够结合VISTA的抗原结合片段的轻链和重链可变域，以及能够结合另一种靶蛋白的抗原结合片段的轻链和重链可变域)，并包括在抗原结合片段之间编码合适的连接子或二聚结构域的序列的DNA构建体。可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)构建体来产生重组双特异性抗体，然后可以任选地纯化表达的重组双特异性抗体。
Fc区
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区。
在IgG中、IgA和IgD同种型中，Fc区由一个多肽的CH2和CH3区以及另一多肽的CH2和CH3区组成。来自两个多肽的CH2和CH3区一起形成Fc区。在IgM和IgE同种型中，Fc区包含三个恒定结构域(CH2、CH3和CH4)，以及来自两个多肽的CH2至CH4一起构成Fc区。
Fc区提供与Fc受体和免疫系统其他分子的相互作用，以产生功能效应例如，在Jefferis等人，Immunol Rev 1998 163：59-76中对IgG Fc介导的效应子功能进行了综述(在此全文引入作为参考)，并带来了通过Fc介导的免疫细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和T细胞)的募集和激活，通过Fc区与免疫细胞表达的Fc受体之间的相互作用，通过Fc区与补体蛋白C1q结合，招募补体通路成分，进而激活补体级联。
Fc介导的功能包括Fc受体结合、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、膜攻击复合物(MAC)形成、细胞脱粒、细胞因子和/或趋化因子的产生、以及抗原的加工和呈递。
影响Fc介导的功能的抗体Fc区的修饰在本领域中是已知的，例如那些如Wang等人，Protein Cell(2018)9(1)：63-73所述，其通过引用整体并入本文。特别地，已知影响抗体效应子功能的示例性Fc区修饰总结于Wang等人，Protein Cell(2018)9(1)：63-73的表1中。下文描述了影响抗体效应子活性的Fc区的修饰。
当Fc区/CH2/CH3被描述为包含“对应于”参考取代的修饰时，则考虑同源Fc/CH2/CH3中的等效取代。举例来说，人IgG1中的L234A/L235A取代(根据如Kabat等人，《免疫学目的蛋白质的序列》，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生服务局，贝塞斯达，马里兰州，1991出版的欧洲联盟编号系统所述的EU编号系统编号)，对应于小鼠Ig gamma-2A链C区A等位基因的117和118位的L对A取代，其编号为SEQ ID NO：256。
当Fc区被描述为包含修饰时，该修饰可以存在于一起形成Fc区的一条或两条多肽链中。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含含有修饰的Fc区。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含在一个或多个CH2和/或CH3区中含有修饰的Fc区。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加Fc介导的功能。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加ADCC。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加ADCP。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加CDC。与包含相应的未修饰的Fc区的抗原结合分子相比，包含含有修饰以增加Fc介导的功能(例如ADCC、ADCP、CDC)的Fc区的抗原结合分子诱导相关效应子功能的水平提高。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与Fc受体的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与Fcγ受体的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIIa的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIa的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIb的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcRn的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与补体蛋白的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与C1q的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以促进抗原结合分子的六聚化。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加抗原结合分子的半衰期。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加共接合。
在一些实施方式中，Fc区含有与取代的组合F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L相对应的修饰，如Stavenhagen等人，Cancer Res.(2007)67:8882-8890所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合S239D/I332E或S239D/I332E/A330L的修饰，如Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA.(2006)103:4005-4010中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合S298A/E333A/K334A的修饰，如Shields等人，J Biol Chem.(2001)276:6591-6604中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A的重链多肽之一的修饰，以及对应于取代组合D270E/K326D/A330M/K334E另一重链多肽的修饰，如Mimoto等人，MAbs.(2013):5:229–236中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合G236A/S239D/I332E的修饰，如Richards等人，Mol CancerTher.(2008)7:2517-2527中所述。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合K326W/E333S的修饰，如Idusogie等人，J Immunol.(2001)166(4):2571-5中所述。在一些实施方式中，Fc区包含与取代组合S267E/H268F/S324T相对应的修饰，如Moore等人，MAbs.(2010)2(2):181-9)中所述。在一些实施方式中，Fc区包含与取代组合相对应的修饰，如Natsume等人，Cancer Res.(2008)68(10):3863-72中所述。在一些实施方式中，Fc区包含与取代组合E345R/E430G/S440Y相对应的修饰，如Diebolder等人，Science(2014)343(6176):1260-3中所述。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合M252Y/S254T/T256E的修饰，如DallAcqua等人，J Immunol.(2002)169：5171–5180中所述。在一些实施方中，Fc区包含对应于取代组合M428L/N434S的修饰，如Zalevsky等人，Nat Biotechnol.(2010)28:157-159中所述。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合S267E/L328F的修饰，如Chu等人，Mol Immunol.(2008)45:3926-3933中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合N325S/L328F的修饰，如Shang等人，Biol Chem.(2014)289:15309-15318中所述。
在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止Fc介导的功能的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止ADCC的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止ADCP的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止CDC的修饰。与包含相应的未修饰Fc的抗原结合分子相比，包含含有减少/阻止Fc介导的功能(例如ADCC、ADCP、CDC)的修饰的Fc区的抗原结合分子诱导相关效应子功能的水平降低。
在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与Fc受体结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与Fcγ受体结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与FcγRIIIa结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与FcγRIIa结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与FcγRIIb结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与补体蛋白结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止与C1q结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含减少/阻止对应于N297的氨基酸残基的糖基化的修饰。
在一些实施方式中，Fc区不能诱导一种或多种Fc介导的功能(即，缺乏引发相关的Fc介导的功能的能力)。因此，包含此类Fc区的抗原结合分子也缺乏诱导相关功能的能力。此类抗原结合分子可被描述为缺乏相关功能。
在一些实施方式中，Fc区不能诱导ADCC。在一些实施方式中，Fc区不能诱导ADCP。在一些实施方式中，Fc区不能诱导CDC。在一些实施方式中，Fc区不能诱导ADCC和/或不能诱导ADCP和/或不能诱导CDC。
在一些实施方式中，Fc区不能结合Fc受体。在一些实施方式中，Fc区不能结合Fcγ受体。在一些实施方式中，Fc区不能结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个。在一些实施方式中，Fc区不能结合FcγRIIIa。在一些实施方式中，Fc区不能结合FcγRIIa。在一些实施方式中，Fc区不能结合FcγRIIb。在一些实施方式中，Fc区不能结合FcRn。在一些实施方式中，Fc区不能结合补体蛋白。在一些实施方式中，Fc区不能结合C1q。在一些实施方式中，Fc区在对应于N297的氨基酸残基处不被糖基化。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于N297A或N297Q或N297G的修饰,如Leabman等人，MAbs.(2013)5:896-903中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于L235E的修饰，如Alegre等人，J Immunol.(1992)148:3461-3468中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合L234A/L235A或F234A/L235A的修饰，如Xu等人，Cell Immunol.(2000)200:16-26中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于P329A或P329G的修饰，如Schlothauer等人，《蛋白质工程、设计与选择》(Protein Engineering，Design and Selection)(2016)，29(10)：457-466中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合L234A/L235A/P329G的修饰，如Lo等人，J.Biol.Chem.(2017)292(9)：3900-3908中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于如Rother等人，Nat Biotechnol.(2007)25:1256-1264中所述取代组合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合S228P/L235E的修饰,如Newman等人，Clin.Immunol.(2001)98:164-174中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合H268Q/V309L/A330S/P331S的修饰,如An等人，MAbs.(2009)1:572-579中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于取代组合V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S的修饰，如Vafa等人，(2014)65:114-126中所述。在一些实施方式中，Fc区包含对应于如US 2015/0044231 A1中所述的取代组合L234A/L235E/G237A/A330S/P331S的修饰。
已知取代突变L234A/L235A和相应取代突变的组合(例如人IgG4中的F234A/L235A)会破坏Fc与Fcγ受体的结合并抑制ADCC、ADCP，并减少C1q结合，从而降低CDC(Schlothauer等人，《蛋白质工程、设计与选择》(2016)，29(10)：457–466，在此通过引用整体并入本文)。P329G和P329A取代突变减少了C1q结合(从而降低了CDC)。已知用A、G或Q取代“N297”可消除糖基化，从而减少Fc与C1q和Fcγ受体的结合，进而降低CDC和ADCC的结合。Lo等人，J.Biol.Chem.Chem(2017)292(9)：3900-3908(通过引用整体并入本文)报道，L234A/L235A/P329G的取代组合消除了补体结合和固定以及Fcγ受体依赖性、抗体依赖性细胞介导的鼠IgG2a和人IgG1的细胞毒性。
在US 2015/0044231 A1中公开了IgG1 Fc中的L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代组合消除了对吞噬作用、ADCC和CDC的诱导作用。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于如Silva等人，J Biol Chem.(2015)290(9):5462-5469中所述的S228P取代的修饰。IgG4 Fc中的S228P取代减少了Fab臂交换(Fab臂交换可能是不希望发生的)。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应L234A/L235A取代的组合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应P329G取代的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应N297Q取代的修饰。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应L234A/L235A/P329G取代的组合的修饰。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应L234A/L235A/P329G/N297Q取代的组合的修饰。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的组合的修饰。
在一些实施方式中，Fc区包含对应于对应S228P取代的修饰，例如在IgG4中。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含在一个或多个CH2和CH3区中含有促进Fc区缔合的修饰的Fc区。抗原结合分子的组成多肽的重组共表达和随后的缔合导致几种可能的组合。为了在重组生产中提高抗原结合分子中所需多肽组合的产率，在Fc区中引入促进重链多肽所需组合的缔合的修饰是有利的。修饰可以促进例如不同多肽链的CH2和/或CH3区域之间的疏水和/或静电相互作用。例如，适当的修饰在Ha等人，Front.Immnol(2016)7：394中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，本发明的抗原抗原结合分子包含一Fc区，该Fc区包括根据以下形式之一的Fc区的CH3区中的成对取代，如Ha等人，Immnol(2016)7：394：KiH，KiHs-s，HA-TF，ZW1、7.8.60，DD-KK，EW-RVT，EW-RVTs-s，SEED或A107在表1中所示。
在一些实施方式中，Fc区包含旋钮入孔或KiH修饰，例如，如例如美国专利US7,695,936和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001年)中所述。在这样的实施方式中，Fc区的一个CH3区包含“旋钮”修饰，而另一个CH3区包含“孔”修饰。“旋钮”和“孔”的修饰位于相应的CH3区域内，因此“旋钮”可以位于“孔”中，以促进多肽的异二聚(和抑制同二聚)和/或稳定异二聚。通过将具有小链的氨基酸替换为具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)来构建“旋钮”。通过将具有大侧链的氨基酸替换为具有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)来产生“孔”。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代(本文中的Fc、CH2和CH3区中的位置/取代基的编号是根据所述的EU编号系统在Kabat等人的《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，贝塞斯达，马里兰州，1991出版)，且Fc区的另一个CH3区包含Y407V取代。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代，且Fc区的另一CH3区包含T366S和L368A取代。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y407V、T366S和L368A取代。
在一些实施方式中，所述Fc区包含如WO 2014/131694 A1中所述的DD-KK修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含K392D和K409D取代，且Fc区的另一个CH3区包含E356K和D399K取代。所述修饰促进CH3区之间的静电相互作用。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含如Labrijn等人，Proc Natl AcadSci USA.(2013)110(13)：5145-50中所述修饰的Fc区，称为“双抗体”形式。在一些实施方式中，一个CH3区包含K409R取代，且Fc区中的另一个CH3区包含K405L取代。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Strop等人，JMol Biol.J.Biol.(2012)420(3):204-19中所述的“EEE-RRR”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含D221E、P228E和L368E取代，且Fc区的另一个CH3区包含D221R、P228R和K409R取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含一Fc区，该Fc区包含Choi等人，Mol CancerTher(2013)12(12)：2748-59中所述的“EW-RVT”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含K360E和K409W取代，且Fc区的另一个CH3区包含Q347R、D399V和F405T取代。
在一些实施方式中，一个CH3区包含S354C取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y349C取代。这些半胱氨酸残基的引入导致在Fc区的两个CH3区之间形成二硫桥，进一步稳定了异二聚体(Carter(2001)，J Immunol Methods 248，7-15)。
在一些实施方式中，Fc区包含“KiH S-S”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含T366W和S354C取代，且Fc区的另一个CH3区包含T366S、L368A、Y407V和Y349C取代。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Davis等人，Protein Eng Des Sel(2010)23(4)：195-202中所述的“SEED”修饰，其中人IgG1 CH3和IgACH3的β-链段被交换。
在一些实施方式中，一个CH3区包含S364H和F405A取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y349T和T394F取代(参见例如Moore等人，MAbs(2011)3(6)：546–57)。
在一些实施方式中，一个CH3区包含T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，而Fc区的另一个CH3区包含T350V、T366L、K392L和T394W取代(例如参见Von Kreudenstein等人，MAbs(2013)5(5)：646-54)。
在一些实施方式中，一个CH3区包含K360D、D399M和Y407A取代，而Fc区的另一个CH3区包含E345R、Q347R、T366V和K409V取代(参见例如Leaver-Fay等人，Structure(2016)24(4)：641-51)。
在某些实施方式中，一个CH3区包含K370E和K409W取代，而Fc区的另一个CH3区包含E357N、D399V和F405T取代(参见例如Choi等人，PLoS One(2015)10(12)：e0145349)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含不与Fcγ受体结合的Fc区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含不与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个结合的Fc区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含不与FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa中的一个或多个结合的Fc区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含不与FcγRIIa和FcγRIIb之一或两者结合的Fc区。
可以根据本领域众所周知的方法，例如ELISA、免疫印迹、免疫沉淀、表面等离子体共振(SPR；参见例如Hearty等人，Methods Mol Biol(2012)907：411-442)或生物层干涉法(BLI；参见例如Lad等人，(2015)J Biomol Screen 20(4)498-507)来分析Fc区或包含Fc区的抗原结合分子与参比蛋白(例如Fc受体)结合的能力。
如本文所用，“不结合”参比蛋白的Fc区可以显示出基本上不结合参比蛋白，通过例如ELISA、免疫印迹(例如Western blot)、免疫沉淀，SPR或BLI确定。“基本上不结合”可以是相互作用的水平不显著大于在给定测定中针对不相互结合的蛋白质所确定的相互作用水平。“基本上不结合”可以是在给定的测定中，对于不相互结合的蛋白质所确定的相互作用水平≤5倍，例如≤4倍、≤3倍、≤2.5倍、≤2倍或≤1.5倍的相互作用水平。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含与FcRn结合的Fc区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含与FcRn结合且不与FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa中的一个或多个结合的Fc区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含与FcRn结合且不与FcγRIIa和FcγRIIb之一或二者结合的Fc区。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含不诱导ADCC的Fc区。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含不诱导ADCP的Fc区。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含不诱导CDC的Fc区。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含不诱导ADCC、ADCP或CDC的Fc区。
如本文所用，不诱导(即不能诱导)ADCC/ADCP/CDC的Fc区/抗原结合分子基本上不引起ADCC/ADCP/CDC活性，例如在适当的分析中通过分析确定的相关活性。“基本上没有ADCC/ADCP/CDC活性”是指ADCC/ADCP/CDC的水平不显著大于在给定测定中适当的阴性对照分子确定的ADCC/ADCP/CDC的水平(例如，缺乏抗原结合分子Fc区或包含“沉默”Fc区的抗原结合分子(例如，如Schlothauer等人，《蛋白质工程、设计与选择》(2016)，29(10)：457-466中所述，以上通过引用并入)。“基本上没有活性”可以是在给定测定中相关活性的水平是适当的阴性对照分子确定的活性水平的≤5倍，例如≤4倍、≤3倍、≤2.5倍、≤2倍或≤1.5倍。
可以通过例如根据Yamashita等人，Scientific Reports(2016)6：19772(通过引用整体并入本文)中描述的方法，或通过例如在Jedema等人，Blood(2004)103：2677–82中所描述的51Cr释放法(通过引用整体并入本文)分析Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导ADCC的能力。可以通过例如根据Kamen等人，J Immunol(2017)198(1增刊)157.17中描述的方法(通过引用整体并入本文)分析Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导ADCP的能力。可以通过例如使用C1q结合测定，例如Schlothauer等人，《蛋白质工程、设计与选择》(2016)，29(10)：457-466(通过引用并入上文)中所述，分析Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导CDC的能力。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，其包含具有与SEQ ID NO：254具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，其包含具有与SEQ ID NO：257具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，其包含具有与SEQ ID NO：259具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，其包含具有与SEQ ID NO：260具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子缺乏Fc区。
Fc受体
Fc受体是与免疫球蛋白的Fc区结合的多肽。Fc受体的结构和功能综述于例如Masuda等人，Inflamm Allergy Drug Targets(2009)8(1)：80-86和Bruhns，Blood(2012)119：5640-5649，两者均通过引用整体并入本文。
Fc受体在包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞的造血细胞表面表达。它们包括与IgG结合的Fcγ受体，IgE的高亲和力受体(FcεRI)，IgA受体以及IgA和IgM的聚合Ig受体。新生儿Fc受体(FcRn)是IgG的另一种Fc受体，并参与跨上皮屏障的IgG转运(胞吞作用)，保护IgG免受降解和抗原呈递。人类具有六类不同的Fcγ受体(小鼠直系同源物显示在圆括号中)：FcγRI(mFcγRI)、FcγRIIa(mFcγRIII)、FcγRIIb(mFcγRIIb)、FcγRIIc、FcγRIIIa(mFcγRIV)和FcγRIIIb。FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa在其细胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，并且通过Fc的连接导致表达该受体的细胞的激活。FcγRIIb在其细胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)，并在通过Fc连接后负调控细胞的活化和脱粒、细胞增殖、内吞作用和吞噬作用。
在本说明书中，“Fcγ受体可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。类似地，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb分别指任何物种的FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
在一些实施方式中，Fcγ受体(例如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、猕猴、非人灵长类或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠和小鼠)。同种型、片段、变体或同源物可以任选地表征为与给定物种(例如人类)的Fcγ受体(例如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)的未成熟或成熟同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如具有通过合适的功能特性/活性分析所确定的参考Fcγ受体的功能特性/活性。例如，FcγRI的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与人IgG1 Fc相关。
在本说明书中，FcRn受体可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
在一些实施方式中，FcRn受体来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、猕猴、非人灵长类或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠或小鼠))。同种型、片段、变体或同系物可以任选地表征为与来自给定物种(例如人类)的FcRn受体的不成熟或成熟同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如具有通过合适的功能特性/活性分析所确定的参考FcRn受体的功能特性/活性。例如，FcRn的同种型、片段、变体或同源物可以例如是显示与人IgG1 Fc相关。
多肽
本发明还提供了抗原结合分子的多肽成份。多肽可以以分离或基本上纯化的形式提供。
本发明的抗原结合分子可以是或可以包含多肽的复合物。
在多肽包含一个以上结构域或区域的本说明书中，应理解，多个结构域/区域优选地存在于同一多肽链中。即，包含一个以上结构域或区域的多肽是包含这些结构域/区域的融合多肽。
在一些实施方式中，根据本发明的多肽包含本文所述的VH或由其组成。在一些实施方式中，根据本发明的多肽包含本文所述的VL或由其组成。
在一些实施方式中，所述多肽还包含一个或多个抗体重链恒定区(CH)。在一些实施方式中，所述多肽还包含一个或多个抗体轻链恒定区(CL)。在一些实施方式中，所述多肽包含免疫球蛋白(Ig)的CH1、CH2区和/或CH3区。
在一些实施方式中，所述多肽包含免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，所述多肽包含如本文所述的CH1区。在一些实施方式中，所述多肽包含如本文所述的CH1-CH2铰链区。在一些实施方式中，所述多肽包含如本文所述的CH2区。在一些实施方式中，所述多肽包含如本文所述的CH3区。
在一些实施方式中，所述多肽包含含有以下任一氨基酸取代/氨基酸取代组合的CH2和/或CH3区：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；S239D/I332E/A330L；S298A/E333A/K334A；L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A；D270E/K326D/A330M/K334E；G236A/S239D/I332E；K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；E345R/E430G/S440Y；M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；S267E/L328F；N325S/L328F；N297A；N297Q；N297G；L235E；L234A/L235A；F234A/L235A；P329A；P329G；L234A/L235A/P329G；H268Q/V309L/A330S/P331S；和V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S。
在一些实施方式中，该多肽包含含有以下任一氨基酸取代/氨基酸取代组合(例如Ha等人，Front。Immnol(2016)7：394的表1中所示，通过引用并入上文)的CH3区：T366W；T366S、L368A和Y407V；T366W和S354C；T366S，L368A、Y407V和Y349C；S364H和F405A；Y349T和T394F；T350V、L351Y，F405A和Y407V；T350V、T366L、K392L和T394W；K360D，D399M和Y407A；E345R、Q347R、T366V和K409V；K409D和K392D；D399K和E356K；K360E和K409W；Q347R、D399V和F405T；K360E、K409W和Y349C；Q347R、D399V、F405T和S354C；K370E和K409W；以及E357N、D399V和F405T。
在一些实施方式中，多肽的CH2和/或CH3区包含一个或多个氨基酸取代，以促进多肽与包含CH2和/或CH3区的另一种多肽缔合。
在一些实施方式中，所述多肽包含免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，所述多肽包含本文所述的CL区。
在一些实施方式中，所述多肽缺少免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，所述多肽缺少CH2区。在一些实施方式中，所述多肽缺少CH3区。在一些实施方式中，所述多肽缺少CH2区，并且也缺少CH3区。
在一些实施方式中，根据本发明的多肽从N末端到C末端包含根据以下之一的结构：
(i)VH
(ii)VL
(iii)VH-CH1
(iv)VL-CL
(v)VL-CH1
(vi)VH-CL
(vii)VH-CH1-CH2-CH3
(viii)VL-CL-CH2-CH3
(ix)VL-CH1-CH2-CH3
(x)VH-CL-CH2-CH3
本发明还提供了由本发明的多肽组成的抗原结合分子。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含以下之一的多肽组合：
(A)VH+VL
(B)VH-CH1+VL-CL
(C)VL-CH1+VH-CL
(D)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL
(E)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1
(F)VL-CH1-CH2-CH3+VH-CL
(G)VL-CL-CH2-CH3+VH-CH1
(H)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL-CH2-CH3
(I)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1-CH2-CH3
在一些实施方式中，抗原结合分子包含多种以上(A)至(I)中所示的组合的多肽。举例来说，参考上文(D)，在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含两个包含VH-CH1-CH2-CH3结构的多肽，和两个包含VL-CL结构的多肽。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含以下多肽组合之一：
(J)VH(抗VISTA)+VL(抗VISTA)
(K)VH(抗VISTA)-CH1+VL(抗VISTA)-CL
(L)VL(抗VISTA)-CH1+VH(抗VISTA)-CL
(M)VH(抗VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗VISTA)-CL
(N)VH(抗VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗VISTA)-CH1
(O)VL(抗VISTA)-CH1-CH2-CH3+VH(抗VISTA)-CL
(P)VL(抗VISTA)-CL-CH2-CH3+VH(抗VISTA)-CH1
(Q)VH(抗VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗VISTA)-CL-CH2-CH3
(R)VH(抗VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗VISTA)-CH1-CH2-CH3
其中：“VH(抗VISTA)”是指能够结合如本文所述的VISTA的抗原结合分子的VH。例如(1)至(76)之一所定义；“VL(抗VISTA)”是指能够结合如本文所述的VISTA的抗原结合分子的VL，例如(77)至(173)之一所定义。
在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO：212至243、248至250、258、266或311至321之一的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
接头和其他序列
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和多肽包含铰链区。在一些实施方式中，在CH1区和CH2区之间提供铰链区。在一些实施方式中，在CL区和CH2区之间提供铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含与SEQ ID NO：207的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和多肽在氨基酸序列之间包含一个或多个接头序列。可以在抗原结合分子/多肽的VH、VL、CH1-CH2铰链区、CH2区和CH3区中的一个或多个的一端或两端提供接头序列。
接头序列是技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许由接头序列连接的氨基酸序列的相对运动。柔性接头是技术人员已知的，并且在Chen等人，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中鉴定了几种。柔性接头序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方式中，所述接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方式中，所述接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方式中，所述接头序列具有1-2、1-3、1-4、1-5或1-10个氨基酸长度。
本发明的抗原结合分子和多肽可以另外包含其他氨基酸或氨基酸序列。例如，所述抗原结合分子和多肽可包含氨基酸序列，以促进抗原结合分子/多肽的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测。例如，所述抗原结合分子/多肽可以包含任选地在抗原结合分子/多肽的N-或C-末端编码His(例如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合分子/多肽包含可检测的部分，例如荧光、发冷光、免疫检测、放射、化学、核酸或酶标记。
本发明的抗原结合分子和多肽可以另外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水性氨基酸序列组成，形成单个α螺旋。分泌的蛋白质和在细胞表面表达的蛋白质通常包含信号肽。
信号肽可以存在于抗原结合分子/多肽的N末端，并且可以存在于新合成的抗原结合分子/多肽中。信号肽提供了抗原结合分子/多肽的有效运输和分泌。信号肽通常通过切割去除，因此不包含在表达抗原结合分子/多肽的细胞分泌的成熟抗原结合分子/多肽中。
信号肽对于许多蛋白质而言是已知的，并且记录在诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源(Protein Information Resource)、蛋白质数据银行(Protein Data Bank)、Ensembl和InterPro等数据库中，和/或可以使用诸如SignalP(Petersen等人，2011Nature Methods 8：785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl，2008Bioinformatics 24：2172-2176)之类的氨基酸序列分析工具识别/预测。
标签和缀合物
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子另外包含可检测的部分。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含可检测的部分，例如荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫可检测标记(例如表位标记)、放射性标记、化学、核酸或酶标记。所述抗原结合分子可以被可检测部分共价或非共价标记。
荧光标记包括例如荧光素、若丹明、别藻蓝蛋白、曙红和NDB、稀土的绿色荧光蛋白(GFP)螯合物(例如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm))、四甲基若丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3和Cy5。放射性标记物包括放射性同位素诸如碘123、碘125、碘126、碘131、碘133、溴77、锝99m、Indium111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞207、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、铜67、氟18、钇90、钯100、铋217和锑211。发光标记包括放射性发光、化学发光(例如a啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)和生物发光标记。免疫可检测的标记包括半抗原、肽/多肽、抗体、受体和配体，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或洋地黄毒苷。核酸标记包括适配子。酶标记包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和萤光素酶。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与化学部分缀合。所述化学部分可以是用于提供治疗效果的部分。抗体-药物缀合物在Parslow等人，Biomedicines.2016年9月；4(3)：14中综述。在一些实施方式中，所述化学部分可以是药物部分(例如细胞毒性剂)。在一些实施方式中，所述药物部分可以是化学治疗剂。在一些实施方式中，所述药物部分选自卡奇霉素、DM1、DM4、单甲基奥他汀E(MMAE)、单甲基奥他汀F(MMAF)、SN-38、阿霉素、杜卡霉素、D6.5和PBD。
抗原结合分子的特定示例性实施方式
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：212的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：213的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：214的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：215的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：216的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：217的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：218的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：219的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：220的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：221的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：222的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：223的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：224的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：225的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：226的氨基酸序列至少具有70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：227的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：228的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：229的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：230的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：231的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：234的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：235的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：236的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：237的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：238的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：239的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：240的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：241的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：242的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：243的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：248的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：249的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：258的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：266的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下组成：
(i)包含与SEQ ID NO：330的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽；和
(ii)包含与SEQ ID NO：213的氨基酸序列具有至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成的两个多肽。
抗原结合分子的功能特性
本文所述的抗原结合分子可以通过参考某些功能特性来表征。在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子可具有以下一种或多种性质：
结合VISTA(例如人、鼠和/或食蟹猕猴VISTA)；
不与PD-L1和/或HER3结合；
不结合Fcγ受体；
不结合C1q；
不诱导ADCC；
不诱导ADCP；
不诱导CDC；
结合FcRn受体；
与表达VISTA的细胞结合；
抑制VISTA和VISTA的结合伴侣(例如PSGL-1、VSIG-3或VSIG-8)之间的相互作用；
抑制VISTA介导的信号传导；
抑制独立于Fc介导功能的VISTA介导的信号传导；
增加表达VISTA的细胞的杀伤；
不诱导/增加表达VISTA的细胞的杀伤；
减少表达VISTA的细胞的数量/比例；
不减少表达VISTA的细胞的数量/比例；
增加效应免疫细胞的数量/活性；
减少抑制免疫细胞的数量/活性；
减少抑制免疫细胞的增殖；
降低表达VISTA的细胞介导的免疫抑制；
增加抗原呈递细胞的抗原呈递；
增加免疫细胞产生IL-6的能力；
在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中增加IFN-γ、IL-2和/或IL-17的产生；
增加T细胞增殖，IFN-γ产生和/或TNFa产生；和
抑制体内癌症的发展和/或进展。
本文所述的抗原结合分子优选地显示出对VISTA的特异性结合。如本文所用，“特异性结合”是指对抗原具有选择性的结合，并且可以与对非靶标抗原的非特异性结合区分开。相比于结合其他非靶分子，特异性结合靶分子的抗原结合分子优选结合靶分子的亲和力更大和/或持续时间更长。
给定多肽与给定分子特异性结合的能力可以根据本领域已知的方法通过分析来确定，例如通过ELISA、表面等离振子共振(SPR；参见例如Hearty等人，Methods Mol Biol(2012)907：411-442)、生物层干涉术(参见例如Lad等人，(2015)J Biomol Screen 20(4)：498-507)、流式细胞仪或通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)酶联免疫吸附法。通过这种分析，可以测量和定量与给定分子的结合。在一些实施方式中，所述结合可以是在给定测定中检测到的应答。
在一些实施方式中，抗原结合分子与非靶标分子的结合程度小于例如通过ELISA、SPR、生物层干涉或RIA所测的抗体与靶标分子的结合程度的约10％。或者，结合特异性可以反映为结合亲和力，其中抗原结合分子结合的解离常数(KD)大于抗原结合分子对非靶标分子的KD至少0.1个数量级(即0.1×10n，其中n为代表数量级的整数)。这可以任选地是至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0之一。
在一些实施方式中，抗原结合分子显示出与人VISTA、鼠类(例如小鼠)VISTA和/或食蟹猕猴(食蟹猴)VISTA的结合。即，在一些实施方式中，抗原结合分子对人VISTA和鼠类VISTA和/或食蟹猕猴VISTA具有交叉反应性。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子显示与非人灵长类动物的VISTA的交叉反应性在模型物种中与VISTA的交叉反应性可在同系模型中体内探索功效，而无需依赖替代分子。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不显示出与PD-L1(例如人PD-L1)的特异性结合。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不显示出与HER3(例如人HER3)的特异性结合。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不显示出与B7蛋白家族的另一成员的特异性结合(即不与之交叉反应)。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不显示出与PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOLSG、CD276、VTCN1、NCR3LG1、HHLA2和/或CTLA4的特异性结合。
在某些实施方式中，所述抗原结合分子不显示出与PD-1、PD-L1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)和/或CTLA4的特异性结合。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能诱导一种或多种Fc介导的功能(即，缺乏引发相关的Fc介导的功能的能力)。此类抗原结合分子可被描述为缺乏相关功能。
如上文所解释，不诱导(即不能诱导)ADCC/ADCP/CDC的Fc区/抗原结合分子基本上不引起ADCC/ADCP/CDC活性，例如在适当的分析中通过分析确定的相关活性。类似地，“不结合”参比蛋白(例如给定的Fc受体或补体蛋白)的抗原结合分子在合适的测定中可以基本上不结合参比蛋白。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能诱导ADCC。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能诱导ADCP。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能诱导CDC。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能诱导ADCC和/或不能诱导ADCP和/或不能诱导CDC。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合Fc受体。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合Fcγ受体。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一种或多种。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合FcγRIIIa。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合FcγRIIa。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合FcγRIIb。在一些实施方式中，所述抗原结合分子与FcRn结合。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合补体蛋白。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合C1q。在一些实施方式中，所述抗原结合分子在对应于N297的氨基酸残基处不被糖基化。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子结合人VISTA、鼠类VISTA和/或食蟹猕猴VISTA；并且不结合PD-L1、PD-1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)和/或CTLA4(例如人PD-L1/PD-1/B7H3/VTCN1/NCR3LG1/HHLA2/CTLA4)。
在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子结合VISTA(例如人VISTA，小鼠VISTA)的KD为10μM或更小，优选地≤5μM、≤2μM、≤1μM、≤500nM，≤100nM，≤75nM，≤50nM，≤40nM，≤30nM，≤20nM，≤15nM，≤12.5nM，≤10nM，≤9nM，≤8nM，≤7nM，≤6nM，≤5nM，≤4nM≤3nM，≤2nM，≤1nM或≤500pM之一。在一些实施方式中，抗原结合分子结合VISTA(例如人VISTA，小鼠VISTA)的亲和力K D＝≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM或≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM或≤1nM。在一些实施方式中，抗原结合分子结合至VISTA(例如人VISTA，小鼠VISTA)的亲和力KD＝≤500pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM或≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM、≤9pM、≤8pM、≤7pM或≤6pM、≤5pM、≤4pM、≤3pM、≤2pM或≤1pM。
本发明的抗原结合分子可以结合VISTA的感兴趣的特定区域。根据本结构域的抗原结合分子的抗原结合区可以结合由氨基酸的连续序列(即氨基酸一级序列)组成的VISTA的线性表位。在一些实施方式中，所述抗原结合区分子可以结合VISTA的构象表位，其由氨基酸序列的一个氨基酸的不连续序列组成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够结合VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够在VISTA的胞外域结合VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够在Ig样V型结构域(例如SEQ ID NO：6所示的区域)中结合VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够在SEQ ID NO：31所示的区域中结合VISTA。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：322所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或由其组成的肽或多肽。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不结合IGN175A结合的VISTA区域(例如在WO 2014/197849 A2中所述)。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不结合以下抗原结合分子所结合的VISTA区域，所述抗原结合分子包括由SEQ ID NO：267的序列组成的多肽和由SEQ ID NO：268的序列组成的多肽。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不与IGN175A(例如在WO 2014/197849 A2中所述)竞争结合VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不与以下抗原结合分子竞争结合VISTA：所述抗原结合分子包括由SEQ ID NO：267的序列组成的多肽和由SEQ ID NO：268的序列组成的多肽。
给定的抗原结合分子与IGN175A或以下抗原结合分子竞争结合VISTA的能力可以通过竞争ELISA或通过表位结合进行分析，例如Abdiche等人，J Immunol Methods(2012)382(-2)：101-116(通过引用整体并入本文)中所述，所述抗原结合分子包括由SEQ ID NO：267序列组成的多肽和SEQ ID NO：268序列组成的多肽。抗原决定簇合并可以例如通过BLI分析，例如如本申请的实施例8中所述进行。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：275所示的氨基酸序列组成的肽。
如本文所用，“肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸单体的链。肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是两个或更多个肽的聚合物链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。
抗原结合分子结合给定肽/多肽的能力可以通过本领域技术人员众所周知的方法来分析，包括通过ELISA、免疫印迹(例如蛋白质印迹)、免疫沉淀、表面等离振子共振和生物层干涉法进行分析。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与以下抗体所结合的VISTA区域相同的VISTA区域或重叠的VISTA区域，所述抗体包含以下克隆之一的VH和VL序列：4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8，V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与IGN175A所结合的VISTA区域(例如在WO 2014/197849 A2中所述)不同的VISTA区域。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与以下抗原结合分子所结合的VISTA区域不同的VISTA区域，所述抗原结合分子包括由SEQ ID NO：267的序列组成的多肽和由SEQ ID NO：268的序列组成的多肽。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与IGN175A所结合的VISTA区域(例如在WO 2014/197849 A2中所述)不重叠的VISTA区域。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与以下抗原结合分子所结合的VISTA区域不重叠的VISTA区域，所述抗原结合分子包含由SEQ ID NO：267组成的多肽和由SEQ ID NO：268的序列组成的多肽。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子通过与VISTA的残基接触而与VISTA结合，所述残基与VSTB112(例如在WO 2015/097536 A2中所述)接触的VISTA残基不同。在一些实施方式中，所述抗原结合分子通过与VISTA的残基接触而与VISTA结合，所述残基与包含由SEQ ID NO：269的序列组成的多肽和由SEQ ID NO：270的序列组成的多肽的抗原结合分子所接触的VISTA残基不同。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子的表位与VSTB112的表位不同。在一些实施方式中，所述抗原结合分子的表位与包含由SEQ ID NO：269的序列组成的多肽和由SEQ IDNO：270的序列组成的多肽的抗原结合分子的表位不同。
抗体结合的肽/多肽的区域可以由技术人员使用本领域所熟知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体分析、肽扫描、诱变作图、氢-氘交换质谱分析、噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这样的方法例如在Gershoni等人，BioDrugs，2007，21(3)：145-156中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，当VISTA在细胞表面(即在细胞膜内或在细胞膜上)表达时，本发明的抗原结合分子在抗原结合分子(即细胞外抗原结合分子)可接近的区域中结合VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合在表达VISTA的细胞的细胞表面表达的VISTA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合表达VISTA的细胞(例如CD14+单核细胞(例如单核细胞衍生的抑制细胞(MDSC))和/或CD33+髓样细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和嗜中性白细胞)。
抗原结合分子结合给定细胞类型的能力可以通过使细胞与抗原结合分子接触并检测结合到细胞上的抗原结合分子(例如在洗涤步骤之后，去除未结合的抗原结合分子)来分析。抗原结合分子结合表达免疫细胞表面分子的细胞和/或表达癌细胞抗原的细胞的能力可以通过流式细胞术和免疫荧光显微镜等方法进行分析。
本发明的抗原结合分子可以是VISTA的拮抗剂。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够抑制由VISTA和/或VISTA的结合伴侣(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)介导的功能或过程(例如相互作用，信号传导或其他活性)。在此，“抑制”是指相对于对照条件的减少、降低或减轻。
本文所述的结合VISTA的抗原结合分子能够通过不需要Fc介导的功能的机制例如ADCC、ADCP和CDC来抑制VISTA介导的功能/过程。即，本文所述的VISTA结合抗原结合分子能够抑制表达VISTA的细胞的免疫抑制活性，而无需引起ADCC、ADCP和/或CDC。
特别地，本文所述的结合VISTA的抗原结合分子能够通过不需要结合Fcγ受体和/或结合C1q的机制抑制VISTA。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制VISTA和VISTA的结合伴侣(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制VISTA和PSGL-1之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制VISTA和VSIG-3之间的相互作用。
抗原结合分子抑制两种因子之间相互作用的能力可以例如通过分析在存在或一种或两种相互作用伴侣与抗体/片段孵育后的相互作用来确定。用于确定给定的抗原结合分子是否能够抑制两个相互作用伴侣之间相互作用的测定包括竞争性ELISA测定和SPR分析。
通过观察与不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的相互作用水平相比，在抗原结合分子存在下或在一个或两个相互作用伴侣与抗原结合分子孵育后的相互作用伴侣之间相互作用水平的减少/降低，可以鉴定出能够抑制给定相互作用的抗原结合分子(例如VISTA和VISTA的结合伴侣之间)。合适的分析可以体外进行，例如使用重组相互作用伴侣或使用表达相互作用伴侣的细胞。表达相互作用伴侣的细胞可能是内源性的，也可能是通过引入细胞的核酸来表达的。为了这种测定的目的，可以标记一个或两个相互作用伴侣和/或抗原结合分子或与可检测实体结合使用，以检测和/或测量相互作用的水平。
抗原结合分子抑制两个结合伴侣之间相互作用的能力也可以通过分析这种相互作用的下游功能性结果来确定。例如，VISTA与VISTA的结合伴侣之间相互作用的下游功能性结果可能包括VISTA介导的信号传导。例如，可以通过在MLR测定中分析IL-2、IFN-γ和/或IL-17的产生来确定抗原结合分子抑制VISTA和VISTA的结合伴侣相互作用的能力。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将VISTA和VISTA的结合伴侣(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)之间的相互作用抑制至VISTA与VISTA结合伴侣在不存在抗原结合分子(或在适当的对照抗原结合分子存在下)条件下的相互作用水平的小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、3倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子抑制VISTA介导的信号传导。可以例如使用效应免疫细胞数目/活性的测定法，如本文实验实施例中描述的MLR测定法分析VISTA介导的信号传导。可以通过检测效应免疫细胞的数量和/或活性的增加来鉴定对VISTA介导的信号传导的抑制，例如通过IL-2、IFN-γ和/或IL-17的产生增加确定。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要或不涉及Fc介导的功能的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够不依赖于Fc介导的功能抑制VISTA介导的信号传导。即，在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够以非Fc区依赖性的方式抑制VISTA介导的信号传导。
抗原结合分子通过不需要/不涉及Fc介导的功能的机制抑制VISTA介导的信号传导的能力可以通过，例如分析以缺乏功能性Fc区的形式提供的抗原结合分子抑制VISTA介导的信号传导的能力来评估。例如，可以使用包含“沉默”Fc区(例如包含LALA PG取代)的抗原结合分子或使用以缺乏Fc区的形式提供的抗原结合分子(例如scFv、Fab等)来研究对VISTA介导的信号传导的影响。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCC的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCP的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，抗原结合分子能够通过不涉及CDC的机制抑制VISTA介导的信号传导。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要抗原结合分子与Fc受体结合的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要抗原结合分子与Fcγ受体结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要抗原结合分子与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一种或多种结合的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要结合FcγRIIIa的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要结合FcγRIIa的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要结合FcγRIIb的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要结合补体蛋白的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要结合C1q的机制来抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不需要N297糖基化的机制来抑制VISTA介导的信号传导。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加表达VISTA的细胞的杀伤。表达VISTA的细胞的杀伤可通过抗原结合分子的效应功能来增加。在抗原结合分子包含Fc区的实施方式中，所述抗原结合分子可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)中的一种或多种来增加表达VISTA的细胞的杀伤。
可以通过观察存在抗原结合分子或将表达VISTA的细胞与抗原结合分子孵育后，与在适当的测定中在不存在抗原结合分子的情况下(或在存在适当的对照抗原结合分子的情况下)检测到的细胞杀伤水平相比，表达VISTA的细胞杀伤水平增加，来鉴定能够增加表达VISTA的细胞杀伤的抗原结合分子。CDC、ADCC和ADCP的测定是技术人员众所周知的。表达VISTA的细胞的杀伤水平也可以通过在暴露于不同的治疗条件后测量存活和/或无存活的表达VISTA的细胞的数目/比例来确定。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将表达VISTA的细胞(例如表达VISTA的MDSC)的杀伤增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的杀伤水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，与没有抗原结合分子存在的孵育后(或有适当对照抗原结合分子存在的孵育后)进行的可比性检测表达VISTA的细胞(例如表达VISTA的MDSC、TAM、中性粒细胞)的数目相比，本发明的抗原结合分子能够将表达VISTA的细胞(例如表达VISTA的MDSC)的数目减少至少1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子是非消耗性抗原结合分子。即，在一些实施方式中，所述抗原结合分子不引起表达VISTA的细胞的实质性消耗。在一些实施方式中，所述抗原结合分子不引发/增加针对表达VISTA的细胞的ADCC、ADCP和/或CDC。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子不诱导/增加对表达VISTA的细胞的杀伤，例如在抗原结合分子缺乏Fc区的实施方式中，或在抗原结合分子包含不能诱导Fc介导的抗体效应功能的Fc区的实施方式中。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子不减少表达VISTA的细胞的数目/比例。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子(i)抑制VISTA介导的信号传导，和(ii)不诱导/增加对表达VISTA的细胞的杀伤。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子(i)抑制VISTA介导的信号传导，和(ii)不减少表达VISTA的细胞的数目/比例。
这可能是特别有利的，因为VISTA是由不希望被耗竭的细胞表达的。例如，VISTA由不希望被杀伤或减少其数目/比例的免疫细胞(例如某些类型的T细胞和树突状细胞)以低水平表达。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够相对于阴性对照条件(例如在体外或体内进行适当的分析)增加效应免疫细胞的数量和/或活性。作为解释，本发明的抗原结合分子可能能够从MDSC介导的效应免疫细胞增殖和功能抑制中释放效应免疫细胞。在一些实施方式中，效应免疫细胞可以是例如CD8+T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTL)、CD4+T细胞、CD4+T辅助细胞、NK细胞、产生IFNγ的细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、经抗原暴露的T细胞或CD45RO+T细胞。
可以例如通过使用抗体的流式细胞仪分析以检测细胞类型来确定细胞数量和比例。可以例如通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入的体外测定或通过CFSE稀释测定法来分析细胞分裂，如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6)：559-564中所述，在此通过引用整体并入本文。效应免疫细胞活性可以通过测量这种活性的相关性来分析。在一些实施方式中，效应免疫细胞的活性可以例如通过分析IL-2、IFN-γ和/或IL-17的产生确定。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将效应免疫细胞类型的数目增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的数目的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将效应免疫细胞活性的相关因子水平增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够降低由表达VISTA的细胞介导的免疫抑制的水平。免疫抑制水平的改变可以使用测量表达VISTA的细胞的精氨酸酶1的表达和/或活性氧种类(ROS)的产生的方法来确定，例如如Ochoa等人，Ann Surg2001年3月；233(3)：393-399以及Dikalov和Harrison，《抗氧化氧化还原信号》，2014年1月10日；20(2)：372–382中所述。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加抗原呈递细胞的抗原呈递作用，例如使用抗原呈递的合适测定法所确定。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加吞噬细胞(例如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或树突细胞)的吞噬作用，例如使用吞噬作用水平的合适测定法所确定的。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加免疫细胞产生IL-6的能力。所述免疫细胞可以是，例如PBMC、淋巴细胞、T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞是单核细胞。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够在刺激后(例如使用LPS)增加免疫细胞的IL-6产生。抗原结合分子增加免疫细胞产生IL-6的能力可以在体外测定(如本文实施例10所述)中进行分析。该方法可以包括用LPS刺激单核细胞(例如THP1细胞)，以及用抗原结合分子孵育被刺激的细胞。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将免疫细胞(例如，LPS刺激的THP1细胞)产生的IL-6增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖、IL-2产生、IFN-γ产生和/或IL-17产生。MLR测定可以如Bromelow等人，J.Immunol Methods，2001年1月1；247(1-2)：1-8中所述进行(通过引用整体并入本文)，或如本文的实验实施例中所述进行。IL-2、IFNγ和/或IL-17的产生可以通过例如技术人员熟知的基于抗体的方法，例如蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT、或通过基于报告子的方法来分析。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够在MLR测定中将T细胞增殖、IL-2产生、IFN-γ产生和/或IL-17产生增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加T细胞增殖、IFN-γ产生和/或TNFα产生，例如在存在VISTA/VISTA表达细胞的情况下。可以评估抗原结合分子的此类特性，例如如本文实验实施例中所述在体外测定中进行。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够将T细胞增殖、IFN-γ产生和/或TNFα产生(例如在存在VISTA/VISTA表达细胞的情况下)增加至在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够比现有技术中公开的VISTA结合抗体(例如VSTB112，如在WO 2015/097536 A2中所述)更大程度地增加T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的增殖。T细胞增殖可以在体外测定(例如本文实施例9中所述)中评估，并且可以包括在激动剂抗CD3抗体的存在下通过培养来刺激T细胞增殖。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够在这种测定法中将T细胞增殖增加至现有技术VISTA结合抗体(例如VSTB112)引起的增殖水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，与现有技术中公开的VISTA结合抗体(例如VSTB112，例如在WO2015/097536 A2中所述)相比，本发明的抗原结合分子能够更大程度地提高THP1细胞的IL-6产生。由THP1细胞产生的IL-6可以在体外测定(例如本文实施例10中所述)中评估，并且可以涉及用LPS刺激THP1细胞。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够在这种测定法中将IL-6的产生增加至现有技术VISTA结合抗体(例如VSTB112)引起的增殖水平的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够：减少抑制性免疫细胞的数量和/或活性、抑制抑制性免疫细胞的增殖，和/或降低相对于对照条件(例如通过适当的体外测定或体内所确定)抑制性免疫细胞在细胞群(例如CD45+细胞，例如从肿瘤获得的CD45+细胞)中的比例。
抑制性免疫细胞可以是，例如表达VISTA的细胞、表达Arg1的细胞、MDSC、粒细胞MDSC(g-MDSC)或单核MDSC(m-MDSC)。
在一些实施方式中，数目/活性/增殖/比例的减少是小于在不存在抗原结合分子(或存在适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的数目/活性/增殖/比例的1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不涉及Fc介导的功能的机制来减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够不依赖于Fc介导的功能(即以Fc区非依赖的方式)减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCC、ADCP和/或CDC的机制减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够通过不涉及表达VISTA的细胞耗竭的机制来减少抑制免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子体内抑制癌症的发展和/或进展。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子引起癌细胞杀伤的增加，例如通过效应免疫细胞。在一些实施方式中，所述抗原结合分子导致体内癌细胞数目的减少，例如与适当的控制条件相比。在一些实施方式中，所述抗原结合分子抑制肿瘤生长，例如通过测量随时间变化的肿瘤大小/体积来确定。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够在用抗原结合分子治疗的小鼠中增加血清IFN-γ和/或IL-23水平。IFN-γ和/或IL-23的血清水平可以通过从血清获得自小鼠血液样品的ELISA来分析。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子的施用使IFN-γ和/或IL-23的血清水平增加至在不施用抗原结合分子的情况下观察到的水平(或在施用适当的对照抗原结合分子后观察到的水平)的1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
可以分析本发明的抗原结合分子在合适的体内模型(例如细胞系来源的异种移植模型，如CT26细胞来源模型。4T-1细胞来源模型、LL2细胞来源模型、B16细胞来源模型或EL4细胞来源模型)中抑制癌症发展和/或进展的能力。所述癌症可以是病理上涉及表达VISTA的细胞和/或MDSC(例如表达VISTA的MDSC、TAM、嗜中性白细胞)的癌症。“病理上涉及”MDSC的癌症包括MDSC或MDSC数量/比例增加与癌症的发生、发展或进展和/或一种或多种癌症症状的严重程度呈正相关的癌症，或MDSC或MDSC数量/比例增加是癌症发生、发展或进展的危险因素。所述癌症可在受疾病影响的器官/组织(例如表现出疾病/病状的器官/组织)或肿瘤中包含MDSC。
在一些实施方式中，根据本发明的抗原结合分子的施用(例如在CT26细胞、4T-1细胞、LL2细胞、B16细胞或EL4细胞衍生的异种移植模型中所确定)可引起以下一种或多种：抑制癌症的发展/进程、延缓/预防癌症的发作、减少/延缓/预防肿瘤生长、减少/延缓/预防转移、减少癌症症状的严重程度、减少癌细胞数量、减少肿瘤大小/体积和/或提高生存率(例如无进展生存期)。
在一些实施方式中，相比于在不施用抗原结合分子的情况下(或在施用适当的对照抗原结合分子之后)观察到的肿瘤生长，施用本发明的抗原结合分子能够抑制大于5％，例如≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％或≥95％的肿瘤生长。
嵌合抗原受体(CARs)
本发明还提供了包含本发明的抗原结合分子或多肽的嵌合抗原受体(CARs)。
CAR是提供抗原结合和T细胞激活功能的重组受体。例如，在Dotti等人，ImmunolRev(2014)257(1)中综述了CAR的结构和工程，其通过引用整体并入本文。CAR包含连接至细胞膜锚定区和信号传导区的抗原结合区。任选的铰链区可提供抗原结合区和细胞膜锚定区之间的分离，并可充当柔性接头。
本发明的CAR包含抗原结合区，其包含本发明的抗原结合分子或由其组成，或包含本发明的多肽或由其组成。
细胞膜锚定区位于CAR的抗原结合区和信号传导区之间，用于将CAR锚定到表达CAR的细胞的细胞膜上，其抗原结合区位于细胞外空间，和细胞内信号传导区。在一些实施方式中，CAR包含细胞膜锚定区，所述细胞膜锚定区包含或由以下氨基酸序列组成：包含CD3-ζ、CD4、CD8或CD28之一的跨膜区氨基酸序列，或由其组成或由其衍生。如本文所用，“源自”参考氨基酸序列的区域包括与参考序列具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的氨基酸序列。
CAR的信号传导区可激活T细胞。CAR的信号传导区可以包含CD3-ζ的细胞内结构域的氨基酸序列，其提供基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，用于表达CAR的T细胞的磷酸化和激活。包含其他含ITAM的蛋白质(例如FcγRI)序列的信号传导区也已在CAR中应用(Haynes等人，2001J Immunol 166(1)：182-187)。CAR的信号传导区还可包含衍生自共刺激分子的信号传导区的共刺激序列，以促进表达CAR的T细胞在与靶蛋白结合后的活化。合适的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。在某些情况下，CAR被设计为提供不同细胞内信号通路的协同刺激。例如，与CD28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)途径，而4-1BB介导的信号传导则是通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接蛋白。因此，CAR的信号传导区有时会包含源自一个以上共刺激分子的信号传导区的共刺激序列。在一些实施方式中，本发明的CAR包含一个或多个共刺激序列，其包含含有CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27的一种或多种细胞内结构域的氨基酸序列或由其组成或由其衍生的氨基酸序列，或由其组成。
任选的铰链区可以提供抗原结合结构域和跨膜结构域之间的分离，并且可以充当柔性接头。铰链区可以源自IgG1。在一些实施方式中，本发明的CAR包含含有以下氨基酸序列或由其组成的铰链区，所述氨基酸序列含有IgG1的铰链区的氨基酸序列或由其组成或由其衍生。
还提供了包含根据本发明的CAR的细胞。根据本发明的CAR可以用于产生表达CAR的免疫细胞，例如CAR-T或CAR-NK细胞。可以在体外培养过程中将CAR改造为免疫细胞。
本发明的CAR的抗原结合区可以以任何合适的形式提供，例如scFv、scFab等。
核酸和载体
本发明提供了一种或多种编码根据本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的核酸。
在一些实施方式中，所述核酸是纯化的或分离的，例如来自其他核酸或天然存在的生物材料。在一些实施方式中，所述核酸包含DNA和/或RNA或由其组成。
本发明还提供了一种或多种载体，其包含根据本发明的一种或多种核酸。
核苷酸序列可以包含在载体，例如表达载体中。如本文所用，“载体”是用作将外源核酸转移到细胞中的运载体的核酸分子。所述载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。这样的载体可以包括与编码要表达的序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于表达来自根据本发明的载体的肽或多肽。
术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中所选核苷酸序列和调节性核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以将核苷酸序列的表达置于调节序列影响或控制下的方式共价连接(从而形成表达盒)。因此，如果调节序列能够影响核酸序列的转录，则该调节序列可操作地连接至所选核酸序列。然后可以将所得的转录本翻译成所需的肽/多肽。
合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(MLV)来源的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘苗病毒载体和疱疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在一些实施方式中，所述载体可以是真核载体，例如包含在真核细胞中表达来自载体的蛋白质所必需的元素。在一些实施方式中，所述载体可以是哺乳动物载体，例如包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动蛋白质表达。
根据本发明的抗原结合分子的组成多肽可以由多种核酸中的不同核酸，或由多种载体中的不同载体编码。
包含/表达抗原结合分子和多肽的细胞
本发明还提供了包含或表达根据本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞。还提供了一种细胞，其包含或表达根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体。
所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物可以是灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人类灵长类动物或人类)或非人类哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括任何啮齿目的动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人类灵长类动物)。
本发明还提供了一种产生包含根据本发明的一种或多种核酸或载体生物细胞的方法，包括将根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体的引入细胞内。在一些实施方式中，将根据本发明的分离的核酸或载体引入细胞包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。
本发明还提供了一种生产表达/包含本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞的方法，其包括将根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体引入细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括在适合于细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方式中，所述方法是体外进行的。
本发明还提供了通过根据本发明的方法获得或可获得的细胞。
产生抗原结合分子和多肽
根据本发明的抗原结合分子和多肽可以根据技术人员已知的多肽生产方法来制备。
多肽可以通过化学合成制备，例如液相或固相合成。例如，可以使用例如Chandrudu等人，Molecules(2013)，18：4373-4388中描述的方法合成肽/多肽，其通过引用整体并入本文。
或者，可以通过重组表达产生抗原结合分子和多肽。适用于重组生产多肽的分子生物学技术是本领域众所周知的，例如Green和Sambrook在《分子克隆：实验室手册(第4版)，冷泉港出版社，2012年，以及在Nat Methods.(2008)；5(2)：135-146中所述，两者均通过引用整体并入本文。重组生产抗原结合分子的方法也描述在Frenzel等人，FrontImmunol.(2013)；4：217以及Kunert和Reinhart，Appl Microbiol Biotechnol.(2016)100：3451–3461，两者均通过引用整体并入本文。
在某些情况下，本发明的抗原结合分子由多于一个的多肽链组成。在这种情况下，抗原结合分子的产生可包括不止一种多肽的转录和翻译，以及随后的多肽链缔合以形成抗原结合分子。
对于根据本发明的重组生产，可以使用适合于表达多肽的任何细胞。所述细胞可以是原核生物或真核生物。在一些实施方式中，所述细胞是原核细胞，例如古细菌或细菌的细胞。在一些实施方式中，所述细菌可以是革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科的细菌，例如大肠杆菌。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细，例如CHO、HEK(例如HEK293)、HeLa或COS细胞。在一些实施方式中，所述细胞是瞬时或稳定表达多肽的CHO细胞。
在某些情况下，所述细胞不是原核细胞，因为某些原核细胞不允许与真核细胞相同的折叠或翻译后修饰。另外，在真核生物中可能有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。也可以利用特异性质粒以增强蛋白质向培养基中分泌。
在一些实施方式中，多肽可以通过无细胞蛋白质合成(CFPS)，例如使用根据Zemella等人，Chembiochem(2015)16(17)：2420-2431中所述的系统，其通过引用整体并入本文。
生产可以涉及经修饰以表达目的多肽的真核细胞的培养或发酵。所述培养或发酵可在配备有适当养分、空气/氧气和/或生长因子的生物反应器中进行。分泌的蛋白质可通过从细胞分离培养基/发酵液，提取蛋白质含量并分离单个蛋白以分离分泌的多肽来收集。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的，并且描述于例如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册》(第4版；以上通过引用并入本文)。
生物反应器包括一个或多个可以在其中培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，培养细胞连续流出。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如pH、氧气、进出容器的流速以及容器内的搅动，从而为培养的细胞提供最佳条件。
培养表达抗原结合分子/多肽的细胞后，可以分离目标多肽。可以使用本领域已知的从细胞分离蛋白质的任何合适方法。为了分离多肽，可能有必要将细胞与营养培养基分离。如果多肽是从细胞分泌的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的目的多肽的培养基分离。如果感兴趣的多肽聚集在细胞内，则蛋白质分离可包括离心以从细胞培养基中分离出细胞，用裂解缓冲液处理细胞沉淀，以及例如通过超声处理、快速冻融或渗透裂解来破坏细胞。
然后可能需要从上清液或培养基中分离目标多肽，所述上清液或培养基可以包含其他蛋白质和非蛋白质成分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的常用方法是沉淀。不同溶解度的蛋白质会在不同浓度的沉淀剂(例如硫酸铵)下沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下，提取水溶性蛋白质。因此，通过添加不同浓度的增加的沉淀剂，可以区分具有不同溶解度的蛋白质。随后可使用透析法从分离的蛋白质中去除硫酸铵。
区分不同蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换层析和大小层析。这些可以用作沉淀的替代，或者可以在沉淀之后进行。
一旦从培养物中分离出目标多肽，就可能需要或必须浓缩多肽。浓缩蛋白质的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
组合物
本发明还提供了包含本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞的组合物。
本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞可以配制成用于临床用途的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。可以将组合物配制成用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、肿瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮给药途径，包括注射或输注。
合适的制剂可以在无菌或等渗培养基中包含抗原结合分子。药物和药物组合物可以配制成包括凝胶在内的流体形式。可以配制流体制剂以通过注射或输注(例如经由导管)施用于人体或动物体的选定区域。
在一些实施方式中，将所述组合物配制成用于注射或输注的制剂，例如进入血管或肿瘤。
根据本文所述的发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可以包括一个或多个选自以下的步骤：生产如本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)或细胞；分离本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)或细胞；和/或将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)或细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本文描述的本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗疾病/病症(例如癌症)的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
治疗和预防应用
本文描述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防的方法。
本发明提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多个)、细胞或组合物，用于医学治疗或预防的方法。还提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的如本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。
所述方法可以有效地减少疾病/病症的发展或进展，缓解疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的病理。所述方法可以有效地预防疾病/病症的进展，例如防止疾病/状况恶化或减慢其发展速度。在一些实施方式中，所述方法可以导致疾病/状况的改善，例如减轻疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的严重性/活动性的其他一些相关因素。在一些实施方式中，所述方法可以防止疾病/病情发展到后期(例如慢性期或转移)。
应当理解，本发明的物品可以用于治疗/预防将从表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数目和/或活性的减少中受益的任何疾病/病症。还将清楚的是，本发明的治疗和预防用途基本上扩展到将从MDSC和/或其他表达VISTA的细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和中性粒细胞的数目或活性的减少中受益的疾病/病症。VISTA的拮抗作用可有效地从MDSC和/或其他表达VISTA的细胞的抑制中释放效应免疫细胞。
例如，所述疾病/病症可以是在病理上涉及表达VISTA的细胞(例如MDSC)，例如一种表达VISTA的细胞(例如MDSCs)数量/比例增加与该疾病/病症的发作、发展或进展和/或该疾病/病症的一种或多种症状的严重程度正相关的疾病/病症，或表达VISTA的细胞数量/比例增加(例如MDSCs)是该疾病/病症发作、发展或进展的危险因素。
在一些实施方式中，根据本发明待治疗/预防的疾病/病症是特征在于表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数目/比例/活性增加的疾病/病症，例如与在没有疾病/病症的情况下表达VISTA的细胞(例如MDSCs)的数量/比例/活性相比。
在一些实施方式中，可基于检测表达VISTA(例如MDSC)的细胞(例如MDSC)的数目/比例/活性的增加来选择本文所述的治疗对象，例如在受疾病/病症影响的外周或器官/组织中(例如，表现出疾病/病症症状的器官/组织)，或肿瘤中存在表达VISTA的细胞(如MDSCs或肿瘤相关巨噬细胞)。所述疾病/病症可能会影响任何组织、器官或器官系统。在一些实施方式中，所述疾病/病症可以影响几种组织/器官/器官系统。
在一些实施方式中，可基于确定受试者在外周或器官/组织中表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数目/比例/活性的增加(相对于健康受试者中此类细胞的数量/比例/活性)来选择根据本发明进行治疗/预防的受试者，或基于确定受试者有包含表达VISTA的细胞(例如MDSC)的肿瘤。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的疾病/病症是癌症。
应当理解，抗原结合分子通常可用于治疗癌症，因为本发明的抗原结合分子可用于从MDSC介导的抑制或表达VISTA的细胞的抑制中释放效应免疫细胞，并因此增强抗癌免疫反应。
所述癌症可以是任何有害的细胞增殖(或任何通过有害的细胞增殖表现出来的疾病)、赘生物或肿瘤。所述癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性的(转移性的)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是源自例如肝癌的组织/细胞。肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴和/或白细胞。
待治疗的肿瘤可能是神经或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢神经系统或周围神经系统，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、血液癌和肉瘤。
MDSCs在进展期结直肠癌中升高(Toor等人，Front Immunol.2016；7:560)。在乳腺癌中也观察到了MDSCs，并且晚期乳腺癌患者外周血MDSCs的百分比升高(Markowitz等，Breast Cancer Res Treat.2013年7月；140(1)：13-21)。MDSC丰度还与实体瘤的不良预后相关(Charoentong等人，Cell Rep.2017年1月3；18(1)：248-262)，并且MDSC肝癌模型中富集(Connolly等人，J Leukoc Biol.(2010)87(4)：713-25)。据报道，前列腺癌和乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌和Lewis肺癌会产生趋化因子，从而吸引MDSC并有助于免疫抑制(Umansky等人，Vaccines(Basel)(2016)4(4)：36))，并且胰腺癌患者中的MDSC与肿瘤负荷呈正相关(Xu等人，Hepatobiliary Pancreat Dis Int.(2016)15(1)：99-105)。据报道，VISTA是治疗卵巢癌(参见例如US 9,631,018 B2)和淋巴瘤(参见例如WO 2017/023749 A1)的靶标。
Blando等人，Proc Natl Acad Sci US A.(2019)116(5)：1692-1697最近报道了胰腺癌中表达VISTA的髓样细胞的显著浸润，并且在前列腺癌CTLA4拮抗剂治疗后，以及黑色素瘤PD-L1拮抗剂的治疗前后均已观察到表达VISTA的髓样细胞的扩增。
在一些实施方式中，癌症选自：含有表达VISTA的细胞的癌症、含有表达VISTA的细胞浸润的癌症、含有表达VISTA的癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢肿瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
在一些实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌(例如结肠癌、结肠腺癌)、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病(例如T细胞白血病)、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和/或实体瘤。
所述治疗/预防可以针对以下一种或多种：延缓/预防癌症症状的发作/进展，降低癌症症状的严重性，降低癌症细胞的存活/生长/侵袭/转移，减少癌细胞的数目和/或增加受试者的存活率。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的细胞。在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的癌细胞。在一些实施方式中，所述表达VISTA的细胞是MDSC(例如，g-MDSC和/或m-MDSC)。在一些实施方式中，所述癌症包括包含表达VISTA的细胞(例如MDSC)的肿瘤。在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括包含MDSC的肿瘤。在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的细胞(例如MDSC)的浸润。在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括表现出表达VISTA的细胞(例如MDSC)浸润的肿瘤。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括包含CD45+细胞群的肿瘤，该CD45+细胞群包括大于1％，例如≥2％、≥5％、≥10％、≥15％、≥20％、≥25％或≥30％的MDSC(例如根据肿瘤的免疫谱分析确定)。
在一些实施方式中，可基于检测包含表达VISTA的细胞(例如MDSCs)的癌症，或检测包含表达VISTA的细胞(例如MDSCs)的肿瘤来选择本文所述的治疗对象，例如从受试者获得的样品中。
在一些实施方式中，在病理上涉及表达VISTA的细胞的疾病/病症是感染性疾病，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方式中，可能特别需要治疗慢性/持续感染，例如与T细胞功能障碍或T细胞衰竭有关的感染。众所周知，T细胞衰竭是在许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫)以及癌症中出现的T细胞功能障碍状态(Wherry NatureImmunology第12卷，第6期，p492-499，2011年6月)。
可以治疗的细菌感染的例子包括由芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、绿弧菌(Vibrio chloerae)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、大肠杆菌(Escherichia)、克雷伯菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、耶尔森氏菌(Yersinia)、欧文氏菌(Erwina)、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria sp)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、分枝杆菌(mycobacteria)(例如结核分枝杆菌)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的感染。例如，所述细菌感染可以是败血症或结核病。可以治疗的病毒感染的例子包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人类感染乳头瘤病毒(HPV)的感染。可以治疗的真菌感染的例子包括链格孢菌(Alternaria sp)、曲霉(Aspergillus sp)、念珠菌(Candidasp)和组织胞浆菌(Histoplasma sp)的感染。所述真菌感染可能是败血症或组织胞浆菌病。可以治疗的寄生虫感染的例子包括疟原虫种(例如恶性疟原虫、约氏疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫或夏伯蒂疟原虫)的感染。寄生虫感染可以是诸如疟疾、利什曼病和弓形体病的疾病。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子通过不涉及Fc区介导的效应功能(例如ADCC、ADCP、CDC)的分子机制发挥其治疗/预防作用。在一些实施方式中，所述分子机制不涉及抗原结合分子与Fcγ受体(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一种或多种)的结合。在一些实施方式中，所述分子机制不涉及抗原结合分子与补体蛋白(例如C1q)的结合。
在一些实施方式中(例如其中抗原结合分子缺少Fc区的实施方式，或其中抗原结合分子包含不能诱导Fc介导的抗体效应功能的Fc区的实施方式)，所述治疗不会诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤。在一些实施方式中，所述治疗不减少表达VISTA的细胞的数目/比例。
在某些实施方式中，所述治疗(i)抑制VISTA介导的信号传导，并且(ii)不诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤。在一些实施方式中，治疗(i)抑制VISTA介导的信号传导，和(ii)不减少表达VISTA的细胞的数目/比例。
优选以“治疗有效”或“预防有效”的量施用本发明的物品，这足以显示出对受试者的治疗或预防益处。实际施用的量以及施用的速率和时程将取决于疾病/病症的性质和严重程度以及所施用的特定制品。治疗处方，(例如剂量等的决定)由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、个体受试者的状况、给药部位、给药方法和其他从业者知晓的因素。上述技术和方案的示例可以在2000年由利平科特，威廉&威尔金斯出版社出版的《雷明顿药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第20版)中找到。
给药可以是单独的，也可以是与其他治疗方法联合使用的，可以同时或相继给药，这取决于待治疗的疾病。本文所述的抗原结合分子或组合物和治疗剂可以同时或依次施用。
在一些实施方式中，所述方法包括另外的治疗或预防性干预，例如用于癌症的治疗/预防。在一些实施方式中，所述治疗或预防性干预选自化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。在一些实施方式中，所述治疗或预防性干预包括白细胞分离术。在一些实施方式中，所述治疗或预防性干预包括干细胞移植。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子与能够抑制由除VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂联合施用。在一些实施方式中，所述免疫检查点分子是，例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。在一些实施方式中，所述抗原结合分子与能够促进由共刺激受体介导的信号传导的试剂联合施用。在一些实施方式中，所述共刺激受体是，例如CD28、CD80、CD40L、CD86、OX40、4-1BB、CD27或ICOS。
据此，本发明提供了包含根据本发明的制品(例如根据本发明的抗原结合分子)和能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂的组合物。还提供了包含本发明制品和能够促进由共刺激受体介导的信号传导的试剂的组合物。还提供了此类组合物在本文所述的医学治疗和预防疾病/病症中的用途。
还提供了用于治疗/预防本文所述疾病/病症的方法，所述方法包括施用本发明的制品，根据本发明的物制品(例如根据本发明的抗原结合分子)和能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂。还提供了用于治疗/预防本文所述的疾病/病症的方法，包括施用本发明的制品，根据本发明的制品(根据本发明的抗原结合分子)和能够促进由共刺激受体介导的信号传导的试剂。
能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的试剂是本领域已知的，包括例如能够结合免疫检查点分子或其配体并抑制免疫检查点分子介导的信号的抗体。能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的其他试剂包括能够降低免疫检查点分子或免疫检查点分子的配体的基因/蛋白质表达的试剂(例如，通过抑制编码免疫检查点分子/配体的基因的转录，抑制编码免疫检查点分子/配体的RNA的转录后加工，降低编码免疫检查点分子/配体的RNA的稳定性，促进编码免疫检查点分子/配体的RNA的降解，抑制免疫检查点分子/配体的翻译后加工，降低免疫检查点分子/配体的稳定性，或促进免疫检查点分子/配体的降解)和小分子抑制剂。
能够促进由共刺激受体介导的信号传导的试剂在本领域中是已知的，包括例如能够与共刺激受体结合并触发或增加由共刺激受体介导的信号传导的激动剂抗体。能够促进由共刺激受体介导的信号传导的其他试剂包括能够增加共刺激受体或共刺激受体的配体的基因/蛋白质表达的试剂(例如，通过促进编码共刺激受体/配体的基因的转录，促进编码共刺激受体/配体的RNA的转录后加工，提高编码共刺激受体/配体的RNA的稳定性，抑制编码共刺激受体/配体的RNA的降解，促进共刺激受体/配体的翻译后加工，提高共刺激受体/配体的稳定性，或抑制共刺激受体/配体的降解)和小分子激动剂。
表达VISTA的MDSC的免疫抑制作用涉及用能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的药剂的治疗失败和产生抗药性。Gao等人，Nature Medicine(2017)23：551-555最近表明，在依匹莫单抗(即抗CTLA-4抗体)治疗后，VISTA可能是前列腺肿瘤中的一种补偿性抑制途径。
在特定的实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由PD-1介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由PD-1介导的信号传导的试剂可以是靶向PD-1或PD-L1的试剂。所述能够抑制由PD-1介导的信号转导的试剂可以是例如能够与PD-1或PD-L1结合并抑制PD-1介导的信号传导的抗体。在一些实施方式中，所述试剂是拮抗剂抗PD-1抗体。在一些实施方式中，所述试剂是拮抗剂抗PD-L1抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由CTLA-4介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由CTLA-4介导的信号传导的试剂可以是靶向CTLA-4的试剂，或靶向针对CTLA-4的配体的试剂，例如CD80或CD86。在一些实施方式中，所述能够抑制由CTLA-4介导的信号传导的试剂可以是，例如能够结合CTLA-4、CD80或CD86并抑制CTLA-4介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由LAG-3介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由LAG-3介导的信号传导的试剂可以是LAG-3靶向试剂，也可以是靶向LAG-3配体的试剂，例如II类MHC。在一些实施方式中，所述能够抑制由LAG-3介导的信号传导的试剂可以是，例如能够与LAG-3或II类MHC结合并抑制LAG-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由TIM-3介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由TIM-3介导的信号传导的试剂可以是TIM-3靶向试剂，也可以是靶向TIM-3配体的试剂，例如Galectin 9。在一些实施方式中，所述能够抑制由TIM-3介导的信号传导的试剂可以是，例如能够与TIM-3或Galectin 9结合并抑制TIM-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制TIGIT介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由TIGIT介导的信号转导的试剂可以是TIGIT靶向试剂，或靶向TIGIT配体的试剂，例如CD113、CD112或CD155。在一些实施方式中，所述能够抑制由TIGIT介导的信号传导的试剂可以是，例如能够结合TIGIT、CD113、CD112或CD155并抑制TIGIT介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由BTLA介导的信号传导的试剂联合施用。所述能够抑制由BTLA介导的信号传导的试剂可以是BTLA靶向试剂，或靶向BTLA的配体的试剂，例如HVEM。在一些实施方式中，所述能够抑制由BTLA介导的信号传导的试剂可以是，例如能够结合BTLA或HVEM并抑制BTLA介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，采用本发明的抗原结合分子和能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的试剂(例如PD-1和/或PD-L1)的组合的方法与当任何一种药物用作单一疗法时观察到的效果相比提供了改善的治疗效果。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由免疫检查点分子(例如PD-1和/或PD-L1)介导的信号传导的试剂的组合提供了协同(即超加性)治疗效果。
在一些实施方式中，用包含(i)本发明的抗原结合分子和(ii)能够抑制由免疫检查点分子(例如PD-1和/或PD-L1)介导的信号传导的试剂的组合治疗可以与以下一项或多项相关联：
·与单独使用组合中的任何一种组分所观察到的治疗效果相比，治疗效果有所改善；
·与单独使用组合中的任何一种组分所观察到的治疗效果相比，具有协同(即超加性)的治疗效果；
·与单独使用组合中的任何一种组分对肿瘤生长的抑制相比，增强了对肿瘤生长的抑制；
·与单独使用组合中的任何一种组分对肿瘤生长的抑制相比，协同(即超加性)抑制肿瘤生长；
·与单独使用组合中的任何一种组分降低抑制性免疫细胞的数量/活性相比，抑制性免疫细胞的数量/活性降低更大；
·与单独使用组合中的任何一种组分降低抑制性免疫细胞的数量/活性相比，协同(即超加性)降低抑制性免疫细胞的数量/活性；
·与单独使用组合中的任何一种组分减少抑制性免疫细胞的增殖相比，抑制性免疫细胞的增殖减少更大；
·与单独使用组合中的任何一种组分来减少抑制性免疫细胞的增殖相比，协同(即超加性)减少抑制性免疫细胞增殖；
·与单独使用组合的任何一种组分降低抑制性免疫细胞的比例相比，在细胞群(例如CD45+细胞，例如从肿瘤获得的CD45+细胞)中抑制免疫细胞的比例有更大的降低；和
·与单独使用组合的任何一种组分降低抑制免疫细胞的比例相比，协同(即超加性)降低细胞群(例如CD45+细胞，例如从肿瘤获得的CD45+细胞)中抑制性免疫细胞的比例。
同时给药是指将抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物和治疗剂一起给药，例如作为含有两种药物的药物组合物(联合制剂)，或紧接着彼此并任选通过相同的给药途径，例如同一条动脉、静脉或其他血管。依次给药是指在给定的时间间隔之后施用抗原结合分子/组合物或治疗剂中的一种，从而分别施用另一种药物。不需要通过相同的途径来施用两种药剂，尽管在某些实施方式中是这种情况。所述时间间隔可以是任何时间间隔。
化学疗法和放射疗法分别是指使用药物或电离辐射治疗癌症(例如，使用X射线或γ射线进行放射治疗)。所述药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、适体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药剂。所述制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。
一种治疗可能涉及一种以上药物的给药。药物可以单独或与其他治疗组合地给药，其也可以根据待治疗的病症同时或依次给药。例如，化学疗法可以是涉及两种药物给药的联合疗法，其中的一种或多种可能旨在治疗癌症。
所述化学疗法可以通过一种或多种给药途径给药，例如肠胃外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或瘤内。
所述化学疗法可以根据治疗方案进行。所述治疗方案可以是化学疗法施用的预定时间表、计划、方案或计划表，其可以由医师或医学从业者准备并且可以定制以适合需要治疗的患者。所述治疗方案可以表示以下一种或多种：向患者施用的化学疗法的类型；每种药物或放射线的剂量；给药之间的时间间隔；每次治疗的时间；任何治疗假期的数量和性质(如果有的话)。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，并指明每种药物的给药方式。
化疗药物可以选自：阿比昔步、醋酸阿比特龙，阿比特赛(甲氨蝶呤)、阿伯克森(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼、AC-T、阿克里斯(维布妥昔单抗注射液)、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸阿霉素)、双马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、阿凯泽(奈妥吡坦和帕洛诺司琼盐酸盐)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、艾乐沙(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、阿利巴(盐酸帕潘立布)、注射用爱克兰(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿洛西(盐酸帕洛诺司琼)、阿仑里格(布加替尼)、安布洛星(氯胺丁)、氨苄青霉素(氯胺丁)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿雷地亚(帕米膦酸二钠)、阿利米得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、阿拉农(奈拉滨)、三氧化二砷、阿泽拉(奥法木单抗)、天冬酰胺酶菊基腐病菌、阿佐里珠单抗、阿瓦斯汀(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、耶卡他、阿昔替尼、阿扎胞苷、巴文昔奥(阿维鲁单抗)、BEACOPP、贝森努(亚硝脲氮芥)、贝利达(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝彭撒(奥英妥珠单抗)、贝伐单抗、贝沙罗汀、贝克撒(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(亚硝脲氮芥)、博来霉素、博纳吐单抗、倍林妥(博纳吐单抗)、硼替佐米、博苏利夫(博舒替尼)、博舒替尼,维布妥昔单抗、布里格替尼、BuMel、白消安、白消安注射液(白消安)、卡巴他赛、卡波美(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、卡昆斯(阿卡替尼)、坎帕斯(阿仑单抗)、坎普托萨尔(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、卡拉克(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、卡铂-他克索、卡非佐米、卡莫布雷斯(卡莫斯汀)、卡莫斯汀、卡莫斯汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、头孢呋啶(盐酸柔红霉素)、塞瓦里克斯(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、氯丁苯比昔尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、氯法雷克斯(氯法拉滨)、克洛拉(氯法拉滨)、CMF、柯美替尼、可美屈(苹果酸卡博替尼)、盐酸帕潘西伯、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(放线菌素)、考特里(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、赛拉萨(雷米单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、癌得星(环磷酰胺)、达拉非尼、达卡巴嗪、达根(地西他滨)、放线菌素、达雷木单抗、兆珂(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、得非乐(去纤苷钠)、德加列里克斯、地尼白介素、地诺单抗、得颇赛(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸地雷佐生、地那妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-多姆(达卡巴嗪)、杜鲁伐单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用药)、埃立特(拉布立酶)、表阿霉素(盐酸表柔比星)、依洛珠单抗、依洛沙汀(奥沙利铂)、艾曲泊帕、意美(阿瑞匹坦)、埃利昔地(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、乙必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸依立普林、瑞利奇(维莫德吉)、盐酸埃洛替尼、欧文泽(天冬酰胺酶菊基腐病菌)、Ethyol(阿米磷汀)、依托磷酸(依托泊苷磷酸酯)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、依法西酯(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、依维他命(盐酸雷洛昔芬)、依伏美拉(盐酸麦法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用药)、法乐通(托瑞米芬)、法达克(帕诺比司他)、芙仕得(氟维司汀)、FEC、弗隆(来曲唑)、菲格拉斯汀、氟达拉(氟达拉滨磷酸盐)、氟达拉滨磷酸盐、氟络合物(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部用药、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、福尔菲里、福尔菲里-贝伐单抗、福尔菲里-西妥昔单抗、福尔菲林、福尔福斯、福洛廷(对乙酰氨基甲酸酯)、FU-LV、氟维司琼、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、加济瓦(奥比努珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-西沙丁胺、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、吉姆萨尔(盐酸吉西他滨)、吉洛特里夫(阿法替尼二马来酸酯)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、格利亚德尔(卡莫斯汀植入物)、格利亚德尔晶片(卡莫斯汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈瑟琳酯、哈文(甲磺酸依立布林)、赫曼戈(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组、HPV九价疫苗、重组、HPV四价疫苗、重组和美新(盐酸托泊替康)、羟基脲(羟脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(帕博西尼)、伊布利他单抗、依鲁替尼、ICE、伊克鲁西格(盐酸波纳替尼)、伊达霉素(盐酸依达比星)、盐酸依达比星、伊达利西布、伊迪法(甲磺酸依西替尼)、伊菲克斯(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、异环磷酰胺(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、伊马替尼甲磺酸盐、伊布维卡(依鲁替尼)、因芬齐(杜鲁伐单抗)、咪喹莫特、利吉克(溶瘤病毒)、英利它(阿昔替尼)、依托珠单抗、干扰素Alfa-2b、重组白介素2(阿地白介素)、内含子A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西单抗和托西单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、伊斯托达克斯(罗米地辛)、伊沙贝比隆、柠檬酸依沙佐米、伊沙普拉(伊沙匹隆)、贾卡菲(磷酸鲁索替尼)、JEB、耶夫塔纳(卡巴他赛)、卡西拉(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、酮咯芬(盐酸雷洛昔芬)、开皮文斯(帕利弗明)、凯特鲁达(派姆单抗)、基斯卡利(瑞博西尼)、金里亚(提香根核)、凯泼利斯(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、拉鲁佛(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸伦伐替尼、伦维玛(甲磺酸伦伐替尼)、来曲唑、白细胞钙、勒克兰(氯丁酸)、醋酸亮丙瑞林、洛伐他汀(克拉屈滨)、勒武兰(氨基乙酰丙酸)、利福林(氯丁酸)、力普多(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、朗瑟夫(三氟吡啶和盐酸提普拉西奇)、卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、林帕扎(奥拉帕利布)、马其波(硫酸长春新碱脂质体)、曼图兰(盐酸卡巴嗪)、盐酸异丙草胺、醋酸孕甾酮、麦金尼斯特(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、梅斯纳、梅斯内克斯(梅斯纳)、甲唑拉酮(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴代甲基纳曲酮、梅克赛特(甲氨蝶呤)、梅克赛特-AQ(甲氨蝶呤)、甲骨膜素、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、线粒体曲霉菌素(丝裂霉素C)、MOPP、莫唑比尔(培来沙福)、芥子碱(盐酸甲氧乙胺)、突变霉素(丝裂霉素C)、米勒兰(白消安)、迈洛萨尔(阿扎胞苷)、米洛塔格(吉妥珠单抗)、纳米粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒配方)、纳维滨(酒石酸维诺瑞滨)、尼珠单抗、奈拉拉宾、尼奥萨(环磷酰胺)、马来酸、耐力士(马来酸奈拉替尼)、内匹坦特和帕洛诺司琼盐酸盐、诺拉斯塔(培格非司亭)、纽泼金(菲格拉斯汀)、蕾莎瓦(索拉非尼甲苯磺酸酯)、尼兰德龙(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、尼拉罗(柠檬酸依沙米布)、甲苯磺酸尼拉帕布一水合物、尼伏鲁单抗、诺尔维德斯(柠檬酸他莫昔芬)、纳雷特(罗米洛司汀)、奥比努妥珠单抗、奥多佐(索尼得昔)、OEPA、奥他妥单抗、OFF、奥拉帕利布、奥拉单抗、甲磺酸琥珀酸奥马西汀、恩卡斯帕(培加曲霉酶)、盐酸恩丹西酮、奥尼维德(盐酸伊立替康脂质体)、奥塔克(地尼白介素)、奥普达(尼武单抗)、OPPA、奥西替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕布昔利布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和内匹坦特、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕诺比司他、派拉特(卡铂)、顺铂(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、吡非司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、佩列塔(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、铂醇(顺铂)、铂醇-AQ(顺铂)、培来沙福、泊马度胺、波马利斯特(泊马度胺)、盐酸帕那替尼、波特拉扎(尼珠单抗)、普拉曲酸、泼尼松、盐酸丙卡巴嗪、普罗白介素(阿地白介素)、普罗利亚(地诺单抗)、普罗马塔(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普列威(西普赛尔)、普里涅特霍尔(巯基嘌呤)、普里克桑(巯基嘌呤)、[无条目]、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫昔单抗、芥酸酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、雷戈非尼、口服溴甲纳曲酮(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、瑞复美(来那度胺)、瑞马特雷(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、瑞妥生(利妥昔单抗)、瑞妥生海拉(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地辛、罗米普司汀、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、鲁巴拉卡(樟脑磺酸瑞卡帕布)、樟脑磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、里达普(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、西普赛尔、长效索马图林(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、普赖赛尔(达沙替尼)、斯坦福特V、无菌滑石粉(滑石粉)、斯特拉泰克(滑石粉)、斯蒂瓦尔加(雷戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、萨拉特龙(PEG干扰素Alfa-2b)、西尔万特(西妥昔单抗)、三利伯(盐酸奥美他汀)、太伯洛(硫鸟嘌呤)、TAC、塔菲拉尔(达拉非尼)、塔格里索(奥西替尼)、滑石粉、塔利莫金拉帕维克、他莫昔芬柠檬酸盐、他拉滨PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、塔格列汀(贝沙罗汀)、塔西格(尼洛替尼)、紫杉醇(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)、特森特里克(阿佐利珠单抗)、特莫达(替莫唑胺)、替莫唑胺、替莫罗莫司、沙利度胺、沙利度(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、蒂奥帕、提香根核、托拉克(氟尿嘧啶-局部用药)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、托里赛尔(特罗罗莫司)、托西单抗和碘I 131托西单抗、托泰克(盐酸地雷佐生)、TPF、曲贝丁、曲美替尼、曲妥珠单抗、特雷安达(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷盐酸/替吡嘧啶、曲森诺克斯(三氧化二砷)、泰克布(拉帕替尼二甲苯磺酸酯)、由吐新(地昔单抗)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、缬沙星(戊柔比星)、万得他尼、VAMP、瓦鲁比(盐酸罗拉匹坦)、维克替比(帕尼单抗)、VeIP、维尔斑(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、维尔萨(硫酸长春碱)、维拉非尼、维耐托克(威尼托克斯)、威尼托克斯、韦尔泽尼奥(阿贝马西比)、维德尔(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、文卡萨PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、长春新碱硫酸盐脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、维斯托加德(三乙酸尿苷)、伏拉沙泽(葡糖苷酶)、伏立诺他、沃曲恩(盐酸帕唑帕尼)、维克斯(盐酸达柔比星和阿糖胞苷脂质体)、维考弗林(盐酸左索夫林钙)、赛可瑞(克鲁索替尼)、希罗达(卡培他滨)、希莱里、施乐、狄诺赛麦(地诺单抗)、克索菲戈(二氯化镭223)、克斯坦迪(恩杂鲁胺)、耶佛(伊匹单抗)、耶卡他(艾克西)、翁德利斯(特拉贝丁)、扎特拉普(阿柏西普)、扎尔西奥(菲格拉斯汀)、泽朱拉(甲苯磺酸尼泊拉布一水合物)、泽尔博拉夫(维拉非尼)、泽伐林(伊布利他单抗)、新卡德(盐酸地雷佐生)、阿柏西普、佐夫兰(盐酸恩丹西酮)、诺雷德(醋酸戈塞瑞林)、唑来膦酸、佐林扎(伏立诺他)、佐美塔(唑来膦酸)、齐德利格(伊达利西布)、扎卡迪亚(色瑞替尼)和扎迪加(醋酸阿比特龙)。
可以提供多剂量的所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)、细胞或组合物。一个或多个或每个剂量可以用于同时或依次施用另一种治疗剂。
多个剂量可以通过预定时间间隔分开，该预定时间间隔可选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天之一，或1、2、3、4、5或6个月。举例来说，剂量可以每7、14、21或28天(正负3、2或1天)给予一次。
检测方法
本发明还提供了用于检测、定位或成像VISTA或表达VISTA的细胞(例如MDSC)的方法中的本发明的制品。本文所述的抗原结合分子可以用于涉及将抗原结合分子引入VISTA的方法中。此类方法可能涉及检测抗原结合分子和VISTA的结合复合物。
特别地，VISTA的检测可用于诊断/预测病理上涉及表达VISTA的细胞(例如MDSC)的疾病/病症的方法中，识别有此类疾病/病症发展风险的对象，和/或可用于预测受试者对治疗干预的反应的方法。
像这样，提供了一种方法，所述方法包括使含有或怀疑含有VISTA的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子和VISTA的复合物的形成。还提供了一种方法，所述方法包括使含有或怀疑含有表达VISTA的细胞的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与表达VISTA的细胞的复合物的形成。
样品可以从任何组织或体液中获取。所述样品可以包含或可以源自：一定量的血液；从个体血液中提取的一定量的血清，可能包括去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液中的液体部分；组织样本或活检；胸水；脑脊液(CSF)；或从所述个体分离的细胞。在一些实施方式中，所述样品可以获自或衍生自受疾病/病症影响的一个或多个组织(例如有疾病/病症的组织，或与疾病/病症的发病有关的组织)。
合适的方法形式是本领域公知的，包括免疫测定法，例如夹心测定法，例如ELISA。所述方法可包括用可检测的部分，标记抗原结合分子或靶标，或两者，例如如本文所述荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫可检测标记、放射性标记、化学、核酸或酶标记。检测技术是本领域技术人员所熟知的，并且可以选择与标记试剂相对应的检测技术。
这类方法可以提供用于疾病或病症(例如癌症)的诊断和/或预后评估的方法的基础。这样的方法可以在患者样品上体外进行，或者在患者样品处理之后进行。一旦收集了样品，就不需要患者存在于待进行的体外方法，因此该方法可以是不在人体或动物体上实践的一种方法。在一些实施方式中，所述方法在体内进行。
样品中的检测可用于诊断疾病/病症(例如癌症)，疾病/病症的易感性，或提供疾病/病症的预后(预测)，例如本文所述的疾病/病症。所述诊断或预后可能与现有(先前诊断)的疾病/病症有关。
本发明还提供了用于对对象进行选择/分层次以供VISTA-靶向剂治疗的方法。在一些实施方式中，基于对VISTA或表达VISTA的细胞的检测/定量(例如从受试者获得的样品中)，选择根据本发明的治疗/预防的受试者，或将其鉴定为将从此类治疗/预防中受益的受试者。
这样的方法可以涉及检测或定量VISTA和/或表达VISTA的细胞(例如MDSC)，例如在患者样本中。在所述方法包括量化相关因素的情况下，所述方法可以进一步包括将测定的量与标准或参考值进行比较，作为诊断或预后评估的一部分。其他诊断/预后测试可以与本文所述的测试结合使用，以增强诊断或预后的准确性或确认通过使用本文所述的测试获得的结果。
如果检测到VISTA水平升高，或者在从受试者获得的样品中检测到表达VISTA的细胞(例如MDSC)的存在或数量/比例增加，则可以诊断为该受试者患有在病理上涉及MDSC的疾病/病症，或处于发展这种疾病/病症的风险中。在这样的方法中，细胞的表达或数目/比例的“增加”水平是指水平/数目/比例大于在适当控制条件下确定的水平/数目/比例，例如在可比样品(例如同类样品，例如从相同体液、组织、器官等中获得的样品)中检测到的水平/数目/比例，例如从健康受试者获得的样品。
与被确定具有较低水平的VISTA，或在可比较的样品(例如同类样品，例如从相同的体液、组织、器官等获得的样品)中表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数量/比例降低相比，如果检测到的VISTA水平升高，或者在从受试者获得的样品中检测到表达VISTA的细胞(例如MDSC)的存在或数目/比例增加，则可以确定该受试者的预后较差。
本发明的抗原结合分子也可用于预测对免疫疗法的反应的方法。“免疫疗法”通常是指旨在利用免疫系统治疗疾病/病症的治疗性干预措施。免疫疗法包括以增加受试者中效应免疫细胞(例如效应T细胞(例如抗原特异性T细胞、CAR-T细胞)，NK细胞)的数量/比例/活性的治疗性干预。增加效应免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法包括促进效应免疫细胞的增殖和/或存活，抑制免疫检查点分子介导的信号传导，促进共刺激受体介导的信号传导，增强抗原呈递细胞的抗原呈递等的干预。增加效应物免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法还包括增加在受试者中具有所需特异性或活性的效应物免疫细胞的频率的干预，例如通过过继细胞转移(ACT)。ACT通常涉及从受试者获得免疫细胞，通常是通过抽取血液样品来分离免疫细胞。然后通常以某种方式处理或改变细胞，然后将其施用于相同的受试者或不同的受试者。ACT通常旨在为受试者提供具有某些所需特征的免疫细胞群，或在该受试者中增加具有此类特征的免疫细胞的频率。在一些实施方式中，ACT可以例如是包含对目标抗原或感兴趣的细胞类型具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。免疫疗法还包括减少受试者体内抑制性免疫细胞(例如调节性T细胞，MDSC)的数量/比例/活性的治疗性干预。减少抑制性免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法包括引起或增强抑制性免疫细胞的细胞杀伤，并抑制免疫检查点分子介导的信号传导的干预。
如果检测到VISTA水平升高，或者在从受试者获得的样品中检测到表达VISTA的细胞(例如MDSC)的存在或数目/比例增加，则可预测该受试者与被确定具有较低VISTA水平或在可比样品(例如相同种类的样品，例如从相同的体液、组织、器官等中获得)中表达VISTA的细胞(例如MDSCs)的数量/比例降低的受试者相比，对增加受试者中效应免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法的反应较差。如果检测到VISTA水平升高，或者在从受试者获得的样品中检测到表达VISTA的细胞(例如MDSC)的存在或数目/比例增加，则可预测该受试者与被确定具有较低VISTA水平或在可比样品(例如相同种类的样品，例如从相同的体液、组织、器官等中获得)中表达VISTA的细胞(例如MDSCs)的数量/比例降低的受试者相比，对旨在降低受试者体内抑制性免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法的反应提高。
在一些实施方式中，所述方法包括确定抑制性免疫细胞室和效应免疫细胞室的相对大小/活性。例如，在一些实施方式中，所述方法在确定表达VISTA的细胞(例如MDSC、TAM、嗜中性粒细胞)与效应免疫细胞的比例的方法中采用本文所述的抗原结合分子。与确定具有较低比率的受试者相比，具有增加的比率的受试者可以被预测为对旨在减少抑制性免疫细胞的数目/比例/活性的免疫疗法的反应提高，和/或可以被预测为对以增加效应免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法的反应较弱。
本发明的诊断和预测方法可以在疾病和/或治疗的整个过程中的多个时间点在从受试者获得的样品上进行，并且可以用于监测疾病/病症随时间的发展，例如对给予受试者的治疗的反应。根据所述方法的表征结果可用于告知关于何时和何种疗法施用于受试者的临床决策。
诊断或预测方法可以在体外对获自受试者的样品进行，或在对获自受试者的样品进行处理之后进行。一旦收集了样品，就不需要患者存在于待进行的诊断或预测的体外方法，因此该方法可以是在人体或动物体上不实践的一种方法。
受试者
根据本文描述的本发明的方面的受试者可以是任何动物或人类。所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受试者可以是男性或女性。所述受试者可以是患者。所述受试者可能已经被诊断出患有需要治疗的疾病或病症(例如癌症)，可能被怀疑患有这种疾病/病症，或者可能处于发展/患有这种疾病/病症的危险中。
在根据本发明的实施方式中，所述受试者优选是人类受试者。在一些实施方式中，根据本文的本发明的治疗或预防方法的待治疗的受试者是患有癌症或处于患癌风险中的受试者。在根据本发明的实施方式中，可以基于所述疾病/病症的某些标志物的表征，根据所述方法选择受试者进行治疗。
试剂盒
在本文描述的本发明的一些方面，提供了一套试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可具有至少一个容器，所述容器具有预定量的如本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于产生如本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物的材料。
所述试剂盒可提供抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物，以及为治疗特定疾病/病症而给予患者的说明书。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包括至少一个容器，所述容器具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化学治疗剂)。在这样的实施方式中，所述试剂盒还可以包含第二种药物或药物组合物，使得可以同时或分别施用两种药物或药物组合物，从而提供针对特定疾病或病症的联合治疗。还可以配制治疗剂以适合于注射或输注至肿瘤或血液。
序列同一性
如本文所用，“序列同一性”是指在比对序列并在必要时引入缺口以实现序列之间最大的序列同一性百分比后，对象序列中与参考序列中的核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸残基的百分比。为了确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的序列同一性百分比的目的，成对和多序列比对可以以本领域技术人员已知的多种方式来实现，例如，使用诸如ClustalOmega(
J.2005，Bioinformatics 21，951-960)、T-Coffee(Notredame等人，2000,J.Mol.Biol.Biol.(2000)302，205-217)、Kalign(Lassmann和Sonnhammer2005，BMC Bioinformatics，6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013，Molecular Biologyand Evolution，30(4)772–780)之类的可公开获得的计算机软件。使用此类软件时，优选使用默认参数(例如对于间隙罚分和延伸罚分)。
序列
编号段落
以下编号的段落(段)提供了与本发明有关的特征和和特征的组合的进一步陈述：
1.一种任选分离的抗原结合分子，其能够与VISTA结合并抑制VISTA介导的信号传导，而不依赖于Fc介导的功能。
2.根据段落1的抗原结合分子，其能够在Ig样V型结构域中结合VISTA。
3.根据段落1或段落2的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合包含SEQID NO：6的氨基酸序列或由其组成的多肽。
4.根据段落1至3中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列或由其组成的多肽。
5.根据段落1至4中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子不与IGN175A竞争结合VISTA。
6.根据段落1至5中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子不能够结合由SEQ ID NO：275的氨基酸序列组成的肽。
7.根据段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：305的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：306的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：307的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：308的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
8.根据段落1至7中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：309的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
9.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：295的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
10.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：300的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
11.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：277的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
12.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：286的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
13.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
14.根据段落1至8中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：300的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
15.根据段落1至7中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
16.根据段落1至7中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
17.根据段落1至7中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
18.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的LC-CDR3。
19.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的LC-CDR3。
20.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：137的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：138的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：139的氨基酸序列的LC-CDR3。
21.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的LC-CDR3。
22.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：127的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的LC-CDR3。
23.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：144的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：151的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3。
24.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：158的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：165的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153的氨基酸序列的LC-CDR3。
25.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：170的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：177的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：179的氨基酸序列的LC-CDR3。
26.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：246的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：247的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
27.根据段1至6或段落26中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
28.根据段1至6或段落26中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：195的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：197的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
29.根据段1至6或段落26中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：200的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：203的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的LC-CDR3。
30.根据段落1至6中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：297的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：299的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：301的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：302的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：303的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：276的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：282的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：285的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：287的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：62的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
一个VL区，其包含与SEQ ID NO：95的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
或者
包含与SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
一个VL区，其包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
或者
包含与SEQ ID NO：143的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：150的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：157的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：102的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：119的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：126的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：183的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：188的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：196的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：199的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：202的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：133的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：136的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或者
包含与SEQ ID NO：168的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：176的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
31.根据段落1至30中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够与人VISTA和以下的一种或多种结合：小鼠VISTA和食蟹猕猴VISTA。
32.一种任选分离的抗原结合分子，其包含(i)根据段落1至31中任一项的抗原结合分子，和(ii)能够结合除VISTA以外的抗原的抗原结合分子。
33.根据段落1至32中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够与在细胞表面表达VISTA的细胞结合。
34.根据段落1至33中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够抑制VISTA和VISTA的结合伴侣之间的相互作用。
35.根据段落1至34中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够抑制VISTA介导的信号传导。
36.根据段落1至35中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够增加效应免疫细胞的增殖和/或细胞因子产生。
37.一种包含段落1至36中任一项的抗原结合分子的嵌合抗原受体(CAR)。
38.任选分离的一种或多种核酸，其编码根据段落1至36中任一项的抗原结合分子或根据段落37中的CAR。
39.一种表达载体或多种表达载体，其包含根据段落38的一种核酸或多种核酸。
40.一种细胞，包含根据段落1至36中的任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38段的一种核酸或多种核酸，或根据段落39的一种表达载体或多种表达载体。
41.一种方法，包括在适合于从一种或多种核酸或一种或多种表达载体表达抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含根据段落38的一种核酸或多种核酸，或根据段落39的一种表达载体或多种表达载体的细胞。
42.一种组合，包含根据段落1至36中的任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38段的一种核酸或多种核酸，或根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，或根据段落40的细胞。
43.一种根据段落42的组合物，其还包含能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂，其中除VISTA以外的免疫检查点分子任选地选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA。
44.一种根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物，用于医学治疗或预防方法。
45.一种根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物，用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法。
46.根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物的用途，用于制造用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法中的药物。
47.一种治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物。
48.根据段落45使用的抗原结合分子、CAR、核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物，根据段落46的用途或根据段落47的方法，其中所述癌症选自：大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
49.根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物，用于治疗或预防病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法。
50.根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物的用途，用于制造用于治疗或预防其中病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法中的药物。
51.一种治疗或预防在病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法，包括对受试者施用治疗或预防有效量的根据段落1至36中任一项的抗原结合分子，根据段落37的CAR，根据段落38的一种核酸或多种核酸，根据段落39的一种表达载体或多种表达载体，根据段落40的细胞，或根据段落42或段落43的组合物。
52.根据段落45段至51中任一项所述使用的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物、用途或方法，其中所述方法还包括给予能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂，任选地，其中除VISTA以外的免疫检查点分子选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
53.一种抑制VISTA介导的信号传导的方法，包括使表达VISTA的细胞与根据段落1至36中任一项的抗原结合分子接触。
54.一种抑制髓源性抑制细胞(MDSC)活性的方法，所述方法包括使MDSC与根据段落1至36中任一项的抗原结合分子接触。
55.一种增加效应免疫细胞数量或活性的方法，所述方法包括用根据段落1至36中任一项的抗原结合分子抑制表达VISTA的细胞的活性。
56.一种任选分离的体外复合物，包含与VISTA结合的根据段落1至36中任一项的抗原结合分子。
57.一种方法，包括使含有或怀疑含有VISTA的样品与根据段落1至36中任一项的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与VISTA的复合物的形成。
58.一种对受试者作选择或分层次以便用于VISTA靶向药物治疗的方法，所述方法包括将受试者的样品体外与根据段落1至36中任一项的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与VISTA的复合物的形成。
59.根据段落1至36中任一项的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后剂的用途。
60.段落1-36中任一项的抗原结合分子在用于检测、定位或成像癌症的方法中的用途，任选地其中所述癌症选自：结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
***
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
现在将通过示例的方式，参照附图说明本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括所附的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。在本文中范围可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将被理解为该特定值形成另一实施方式。
在本文公开了核酸序列的情况下，也明确考虑了其反向互补。
本文所述的方法可优选体外进行。术语“体外”旨在涵盖用培养中的细胞进行的程序，而术语“体内”旨在涵盖用/在完整的多细胞生物上进行的程序。
附图说明
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验。
图1A至1D.柱状图显示了通过流式细胞术测定的抗VISTA抗体对细胞的染色。柱状图显示抗VISTA抗体克隆(1A)VSTB112(阳性对照；WO 2015/097536)，(1B)4-M2-D5，(1C)9M2-C12或(1D)4M2-C12(在本文中也称为V4)对HEK293细胞(不表达VISTA)或HEK293 VISTA过表达细胞(HEK293 VISTA O/E)的染色。
图2.柱状图显示了通过流式细胞术测定的抗VISTA抗体对细胞的染色。柱状图显示了抗VISTA抗体克隆9M2C12、V4和VSTB112或同种型对照抗体对HEK293细胞(不表达VISTA)或HEK293 VISTA过表达的细胞(HEK293 VISTA O/E)的染色。分析未染色的细胞作为阴性对照。
图3A至3C.传感图显示了抗VISTA抗体克隆V4与人、食蟹猴和鼠类VISTA结合的亲和力分析结果。(3A)显示与人VISTA的结合，(3B)显示与食蟹猴VISTA的结合，以及(3C)显示与鼠VISTA的结合。显示了Kon、Koff和KD。
图4A至4B.曲线图显示抗VISTA抗体与不同蛋白质结合的分析结果。4A显示了抗VISTA抗体克隆V4与人、食蟹猴和鼠类VISTA、人PD-L1和人HER3的结合，通过ELISA所确定。4B显示了抗VISTA抗体克隆V4与人VISTA、PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、CTLA4和无关抗原的结合。
图5.传感图显示了VISTA与VSIG-3之间的结合分析结果。
图6.曲线图显示了抗VISTA抗体克隆5M1-A11和9M2-C12抑制VISTA和VSIG-3之间相互作用的分析结果。
图7A和7B.曲线图和条形图显示了在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中抗VISTA抗体克隆13D5p处理对IFN-γ、IL-2和IL-17A产生的影响的分析结果。(7A)显示了测定结束时在细胞培养上清液中检测到的细胞因子水平，以及(7B)显示了所指示的细胞因子水平的倍数变化(“FC”)。
图8A和8B.曲线图和条形图显示了在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中，抗PD-L1抗体克隆MIH5(赛默飞世尔科技)处理对产生IFN-γ、IL-2和IL-17A的影响的分析结果。(8A)显示了测定结束时在细胞培养上清液中检测到的细胞因子水平，以及(8B)显示了所指示的细胞因子水平的倍数变化(“FC”)。
图9.曲线图显示了通过差示扫描荧光法分析抗VISTA抗体克隆V4的稳定性的结果。
图10.曲线图显示了通过尺寸排阻色谱法分析抗VISTA抗体克隆V4的结果。
图11.图像显示了通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析抗VISTA抗体克隆V4表达的结果。泳道：M1＝TaKaRa蛋白标记物(货号：3452)；M2＝GenScript蛋白标记物(货号：M00521；1＝还原条件；2＝非还原条件；P＝阳性对照：小鼠IgG1，Kappa(西格玛，货号：M9269)。对于蛋白质印迹，使用的第一抗体是羊抗鼠IgG(H+L)抗体(LI-COR，货号：926-32210)。
图12.曲线图和表格显示了通过抗体血清的ELISA分析对抗VISTA抗体克隆V4的药代动力学分析结果。
图13.曲线图显示了在源自同源细胞系的结肠癌小鼠模型体内抗VISTA抗体克隆V4体内的抗癌活性分析结果。
图14.条形图显示了在针对指定的检查点分子的单一疗法或联合疗法治疗后的源自同源细胞系的结肠癌小鼠模型中，在第15天对肿瘤生长的抑制作用。本研究中使用的抗体如下：抗VISTA＝克隆V4、抗PD-L1＝克隆10F.9G2、抗TIGIT＝克隆1G9、抗LAG-3＝克隆C9B7W和抗TIM-3＝克隆RMT3-23。
图15.条形图显示每100,000个细胞MDSC的数量，以及CD8+T细胞的比例：在源自同源细胞系的结肠癌小鼠模型的肿瘤块中的Treg，在单独使用抗VISTA抗体克隆V4或抗PD-L1抗体克隆10F.9G2治疗，抗VISTA抗体克隆V4和抗PD-L1抗体克隆10F.9G2联合治疗，或用PBS治疗(阴性对照)后，通过对大块肿瘤的RNA-Seq分析确定。
图16.曲线图显示了在源自同源细胞系的Lewis肺癌小鼠模型中抗VISTA抗体克隆V4体内的抗癌活性分析结果。
图17.曲线图显示了在源自同源细胞系的黑色素瘤小鼠模型中，作为单一疗法或与抗PD-1抗体RMP1-14(Bio X Cell)联合使用时，抗VISTA抗体克隆V4体内的抗癌活性分析结果。
图18.条形图显示了单剂量900μg抗VISTA抗体克隆V4或等体积运载体(PBS)作为阴性对照单一给药后白细胞的数量或不同类型。
图19A和19B.条形图显示了通过评估单剂量900μg抗VISTA抗体克隆V4或等体积运载体(PBS)作为阴性对照给药后(9A)肝脏和(9B)肾功能的相关性来分析肝毒性和肾毒性。(9A)显示了丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，(9B)显示了血尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)的水平。
图20.曲线图显示了通过ELISA测定的抗VISTA抗体克隆13D5-1与人、食蟹猴和小鼠VISTA和人PD-L1结合的分析结果。
图21.曲线图显示了通过ELISA测定的抗VISTA抗体克隆13D5-13与人和小鼠VISTA结合的分析结果。
图22.曲线图显示了在源自细胞系的结肠癌小鼠模型中，抗VISTA抗体克隆13D5-1单独或与抗PD-L1组合的的体内抗癌活性分析结果。
图23.曲线图显示了抗VISTA抗体克隆13D5-1在源自细胞系的乳腺癌小鼠模型中的体内抗癌活性的分析结果。
图24.柱状图显示了通过流式细胞仪测定的抗VISTA抗体对细胞的染色。柱状图显示了抗VISTA抗体克隆4M2-B4、2M1-B12、4M2-C9、2M1-D2、4M2-D9、1M2-D2、5M1-A11、4M2-D5、4M2-A8和9M2-C12对HEK293细胞(不表达VISTA)或HEK293 VISTA过表达的细胞(HEK293VISTA O/E)的染色。
图25A至25D.传感图显示了4M2-C12 mIgG1与(25A)小鼠FcγRIV，(25B)小鼠FcγRIII，(25C)小鼠FcγRIIb和(25D)小鼠FcRn结合的分析结果。
图26A至26D.传感图显示了4M2-C12 mIgG2a与(26A)小鼠FcγRIV，(26B)小鼠FcγRIII，(26C)小鼠FcγRIIb和(26D)小鼠FcRn结合的分析结果。
图27A至27D.传感图显示了4M2-C12 mIgG2a LALA PG与(27A)小鼠FcγRIV，(27B)小鼠FcγRIII，(27C)小鼠FcγRIIb和(27D)小鼠FcRn结合的分析结果。
图28A至28D.传感图显示了4M2-C12 mIgG2a NQ与(28A)小鼠FcγRIV，(28B)小鼠FcγRIII，(28C)小鼠FcγRIIb和(28D)小鼠FcRn结合的分析结果。
图29A至29C.表格汇总了4M2-C12 mIgG1、4M2-C12 mIgG2a，4M2-C12 mIgG2a LALAPG和4M2-C12 mIgG2a与小鼠FcγRIV、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIIb和小鼠FcRn结合的分析结果。29A显示了计算出的Kon值，29B显示了计算出的Kdis值，29C显示了计算出的KD值。
图30A至30C.图表显示了在T细胞淋巴瘤细胞系来源小鼠模型中，mIgG2a和mIgG2aLALA PG形式的抗VISTA抗体克隆4M2-C12的体内抗癌活性分析结果。30A显示了不同治疗组的数据，30B显示了运载体对照和4M2-C12 mIgG2a治疗组中的单个小鼠的数据，以及30C显示了运载体对照和4M2-C12 mIgG2a LALA PG治疗组中的各小鼠的数据。
图31A和31B.传感图显示了通过BLI分析不同抗VISTA抗体与人VISTA结合之间竞争的结果。
图32.曲线图显示了抗VISTA抗体4M2-C12抑制VISTA和VSIG-3之间结合的分析结果。
图33A至33D.条形图显示了用CFSE稀释法测定抗VISTA抗体对经VISTA-Ig处理的T细胞的T细胞增殖能力恢复的分析结果。图33A和33C显示了从使用比例为1：1的激动剂抗CD3抗体和VISTA-Ig包被的孔中获得的结果，图33B和33D显示了从使用比例为2：1的激动剂抗CD3抗体和VISTA-Ig包被的孔中获得的结果。图33A和33B显示了CFSE低的CD4+T细胞的百分比，图33C和33D显示了CFSE低的CD8+T细胞的百分比。
图34A和34B.条形图显示了抗VISTA抗体促进LPS刺激的THP-1细胞产生IL-6的能力的分析结果。图34A显示了使用4M2-C12获得的结果，图34B显示了使用VSTB112获得的结果。
图35.条形图显示了在服用抗VISTA抗体4M2-C12的小鼠中，在给药前2小时以及给药后0.5小时、6小时、24小时和96小时，从获得的小鼠血液样品中检测到的IL-6水平。
图36A和36B.曲线图显示了在源自细胞系的小鼠结肠癌模型中，抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体联合治疗的体内抗癌活性分析结果。36A显示了不同治疗组的数据，36B显示了在载体对照组和4M2-C12 mIgG2a+抗PD-1治疗组中的单个小鼠获得的数据。
图37.条形图显示了肿瘤浸润的CD45+细胞的百分比，该细胞是源自细胞系的小鼠结肠癌模型的第22天肿瘤的g-MDSCs，获取自用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(Anti-PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体的联合治疗(组合)的小鼠。
图38A至38E.条形图显示了在从源自细胞系的小鼠结直肠癌模型的第18天获得的血清中(38A)IFNγ、(38B)IL-23、(38C)IL-10、(38D)IL-4和(38E)IL-5的水平，获取自用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1种抗体(V4+PD1)联合治疗的小鼠。
图39.条形图显示了在源自细胞系的小鼠结直肠癌模型的第21天肿瘤中Arg1 RNA表达的水平，获取自用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-L1抗体(PDL1)或与4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体(V4+PDL1)联合治疗的小鼠。
图40A和40B.曲线图显示了在源自细胞系的小鼠结肠癌模型中，抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体联合治疗的的体内抗癌活性分析结果。40A显示了不同治疗组的数据，40B显示了在运载体对照组和4M2-C12mIgG2a+抗PD-1治疗组中的各小鼠获得的数据。
图41.条形图显示了肿瘤浸润的CD45+细胞的百分比，该细胞是源自细胞系的小鼠结肠癌模型的第18天肿瘤的g-MDSCs，获取自用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(Anti-PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体(组合)的联合治疗的小鼠。
图42.曲线图显示了在源自细胞系的T细胞白血病/淋巴瘤小鼠模型中抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(Anti-PD1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体(V4+Anti-PD1)联合治疗的体内抗癌活性分析结果。
图43.条形图显示了肿瘤浸润的CD45+细胞的百分比，这些细胞是从T细胞白血病/淋巴瘤的细胞系小鼠模型中获得的第16天肿瘤的g-MDSCs，获取自用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-1抗体(Anti-PD1)或与4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体(Combo)联合治疗的小鼠。
图44.曲线图显示了用PBS(运载体)、抗VISTA抗体4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗PD-L1抗体(Anti-PDL1)或4M2-C12 mIgG2a和抗PD-1抗体(V4+Anti-PD1)联合治疗的源自细胞系的小鼠结直肠癌模型在治疗期间的小鼠体重。
图45A至45D.传感图和表格显示了通过生物层干涉法测定的不同的抗VISTA抗体与人VISTA(45A)小鼠VISTA(45B)和人PD-L1(45C)结合的分析结果。45D总结了根据45A和45B的传感图计算出的动力学和热力学常数。
图46A和46B.传感图和表格显示了通过生物层干涉法测定的不同的抗VISTA抗体与小鼠VISTA结合的分析结果。45B总结了根据46A传感图计算出的动力学和热力学常数。
图47A至47C.传感图和表格显示了通过生物层干涉法测定的不同的抗VISTA抗体与人VISTA(47A)和小鼠VISTA(47B)结合的分析结果。47C总结了根据47A和47B的传感图计算出的动力学和热力学常数。
图48A和48B.传感图和表格显示了通过生物层干涉法测定的不同的抗VISTA抗体与人VISTA以及小鼠VISTA和人CD47结合的分析结果。48B总结了根据48A传感图计算出的动力学和热力学常数。
图49A至49C.浓度-反应图和表格显示了通过ELISA测定的不同抗体与人VISTA(49A)或小鼠VISTA(49B)结合的分析结果。49C显示了不同抗体与所示蛋白质结合的EC50值(nM)。
图50A至50C.浓度-反应图和表格显示了通过ELISA测定的不同抗体与人VISTA(50A)和小鼠VISTA(50B)结合的分析结果。50C显示了不同抗体与所示蛋白质结合的EC50值(nM)。
图51A至51C.浓度-反应图和表格显示了通过ELISA测定的不同抗体与人VISTA(51A)和小鼠VISTA(51B)结合的分析结果。51C显示了不同抗体与所示蛋白质结合的EC50值(nM)。
图52A至52J.熔解曲线图和表格显示了通过差示扫描荧光法分析的不同抗VISTA抗体的稳定性的结果。52A至52I显示了从测试抗体制剂和无蛋白对照(NPC)制剂获得的原始数据的一阶导数，一式三份。52J汇总了52A至52I的结果。
图53.表格汇总了不同抗VISTA抗体在安全性和免疫原性方面的计算机分析结果。
图54.曲线图显示了抗VISTA抗体4M2-C12抑制VISTA和VSIG-3之间结合的分析结果。
图55.条形图显示了抗VISTA抗体克隆4M2-C12(V4)抑制VISTA和PSGL-1结合的结果。
图56A至56G.浓度-反应图显示了通过ELISA法测定的(56A)V4、(56B)V4-C24、(56C)V4-C26、(56D)V4-C27、(56E)V4-C28、(56F)V4-C30和(56G)V4-C31与人VISTA、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、PD-1和CTLA-4结合的分析结果。
图57A至57I.浓度-反应图显示了通过ELISA法测定的(57A)V4、(57B)V4-C24、(57C)V4-C26、(57D)V4-C27、(57E)V4-C28、(57F)V4-C30、(57G)V4-C31和(57H)同种型匹配对照抗体与人VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA和猕猴VISTA结合的分析结果。57I显示不同抗体与所示蛋白质结合的EC50值(M)。
图58A至58C.柱状图显示了通过流式细胞仪测定的不同抗VISTA抗体或同种型对照抗体对细胞的染色。58A显示了抗体与野生型未转染的HEK293-6E细胞的结合。58B显示了抗体与过表达人VISTA蛋白的HEK293-6E细胞的结合。58C显示了抗体与过表达小鼠VISTA蛋白的HEK293-6E细胞的结合。1＝无抗体(未染色)，2＝人IgG1同种型对照抗体，3＝VSTB112IgG1，4＝4M2-C12 IgG1，5＝V4-C24 IgG1，6＝V4-C26 IgG1，7＝V4-C27 IgG1，8＝V4-C28IgG1、9＝V4-C30 IgG1和10＝V4-C31 IgG1。
图59A和59B.图片显示了使用抗VISTA抗体对人体组织进行免疫组织化学染色。在所示的放大倍数下，59A显示了正常人脾脏组织被4M2-C12 mIgG2a染色，而59B显示了正常人卵巢组织被4M2-C12 mIgG2a染色。
图60A至60D.柱状图和条形图显示了抗VISTA抗体4M2-C12-hIgG1(V4)或VSTB112从表达VISTA的细胞抑制中释放激活的T细胞的能力的分析结果。60A和60B显示了在存在VISTA表达细胞和指定量的抗VISTA抗体的情况下持续5天的T细胞增殖的CFSE稀释分析结果。60C和60D显示了5天后在细胞培养上清液中检测到的IFNγ(60C)和TNFa(60D)的浓度。
图61A至61C.条形图显示了抗VISTA抗体4M2-C12-hIgG1(V4)或VSTB112促进LPS刺激的THP-1细胞产生细胞因子的能力的分析结果。61A显示了在细胞培养上清液中检测到的IL-6浓度，而61B显示了在指定量的抗VISTA抗体存在24小时的情况下细胞的细胞培养上清液中检测到的TNFa浓度。61C显示了THP1细胞是VISTA表达细胞；并显示了确定表达VISTA的培养细胞百分比。1＝未染色，2＝用同型匹配的对照抗体染色的细胞，3＝用20μg V4染色的细胞，4＝用40μg V4染色的细胞，和5＝用20μg VSTB112染色的细胞。
图62.条形图显示了抗VISTA抗体4M2-C12-hIgG1或4M2-C12-hIgG4促进LPS刺激的THP-1细胞产生IL-6的能力的分析结果。显示了在细胞培养上清液中检测到的IL-6的浓度。
图63A至63D.曲线图和表格显示了通过抗体血清的ELISA分析对抗VISTA抗体4M2-C12-hIgG1和4M2-C12-hIgG4进行药代动力学分析的结果。显示了施用(63A)10mg/kg、(63B)25mg/kg、(63C)100mg/kg或(63D)250mg/kg抗体后的结果。
图64A至64C.表格显示了在施用50mg/kg 4M2-C12-hIgG1或等体积的PBS后96小时，BALB/C小鼠的代表性血液学特征。64A显示了红细胞的分析结果，64B显示了白细胞的分析结果，64C显示肝肾功能相关的分析结果。RBC＝红细胞，MVC＝平均红细胞体积，MCH＝平均红细胞血红蛋白，MCHC＝平均红细胞血红蛋白浓度，WBC＝白细胞，ALT＝丙氨酸氨基转移酶，ALP＝碱性磷酸酶，CREA＝肌酐，BUN＝血尿素氮。
图65A至65C.表格显示了在施用250mg/kg 4M2-C12-hIgG1、250mg/kg4M2-C12-hIgG4或等体积的PBS后SD大鼠的代表性血液学特征。65A显示了红细胞的分析结果，65B显示了白细胞的分析结果，65C显示了肝、肾、胰腺功能以及电解质水平相关的分析结果。RBC＝红细胞，MVC＝平均红细胞体积，MCH＝平均红细胞血红蛋白，MCHC＝平均红细胞血红蛋白浓度，WBC＝白细胞，ALT＝丙氨酸氨基转移酶，ALP＝碱性磷酸酶，CREA＝肌酐，BUN＝血尿素氮，GLU＝胰高血糖素，AMY＝淀粉酶，NA＝钠，K＝钾，P＝磷，CA＝钙。
实施例
在以下实施例中，发明人描述了靶向VISTA分子中特定目标区域的新型抗VISTA抗体克隆的产生，以及这些抗原结合分子的生物物理和功能表征以及治疗评估。
实施例1：VISTA靶标设计和抗VISTA抗体杂交瘤生产
发明人在人VISTA的细胞外区域(SEQ ID NO：3)中选择了用于产生结合VISTA的单克隆抗体的区域。
FG环区被靶向，因为有人认为VISTA的这一区域对于VISTA的抑制功能很重要(Vigdorovich等人，Structure.2013 21(5):707-717)。VISTA的正面β-片层区也被靶向。
1.1杂交瘤的产生
从InVivos(新加坡)获得约6周龄的雌性BALB/c小鼠。将动物圈养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
为了产生杂交瘤，用抗原肽、重组靶蛋白或表达靶蛋白的细胞的专有混合物免疫小鼠。
在收获脾脏进行融合之前，连续三天用抗原混合物加强小鼠的免疫。在最后一次加强免疫后24小时，根据制造商的说明(干细胞技术，加拿大)，分离总脾细胞，并使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒用PEG与骨髓瘤细胞系P3X63.Ag8.653(ATCC，美国)融合。
将融合细胞在ClonaCell-HY培养基C(干细胞技术，加拿大)中于5％CO2培养箱中37℃培养过夜。第二天，将融合的细胞离心并重悬于10ml的ClonaCell-HY培养基C中，然后与90ml含HAT成分的基于半固体甲基纤维素的ClonaCell-HY培养基D(干细胞技术，加拿大)轻轻混合，将杂交瘤选择和克隆结合到了一个步骤。
然后将融合的细胞接种到96孔板中，并使其在5％CO2培养箱中于37℃下生长。7-10天后，分离出单个杂交瘤克隆，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACs)筛选上清液，从而选择产生抗体的杂交瘤。
1.2抗体可变区扩增和测序
使用TRIzol试剂(美国生命技术公司),用制造商的方案从杂交瘤细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，使用SMARTer RACE 5'/3’试剂盒(ClontechTM，美国)合成了双链cDNA。简而言之，使用5'-RACE CDS引物(试剂盒中提供)将1μg总RNA用于生成全长cDNA，然后根据制造商的说明将5'衔接子(SMARTer II A引物)掺入每个cDNA中。cDNA合成反应包括：5×第一链缓冲液，DTT(20mM)，dNTP Mix(10mM)，RNase抑制剂(40U/μl)和SMARTScribe逆转录酶(100U/μl)。
使用SeqAmp DNA聚合酶(ClontechTM，美国)扩增准备好的race cDNA。扩增反应包含SeqAmp DNA聚合酶，2×Seq AMP缓冲液，5'SMARTer Race试剂盒中提供的5'通用引物(与衔接子序列互补)，以及与相应的重链或轻链恒定区引物退火的3'引物。根据Krebber等人,J.Immunol.Methods 1997；201:35-55,Wang等人,Journal of Immunological Methods2000,233；167–177或Tiller等人,Journal of Immunological Methods 2009；350:183–193先前报道的引物混合物设计5'恒定区。使用以下热实验方案：94℃预变性循环1分钟；94℃，30s，55℃，30s和72℃，45s 35个循环；72℃终延伸3分钟。
使用CloneJET PCR克隆试剂盒(赛默飞世尔科技，美国)将所得的大约550bp的VH和VL PCR产物克隆到pJET1.2/钝载体中，并用于转化高效的大肠杆菌DH5α。使用Miniprep试剂盒(凯杰公司，德国)从所得的转化体中制备质粒DNA，并进行测序。DNA测序由AITbiotech执行。使用国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统(LeFranc等人，Nucleic AcidsRes.(2015)43(数据库期号)：D413-22)来表征各个CDR和框架序列。VH和VL的5'端的信号肽已通过SignalP(v 4.1；Nielsen，刊于Kihara，D(编)：蛋白质功能预测(《分子生物学方法》第1611卷)59-73，Springer 2017)鉴定。
然后选择单克隆抗VISTA抗体克隆用于进一步开发和表征。抗体克隆4M2-C12的人源化形式(在本文中也称为“V4”)也根据标准方法通过将抗体的CDR克隆到包含人抗体框架区的VH和VL中来制备。
实施例2：抗体生产与纯化
2.1将VH和VL克隆到表达载体中：
将编码抗VISTA抗体克隆的重链和轻链可变区的DNA序列亚克隆到pmAbDZ_IgG1_CH和pmAbDZ_IgG1_CL(InvivoGen，美国)真核表达载体中，以构建人-鼠嵌合抗体。
或者，将编码抗VISTA抗体克隆的重链和轻链可变区的DNA序列亚克隆到pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen，美国)真核表达载体中，以构建人-鼠嵌合抗体。由pFUSE-CHIg-hG1编码的人IgG1恒定区相对于人IgG1恒定区(IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO：210)在CH3区中包含D356E、L358M(位置根据EU编号编码)。pFUSE2ss-CLIg-hk编码人IgG1轻链κ恒定区(IGCK；UniProt：P01834-1，v2)。
按照制造商的方案，使用SeqAmp酶(美国ClontechTM)从克隆载体中扩增出可变区以及信号肽。使用与VH或VL中的适当区域具有15-20bp的重叠，并在5'端加上6bp作为限制性位点的正向和反向引物。DNA插入片段和pFuse载体用制造商推荐的限制酶(例如，VH为EcoRI和NheI，VL为AgeI和BsiWI)消化，以确保不引入移码，并使用T4连接酶(赛默飞世尔科技，美国)连接到各自的质粒中。用于连接的DNA插入物与载体的摩尔比为3∶1。
2.2抗体在哺乳动物细胞中的表达
按照制造商的说明，使用1)Expi293瞬时表达系统试剂盒(美国生命技术公司)，或2)HEK293-6E瞬时表达系统(CNRC-NRC，加拿大)表达抗体。
1)Expi293瞬时表达系统：
细胞系培养：
HEK293F细胞(Expi293F)获自生命技术公司(美国)。在无血清、无蛋白质、化学成分确定的培养基(Expi293表达培养基，赛默飞世尔，美国)，并添加50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco，美国)，在带有振动平台的8％CO2和80％加湿培养箱中37℃培养细胞。
转染：
按照其制造商的方案，使用ExpiFectamine 293试剂盒(Gibco，美国)，用表达质粒转染Expi293F细胞。简而言之，对维持状态的细胞进行培养基更换以通过旋转培养物去除抗生素，然后在转染前1天将细胞沉淀重悬于没有抗生素的新鲜培养基中。每次转染在转染当天将2.5×106/ml的活细胞接种在摇瓶中。在减少血清的培养基Opti-MEM(Gibco，美国)中于室温25分钟形成DNA-ExpiFectamine复合物，然后将其加入到细胞中。在转染后16-18小时将增强子加入到转染的细胞中。在转染后第4天，将等量的培养基添加至转染子，以防止细胞聚集。在第7天通过4000x g离心15分钟收获转染子，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
2)HEK293-6E瞬时表达系统
细胞系培养：
HEK293-6E细胞获自加拿大国家研究委员会。在无血清、无蛋白质、化学成分明确的Freestyle F17培养基(英杰公司，美国)，并添加0.1％Kolliphor-P188和4mM L-谷氨酰胺(Gibco，美国)和25μg/ml G-418，在带有振荡平台的5％CO2和80％湿润培养箱中37℃培养细胞。
转染：
按照其制造商的方案，使用PEIproTM(Polyplus，美国)用表达质粒转染HEK293-6E细胞。简而言之，将维持状态下的细胞进行培养基更换以通过离心去除抗生素，在转染前1天将细胞沉淀用不含抗生素的新鲜培养基重悬。每次转染在转染当天将1.5-2×106/ml的活细胞接种在摇瓶中。将DNA和PEIproTM以1：1的比例混合，然后在F17培养基中于室温5分钟形成复合物，然后加入到细胞中。在转染后24-48小时将0.5％(w/v)的胰蛋白N1加入转染子。在第6-7天通过4000x g离心15分钟收获转染子，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
用编码以下多肽组合的载体转染细胞：
2.3抗体纯化
亲和纯化，缓冲液交换和存储：
使用液相色谱系统AKTA Start(GE保健公司，英国)纯化由转染细胞分泌到培养上清液中的抗体。具体地说，将上清液以5ml/min的结合速率加载到HiTrap Protein G色谱柱(GE保健公司，英国)上，然后用10倍柱体积的洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗涤。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱结合的单克隆抗体，并将洗脱液分馏至装有适量的中和缓冲液(1M Tris，pH 9)的收集管中。使用30K MWCO蛋白浓缩器(赛默飞世尔，美国)或3.5K MWCO透析盒(赛默飞世尔，美国)将含有纯化的单克隆抗体的中和洗脱缓冲液交换为PBS。通过0.22μm过滤器对单克隆抗体进行灭菌，将其等分并在-80℃速冻保存。
2.4抗体纯度分析
尺寸排阻色谱法(SEC)：
在AKTA Explorer液相色谱系统(GE保健公司，英国)上，使用Superdex 200 10/30GL色谱柱(GE保健公司，英国)在PBS运行缓冲液中通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析抗体纯度。
在室温下以0.75ml/min的流速将溶于500μlPBS pH 7.2的150μg抗体注入色谱柱。根据蛋白质的分子量洗脱蛋白质。
抗VISTA抗体克隆V4(实施例2.2的[1])的结果如图10所示。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
还根据标准方法通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析抗体纯度。简而言之，使用4％-20％TGX蛋白凝胶(伯乐，美国)通过微型蛋白质电泳系统(伯乐，美国)来解析蛋白质。对于非还原条件，通过将蛋白质样品与2×Laemmli样品缓冲液(伯乐，美国)混合，使其变性，并在上样至凝胶之前于95℃煮沸5-10分钟。对于还原条件，使用了含有5％β-巯基乙醇(βME)或40mM DTT(二硫苏糖醇)的2×样品缓冲液。在SDS运行缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，1％SDS，pH 8.3)中，在150V的恒定电压下电泳1h。
蛋白质印迹：
如上所述，通过SDS-PAGE分离蛋白质样品(30μg)，并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭，并在4℃下用抗体免疫印迹过夜。在PBS-Tween中洗涤3次后，然后将膜与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体在室温下孵育1小时。通过化学发光的Pierce ECL底物蛋白质印迹检测系统(赛默科技，美国)和放射自显影胶片(Kodak XAR胶片)对结果进行可视化。
用于检测的第一抗体是山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(LI-COR，货号：926-32210)。
抗VISTA抗体克隆V4(实施例2.2的[1])的结果如图11所示。V4易于表达，纯化和在高浓度下处理。
实施例3：生物物理表征
3.1流式细胞术分析细胞表面抗原结合
将野生型HEK293T细胞(不表达高水平的VISTA)和用编码人VISTA的载体转染的HEK293T细胞(即HEK 293HER O/E细胞)与20μg/ml抗VISTA抗体或同型对照抗体一起在4℃下孵育1小时。如WO 2015/097536中所述的抗VISTA抗体克隆VSTB112被包括在分析中作为阳性对照。
将细胞用FACS缓冲液(含5mM EDTA和0.5％BSA的PBS)洗涤三次，并在2-8℃下重悬于结合FITC的抗FC抗体(英杰公司，美国)中40分钟。再次洗涤细胞，并重悬于200μLFACS流缓冲液(含5mM EDTA的PBS)中，使用MACSQuant 10(美天旎生物技术，德国)进行流式细胞分析。采样后，使用Flowlogic软件分析所有原始数据。使用前向和侧面散射曲线对细胞进行门控，并确定天然和过表达细胞群体的荧光强度中值(MFI)值。
结果显示在图1A至1D，图2和图24中。显示抗VISTA抗体以高特异性结合人VISTA。
在一个单独的实验中，分析了13D5p(实施例2.2的[14])与编码食蟹猕猴VISTA或鼠VISTA的载体转染的细胞结合的能力。结果发现13D5p表现出与食蟹猕猴VISTA和鼠VISTA的交叉反应性。
3.2使用Octet QK384系统的总体亲和力研究
使用Octet QK384系统(ForteBio)进行了生物层干涉(BLI)实验。使用抗Penta-HIS(HIS1K)涂层的生物传感器探头(Pall ForteBio，美国)来捕获带有His标记的人、食蟹猕猴或鼠VISTA(270nM)。所有测量均在25℃下以1000rpm的转速进行。抗原结合的动力学测量是通过将不同浓度的抗VISTA抗体(图中所示)加载120s，然后通过将生物传感器转移到含有测定缓冲液的孔中进行120s解离时间来进行的。传感图参考缓冲液效果，然后使用Octet QK384用户软件(Pall ForteBio，美国)进行拟合。使用一个位点结合模型对动力学响应进行整体拟合，以获得缔合(kon)，解离(koff)速率常数和平衡解离常数(KD)的值。分析中仅包含可通过软件可靠拟合的曲线(R2>0.90)。
用于分析抗VISTA抗体克隆V4(即实施例2.2的[1])的结合情况的代表性传感图显示在图3A至3C中。
发现抗VISTA抗体克隆V4以KD＝＜1pM的亲和力结合人和食蟹猕猴VISTA，并且以KD＝113nM的亲和力结合鼠类VISTA。
3.3用于确定抗体特异性的ELISA
ELISA用于确定抗体的结合特异性。分析了抗VISTA抗体与人VISTA多肽，小鼠和食蟹猕猴的同系物以及人PD-L1和人HER3的结合(北京义翘神州科技股份有限公司，中国)。
ELISA根据标准方案进行。简而言之，在37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)中，用1μg/ml的目标蛋白包被96孔板(Nunc，丹麦)2小时。在室温下用10％BSA的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1小时后，将测试抗体进行连续稀释(12点连续稀释)，最高浓度为30μg/ml，并添加到平板中。在室温下孵育1小时后，将板子用含有0.05％Tween 20的TBS(TBS-T)洗涤3次，然后与HRP偶联的抗小鼠IgG抗体(生命科技有限公司，美国)在室温下孵育1小时。洗涤后，在室温下用比色检测底物3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(Turbo-TMB；Pierce，美国)显影板子15分钟。用2MH2SO4终止反应，并在30分钟内在450nM测量OD值。
用抗VISTA抗体克隆V4(实施例2.2的[1])获得的结果如图4A所示。结果发现克隆V4能够结合人、食蟹猕猴和鼠VISTA，但没有显示出与人PD-L1或人HER3的交叉反应性(即使在非常高的浓度下)。
用抗VISTA抗体克隆13D5-1(实施例2.2的[15])获得的结果如图20所示。结果发现克隆13D5-1能够结合人、食蟹猕猴和小鼠VISTA。
用抗VISTA抗体克隆13D5-13(实施例2.2的[16])获得的结果如图21所示。结果发现克隆13D5-13能够结合人和小鼠VISTA。
在进一步的实验中，通过ELISA分析抗VISTA抗体克隆V4(实施例2.2的[1])结合人VISTA、PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7和CTLA4的能力。结果显示在图4C中。发现克隆V4不与PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7或CTLA4发生交叉反应。
3.4通过差示扫描荧光法分析热稳定性
简而言之，在25μLPBS中制备0.2mg/mL的抗体和SYPRO Orange染料(赛默飞世尔)的三份反应混合物，转移到MicroAmp Optical 96孔反应板(赛默飞世尔)的孔中，并用MicroAmp光学胶膜(赛默飞世尔)密封。熔解曲线在7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems)中运行，选择TAMRA作为报告基因，ROX作为被动参考。热曲线包括在25℃下2分钟的初始步骤和在99℃下2分钟的最终步骤，其升温速率为1.2％。将原始数据的一阶导数绘制为温度的函数，以获得导数熔解曲线。从导数曲线的峰中提取抗体的解链温度(Tm)。
通过差示扫描荧光法分析抗体克隆V4 IgG1形式(即实施例2.2的[1])的热稳定性获得的原始数据的一阶导数如图9所示。测定的Tm为67.5℃。
实施例4：功能表征
4.1VISTA和VSIG-3之间的相互作用
发明人通过使用Octet QK384系统(ForteBio)的生物层干涉术(BLI)分析来研究VSIG-3是否充当VISTA的配体。简而言之，使用抗人Fc捕获生物传感器捕获浓度为100nM的带有Fc标签的VSIG-3，并测量捕获的VSIG-3与3次连续稀释后从3000nM开始的浓度施加的VISTA的结合，并与PBS对照进行比较。
代表性的传感图如图5所示。VSIG-3和VISTA之间的缔合亲和力经计算为～KD＝5.28μM。
接下来，发明人分析了抗VISTA抗体抑制VISTA和VSIG-3之间相互作用的能力。
简而言之，将96孔板(Nunc，丹麦)在1×PBS中用1μg/ml的未标记或Fc标记的VSIG-3(R&D系统，美国)在4℃下包被16小时。在室温下用1％BSA的TBS封闭1小时后，在存在或不存在浓度不断增加的抗VISTA抗体的情况下，添加15μg/ml的VISTA/人组氨酸标签的融合蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司，中国)，并在室温下孵育1小时。随后将板子用TBS-T洗涤3次，并在室温下与HRP缀合的抗His二抗孵育1小时。洗涤后，用比色检测底物Turbo-TMB(Pierce，美国)对板子进行显影。用2M H2SO4终止反应，在450nM测量OD值。
抗VISTA抗体克隆5M1-A11和9M2-C12(实施例2.2的[10]和[13])获得的结果如图6所示。抗VISTA抗体对VISTA与VSIG-3之间的相互作用呈剂量依赖性抑制。
在进一步的实验中，分析了4M2-C12 IgG1(实施例2.2的[1])对VISTA和VSIG-3之间相互作用的抑制。对无关靶抗原具有特异性的抗体和人IgG1同种型对照对VISTA：VSIG-3相互作用的抑制也被作为对照条件进行了分析。结果如图32所示。结果发现4M2-C12 IgG1以剂量依赖性方式抑制VISTA：VSIG-3相互作用。
在另一实验中，在将VISTA-Fc用作捕获剂的测定中分析了4M2-C12 IgG1(实施例2.2的[1])对VISTA和VSIG-3之间相互作用的抑制。简而言之，在室温下将384孔板的孔用30μl的0.5μg/ml VISTA-Fc包被1小时。用PBS-T洗涤板子，并在室温下用1％BSA的TBS溶液封闭1小时。将4M2-C12 IgG1或人IgG1同型对照抗体的连续稀释液与0.3μg/ml的VISG3-His一起添加到平板中。在室温下孵育1小时后，将板子用PBS-T洗涤五次，并在室温下与山羊抗-HIS-HRP孵育1小时。用PBS-T洗涤板子五次，并用Turbo-TMB显影。用2M H2SO4终止反应，在450nM测量OD值。
结果如图54所示。结果发现4M2-C12 IgG1以剂量依赖性方式抑制VISTA：VSIG-3相互作用。
4.2VISTA和PSGL-1之间的相互作用
接下来，发明人研究了在基于流式细胞术的测定中PSGL-1是否充当VISTA的配体。
简而言之，将经修饰以过表达人VISTA蛋白的100,000个HEK293T细胞(通过转染编码人VISTA的构建体)与4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])或同种型匹配的对照抗体以20μg/ml，40μg/ml或80μg/ml的浓度在包含HBSS，0.5％BSA和2mM EDTA pH 6.0的缓冲液中于4℃共孵育15分钟。将15μg/ml带有Fc标签的人PSGL1(R&D系统，货号：3345-PS)或等量的带有Fc标签的无关抗原添加到细胞中，然后将其在4℃下再孵育45分钟。随后将细胞用缓冲液洗涤3次，然后加入稀释因子为(1:11)的FITC偶联的抗PSGL1抗体(Miltenyi Biotec，货号：130-104-706)或加入稀释因子为1：200的Alex488偶联抗-Fc抗体，并将细胞在4℃下孵育15分钟。然后将细胞用缓冲液洗涤三次，并通过流式细胞仪进行分析。
结果如图55所示。结果发现4M2-C12-hIgG1以剂量依赖性方式抑制PSGL-1与VISTA的结合。
4.3抑制VISTA介导的信号传导
发明人通过使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定法的分析，研究了抗VISTA抗体克隆13D5p是否可以抑制VISTA介导的信号传导。
简而言之，根据制造商的说明，使用Septamate试剂盒(干细胞技术，加拿大)从不相关的供体中分离PBMC(以获得刺激物和效应物群体)。刺激细胞在37℃下用50μg/mL丝裂霉素C(西格玛奥德里奇，美国)处理20分钟，并在用1×PBS洗涤5次后使用。在存在或不存在递增浓度的测试抗体的情况下，以最高20μg/ml的浓度开始接种刺激种群，每孔接种0.5×105个细胞，反应种群的剂量为每孔1.0×105个细胞。5天后，收集上清液，并按照标准方案通过ELISA测定IL-17、IL-2A和IFN-γ的水平。
结果如图7A和7B所示。结果发现抗VISTA抗体13D5p导致IL-17、IL-2和IFN-γ的水平增加。图8A和8B显示了使用抗PD-L1抗体克隆MIH5(赛默飞世尔科技)在相同测定中获得的结果。
实施例5：体内分析
对于体内研究，以小鼠IgG2a形式生产了4M2-C12。所述分子是具有SEQ ID NO：248所示序列的重链多肽和具有SEQ ID NO：250所示序列的轻链多肽的异聚体。通过在CHO细胞中共表达编码重链和轻链多肽的核酸来生产4M2-C12 mIgG2a，然后将其纯化。
5.1药代动力学分析
将约6-8周龄的C57BL/6小鼠饲养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
施用600μg抗VISTA抗体，并在施用后在基线(-2小时)、0.5小时、6小时、24小时、96小时、168小时和336小时通过心脏穿刺从3只小鼠中获得血液。血清中的抗体通过ELISA定量。
药代动力学分析的参数来源于非房室模型：
最大浓度(Cmax)，AUC(0-336小时)，AUC(0-无穷大)，半衰期(t1/2)，间隙(CL)，稳态下的分布体积(Vss)。
抗VISTA抗体克隆V4(实施例5的[17])获得的结果如图12所示。结果发现所述抗体克隆的半衰期为11.7天。
5.2体内治疗癌症的疗效分析
从InVivos(新加坡)购买约6-8周大的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠。将动物圈养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
研究中使用的细胞系包括从ATCC获得的LL2细胞(Lewis肺癌)、4T1细胞(乳腺癌)、CT26细胞(结肠癌)、Clone-M3细胞(黑色素瘤)和EL4细胞(T细胞白血病/淋巴瘤)。B16-BL6细胞(黑色素瘤)获自Creative Bioarray。按照供应商的说明培养细胞系；在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养LL2细胞、B16-BL6细胞和EL4细胞，并在补充有10％FBS和1和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640中培养4T1细胞和CT26细胞。Clone-M3细胞在补充了2.5％FBS，15％马血清和1％青霉素/链霉素的F12-K培养基中生长。将所有细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养。
通过将LL2(2×105)、4T1(5×105)、CT26(1×105-1×106)、Clone-M3(5×105)、EL4(2×105)或B16-BL6(1×105)皮下注射到小鼠的右侧腹来生成同源肿瘤模型。
植入后3天，每3天腹膜内施用抗VISTA抗体，共6剂。对照组以相同的剂量间隔接受运载体治疗。
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦对照组的肿瘤长度>1.5cm，就认为已达到研究终点。
5.2.1CT26细胞模型
图13显示了在CT26细胞系衍生的同源性小鼠结肠癌模型中将抗VISTA抗体克隆V4(实施例5[17])与抗PD-L1抗体克隆10F.9G2的抗癌作用进行比较的实验结果。通过将100,000个CT26细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹中建立模型(每个治疗组n＝8只小鼠)。
从第3天起以每3天每剂300μg的剂量施用V4或抗PD-L1抗体。分析中还包括每剂300μg V4+300μg抗PD-L1抗体的联合治疗。
发现抗VISTA抗体克隆V4在此模型中非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约60％。
在第21天，根据Newman等人，Nat Methods.(2015)12(5):453-457中描述的方法，收获肿瘤并通过RNA-seq分析评估Arg1RNA的表达。Nat Methods.(2015)12(5):453-457.结果如图39所示。在第21天，用4M2-C12治疗与肿瘤中Arg1表达的显著降低有关。
在另一个实验中，通过将100,000个CT26细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹中(每个治疗组n＝8只小鼠)，建立了CT26细胞系衍生的同系小鼠结肠癌模型，并从第3天起通过给予小鼠每3天每剂300μg同种型对照抗体、抗PD-L1抗体克隆10F.9G2、抗VISTA抗体克隆V4(实施例5的[17])、抗TIGIT抗体克隆1G9、抗LAG-3抗体克隆C9B7W、抗TIM-3抗体克隆RMT3-23或每剂300μg抗PD-L1抗体克隆10F.9G2与每剂300μg其他抗体的联合治疗也包括在内分析。
图14显示了在第15天检测到的对肿瘤生长的抑制作用的计算结果。在该实验中，发现抗VISTA抗体克隆V4是比任何其他针对免疫检查点分子的单一疗法更有效的肿瘤生长抑制剂，并且发现与抗PD-L1疗法联合使用效果更好。
发明人进行了进一步的实验，其中以相同的方式建立了CT26肿瘤，然后每两周给小鼠施用300μg抗VISTA抗体克隆V4、200μg抗PD-L1抗体克隆10F.9G2、300μg抗-VISTA抗体克隆V4+200μg抗PD-L1抗体克隆10F.9G2或以PBS为对照条件。在实验结束时，通过RNA-Seq分析肿瘤以确定MDSC、CD8+T细胞和Treg的相对数目，根据如Newman等人，Nat Methods.(2015)12(5)：453-457中所述的方法，其通过引用整体并入本文。
结果如图15所示。发现用抗VISTA抗体克隆V4治疗(单独或与抗PD-L1治疗联合使用)可减少MDSC的数量，并增加CD8 T细胞：Treg比率。与抗VISTA抗体治疗相关的肿瘤微环境中基因表达变化的分析还显示，与吞噬过程有关的基因表达(例如基于肌动蛋白丝的运动)上调，而精氨酸酶1的表达下调(导致免疫抑制环境降低)。
在进一步的实验中，如上所述，在Balb/C小鼠中建立了CT26细胞系衍生的同系小鼠结肠癌模型，并从第3天以及每3天向小鼠给药：(i)600μg抗VISTA抗体克隆13D5-1，(ii)200μg抗PD-L1抗体克隆10F.9G2，(iii)600μg抗VISTA抗体克隆13D5-1+200μg抗PD-L1抗体克隆10F.9G2，或(iv)等体积的PBS(作为阴性对照)。
结果如图22所示。发现在该模型中，抗VISTA抗体克隆13D5-1(单独或与抗PD-L1治疗联合使用)能够抑制肿瘤生长。
5.2.2 LL2细胞模型
通过向Balb/c小鼠的右侧腹皮下注射200,000个LL2细胞(每个治疗组n＝8小鼠)来建立LL2模型，随后每两周给予小鼠600μg抗VISTA抗体克隆V4(实施例5的[17])或等体积的运载体作为阴性对照。
实验结果如图16所示。发现在该模型中，抗VISTA抗体克隆V4具有很高的效力-能够抑制约44％的肿瘤生长。
5.2.3 B16-BL6细胞模型
通过将200,000个B16-BL6细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧腹中(每个治疗组n＝8小鼠)建立了B16-BL6模型，随后每两周(共6剂)给予小鼠600μg抗VISTA抗体克隆V4(实施例5的[17])、200μg抗PD-1抗体RMP1-14(Bio X Cell)、600μg抗VISTA抗体克隆V4+200μg抗PD-1抗体，或等体积的运载体作为阴性对照。
实验结果如图17所示。发现在该模型中，抗VISTA抗体克隆V4与抗PD-1抗体治疗相结合非常有效。
5.2.4 4T1细胞模型
通过将250,000个4T1细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹中建立了4T1细胞系衍生的同系小鼠乳腺癌模型。
随后从第3天开始，每3天(共6剂)向小鼠施用300或600μg抗VISTA抗体克隆13D5-1、同种型对照抗体或等体积的运载体作为阴性对照。
实验结果如图23所示。发现抗VISTA抗体克隆13D5-1在该模型中非常有效-能够抑制约70％的肿瘤生长。
5.3安全药理学，毒理学和免疫毒性
使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等人，Nucleic Acids Res.，38，D301-307(2010))和IEDB脱免疫(Dhanda等人，Immunology.，(2018)153(1)：118-132)工具在计算机上分析了抗VISTA抗体克隆V4和人源化版本V4H1和V4H2的安全性和免疫原性。(2018)153(1):118-132)tools.
抗VISTA抗体克隆V4H1和V4H2与人的重链和轻链具有足够的同源性，可以被认为是人源化的(即>85％)，潜在的免疫原性肽的数量很少被认为是安全的，并且不具有其他任何可以导致潜在的可延展性问题。
在实施例5.2中描述的实验过程中，发明人还称重并分析了小鼠的大体尸检(gross necroscopy)迹象；用抗VISTA抗体克隆V4治疗的小鼠与PBS治疗的对照小鼠没有任何差异。图44显示了在实施例5.2.1中描述的研究过程中获得的结果。
发明人在实验中进一步研究了在实验中被注射了单剂量的900μg抗VISTA抗体克隆V4或等体积的PBS的小鼠的血液毒性。
获得血液样本并使用HM5血液学分析仪分析不同类型白细胞的数量。结果如图18所示。不同细胞类型的数量在查尔斯河(Charles River)参考范围内，并且在V4和PBS治疗组之间没有差异，并且在不同组之间未检测到临床体征、大体尸检或体重差异。
还对小鼠进行了肝毒性和肾毒性的相关分析，结果如图19所示。检测到的水平在查尔斯河参考范围内，在V4和PBS处理组之间没有差异。
5.4晚期实体瘤的治疗
首先在人中
通过静脉内注射抗VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])、或V4H2(实例2.2的[4])来治疗具有标准疗法治疗后疾病进展或治疗不耐受，器官功能和ECOG状况良好的晚期或转移性实体瘤患者，剂量应根据安全调整后的“最小预期生物效应水平”(MABEL)方法进行计算。给药后监测患者28天。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，以及确定分子的药代动力学。
发现使用抗VISTA抗体治疗是安全且可耐受的。
剂量递增–单一疗法
患有晚期或转移性实体瘤，其标准疗法治疗后疾病进展或治疗后不耐受且器官功能和ECOG状况良好的患者(n＝18-24)，
通过静脉内注射抗VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])或V4H2进行治疗(示例2.2的[4])，根据基于3+3模型的过量剂量控制(EWOC)的剂量递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。还确定了最大耐受剂量(MTD)和最大给药剂量(MAD)。
剂量递增–联合治疗
标准疗法治疗后疾病进展或治疗后不耐受且器官功能和ECOG状态良好(n＝9)的晚期或转移性实体瘤患者使用抗VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])或V4H2(实施例2.2的[4])治疗，根据基于3+3模型的抗PD-1或抗PD-L1抗体(3mg/kg)剂量递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。
剂量扩大
分析经治疗的患者的总体缓解率、肿瘤标志物的表达、循环肿瘤细胞、无进展生存期、总体生存期、安全性和耐受性。
发现抗VISTA抗体是安全且可耐受的，能够减少癌细胞的数量/比例，减少肿瘤细胞标志物的表达，增加无进展生存期并增加总体生存期。
5.5淋巴瘤的治疗
首先在人中
不能从1线化疗中受益，未接受同种异体干细胞移植并且可能对利妥昔单抗(NHL)和纳武利尤单抗或派姆单抗(HL)有反应的淋巴瘤患者(NHL和HL)通过静脉注射抗-VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])或V4H2(实施例2.2的[4])治疗，其剂量根据安全调整后的“最小预期生物效应水平”(MABEL)方法计算。给药后监测患者28天。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，以及确定分子的药代动力学。
发现使用抗VISTA抗体治疗是安全且可耐受的。
剂量递增–单一疗法
不能从1线化疗中受益，未接受同种异体干细胞移植并且可能对利妥昔单抗(NHL)和纳武利尤单抗或派姆单抗(HL)有反应的淋巴瘤患者(NHL和HL)通过静脉注射抗-VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])或V4H2(实施例2.2的[4])治疗，根据基于3+3模型的过量控制(EWOC)剂量递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。还确定了最大耐受剂量(MTD)和最大给药剂量(MAD)。
剂量递增–联合治疗
不能从1线化疗中受益，未接受同种异体干细胞移植并且可能对利妥昔单抗(NHL)和纳武利尤单抗或派姆单抗(HL)有反应的淋巴瘤患者(NHL和HL)通过静脉注射抗-VISTA抗体V4(实施例2.2的[1])、V4H1(实施例2.2的[3])或V4H2(实施例2.2的[4])治疗，根据基于3+3模型的抗PD-L1抗体剂量递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。
剂量扩大
分析经治疗的患者的总体缓解率、癌细胞标志物的表达、循环中的癌细胞、无进展生存期、总体生存期、安全性和耐受性。
发现抗VISTA抗体是安全且可耐受的，能够减少癌细胞的数量/比例，减少肿瘤细胞标志物的表达，增加无进展生存期并增加总体生存期。
实施例6：包含不同Fc区的VISTA结合抗体的生产和表征
6.1包含不同Fc区的VISTA结合抗体的生产和表征
以小鼠IgG2a LALA PG形式生产4M2-C12。该分子是具有SEQ ID NO：249所示序列的重链多肽和具有SEQ ID NO：250所示序列的轻链多肽的异聚体。重链序列包括在CH2区中的在根据SEQ ID NO：253编号的4和5位的亮氨酸(L)至丙氨酸(A)的取代，以及在根据SEQID NO：253编号的99位的脯氨酸(P)至甘氨酸(G)的取代。这些取代在文献中称为L234A、L235A和P329G，并描述于例如在Lo等人，J.Biol.Chem.Chem(2017)292(9)：3900-3908中的小鼠IgG2a Fc，其通过引用整体并入本文。通过在CHO细胞中共表达编码重链和轻链多肽的核酸来生产4M2-C12mIgG2a LALA PG，然后将其纯化。
也以小鼠IgG2a NQ形式生产4M2-C12。该分子是具有SEQ ID NO：258所示序列的重链多肽和具有SEQ ID NO：250所示序列的轻链多肽的异聚体。重链序列在根据SEQ ID NO：253的CH2区中的67位处包含天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)的取代。该取代在文献中称为N297Q，并描述于例如在Lo等人，J.Biol.Chem.化学(2017)292(9)：3900-3908中的小鼠IgG2a Fc。通过在CHO细胞中共表达编码重链和轻链多肽的核酸来产生4M2-C12 mIgG2aNQ，然后将其纯化。
4M2-C12以小鼠IgG1形式生产。该分子是具有SEQ ID NO：266所示序列的重链多肽和具有SEQ ID NO：250所示序列的轻链多肽的异聚体。通过在CHO细胞中共表达编码重链和轻链多肽的核酸来生产4M2-C12 mIgG1，然后将其纯化。
6.2分析包含不同Fc区的VISTA结合抗体与Fc受体的结合
通过ELISA评估不同抗体形式的4M2-C12与人、食蟹猴和鼠类VISTA蛋白的结合，并使用Pall ForteBio Octet QK 384系统通过BLI评估与小鼠Fcγ受体和小鼠FcRn的结合。
组氨酸标签的mFcγRIV(50036-M08H)、mFcγRIII(50326-M08H)、mFcγRIIb(50030-M08H)和mFcRn(CT009-H08H)是从义翘神州科技获得的。抗Penta-HIS(HIS1K)生物传感器购自Forte Bio(18-5120)。
对于动力学实验，将抗Penta-HIS生物传感器在PBS缓冲液(pH 7.2)中孵育60秒以获得第一个基线，然后将200nMmFcγRIV(hFcγRIIIa的同源物)、160nMmFcγRIII(hFcγRIIa直系同源物)、75nMmFcγRIIb(hFcγRIIb直向同源物)或120nM mFcRn在PBS(pH 7.2)中加载120秒。加载后，将生物传感器在PBS缓冲液(对于Fcγ受体的pH值为7.2，对于FcRn的pH值为5.8)中孵育60秒钟，以获得第二个基线，并用6.2倍稀释的系列测试抗体(对于mFcγ受体结合为2000nM-62.5nM，对于FcRn结合为500nM-15.6nM)在PBS中(对于Fcγ受体的pH值为7.2，对于FcRn的pH值为5.8)孵育60秒，以获得关联曲线。最后，将生物传感器在PBS中孵育120秒(对于mFcγR的pH值为7.2，对于mFcRn的pH值为5.8)，以获得解离曲线。通过将缔合和解离数据与1：1结合模型进行整体拟合来计算动力学常数和亲和常数。
4M2-C12-mIgG1与不同的小鼠Fcγ受体和小鼠FcRn结合的分析结果如图25A至25D所示。
4M2-C12-mIgG2a与不同的小鼠Fcγ受体和小鼠FcRn结合的分析结果如图26A至26D所示。进行了两个独立的实验(1和2；参见图29A至29C)；图26A至26D显示了实验2中获得的结果。对于不同的Fcγ受体检测到的结合水平与科学文献中报道的水平相当。
4M2-C12-mIgG2a LALA PG与不同的小鼠Fcγ受体和小鼠FcRn结合的分析结果如图27A至27D所示。与mFcγRIV、mFcγRIII和mFcγRIIb的结合水平是可忽略的/不可检测的，与mFcRn的结合水平类似于4M2-C12-mIgG2a与mFcRn的结合水平。
4M2-C12-mIgG2a NQ与不同的小鼠Fcγ受体和小鼠FcRn结合的分析结果如图28A至28D所示。
确定的4M2-C12-mIgG1、4M2-C12-mIgG2a、4M2-C12-mIgG2a LALA PG和4M2-C12-mIgG2a NQ与不同Fc受体结合的Kon、Kdis和KD值总结于图29A至29C的表中。
实施例7：包含不同Fc区的VISTA结合抗体的体内分析
评价了4M2-C12-mIgG2a和4M2-C12-mIgG2a LALA PG(参见实施例6.1)在同系EL4T细胞白血病/淋巴瘤模型中体内治疗癌症的功效。
EL4细胞在补充有10％马血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养。将细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养。
从InVivos(新加坡)获取约6周龄的C57BL/6小鼠。将动物圈养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。在C57BL/6小鼠的右侧腹接种2×105个EL4 T细胞白血病/淋巴瘤细胞。肿瘤植入后，当肿瘤的大小达到350至400mm3时，将小鼠随机分为以下治疗组：a)运载体对照(PBS)，b)4M2-C12 mIgG2a(实施例5的[17]，或c)4M2-C12 mIgG2a-LALA PG(实施例6的[18])，剂量为25mg/kg。每3天腹膜内给药治疗，共5剂。
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦运载体对照治疗组的肿瘤长度>1.5cm，就认为已达到研究终点。
结果显示在图30A至30C中。到研究的最后一天(植入后第23天)，LAM PG治疗组4M2-C12 IgG2a和4M2-C12 IgG2a的平均肿瘤体积均小于可靠测量的大小(<30mm3)。相比之下，到第18天，运载体(PBS)治疗组小鼠的平均肿瘤体积超过2000mm3，所有动物均被安乐死。
因此，发现4M2-C12在IgG2a和IgG2a LALA PG形式均显示出对肿瘤生长的有效抑制作用。
发现用抗VISTA抗体4M2-C12治疗高度成熟的EL4荷瘤小鼠作为单一疗法非常有效，并导致肿瘤清除。
发现4M2-C12的生物学活性不依赖于鼠类Fcγ受体的参与，强烈表明4M2-C12通过抑制VISTA介导的信号传导发挥其生物学活性。
实施例8：抗体结合的VISTA表位分析
评价抗VISTA抗体以确定它们是否彼此竞争结合VISTA。
前期已经表明VSTB112在多个区域中结合VISTA。已经提出主要表位对应于SEQ IDNO：1(即SEQ ID NO：271和272)的59至68位和86至97位。已经提出次要表位对应于SEQ IDNO：1(即SEQ ID NO：273和274)的71至84位和150至166位。参见例如WO 2017/137830 A1，例如在第[0302]段。VSTB112描述于例如在WO 2015/097536 A2中，其通过引用整体并入本文。
IGN175A被认为在成熟蛋白的前32个氨基酸内(即在SEQ ID NO：1的33至64位(即SEQ ID NO：275)内)与VISTA结合。IGN175A例如在WO 2014/197849A2中所述，其通过引用整体并入本文。
使用Octet QK384系统(ForteBio)通过BLI进行抗原决定簇合并实验。简而言之，将PBS中的人VISTA-His重组蛋白(4.7μg/ml)固定在Anti-Penta His传感器(HIS1K，ForteBio)上5分钟。测量PBS中的基线信号30秒钟，然后将400nM饱和抗体加载到PBS中10分钟，并以1000rpm的振荡速度，然后使用PBS进行120秒的解离步骤。随后将生物传感器用PBS中的300nM竞争抗体以1000rpm的振荡速度处理5分钟，然后使用PBS进行120秒的解离步骤。
在实验中分析了以下抗原结合分子：
·IgG1形式的4M2-C12(V4)(实施例2.2的[1])
·人源化且亲和力成熟的IgG1形式的4M2-C12(V4-C1)变异体(实施例13的[21])
·IGN175A IgG1(包含IGN175A HC(SEQ ID NO：267)+IGN175A LC(SEQ ID NO：268))
·VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(SEQ ID NO：269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO：270))
研究了以下抗原/饱和抗体/竞争抗体组合：
| 抗原 | 饱和抗体 | 竞争抗体 |
| 人类VISTA | V4-C1 IgG1 | IGN175A IgG1 |
| 人类VISTA | V4-C1 IgG1 | V4-C1 IgG1 |
| 人类VISTA | V4-C1 IgG1 | VSTB112 IgG1 |
| 人类VISTA | VSTB112 IgG1 | IGN175A IgG1 |
| 人类VISTA | IGN175A IgG1 | V4-C1 IgG1 |
| 人类VISTA | VSTB112 IgG1 | V4-C1 IgG1 |
| 人类VISTA | IGN175A IgG1 | IGN175A IgG1 |
| 无(PBS) | V4-C1 IgG1 | IGN175A IgG1 |
结果如图31A和31B所示。
发现V4和V4-C1 IgG1不与IGN175A竞争结合VISTA。发现VSTB112与V4、V4-C1和IGN175A部分竞争与VISTA的结合。添加竞争抗体后反应的变化(以nm为单位)如下所示。
结果表明，4M2-C12和IGN175A结合到VISTA的局部远区，而VSTB112在4M2-C12和IGN175A的近端区域与VISTA结合。
V1-C1和IGN175A不竞争与VISTA结合的事实，以及VSTB112与IGN175A竞争与VISTA结合的观察结果，表明包含4M2-C12 CDR的抗体与VISTA的抗原决定簇结合IGN175A与IGN175A结合的VISTA的表位不同，并且与VSTB112结合的VISTA的表位也不同。
通过分析VISTA的序列，用于产生4M2-C12的免疫原和物种交叉反应性数据，发明人得出结论，4M2-C12及其衍生物与SEQ ID NO：322(对应SEQ ID NO：1的76到81位)所示序列结合。
实施例9：VISTA结合抗体回补VISTA介导的T细胞增殖抑制作用的能力分析
在体外分析中分析了抗VISTA抗体回补VISTA介导的信号传导抑制作用的能力。
简而言之，96孔板以1：1(2.5μg/ml抗CD3：2.5μg/ml VISTA/对照)或2：1(2.5μg/ml抗CD3：1.25μg/ml VISTA/对照Ig)的浓度比率包被抗CD3和VISTA-Ig或对照-Ig。无关的抗原-Ig用作对照条件。将板在4℃下孵育过夜。
从新鲜采集的血液样本中纯化PBMC，并使用人泛T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)进一步富集T细胞。然后将富集的T细胞群用CFSE标记。
用PBS将孔洗涤3次，并在添加了10％FBS的完全RPMI 1640培养基中，在终浓度为20μg/ml或50μg/ml的4M2-C12 IgG1存在的情况下，或在终浓度为20μg/ml的VSTB 1 12存在的情况下，或在没有添加抗体的情况下，向每个孔中添加100,000CFSE标记的T细胞。
5天后，收获细胞，用荧光缀合的抗CD4和抗CD8抗体标记，并使用MacsquantAnalyzer 10通过流式细胞术进行分析。
实验结果如图33A至33D所示。发现4M2-C12恢复了CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖能力。
重要的是，发现4M2-C12在恢复T细胞增殖方面比VSTB112更有效。
实施例10：VISTA结合抗体促进THP1细胞响应LPS产生IL-6的能力分析
在体外试验中分析了抗VISTA抗体响应LPS刺激促进THP-1细胞产生IL-6的能力。
简而言之，将未分化的THP1细胞一式两份地接种在96孔板中(100,000个细胞/孔)，在没有FBS或青霉素/链霉素的RPMI培养基中。随后在浓度范围从2000μg/ml至7.8μg/ml的4M2-C12 IgG1(实施例2.2的[1])，或不同浓度的范围从1000μg/ml至7.8μg/ml的VSTB112存在的情况下，用LPS(终浓度为100μg/ml)和MnCl2(100μM)处理的细胞。3天后，收集细胞培养上清液，并使用IL-6人ELISA试剂盒(Invitrogen)通过ELISA分析以确定IL-6的水平。
结果如图34A和34B所示。发现与比VSTB112相比，4M2-C12可以促进LPS刺激的THP1细胞产生更多的IL-6。
实施例11：VISTA结合抗体促进体内IL-6产生的分析
体内研究了响应4M2-C12治疗的IL-6产生。
简而言之，对C57BL/6小鼠(n＝3)施用600μg单剂量的4M2-C12 mIgG2a(实施例5的[17])，在给药前2小时和0.5小时，以及给药后6小时、24小时、96小时、168小时和336小时从小鼠采集血液样本，。
使用小鼠IL-6ELISA试剂盒(Abcam，ab100712)分析血清中的IL-6含量。
结果如图35所示。4M2-C12 mIgG2a给药后0.5小时，在血清中检测到IL-6。
实施例12：单独或与抗PD-1/PD-L1抗体联合使用的VISTA结合抗体的体内分析
12.1 CT26细胞模型
通过将1×105个CT26细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹，生成T细胞白血病/淋巴瘤的同源模型。
每3天对小鼠(每个治疗组7个)进行腹膜内给药，共7剂，其剂量为：
·600μg4M2-C12 IgG2a(实施例5的[17])
·200μg抗PD-1抗体(克隆RMP1-14(Bioxcell))
·600μg4M2-C12 IgG2a+200μg抗PD-1抗体
·仅PBS
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦对照组的肿瘤长度>1.5cm，就认为已达到研究终点。
结果如图36A和36B所示。抗VISTA抗体4M2-C12和抗PD-1的联合治疗比单独使用任何一种药物都更大程度地抑制了肿瘤的生长。
对肿瘤浸润的CD45+细胞进行免疫分析。简而言之，在实验的第22天收集肿瘤，将其加工成单细胞悬液，并用免疫细胞表面蛋白(CD45、CD4、CD8、CD25、CD11b、Ly6G和Ly6C)的特异性抗体染色。
通过流式细胞仪分析样品，并根据其对不同免疫细胞表面蛋白的染色情况，将其分为以下免疫细胞亚群：
·CD4细胞：CD45+CD4+；
·CD8 T细胞：CD45+CD8+；
·Treg细胞：CD45+CD4+CD25+；
·粒细胞MDSC(g-MDSC)：CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clo/-
·单核MDSC(m-MDSC)：CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chi/+
具有指定表型的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比总结如下：
图37中显示了为g-MDSC的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比。用4M2-C12(单独使用或与抗PD-1组合使用)治疗可显著降低肿瘤浸润性CD45+细胞中g-MDSC的比例。
在第18天从小鼠获得血液，并使用用于小鼠的MACSPlex细胞因子10试剂盒(Miltenyi Biotec)通过分析来分析血清中各种不同细胞因子的水平。
结果显示如图38A至38E所示。
12.2B16-BL6细胞模型
图40A和40B显示了延长至18天的上述实施例5.2.3中描述的研究结果(结果如图17所示)。抗VISTA抗体4M2-C12和抗PD-1的联合治疗比单独使用任何一种药物都更大程度地抑制了肿瘤的生长。
对肿瘤浸润的CD45+细胞进行免疫分析。简而言之，在实验的第18天，收集肿瘤，将其加工成单细胞悬液，用免疫细胞表面的特异性抗体染色，通过流式细胞术进行分析，并且如上文实施例12.1中所述将细胞分类为免疫细胞亚群。
具有指定表型的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比总结如下：
图41中显示了为g-MDSC的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比。
12.3 EL4细胞模型
通过将2×105个EL4细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧腹，建立了T细胞白血病/淋巴瘤的同源模型。
每3天对小鼠(每个治疗组7只)进行腹膜内给药，共5剂，其剂量为：
·600μg4M2-C12 IgG2a(实施例5的[17])
·200μg抗PD-1抗体(克隆RMP1-14(Bioxcell))
·600μg4M2-C12 IgG2a+200μg抗PD-1抗体
·仅PBS
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦对照组的肿瘤长度>1.5cm，就认为已达到研究终点。
结果如图42所示。抗VISTA抗体4M2-C12和抗PD-1的联合治疗比单独使用任何一种药物都更大程度地抑制了肿瘤的生长。
对肿瘤浸润的CD45+细胞进行免疫分析。简而言之，在实验的第16天，收集肿瘤，将其加工成单细胞悬液，用免疫细胞表面的特异性抗体染色，通过流式细胞术进行分析，并且如上文实施例12.1中所述将细胞分类为免疫细胞亚群。
具有指定表型的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比总结如下：
图43中显示了为g-MDSC的肿瘤浸润CD45+细胞的百分比。用4M2-C12(单独使用或与抗PD-1组合使用)治疗可显著降低肿瘤浸润性CD45+细胞中g-MDSC的比例。
12.4结论
在CT26、B16-BL6和EL4模型中，抑制PD-1/PD-L1信号可增加g-MDSC在肿瘤浸润CD45+细胞中的比例，而4M2-C12处理可抑制g-MDSC的扩增。
实施例13：VISTA结合抗体的进一步表征
产生了更多的VISTA结合抗原结合分子：
使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等人，Nucleic Acids Res。，38，D301-307(2010))和IEDB脱免疫(Dhanda等人，Immunology，(2018)153(1)：118-132)工具在计算机上模拟分析了V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31的安全性和免疫原性。
V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与人的重链和轻链具有足够的同源性，可以被认为是人源化的(即>85％)，具有潜在的免疫原性肽的数量少到足以被认为是安全的(参见图53)，并且不具有任何其他可能引起潜在的可延展性问题的特性。
13.1通过BLI分析结合亲和力
通过BLI使用Pall ForteBio Octet QK 384系统评估V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31(即[21]至[28])与人和小鼠VISTA蛋白以及人类PD-L1的结合情况。
简而言之，将抗Penta-HIS生物传感器在PBS缓冲液(pH 7.2)中孵育60秒以获得第一个基线，然后在PBS(pH 7.2)中将180nM hVISTA、180nM mVISTA或250nM hPD-L1加载120秒。上样后，将生物传感器在pH 7.2的PBS缓冲液中孵育60秒钟以获得第二个基线，并用6.2倍稀释的系列测试抗体(500nM-15.6nM)在PBS pH 7.2中孵育120秒或900秒，以获得关联曲线。最后，将生物传感器在PBS pH 7.2中孵育120秒，以获得解离曲线。通过将缔合和解离数据与1：1结合模型进行整体拟合来计算动力学常数和亲和常数。
V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30或V4-C31均未显示与人PD-L1的显著结合(图45C)。
在该实验中，计算出的V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与人VISTA和小鼠VISTA结合的动力学和热力学常数如图45D所示。
在独立的实验中分析了V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与小鼠VISTA蛋白的结合，其中包括评估VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(SEQ IDNO：269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO：270))。
VSTB112没有显示出与小鼠VISTA蛋白的显著结合(图46A)。在该实验中，计算出的V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与小鼠VISTA结合的动力学和热力学常数如图46B所示。
在另一个实验中，分析了V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27和VSTB112IgG1与人VISTA和小鼠VISTA的结合，图47C显示了计算出的动力学和热力学常数。
在另一个实验中，对V4(实施例2.2的[1])和VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(SEQID NO：269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO：270))对人VISTA、小鼠VISTA和人CD47的结合进行了分析。将抗Penta-HIS生物传感器在PBS缓冲液(pH 7.2)中孵育60秒，以获得第一个基线，然后在PBS(pH 7.2)中加入180nM hVISTA、180nM mVISTA或300nM hCD47加载120秒。上样后，将生物传感器在pH 7.2的PBS缓冲液中孵育60秒钟以获得第二个基线，并在pH 7.2的PBS中用稀释的系列测试抗体(1500nM-46.9nM)孵育120秒钟，以获得关联曲线。最后，将生物传感器在PBS pH 7.2中孵育120秒，以获得解离曲线。通过将缔合和解离数据与1：1结合模型进行整体拟合来计算动力学常数和亲和常数。
V4和VSTB112均未显示与人CD47的结合。VSTB112没有显示出与小鼠VISTA蛋白的显著结合，而V4有。计算的动力学常数和热力学常数如图48B所示。
13.2通过ELISA分析结合亲和力
采用ELISA评估不同抗体与人VISTA和小鼠VISTA的结合。如以上实施例3.3中所述进行ELISA。
在实验中分析了以下抗体：
·4M2-C12 IgG1(实施例2.2的[1]；在附图中称为“V4pr”)
·V4-C1 IgG1(实施例13的[21])
·V4-C9 IgG1(实施例13的[22])
·V4-C24 IgG1(实施例13的[23])
·V4-C26 IgG1(实施例13的[24])
·V4-C27 IgG1(实施例13的[25])
·V4-C28 IgG1(实施例13的[26])
·V4-C30 IgG1(实施例13的[27])
·V4-C31 IgG1(实施例13的[28])
·VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(SEQ ID NO：269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO：270))
·阿特朱单抗(Atezolizumab)
·人IgG1同种型对照
获得的结果显示在图49A和49B中，并且从ELISA计算出的针对抗体与所示蛋白的结合的EC50(nM)值总结在图49C中。
进行进一步的实验分析了V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、VSTB112和同种型对照抗体与人VISTA或小鼠VISTA的结合。结果显示在图50A和50B中，并且从ELISA计算出的针对抗体与所示蛋白质的结合的EC50(nM)值总结在图50C中。
进行进一步的实验分析了V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、VSTB112和同种型对照抗体与人VISTA或小鼠VISTA的结合。结果显示在图51A和51B中，并且从ELISA计算出的针对抗体与所示蛋白质的结合的EC50(nM)值总结在图51C中。
进行了进一步的实验分析了V4、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31以及同种型对照抗体与人VISTA、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、PD-1和CTLA-4的结合。结果显示在图56A至56G中。V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31均显示出与人VISTA的强结合力，并且与B7蛋白质家族的其他成员无交叉反应性。
在进一步的实验中，分析了V4(在图57中称为“V4P”)、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与人VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA和猕猴VISTA的结合。所获得的结果示于图57A至57H中，并且根据ELISA计算的针对抗体与所示蛋白质的结合的EC50(M)值总结于图57I中。
发现V4和所有V4衍生的克隆V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31与人VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA和猕猴VISTA结合。
13.3流式细胞术分析表达VISTA的细胞的结合
基本上如以上实施例3.1中所述，分析抗VISTA抗体结合表达VISTA的细胞的能力。
简而言之，将转染的细胞或用编码人VISTA或小鼠VISTA的载体转染的HEK293细胞与1μg/ml的抗VISTA抗体或同种型对照抗体在4℃孵育1小时。然后洗涤细胞，并与10μg/mlFITC偶联的抗人Fc抗体在4℃孵育1小时。再次洗涤细胞，然后通过流式细胞术分析。
在实验中分析了以下抗体：
·4M2-C12 IgG1(实施例2.2的[1]；在附图中称为“V4P”)
·V4-C24 IgG1(实施例13的[23])
·V4-C26 IgG1(实施例13的[24])
·V4-C27 IgG1(实施例13的[25])
·V4-C28 IgG1(实施例13的[26])
·V4-C30 IgG1(实施例13的[27])
·V4-C31 IgG1(实施例13的[28])
·VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(SEQ ID NO：269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO：270))
·人IgG1同种型对照
结果显示在图58A至58C中。
13.4通过差示扫描荧光法分析热稳定性
如上文实施例3.4中所述，通过差示扫描荧光法分析评估不同抗体的热稳定性。
V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31(即[21]至[28])和VSTB112(三次重复)的热稳定性的差示扫描荧光分析获得的原始数据的一阶导数显示在图52A至52I中，结果总结在图52J中。
发现V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30和V4-C31的Fab区的熔解温度(Tm)比V4高(67.5℃)，因此提高了热稳定性。
实施例14：VISTA结合抗体在免疫组化中的应用
评价抗VISTA抗体4M2-C12mIgG2a(实施例5的[17])在免疫组织化学中用于检测人VISTA蛋白的能力。
使用Bond试剂(莱卡生物系统)进行切片处理。将来自正常人脾脏或正常人卵巢的市售石蜡切片在Bond Dewax溶液中进行脱石蜡处理，并再水化使用。然后在各步骤之间用1×Bond Wash进行4-5次冲洗，对切片进行以下处理：(i)在100℃下用Bond EpitopeRetrieval Solution处理抗原40分钟，(ii)在室温下用3.5％(v/v)H2O2处理15分钟来封闭内源性过氧化物酶，(iii)用10％的山羊血清在室温下放置30分钟封闭，(iv)在4℃下以1:50稀释的9.37mg/mL溶液与4M2-C12mIgG2a一起孵育过夜，(v)与HRP-聚合物缀合的山羊抗-小鼠抗体在室温下放置5分钟，并且(vi)在室温下用Bond Mixed DAB Refine显影7分钟，然后用去离子水冲洗以终止反应。
将切片在室温下用苏木精复染5分钟，并用去离子水和1×Bond Wash溶液冲洗，然后脱水，固定在合成固定介质中并进行高分辨率扫描。
结果如图59A和59B所示。抗VISTA抗体染色了脾脏细胞的细胞质，但正常卵巢切片(对照)中的细胞没有被染色。
实施例15：进一步分析VISTA结合抗体回补VISTA介导的T细胞增殖抑制和促炎细
胞因子产生的能力
表征了抗VISTA抗体从VISTA介导的抑制中释放T细胞的能力。
将96孔板用浓度为2.5μg/ml的抗CD3包被，并在4℃孵育过夜。从血液样本中分离出PBMC，从PBMC中富集T细胞并按上述方法用CSFE标记，然后CFSE标记的T细胞与转染有编码人VISTA蛋白的HEK293-6E细胞以2：1的比例在添加2％FBS的RPMI 1640培养基中共培养。
然后用4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])或浓度为0μg/ml(对照)、20μg/ml或50μg/ml的VSTB112处理细胞。
5天后，收获细胞并通过流式细胞术分析以通过CSFE稀释曲线确定细胞增殖。也收获细胞培养上清液，并通过ELISA分析INFγ和TNFα水平。
结果显示在图60A至60D中。图60A和60B显示了4M2-C12-hIgG1以剂量依赖性方式从VISTA介导的增殖抑制释放T细胞。图60C和60D显示了4M2-C12-hIgG1从VISTA介导的INFγ和TNFα产生的抑制中释放T细胞。
在进一步的实验中，将未分化的THP1细胞一式两份地接种在96孔板的孔中，在没有FBS或青霉素/链霉素的RPMI培养基中(100,000个细胞/孔)，并在连续稀释浓度的4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])或浓度范围为2000μg/ml至7.8μg/ml的VSTB112存在下，用LPS(100μg/ml)刺激细胞。
24小时后，收集细胞培养上清液并通过ELISA分析IL-6和TNFα。细胞也被固定和透化，并通过流式细胞术分析VISTA的存在。
结果显示在图61A至61C中。发现4M2-C12-hIgG1以剂量依赖的方式增加了LPS刺激的THP1细胞的IL-6和TNFa产生，且程度比VSTB112大得多。
在进一步的实验中，将未分化的THP1细胞一式两份接种在96孔板的孔中，在没有FBS或青霉素/链霉素的RPMI培养基中(100,000个细胞/孔)，并在连续稀释浓度的4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])或浓度范围为2000μg/ml至7.8μg/ml的VSTB112存在下，用LPS(100μg/ml)和MnCl2(100μM)刺激细胞。24小时后，收集细胞培养上清液并通过ELISA分析IL-6。
结果如图62所示。发现由LPS刺激的THP1细胞产生的IL-6产量增加与Fc无关，因为在以人IgG1或IgG4形式的4M2-C12处理诱导的IL6水平之间未观察到显著差异。
实施例16：药理学，毒理学和免疫毒性的进一步分析
在急性剂量研究中，大鼠被以10mg/kg、25mg/kg，100mg/kg或250mg/kg的4M2-C12-hIgG1(实施例2.2[1])或4M2-C12-hIgG4(实施例15的[29])给药。
给药后在基线(-2小时)、0.5小时、6小时、24小时、96小时、168小时和336小时从大鼠获得血液。血清中的抗体通过ELISA定量。
药代动力学分析的参数来源于非房室模型：
最大浓度(Cmax)，AUC(0-336小时)，AUC(0-无穷大)，半衰期(t1/2)，间隙(CL)，稳态下的分布体积(Vss)。
结果显示在图63A至63D中。
在独立的实验中，BALB/C小鼠单剂量给药50mg/kg 4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])或等体积的PBS。96小时后获得血液样本，并使用HM5血液分析仪分析不同类型白细胞的数量。还对血样进行了肝毒性和肾毒性的相关分析。
代表性结果如图64A至64C的表格所示。
在进一步的实验中，以250mg/kg的4M2-C12-hIgG1(实施例2.2的[1])单剂量或等体积的PBS给药Sprague Dawley大鼠。在第6、24、96和168小时获取血液样本，并使用HM5血液分析仪分析不同类型白细胞的数量。还分析了血液样品的肝毒性、肾毒性和胰腺毒性。
代表性结果如图65A至65C的表格所示。
没有发现4M2-C12-hIgG1给药与明显的毒性相关，并且没有显著改变血液中细胞类型的数量。
序列表
<110> 蜂鸟生物科技私人有限公司 (所有指定国)
R·克莱格 （仅针对卢森堡）
<120> VISTA抗原结合分子
<130> 007450851
<150> PCT/EP2018/058258
<151> 2018-03-29
<150> US 16/180、949
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<150> GB 1814562.3
<151> 2018-09-07
<160> 330
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VISTA
<400> 1
Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp
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Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
100 105 110
Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
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Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
130 135 140
Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
145 150 155 160
His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
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180 185 190
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu
195 200 205
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Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile
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Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu
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Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro
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Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp
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Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VISTA
<400> 2
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
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Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
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Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
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Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
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Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu
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Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn
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Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile
195 200 205
Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu
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Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser
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Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro
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Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp
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Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）细胞外结构域
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Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
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Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
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Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
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Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
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Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
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Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
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Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
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His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
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Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr
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Ala Ala
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VISTA跨膜结构域
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Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu
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Ile Leu Leu Leu Val
20
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VISTA细胞内结构域
<400> 5
Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala
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Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu Ala Lys Val Arg His Pro Leu
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Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser Glu Ser Gly Arg His Leu Leu
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Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe
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Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VISTA Ig-样V-型结构域
<400> 6
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
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Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
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Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
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Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
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Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
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His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG 3同种型1
<400> 7
Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu
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His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile
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Ser Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu
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Ser Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln
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Met Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly
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Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp
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Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr
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Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr
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Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser
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Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe
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Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn
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<211> 430
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型2
<400> 8
Met Ser Leu Val Glu Leu Leu Leu Trp Trp Asn Cys Phe Ser Arg Thr
1 5 10 15
Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln
20 25 30
Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser
50 55 60
Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met
65 70 75 80
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85 90 95
Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser
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Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly
115 120 125
Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser
130 135 140
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Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu
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Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln
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Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser Thr
210 215 220
Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile Gly
225 230 235 240
Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys
245 250 255
Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp Leu
275 280 285
Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser Ser
290 295 300
Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Tyr
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Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His Arg Asn Thr Glu Ser Val Ser His
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Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala Asn
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Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln His
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Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val Met
370 375 380
Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser Arg Lys Pro Arg Pro Pro His Thr
385 390 395 400
His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala Val
405 410 415
Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
420 425 430
<210> 9
<211> 406
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型3
<400> 9
Met Ser Leu Val Glu Leu Leu Leu Trp Trp Asn Cys Phe Ser Arg Thr
1 5 10 15
Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln
20 25 30
Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser
50 55 60
Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met
65 70 75 80
Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr
85 90 95
Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser
100 105 110
Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly
115 120 125
Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser
130 135 140
Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val
145 150 155 160
Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu
165 170 175
Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln
180 185 190
Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Ser Ala Gln Pro Arg Asn Ile Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr
210 215 220
Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe
225 230 235 240
Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro
245 250 255
Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys
260 265 270
Ala Phe His Thr Glu Ile Ser Ser Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser
275 280 285
Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Tyr Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His
290 295 300
Arg Asn Thr Glu Ser Val Ser His Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe
305 310 315 320
Ser Phe His Ser Gly Asn Ala Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly
325 330 335
Thr His Leu Val Pro Gly Gln His Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn
340 345 350
Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser
355 360 365
Arg Lys Pro Arg Pro Pro His Thr His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala
370 375 380
Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala Val Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser
385 390 395 400
Arg Ala Gly Ser Leu Val
405
<210> 10
<211> 409
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型1
<400> 10
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys Gln
115 120 125
Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp
145 150 155 160
Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly
165 170 175
Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln
180 185 190
Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser Thr Cys Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile Gly Leu Ile Ala Gly Ala
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile Leu
225 230 235 240
Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn Lys Glu Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Pro Pro Lys Cys Ser
260 265 270
Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser Ser Ser Asp Asn Asn Thr
275 280 285
Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Tyr Trp Ser Asn Asn Pro
290 295 300
Lys Val His Arg Asn Thr Glu Ser Val Ser His Phe Ser Asp Leu Gly
305 310 315 320
Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala Asn Ile Pro Ser Ile Tyr
325 330 335
Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln His Lys Thr Leu Val Val
340 345 350
Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val Met Ser Arg Ser Asn Gly
355 360 365
Ser Val Ser Arg Lys Pro Arg Pro Pro His Thr His Ser Tyr Thr Ile
370 375 380
Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala Val Pro Val Met Val Pro
385 390 395 400
Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
405
<210> 11
<211> 409
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型2
<400> 11
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys Gln
115 120 125
Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp
145 150 155 160
Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly
165 170 175
Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln
180 185 190
Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser Thr Cys Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile Gly Leu Ile Ala Gly Ala
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile Leu
225 230 235 240
Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn Lys Glu Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Pro Pro Lys Cys Ser
260 265 270
Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser Ser Ser Asp Asn Asn Thr
275 280 285
Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Tyr Trp Ser Asn Asn Pro
290 295 300
Lys Val His Arg Asn Thr Glu Ser Val Ser His Phe Ser Asp Leu Gly
305 310 315 320
Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala Asn Ile Pro Ser Ile Tyr
325 330 335
Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln His Lys Thr Leu Val Val
340 345 350
Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val Met Ser Arg Ser Asn Gly
355 360 365
Ser Val Ser Arg Lys Pro Arg Pro Pro His Thr His Ser Tyr Thr Ile
370 375 380
Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala Val Pro Val Met Val Pro
385 390 395 400
Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
405
<210> 12
<211> 385
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型3
<400> 12
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys Gln
115 120 125
Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp
145 150 155 160
Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly
165 170 175
Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser Ser Ala Gln Pro Arg
180 185 190
Asn Ile Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile
195 200 205
Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser
210 215 220
Lys Asn Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu
245 250 255
Ile Ser Ser Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn
260 265 270
Ser Arg Tyr Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His Arg Asn Thr Glu Ser
275 280 285
Val Ser His Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly
290 295 300
Asn Ala Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro
305 310 315 320
Gly Gln His Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro
325 330 335
Gln Val Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser Arg Lys Pro Arg Pro
340 345 350
Pro His Thr His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile
355 360 365
Gly Ala Val Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu
370 375 380
Val
385
<210> 13
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型1和2细胞外结构域
<400> 13
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys Gln
115 120 125
Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp
145 150 155 160
Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly
165 170 175
Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln
180 185 190
Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser Thr Cys Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile Gly
210 215
<210> 14
<211> 195
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3同种型3细胞外结构域
<400> 14
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys Gln
115 120 125
Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp
145 150 155 160
Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly
165 170 175
Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu Ser Ser Ala Gln Pro Arg
180 185 190
Asn Ile Gly
195
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3跨膜结构域
<400> 15
Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ile Leu
20
<210> 16
<211> 169
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3细胞内结构域
<400> 16
Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn Lys Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Pro Pro Lys Cys Ser
20 25 30
Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser Ser Ser Asp Asn Asn Thr
35 40 45
Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Tyr Trp Ser Asn Asn Pro
50 55 60
Lys Val His Arg Asn Thr Glu Ser Val Ser His Phe Ser Asp Leu Gly
65 70 75 80
Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala Asn Ile Pro Ser Ile Tyr
85 90 95
Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln His Lys Thr Leu Val Val
100 105 110
Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val Met Ser Arg Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Val Ser Arg Lys Pro Arg Pro Pro His Thr His Ser Tyr Thr Ile
130 135 140
Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala Val Pro Val Met Val Pro
145 150 155 160
Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
165
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3 Ig-样V-型结构域
<400> 17
Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala Asn Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln Met Phe Asp Gly Ala Pro
50 55 60
Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly Thr Met Pro Ala Thr Asn
65 70 75 80
Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
85 90 95
Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile Gly
100 105 110
Val Thr
<210> 18
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-3 Ig-样V-型结构域
<400> 18
Pro Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asp Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr
20 25 30
Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala
35 40 45
Thr Gln Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala
50 55 60
Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr
65 70 75 80
Ser Thr Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser
85 90
<210> 19
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens） VSIG-8
<400> 19
Met Arg Val Gly Gly Ala Phe His Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ser Ala Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu
20 25 30
Tyr Leu Ala Glu Gly Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu
35 40 45
Asp Pro Glu Asp Tyr Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln
50 55 60
Val Asn Ser Asp Pro Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Gln Asp Lys Arg Ile Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg
85 90 95
Val Arg Phe Ala Ala Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn
100 105 110
Leu Met Asn Leu Gln Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val
115 120 125
Lys Lys Thr Thr Met Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala
130 135 140
Arg Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly
145 150 155 160
Asn Asp Val Val Leu Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala
180 185 190
Gly Ser Tyr Thr Ser Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln
195 200 205
Glu Ser Phe His Ser Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu
210 215 220
Val Leu Lys Asp Ile Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr
225 230 235 240
Val Ala Asn Asn Val Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val
245 250 255
Ser Asp Ser Arg Arg Ile Gly Val Ile Ile Gly Ile Val Leu Gly Ser
260 265 270
Leu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Val Gly Ile Trp Gly Leu Val Cys
275 280 285
Cys Cys Cys Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Ala Phe Gly
290 295 300
Tyr Gly Asn Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys Gly Asp Leu Ala
305 310 315 320
Ser Glu Ile Arg Glu Asp Ala Val Ala Pro Gly Cys Lys Ala Ser Gly
325 330 335
Arg Gly Ser Arg Val Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro Thr Gln Asn Val
340 345 350
Ser Arg Ser Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro Cys Gly Gly Pro
355 360 365
Glu Asp Val Ala Leu Ala Pro Cys Thr Ala Ala Ala Ala Cys Glu Ala
370 375 380
Gly Pro Ser Pro Val Tyr Val Lys Val Lys Ser Ala Glu Pro Ala Asp
385 390 395 400
Cys Ala Glu Gly Pro Val Gln Cys Lys Asn Gly Leu Leu Val
405 410
<210> 20
<211> 393
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8
<400> 20
Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu Tyr Leu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu Asp Pro Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln Val Asn Ser Asp Pro
35 40 45
Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Arg Ile
50 55 60
Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg Val Arg Phe Ala Ala
65 70 75 80
Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn Leu Met Asn Leu Gln
85 90 95
Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val Lys Lys Thr Thr Met
100 105 110
Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala Arg Pro Ala Val Pro
115 120 125
Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly Asn Asp Val Val Leu
130 135 140
Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu Ser Tyr Lys Trp Ala
145 150 155 160
Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala Gly Ser Tyr Thr Ser
165 170 175
Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln Glu Ser Phe His Ser
180 185 190
Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu Val Leu Lys Asp Ile
195 200 205
Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr Val Ala Asn Asn Val
210 215 220
Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val Ser Asp Ser Arg Arg
225 230 235 240
Ile Gly Val Ile Ile Gly Ile Val Leu Gly Ser Leu Leu Ala Leu Gly
245 250 255
Cys Leu Ala Val Gly Ile Trp Gly Leu Val Cys Cys Cys Cys Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Ala Phe Gly Tyr Gly Asn Gly Gly
275 280 285
Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys Gly Asp Leu Ala Ser Glu Ile Arg Glu
290 295 300
Asp Ala Val Ala Pro Gly Cys Lys Ala Ser Gly Arg Gly Ser Arg Val
305 310 315 320
Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro Thr Gln Asn Val Ser Arg Ser Leu Arg
325 330 335
Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro Cys Gly Gly Pro Glu Asp Val Ala Leu
340 345 350
Ala Pro Cys Thr Ala Ala Ala Ala Cys Glu Ala Gly Pro Ser Pro Val
355 360 365
Tyr Val Lys Val Lys Ser Ala Glu Pro Ala Asp Cys Ala Glu Gly Pro
370 375 380
Val Gln Cys Lys Asn Gly Leu Leu Val
385 390
<210> 21
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8细胞外结构域
<400> 21
Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu Tyr Leu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu Asp Pro Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln Val Asn Ser Asp Pro
35 40 45
Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Arg Ile
50 55 60
Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg Val Arg Phe Ala Ala
65 70 75 80
Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn Leu Met Asn Leu Gln
85 90 95
Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val Lys Lys Thr Thr Met
100 105 110
Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala Arg Pro Ala Val Pro
115 120 125
Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly Asn Asp Val Val Leu
130 135 140
Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu Ser Tyr Lys Trp Ala
145 150 155 160
Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala Gly Ser Tyr Thr Ser
165 170 175
Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln Glu Ser Phe His Ser
180 185 190
Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu Val Leu Lys Asp Ile
195 200 205
Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr Val Ala Asn Asn Val
210 215 220
Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val Ser Asp Ser Arg Arg
225 230 235 240
Ile Gly
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8跨膜结构域
<400> 22
Val Ile Ile Gly Ile Val Leu Gly Ser Leu Leu Ala Leu Gly Cys Leu
1 5 10 15
Ala Val Gly Ile Trp
20
<210> 23
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8细胞内结构域
<400> 23
Gly Leu Val Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Arg
1 5 10 15
Gly Ala Phe Gly Tyr Gly Asn Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys
20 25 30
Gly Asp Leu Ala Ser Glu Ile Arg Glu Asp Ala Val Ala Pro Gly Cys
35 40 45
Lys Ala Ser Gly Arg Gly Ser Arg Val Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro
50 55 60
Thr Gln Asn Val Ser Arg Ser Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro
65 70 75 80
Cys Gly Gly Pro Glu Asp Val Ala Leu Ala Pro Cys Thr Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Cys Glu Ala Gly Pro Ser Pro Val Tyr Val Lys Val Lys Ser Ala
100 105 110
Glu Pro Ala Asp Cys Ala Glu Gly Pro Val Gln Cys Lys Asn Gly Leu
115 120 125
Leu Val
130
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8 Ig-样V-型结构域
<400> 24
Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu Tyr Leu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu Asp Pro Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln Val Asn Ser Asp Pro
35 40 45
Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Arg Ile
50 55 60
Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg Val Arg Phe Ala Ala
65 70 75 80
Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn Leu Met Asn Leu Gln
85 90 95
Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val Lys Lys Thr Thr Met
100 105 110
Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr
115 120
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）VSIG-8 Ig-样V-型结构域
<400> 25
Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly Asn
1 5 10 15
Asp Val Val Leu Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu Ser
20 25 30
Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala Gly
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln Glu
50 55 60
Ser Phe His Ser Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu Val
65 70 75 80
Leu Lys Asp Ile Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr Val
85 90 95
Ala Asn Asn Val Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val Ser
100 105 110
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
Ser Arg Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
Phe Gln Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
Arg His His His Ser Glu His Arg Val His Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser
1 5 10 15
Arg Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu
20 25 30
Thr Phe Gln Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Thr Ser His Asp Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp
50 55 60
His His Gly Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser
85 90 95
Glu His Arg Val His Gly
100
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile
1 5
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 36
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 38
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
35
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 39
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 40
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 41
Ser Ser Val Gly Tyr
1 5
<210> 42
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 42
Ala Thr Ser
1
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 43
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 44
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 45
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 46
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 46
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 47
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
1 5 10
<210> 48
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 48
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 49
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 50
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 51
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala
20 25
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Val Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 53
Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 54
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 55
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val
<210> 56
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 56
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 57
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 58
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 58
Asp Thr Ser
1
<210> 59
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 59
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
20 25
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 60
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 61
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 61
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 64
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 65
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 65
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Asp Cys
35
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 67
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 67
Ala Ala Ser
1
<210> 68
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 69
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 70
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 70
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 71
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Thr Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Glu Arg Ala Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly His Thr Asn Tyr Lys Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gln Ile Pro Leu Tyr Tyr Gly His Tyr Arg Ser Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 72
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 73
Ile Phe Pro Gly Gly Gly His Thr
1 5
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 74
Ala Gln Ile Pro Leu Tyr Tyr Gly His Tyr Arg Ser Ala Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 75
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Thr Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 76
Leu Gly Trp Val Lys Glu Arg Ala Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu
<210> 77
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 77
Asn Tyr Lys Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 78
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 79
Asp Ile Gln Met Met Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 80
Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
1 5
<210> 81
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 81
Gly Ala Thr
1
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 82
Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 83
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 83
Asp Ile Gln Met Met Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser
20 25
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 84
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 85
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 85
Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 86
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 87
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 87
Gln Val Thr Leu Lys Glu Cys Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Leu Asp Gly Tyr Asn Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 88
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 89
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 90
Ala Arg Arg Leu Asp Gly Tyr Asn Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 91
Gln Val Thr Leu Lys Glu Cys Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser
20 25
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 92
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10 15
His
<210> 93
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 93
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser
1 5 10 15
Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 94
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Val Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 96
Gln Asn Val Asn Val Trp
1 5
<210> 97
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 97
Lys Ala Ser
1
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 98
Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 99
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser
20 25
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 100
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 101
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 101
Asn Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 102
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Glu Arg Ala Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly His Thr Asn Tyr Lys Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gln Ile Pro Leu Tyr Tyr Gly His Tyr Arg Ser Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 103
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 103
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 104
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 105
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser
20 25
<210> 106
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 106
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Leu
50 55 60
Glu Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn His Tyr Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 107
Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr
1 5
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 108
Ala Arg Asn His Tyr Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 109
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 109
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 110
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 111
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 111
Thr Tyr Ser Pro Ser Leu Glu Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 112
Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 113
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 113
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 114
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 115
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 116
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 117
Met Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 118
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 118
Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala
20 25 30
Met Tyr Phe Cys
35
<210> 119
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 119
Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val His Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Val Glu
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Phe Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 121
Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 122
Thr Arg Arg Asp Gly Tyr Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 123
Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 124
Met Asp Trp Val His Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Glu
<210> 125
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 125
Tyr Tyr Val Glu Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ser Lys Ser Ser Val Phe Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 126
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 126
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 127
Ser Ser Ser Val Arg Asp
1 5
<210> 128
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 128
Asn Thr Phe
1
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 129
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr
1 5
<210> 130
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 130
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala
20 25
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 131
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Val Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 132
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 132
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Ala Tyr Tyr Cys
35
<210> 133
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 133
Gln Val Thr Leu Lys Val Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Leu Asp Gly Tyr Asn Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 134
Gln Val Thr Leu Lys Val Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser
20 25
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 135
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 136
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 137
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 138
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 138
Leu Thr Ser
1
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 139
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 140
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）1
<400> 140
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 141
Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 142
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 142
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 143
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 143
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Asp Ser Asp Tyr Thr Thr Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 144
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 145
Ile Asn Pro Asp Ser Asp Tyr Thr
1 5
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 146
Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 147
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）1
<400> 147
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 148
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 149
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 149
Thr Tyr Asp Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 150
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 150
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 151
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 151
Gln Ser Val Thr Asn Asp
1 5
<210> 152
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 152
Tyr Ala Ser
1
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 153
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 154
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 154
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 155
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 156
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 156
Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 157
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 157
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Thr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Ser Asn Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 158
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Thr
1 5
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 159
Ile Asn Pro Ser Asn Asp Tyr Thr
1 5
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 160
Ala Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 161
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 161
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 162
Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 163
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 163
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 164
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 164
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 165
Gln Ser Val Thr Asn Gly
1 5
<210> 166
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 166
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 167
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 167
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 168
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 168
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Cys Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Thr Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 169
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 170
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 171
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 171
Ala Arg Trp Ala Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 172
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 172
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 173
Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu
<210> 174
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 174
Asn Cys Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Thr Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 175
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 176
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 176
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 177
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 178
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 178
Lys Val Ser
1
<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 179
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 180
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 180
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 181
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 181
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 182
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 182
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 183
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 183
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 184
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 184
Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr
1 5
<210> 185
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 185
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 186
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 186
Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Asp
<210> 187
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 187
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 188
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 188
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 189
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 190
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 191
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 191
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 192
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 193
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 193
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 194
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 195
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 195
Val Arg Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 196
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 196
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 197
Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 198
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 199
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 199
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 200
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 200
Val Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 201
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 201
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Asp Tyr Phe Cys
35
<210> 202
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 202
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Thr Val His Ser
20 25 30
Ile Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 203
Gln Ser Thr Val His Ser Ile Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 204
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 204
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 205
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 205
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 206
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 206
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 207
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 208
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 208
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 209
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 210
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 210
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 211
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 211
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 212
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 212
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 213
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 213
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 214
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 214
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 215
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 215
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 216
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 216
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Val Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 217
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 217
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 218
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 218
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 219
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 220
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 220
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Thr Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Glu Arg Ala Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly His Thr Asn Tyr Lys Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gln Ile Pro Leu Tyr Tyr Gly His Tyr Arg Ser Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 221
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 221
Asp Ile Gln Met Met Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 222
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 222
Gln Val Thr Leu Lys Glu Cys Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Leu Asp Gly Tyr Asn Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 223
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 223
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Val Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 224
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 224
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Glu Arg Ala Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly His Thr Asn Tyr Lys Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gln Ile Pro Leu Tyr Tyr Gly His Tyr Arg Ser Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 225
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 225
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 226
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 226
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Leu
50 55 60
Glu Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn His Tyr Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 227
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 227
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 228
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 228
Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val His Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Val Glu
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Phe Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 229
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 229
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 230
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 230
Gln Val Thr Leu Lys Val Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Leu Asp Gly Tyr Asn Asp Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 231
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 231
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 232
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 232
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Asp Ser Asp Tyr Thr Thr Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 233
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 233
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 234
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 234
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Thr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Ser Asn Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 235
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 235
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 236
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 236
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Cys Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Thr Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 237
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 237
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 238
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 238
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 239
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 239
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 240
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 240
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 241
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 241
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 242
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 242
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 243
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 243
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Thr Val His Ser
20 25 30
Ile Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 244
Gly Tyr Xaa Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 245
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 245
Xaa Xaa Ser
1
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 246
Xaa Arg Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 247
Gln Ser Xaa Val His Ser Xaa Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 248
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 248
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 249
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 249
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Gly Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 250
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 250
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 251
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 251
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile
<210> 252
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 252
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
<210> 253
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 253
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
100 105 110
<210> 254
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 254
Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Gly Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
100 105 110
<210> 255
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 255
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
20 25 30
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
35 40 45
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
50 55 60
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His
85 90 95
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
100 105
<210> 256
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 256
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 257
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 257
Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Gly Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
100 105 110
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
130 135 140
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215
<210> 258
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 258
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 259
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 259
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
100 105 110
<210> 260
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 260
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
100 105 110
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
130 135 140
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215
<210> 261
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 261
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 262
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 262
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile
<210> 263
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 263
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
1 5 10
<210> 264
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 264
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
1 5 10 15
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
20 25 30
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
35 40 45
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
50 55 60
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105
<210> 265
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 265
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
1 5 10 15
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
20 25 30
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
35 40 45
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr
50 55 60
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
85 90 95
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 266
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 266
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210 215 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290 295 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305 310 315 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340 345 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355 360 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370 375 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 267
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 267
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Thr His
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 268
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 268
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 269
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 269
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Leu Leu Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Trp Ser Tyr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 270
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 270
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Tyr Asn Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 271
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 271
Pro Val Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe
1 5 10
<210> 272
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 272
Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp Leu
1 5 10
<210> 273
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 273
Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser
1 5 10
<210> 274
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 274
Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val His Gly Ala Met Glu
1 5 10 15
Leu
<210> 275
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 275
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
20 25 30
<210> 276
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 276
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 277
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 277
Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Ile
1 5
<210> 278
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 278
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 279
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 279
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 280
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 280
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Ser Cys
35
<210> 281
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 281
Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 282
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 282
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 283
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 283
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 284
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 284
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ser Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 285
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 285
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 286
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 286
Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Val
1 5
<210> 287
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 287
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 288
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 288
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 289
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 289
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 290
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Thr
1 5
<210> 291
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 291
Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Val
1 5
<210> 292
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 292
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
His
<210> 293
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 293
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
35
<210> 294
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 294
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 295
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 295
Thr Thr Ser
1
<210> 296
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 296
Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ser Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 297
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 297
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Ile Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 298
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 298
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Ile Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 299
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 299
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 300
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 300
Ala Thr Tyr
1
<210> 301
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 301
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 302
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 302
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 303
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 303
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Tyr Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 304
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 304
Tyr Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ser Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 305
Gly Tyr Xaa Ile Thr Ser Asp Tyr Xaa
1 5
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 306
Ile Thr Tyr Ser Gly Xaa Xaa
1 5
<210> 307
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 307
Ala Arg Xaa Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 308
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 308
Xaa Xaa Xaa
1
<210> 309
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 309
Xaa Thr Xaa
1
<210> 310
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 310
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Xaa Ile Tyr
35 40 45
Xaa Thr Xaa Xaa Tyr Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 311
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 311
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 312
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 312
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 313
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 313
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 314
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 314
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 315
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 315
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 316
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 316
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 317
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 317
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Ile Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 318
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 318
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 319
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 319
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 320
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 320
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 321
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 321
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Tyr Tyr Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 322
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 322
Ser Arg Gly Glu Val Gln
1 5
<210> 323
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）PSGL-1同种型1 (UniProt: Q14242-1、v1)
<400> 323
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
35 40 45
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
50 55 60
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
65 70 75 80
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu
100 105 110
Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala
115 120 125
Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr
130 135 140
Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln
180 185 190
Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala
195 200 205
Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr
210 215 220
Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu
225 230 235 240
Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu
245 250 255
Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu
260 265 270
Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val
275 280 285
Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser
290 295 300
Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys
305 310 315 320
Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val
325 330 335
Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr
340 345 350
Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu
355 360 365
Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg
385 390 395 400
Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro
405 410
<210> 324
<211> 428
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）PSGL-1同种型2 (UniProt: Q14242-2)
<400> 324
Met Ala Val Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Asp Lys Met Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
20 25 30
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
35 40 45
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
50 55 60
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
65 70 75 80
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
85 90 95
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly
100 105 110
Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu
115 120 125
Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala
130 135 140
Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr
145 150 155 160
Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu
165 170 175
Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln
195 200 205
Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala
210 215 220
Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu
245 250 255
Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu
260 265 270
Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu
275 280 285
Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val
290 295 300
Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser
305 310 315 320
Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys
325 330 335
Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val
340 345 350
Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr
355 360 365
Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu
370 375 380
Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu
385 390 395 400
Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg
405 410 415
Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro
420 425
<210> 325
<211> 395
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）成熟的人PSGL-1同种型1 (Q14242-1，v1 18至412位)
<400> 325
Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu Gly
1 5 10 15
Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu
20 25 30
Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn
35 40 45
Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr
50 55 60
Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu Ser
85 90 95
Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr
100 105 110
Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro
115 120 125
Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala
130 135 140
Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr
165 170 175
Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met
180 185 190
Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln
195 200 205
Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala
210 215 220
Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala
225 230 235 240
Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser
245 250 255
Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser
260 265 270
Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val
275 280 285
Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys Leu
290 295 300
Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val Cys
305 310 315 320
Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro
325 330 335
Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu
340 345 350
Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu
370 375 380
Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro
385 390 395
<210> 326
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 326
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1 5 10 15
Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala
210 215 220
Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala
225 230 235 240
Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser
245 250 255
Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser
260 265 270
Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val
275 280 285
Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys
290 295 300
<210> 327
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 327
Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val
1 5 10 15
Cys Thr Val Val Leu
20
<210> 328
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 328
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70
<210> 329
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 329
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1 5 10 15
Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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130 135 140
<210> 330
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 330
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1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
Claims (34)
1.一种任选分离的抗原结合分子，其能够与VISTA结合并抑制VISTA介导的信号传导，而不依赖于Fc介导的功能。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：305的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：306的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：307的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：308的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：309的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：295的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：290的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：291的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：300的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LC-CDR3。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：297的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
包含与SEQ ID NO：289的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包含与SEQ ID NO：299的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
10.一种任选分离的抗原结合分子，其包含(i)根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合分子，和(ii)能够结合除VISTA以外的抗原的抗原结合分子。
11.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子。
12.一种或多种任选分离的核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子或根据权利要求11所述的CAR。
13.一种或多种表达载体，其包含根据权利要求12所述的一种或多种核酸。
14.一种细胞，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，或根据权利要求13所述的一种或多种表达载体。
15.一种方法，其包括在适合从核酸或表达载体表达抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含根据权利要求12所述的一种或多种核酸，或根据权利要求13所述的一种或多种表达载体的细胞。
16.一种组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体或根据权利要求14所述的细胞。
17.根据权利要求16所述的组合物，其还包含能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的试剂，其中除了VISTA以外的免疫检查点分子任选地选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞，或根据权利要求16或17所述的组合物，用于医学治疗或预防的方法。
19.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞或根据权利要求16或权利要求17所述的组合物，用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求12所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞，或根据权利要求16或17所述的组合物的用途，用于制备用于治疗或预防癌症或感染性疾病的方法的药物。
21.一种治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，其包括对受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞或根据权利要求16或权利要求17所述的组合物。
22.根据权利要求19所述使用的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞或组合物，根据权利要求20所述的用途或根据权利要求21所述的方法，其中，所述癌症选自：含有表达VISTA的细胞的癌症、含有表达VISTA的细胞浸润的癌症、含有表达VISTA的癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢肿瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
23.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞或根据权利要求16或权利要求17所述的组合物，用于治疗或预防与病理上涉及的髓性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法。
24.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的核酸或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞或根据权利要求16或权利要求17所述的组合物的用途，用于制备用于治疗或预防其中病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法的药物。
25.一种治疗或预防在病理上涉及髓源性抑制细胞(MDSC)的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求11所述的CAR，根据权利要求12所述的一种或多种核酸，根据权利要求13所述的一种或多种表达载体，根据权利要求14所述的细胞，或根据权利要求16或权利要求17所述的组合物。
26.根据权利要求19至25中任一项所述使用的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体，使用的细胞或组合物、用途或方法，其中，所述方法还包括给予能够抑制由VISTA以外的免疫检查点抑制剂介导的信号传导的试剂，任选地，其中除VISTA以外的免疫检查点抑制剂选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
27.一种抑制VISTA介导的信号传导的方法，其包括使表达VISTA的细胞与根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子接触。
28.一种抑制髓源性抑制细胞(MDSC)活性的方法，所述方法包括使MDSC与根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子接触。
29.一种增加效应免疫细胞的数量或活性的方法，所述方法包括用根据权利要求1-10中任一项所述的抗原结合分子抑制表达VISTA的细胞的活性。
30.一种任选分离的体外复合物，其包含与VISTA结合的根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子。
31.一种方法，包括使含有或怀疑含有VISTA的样品与根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子接触，并检测所述抗原结合分子与VISTA的复合物的形成。
32.一种对受试者作选择或分层以便用于VISTA靶向药物治疗的方法，所述方法包括将来自受试者的样品与根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子体外接触，并检测抗原结合分子与VISTA的复合物的形成。
33.根据权利要求1至10中任一项的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后剂的用途。
34.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子在用于检测、定位或成像癌症的方法中的用途，任选地其中所述癌症选自：含有表达VISTA的细胞的癌症、含有表达VISTA的细胞浸润的癌症、含有表达VISTA的癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢肿瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
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